Gebiet der ErfindungField of the invention

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Diagnose sowie Medikamente zur Behandlung von Erkrankungen des Zellwachstums, insbesondere krankhaftes Zellwachstum mit einer genetischen Ursache, einschließlich Störungen, die mit dem Verlust von Tumor-Suppressor-Funktionen verbunden sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Diagnose, Früherkennung und Behandlung von Erkrankungen der Neurofibromatose Typ 1 (NF1) sowie NF1 assoziierter Tumore.The present invention relates to methods of diagnosis as well as medicaments for the treatment of diseases of cell growth, in particular pathological cell growth with a genetic cause, including disorders associated with the loss of tumor suppressor functions. In particular, the present invention relates to the diagnosis, early detection and treatment of disorders of neurofibromatosis type 1 (NF1) and NF1 associated tumors.

Hintergrund der ErfindungBackground of the invention

Die Neurofibromatose Typ 1 (NF1) ist eine autosomal-dominant vererbbare Multiorganerkrankung mit unterschiedlich stark ausgeprägten Symptomen innerhalb der Haut, des Knochens und/oder des Nervensystems und der Neigung zu benignen und malignen Tumoren des Nervensystems. NF1 basiert auf Mutationen des NF1-Gens, welches für Neurofibromin, ein Tumorsuppressorgen (negativer Regulator des Ras-Signalwegs) kodiert und auf dem Chromosom 17/g11.2 lokalisiert ist. Die Krankheit zeigt eine vollständige Penetranz, das heißt, dass alle Personen mit einer NF1-Mutation auch klinische Symptome entwickeln [1–4]. NF1 ist eine seltene Erkrankung mit einer Prävalenz von 30–40 Fällen pro 100000 Einwohner; ein Kind von 3000 bis 4000 Geburten ist betroffen. Es wird geschätzt, dass 50% der Fälle durch eine Neumutation im NF-1-Gen verursacht wird.Neurofibromatosis type 1 (NF1) is an autosomal dominant hereditary multiorgan disorder characterized by varying degrees of symptoms within the skin, bone and / or nervous system and the tendency to benign and malignant tumors of the nervous system. NF1 is based on mutations of the NF1 gene, which codes for neurofibromin, a tumor suppressor gene (negative regulator of the Ras signaling pathway), located on chromosome 17 / g11.2. The disease shows complete penetrance, which means that all individuals with a NF1 mutation also develop clinical symptoms [1-4]. NF1 is a rare disease with a prevalence of 30-40 cases per 100,000 population; a child of 3000 to 4000 births is affected. It is estimated that 50% of the cases are caused by a new mutation in the NF-1 gene.

Die Diagnose von NF1 erfolgt bisher größtenteils mittels klinischer Diagnostik anhand von Kardialsymptomen (> 5 Cafe-au Lait-Flecken bei 95% der Patienten, kutane Tumore bei > 90% der Patienten), jedoch ist gerade bei Kinder mit wenig ausgeprägten Symptomen oder bei Patienten mit NF1-Sonderformen eine klinische Diagnosestellung oft sehr schwierig.Up to now, most of the diagnosis of NF1 has been by clinical diagnosis using cardiac symptoms (> 5 Cafe-au-Lait spots in 95% of patients, cutaneous tumors in> 90% of patients), but it is especially common in children with little or no symptoms With NF1 special forms, a clinical diagnosis is often very difficult.

Eines der bezeichnensten Eigenschaften von NF1 ist die Entwicklung eines beginnenden peripheren Nervenscheidentumors, welcher an jeder beliebigen Stelle des Körpers auftreten kann. Während kutane Neurofibrome (cNF) zumeist sichtbar und tastbar sind, sind subkutane Neurofibrome, interne plexiform Neurofibrome (PNF) und maligne periphere Nervenscheidentumore (MPNST) zumeist schwierig zu detektieren, zu quantifizieren oder zu überwachen [4]. 4,6–10% aller Patienten mit einer NF-1 können maligne periphere Nervenscheidentumoren (MPNST) entwickeln ( Stark et al., 2002, Tumoren peripherer Nerven, Deutsches Ärzteblatt ).One of the hallmark features of NF1 is the development of an incipient peripheral nerve sheath tumor that can occur anywhere on the body. While cutaneous neurofibromas (cNF) are mostly visible and palpable, subcutaneous neurofibromas, internal plexiform neurofibromas (PNF), and malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNST) are usually difficult to detect, quantify, or monitor [4]. 4.6-10% of all patients with NF-1 can develop malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNST) ( Stark et al., 2002, Tumors of Peripheral Nerves, Deutsches Ärzteblatt ).

MPNST sind die häufigste Ursache für eine verkürzte Lebensdauer von NF1 Patienten und führen zum Tod, wenn sie nicht frühzeitig entdeckt und behandelt werden. Dieser bösartige Tumor entwickelt sich bei NF1-Patienten aus vorbestehenden gutartigen plexiformen Neurofibromen. Die erste Form der Behandlung ist die selektive Resektion von beginnenden PNF, und die radikale operative Entfernung von MPNST [5–8]. Auf Grund des invasiven Wachstumsmusters von MPNST wird häufig die komplette Entfernung des Tumors verhindert, besonders wenn dieser erst spät diagnostiziert wird. Darüber hinaus können Chemo- und Radiotherapie die Wiederkehr des Tumors zwar verzögern, jedoch hat diese Behandlung nur einen geringen Effekt auf das Langzeitüberleben [7, 9]. Das lebenslange Risiko einen MPNST zu entwickeln wurde bei NF1 Patienten mit 8–13% bestimmt und ist mehr als 100-mal höher in NF1 Patienten gemessen an der Normalbevölkerung.MPNST are the most common cause of shortened life of NF1 patients and lead to death if not detected and treated early. This malignant tumor develops in NF1 patients from pre-existing benign plexiform neurofibromas. The first form of treatment is the selective resection of incipient PNF, and the radical surgical removal of MPNST [5-8]. Due to the invasive growth pattern of MPNST, the complete removal of the tumor is often prevented, especially if it is diagnosed late. In addition, although chemotherapy and radiotherapy may delay tumor recurrence, this treatment has little effect on long-term survival [7, 9]. The lifetime risk of developing MPNST was determined to be 8-13% in NF1 patients and more than 100-fold higher in NF1 patients compared to the normal population.

Darüber hinaus entwickeln viele NF1 Patienten in einem sehr jungen Alter von ungefähr 30 Jahren [10, 11] einen malignen peripheren MPNST, verglichen zu dem Durchschnittsalter von 62 Jahren nach Diagnosestellung in der Normalbevölkerung [12]. Da MPNST sich durch den malignen Verlauf eines vorher existierenden PNF entwickelt, steigt das Risiko von NF1 Patienten mit PNF um bis zu 50% [12, 13].In addition, many NF1 patients at a very young age of approximately 30 years [10, 11] develop a malignant peripheral MPNST compared to the average age of 62 years after diagnosis in the normal population [12]. As MPNST develops through the malignant course of a preexisting PNF, the risk of NF1 patients with PNF increases by up to 50% [12, 13].

Darüber hinaus kann die Diagnosestellung sehr lange dauern, bei Kindern einige Jahre oder sogar erst im Erwachsenenalter erfolgen, je nach Wissens- und Erfahrungsstand der diagnostizierenden Ärzte (Kinderärzte, Hautärzte, Neurologen). Eine NF1-Gendiagnostik (Nachweis von Mutationen im NF1-Gen (derzeit sind über 100 verschiedene Mutationen bekannt) ist möglich, jedoch sehr kostspielig, auch ist keine 100%ige Sensitivität möglich, (siehe auch Leitlinien zur Diagnostik, A15 Neurofibromatose Typ I, D. Horn, J. Kunze, Stand: Januar 2002 ). Größe des Gens, multiple Mutation Sites und mehrere Pseudogene haben eine direkte molekulare Analyse des NF1-Gens zudem technisch schwierig gemacht und begrenzen so den Nutzen und die Praktikabilität der Gen-basierten diagnostischen Techniken und Behandlungsmethoden.In addition, the diagnosis can take a long time, in children a few years or even in adulthood, depending on the knowledge and experience of the diagnosing physicians (paediatricians, dermatologists, neurologists). NF1 genetic diagnosis (detection of mutations in the NF1 gene (currently more than 100 different mutations are known) is possible, but very costly, and no 100% sensitivity is possible (see also Diagnostic Guidelines, A15 Neurofibromatosis Type I, D. Horn, J. Kunze, January 2002 ). Gene size, multiple mutation sites and multiple pseudogenes have also made direct molecular analysis of the NF1 gene technically difficult, thus limiting the utility and practicability of gene-based diagnostic techniques and treatments.

Dermale und oberflächliche Neurofibrome unterliegen direkten Messungen durch optische oder Ultraschallverfahren [14], während PNF und MPNST zumeist nur nach dem Auftreten klinischer Symptome diagnostiziert werden. Systematische Analysen der internen Tumorlast von NF1 Patienten bei Ganzkörper-Magnetresonanztomographie (MRT) weisen zudem auf einen Zusammenhang zwischen dem Risiko einen MPNST zu entwickeln und der internen PNF Tumorlast hin [15]. Weiterhin lassen sich Mithilfe von bildgebenden Verfahren wie der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) bösartige von gutartigen Tumoren unterscheiden, jedoch nicht mit 100% Spezifität. Diese bildgebenden Verfahren können zwar hilfreich sein bei der Differenzierung gutartiger und bösartiger Tumore, sind aber auf Grund der hohen Kosten und der Strahlenbelastung als regelmäßige Früherkennungsmaßnahme ungeeignet. Hinzu kommt, dass die Gefahr einer Tumorinduktion durch Bestrahlung bei NF1-Patienten größer ist als in der Normalbevölkerung.Dermal and superficial neurofibromas are subject to direct measurements by optical or ultrasound techniques [14], while PNF and MPNST are usually only after the onset of clinical symptoms be diagnosed. Systematic analyzes of the internal tumor burden of NF1 patients in whole-body magnetic resonance imaging (MRI) also suggest an association between the risk of developing MPNST and the internal PNF tumor burden [15]. Furthermore, with the help of imaging techniques such as positron emission tomography (PET), malignant tumors can be distinguished from benign tumors, but not with 100% specificity. Although these imaging techniques can be helpful in the differentiation of benign and malignant tumors, they are unsuitable as a regular early detection measure due to the high costs and the radiation exposure. In addition, the risk of tumor induction by irradiation in NF1 patients is greater than in the normal population.

Aufgrund der schwierigen klinischen Diagnostik wäre eine Unterstützung der NF1 Diagnose durch Biomarker sinnvoll. Bisher wurde die Suche nach Ersatz-Biomarkern, um frühzeitig das Risiko für eine maligne Transformation eines Patienten identifizieren zu können auf der Grundlage der Annahme durchgeführt, dass die Überexpression von Proteinen in PNF und MPNST zu einer erhöhten systemischen Konzentration führen würden [16–19]. In Tabone-Eglinger et al., Sarcoma (2008), 1–7 wurde beschrieben, dass in humanen MPNST-Tumoren eine erhöhte Expression von EGFR-Transkripten vorliegt. In der internationalen Anmeldung WO 2010/022166 A2 , werden verschiedene miRNAs (MicroRNA (MiRNA)) als Markerkandidaten zur Diagnose von NF1 und MPNST vorgeschlagen. Nukleinsäure basierende Nachweistechniken haben allerdings den Nachteil, dass die Aufarbeitung der Probe aufwendig ist und meist eine Biopsie erfordert sowie mRNAs und miRNAs schnellerem Abbau unterliegen was zu verfälschten Ergebnissen führen kann.Due to the difficult clinical diagnostics, it would make sense to support NF1 diagnosis with biomarkers. To date, the search for replacement biomarkers to identify early the risk of malignant transformation of a patient has been based on the assumption that overexpression of proteins in PNF and MPNST would lead to increased systemic concentration [16-19]. , In Tabone-Eglinger et al., Sarcoma (2008), 1-7 It has been described that in human MPNST tumors an increased expression of EGFR transcripts is present. In the international application WO 2010/022166 A2 , various miRNAs (miRNAs) are proposed as marker candidates for the diagnosis of NF1 and MPNST. However, nucleic acid-based detection techniques have the disadvantage that the work-up of the sample is complicated and usually requires a biopsy and mRNAs and miRNAs are subject to faster degradation, which can lead to falsified results.

Als eine mögliche Alternative werden Proteine als Biomarker diskutiert, deren Vorliegen in Körperflüssigkeiten einen einfacheren Nachweis erlauben würde. Beispielsweise wurde beschrieben, dass das Serumlevel für die Wachstumsfaktoren Midkine (MK) und dem Stammzellfaktor (SCF) signifikant in einer Kohorte von 39 NF1 Patienten erhöht vorlag, jedoch wurde keine Korrelation mit der Tumorlast zu MPNST gefunden [20]; siehe auch die internationale Patentanmeldung WO 00/31541 A2 , welche Midkine als Marker zur Prognose für NF1 vorschlägt.As a possible alternative, proteins are discussed as biomarkers whose presence in body fluids would allow easier detection. For example, it has been reported that serum levels for the growth factors midkine (MK) and stem cell factor (SCF) were significantly increased in a cohort of 39 NF1 patients, but no correlation was found with the tumor burden on MPNST [20]; see also the international patent application WO 00/31541 A2 , which suggests midkine as a marker for NF1 prognosis.

Kürzlich wurde das Meloma inhibierende Aktivität/cd-rap (MIA) Protein als ein Marker für die interne Tumorlast in einer Kohorte von 42 NF1 Patienten [21] identifiziert. MIA wurde bereits früher als ein Biomarker für maligne neuroektotermale Tumore postuliert [22]. In einer anderen Studie wurden 92 Gene, die für putativ sekretierte Proteine in Neurofibrome und MPNST kodieren, als mögliche Marker analysiert [23]. Nur für eines von diesen, Adrenomedullin (ADM), konnte bestätigt werden, dass es differenziell exprimiert und erhöht im Serum von NF1 Patienten vorlag. Eine weitere noch erhöhtere Serumkonzentration wurde in einer kleinen Gruppe von MPNST Patienten gefunden (n = 5).Recently, the meloma inhibitory activity / cd-rap (MIA) protein was identified as a marker of internal tumor burden in a cohort of 42 NF1 patients [21]. MIA has previously been postulated as a biomarker of malignant neuroectotic tumors [22]. In another study, 92 genes coding for putatively secreted proteins in neurofibromas and MPNST were analyzed as potential markers [23]. Only one of these, adrenomedullin (ADM), could be confirmed to be differentially expressed and elevated in the serum of NF1 patients. Another even higher serum concentration was found in a small group of MPNST patients (n = 5).

Daher gibt es zwar Ansätze, die Expression von Markerproteinen zur Diagnose von Neurofibromatose Typ 1 zu nutzen, jedoch lassen sowohl die bisherigen Nukleinsäure-basierenden Verfahren wie auch die jüngsten Protein-gestützten Nachweisverfahren zur Diagnose von NF1 und assoziierten Tumoren noch keine Aussage zu, die ähnlich verlässlich wie die klinische Diagnose ist. Daher besteht Bedarf an einem technisch einfach durchzuführenden, zuverlässigen und vorzugsweise kostengünstigen Verfahren zur Diagnose und Früherkennung für NF1 und NF1 assoziierter Tumore.Therefore, although there are approaches to exploit the expression of marker proteins for the diagnosis of neurofibromatosis type 1, however, both the previous nucleic acid-based methods as well as the recent protein-based detection methods for the diagnosis of NF1 and associated tumors are still no statement, the similar reliable as the clinical diagnosis is. Therefore, there is a need for a technically simple, reliable and preferably inexpensive method of diagnosis and early detection of NF1 and NF1 associated tumors.

Zusammenfassung der ErfindungSummary of the invention

Die vorliegende Erfindung betrifft das technische Gebiet der neurokutanen Tumorerkrankungen, insbesondere den Nachweis von bestimmten Biomarkern, welche charakteristisch für NF1 Erkrankungen sind. Durch die vorliegende Erfindung wird ein einfaches, schnelles, zuverlässiges und kostengünstiges Verfahren zur Diagnose/Früherkennung dieser Erkrankungen bereitgestellt sowie neue Zielmoleküle als Angriffspunkte zu deren Behandlung.The present invention relates to the technical field of neurocutaneous tumor diseases, in particular the detection of certain biomarkers which are characteristic of NF1 disorders. The present invention provides a simple, fast, reliable and inexpensive method of diagnosis / early detection of these diseases as well as novel target molecules as targets for their treatment.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der erfolgreichen Identifizierung von einem Set von Biomarkern in Serum, mit deren Nachweis es möglich ist NF1 und assoziierte Tumore frühzeitig zu diagnostizieren, und vorteilhafterweise zwischen der Ausprägung bzw. Vorhandensein von NF1, NF1 assoziierten malignen peripheren Nervenscheidentumoren (MPNST) und plexiformen Neurofibromen (PNF) zu differenzieren und zudem die Tumorlast in NF1-Patienten zu bestimmen, was beispielweise hilfreich in der Dosierung einer Chemotherapie ist. Das erfindungsgemäße Set von Bio- bzw. Serummarker umfasst Tumor Nekrose Faktor alpha (TNFalpha), Interferon gamma (IFNgamma), Epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR), Insulin ähnlicher Wachstumsfaktor Bindungsprotein-1 (IGFBP-1), Regulated an Activation, Normal T cell Expressed and Secreted (RANTES) und humaner Platelet-Derived Growth Faktor-BB (PDGF-BB) sowie Fragmente davon.The present invention is based on the successful identification of a set of biomarkers in serum, with the aid of which it is possible to early diagnose NF1 and associated tumors, and advantageously between the presence or presence of NF1, NF1 associated malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNST) and To differentiate plexiform neurofibromas (PNF) and also to determine the tumor burden in NF1 patients, which is helpful, for example, in the dosage of chemotherapy. The set of bio- or serum markers according to the invention comprises Tumor Necrosis Factor alpha (TNFalpha), Interferon gamma (IFNgamma), Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR), Insulin-like Growth Factor Binding Protein-1 (IGFBP-1), Regulated to Activation, Normal T cell Expressed and Secreted (RANTES) and human Platelet Derived Growth Factor BB (PDGF-BB) and fragments thereof.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein in vitro-Verfahren zur Diagnose und/oder Früherkennung einer Neurofibromatose Typ 1 (NF1) und/oder eines NF1 assoziierten Tumor, umfassend den Nachweis mindestens eines Proteins ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IGFBP-1, RANTES und PDGF-BB oder eines Fragments einer dieser Proteine in einer Probe von einem Patienten, wobei das Vorliegen einer dieser Proteine oder Fragmente davon in veränderter Konzentration im Vergleich zu deren Konzentration in einer Referenzprobe das Vorliegen und/oder die Entwicklung einer NF1 oder eines NF1 assoziierten Tumor anzeigt. Vorteilhafterweise werden 2, 3, 4, 5 oder alle Serummarker zum Nachweis ausgewählt. Alternativ oder zusätzlich kann das erfindungsgemäße Verfahren den Nachweis weiterer, im Stand der Technik beschriebene Biomarker umfassen wie Midkine und vorzugsweise Interleukin 6 (IL-6), dass in den erfindungsgemäß durchgeführten Experimenten erstmals als NF1-Marker im Serum validiert werden konnte. Dabei weisen die vier Macker TNF-α, EGFR, IFNγ und IL-6 eine veränderte Serumkonzentration in NF1-Patienten im Vergleich zu gesunden Probanden auf. Die drei Marker IGFBP1, RANTES und PDGF-BB zeigen eine signifikant veränderte Konzentration in NF1-Patienten, die einen malignen peripheren Nervenscheidentumor (MPNST) oder ein plexiformes Neurofibrom (PNF) aufweisen, verglichen zu NF1-Patienten ohne MPNST oder PNF, wobei die IGFBP1 Konzentration zudem mit der Tumorlast in einem NF1-Patienten korreliert. In particular, the present invention relates to an in vitro method for the diagnosis and / or early detection of a neurofibromatosis type 1 (NF1) and / or an NF1 associated tumor, comprising the detection of at least one protein selected from the group consisting of TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IGFBP -1, RANTES and PDGF-BB or a fragment of one of these proteins in a sample from a patient, the presence of one of these proteins or fragments thereof in altered concentration compared to their concentration in a reference sample, the presence and / or development of NF1 or an NF1-associated tumor. Advantageously, 2, 3, 4, 5 or all serum markers are selected for detection. Alternatively or additionally, the method according to the invention may comprise the detection of further biomarkers described in the prior art, such as midkines and preferably interleukin 6 (IL-6), which for the first time could be validated as NF1 markers in serum in the experiments carried out according to the invention. The four markers TNF-α, EGFR, IFNγ and IL-6 show an altered serum concentration in NF1 patients compared to healthy volunteers. The three markers IGFBP1, RANTES and PDGF-BB show a significantly altered level in NF1 patients presenting a malignant peripheral nerve sheath tumor (MPNST) or plexiform neurofibroma (PNF) compared to NF1 patients without MPNST or PNF, with IGFBP1 Concentration also correlates with tumor burden in a NF1 patient.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung in vitro-Verfahren zur Diagnose und/oder Früherkennung einer Neurofibromatose Typ 1 (NF1) und/oder eines NF1 assoziierten Tumor wobei (a) eine erhöhte Konzentration von TNFalpha, IFNgamma, und/oder IL-6 bzw. eine erniedrigte Konzentration von EGFR für NF1; (b) eine erhöhte Konzentration von IGFBP1 und/oder RANTES für einen NF1 assoziierten malignen peripheren Nervenscheidentumor (MPNST); und (c) eine erniedrigte Konzentration von PDGF-BB für ein plexiformes Neurofibrom (PNF) bezeichnend ist; und wobei die Referenzprobe in (a) von einem gesunden Subjekt und in (b und c) von einem NF1 Patienten stammt.In a particularly preferred embodiment, the present invention relates to in vitro methods for the diagnosis and / or early detection of a neurofibromatosis type 1 (NF1) and / or a NF1-associated tumor wherein (a) an increased concentration of TNFalpha, IFNgamma, and / or IL- 6 or a decreased concentration of EGFR for NF1; (b) an increased concentration of IGFBP1 and / or RANTES for an NF1-associated malignant peripheral nerve sheath tumor (MPNST); and (c) a decreased concentration of PDGF-BB is indicative of a plexiform neurofibroma (PNF); and wherein the reference sample in (a) is from a healthy subject and in (b and c) from an NF1 patient.

Da bereits Patienten mit einer NF1 Erkrankung ohne erkennbare klinische Symptome eine veränderte Konzentration von den erfindungsgemäßen Markerproteinen im Blut oder Serum aufweisen, stellt die vorliegende Erfindung zum ersten Mal ein in der Handhabung einfaches und kostengünstiges Frühdiagnoseverfahren bereit.Since patients with a NF1 disease without recognizable clinical symptoms already have an altered concentration of the marker proteins according to the invention in blood or serum, the present invention provides for the first time a simple and cost-effective early diagnosis method.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann vorteilhafterweise mit klassischen immunologischen Material und Methoden durchgeführt werden, beispielsweise mit kommerziell erhältlichen Reagenzien, die jeweils spezifisch für die oben angegebenen Proteine sind, insbesondere mit Antikörpern, vorzugsweise monoklonalen Antikörpern oder äquivalenten Bindungsmolekülen wie Aptamere oder Spiegelmere. Somit umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von solchen Reagenzien, insbesondere anti-TNFalpha, anti-IFNgamma, anti-EGFR, anti-IGFBP1 und/oder anti-RANTES Antikörper oder Fragmente davon sowie Aptamere und/oder Spiegelmere zur Diagnose und/oder Früherkennung einer NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumor.The method according to the invention can advantageously be carried out with classical immunological material and methods, for example with commercially available reagents which are each specific for the above-mentioned proteins, in particular with antibodies, preferably monoclonal antibodies or equivalent binding molecules such as aptamers or spiegelmers. Thus, the present invention also encompasses the use of such reagents, in particular anti-TNFα, anti-IFNγ, anti-EGFR, anti-IGFBP1 and / or anti-RANTES antibodies or fragments thereof as well as aptamers and / or spiegelmers for diagnosis and / or early detection NF1 and / or NF1 associated tumor.

Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Kits in dem erfindungsgemäßen Verfahren, wobei das Kit Reagenzien umfasst, die spezifisch für den Nachweis von mindestens einem Protein ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus IFNgamma, IL-6, TNFalpha, EGFR, IGFBP1, RANTES und PDGF-BB oder Fragmente davon sind, wobei die Reagenzien vorzugsweise Antikörper oder Fragmente davon umfassen.Moreover, the present invention relates to the use of a kit in the method according to the invention, wherein the kit comprises reagents specific for the detection of at least one protein selected from a group consisting of IFNgamma, IL-6, TNFalpha, EGFR, IGFBP1, RANTES and PDGF-BB or fragments thereof, the reagents preferably comprising antibodies or fragments thereof.

Die Erfindung betrifft auch ein Kit umfassend Reagenzien, die spezifisch für den Nachweis von (i) IFNgamma, TNFalpha, und EGFR und/oder (ii) IGFBP1 und RANTES sind; und optional für PDGF-BB und/oder IL-6, wobei der Nachweis bevorzugt mit einem Microarray oder einem Teststreifen durchgeführt wird.The invention also relates to a kit comprising reagents which are specific for the detection of (i) IFNgamma, TNFalpha, and EGFR and / or (ii) IGFBP1 and RANTES; and optionally for PDGF-BB and / or IL-6, wherein the detection is preferably performed with a microarray or a test strip.

Basierend auf den Erkenntnissen, dass die vorstehend beschriebenen Proteine in Patienten mit NF1 und/oder einem NF1 assoziieren Tumor in veränderter Konzentration vorliegen und es sich bei den Proteinen um Zytokine bzw. Wachstumsfaktoren handelt, für die bekannt ist, dass sie in der Entstehung bzw. Nährstoffversorgung von Tumoren involviert sind, stellen die erfindungsgemäßen Biomarker auch Angriffspunkte zur Therapie bzw. Prävention von NF1 assoziierten Erkrankungen oder eines NF1 assoziierten Tumors dar. Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines Wirkstoffs, der ein Modulator eines der Proteine ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TNFalpha, INFgamma, EGFR, IGFBP1, RANTES, PDGF-BB und IL-6 zur Herstellung eines Medikamentes in der Behandlung eines Patienten mit NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumors, vorzugsweise wobei der Patient gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren diagnostiziert wurde.Based on the finding that the proteins described above are present in altered concentration in patients with NF1 and / or an NF1 associated tumor and that the proteins are cytokines or growth factors that are known to be present in the development or Nutrient supply of tumors are involved, the biomarkers according to the invention are also targets for the therapy or prevention of NF1 associated diseases or NF1 associated tumor dar. Therefore, the present invention also relates to the use of an active ingredient which is a modulator of one of the proteins selected from the A group consisting of TNFalpha, INFgamma, EGFR, IGFBP1, RANTES, PDGF-BB and IL-6 for the manufacture of a medicament in the treatment of a patient with NF1 and / or an NF1-associated tumor, preferably wherein the patient has been diagnosed according to the method of the invention.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines anti-Tumorwirkstoffes zur Herstellung eines Medikamentes in der Behandlung eines Patienten mit NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumors, wobei der Patient gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren diagnostiziert wurde. Further, the present invention relates to the use of an antitumor agent for the manufacture of a medicament in the treatment of a patient with NF1 and / or a NF1-associated tumor, wherein the patient has been diagnosed according to the method of the invention.

Weitere Ausführungsformen und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung und den Beispielen hervor.Other embodiments and advantages of the present invention will become apparent from the following description and examples.

Legende zu den AbbildungenLegend to the pictures

: Schematische Darstellung der Kandidatenauswahl und des Screening-Ablaufs. Die ursprüngliche Anzahl von 115 möglichen Serummarkern für NF1 Tumore bestanden aus Proteinen, die überexprimiert in PNF oder MPNST vorliegen sowie das Tumorwachstum verstärken (n = 79) oder immunmodulatorische Zytokine sind (n = 36). Die 115 Proteine wurden aus veröffentlichten Daten ausgewählt. 56 der 115 ursprünglich ausgewählten Proteine wurden in zwei Schritten gescreent, einmal zusammen mit Seren von 60 NF1-Patienten, wobei 5 Proteine mit signifikanten Unterschieden zwischen den Gruppen aufgefunden wurden. Diese 5 Proteine wurden mit 26 neuen Proteinen an insgesamt 104 NF1-Patienten untersucht. Insgesamt wurden bei dieser Untersuchung 6 Proteine aufgefunden, die signifikante Unterschiede zur Vergleichsgruppe zeigten. : Schematic representation of the candidate selection and the screening process. The original number of 115 possible serum markers for NF1 tumors consisted of proteins that are overexpressed in PNF or MPNST and that increase tumor growth (n = 79) or immunomodulatory cytokines (n = 36). The 115 proteins were selected from published data. 56 of the 115 originally selected proteins were screened in two steps, once with sera from 60 NF1 patients, finding 5 proteins with significant differences between the groups. These 5 proteins were studied with 26 new proteins in a total of 104 NF1 patients. In total, 6 proteins were found in this study, which showed significant differences to the comparison group.

: IL-6, IFNgamma und TNFalpha weisen signifikant erhöhte und EGFR signifikant erniedrigte Konzentrationen in Seren von NF1 Patienten auf. Quantitative Proteinarray Ergebnisse von Seren von 104 NF1-Patienten (NF1_total) verglichen zu 41 gesunden Kontrollen (Co) für (a) IL-6, (B) IFN-γ, (c) EGFR, (D) TNFα. Die Unterschiede sind hochsignifikant für (a) bis (d). Keiner der anderen getesteten Proteine zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Gruppen. Statistische Unterschiede werden durch nicht-parametrische Tests (Mann-Whitney U) umfassend der Bonferroni-Methode ausgewertet. : IL-6, IFNgamma and TNFalpha have significantly increased and significantly decreased EGFR concentrations in sera from NF1 patients. Quantitative protein array results from sera from 104 NF1 patients (NF1 _total ) compared to 41 healthy controls (Co) for (a) IL-6, (B) IFN-γ, (c) EGFR, (D) TNFα. The differences are highly significant for (a) to (d). None of the other proteins tested showed a significant difference between the two groups. Statistical differences are evaluated by non-parametric tests (Mann-Whitney U) comprising the Bonferroni method.

: Seren von NF1 Patienten weisen verglichen zu Kontrollpatienten einen signifikanten Unterschied der IFNgamma- und EGFR-Konzentration auf. Unterschiede der einzelnen Gruppen mit unterschiedlichen Tumorentitäten im Vergleich zu den Kontrollpatienten sind vorhanden, erreichen aber kein Signifikanzniveau. : Sera from NF1 patients show a significant difference in IFNgamma and EGFR concentration compared to control patients. There are differences between the individual groups with different tumor entities compared to the control patients, but they do not reach a level of significance.

: Seren von NF1 Patienten weisen verglichen zu gesunden Kontrollpatienten einen signifikanten Unterschied der IL-6- und TNFalpha-Konzentration auf. Signifikante Unterschiede der einzelnen NF1-Gruppen mit unterschiedlichen Tumorentitäten im Vergleich zu den Kontrollpatienten sind nicht vorhanden. : Sera from NF1 patients show a significant difference in IL-6 and TNFalpha concentrations compared to healthy control patients. Significant differences between the individual NF1 groups with different tumor entities compared to the control patients are absent.

: Die PDGF-BB Serumkonzentration in NF1 Patienten ist verglichen zu der Kontrollgruppe grenzwertig signifikant (p = 0,052). NF1 Patienten mit PNF Tumoren haben eine geringere PDGF-BB Konzentration verglichen zu NF1 Patienten ohne PNF (p = 0,013). : The PDGF-BB serum concentration in NF1 patients is borderline significant compared to the control group (p = 0.052). NF1 patients with PNF tumors have a lower PDGF-BB concentration compared to NF1 patients without PNF (p = 0.013).

: IGFBP1 und RANTES weisen signifikant erhöhte Konzentrationen in dem Serum von NF1 Patienten mit einem MPNST auf. Quantitative Proteinarray Ergebnisse von 41 gesunden Kontrollen und 104 NF1-Patienten Seren unterteilt in drei Gruppen: 35 NF1-Patienten ohne PNF und ohne MPNST (cNF), 39 NF1-Patienten mit PNF aber ohne MPNST und 30 NF1-Patienten mit MPNST. (A) IGFBP1 und (B) RANTES; (C) IGFBP1 Serumkonzentrationen in NF1-Patienten mit unterschiedlichen internen Tumorlasten bestimmt durch MRI-basierende Volumetrie (Nichts: 0 cm³, niedrig: 1–99 cm³; moderat: 100–500 cm³; hoch: ≥ 500 cm³). Statistische Unterschiede werden bei nicht-parametrischen Tests (Mann-Whitney U) getestet umfassend der Bonferroni-Methode. : IGFBP1 and RANTES have significantly elevated levels in the serum of NF1 patients with an MPNST. Quantitative protein array results from 41 healthy controls and 104 NF1 patients serums divided into three groups: 35 NF1 patients without PNF and no MPNST (cNF), 39 NF1 patients with PNF but no MPNST and 30 NF1 patients with MPNST. (A) IGFBP1 and (B) RANTES; (C) serum concentrations IGFBP1 in NF1 patients with different internal tumor burden determined by MRI-based volumetry (none: 0 cm ^3, low: 1-99 cm ^3; moderate: 100-500 cm ^3; high: ≥ 500 cm ^3). Statistical differences are tested in non-parametric tests (Mann-Whitney U) including the Bonferroni method.

: Der MPNST-Marker RANTES wird sowohl von MPNST Zellen selbst als auch von den infiltrierenden Lymphozyten produziert. Lichtmikroskopische Aufnahme eines immunhistochemisch angefärbten MPNST Paraffingewebeschnitts (Tumor ID 28044). Das RANTES Protein wurde mit Hilfe eines polyklonalen Kaninchen anti-humanen RANTES Antikörpers (1:100, ab9679, Abcam Inc.) nachgewiesen. Nach erneutem Waschen erfolgte die Inkubation mit dem biotinyliertem Sekundärantikörper, Streptavidin Peroxidase und DAB unter Nutzung des ”Dako REALTM Detection system” (Dako REALTM Detection system, peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse, code K5001, Dako, Denmark A/S) für automatisiertes Färben. Schließlich erfolgte eine Gegenfärbung der Zellkerne mit Hämatoxylin. : The MPNST marker RANTES is produced both by MPNST cells themselves and by the infiltrating lymphocytes. Light microscopic image of an immunohistochemically stained MPNST paraffin tissue section (tumor ID 28044). The RANTES protein was detected using a polyclonal rabbit anti-human RANTES antibody (1: 100, ab9679, Abcam Inc.). After washing again, the incubation with the biotinylated secondary antibody, streptavidin peroxidase and DAB using the "Dako REALTM detection system" (Dako REALTM detection system, peroxidase / DAB +, Rabbit / Mouse, code K5001, Dako, Denmark A / S) for automated To dye. Finally, the nuclei were counterstained with hematoxylin.

: IGFBP1 wird von MPNST Tumoren exprimiert. ELISA Assay zum Nachweis von humanem IGFBP1 in Zellkulturüberständen der MPNST Zelllinien ST88-14, 1507-2, 5462, T462 T265 und STS26T: Das in das Medium sekretierte IGFBP1 wird mittels HRP-gebundenem Streptavidin nachgewiesen, wobei die gemessene Farbintensität proportional zur Menge an IGFBP1 in der Probe ist. IGFBP1 Konzentrationen wurden nach 24, 36 und 48 Stunden nach dem Aussäen der Zellen bestimmt. : IGFBP1 is expressed by MPNST tumors. ELISA assay for the detection of human IGFBP1 in cell culture supernatants of MPNST cell lines ST88-14, 1507-2, 5462, T462 T265 and STS26T: IGFBP1 secreted into the medium is detected by HRP-bound streptavidin, with the measured color intensity is proportional to the amount of IGFBP1 in the sample. IGFBP1 concentrations were determined after 24, 36 and 48 hours after seeding of the cells.

: T Lymphozyten produzieren TNFalpha und IFNgamma. Phorbol Myristat Acetat(PMA)-Ionomycin-induzierte Sektretion der intrazelluläre Zytokine wurde mittels FACS Analyse an CD3+/CD4+ bzw. CD3+/CD8+ positiven T-Zellen von Kontrollpatienten (KO) und NF1 Patienten (NF1) untersucht. Die Menge des produzierten Zytokins wurde mittels anti-TNFalpha Antikörper (A) bzw. anti-IFNgamma Antikörper (B) bestimmt. Es zeigte sich, das CD8+ T-Zellen von NF1-Patienten mehr TNFalpha und IFNgamma produzieren als entsprechende Vergleichszellen von nicht-NF1 Personen. Die Unterschiede waren aber nicht signifikant (TNFalpha p = 0,102 und IFNgamma p = 0,233). : T lymphocytes produce TNFalpha and IFNgamma. Phorbol myristate acetate (PMA) -Ionomycin-induced secretion of intracellular cytokines was studied by FACS analysis on CD3 + / CD4 + and CD3 + / CD8 + positive T cells from control (KO) and NF1 (NF1) patients, respectively. The amount of cytokine produced was determined by anti-TNFalpha antibody (A) and anti-IFNgamma antibody (B), respectively. It was found that CD8 + T cells from NF1 patients produce more TNFalpha and IFNgamma than corresponding control cells from non-NF1 individuals. The differences were not significant (TNFalpha p = 0.102 and IFNgamma p = 0.233).

: IL-6, IFNγ, TNFα, EGFR, IGFBP1 und RANTES weisen diagnostisches Potential auf. ROC-Kurven hinsichtlich der Unterscheidung zwischen NF1-Gruppen und Kontrollgruppen für (A) IL-6, (B) IFNγ, (C) TNFα und (D) EGFR; die ROC-Kurven zur Unterscheidung zwischen NF1-Patienten mit oder ohne MPNST sind in (E) für IGFBP1 und (F) für RANTES gezeigt. : IL-6, IFNγ, TNFα, EGFR, IGFBP1 and RANTES have diagnostic potential. ROC curves for the distinction between NF1 groups and control groups for (A) IL-6, (B) IFNγ, (C) TNFα and (D) EGFR; the ROC curves for distinguishing NF1 patients with or without MPNST are shown in (E) for IGFBP1 and (F) for RANTES.

Tab. 1: Charakteristika der Patienten- und Kontrollkohorten. Angabe von Anzahl, Alter, Geschlecht und Ganzkörper MRT je Gruppe.Tab. 1: Characteristics of patient and control cohorts. Indication of number, age, sex and whole body MRI per group.

Tab. 2: Überblick über die Serummarkereigenschaften bei 90%iger Sensitivität. Die Prävalenz der NF1 Marker wurde bei 0.5 gesetzt, da nur ausgewählte Personen untersucht werden wie z. B. Kinder von NF1-Eltern. Diese haben ein 50%iges Risiko eine NF1 Mutation zu tragen. Die Prävalenz für MPNST bei NF1 Patienten wurde auf 10% geschätzt (der geschätzte Wert bezieht sich auf erwachsene NF1 Patienten mit PNF).Tab. 2: Overview of the serum marker properties at 90% sensitivity. The prevalence of NF1 markers was set at 0.5, as only selected individuals, such as B. Children of NF1 parents. These have a 50% risk of carrying an NF1 mutation. The prevalence for MPNST in NF1 patients was estimated at 10% (the estimated value refers to adult NF1 patients with PNF).

Definitionendefinitions

Wenn nicht anders bezeichnet, werden die hierverwendeten Begriffe gemäß ihrer Definitionen, wie in dem Oxford dictionary of biochemistry and molecular biology, Oxford University Press, 1997, wiederaufgelegt 2003, ISBN 0 19 850673 2 , verwendet.Unless otherwise indicated, the terms used herein will be construed according to their definitions as in Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997, relaunched 2003, ISBN 0 19 850673 2 , used.

Soweit nachfolgend der Kontext nicht eindeutig etwas anderes ergibt, ist bei der Verwendung von Singular-Formen bzw. Plural-Formen stets sowohl die Mehr- als auch die Einzahl umfasst.Unless the context clearly indicates otherwise, the use of singular forms or plural forms always includes both the multiple and the singular.

Der Begriff ”Patient oder NF1 Patient”, ”Erkrankter oder NF1 Erkrankter” oder ”Betroffener oder NF1 Betroffener” wird im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung in austauschbarerweise verwendet und umfasst Menschen als auch Tiere, vorzugsweise aber Menschen.The term "patient or NF1 patient", "subject or NF1 subject" or "affected or NF1 affected" is used interchangeably in the context of the present invention and includes humans as well as animals, but preferably humans.

Der Begriff ”Probe” bezeichnet eine biologische Probe, die für die ex vivo oder in vitro Untersuchung verwendet wird. Die Patienten und die Kontrollprobe können nach der Untersuchung vernichtet werden oder für weitere Untersuchung adäquat aufbewahrt werden.The term "sample" refers to a biological sample used for ex vivo or in vitro study. Patients and the control sample may be destroyed after the examination or adequately stored for further examination.

Der hier verwendetet Begriff ”Körperflüssigkeit” kann jede Flüssigkeit des Körpers darstellen, wie beispielsweise, Blut, Spuktum, Urin, Gehirn- oder Lymphflüssigkeit, Speichel, Samen, Extremente, Zellen oder Proteine und dessen Fragmente, katalytische Produkte und Vorstufen die in einer Körperflüssigkeit gelöst vorliegen und innerhalb des Körpers zirkulieren. Vorzugsweise handelt es sich bei der Probe um Serum.The term "body fluid" as used herein may represent any fluid of the body such as blood, sputum, urine, brain or lymph fluid, saliva, semen, extrins, cells or proteins and fragments thereof, catalytic products and precursors dissolved in a body fluid exist and circulate within the body. Preferably, the sample is serum.

Die Begriffe ”Marker”, ”Proteinmarker” oder ”Biomarker”, werden im Kontext der vorliegenden Erfindung in austauschbarer Weise verwendet und bezeichnen allgemein die erfindungsgemäßen Proteine oder Fragmente davon. ”Proteine oder Fragmente davon” im Sinne der Erfindung können alle Markerproteine oder Fragmente davon, die in vivo vorkommen oder die in vitro erzeugt werden können (z. B. durch Mischen einer Probe mit einer Protease oder chemische Substanzen, wie CNBr).The terms "marker", "protein marker" or "biomarker" are used interchangeably in the context of the present invention and generally refer to the proteins or fragments thereof of the invention. "Proteins or fragments thereof" within the meaning of the invention may be any marker proteins or fragments thereof which may be present in vivo or which may be generated in vitro (eg by mixing a sample with a protease or chemical substances such as CNBr).

Die Begriffe ”Fragment”, ”Peptid” und ”Protein” werden hier austauschbar verwendet, um ein Polymer von Aminosäureresten zu beschreiben. Die Begriffe beziehen sich auf Aminosäurepolymere, in denen ein oder mehr Aminosäurereste ein künstliches chemisches Mimetikum einer entsprechenden natürlich vorkommenden Aminosäure ist, sowie auch auf natürlich vorkommende Aminosäurepolymere und nicht natürlich vorkommende Aminosäurepolymere. Wie hier verwendet, umfassen die Begriffe Aminosäureketten jeder Länge, einschließlich Volllängenproteine (d. h., Antigene), wobei die Aminosäurereste über kovalente Peptidbindung gebunden sind.The terms "fragment", "peptide" and "protein" are used interchangeably herein to describe a polymer of amino acid residues. The terms refer to amino acid polymers in which one or more amino acid residues is an artificial chemical mimetic of a corresponding naturally occurring amino acid, as well as naturally occurring amino acid polymers and non-naturally occurring amino acid polymers. As used herein, the terms encompass amino acid chains of any length, including full-length proteins (i.e., antigens), where the amino acid residues are attached via covalent peptide bonding.

Der Begriff ”Behandlung”, ”behandeln”, ”lindern” ”bekämpfen” und Ähnliches wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung in austauschbarer Weise verwendet und bedeutet, dass ein pharmakologischer Effekt und/oder physiologischer Effekt erzielt werden soll. Dieser Effekt kann prophylaktisch sein, im Sinne dass die Ausprägung der NF1 Krankheit oder assoziierte Symptome vollständig oder teilweise unterbunden werden oder der Effekt kann therapeutischer Natur sein, so dass eine vollständige oder teilweise Genesung von einem NF1 assoziierten Tumor oder anderer NF1 assoziierten Symptome erzielt wird. The term "treatment", "treat", "alleviate""combat" and the like is used interchangeably in the context of the present invention and means that a pharmacological effect and / or physiological effect is to be achieved. This effect may be prophylactic in the sense that the expression of NF1 disease or associated symptoms is completely or partially arrested, or the effect may be of a therapeutic nature to achieve complete or partial recovery from an NF1-associated tumor or other NF1-associated symptoms.

”Inhibitor” ist jede Substanz, welche eine physiologische Aktion oder Antwort verhindert oder vermindert."Inhibitor" is any substance that prevents or reduces a physiological action or response.

Die Begriffe ”induzieren”, ”inhibieren”, ”erhöhen”, ”erniedrigen”, ”sinken” oder Vergleichbares, beziehen sich auf einen quantitativen Unterschied zwischen zwei Werten/Leveln/Konzentrationen und bezeichnen zumindest einen signifikanten Unterschied zwischen diesem beiden Werten/Leveln/Konzentrationen. Zum Beispiel drückt die Bezeichnung ”wobei das Vorliegen einer dieser Proteine oder Fragmente davon in veränderter Konzentration im Vergleich zu deren Konzentration in einer Referenzprobe ...” aus, dass das der Wert/Level/Konzentration oder Expression eines der erfindungsgemäßen Proteine oder Fragmente davon in einer zu untersuchenden Probe statistisch signifikant unterschiedlich ist im Vergleich zu dem Wert/Level/Konzentration oder Expression des eines der erfindungsgemäßen Proteine oder Fragmente davon zu einem gesunden bzw. nicht NF1 Patienten.The terms "induce", "inhibit", "increase", "decrease", "decrease" or the like refer to a quantitative difference between two values / levels / concentrations and indicate at least one significant difference between these two values / levels / concentrations. For example, the term "wherein the presence of one of these proteins or fragments thereof in altered concentration relative to their concentration in a reference sample ..." expresses that the value / level / concentration or expression of one of the proteins of the invention or fragments thereof in A sample to be tested is statistically significantly different in comparison to the value / level / concentration or expression of one of the proteins of the invention or fragments thereof to a healthy or not NF1 patient.

Unter den Begriff ”Reagenzien, die spezifisch für den Nachweis von mindestens einem Protein sind”, ”Reagenz, das spezifisch für ein Protein ist” bzw. ”spezifisches Reagenz oder Mittel” werden gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise ”Bindungsmoleküle” bzw. ein Bindungsmolekül wie Antikörper und deren Antigen-bindende Fragmente verstanden, die spezifisch an ein Zielprotein oder Fragment davon binden. Ebenso umfasst sind aber auch äquivalente, nicht auf Antikörper beruhende Bindungsmoleküle die an die hier beschriebenen Proteine, d. h. Biomarker binden, einschließlich aber nicht beschränkt auf Hormone, Rezeptoren und deren Bindungsdomänen, Liganden, Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Moleküle, Chaperone wie Hitzeschockproteine (HSPs) sowie Zell-Zelladhäsionsmoleküle wie Mitglieder der Cadherin, Intergrin, C-type Lektin and Immunoglobulin (Ig) Superfamilien. Neben Protein-basierenden Bindungsmolekülen kommen auch Nukleinsäuren, beispielsweise RNA-Moleküle in Betracht, die so genannten Aptamere, die zur Bindung an biologische Moleküle dienen können und aufgrund der Affinität und Spezifität zu therapeutischen oder diagnostischen Zwecken eingesetzt werden können, wie dies auch mit Hilfe von Antikörper der Fall ist. Genauso wie Antikörper und ähnliche Bindungsmoleküle können Aptamere in vitro und/oder in silico auf ein besseres Bindungsverhalten optimiert werden. Eine bevorzugte RNA-Spezies als Bindungsmolekül werden Spiegelmere eingesetzt, die spiegelverkehrte RNA-Abschnitte und daher resistent gegen enzymatischen Abbau sind. Ansonsten kommen aufgrund der im Stand der Technik entwickelten kombinatorischen Substanzbibliotheken und Screeningverfahren grundsätzlich natürlich auch andere Molekülklassen in Betracht, die auf die Bindung eines der in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Proteine selektioniert werden können. In einer Ausführungsform werden unter den vorgenannten Begriffen auch Mittel zum Nachweis der Genexpression beispielsweise der mRNA des betreffenden Proteins umfasst, d. h. Nukleinsäure-Sonden wie DNA oder RNA Oligonukleotide, sofern deren Nachweis zu vergleichbaren, d. h. im Wesentlichen identischen oder ähnlichen Ergebnissen wie der Nachweis des entsprechenden Proteins führt. Grundsätzlich werden allerdings unter den Begriffen ”Reagenz” und ”Mittel” besonders bevorzugt Bindungsmoleküle verstanden, die Nachweis des Proteins oder Fragmenten davon geeignet sind.The term "reagents which are specific for the detection of at least one protein", "reagent which is specific for a protein" or "specific reagent or agent" are according to the present invention preferably "binding molecules" or a binding molecule such as Antibodies and their antigen-binding fragments understood that bind specifically to a target protein or fragment thereof. Equally encompassed, however, are equivalent non-antibody-based binding molecules that bind to the proteins described herein, i. H. Biomarkers bind, but are not limited to, hormones, receptors and their binding domains, ligands, major histocompatibility complex (MHC) molecules, chaperones such as heat shock proteins (HSPs) and cell-cell adhesion molecules such as cadherin, intergrin, C-type lectin and immunoglobulin (Ig) superfamily members , In addition to protein-based binding molecules are also nucleic acids, for example RNA molecules into consideration, the so-called aptamers, which can serve for binding to biological molecules and can be used for therapeutic or diagnostic purposes due to the affinity and specificity, as with the aid of Antibody is the case. Just like antibodies and similar binding molecules, aptamers can be optimized in vitro and / or in silico for better binding behavior. A preferred RNA species as a binding molecule spiegelmers are used, which are mirror-inverted RNA sections and therefore resistant to enzymatic degradation. Otherwise, due to the combinatorial substance libraries and screening methods developed in the prior art, it is of course also possible to use other classes of molecules which can be selected for the binding of one of the proteins described in the present application. In one embodiment, the aforementioned terms also include means for detecting gene expression, for example, the mRNA of the protein in question, i. H. Nucleic acid probes such as DNA or RNA oligonucleotides, if their detection is comparable, d. H. result in substantially identical or similar results as the detection of the corresponding protein. In principle, however, the terms "reagent" and "agent" are particularly preferably understood to mean binding molecules which are suitable for detection of the protein or fragments thereof.

Der Klarheit wegen werden zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung deren nachfolgenden Ausführungsformen wie auch die Beispiele im Wesentlichen anhand von Antikörpern illustriert, ohne dass dies als Einschränkung auf diese Klasse von Bindungsmolekülen verstanden wird.For the sake of clarity, in order to explain the present invention, its subsequent embodiments as well as the examples will be illustrated essentially with the aid of antibodies, without this being understood as a restriction to this class of binding molecules.

Der Ausdruck ”bindet spezifisch” oder ”spezifisch für den Nachweis”, wenn auf ein Protein bzw. Biomarker oder Fragmenten davon bezogen bezieht sich auf eine Bindungsreaktion, die bestimmend ist für das Vorhandensein des Proteins in Anwesenheit einer heterogenen Population von Proteinen und anderen biologischen Wirkstoffen. Daher, unter bestimmten Immunoassay-Bedingungen, binden die näher beschriebenen Antikörper oder Fragmente davon, Aptamere oder Spiegelmere an ein bestimmtes Protein und binden nicht in einer signifikanten Menge an andere Markerproteine oder Fragmente davon, die in der Probe vorhanden sind. Typischerweise wird eine spezifische oder selektive Reaktion mindestens dem zweifachen Hintergrundsignal oder Rauschen entsprechen, und noch typischerweise mehr als dem 10- bis 100-facher Hintergrund.The term "binds specific" or "specific for detection" when referring to a protein or biomarker or fragments thereof refers to a binding reaction that is determinative of the presence of the protein in the presence of a heterogeneous population of proteins and other biologically active substances , Therefore, under certain immunoassay conditions, the more specifically described antibodies or fragments thereof, aptamers or spiegelmers bind to a particular protein and do not bind in a significant amount to other marker proteins or fragments thereof present in the sample. Typically, a specific or selective response will be at least twice the background signal or noise, and more typically more than 10 to 100 times the background.

Der Begriff ”Konzentration” oder ”veränderte Konzentration” wird gleichbedeutend mit dem Begriff ”Wert”, ”Referenzwert”, oder ”Level” der erfindungsgemäßen Proteine oder Fragmente davon bezeichnet und meint die Menge eines Proteins oder Fragment davon in einer Probe, wobei eine veränderte Konzentration signifikant ist, wenn sie eine Abweichung in Bezug auf den Referenzwert von mindestens 5%, 10%, 20% 30% 40% 50% 60% oder 70% aufweist, bevorzugt eine Abweichung von mindestens 5% verglichen zu einem Referenzwert aufweist.The term "concentration" or "altered concentration" is synonymous with the term "value", "reference value", or "level" of the proteins of the invention or fragments thereof, and means the amount of a protein or fragment thereof in a sample, wherein a changed concentration is significant if it has a deviation with respect to the reference value of at least 5%, 10%, 20% 30% 40% 50% 60% or 70% , preferably has a deviation of at least 5% compared to a reference value.

”Zytokine” sind von Zellen gebildete Substanzen, die als Vermittler die Aktivität anderer Zellen beeinflussen. Dazu gehören beispielsweise Wachstumsfaktoren. Weiterhin gibt es Zytokine, die die Entzündungsreaktion hemmen und Zytokine, die die Entzündungsreaktion fördern. Entzündungsreations-fördernde Zytokine, auch entzündliche/inflammatorische Zytokine genannt sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung der Interferon gamma (IFNgamma), Tumornekrosefaktor apha (TNFalpha), Interleukin 6 (IL-6) und Regulated an Activation, Normal T cell Expressed and Secreted (RANTES) die dem Fachmann gut bekannt und ausführlich in der der Literatur beschrieben sind; siehe beispielsweise in den Referenzen [51] für IFNgamma, [46, 48] für TNFalpha, [54] für IL-6 und [58] für RANTES."Cytokines" are substances formed by cells, which, as mediators, influence the activity of other cells. These include, for example, growth factors. There are also cytokines that inhibit the inflammatory response and cytokines that promote the inflammatory response. Inflammatory-stimulating cytokines, also called inflammatory / inflammatory cytokines, are within the scope of the present invention interferon gamma (IFNgamma), tumor necrosis factor apha (TNFalpha), interleukin 6 (IL-6) and Regulated on Activation, Normal T cell Expressed and Secreted (RANTES ) well known to those skilled in the art and described in detail in the literature; see, for example, References [51] for IFNgamma, [46, 48] for TNFalpha, [54] for IL-6, and [58] for RANTES.

”Wachtumsfaktoren” sind gemäß der vorliegenden Erfindung Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor Bindungsprotein-1 (IGFBP-1), human Platelet-Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB), Der epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR), kann mit EGF sowie TNFalpha interagieren. Diese Faktoren die dem Fachmann gut bekannt und ausführlich in der der Literatur beschrieben sind; siehe beispielsweise in den Referenzen [52] für IGFBP-1, [59] für PDGF-BB, und [46] für EGFR."Growth factors" according to the present invention are insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1), human platelet-derived growth factor BB (PDGF-BB), the epidermal growth factor receptor (EGFR), may interact with EGF as well as TNFalpha. These factors are well known to those skilled in the art and described in detail in the literature; see for example references [52] for IGFBP-1, [59] for PDGF-BB, and [46] for EGFR.

”Inhibitoren”, ”Aktivatoren”, und ”Modulatoren” von Zytokinrezeptoraktivität werden verwendet, um inhibierende, aktivierende, bzw. modulierende Moleküle zu beschreiben, die durch die Verwendung von in vitro- und in vivo-Assays für Zytokinrezeptorbindung oder Signalweiterleitung identifiziert wurden, z. B., Liganden, Agonisten, Antagonisten, und deren Homologe und Mimetika."Inhibitors," "activators," and "modulators" of cytokine receptor activity are used to describe inhibitory, activating, or modulating molecules identified by the use of in vitro and in vivo assays for cytokine receptor binding or signal transduction, e.g. , B., ligands, agonists, antagonists, and their homologues and mimetics.

Der Begriff ”Wirkstoff” schließt Inhibitoren und Aktivatoren ein. Inhibitoren sind Wirkstoffe, die z. B., an Zytokinrezeptoren binden, teilweise oder vollständig die Stimulation blocken, deren Aktivierung erniedrigen, verhindern, die Aktivität verzögern, inaktivieren, desensitivieren, oder herunter regulieren, z. B., Antagonisten. Aktivatoren sind Wirkstoffe, die, z. B., an Zytokinrezeptoren binden, deren Aktivierung stimulieren, erhöhen, öffnen, aktivieren, erleichtern, verstärken, die Aktivität sensitivieren, oder hochregulieren, z. B., Agonisten. Modulatoren schließen Wirkstoffe ein, die z. B. die Wechselwirkung von Zytokinrezeptoren mit: Proteinen, die Aktivatoren oder Inhibitoren binden, Rezeptoren, einschließlich G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), Kinasen, etc., verändern. Wirkstoffe schließen genetisch modifizierte Versionen von natürlich vorkommenden Zytokinrezeptor-Liganden ein, z. B., mit veränderter Aktivität, sowie natürlich vorkommende und synthetische Liganden, Antagonisten, Agonisten, kleine chemische Moleküle und Ähnliches. Proben oder Assays, die Zytokinrezeptoren umfassen, die mit einem potentiellen Aktivator, Inhibitor oder Modulator behandelt sind, werden mit Kontrollproben ohne den Inhibitor, Aktivator, oder Modulator verglichen, um das Ausmaß der Inhibition zu bestimmen. Kontrollproben (nicht mit den Inhibitoren behandelt) wird ein relativer Zytokinrezeptor-Aktivitätswert von 100% zugeordnet. Inhibierung eines Zytokinrezeptors ist erreicht, wenn der Zytokinrezeptor-Aktivitätswert im Vergleich zur Kontrolle ungefähr 80%, 70% 60% gegebenenfalls 50% oder 25-0% beträgt. Aktivierung eines Zytokinrezeptors ist erreicht, wenn der Zytokinrezeptor-Aktivitätswert im Vergleich zur Kontrolle 110%, gegebenenfalls 150%, gegebenenfalls 200–500%, oder 1000–3000% höher ist.The term "drug" includes inhibitors and activators. Inhibitors are agents that z. B., bind to cytokine receptors, partially or completely block the stimulation, reduce their activation, prevent, delay the activity, inactivate, desensitize or down regulate, for. B., antagonists. Activators are agents that, for. B. bind to cytokine receptors, stimulate their activation, increase, open, activate, facilitate, enhance, sensitize the activity, or upregulate, z. B., agonists. Modulators include agents that z. For example, the interaction of cytokine receptors with proteins that bind activators or inhibitors can alter receptors, including G protein-coupled receptors (GPCRs), kinases, etc. Agents include genetically modified versions of naturally occurring cytokine receptor ligands, e.g. With altered activity, as well as naturally occurring and synthetic ligands, antagonists, agonists, small chemical molecules, and the like. Samples or assays comprising cytokine receptors treated with a potential activator, inhibitor or modulator are compared to control samples without the inhibitor, activator, or modulator to determine the extent of inhibition. Control samples (not treated with the inhibitors) are assigned a relative cytokine receptor activity value of 100%. Inhibition of a cytokine receptor is achieved when the cytokine receptor activity value is approximately 80%, 70% 60%, optionally 50% or 25-0%, as compared to the control. Activation of a cytokine receptor is achieved when the cytokine receptor activity value is greater than 110%, optionally 150%, optionally 200-500%, or 1000-3000% higher than the control.

Ausführliche Beschreibung der ErfindungDetailed description of the invention

Im Allgemeinen betrifft die vorliegende Erfindung diagnostische Mittel und Medikamente zur Diagnose, Prävention und Behandlung der Neurofibromatose Typ 1 (NF1) und zur Früherkennung bzw. Prognoseabschätzung sowie Behandlung von NF1 assoziierten Tumoren.In general, the present invention relates to diagnostic agents and medicaments for the diagnosis, prevention and treatment of neurofibromatosis type 1 (NF1) and for the early detection and prediction as well as treatment of NF1-associated tumors.

Wie in den Beispielen gezeigt, wurde in Experimenten, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden mittels Antikörper-basierter Microarray-Technologie 58 nach erfindungsgemäß zusammengestellten Kriterien ausgewählte Proteine, die potentiell vom Körper sekretiert werden auf ihr diagnostisches Potential bei NF1 Patienten untersucht. In diesen Experimenten konnten im Blutserum von NF1 Betroffenen mehrere Proteine identifiziert werden, die im Vergleich zu nicht NF1-Erkrankten eine signifikant veränderte Serumkonzentration aufwiesen: EGFR, IFNgamma, IL-6, TNFalpha. Bis auf EGFR zeigten diese Proteine eine erhöhte Serumkonzentration bei NF1-Patienten. Die Proteine IGFBP1 und RANTES zeigten bei NF1-Patienten mit MPNST eine signifikant höhere Serumkonzentration im Vergleich zu NF1-Patienten ohne MPNST und das Protein PDGF-BB zeigt bei NF1-Patienten mit plexiformen Neurofibromen eine signifikant niedrigere Serumkonzentration im Vergleich zu NF1-Patienten ohne plexiforme Neurofibrome. Dementsprechend wird gemäß der vorliegenden Erfindung erstmals ein Set von Biomarkern bereitgestellt, mit deren Nachweis es möglich ist NF1 und assoziierte Tumore frühzeitig zu diagnostizieren, und vorteilhafterweise zwischen der Ausprägung bzw. Vorhandensein von NF1, NF1 assoziierten malignen peripheren Nervenscheidentumor (MPNST) und plexiformen Neurofibrom (PNF) zu differenzieren und zudem die Tumorlast in NF1-Patienten zu bestimmen, was beispielweise hilfreich in der Dosierung einer Chemotherapie ist. Da die vorgenannten Biomarker in Serum nachgewiesen werden, das einfach zu gewinnen und reproduzierbare Ergebnisse erlaubt, stellt die vorliegende Erfindung Serummarker zur frühzeitigen, zuverlässigen und kostengünstigen Diagnose von NF1 und NF1 assoziierter Tumore, insbesondere MPNST zu Verfügung. Es wird davon ausgegangen, dass das erfindungsgemäße Verfahren große Relevanz in der klinischen Praxis erlangen wird, da besonders bei NF1-Sonderformen und Kindern mit wenigen Symptomen die Diagnosestellung bisher schwierig ist, da bisher keine Serummarker zur Diagnose von NF1 bzw. MPNST oder anderweitige, nicht-invasive und praktizierbare Nachweisverfahren zur Verfügung stehen. Da eine frühzeitige Operation die derzeit einzige therapeutische Option darstellt, könnte die Überlebenschance eines MPNST Patienten (Überlebenszeit bisher 17 Monate) durch eine frühzeitige Diagnosestellung extrem verbessert werden.As demonstrated in the Examples, in experiments conducted within the scope of the present invention, antibodies selected based on the criteria of the present invention have been screened for their diagnostic potential in NF1 patients using antibodies based microarray technology. In these experiments, several proteins could be identified in the blood serum of NF1 sufferers, which had a significantly altered serum concentration compared to non-NF1 patients: EGFR, IFNgamma, IL-6, TNFalpha. Except for EGFR, these proteins showed an increased serum concentration in NF1 patients. Proteins IGFBP1 and RANTES showed a significantly higher serum concentration in NF1 patients with MPNST compared to NF1 patients without MPNST, and the protein PDGF-BB shows a significantly lower serum concentration in NF1 patients with plexiform neurofibromas compared to non-plexiform NF1 patients neurofibromas. Accordingly, according to the present invention, a set of biomarkers is provided for the first time with their detection it is possible to early diagnose NF1 and associated tumors, and to advantageously differentiate between the presence or presence of NF1, NF1 associated malignant peripheral nerve sheath tumor (MPNST) and plexiform neurofibroma (PNF) and, in addition, to determine the tumor burden in NF1 patients For example, it is helpful in the dosage of chemotherapy. Since the aforementioned biomarkers are detected in serum which is easy to obtain and allows reproducible results, the present invention provides serum markers for the early, reliable and cost-effective diagnosis of NF1 and NF1 associated tumors, in particular MPNST. It is assumed that the method according to the invention will acquire great relevance in clinical practice, since in particular in NF1 special forms and children with few symptoms the diagnosis is difficult so far, since no serum markers for the diagnosis of NF1 or MPNST or otherwise, not -Invasive and practicable detection methods are available. Since early surgery is currently the only therapeutic option, early survival of an MPNST patient (survival 17 months) could be greatly improved by early diagnosis.

Daher wird ein in vitro Verfahren bereit gestellt zur Diagnose und/oder Früherkennung einer Neurofibromatose Typ 1 (NF1) und/oder eines NF1 assoziierten Tumor, umfassend den Nachweis mindestens eines Proteins ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tumor Nekrose Faktor alpha (TNFalpha), Interferon gamma (IFNgamma), Epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR), Insulin ähnlicher Wachstumsfaktor Bindungsprotein-1 (IGFBP-1), Regulated an Activation, Normal T cell Expressed and Secreted (RANTES) und humaner Platelet-Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) oder eines Fragments einer dieser Proteine in einer Probe von einem Patienten, wobei das Vorliegen einer dieser Proteine oder Fragmente davon in veränderter Konzentration im Vergleich zu deren Konzentration in einer Referenzprobe das Vorliegen und/oder die Entwicklung einer NF1 oder eines NF1 assoziierten Tumor anzeigt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren auch den Nachweis von Interleukin 6 (IL-6).Therefore, an in vitro method is provided for the diagnosis and / or early detection of a neurofibromatosis type 1 (NF1) and / or an NF1 associated tumor, comprising the detection of at least one protein selected from the group consisting of tumor necrosis factor alpha (TNFalpha), interferon Gamma (IFNgamma), Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR), Insulin-like Growth Factor Binding Protein-1 (IGFBP-1), Regulated to Activation, Normal T cell Expressed and Secreted (RANTES), and Human Platelet-Derived Growth Factor BB (PDGF-BB) or a fragment of one of these proteins in a sample from a patient, wherein the presence of one of these proteins or fragments thereof in altered concentration relative to their concentration in a reference sample indicates the presence and / or development of an NF1 or NF1 associated tumor. In a preferred embodiment, the method according to the invention also comprises the detection of interleukin 6 (IL-6).

So stellt die vorliegende Erfindung ein Nachweisverfahren bereit, das sich zur Früherkennung und/oder Diagnose von NF1 Störung in einem Individuum eignet. In Ausführungsformen umfasst das erfindungsgemäße Verfahren das Auffinden der Werte der TNFalpha, IFNgamma, EGFR, RANTES, PDGF-BB, IGFBP-1 sowie IL-6 Proteinen oder Fragmenten davon in einer Körperflüssigkeitsprobe eines Individuums und des Vergleichens zu einer Referenzprobe, wobei die Anwesenheit von einer veränderten Menge der Markerproteine oder Fragmente davon als die der vorbestimmten Menge die Wahrscheinlichkeit einer Neurofibromatose Typ 1 Störung anzeigt.Thus, the present invention provides a detection method useful for the early detection and / or diagnosis of NF1 disorder in an individual. In embodiments, the method of the invention comprises finding the values of the TNFα, IFNγ, EGFR, RANTES, PDGF-BB, IGFBP-1 and IL-6 proteins or fragments thereof in a body fluid sample of an individual and comparing them to a reference sample, wherein the presence of an altered amount of the marker proteins or fragments thereof than that of the predetermined amount indicates the likelihood of a neurofibromatosis type 1 disorder.

Die Vielseitigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigt sich in den experimentellen Daten, die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden. So deuten die experimentellen Daten der vorliegenden Erfindung darauf hin, dass der Grad der immunologischen Deregulation indirekt das Risiko für Tumorwachstum und maligne Transformation erhöht. Wie aus Beispiel 2 und ersichtlich, sind die Serumkonzentration der vier Proteine IL-6, TNFalpha, IFNgamma, EGFR zwischen NF1-Patienten und gesunden Subjekten unterschiedlich. Dabei sind die Konzentration des epithelialen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) signifikant geringer in NF1-Patienten verglichen zu gesunden Subjekten, wobei die inflammotrischen Zytokine IFγ, TNF-α und IL-6 einen signifikant höheren Serumlevel in NF1-Patienten zeigen.The versatility of the method of the invention is demonstrated in the experimental data conducted in connection with the present invention. Thus, the experimental data of the present invention suggest that the degree of immunological deregulation indirectly increases the risk of tumor growth and malignant transformation. As from example 2 and As can be seen, the serum concentrations of the four proteins IL-6, TNFalpha, IFNgamma, EGFR are different between NF1 patients and healthy subjects. The concentration of the epithelial growth factor receptor (EGFR) is significantly lower in NF1 patients compared to healthy subjects, with the inflammatory cytokines IFγ, TNF-α and IL-6 showing a significantly higher serum level in NF1 patients.

So kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren durch den Nachweis eines veränderten Wertes der TNFalpha, IFNgamma, EGFR sowie zusätzlich des IL-6 Proteins oder Fragments davon in einer Probe eines Individuums, verglichen zu Werten, die für Nicht-NF1-Betroffene charakteristisch sind, eine Aussage darüber getroffen werden, ob das zu untersuchende Individuum eine NF1 Erkrankung aufweist. Wobei ein erhöhter Wert für TNFalpha, IFNgamma und IL-6 und ein erniedrigter Wert für EGFR in einer zu untersuchenden Probe verglichen zu Referenzwerten, auf eine NF1 Erkrankung hindeutet. In diesem Zusammenhang ist der Nachweis von mindestens zwei der erfindungsgemäßen Markerproteine besonders vorteilhaft um eine zuverlässige Aussage darüber zu erhalten ob ein Individuum eine NF1 Störung aufweist.Thus, with the method according to the invention by the detection of an altered value of TNFalpha, IFNgamma, EGFR and additionally the IL-6 protein or fragment thereof in a sample of an individual, compared to values that are characteristic of non-NF1-affected, a statement whether the individual to be examined has NF1 disease. An increased value for TNFalpha, IFNgamma and IL-6 and a decreased value for EGFR in a sample to be tested compared to reference values indicate an NF1 disease. In this context, the detection of at least two of the marker proteins according to the invention is particularly advantageous in order to obtain a reliable statement as to whether an individual has an NF1 disorder.

Kürzlich wurde in der Veröffentlichung von Lasater et al., Journal of Clinical Investigation 120 (2010), 859–70 gezeigt, dass NF1-Patienten Anzeichen einer chronischen Entzündung aufweisen und es wurde vermutet, dass das vermehrte Einwandern entzündlicher Zellen in die Gefäßwände bei NF1-Patienten für häufigere Gefäßverschlüsse verantwortlich ist. In diesem Zusammenhang wurde an einer sehr kleinen Kohorte (N = 6) von NF1-Patienten gezeigt, dass der IL-6 Zytokinlevel im Blutplasma erhöht vorlag. Allerdings lässt die Anzahl der untersuchen Proben (n = 6) keine signifikante Aussage dieses Ergebnis zu. Weiterhin wurde von den Autoren in Lasater et al diese Untersuchungen im Kontext von vaskulären Störungen, die bei NF1 Patienten beobachtet werden, durchgeführt, so dass die Autoren sich auf die Untersuchung von diesbezüglich spezifischen Markern spezialisiert haben. Zudem wurde die Probe in dem Plasma von Patienten untersucht, dass im Gegensatz zu Serum, wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, der fast zellenfreie Überstand nach Zentrifugation von dem Vollblut ist. Dies führt dazu, dass signifikante diagnostische Konzentrationsunterschiede in einer Plasmaprobe verglichen zu einer Serumprobe vorherrschen und nicht miteinander korrelieren müssen. Dies wird beispielsweise dadurch deutlich, dass obwohl die Autoren neben IL-6 auch andere Zytokine wie TNFalpha, IFNgamma untersucht haben, wie aus dem Methodenteil auf Seite 869 linke Spalte, zweiter Abschnitt ersichtlich, keine Unterschiede in der Plasmakonzentration festgestellt haben, da die Autoren zu diesen Experimenten schweigen.Recently, in the publication of Lasater et al., Journal of Clinical Investigation 120 (2010), 859-70 demonstrated that NF1 patients show signs of chronic inflammation and it has been suggested that the increased influx of inflammatory cells into the vessel walls in NF1 patients is responsible for more frequent vascular occlusion. In this context, it was shown in a very small cohort (N = 6) of NF1 patients that the IL-6 cytokine level was elevated in the blood plasma. However, the number of samples examined (n = 6) does not allow any significant statement of this result. Furthermore, the authors in Lasater et al have performed these studies in the context of vascular disorders seen in NF1 patients, so that the authors have specialized in the study of markers specific for this purpose. In addition, the sample was examined in the plasma of patients, that, unlike serum, as used in the present invention, the almost cell-free supernatant after centrifugation is from the whole blood. As a result, significant differences in diagnostic concentration in a plasma sample are predominant rather than correlated with a serum sample. This is made clear, for example, by the fact that, in addition to IL-6, the authors also investigated other cytokines such as TNFalpha, IFNgamma, as can be seen from the Methods section on page 869, left column, second section, showed no differences in the plasma concentration, since the authors agree keep silent about these experiments.

Weiterhin kann mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens die Diagnose und/oder Früherkennung der Anwesenheit eines Tumors in einem Individuum, insbesondere Tumoren des Nervensystems gestellt werden. Wie in Beispiel 4 erläutert und in dargestellt, zeigen die Proteine IGFBP1 und RANTES einen signifikanten Unterschied zwischen NF1-Patienten mit MPNST und denen ohne MPNST. Dabei kann kein Unterschied für die beiden Proteine zwischen den Kontrollgruppen und den NF1-Patienten ohne MPNST (n = 74) detektiert werden ( , B). Interessanterweise korreliert die Konzentration von IGFBP1 mit der internen Tumorlast ( ) und der IGFBP1 Level in einer Probe mit dem Vorhandensein von MPNST ( ). Zusammengenommen zeigen diese Daten dass IGFBP1 ein neuer Risikomarker für maligne Transformation in NF1 Patienten ist. Darüber hinaus wird in Beispiel 3 und gezeigt, dass PDGF-BB sich als Marker für plexiforme Neurofibrome (PNF) eignet. Zudem zeigt PDGF-BB eine erhöhte Konzentration in NF1 Patienten mit MPNST Tumoren wie ersichtlich.Furthermore, with the aid of the method according to the invention, the diagnosis and / or early detection of the presence of a tumor in an individual, in particular tumors of the nervous system, can be made. As explained in Example 4 and in shown, the proteins IGFBP1 and RANTES show a significant difference between NF1 patients with MPNST and those without MPNST. No difference for the two proteins between the control groups and the NF1 patients without MPNST (n = 74) can be detected ( , B). Interestingly, the concentration of IGFBP1 correlates with the internal tumor burden ( ) and the IGFBP1 level in a sample with the presence of MPNST ( ). Taken together, these data indicate that IGFBP1 is a new risk marker for malignant transformation in NF1 patients. In addition, in Example 3 and demonstrated that PDGF-BB is useful as a marker for plexiform neurofibromas (PNF). In addition, PDGF-BB shows an increased concentration in NF1 patients with MPNST tumors such as seen.

Daher umfasst das erfindungsgemäße Verfahren einen Nachweis in einer Blut- oder Serumprobe von dem Individuum, wobei die Menge von RANTES, PDGF-BB sowie IGFBP-1 Protein in der Probe festgestellt wird und anschließend mit einem Referenzwert verglichen, wobei ein veränderter bzw. erhöhter oder erniedrigter Wert eines, zwei oder drei der Proteine oder Fragmente davon oder einer Kombinationen von ein bis drei der Proteine oder Fragmente davon im Vergleich zu der Referenzprobe darauf hindeutet, dass das zu testende Individuum einen Tumor, der mit einer NF1 Störung assoziiert ist, aufweist.Thus, the method of the invention comprises detecting in a blood or serum sample from the subject, detecting the amount of RANTES, PDGF-BB, and IGFBP-1 protein in the sample, and then comparing it to a reference value, wherein an increased or decreased value of one, two or three of the proteins or fragments thereof or a combination of one to three of the proteins or fragments thereof compared to the reference sample suggesting that the individual to be tested has a tumor associated with an NF1 disorder.

Bei der Durchführung dieses Testverfahrens, ist es natürlich nicht erforderlich, dass die Probe von der zu testenden Person, gleichzeitig mit einer Probe einer Nicht-NF1 betroffenen Person bzw. einer NF1 betroffenen Person, die keine NF1-assoziierten Tumore aufweist jeweils getestet wird. Stattdessen kann der Vergleich auch anhand zuvor festgelegter Werte von Personen, die nicht über eine Neurofibromatose Typ 1 Störung bzw. NF1 betroffenen Person, die keine NF1-assoziierte Tumore aufweisen, erfolgen. Solche Referenzwerte können entweder von dem individuell zu behandelnden Patienten im Laufe der Therapie gewonnen werden oder sind das Ergebnis von großflächigen Studien. Üblicherweise stammt ein Referenzwert aus einer so genannten gesunden Kontrollgruppe. Der Fachmann in diesem Bereich ist ohne weiteres in der Lage, geeignete Protokolle auszuwählen um so geeignete Referenzwerte erhalten zu können. Diesbezüglich weiß der Fachmann, dass der Spender der Referenzprobe auch ansonsten gesund ist, d. h. insbesondere frei von Entzündungen und anderweitiger Störungen ist, die durch unkontrolliertes Zellwachstum bedingt sind.When performing this test procedure, it is of course not necessary for the sample to be tested by the person being tested simultaneously with a sample from a non-NF1 affected person or a NF1 affected individual who does not have NF1-associated tumors. Instead, the comparison can also be made on the basis of previously determined values of persons who do not have a neurofibromatosis type 1 disorder or NF1-affected person who have no NF1-associated tumors. Such reference values can either be obtained from the individual patient to be treated in the course of therapy or are the result of large scale studies. Usually, a reference value comes from a so-called healthy control group. Those skilled in the art will readily be able to select suitable protocols to obtain appropriate reference values. In this regard, one skilled in the art will appreciate that the donor of the reference sample is otherwise healthy, i. H. especially free from inflammation and other disorders caused by uncontrolled cell growth.

Wenn nicht anders angegeben, stellen die hierfür beschriebenen Ausführungsformen gleichermaßen Ausführungsformen, in denen die verwendeten TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IL-6, RANTES, PDGF-BB, IGFBP-1 sowie Proteine oder Fragmente davon, Alternativen bzw. äquivalente Proteine/Peptid-Isoformen oder dessen mRNA Transkripte, dar und können anstatt der Proteine oder Fragmente davon in dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden. Ferner versteht sich, dass eine hier beschriebene Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bzw. deren Merkmale mit einer oder mehreren anderen hierin beschriebenen Ausführungsformen und deren Merkmalen kombiniert werden können, sofern sich die jeweiligen Ausführungsformen nicht ausschließen.Unless otherwise specified, the embodiments described herein likewise provide embodiments in which the TNFα, IFNγ, EGFR, IL-6, RANTES, PDGF-BB, IGFBP-1 and proteins or fragments thereof used, alternatives or equivalent proteins / peptide Isoforms or its mRNA transcripts, and can be detected instead of the proteins or fragments thereof in the method according to the invention. Furthermore, it is understood that an embodiment of the present invention or its features described here can be combined with one or more other embodiments described herein and their features, unless the respective embodiments are not exclusive.

Wie bereits vorstehend erläutert, liegt der vorliegenden Erfindung die überraschende Beobachtung zugrunde, dass (a) eine erhöhte Konzentration von TNFalpha, IFNgamma, und/oder IL-6 bzw. eine erniedrigte Konzentration von EGFR für NF1; (b) eine erhöhte Konzentration von IGFBP1 und/oder RANTES für einen NF1 assoziierten malignen peripheren Nervenscheidentumor (MPNST); und (c) eine erniedrigte Konzentration von PDGF-BB für plexiforme Neurofibrome (PNF) bezeichnend ist; und wobei die Referenzprobe in (a) und von einem gesunden Subjekt und in (b und c) von einem NF1 Patienten stammt.As already explained above, the present invention is based on the surprising observation that (a) an increased concentration of TNFalpha, IFNgamma, and / or IL-6 or a reduced concentration of EGFR for NF1; (b) an increased concentration of IGFBP1 and / or RANTES for an NF1-associated malignant peripheral nerve sheath tumor (MPNST); and (c) a decreased concentration of PDGF-BB is indicative of plexiform neurofibromas (PNF); and wherein the reference sample is in (a) and from a healthy subject and in (b and c) from an NF1 patient.

Ein wesentlicher Aspekt sowie Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens wird durch das Nachweisverfahren der Erfindung bereitgestellt. Denn der Nachweis ob ein zu untersuchendes Individuum an einer NF1-Erkrankung leidet oder sich ein MPNST Tumor in einem frühen Stadium befindet, der aber noch keine klinischen Symptome zeigt, ermöglicht es einerseits erstmals eine verlässliche Diagnose zu stellen, was für die Beteiligten als auch Angehörigen als ein bedeutender Schritt gewertet wird, da zumeist Kinder die Betroffenen sind und schon im frühen Alter bzw. ab Geburt körperliche als auch geistige Auffälligkeiten, wie Lernschwächen oder auch veränderte Gliedmaßen aufweisen können. Zudem kann die Frühdiagnose eines MPNST maßgeblich dafür verantwortlich sein, dass eine erfolgreiche Behandlung des NF1 assoziierten Tumors stattfinden kann und somit die Lebenserwartung eines NF1 Patienten maßgeblich erhöht, da wie vorstehend erwähnt, eine MPNST-spezifische Behandlung nur wenn es in einem sehr frühen Stadium diagnostiziert wird, erfolgsversprechend ist.An essential aspect and advantage of the method according to the invention is provided by the detection method of the invention. For the proof whether an individual to be examined suffers from a NF1 disease or an MPNST tumor is in an early stage, but does not yet show clinical symptoms, on the one hand makes it possible for the first time to make a reliable diagnosis, which for the participants as well as relatives is considered a significant step, since mostly children are the Affected are and at an early age or from birth physical and mental abnormalities, such as learning disabilities or altered limbs may have. In addition, the early diagnosis of an MPNST can be instrumental in ensuring that successful treatment of the NF1-associated tumor can occur, thus significantly increasing the life expectancy of a NF1 patient, as noted above, only treating it with MPNST-specific treatment if diagnosed at a very early stage will, is promising.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens begründet sich in den Nachweis der erfindungsgemäßen Marker in einer leicht zugänglichen Blutprobe, die im Gegensatz zu einer Biopsie, wie eine Tumor- oder Stanzbiopsie, routinemäßig bei einem Arztbesuch entnommen werden kann. Zum Anderen ist das erfindungsgemäße Verfahren, wie nachfolgend in den Beispielen noch ausführlich beschrieben, gegenüber den im Stand der Technik eingesetzten Verfahren, wie psychometrischen Verfahren, neuro-bildgebenden Verfahren oder dergleichen, deutlich vereinfacht und kostengünstig durchzuführen, wobei es den erstaunlichen Vorteil aufweist, dass mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahren zum ersten Mal die Früherkennung bzw. das Vorhandensein eines NF1 assoziierten Tumors bestimmt werden kann bevor dieser klinisch auffällig wird bzw. ohne die Entnahme einer Gewebeprobe, wodurch die Chancen zur erfolgreichen Behandlung, besonders bei einem MPNST Tumor, deutlich verbessert werden. Die Ergebnisse, welche mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, können jedoch zur Sicherung der Diagnose mit bildgebenden Verfahren sowie einer Biopsie validiert werden.A further advantage of the method according to the invention is the detection of the markers according to the invention in an easily accessible blood sample which, in contrast to a biopsy, such as a tumor or punch biopsy, can be routinely taken at a doctor's visit. On the other hand, the method according to the invention, as described in more detail in the examples below, compared to the methods used in the prior art, such as psychometric methods, neuro-imaging methods or the like, clearly simplified and inexpensive to perform, where it has the amazing advantage that With the aid of the method according to the invention, for the first time, the early detection or the presence of an NF1-associated tumor can be determined before it becomes clinically conspicuous or without the removal of a tissue sample, whereby the chances of successful treatment, especially in the case of an MPNST tumor, are markedly improved , However, the results which are obtained with the aid of the method according to the invention can be validated by means of imaging methods and a biopsy to ensure the diagnosis.

Die Proben, die in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, umfassen flüssige Proben, wie z. B. Blut, Urin, Speichel oder Gewebeflüssigkeiten, die gegebenenfalls auch weiter fraktioniert werden können. Falls bereits Gewebeproben, wie z. B. Gewebeschnitte auffälliger oder veränderter/entarteter Hautpartien oder Tumorbiopsien vorhanden sind, kann das erfindungsgemäße Verfahren auch an diesen Gewebeproben durchgeführt werden. Wie in den Beispielen 5 und 6 sowie in den und gezeigt, sekretieren die Lymphozyten, welche in einen MPNST Tumor einwandern als auch die Tumorzellen selbst das RANTES Protein. Bei Bedarf können die Proben in geeigneter Weise hergestellt bzw. aufbereitet werden um die Probe zu analysieren und die Konzentration der erfindungsgemäßen Marker darin zu bestimmen. Zur Aufbereitung der Proben können gängigen Methoden verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind. Die so erhaltenden Fraktionen einer flüssigen Probe oder durch Homogenisierung aufbereitete Gewebeproben können in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Probe eine menschliche Probe, beispielsweise eine Körperflüssigkeit, wie Blut, Speichel, Urin, einer Gewebeflüssigkeit wobei die Probe aus der Gruppe bestehend aus einer Blutprobe, einer Serumprobe und einer Plasmaprobe ausgewählt ist. Vorzugsweise handelt es sich bei der Probe um Serum.The samples used in the method according to the invention include liquid samples such as e.g. As blood, urine, saliva or tissue fluids, which may optionally be further fractionated. If already tissue samples such. B. tissue sections of conspicuous or altered / degenerated areas of the skin or tumor biopsies are present, the inventive method can also be performed on these tissue samples. As in Examples 5 and 6 and in the and The lymphocytes which migrate into an MPNST tumor secrete as well as the tumor cells themselves the RANTES protein. If necessary, the samples may be prepared or prepared in a suitable manner to analyze the sample and to determine the concentration of the markers according to the invention therein. For preparation of the samples common methods can be used, which are known in the art. The thus obtained fractions of a liquid sample or tissue samples prepared by homogenization can be used in the method according to the invention. In a preferred embodiment of the invention, the sample is a human sample, for example a body fluid, such as blood, saliva, urine, tissue fluid, wherein the sample is selected from the group consisting of a blood sample, a serum sample and a plasma sample. Preferably, the sample is serum.

Der Nachweis der erfindungsgemäßen Markerproteine kann mittels jedem gängigen Verfahren, dass sich zum Proteinnachweis eignet, durchgeführt werden. Erfindungsgemäß bevorzugt erfolgt der Nachweis der Markerproteine oder Fragmente davon durch ein immunologisches Verfahren.The detection of the marker proteins according to the invention can be carried out by means of any conventional method which is suitable for protein detection. According to the invention, the detection of the marker proteins or fragments thereof is preferably carried out by an immunological method.

Durch die Bindung mindestens einen Antikörpers, der mindestens ein erfindungsgemäßes Markerprotein erkennt, oder wenigstens einem weiteren Antikörper, Antikörper-Chip-, Protein Chip-Microrarray, beschichteter Mikrotiterplatte oder Lateral-Flow-Vorrichtungen/immunochormatographischer Schnelltest/Teststreifen, können eine Vielzahl an Nachweisreagenzien bereitgestellt werden, die in einer Vielzahl von Verfahren eingesetzt werden. Um die Spezifität des erfindungsgemäßen Diagnoseverfahrens zu gewährleisten, wird bevorzugt der Nachweis von mindestens einem zweiten erfindungsgemäßen Markerprotein in einer Probe untersucht. Diese Verfahren sind dem Fachmann ausreichend bekannt, siehe beispielsweise die Veröffentlichung ”Bioanalytik” (Lottspeich und Zorbas, Spektrum Verlag 1998) .By binding at least one antibody which recognizes at least one marker protein of the invention, or at least one further antibody, antibody chip, protein chip microarray, coated microtiter plate or lateral flow devices / immunochormatographic rapid test / test strip, a multiplicity of detection reagents can be provided be used in a variety of procedures. In order to ensure the specificity of the diagnostic method according to the invention, the detection of at least one second marker protein according to the invention in a sample is preferably investigated. These methods are well known to those skilled in the art, see, for example, the publication "Bioanalytics" (Lottspeich and Zorbas, Spektrum Verlag 1998) ,

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das erfindungsgemäße immunologische Nachweisverfahren ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus direkter ELISA, indirekter ELISA, Sandwich ELISA, Zellkultur ELISA, Durchflusszytometrie (FACS), immunochromatographischer Schnelltest und Protein-Chip Microarray.In a particularly preferred embodiment of the present invention, the immunological detection method according to the invention is selected from a group consisting of direct ELISA, indirect ELISA, sandwich ELISA, cell culture ELISA, flow cytometry (FACS), immunochromatographic rapid test and protein chip microarray.

Insbesondere immuncytochemische Verfahren, wie die Bestimmung durch die Durchflusszytometrie (FACS), die Bestimmung durch einen ”Enzyme linked Immunosorbent Assay” (ELISA) oder mit Hilfe eines Protein Chip-Microarray haben sich als besonders geeignet erwiesen. Als hervorragende Alternative ist ein Test auf einem Testträger mit möglichst geringem Volumenbedarf, z. B. auf einem Teststreifen wie dem immunochromatographischen Schnelltest auch ”Lateral Flow Assay” (LFA) genannt, zu verwenden wie beschrieben z. B. in den internationalen Patentameldungen WO 2003/068398 A2 WO 2007/055712 A2 , Lateral-Flow-Geräte (LFD, Teststreifen) sind in der internationalen Anmeldung WO 02/059567 A2 beschrieben.In particular, immunocytochemical methods, such as the determination by flow cytometry (FACS), the determination by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or with the aid of a protein chip microarray have proven to be particularly suitable. An excellent alternative is a test on a test carrier with the lowest possible volume requirement, eg. B. on a test strip such as the immunochromatographic rapid test also called "Lateral Flow Assay" (LFA), as described z. In the international patent applications WO 2003/068398 A2 WO 2007/055712 A2 , Lateral flow devices (LFD, test strips) are in the international application WO 02/059567 A2 described.

Die LFA basieren auf dem gleichen Prinzip wie andere immunologische Assays (ELISA, Magnetic Bead Assays usw.), sie nützen den Effekt der Antikörper-Antigen Reaktion aus. Zusätzlich haben sie chromatographische Eigenschaften, da die Antikörper auf einer Membran gebunden sind. Die zu analysierende Probe (Lösung) wird durch die Kapillarkräfte über den ganzen Streifen gezogen und führt zu einem schnell sichtbaren Resultat. Aus den erwähnten Gründen wird der LFA auch als Immun-Chromatographie bezeichnet. Die überschüssige Flüssigkeit mit den an der Test- bzw. Kontrolllinie nicht gebundenen Goldpartikeln strömt weiter durch das Membransystem, bis sie von einem Filterpapier aufgesaugt wird und somit einen Rückfluss verhindert. The LFAs are based on the same principle as other immunological assays (ELISA, magnetic bead assays, etc.), they exploit the effect of the antibody-antigen reaction. In addition, they have chromatographic properties because the antibodies are bound to a membrane. The sample (solution) to be analyzed is pulled over the entire strip by the capillary forces and leads to a quickly visible result. For the reasons mentioned, the LFA is also referred to as immunochromatography. The excess liquid with the gold particles not bound to the test or control line continues to flow through the membrane system until it is sucked up by a filter paper and thus prevents backflow.

Auch der Nachweis der erfindungsgemäßen Proteine oder Fragmente davon können unter Verwendung radioaktiv markierter Antigene oder Antikörper Radioimmunoassay (RIA) durchgeführt werden, beispielsweise in W. M. Hunter in ”Handbook of Experimental Immunology, Kapitel 17, Oxford, Blackwell Scientific Publications, 1973 beschreiben. Die Durchführung selbst kann als kompetitiver RIA oder als Immunoradiometrischer Assay (IRMA) erfolgen.The detection of the proteins or fragments thereof according to the invention can also be carried out using radioactively labeled antigens or antibody radioimmunoassay (RIA), for example in US Pat WM Hunter in Handbook of Experimental Immunology, Chapter 17, Oxford, Blackwell Scientific Publications, 1973 describe. The performance itself can be carried out as a competitive RIA or as an immunoradiometric assay (IRMA).

Wie vorstehend erwähnt, kann der Nachweis mit Enzym-markierten Antigenen oder Antikörpern Enzyme Immunoassay (EIA) erfolgen, vgl. U. Göbel Wehrmed. Mschr. 12, 354 (1979) . Bekannt sind Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA), Enzyme-Multiplied-Immunoassay-Technique (EMIT) oder auch der Nachweis mit fluorochrommarkierten Antigenen oder Antikörpern Fluoreszenzimmunoassay (FIA), vgl. B. Viel, MTA-Journal 1, 56 (1979), Grundlagen der Immunfluoreszenz . Weitere Informationen und Protokolle sind beispielsweise in R aem, Arnold M. Immunoassays. 1. Auflage, München; Heidelberg: Elsevier, Spektrum Akademischer Verlag., 2007 ; David Wild (Ed.): The Immunoassay Handbook. 3rd ed. Elsevier Science Publishing Company, Amsterdam, Boston, Oxford 2005 beschrieben. Weiterführende Informationen und Protokolle für die Durchführung verschiedener ELISA Assays sind in dem Fachmann im Bereich der Diagnostik gut bekannt, siehe beispielsweise Kapitel 11 von Ausubel (Ed) Current Protocols in Molecular Biology, fünfte Ausgabe, John Wiley & Sons, Inc, NY, 2002 .As mentioned above, the detection can be carried out with enzyme-labeled antigens or antibodies Enzyme Immunoassay (EIA), cf. U. Göbel Wehrmed. Mschr. 12, 354 (1979) , Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), enzyme-multiplied immunoassay technique (EMIT) or detection with fluorochrome-labeled antigens or antibodies Fluorescence immunoassay (FIA), cf. B. Viel, MTA Journal 1, 56 (1979), Fundamentals of Immunofluorescence , Further information and protocols are for example in R aem, Arnold M. Immunoassays. 1st edition, Munich; Heidelberg: Elsevier, Spektrum Akademischer Verlag., 2007 ; David Wild (Ed.): The Immunoassay Handbook. 3rd ed. Elsevier Science Publishing Company, Amsterdam, Boston, Oxford 2005 described. Further information and protocols for performing various ELISA assays are well known to those of skill in diagnostics, see for example Chapter 11 of Ausubel (Ed) Current Protocols in Molecular Biology, fifth edition, John Wiley & Sons, Inc, NY, 2002 ,

In den oben aufgeführten Verfahren wird mindestens ein Antikörper mit einem Label markiert, dies kann beispielsweise ein Enzym, wie die Peroxidase, insbesondere Meerrettich-Peroxidase, Biotin, ein fluoreszierender Farbstoff, insbesondere Fluorescein (FITC, DFTF), R-Phycoerythrin (PE), Peridinium-Chlorophyll-Protein (PerCP) und Tandem-Konjugate, wie PE-Cy5 oder PE-Texas-Rot, Gold-Kolloid oder Rodionuclide sein. Zudem kann ein weiterer Antikörper an eine feste Phase gebunden werden. Durch eine solche Kennzeichnung eines Antikörpers ist es möglich, direkt die Anwesenheit und Konzentration des markierten Antikörpers qualitativ und quantitativ zu bestimmen und darüber das daran gebundene Epitop eines der Markerproteine.In the above-mentioned methods, at least one antibody is labeled with a label, for example an enzyme such as the peroxidase, in particular horseradish peroxidase, biotin, a fluorescent dye, in particular fluorescein (FITC, DFTF), R-phycoerythrin (PE), Peridinium chlorophyll protein (PerCP) and tandem conjugates such as PE-Cy5 or PE-Texas Red, gold colloid or rodionuclide. In addition, another antibody can be bound to a solid phase. Such labeling of an antibody makes it possible to qualitatively and quantitatively determine directly the presence and concentration of the labeled antibody and, via it, the epitope of one of the marker proteins bound thereto.

Wie bereits zu Anfang erwähnt, wurden die erfindungsgemäßen Markerproteine durch einen beim Hersteller in Auftrag gegebenen ”custumized” Protein Micro-Chip Array, ein sogenannter Quantibody^® Array aufgefunden. Daher eignen sich Microarray-Chip Array ebenfalls sehr gut für das erfindungsgemäße Verfahren sowie zu Diagnosezwecken, da minimale Mengen an einer Blut oder Serumprobe oder Kulturüberstände von Tumorzellen oder Biopsiematerial eines Patienten verwendet werden können. Zudem werden die Proben Daten zumeist mindestens in einer Doppelbestimmung wenn nicht sogar in einer Dreifachbestimmung ausgewertet und somit werden Fehler minimiert. Zusätzlich bietet die Protein Chip Technologie den Vorteil in Diagnostischen Labors gleichzeitig mehrere Proben von Patienten sowie von Kontrollen durchzuführen und damit auch gleichzeitig Vergleichsdaten bereitzustellen, die Aussagen über die Qualität des durchgeführten Assay einerseits zu lassen, als auch wertvolle zusätzliche Vergleichswerte zwischen den einzelnen untersuchten Patienten zu lassen. Vom relevanten Zellmaterial können oft nur kleinste Mengen gewonnen werden, was den Umfang der Untersuchungsmöglichkeiten einschränkt. Um eine zielgerichtete Behandlung des Patienten durchführen zu können, ist eine umfangreiche Untersuchung des Biopsiematerials jedoch unerlässlich. Deswegen ist es wichtig, dass die Biopsie des Patienten zu Analysezwecken optimal genutzt wird und als Ausgang für so viele Microarray-Chips wie möglich dient. Üblicherweise werden die Chips mit Mikrodispensersystemen hergestellt.As mentioned at the beginning, marker proteins of the invention were discovered by a commissioned from the manufacturer "custumized" Protein Micro-chip array, a so-called Quantibody ^® array. Therefore, microarray chip arrays are also very well suited for the method of the invention as well as for diagnostic purposes, since minimal amounts of a blood or serum sample or culture supernatants of tumor cells or biopsy material of a patient can be used. In addition, the data are usually evaluated at least in a double determination if not in a triple determination and thus errors are minimized. In addition, the protein chip technology offers the advantage in Diagnostic Laboratories to perform multiple patient and control samples simultaneously, and to provide comparative data that leave behind statements about the quality of the assay, as well as valuable additional comparisons between the individual patients studied to let. From the relevant cell material often only the smallest amounts can be obtained, which limits the scope of the investigation possibilities. In order to be able to perform a targeted treatment of the patient, however, a comprehensive examination of the biopsy material is essential. Therefore, it is important that the biopsy of the patient be used optimally for analysis and serve as the output for as many microarray chips as possible. Usually, the chips are manufactured with Mikrodispensersystemen.

Microarrays sind in der Lage die schnelle und hochparallele Detektion einer Vielzahl spezifisch bindender Moleküle in einem einzigen Experiment zu ermöglichen. Oligonukleotid- und cDNA-Microarrays, welche eine Vielzahl individueller Gene auf Filter- oder Glasoberflächen repräsentieren, sind dem Fachmann gut bekannt und beispielsweise in der europäischen Patentanmeldung EP 2 189 791 A1 oder WO 95/35505 beschrieben. Neben den Oligonukleotid-basierenden Microarrays gibt es auch Protein-basierte Microarrays. Ein Vorteil gegenüber DNA-Microarrays ist die schnellere Analyse von Proben, da man auf eine Vermehrung des genetischen Materials sowie die Hybridisierung verzichten kann. Zudem lassen Protein-Microarrays eine Analyse des tatsächlichen Proteinlevels zu. Die ist besonders wichtig, da mRNA- und Proteinmenge nicht immer miteinander korrelieren, und man daher aus den DNA-Microarray-Ergebnissen nicht unbedingt auf die Höhe der Proteinexpression schließen kann.Microarrays are capable of enabling the rapid and highly parallel detection of a variety of specific binding molecules in a single experiment. Oligonucleotide and cDNA microarrays representing a variety of individual genes on filter or glass surfaces are well known to those skilled in the art and, for example, in the European patent application EP 2 189 791 A1 or WO 95/35505 described. In addition to the oligonucleotide-based microarrays, there are also protein-based microarrays. An advantage over DNA microarrays is the faster analysis of samples, as one can dispense with an increase in the genetic material and hybridization. In addition, protein microarrays allow an analysis of the actual protein levels. This is especially important because mRNA and protein levels are not always correlate with each other, and therefore one can not necessarily conclude from the DNA microarray results on the level of protein expression.

Bei Protein-Microarrays werden statt der DNA-Kopien kleine Proteinmengen auf dem Trägermaterial aufgebracht. Diese auch Chips genannt, werden mit einer proteinhaltigen Probe, zum Beispiel einem Antikörper, inkubiert, wobei dieser dann an einige der auf dem Chip befindlichen Protein-Spots bindet. Nach der Durchführung eines Waschschritts, bei dem ungebundener Antikörper entfernt wird, kann die Stärke des Signals jedes Spots und damit die Menge des dort gebundenen Antikörpers aus der Probe ermittelt werden. Das Signal entsteht beispielsweise durch einen weiteren Antikörper, der an einen fluoreszierenden Farbstoff gebunden ist und wiederum an den ersten Antikörper bindet. Man kann die verschiedenen Protein-Microarray-Arten nach der Art der Interaktion (Antigen-Antikörper, Enzym-Substrat, Rezeptor-Protein oder allgemeine Protein-Protein Interaktion) unterscheiden. Bei einem Sandwich Immunoassay werden Antikörper, die hochspezifisch an die zu untersuchenden Proteine binden, auf dem Trägermaterial immobilisiert. Die Ziel-Proteine werden auf das Array gegeben und binden an die zuvor immobilisierten Antikörper. Im dritten Schritt werden die gebundenen Proteine durch markierte Antikörper identifiziert. Antigen Capture Immunoassays: Wie bei der Sandwich-Methode werden spezifisch bindende Antikörper auf dem Array immobilisiert. Allerdings wird hier auf einen zweiten Antikörper zur Detektion verzichtet, die Proteine werden direkt mit einem Fluorophor markiert. Direkte Immunoassays: Hier werden die Zielmoleküle selber immobilisiert, als Detektoren fungieren wieder mit Fluorophoren markierte Antikörper. Es kann auch differenziert werden, ob Proteine der Probe am Array fixiert werden und dann mit einer Vielzahl von spezifischen, bekannten Testproteinen geprüft wird – oder ob die Testproteine in den Testflächen fixiert werden und dann die Reaktion mit den Probenproteinen erfolgt. Diese Techniken sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise in MacBeath Nature Genetics 32 (2002), 526–532 beschrieben.In protein microarrays, small amounts of protein are applied to the carrier material instead of the DNA copies. These also called chips, are incubated with a protein-containing sample, for example an antibody, which then binds to some of the on-chip protein spots. After carrying out a washing step in which unbound antibody is removed, the strength of the signal of each spot and thus the amount of antibody bound therefrom can be determined from the sample. The signal is generated, for example, by another antibody which is bound to a fluorescent dye and in turn binds to the first antibody. It is possible to differentiate the different types of protein microarray according to the type of interaction (antigen-antibody, enzyme-substrate, receptor-protein or general protein-protein interaction). In a sandwich immunoassay, antibodies that bind highly specifically to the proteins to be examined are immobilized on the carrier material. The target proteins are added to the array and bind to the previously immobilized antibodies. In the third step, the bound proteins are identified by labeled antibodies. Antigen Capture Immunoassays: As with the sandwich method, specific binding antibodies are immobilized on the array. However, here is dispensed with a second antibody for detection, the proteins are labeled directly with a fluorophore. Direct immunoassays: Here, the target molecules are immobilized themselves, as detectors act again with fluorophores labeled antibodies. It can also be differentiated whether proteins of the sample are fixed to the array and then tested with a variety of specific, known test proteins - or whether the test proteins are fixed in the test areas and then the reaction with the sample proteins takes place. These techniques are known to the person skilled in the art and, for example, in MacBeath Nature Genetics 32 (2002), 526-532 described.

Die Microarrays können auf einer Vielzahl von festen Oberflächen, wie Kunststoffen (z. B. Polycarbonat), komplexe Kohlenhydrate (z. B. Agarose und Sepharose), Acrylharze (z. B. Polyacrylamid und Latexkügelchen) und Nitrocellulose erstellt werden. Bevorzugte feste Trägermaterialien schließen Objektträger, Wafer, und positiv geladene Nylonmembran ein. Verfahren zur kovalenten Bindung der Antikörper an einen festen Träger sind in der Technik bekannt. Beispiele für solche Verfahren finden sich in Bhatia et al, Anal. Biochem. 178 (1989), 408–413 ; Ahluwalia, et al, Biosens. Bioelectron. 7 (1992), 207–214 ; Jonsson, et al, Biochem. J. 227 (1985), 373–378 und Freij-Larsson, et al, Biomaterials 17 (1996), 2199–2207 . Alternativ können auch direkt Proteine oder Peptide an einen festen Träger gebunden werden oder zusätzlich Proteine an die bereits an den festen Träger gebundene Antikörper gekoppelt werden. Diesbezügliche Techniken sind dem Fachmann geläufig und beispielsweise in der EP 218 9791 A1 oder WO 95/35505 beschrieben.The microarrays can be created on a variety of solid surfaces, such as plastics (eg, polycarbonate), complex carbohydrates (eg, agarose and sepharose), acrylic resins (eg, polyacrylamide and latex beads), and nitrocellulose. Preferred solid support materials include glass slides, wafers, and positively charged nylon membranes. Methods of covalently attaching the antibodies to a solid support are known in the art. Examples of such methods can be found in Bhatia et al, Anal. Biochem. 178 (1989), 408-413 ; Ahluwalia, et al, Biosens. Bioelectron. 7 (1992), 207-214 ; Jonsson, et al, Biochem. J. 227 (1985), 373-378 and Freij-Larsson, et al, Biomaterials 17 (1996), 2199-2207 , Alternatively, proteins or peptides can also be bound directly to a solid carrier or, in addition, proteins can be coupled to the antibodies already bound to the solid carrier. Techniques related to this are familiar to the person skilled in the art and are described, for example, in US Pat EP 218 9791 A1 or WO 95/35505 described.

Substanzen, die zum Nachweisen von Proteinen in einem Microarray verwendet werden können, schließen fluoreszierende Farbstoffe, wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Fluorescein, Rhodamin, Tetramethyl-Rhodamin-5-(und 6)-(TRITC), Texas-Rot-, Cyanin-Farbstoffe (Cy3 und Cy5, zum Beispiel) und dergleichen sowie Enzyme, die mit kolorimetrischen Substraten, wie z. B. Meerrettich-Peroxidase reagieren, ein. Die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen wird im Allgemeinen in der Praxis der Erfindung bevorzugt, da diese in sehr geringen Mengen nachgewiesen werden können. Ferner erlaubt die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen den gleichzeitigen Nachweis mehrere Antigene, die mit einem einzigen Array umgesetzt werden können, da jedes Antigen mit einer unterschiedlichen fluoreszierenden Verbindung markiert werden kann.Substances that can be used to detect proteins in a microarray include fluorescent dyes such as fluorescein isothiocyanate (FITC), fluorescein, rhodamine, tetramethyl-rhodamine-5- (and 6) - (TRITC), Texas Red, cyanine. Dyes (Cy3 and Cy5, for example) and the like, as well as enzymes associated with colorimetric substrates, such as. B. horseradish peroxidase, a. The use of fluorescent dyes is generally preferred in the practice of the invention because they can be detected in very small amounts. Furthermore, the use of fluorescent dyes allows the simultaneous detection of multiple antigens that can be reacted with a single array, as each antigen can be labeled with a different fluorescent compound.

Mittel zum Detektieren von Markierungen sind dem Fachmann gut bekannt. Daher, wo beispielsweise die Markierung eine radioaktive Markierung ist, schließen die Mittel zur Detektion einen Scintillationszähler oder fotographischen Film ein, wie bei der Autoradiographie. Wenn die Markierung eine Fluoreszenzmarkierung ist, kann durch Anregung des Fluorochroms mit der geeigneten Wellenlänge, die resultierende Fluoreszenz detektiert. Die Fluoreszenz kann visuell detektiert werden, durch fotographische Filme, durch die Verwendung eines elektronischen Detektors, wie beispielsweise charge coupled devices (CCDs) oder Fotomultipliern und ähnlichem. In ähnlicher Weise können enzymatische Markierungen detektiert werden durch Bereitstellung des geeigneten Substrats für das Enzym und Detektieren des resultierenden Reaktionsprodukts. Schließlich können einfache kolorimetrische Markierungen direkt durch Beobachtung der Farbe die mit der Markierung assoziiert ist, detektiert werden. Daher erscheint in verschiedenen Dipstick-Assays konjugiertes Gold oftmals pink, wobei verschieden konjugierte Beads in der Farbe der Beads erscheinen.Means for detecting labels are well known to those skilled in the art. Therefore, where, for example, the label is a radioactive label, the means of detection include a scintillation counter or photographic film, as in autoradiography. If the label is a fluorescent label, by exciting the fluorochrome at the appropriate wavelength, the resulting fluorescence can be detected. Fluorescence can be detected visually, through photographic films, through the use of an electronic detector such as charge coupled devices (CCDs) or photomultipliers and the like. Similarly, enzymatic labels can be detected by providing the appropriate substrate for the enzyme and detecting the resulting reaction product. Finally, simple colorimetric labels can be detected directly by observing the color associated with the label. Therefore, in various dipstick assays, conjugated gold often appears pink, with differently conjugated beads appearing in the color of the beads.

Manche Assayformate benötigen keine Verwendung von markierten Komponenten. Zum Beispiel Agglutinationsassays können verwendet werden, um die Anwesenheit von Zielantikörpern zu detektieren. In diesem Fall werden Antigen-beschichtete Partikel durch Proben agglutiniert, die die Zielantikörper umfassen. In diesem Format braucht keiner der Komponenten markiert zu werden und das Vorhandensein des Zielantikörpers wird durch einfache visuelle Kontrolle detektiert.Some assay formats do not require the use of labeled components. For example, agglutination assays can be used to detect the presence of target antibodies. In this case, antigen-coated particles are agglutinated by samples comprising the target antibodies. In In this format, none of the components need to be labeled and the presence of the target antibody is detected by simple visual control.

Wie vorstehend ausführlich beschrieben werden üblicherweise diagnostische Verfahren unter Verwendung von Antikörpern durchgeführt und können mittels leicht zu detektierenden signalerzeugenden Wirkstoffen in Verbindung mit den besagten Antikörpern oder Fragmente davon verwendet werden.As described in detail above, diagnostic methods are usually performed using antibodies and can be used by easily detectable signal producing agents in conjunction with said antibodies or fragments thereof.

Daher erstreckt sich die vorliegende Erfindung natürlicherweise auf die Verwendung eines TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IGFBP1 und/oder RANTES spezifischen Reagenz oder Mittel zur Diagnose und/oder Früherkennung von NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumor, wobei das Reagenz oder Mittel vorzugsweise ausgewählt ist aus einer Gruppe von einem Antikörper oder Fragment davon, Aptamer und Spiegelmer; siehe auch die vorstehende Definition des Begriffs ”Reagenz”. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines anti-IL-6 und/oder PDGF-BB Antikörpers oder äquivalenten Reagenzien.Therefore, the present invention naturally extends to the use of a TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IGFBP1 and / or RANTES specific reagent or means for the diagnosis and / or early detection of NF1 and / or an NF1 associated tumor, wherein the reagent or agent is preferably selected from a group of an antibody or fragment thereof, aptamer and spiegelmer; see also the above definition of the term "reagent". In a preferred embodiment, the present invention also relates to the use of an anti-IL-6 and / or PDGF-BB antibody or equivalent reagents.

Naturgemäß erstreckt sich die vorliegenden Erfindung somit auch auf die Verwendung von (i) IFNgamma, TNFalpha, EGFR, IGFBP1, RANTES, PDGF-BB und/oder IL-6 als Serummarker oder (ii) einem Reagenz zum Nachweis eines dieser Proteine in Serum zur Diagnose und/oder Früherkennung von NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumors.Naturally, the present invention thus also extends to the use of (i) IFNgamma, TNFalpha, EGFR, IGFBP1, RANTES, PDGF-BB and / or IL-6 as serum markers or (ii) a reagent for detecting one of these proteins in serum Diagnosis and / or early detection of NF1 and / or NF1 associated tumor.

Gemäß der Erfindung können Antikörper, die gegen die erfindungsgemäßen Proteine oder Fragmente davon gerichtet sind, verwendet werden um in einem Nachweisverfahren spezifisch an ein Epitop der Markerproteine zu binden. Dafür eignen sich kommerziell erhältliche Antikörper, die auch in den Experimenten zu der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, welche in den unten aufgeführten Beispielen im Material und Methodenteil aufgelistet sind. Die Herstellung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern sind dem Fachmann bekannt und in der Literatur gut beschrieben, siehe beispielsweise Köhler G. und Milstein C. Nature 256 (1975), 495 ; oder Galfre et al., Nature 266 (1977), 550 ). Gemäß der Erfindung können die Antikörper auch rekombinant hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Antikörpern sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt (vgl. z. B. bekannt, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, 2001 ). Die Erzeugung von chimären Antikörpern ist beispielsweise beschrieben in WO 89/09622 . Verfahren zur Erzeugung humanisierter Antikörper sind beispielsweise beschrieben in EP-A1 0 239 400 und WO 90/07861 .According to the invention, antibodies directed against the proteins of the invention or fragments thereof can be used to specifically bind to an epitope of the marker proteins in a detection procedure. Commercially available antibodies which have also been used in the experiments of the present invention, which are listed in the Examples and Examples below, are suitable for this purpose. The preparation of polyclonal or monoclonal antibodies are known to those skilled in the art and well described in the literature, see, for example Kohler G. and Milstein C. Nature 256 (1975), 495 ; or Galfre et al., Nature 266 (1977), 550 ). According to the invention, the antibodies can also be prepared recombinantly. Methods for producing recombinant antibodies are known to the person skilled in the art from the prior art (cf., for example, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, 2001 ). The production of chimeric antibodies is described, for example, in WO 89/09622 , Methods for producing humanized antibodies are described, for example, in US Pat EP-A1 0 239 400 and WO 90/07861 ,

Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das erfindungsgemäße Verfahren natürlich auch funktionelle Varianten von vollständigen Antikörpern sowie deren Fragmente oder Derivate, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Diagnostik bekannt sind und äquivalent zu den Antikörpern eine Bindung zu den Markerproteinen eingehen können.Of course, according to the present invention, the method according to the invention also comprises functional variants of complete antibodies and their fragments or derivatives, which are known to the person skilled in the art of diagnostics and can bind to the marker proteins equivalent to the antibodies.

Bei dem Antigen-bindenden Fragment des monoklonalen Antikörpers kann es sich um ein einkettiges Fv-Fragment, ein F(ab')-Fragment, ein F(ab)-Fragment sowie ein F(ab')₂-Fragment oder um ein beliebiges anderes Antigen bindendes Fragment handeln.The antigen-binding fragment of the monoclonal antibody may be a single-chain Fv fragment, an F (ab ') fragment, an F (ab) fragment, an F (ab') ₂ fragment, or any other Act as an antigen binding fragment.

Die Antikörper der vorliegenden Erfindung oder deren korrespondierende Immunglobulinkette(n) können unter Verwendung konventioneller im Stand der Technik bekannter Verfahren weiter modifiziert werden, beispielsweise durch Deletion(en), Insertion(en), Substitution(en), Addition(en) und/oder Rekombination(en) von Aminosäuren und/oder durch beliebige andere im Stand der Technik bekannte Verfahren, entweder alleine oder in Kombination. Verfahren zum Einfügen solcher Modifikationen in die DNA-Sequenz, die der Aminosäuresequenz einer Immunglobulinkette zu Grunde liegt, sind dem Fachmann wohl bekannt; siehe beispielsweise Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. und Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994) . Modifikationen des erfindungsgemäßen Antikörpers schließen ein: chemische und/oder enzymatische Derivatisierungen an einer oder mehreren konstituierenden Aminosäuren, einschließlich Modifikationen der Seitenkette, Modifikationen des Rückgrats sowie N- und C-terminale Modifikationen einschließend Acetylierung, Hydroxylierung, Methylierung, Amidierung sowie die Anbindung von Kohlenhydrat- oder Lipidresten, Cofaktoren und dergleichen. Erfindungsgemäß können ebenfalls bi- oder multifunktionelle Moleküle zur Diagnose oder Früherkennung einer NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumors verwendet werden, die eine Bindungsdomäne eines Antikörpers, eine Immunglobulinkette oder ein Bindungsfragment, die gemäß der vorliegenden Erfindung an das erfindungsgemäße Protein oder Fragment davon bindet sowie mindestens eine weitere funktionelle Domäne, umfassen.The antibodies of the present invention or their corresponding immunoglobulin chain (s) may be further modified using conventional methods known in the art, for example by deletion (s), insertion (s), substitution (s), addition (s) and / or Recombination (s) of amino acids and / or by any other method known in the art, either alone or in combination. Methods for incorporating such modifications into the DNA sequence underlying the amino acid sequence of an immunoglobulin chain are well known to those skilled in the art; see for example Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) NY and Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY (1994) , Modifications of the antibody of the invention include chemical and / or enzymatic derivatizations on one or more constituent amino acids, including modifications of the side chain, modifications of the backbone, and N- and C-terminal modifications including acetylation, hydroxylation, methylation, amidation, and attachment of carbohydrate. or lipid residues, cofactors and the like. Also useful in the present invention are bi- or multi-functional molecules for the diagnosis or early detection of an NF1 and / or NF1 associated tumor which binds a binding domain of an antibody, an immunoglobulin chain, or a binding fragment that binds to the protein or fragment thereof according to the present invention at least one further functional domain.

Der Antikörper kann mit einer markierenden Substanz bzw. Label markiert werden. Dies kann ein Enzym, ein Radioisotop, ein fluoreszierender Farbstoff, Biotin, Digoxigenin oder dergleichen sein. Das Enzym ist nicht besonders beschränkt, solange die Stabilität in dem Antikörper-bindenden Zustand erhalten bliebt sowie die Fähigkeit des Labels bzw. des daran gekoppelten Substrats eine Nachweisreaktion, wie z. B. der Wiedergabe des Substrats eine bestimmte Farbe erhalten bleibt. Zum Beispiel können Peroxidasen in den allgemein bekannten EIA (Enzymimmunoassay), β-Galactosidase, alkalische Phosphatase, Glucoseoxidase, Acetylcholin-Esterase, Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, Malat-Dehydrogenase oder dergleichen verwendet werden. Darüber hinaus ist es auch möglich, ein inhibierendes Enzym, ein Coenzym oder dergleichen zu verwenden. Diese Enzyme können an den Antikörper durch ein bekanntes Verfahren unter Verwendung einer Maleimid-Verbindung oder eines solchen Vernetzungsmittels gebunden werden. Wie für das Substrat ist es möglich, eine bekannte Substanz nach der Art des zu verwendenden Enzyms zu verwenden. Zum Beispiel kann 3,3' oder 5,5'-Tetramethylbenzidin als Substrat, wenn Peroxidase als ein Enzym verwendet wird, oder Paranitrophenol als Substrat, wenn alkalische Phosphatase als Enzym verwendet wird, benutzt werden. The antibody can be labeled with a labeling substance or label. This may be an enzyme, a radioisotope, a fluorescent dye, biotin, digoxigenin or the like. The enzyme is not particularly limited as long as the stability in the antibody-binding state is maintained, and the ability of the label or the substrate coupled therewith to provide a detection reaction such as, e.g. B. the reproduction of the substrate is maintained a certain color. For example, peroxidases can be used in the well-known EIA (enzyme immunoassay), β-galactosidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, acetylcholine esterase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, malate dehydrogenase or the like. In addition, it is also possible to use an inhibiting enzyme, a coenzyme or the like. These enzymes can be linked to the antibody by a known method using a maleimide compound or such a crosslinking agent. As for the substrate, it is possible to use a known substance according to the type of enzyme to be used. For example, 3,3 'or 5,5'-tetramethylbenzidine can be used as a substrate when peroxidase is used as an enzyme or paranitrophenol as a substrate when alkaline phosphatase is used as an enzyme.

Solche detektierbaren Markierungen sind im Bereich von Immunoassays gut entwickelt und allgemein können die meisten Markierungen, die nützlich in solchen Verfahren sind, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Daher ist eine Markierung irgendeine Zusammensetzung, die durch spektroskopische, fotochemische, biochemische, immunochemische, elektrische, optische oder chemische Methoden detektierbar ist. Nützliche Markierungen in der vorliegenden Erfindung schließen ein, magnetische Beads (z. B., Dynabeads^TM), Fluoreszenzfarbstoffe (z. B., Fluoroeszein-Isothiocyanat, Texasrot, Rhodamin, und ähnliches), Radiomarkierungen (z. B., ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C oder ³²P), Enzyme (z. B., Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase und andere, die üblicherweise in einem ELISA verwendet werden) und kolorimetrische Markierungen wie z. B. kolloidales Gold oder gefärbtes Glas oder Plastik (z. B. Polystyrol, Polypropylen, Latex, etc.) Beads.Such detectable labels are well developed in the field of immunoassays, and generally, most labels useful in such methods can be used in the present invention. Therefore, a label is any composition that is detectable by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, electrical, optical or chemical methods. Useful labels in the present invention include magnetic beads (z. B., Dynabeads ^™), fluorescent dyes (e.g., B., Fluoroeszein isothiocyanate, Texas red, rhodamine, and the like), radiolabels (eg. B., ³ H, ¹²⁵ I, ³⁵ S, ¹⁴ C, or ³² P), enzymes (e.g., horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, and others commonly used in an ELISA), and colorimetric labels such as e.g. Colloidal gold or colored glass or plastic (e.g., polystyrene, polypropylene, latex, etc.) beads.

Die Markierung kann entsprechend im Fachbereich gut bekannter Methoden direkt oder indirekt an die gewünschte Komponente des zu verwendenden Assays gekoppelt werden. Wie oben angezeigt, kann eine breite Vielfalt von Markierungen verwendet werden, wobei die Wahl der Markierung abhängt von der erforderlichen Sensitivität, die einfache Konjugation mit der Verbindung, Stabilitätserfordernisse, verfügbare Geräteausstattung und EntsorgungsvorkehrungenThe label may be coupled directly or indirectly to the desired component of the assay to be used, according to methods well known in the art. As indicated above, a wide variety of labels can be used, the choice of label depending on the required sensitivity, ease of conjugation with the compound, stability requirements, available instrumentation and disposal arrangements

Nicht-radioaktive Markierungen werden oft durch indirekte Mittel angehängt. Die Moleküle können ebenfalls direkt an die signalerzeugende Verbindung konjugiert werden, z. B., durch Konjugation mit einem Enzym oder fluoreszierender Verbindung. Eine Vielfalt von Enzymen und fluoreszierenden Verbindungen kann in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden und sind dem Fachmann gut bekannt (zur Übersicht verschiedener Markierungs- oder signalproduzierende Systeme, die verwendet werden können, siehe, z. B., U.S. Patent Nr. 4,391,904 ).Non-radioactive labels are often attached by indirect means. The molecules can also be conjugated directly to the signal producing compound, e.g. B., by conjugation with an enzyme or fluorescent compound. A variety of enzymes and fluorescent compounds can be used in the methods of the present invention and are well known to those skilled in the art (for a review of various labeling or signal producing systems that can be used, see, e.g. U.S. Patent No. 4,391,904 ).

Daher ist die vorliegende Erfindung auch nicht auf Antikörper beschränkt. Auch Agentien, die an die Markerproteine oder Fragmente davon direkt oder indirekt binden können sind Bestandteil der Erfindung. So können beispielsweise interagierende Proteine oder Peptide oder Antikörper-abgeleitete Moleküle wie Fab, Fv oder scFv Fragmente verwendet werden. Die Herstellung solcher Moleküle sind beispielsweise in Harlow and Lane ”Antibodies, A Laboratory Manual”, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988 oder EP-A 0 451 und EP 1 100 830 B1 beschrieben. Darüber hinaus ist dem Fachmann bekannt, dass gegen die bereits bekannten Proteine IFNgamma, TNFalpha, EGFR, IL-6, IGFBP1, RANTES und PDGF-BB eine Vielzahl an kommerziell erhältlichen Antiköper gibt, die entsprechend verwendet oder modifiziert werden können.Therefore, the present invention is not limited to antibodies. Agents which can bind directly or indirectly to the marker proteins or fragments thereof are also part of the invention. For example, interacting proteins or peptides or antibody-derived molecules such as Fab, Fv or scFv fragments can be used. The preparation of such molecules are, for example, in Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988 or EP-A 0 451 and EP 1 100 830 B1 described. In addition, it is known to the person skilled in the art that against the already known proteins IFNgamma, TNFalpha, EGFR, IL-6, IGFBP1, RANTES and PDGF-BB there are a multiplicity of commercially available antibodies which can be used or modified accordingly.

Ebenfalls stellt die vorliegende Erfindung Reagenzien wie Aptamere und Spiegelmere oder ähnliches bereit, die gegen die jeweiligen Makerproteine gerichtet sind, vorzugsweise gegen IFNgamma, TNFalpha, IGFBP1, RANTES, PDGF-BB, EGFR oder IL-6 oder eine Mutante, ein Fragment oder eine Variante hiervon.Also, the present invention provides reagents such as aptamers and spiegelmers or the like directed against the respective maker proteins, preferably against IFNgamma, TNFalpha, IGFBP1, RANTES, PDGF-BB, EGFR or IL-6 or a mutant, fragment or variant hereof.

Aptamere sind künstliche DNA- oder RNA-Moleküle, die ein anderes Molekül, z. B. eine Nukleinsäure, ein Protein, kleine organische Verbindungen und sogar ganze Organismen, spezifisch binden können, siehe beispielsweise die europäischen Patentanmeldungen EP 2 467 167 A1 oder EP 2 402 016 A1 . Bei hoher Spezifität und Affinität sowie chemischer Stabilität weisen Aptamere im Vergleich zu Antikörpern eine niedrige Immunogenität auf. Aptamere können zum Beispiel mit Hilfe eines Verfahrens selektiert werden, das als SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) bezeichnet wird ( Ellington und Szostak (1990), Nature 346, 818–822; Gopinath (2007), Anal. Bioanal. Chem. 387, 171–182 ; WO 91/19813 ). Daher eignen sich Aptamere als therapeutische und diagnostische Mittel, siehe beispielsweise Osborne et al. (1997), Curr. Opin. Chem. Biol. 1, 5–9 .Aptamers are artificial DNA or RNA molecules that contain another molecule, e.g. As a nucleic acid, a protein, small organic compounds and even whole organisms, can specifically bind, see, for example, the European patent applications EP 2 467 167 A1 or EP 2 402 016 A1 , With high specificity and affinity as well as chemical stability, aptamers have low immunogenicity compared to antibodies. For example, aptamers can be selected by a method called SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) ( Ellington and Szostak (1990), Nature 346, 818-822; Gopinath (2007), Anal. Bioanal. Chem. 387, 171-182 ; WO 91/19813 ). Therefore, aptamers are useful as therapeutic and diagnostic agents, see for example Osborne et al. (1997), Curr. Opin. Chem. Biol. 1, 5-9 ,

Zu der Gruppe der künstlichen RNA- oder DNA Moleküle gehören auch die Spiegelmere. Diese sind spiegelverkehrte RNA-Abschnitte, die resistent gegen enzymatischen Abbau sind, siehe beispielsweise die europäische Patentanmeldungen EP 2 431 377 A1 . Sie besitzen damit neben der hohen Spezifität und Affinität eine längere Lebensdauer und Effizienz und können zudem sehr wirksame Inhibitoren Ihrer Zielmoleküle darstellen, zudem vereinen sie die Vorzüge von niedermolekularen Substanzen und Biopharmazeutika, siehe beispielsweise die interantionalen Anmeldungen WO 2012/025251 A2 und WO 2004/013274 . Aufgrund ihrer spiegelbildlichen Struktur werden Spiegelmere in Stoffwechselprozessen nicht abgebaut und binden nicht an die natürlich vorkommenden Nukleinsäuren. Im Gegensatz zu einer Reihe von konventionellen Oligonukleotiden lösen Spiegelmere nicht die angeborene Immunantwort über Toll-like Rezeptoren (TLR) aus. Darüber hinaus zeigten sie in präklinischen Versuchsreihen ein überaus vorteilhaftes Immunogenitätsprofil. The group of artificial RNA or DNA molecules also includes the spiegelmers. These are mirror-inverted RNA sections which are resistant to enzymatic degradation, see, for example, the European patent applications EP 2 431 377 A1 , In addition to their high specificity and affinity, they have longer lifetimes and higher efficiencies and can also be very effective inhibitors of their target molecules. They also combine the advantages of low molecular weight substances and biopharmaceuticals, see, for example, the international applications WO 2012/025251 A2 and WO 2004/013274 , Due to their mirror-image structure, spiegelmers are not degraded in metabolic processes and do not bind to the naturally occurring nucleic acids. In contrast to a number of conventional oligonucleotides, spiegelmers do not trigger the innate immune response via toll-like receptors (TLRs). In addition, in preclinical trials they showed a very favorable immunogenicity profile.

Wie in den Beispielen dargelegt, korreliert das Vorhandensein der erfindungsgemäßen Markerproteine TNFalpha, IFNgamma und EGFR, mit einer NF1 Erkrankung (Beispiele 2 und 3, – ) oder im Falle von IGFBP1 und/oder RANTES mit dem Vorhandensein eines NF1 assoziierten Tumors, dem malignen MPNST (siehe Beispiele 4 und 6 sowie die und ). Zusätzlich liegt eine veränderte die Konzentration von PDGF-BB in plexiformen Neurofibromen vor (siehe Beispiel 3 sowie ). Ebenfalls wird eine veränderte, d. h. erhöhte Konzentration von PDGF-BB in NF1 Patienten sowie in NF1 Patienten mit MPNST Tumoren beobachtet (Siehe ). Somit sind diese Proteine gewissermaßen Indikatoren für pathologische Vorgänge im Rahmen der NF1 Erkrankung in einem zu untersuchenden Patienten.As demonstrated in the Examples, the presence of the marker proteins of the invention, TNFalpha, IFNgamma and EGFR, correlates with NF1 disease (Examples 2 and 3). - ) or, in the case of IGFBP1 and / or RANTES, with the presence of an NF1 - associated tumor, the malignant MPNST (see Examples 4 and 6 and the US Pat and ). In addition, there is a change in the concentration of PDGF-BB in plexiform neurofibromas (see Example 3 and Figs ). Also, an altered, ie increased, concentration of PDGF-BB is observed in NF1 patients as well as in NF1 patients with MPNST tumors (See ). Thus, these proteins are to a certain extent indicators of pathological processes in the context of NF1 disease in a patient to be examined.

Daher umfasst die vorliegende Anmeldung ebenfalls die Verwendung eines Kits in dem erfindungsgemäßen Verfahren wie vorstehend aufgeführt, wobei das Kit Reagenzien umfasst, die spezifisch für den Nachweis von mindestens einem Protein ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus IFNgamma, IL-6, TNFalpha, EGFR, IGFBP1, RANTES und PDGF-BB oder Fragmente davon sind, wobei die Reagenzien vorzugsweise Antikörper oder Fragmente davon umfassen.Therefore, the present application also encompasses the use of a kit in the method of the invention as listed above, wherein the kit comprises reagents specific for the detection of at least one protein selected from a group consisting of IFNgamma, IL-6, TNFalpha, EGFR, IGFBP1 , RANTES and PDGF-BB or fragments thereof, the reagents preferably comprising antibodies or fragments thereof.

Die Verwendung solcher Kits sind für eine Vielzahl von Zwecken nützlich, einschließend forensische Analysen, diagnostische und Anwendungen sowie epidemiologische Studien an NF1 Krankheiten und deren damit verbundenen Symptomen, jedoch nicht auf diese beschränkt. Ein derartiges Kit würde typischerweise markierte oder unmarkierte Antikörper oder Fragmente davon, Aptamere, Spiegelmere oder Ähnliches enthalten.The use of such kits is useful for a variety of purposes, including, but not limited to, forensics, diagnostics, and applications, as well as epidemiological studies of NF1 diseases and their associated symptoms. Such a kit would typically contain labeled or unlabeled antibodies or fragments thereof, aptamers, spiegelmers or the like.

Weiterhin kann das Kit auch Puffer, ein spezifisches Konjugat nebst Enzym, eine Waschlösung, eine Substratlösung zum Nachweis der Immunreaktion und/oder eine Stopplösung umfassen. Die Puffer, das spezifische Konjugat nebst Enzym, die Waschlösung, die Substratslösung zum Nachweis der Enzymreaktion und die Stopplösung sind dem Fachmann bekannt. Es wäre beispielsweise ausreichend, dass das Kit Antikörper oder Fragmente davon, Aptamere, Spiegelmere, spezifisch für die erfindungsgemäßen Markerproteine umfasst und erst kurz vor der Testung des biologischen Materials die Puffer und anderen Lösungen hinzugegeben werden. Es ist jedoch auch möglich, Antikörper oder Fragmente davon, Aptamere, Spiegelmere an eine feste Phase gebunden im Kit vorzugeben. Für den Nachweis der erfindungsgemäßen Marker müssten dann spezifische Konjugate, Waschlösung, Substratlösung und Stopplösung, die Bestandteile des Kits sein können, nach einem dem Fachmann bekannten Modus zugegeben werden.Furthermore, the kit may also comprise buffer, a specific conjugate plus enzyme, a washing solution, a substrate solution for detecting the immune reaction and / or a stop solution. The buffers, the specific conjugate plus enzyme, the wash solution, the substrate solution for detection of the enzyme reaction and the stop solution are known in the art. It would be sufficient, for example, that the kit comprises antibodies or fragments thereof, aptamers, spiegelmers, specific for the marker proteins according to the invention and the buffers and other solutions are added only shortly before the testing of the biological material. However, it is also possible to predetermine antibodies or fragments thereof, aptamers, spiegelmers bound to a solid phase in the kit. For the detection of the markers according to the invention, it would then be necessary to add specific conjugates, washing solution, substrate solution and stop solution, which may be constituents of the kit, according to a mode known to the person skilled in the art.

Neben den Mitteln zur Durchführung der genannten erfindungsgemäßen Verfahren kann das Kit weiterhin gegebenenfalls weitere geeignete Komponenten und/oder Hilfsstoffe umfassen. Geeignete pharmazeutische Hilfsstoffe sind in Remington's Pharmaceutical Sciences beschrieben.In addition to the means for carrying out the abovementioned methods according to the invention, the kit may furthermore optionally comprise further suitable components and / or auxiliaries. Suitable pharmaceutical excipients are described in Remington's Pharmaceutical Sciences.

Die erfindungsgemäße Konzeption ist zum Einen besonders aussagekräftig, da sie auf der Analyse definierter Biomarker in einer definierten Probe basiert, welche im direktem Zusammenhang mit einer NF1 Erkrankung stehen, wobei die Anwesenheit oder eine erhöhte Menge von TNFalpha, IFNgamma und optional IL-6 bzw. erniedrigte Menge von EGFR in einer wie oben definierten Probe bezeichnend für die Anwesenheit einer NF1 Erkrankung ist und eine erhöhte Menge an IGFBP1, RANTES und/oder erniedrigte Menge an PDGF-BB bezeichnend für die Anwesenheit eines NF1 assoziierten Tumors ist. Es ist bekannt, dass sich ein MPNST durch den malignen Verlauf von vorher existierenden PNF entwickelt, wodurch das Risiko von NF1 Patienten mit PNF bis zu 50% ansteigt einen MPNST Tumor zu entwickeln [12, 13]. Somit kann mit Hilfe der erfindungsgemäßen Marker zum ersten Mal ein umfassendes Diagnoseverfahren bereitgestellt, mit dem es ermöglicht wird ohne invasive Verfahren von der Diagnosestellung einer NF1 Erkrankung den weiteren Verlauf der Krankheit, beispielsweise der Entstehung von PNF Tumoren zu überwachen und bei Beginn/Auftreten eines MPNST therapeutische Maßnahmen einzuleiten.On the one hand, the concept according to the invention is particularly meaningful, since it is based on the analysis of defined biomarkers in a defined sample, which are directly related to a NF1 disease, wherein the presence or an increased amount of TNFalpha, IFNgamma and optionally IL-6 or decreased amount of EGFR in a sample as defined above is indicative of the presence of NF1 disease and an increased amount of IGFBP1, RANTES and / or decreased amount of PDGF-BB is indicative of the presence of an NF1-associated tumor. It is known that an MPNST develops through the malignant course of pre-existing PNF, increasing the risk of NF1 patients with PNF by up to 50% to develop an MPNST tumor [12, 13]. Thus, with the aid of the markers according to the invention, a comprehensive diagnostic method can be provided for the first time, which makes it possible to monitor the further course of the disease, for example the development of PNF tumors, and the onset / onset of an MPNST without invasive procedures from the diagnosis of NF1 disease to initiate therapeutic measures.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls ein Kit umfassend Reagenzien, die spezifisch für den Nachweis von (i) IFNgamma, TNFalpha, und EGFR und/oder (ii) IGFBP1 und RANTES sind; und optional für PDGF-BB und/oder IL-6. Therefore, the present invention also relates to a kit comprising reagents specific for the detection of (i) IFNgamma, TNFalpha, and EGFR and / or (ii) IGFBP1 and RANTES; and optionally for PDGF-BB and / or IL-6.

Beschreibungsgemäß wird das Kit vorzugsweise zur Diagnose und/oder der Früherkennung von einer NF1 Erkrankungen oder eines NF1 assoziierten Tumors und/oder zur Überwachung der Entwicklung der NF1 Erkrankung und die damit assoziierten klinischen Symptome verwendet. Diesbezüglich ist es durchaus möglich, dass das Kit in zwei Teilen, getrennt oder gemeinsam vertrieben wird. Wobei ein Teil des Kits derart ausgestaltet ist, dass es eine NF1 Erkrankung durch Nachweis mindestens einem der erfindungsgemäßen Marker IFNgamma, TNFalpha, order EGFR umfasst und einen zweiten Teil eines Kits, derart ausgestaltet ist, dass es einen NF1 assoziierten Tumor durch Nachweis von mindestens einem der erfindungsgemäßen Marker IGFBP1 und RANTES umfasst. Weiterhin könnte in einer bevorzugten Ausführungsform der erste Teil des Kits Reagenzien, die spezifisch für den Nachweis von IL-6 und der zweite Teil des Kits Reagenzien, die spezifisch für den Nachweis von PDGF-BB sind, enthalten.As described, the kit is preferably used for the diagnosis and / or early detection of NF1 disease or NF1 associated tumor and / or for monitoring the development of NF1 disease and the associated clinical symptoms. In this regard, it is quite possible that the kit will be distributed in two parts, separately or together. Wherein a part of the kit is designed to comprise a NF1 disease by detection of at least one of the markers IFNgamma, TNFalpha or EGFR according to the invention and a second part of a kit designed to detect an NF1 associated tumor by detection of at least one the inventive marker IGFBP1 and RANTES comprises. Furthermore, in a preferred embodiment, the first part of the kit could contain reagents specific for the detection of IL-6 and the second part of the kit reagents specific for the detection of PDGF-BB.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Verwendung eines Kits oder das Kit wie vorstehend definiert Reagenzien, die an einem Träger gebunden sind, vorzugsweise auf einem Microarray oder einem Teststreifen. Beispielsweise können Antikörper oder Fragmente davon an einer festen Phase immobilisiert werden.In a particularly preferred embodiment of the present invention, the use of a kit or kit as defined above comprises reagents bound to a carrier, preferably on a microarray or a test strip. For example, antibodies or fragments thereof can be immobilized on a solid phase.

Wie vorstehend erläutert sind die gängigsten diagnostischen Nachweisverfahren die FACS Analyse, die verschiedenen Arten von Protein-Chip Microarrays sowie der Streifentest/Lateral Flow Immunotest/Teststreifen. Der Teststreifen kann beispielsweise in Serum – oder andere biologische Proben – eingetaucht und inkubiert werden. Anhand einer spezifischen biochemischen Reaktion auf dem Teststreifen nach Bildung der erfindungsgemäßen Markerprotein-Antikörperkomplexes kann dann eine spezifische Farbreaktion ausgelöst werden, mit deren Hilfe die Markerproteine detektiert werden können. In Analogerweise kann auch ein Microarray, bevorzug ein Protein Chip Microarray, wie vorstehend beschreiben, verwendet werden.As discussed above, the most common diagnostic detection methods are FACS analysis, the various types of protein chip microarrays, and the strip / lateral flow immunoassay / test strips. For example, the test strip may be dipped in serum or other biological samples and incubated. On the basis of a specific biochemical reaction on the test strip after formation of the marker protein-antibody complex according to the invention, a specific color reaction can then be initiated with the aid of which the marker proteins can be detected. Analogously, a microarray, preferably a protein chip microarray, as described above can also be used.

Der Fachmann weiß, dass sich andere Reagenzien wie Aptamere, Spiegelmere oder Derivate dieser Nachweismoleküle ebenfalls bestens zum Nachweis der erfindungsgemäßen Marker eignen und in analogerweise verwendet werden können.The person skilled in the art knows that other reagents such as aptamers, spiegelmers or derivatives of these detection molecules are likewise very suitable for detecting the markers according to the invention and can be used in analogy.

Die experimentellen Daten der vorliegenden Erfindung im Lichte der Erkenntnisse des Stand der Technik zeigen, dass eine permanente Entzündungsreaktion in NF1 Patienten, hervorgerufen durch die erhöhte Ras Aktivität aufgrund der NF1 Haploinsuffizienz aller Körperzellen zu den wesentlichen klinischen Manifestationen bzw. Symptomen der NF1 Erkrankung beiträgt. In diesem Zusammenhang ist es interessant, dass die erfindungsgemäßen Markerproteine (IFNgamma, TNFalpha) den Th1 pro-inflamatorischen Zytokinen und (IL-6 sowie TNFalpha) den Th17 Zytokinen zugeordnet werden können, wobei aus der Literatur bekannt ist, dass die Th1-Zytokin vermittelte Immunantwort eine Th2-Antwort unterbindet und hauptsächlich zu Entzündungsvorgängen führt. Der Th17-Reaktionsweg ist wichtig für die Entstehung von Autoimmunerkrankungen, dabei unterdrückt IL-17 effizient Th1-Reaktionen und chronifiziert damit Entzündungsprozesse, siehe beispielsweise Alber et al. Current Immunology Reviews 3 (2007), 3–16 sowie Weaver et al. Annu Rev Immunol 25 (2007), 821–852 . Experimentelle und epidemiologische Studien belegen, dass eine chronische Entzündung mit der Tumorgenese einhergeht und ein wichtiger Faktor für dessen Wachstum ist. Dabei stehen zwei Signaltransduktionswege in wechselseitiger Beziehung zueinander: i) Genetisch-bedingte Auslöser welche zu einer neoplastischen Transformation führen und ein entzündliche Umgebung schaffen, ii) Tumor-infiltrierende Leukozyten sind die Initial-Regulatoren von krebsbedingter Entzündung, siehe beispielsweise Allavena Immunol Rev. 222 (2008), 155–61 .The experimental data of the present invention in light of the findings of the prior art show that a permanent inflammatory response in NF1 patients, caused by the increased Ras activity due to the NF1 haploinsufficiency of all body cells, contributes to the substantial clinical manifestations or symptoms of NF1 disease. In this context, it is interesting that the marker proteins (IFNgamma, TNFalpha) according to the invention can be assigned to the Th1 pro-inflammatory cytokines and (IL-6 and TNFalpha) to the Th17 cytokines, it being known from the literature that the Th1 cytokine mediated Immune response suppresses a Th2 response and leads mainly to inflammatory processes. The Th17 pathway is important for the development of autoimmune diseases, while IL-17 efficiently suppresses Th1 responses and chronicles inflammatory processes, see for example Alber et al. Current Immunology Reviews 3 (2007), 3-16 such as Weaver et al. Annu Rev Immunol 25 (2007), 821-852 , Experimental and epidemiological studies have shown that chronic inflammation is associated with tumorigenesis and is an important factor in its growth. Two signal transduction pathways are mutually related: i) Genetically induced triggers leading to neoplastic transformation and creating an inflammatory environment, ii) Tumor infiltrating leukocytes are the initial regulators of cancerous inflammation, see for example Allavena Immunol Rev. 222 (2008), 155-61 ,

Daher ist eine Blockierung/Neutralisierung der erfindungsgemäßen Markerproteine ein vielversprechender therapeutischer Ansatz für NF1 Patienten. Zudem sind die erfindungsgemäßen Marker in der Früherkennung von der malignen Umwandlung extrem nützlich, da therapeutische Eingriffe frühzeitig initiiert werden können, bevor der Tumor sich weiter entwickelt und zu streuen beginnt, so dass Metastasen entstehen. Dem entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform auch die Verwendung eines Wirkstoffs, der ein Modulator eines der Proteine ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TNFalpha, INFgamma, EGFR, IGFBP1, PDGF-BB, IL-6 und RANTES zur Herstellung eines Medikamentes in der Behandlung eines Patienten mit NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumors, vorzugsweise wobei der Patient gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wie vorstehend beschrieben diagnostiziert wurde.Therefore, blocking / neutralization of the marker proteins of the invention is a promising therapeutic approach for NF1 patients. In addition, the markers of the present invention are extremely useful in the early detection of malignant transformation since therapeutic interventions can be initiated early before the tumor progresses and begins to scatter, resulting in metastases. Accordingly, in one embodiment, the present invention also relates to the use of a drug which is a modulator of one of the proteins selected from the group consisting of TNFalpha, INFgamma, EGFR, IGFBP1, PDGF-BB, IL-6 and RANTES for the manufacture of a medicament in treating a patient with NF1 and / or an NF1-associated tumor, preferably wherein the patient has been diagnosed according to the method of the invention as described above.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff ”Wirkstoff” einen Modulator, wie vorstehend definiert, der sowohl ein Agonist oder Antagonist, welche als Inhibitoren oder auch als Aktivatoren wirken können, sein kann. Diesbezüglich geeignete inhibierende Modulatoren bzw. Wirkstoffe schließen ein: anti-TNFalpha, anti-IFNgamma, anti-IGFBP1 anti-RANTES und/oder anti-PDGF-BB-Antikörper, anti-IL-6, Antigen-bindende Fragmente davon und lösliche Rezeptormoleküle, die spezifisch an diese Proteine binden sowie Verbindungen, die die Synthese, Freisetzung oder Wirkung auf Targetzellen der genannten Proteine verhindern und/oder inhibieren. Diese Verbindungen sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise wird in Michiels, J. Biochem Cell Biol. 30 (1998), 505 ) der lösliche IFNgamma Rezeptor als ein Inhibitor für IFNgamma beschrieben, weitere Inhibitoren sind in der internationalen Anmeldung WO 2011069141 A1 oder EP 2211905 A1 enthalten. Für TNFalpha sind beispielsweise Thalidomid, Tenidap, Phosphodiesterase-Inhibitoren (z. B. Pentoxifyllin und Rolipram), A2b-Adenosinrezeptor-Agonisten und A2b-Adenosinrezeptor-Enhancer bekannt; für IGFBP1 wird Lithium Chlorid, Insulin als auch humane anti-IGFBP1 Antikörper in der Literatur beschrieben, siehe beispielsweise Lewitt et al., Journal of Endocrinology 171 (2001), R11–R15 sowie die internationale Anmeldung WO 96/001125 . Für RANTES sind beispielsweise TGF-β1, Staurosporin, Wortmannin, oder Pertussis Toxin bekannt, siehe beispielsweise Kapp et al., J Invest Dermatol. 102 (1994), 906–14 . Für PDGF-BB ist beispielsweise Lycopene in WU et al., Biochem Soc Trans. 35 (2007), 377–8 als auch Imatinib beschrieben. For the purposes of the present invention, the term "active ingredient" denotes a modulator, as defined above, which may be either an agonist or antagonist, which may act as inhibitors or as activators. Suitable inhibitory modulators in this regard include: anti-TNFα, anti-IFNγ, anti-IGFBP1 anti-RANTES and / or anti-PDGF BB antibodies, anti-IL-6, antigen-binding fragments thereof and soluble receptor molecules, which specifically bind to these proteins and compounds which prevent and / or inhibit the synthesis, release or action on target cells of said proteins. These compounds are known to the person skilled in the art. For example, in Michiels, J. Biochem Cell Biol. 30 (1998), 505 ) the soluble IFNgamma receptor as an inhibitor of IFNgamma, further inhibitors are in the international application WO 2011069141 A1 or EP 2211905 A1 contain. For TNFalpha, for example, thalidomide, tenidap, phosphodiesterase inhibitors (eg, pentoxifylline and rolipram), A2b adenosine receptor agonists and A2b adenosine receptor enhancers are known; For IGFBP1, lithium chloride, insulin as well as human anti-IGFBP1 antibodies are described in the literature, see for example Lewitt et al., Journal of Endocrinology 171 (2001), R11-R15 as well as the international application WO 96/001125 , For RANTES, for example, TGF-β1, staurosporine, wortmannin, or pertussis toxin are known, see for example Kapp et al., J. Invest Dermatol. 102 (1994), 906-14 , For PDGF-BB, for example, Lycopene is in WU et al., Biochem Soc. Trans. 35 (2007), 377-8 as well as imatinib.

Es können erfindungsgemäß auch andere Entzündungsvermittler als die beschriebenen Wirkstoffe anstatt der oder zusätzlich zu diesen Wirkstoffen verwendet werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff ”Entzündungsvermittler” auf einen Wirkstoff bzw. inhibierend-wirkenden Modulator, der die pro-entzündliche Vermittleraktivität verringert, blockiert, inhibiert, außer Kraft setzt oder stört. Typische Entzündungshemmer, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Wirkstoffe ein, die die IL-1-Aktivität, -synthese oder die -Rezeptorsignalgebung verringern, blockieren, inhibieren, außer Kraft setzen oder stören, wie anti-IL-1-Antikörper, lösliches IL-1R, IL-1-Rezeptorantagonist oder andere geeignete Peptide und kleine Moleküle; Wirkstoffe, die die Aktivität, Synthese oder Rezeptorsignalgebung anderer pro-entzündlicher Vermittler, wie GM-CSF und Mitglieder der Zytokin-IL-8-Familie, verringern, blockieren, inhibieren, außer Kraft setzen oder stören; und Zytokine mit anti-entzündlichen Eigenschaften, wie IL-4, IL-10, IL-13 und TGFβ. Zusätzlich können andere anti-entzündliche Wirkstoffe, wie der anti-rheumatische Wirkstoff Methotrexat, ggf. in Verbindung mit dem IL-12-Antagonisten und/oder dem TNF-Antagonisten verabreicht werden. Entzündungsvermittler und anti-entzündliche Wirkstoffe sind auch in dem US Patent Nr. 6270766 beschrieben.It is also possible according to the invention to use inflammation mediators other than the active substances described instead of or in addition to these active substances. In accordance with the present invention, the term "inflammatory mediator" refers to an inhibitory modulator that reduces, blocks, inhibits, abrogates, or interferes with pro-inflammatory mediator activity. Typical anti-inflammatory agents that can be used in the context of the present invention include agents that reduce, block, inhibit, defeat or disrupt IL-1 activity, synthesis or receptor signaling, such as anti-IL-1 Antibody, soluble IL-1R, IL-1 receptor antagonist or other suitable peptides and small molecules; Agents that reduce, block, inhibit, override or disrupt the activity, synthesis or receptor signaling of other pro-inflammatory mediators such as GM-CSF and members of the cytokine IL-8 family; and cytokines with anti-inflammatory properties, such as IL-4, IL-10, IL-13 and TGFβ. In addition, other anti-inflammatory agents, such as the anti-rheumatic agent methotrexate, may optionally be administered in conjunction with the IL-12 antagonist and / or the TNF antagonist. Inflammation mediators and anti-inflammatory agents are also in the US Patent No. 6270766 described.

Erste Versuche der Erfinder plexiforme Neurofibrome mit Imatinib (Glivec oder STI571, ein 2-Phenylaminopyrimidinderivat) zu behandeln, haben bei einigen Patienten gutes Ansprechen gezeigt. Imatinib ist ein Inhibitor strukturell verwandter Rezeptortyrosinkinasen zu denen auch der Rezeptor, welcher ein Tyrosinkinaserezeptor ist, für PDGF (PDGFR) gehört. PDGF-BB ein Wachstumsfaktor, der auf gliale Zellen wie zum Beispiel Schwannzellen wirkt. Nervenscheidentumore wie MPNST und Neurofibrome gehen aus Schwannzellen hervor. Die Blockierung des PDGF/PDGFR Systems ist daher vielversprechend zur Behandlung von Nervenscheidentumoren.First attempts by the inventors to treat plexiform neurofibromas with imatinib (Glivec or STI571, a 2-phenylaminopyrimidine derivative) have shown good response in some patients. Imatinib is an inhibitor of structurally related receptor tyrosine kinases, which also includes the receptor, which is a tyrosine kinase receptor, for PDGF (PDGFR). PDGF-BB is a growth factor that acts on glial cells such as Schwann cells. Nerve sheath tumors such as MPNST and neurofibromas are derived from Schwann cells. The blocking of the PDGF / PDGFR system is therefore promising for the treatment of nerve sheath tumors.

Daher eignen sich besonders Wirkstoffe, wie vorstehend definiert sowie neutralisierende Antikörper oder Fragmente davon, die gegen IGFBP1 und RANTES und/oder PDGF-BB gerichtet sind zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines NF1 assoziierten Tumors, insbesondere eines malignen peripheren Nervenscheidentumor (MPNST) oder eines plexiformen Neurofibroms (PNF), vorzugsweise wobei der Patient gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wie vorstehend beschrieben diagnostiziert wurde. Besonders bevorzugt ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Verwendung einer Kombination von IGFBP1 und RANTES spezifischen Wirkstoffen zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines MPNST. Weiterhin besonders bevorzugt ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Verwendung von einem PDGF-BB spezifisch inhibierenden Modulator (Antagonist) oder Wirkstoff zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines PNF in einem NF1 Patienten oder eines PDGF-BB inhibierenden Modulators zur Behandlung eines MPNST. Wie weiterhin aus ersichtlich, ist das PDGF-BB Level in NF1 Patienten im Vergleich zu gesunden Pateinten erhöht und somit eignen sich PDGF-BB Antagonisten ebenfalls zur Behandlung von NF1 assoziierten Symptomen.Thus, particularly drugs as defined above, as well as neutralizing antibodies or fragments thereof, directed against IGFBP1 and RANTES and / or PDGF-BB are useful in the preparation of a medicament for the treatment of a NF1-associated tumor, in particular a malignant peripheral nerve sheath tumor (MPNST) or a plexiform neurofibroma (PNF), preferably wherein the patient has been diagnosed according to the method of the invention as described above. Particularly preferred within the scope of the present invention is the use of a combination of IGFBP1 and RANTES specific drugs for the manufacture of a medicament for the treatment of an MPNST. In the context of the present invention, the use of a PDGF-BB-specific inhibiting modulator (antagonist) or drug for the preparation of a medicament for the treatment of a PNF in an NF1 patient or a PDGF-BB inhibiting modulator for the treatment of an MPNST is also particularly preferred. How to continue As can be seen, the PDGF-BB level is increased in NF1 patients compared to healthy Pateinten and thus PDGF-BB antagonists are also suitable for the treatment of NF1 associated symptoms.

Da wie in den Beispielen 2 und 3 sowie den und aufgeführt, das PDGF-BB Level in PNF erniedrigt verglichen zu NF1 Patienten ohne PNF, als auch das EGFR Level in Seren von NF1 Patienten verglichen zu nicht NF1 Betroffenen signifikant erniedrigt vorliegt, umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines PDGF-BB und/oder EGFR-spezifisch aktivierenden Modulators (Agonist) als Wirkstoff zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines NF1 Patienten, vorzugsweise wobei der Patient gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wie vorstehend beschrieben diagnostiziert wurde. Agonisten des PDGF-BB Rezeptors sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise PDGF-BB oder PDGF-Rezeptor-aktivierende Substanzen, wie Tyrosinkinaserezeptoragonisten. Bevorzugt ist der Agonist derart ausgestaltet, dass er als duales Molekül verabreicht wird, wobei ein Teil des Moleküls spezifisch PNF Zellen erkennt und somit zu einer spezifischen Erhöhung von PDGF-BB in PNF Zellen führt. Obwohl bisher die Aktivierung insbesondere des EGFR Levels und/oder PDGF-BB aus bisheriger Sicht eines Fachmanns nicht wünschenswert erschien, so sind allgemein Agonisten von der vorliegenden Erfindung explizit umfasst, da erwartet werden kann, dass in naher Zukunft solche Agonisten im Sinne der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise Verwendung finden.As in Examples 2 and 3 and the and which reduces PDGF-BB level in PNF compared to NF1 patients without PNF, and the EGFR level in sera of NF1 patients is significantly decreased compared to non-NF1 patients, the present invention also includes the use of a PDGF-BB and / or EGFR-specific activating modulator (agonist) as an active ingredient for the manufacture of a medicament for the treatment of a NF1 patient, preferably wherein the patient was diagnosed according to the method of the invention as described above. Agonists of the PDGF BB receptors are known in the art and include, for example, PDGF-BB or PDGF receptor activating substances such as tyrosine kinase receptor agonists. Preferably, the agonist is designed to be administered as a dual molecule with a portion of the molecule specifically recognizing PNF cells, thus resulting in a specific increase in PDGF-BB in PNF cells. Although activation of, in particular, the EGFR level and / or PDGF-BB has hitherto not been desirable to a person skilled in the art, general agonists of the present invention are explicitly encompassed, since it may be expected that in the near future such agonists will be used within the meaning of the present invention find use in an advantageous manner.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung somit auch die Verwendung eines anti-Tumorwirkstoffs zur Herstellung eines Medikamentes in der Behandlung eines Patienten mit NF1 und/oder eines NF1 assoziierten Tumors, wobei der Patient gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wie vorstehend beschrieben diagnostiziert wurde.Further, the present invention thus also relates to the use of an antitumor agent for the manufacture of a medicament in the treatment of a patient with NF1 and / or an NF1-associated tumor, wherein the patient has been diagnosed according to the method of the invention as described above.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe können einem Individuum prophylaktisch oder therapeutisch verabreicht werden. Weiterhin können alle TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IL-6, IGFBP1, RANTES und/oder PDGF-BB-spezifische Wirkstoffe gemeinsam, gleichzeitig oder nur in einer Kombination aus einem, zwei, drei, vier oder fünf (in der gleichen oder anderen Zusammensetzungen) oder sequentiell verabreicht werden.The active compounds according to the invention can be administered prophylactically or therapeutically to an individual. Furthermore, all TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IL-6, IGFBP1, RANTES and / or PDGF-BB specific agents may be co-administered, simultaneously or only in a combination of one, two, three, four or five (in the same or different compositions ) or sequentially.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung können einem Individuum auf verschiedenen Wegen verabreicht werden. Die Verabreichungswege schließen ein intradermale, transdermale (z. B. in Slow-Release-Polymeren), intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse (einschließend Infusion und/oder Bolus-Injektion), subkutane, orale, topische, epidurale, buccale, rektale, vaginale und intranasale Wege. Andere geeignete Verabreichungswege können auch verwendet werden, beispielsweise um Absorption durch epitheliale oder mucokutane Deckschichten zu erreichen. Zur parenteralen (z. B. intravenös, subkutan, intramuskulär) Verabreichung können TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IL-6, IGFBP1, RANTES und/oder PDGF-BB-Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung als Lösung, Suspension, Emulsion oder gefriergetrocknetes Pulver formuliert werden zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen parenteralen Vehikel. Beispiele für solche Vehikel sind Wasser, Kochsalzlösung, Ringersche Lösung, Dextroselösung und 5%-Humanserum-Albumin. Liposomen und nicht-wässrige Vehikel wie fixierte Öle können auch verwendet werden. Das Vehikel oder gefriergetrocknete Pulver kann Additive enthalten, die die Isotonie (z. B. Natriumchlorid, Mannitol) oder die chemische Stabilität (z. B. Puffer und Konservierungsstoffe) aufrecht erhalten. Die Formulierung wird mit üblicherweise verwendeten Techniken sterilisiert.The active compounds of the present invention can be administered to an individual in a variety of ways. Routes of administration include intradermal, transdermal (eg in slow-release polymers), intramuscular, intraperitoneal, intravenous (including infusion and / or bolus injection), subcutaneous, oral, topical, epidural, buccal, rectal, vaginal and intranasal routes. Other suitable routes of administration may also be used, for example to achieve absorption by epithelial or mucocutaneous cover layers. For parenteral (eg, intravenous, subcutaneous, intramuscular) administration, TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IL-6, IGFBP1, RANTES, and / or PDGF-BB drugs of the present invention may be formulated as a solution, suspension, emulsion, or lyophilized powder together with a pharmaceutically acceptable parenteral vehicle. Examples of such vehicles are water, saline, Ringer's solution, dextrose solution and 5% human serum albumin. Liposomes and non-aqueous vehicles such as fixed oils may also be used. The vehicle or lyophilized powder may contain additives that maintain isotonicity (eg, sodium chloride, mannitol) or chemical stability (eg, buffers and preservatives). The formulation is sterilized by commonly used techniques.

TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IL-6, IGFBP1, RANTES und/oder PDGF-BB-spezifische Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung können auch durch Gentherapie verabreicht werden, wobei dem Patienten ein DNA-Molekül, das ein bestimmtes therapeutisches Protein oder Peptid kodiert, verabreicht wird, z. B. mittels eines Vektors, der die Expression und Sekretion des bestimmten Proteins oder Peptids in therapeutischen Mengen in vivo veranlasst. Zusätzlich können TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IL-6, IGFBP1, RANTES und/oder PDGF-BB-spezifische Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung zusammen mit anderen Komponenten wie Hilfsstoffen verabreicht werden, beispielsweise pharmazeutisch verträgliche oberflächenentspannende Hilfsstoffe (z. B. Glyzeride), Korrigenzien (z. B. Laktose), Träger, Verdünnungsmittel und Vehikel. Falls gewünscht, können ebenfalls bestimmte Süßungs-, Geschmacks- oder Farbstoffe hinzugefügt werden.TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IL-6, IGFBP1, RANTES and / or PDGF-BB specific agents of the present invention may also be administered by gene therapy wherein the patient is administered a DNA molecule encoding a particular therapeutic protein or peptide is, for. By means of a vector which induces the expression and secretion of the particular protein or peptide in vivo in therapeutic amounts. In addition, TNFalpha, IFNgamma, EGFR, IL-6, IGFBP1, RANTES and / or PDGF-BB specific agents of the present invention may be administered together with other components such as excipients, for example pharmaceutically acceptable surface-relaxing adjuvants (e.g., glycerides), corrigents (eg lactose), carrier, diluent and vehicle. If desired, certain sweetening, flavoring or coloring agents may also be added.

Der Offenbarungsgehalt der vor- und nachstehend zitierten Dokumente aus dem Stand der Technik ist hiermit durch Bezugnahme in dieser Anmeldung enthalten, insbesondere betreffend die Herstellung von erfindungsgemäßen Proteinen, damit beladene Chips und Arrays, Vektoren, Wirtszellen, Antikörper, transgene Tiere, etc. Diese und andere Ausführungsformen sind dem Fachmann offenbart und offensichtlich und umfasst durch die Beschreibung und die Beispiele der vorliegenden Erfindung. Weiterführende Literatur zu einer der oben angeführten Werkstoffen und elektronischen Hilfsmitteln, die im Sinne der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können dem Stand der Technik entnommen werden, z. B. aus öffentlichen Bibliotheken unter z. B. der Benutzung elektronischer Hilfsmittel. Zudem bieten sich andere öffentliche Datenbanken an wie die ”Medline”, die über das Internet zur Verfügung stehen.The disclosure content of the prior art documents cited above and below is hereby incorporated by reference in this application, in particular regarding the production of proteins according to the invention, so loaded chips and arrays, vectors, host cells, antibodies, transgenic animals, etc. These and other embodiments are disclosed and apparent to those skilled in the art, and encompassed by the description and examples of the present invention. Further literature on any of the above-mentioned materials and electronic aids that can be used in the context of the present invention can be found in the prior art, for. B. from public libraries under z. B. the use of electronic aids. In addition, other public databases are available, such as the "Medline", which are available over the Internet.

Techniken zur Ausführung der Erfindung sind dem Fachmann bekannt und können der einschlägigen Literatur entnommen werden, siehe beispielsweise Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) ; DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985) ; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984) ; Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195 ; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harnes & S. J. Higgins eds. 1984) ; Transcription And Translation (B. D. Harnes & S. J. Higgins eds. 1984) ; Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987) ; Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986) ; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984) ; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.) ; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory) ; Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987) ; Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I–IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986) ; Extracting information from cDNA arrays, Herzel et al., CHAOS 11, (2001), 98–107 .Techniques for carrying out the invention are known to the person skilled in the art and can be taken from the relevant literature, see, for example Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd ed., Ed. By Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) ; DNA Cloning, Volumes I and II (DN Glover ed., 1985) ; Oligonucleotide Synthesis (MJ Gait ed., 1984) ; Mullis et al. US Pat. 4,683,195 ; Nucleic acid hybridization (BD Harnes & SJ Higgins eds. 1984) ; Transcription And Translation (BD Harnes & SJ Higgins eds. 1984) ; Culture Of Animal Cells (RI Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987) ; Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986) ; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984) ; the Treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., NY) ; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (JH Miller and MP Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory) ; Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al., Eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987). ; Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (DM Weir and CC Blackwell, eds., 1986) ; Extracting information from cDNA arrays, Herzel et al., CHAOS 11, (2001), 98-107 ,

BEISPIELEEXAMPLES

Material und Methodenmaterial and methods

Patienten und SerumentnahmePatients and serum intake

Serumproben von NF1 Patienten wurden von der Abteilung Mund-Kiefer und Gesichtschirurgie, Universitätsklinik Eppendorf, Hamburg bezogen. Alle NF1 Patienten wurden klinisch nach den veröffentlichen Richtlinien und Kriterien diagnostiziert [31]. Serumproben von gesunden Probanden wurden von dem Institut für medizinische Immunologie, Charité-Universitätsmedizin Berlin bezogen. Alle Seren wurden mittels IRB-bestätigten Protokollen gesammelt. Detaillierte Informationen zu den Patienten Kohorten sind Tabelle 1 zusammengestellt. Venöses Blut (1 bis 10 ml) wurde gesammelt, innerhalb von 2 Stunden zentrifugiert und anschließend wurden die Serumproben aliquotiert und bei –80°C bis zur Verwendung gelagert. Frische Aliquots wurden für jede Analyse verwendet. Tabelle 1: Charakteristika der Patientenkohorten.

Kandidatenmarker AuswahlCandidate marker selection

Das Auswählen von Kandidatenmarkern basierte auf einer manuellen Literatursuche in Veröffentlichungen und Datenbanken, welche in (i) Serum, Plasma oder Zellüberständen Proteinlevels von Patienten mit Nerventumoren oder Epitheltumoren oder Zelllinien beschreiben, und in (ii) differenzieller Genexpression zwischen den normalen peripheren Nervensystem, Neurofibromen und MPNST sowie (iii) immunmodulatorische Zytokine. Die so aufgestellte Kandidatenfaktorliste basiert auf der Genontologie (GO) und den Genkarteninformationen [32, 33] weiter reduziert indem solche Faktoren, die bereits eine bekannte Funktion in der Tumorgenese wie beispielsweise Wachstumsbeschleunigung, Migration und Metastasierung, Angiogenese und Immunmodulation aufweisen, ausgewählt wurden. Die abschließende Auswahl der Kandidatenfaktoren wurde anhand der Verfügbarkeit geeigneter Screening Plattformen ausgewählt. Von den 115 ausgewählten möglichen Serumproteinen wurde basierend auf der Verfügbarkeit von Antikörpern für eine individuell angepasste Array-Analyse eine Liste von 56 Kandidatenfaktoren zusammengestellt, die zum Screening von Serumproben ( ) verwendet wurde.The selection of candidate markers was based on a manual literature search in publications and databases describing protein levels of patients with nerve tumors or epithelial tumors or cell lines in (i) serum, plasma or cell supernatants, and in (ii) differential gene expression between the normal peripheral nervous system, neurofibromas and MPNST and (iii) immunomodulatory cytokines. The candidate factor list thus established is further reduced based on genome (GO) and genetic map information [32, 33] by selecting those factors which already have a known function in tumorigenesis, such as growth acceleration, migration and metastasis, angiogenesis and immunomodulation. The final selection of candidate factors was selected based on the availability of suitable screening platforms. Out of the 115 selected possible serum proteins, a list of 56 candidate factors was assembled for the screening of serum samples based on the availability of antibodies for a customized array analysis. ) has been used.

Serum screeningSerum screening

Individuell hergestellte humane Quantibodys^® Arrays (Raybiotech, Inc., GA, USA) wurden verwendet um die Serumproteinkonzentration zu bestimmen. Die Analyse wurde gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Das Imaging wurde mittels Quantibody^® Array Testing Software (Raybiotech, Inc., GA, USA) durchgeführt. Potenzielle Markerproteine wurden zuerst bei einem Screening von 30 Proteinkandidaten unter Verwendung von 60 NF1 Seren identifiziert. Eine weitere zweite Validierung wurde mit den 5 Proteinen, welche signifikante Unterschiede in der ersten Screening Runde aufzeigten, zusammen mit weiteren 26 Kandidatenproteinen durchgeführt. In der zweiten Runde wurden 104 NF1- und 41 Kontrollseren verwendet. Insgesamt wurden 56 Kandidatenproteine gescreent sowie 104 NF1- und 41 Kontrollsera verwendet. Die Kandidatenproteine wurden gleichzeitig mittels multiplexer Erfassung in Dreier-Spots pro Array gescreent. Das heißt, dass alle Seren mindestens dreifach analysiert wurden. Eine Übersicht des Screenings-Verfahrens ist in dargestellt. Serumfaktoren, welche ein signifikant unterschiedliches Level zwischen den einzelnen Gruppen aufwiesen, wurden mittels Festphasenenzymimmunoassays (ELISA) (Abcam, Cambridge, UK) für Insulin ähnliche Wachstumsfaktoren bindende Proteine 1 (IGFBP1), und zytometischen Kügelchen/Beads-Arrays (CBA) (BD Bioscience, Heidelberg, Deutschland) für RANTES (Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed, and Secreted), Interferon γ (IFNγ), Interleukin 6 (IL-6) und Tumornekrosefaktor α (TNFα), in einer ausgewählten Teilgruppe von Serumproben (n = 11) verifiziert. Die Analysen wurden gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Die ”Einfang”-Kügelchen (Capture beads) wurden mit einem FACS-Calibur Durchflusszytometer analysiert (BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland). Die Durchflusszytometriedaten wurden mittels FCAP Array Analysis Software evaluiert (Soff Flow, Inc., MN, USA).Human Quantibodys ^® arrays (RayBiotech, Inc., GA, USA) individually produced were used to determine the serum protein concentration. The analysis was carried out according to the manufacturer's instructions. Imaging was performed by Quantibody ^® Array Testing Software (RayBiotech, Inc., GA, USA). Potential marker proteins were first identified by screening 30 protein candidates using 60 NF1 sera. Another second validation was performed with the 5 proteins that showed significant differences in the first round of screening, along with another 26 candidate proteins. In the second round, 104 NF1 and 41 control sera were used. A total of 56 candidate proteins were screened and 104 NF1 and 41 control sera were used. Candidate proteins were simultaneously screened by multiplex detection in threefold spots per array. This means that all sera were analyzed at least three times. An overview of the screening procedure is in shown. Serum factors, which had significantly different levels between groups, were determined by solid phase enzyme immunoassays (ELISA) (Abcam, Cambridge, UK) for insulin-like growth factor binding proteins 1 (IGFBP1), and cytometic bead arrays (CBA) (BD Bioscience , Heidelberg, Germany) for RANTES (Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed and Secreted), Interferon γ (IFNγ), Interleukin 6 (IL-6) and Tumor Necrosis Factor α (TNFα), in a selected subset of serum samples (n = 11) verified. The analyzes were carried out according to the manufacturer's instructions. Capture beads were analyzed with a FACS-Calibur flow cytometer (BD Biosciences, Heidelberg, Germany). Flow cytometry data was evaluated by FCAP Array Analysis software (Soff Flow, Inc., MN, USA).

Datenauswertungdata analysis

Serumlevel der Markerkandidaten in den NF1 und Kontrollobjekten wurden mittels der Medianebene und des Quartilabstands analysiert. Um alle Daten einer normalen Verteilung zu verifizieren, wurde der Kolmogorow-Smirnow Test verwendet. Ausdifferenzierte Patientengruppen wurden mittels des Mann-Whitney U Test für kontinuierliche nicht-parametrische Variablen verglichen. Um die Aussagefähigkeit der individuellen Marker zu prüfen wurden die Receiver Operating Characteristics (ROC) der Kurven und die Fläche unter dieser Kurve (AUC) berechnet. Es wurde eine Bonferroni Korrektur durchgeführt. Die P-Werte < 0,05 wurden als signifikant angenommen. Statistische Auswertungen wurden mittels SPSS Softwareversion 18 (SPSS, Inc.; IL, USA) und GraphPad Prism Software 5.0 (GraphPad Software Inc., CA, USA) durchgeführt. Detektion der Zytokinenproduktion von T-Lymphozyten mittels Cytometric Bead Array BD 560112 Human TNF FlexSet (Bead C4) BD 558324 Human RANTES Flex Set (Bead D4) BD 558276 Human IL-6 Flex Set (Bead A7) BD 560111 Human IFN-a Flex Set (Bead) BD 560005 Cell Signaling Master Buffer Kit Die Bestimmung von TNFalpha, IL-6, IFNgamma und RANTES mit einem CBA (Cytometric Bead Array) der Firma BD Bioscience.Serum levels of the marker candidates in the NF1 and control subjects were analyzed by median plane and quartile distance. To verify all data of a normal distribution, the Kolmogorov-Smirnov test was used. Differentiated patient groups were compared using the Mann-Whitney U test for continuous non-parametric variables. To test the validity of the individual markers, the receiver operating characteristics (ROC) of the curves and the area under this curve (AUC) were calculated. A Bonferroni correction was made. The P values <0.05 were considered significant accepted. Statistical evaluations were performed using SPSS Software Version 18 (SPSS, Inc., IL, USA) and GraphPad Prism Software 5.0 (GraphPad Software Inc., CA, USA). Detection of cytokine production of T lymphocytes using Cytometric Bead Array BD 560112 Human TNF FlexSet (Bead C4) BD 558324 Human RANTES Flex Set (Bead D4) BD 558276 Human IL-6 Flex Set (Bead A7) BD 560111 Human IFN-a Flex Set (Bead) BD 560005 Cell Signaling Master Buffer Kit The determination of TNFalpha, IL-6, IFNgamma and RANTES with a CBA (Cytometric Bead Array) from BD Bioscience.

Das Prinzip beruht auf der Bindung von spezifischen Antikörpern an sogenannte ”Einfang-Beads” und auf der zeitgleichen Detektion von Zytokinen durch das aus mit Phycoerythrin(PE)-konjugierten Antikörpern bestehende Detektions-Reagenz. Nach Anregung dieses Reagenz entsteht ein fluoreszierendes Signal, welches proportional zur Menge des gebundenen Zytokins ist.The principle is based on the binding of specific antibodies to so-called "capture beads" and on the simultaneous detection of cytokines by the detection reagent consisting of phycoerythrin (PE) -conjugated antibodies. Upon excitation of this reagent, a fluorescent signal is produced which is proportional to the amount of bound cytokine.

Zur Bestimmung der Zytokinkonzentration können 20 μL von jedem Überstand eingesetzt werden. Je 20 μL Probe können je 4 μL der 4 Capture Beads zugegeben werden. Die Inkubation erfolgt für 3 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln. Anschließend werden die Ansätze mit je 400 μL Waschpuffer 5 Minuten (300 × g, Raumtemperatur) zentrifugiert und die Überstände bis auf ein Restvolumen von 100 μL abgenommen. Die Analyse erfolgt mit dem FACSCanto von BD Bioscience und der BDTM CBA Software.To determine the cytokine concentration, 20 μL of each supernatant can be used. For every 20 μL of sample, 4 μL of the 4 capture beads can be added. The incubation is carried out for 3 hours at room temperature in the dark. The mixtures are then centrifuged with 400 μl of washing buffer for 5 minutes (300 × g, room temperature) and the supernatants are removed to a residual volume of 100 μl. The analysis is done with the FACSCanto from BD Bioscience and the BDTM CBA software.

Beispiel 1: Auffindung und Auswahl der KandidatenmarkerproteineExample 1: Detection and Selection of Candidate Marker Proteins

Neurofibromatose Typ 1 (NF1) ist eine erbliche Tumorerkrankung, die durch die Entwicklung von beginnenden Nervenscheidentumoren gekennzeichnet ist, welches in 8 bis 13% der NF1 Patienten in einen peripheren malignen Nervenscheidentumor (MPNST) transformiert. MPNST sind invasive Sarkome mit extrem schlechter Prognose und ihre Entwicklung korreliert mit der internen Tumorlast in NF1-Patienten. Da die Früherkennung von NF1 Patienten, die einen MPNST entwickeln, deutlich den klinischen Erfolg dieser Patienten verbessern würde, ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, Serumbiomarker für die Tumorfrüherkennung zu identifizieren und ihre Korrelation mit den Tumorarten und der internen Tumorlast zu analysieren.Neurofibromatosis type 1 (NF1) is a hereditary malignancy characterized by the development of incipient nerve sheath tumors, which transforms into a peripheral malignant nerve sheath tumor (MPNST) in 8 to 13% of NF1 patients. MPNST are invasive sarcomas with extremely poor prognosis and their development correlates with the internal tumor burden in NF1 patients. Since the early detection of NF1 patients who develop an MPNST would significantly improve the clinical success of these patients, the aim of the present invention is to identify serum biomarkers for early tumor detection and to analyze their correlation with tumor types and internal tumor burden.

Wie vorstehend im Material und Methodenteil beschrieben wurden Antikörper Arrays verwendet um Serummarker allgemein für NF1 und spezifisch für NF1-assozierten Nervenscheidentumor zu identifizieren. Händisch ausgesuchte Daten förderten eine Liste von 115 Proteinen als potenzielle Serummarker für NF1 zu Tage. 79 dieser Proteine werden in PNS und MPNST exprimiert oder werden als tumorgenerische Serumfaktoren beschrieben.As described above in the Material and Methods section, antibody arrays have been used to identify serum markers generally for NF1 and specifically for NF1-associated nerve sheath tumor. Hand-picked data revealed a list of 115 proteins as potential serum markers for NF1. 79 of these proteins are expressed in PNS and MPNST or are described as tumorigenic serum factors.

Die anderen 36 Proteine sind immunmodulatorische Zytokine. Diese wurden ausgewählt, weil es Hinweise darauf gibt, dass die systemische NF1 Haploinsuffizienz in NF1-Patienten möglicherweise zu einer Überexpression von Zytokinen führt [34, 35].The other 36 proteins are immunomodulatory cytokines. These were selected because there is evidence that systemic NF1 haploinsufficiency may result in overexpression of cytokines in NF1 patients [34, 35].

Daher scheint der Grad der immunologischen Deregulation möglicherweise indirekt das Risiko für Tumorwachstum und maligne Transformation zu erhöhen. Seren von 104 NF1-Patienten mit unterschiedlichen Tumortypen und 41 ausgesuchten Kontrollsubjekten (Tabelle 1) wurden gemeinsam analysiert und 56 von den 115 zuerst identifizierten Kandidatenproteinen wurden gescreent ( ). Die statistische Auswertung wurde mittels nicht-parametrischem Mann-Whitney U Test, gefolgt von einer Bonferroni-Korrektur, durchgeführt.Therefore, the degree of immunological deregulation may possibly indirectly increase the risk of tumor growth and malignant transformation. Sera from 104 NF1 patients with different tumor types and 41 selected control subjects (Table 1) were analyzed together and 56 of the 115 first identified candidate proteins were screened ( ). Statistical evaluation was performed by non-parametric Mann-Whitney U test followed by Bonferroni correction.

Beispiel 2: Die inflammatorischen Zytokine IFNγ, TNF-α und IL-6 zeigen signifikant erhöhte und EGFR ein erniedrigtes Serumlevel in NF1-Patienten.Example 2: The inflammatory cytokines IFNγ, TNF-α and IL-6 show significantly increased and EGFR a decreased serum level in NF1 patients.

Wie vorstehend im Abschnitt Material und Methoden aufgeführt, werden die Serumfaktoren, welche ein signifikant unterschiedliches Level zwischen den einzelnen Gruppen aufweisen, mittels Festphasenenzymimmunoassay (ELISA) (Abcam, Cambridge, UK) für Insulin ähnliche Wachstumsfaktoren bindende Proteine 1 (IGFBP1), und zytrometischen Kügelchen/Beads-Arrays (CBA) (BD Bioscience, Heidelberg, Deutschland) für RANTES (Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed, and Secreted), interferon γ (IFNγ), interleukin 6 (IL-6) und Tumornekrosefaktor α (TNFα), gemäß den Herstellerangaben in einer ausgewählten Teilgruppe von Serumproben (n = 11) verifiziert und ausgewertet. Für PDGF-BB kann ebenfalls ein Festphasenenzymimmunoassa von Abcam (PDGF BB Human ELISA Kit (ab100624)) verwendet werden.As noted above in the Materials and Methods section, the serum factors, which have significantly different levels between groups, are determined by solid phase enzyme immunoassay (ELISA) (Abcam, Cambridge, UK) for insulin-like growth factor binding proteins 1 (IGFBP1), and cyclospectrical beads / Beads arrays (CBA) (BD Bioscience, Heidelberg, Germany) for RANTES (Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed and Secreted), interferon γ (IFNγ), interleukin 6 (IL-6) and tumor necrosis factor α (TNFα), according to the manufacturer's instructions in a selected subset of serum samples (n = 11) verified and evaluated. For PDGF-BB, a solid phase enzyme immunoassay of Abcam (PDGF BB Human ELISA Kit (ab100624)) can also be used.

Es lag ein signifikanter Unterschied für sechs Proteine zwischen den jeweiligen Kohorten vor. Die Serumkonzentrationen von allen sechs Markerkandidaten waren unabhängig vom Alter und Geschlecht beobachtet worden. Signifikante Unterschiede in den Serumkonzentrationen von vier Proteinen wurden in NF1-Patienten verglichen zu gesunden Subjekten gefunden ( ). Die Konzentration des epithelialen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) ist signifikant geringer in NF1-Patienten verglichen zu gesunden Subjekten, wobei die inflammotrischen Zytokine IFNγ, TNF-α und IL-6 einen signifikant höheren Serumlevel in NF1-Patienten zeigen.There was a significant difference for six proteins between the respective cohorts. The serum concentrations of all six marker candidates were observed regardless of age and sex. Significant differences in serum concentrations of four proteins were found in NF1 patients compared to healthy subjects ( ). The epithelial growth factor receptor (EGFR) concentration is significantly lower in NF1 patients compared to healthy subjects, with the inflammatory cytokines IFNγ, TNF-α and IL-6 showing a significantly higher serum level in NF1 patients.

Weiterhin werden die NF1 Kohorten in drei klinische Gruppen (NF1-Patienten mit (i) nur kutanten Neurofibromen (cNF), (ii) mit plexiformen Neurofibromen (PNF) und (iii) mit malignen peripheren Nervenscheidentumoren (MPNST), aufgeteilt, siehe auch Tabelle 1. Zur Identifizierung der Unterschiede zwischen gesunden Probanden und NF1 Betroffenen wird eine Varianzanalyse (ANOVA) mit Bonferroni Korrektur durchgeführt. Wenn ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Gruppen gezeigt werden kann, wird zur Differenzierung eine Multivariate Varianzanalyse (MANOVA) angeschlossen, die zum einen eine Unterscheidung zwischen gesunden Probanden und NF1 Betroffenen mit unterschiedlicher Tumorentitäten, zum Anderen auch Unterschiede zwischen den verschiedenen Tumorentitäten selbst ermöglicht.Furthermore, the NF1 cohorts are divided into three clinical groups (NF1 patients with (i) only cutaneous neurofibromas (cNF), (ii) with plexiform neurofibromas (PNF) and (iii) with malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNST), see also table 1. An analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni correction is performed to identify the differences between healthy subjects and NF1 subjects If a significant difference between the two groups can be demonstrated, a multivariate analysis of variance (MANOVA) is used for differentiation Differentiation between healthy subjects and NF1 sufferers with different tumor entities, on the other hand also allows differences between the different tumor entities themselves.

Wie aus der und ersichtlich, zeigt IFNgamma, EGFR, IL-6 sowie TNFalpha zwar einen signifikanten Unterschied in NF1-Patienten verglichen zu den Kontrollpatienten jedoch keinen Unterschied in Patienten mit MPNST verglichen zu denen ohne MPNST.Like from the and Although IFNgamma, EGFR, IL-6 as well as TNFalpha show a significant difference in NF1 patients compared to the control patients, no difference in patients with MPNST compared to those without MPNST.

Die Ergebnisse deuten ebenfalls darauf hin, dass die erhöhten Zytokinlevel in NF1-Patienten unabhängig von deren Tumorlast sind. Eher legen diese Daten nahe, dass eine systemische NF1-Haploinsuffizienz einen permanenten und systemischen Entzündungsreaktionstatus in NF1-Patienten hervorruft, welcher sich durch eine signifikante Erhöhung von IFNγ, TNFα und IL-6 bemerkbar macht [34].The results also indicate that elevated cytokine levels in NF1 patients are independent of their tumor burden. Rather, these data suggest that systemic NF1-haploinsufficiency causes a permanent and systemic inflammatory response status in NF1 patients, which is manifested by a significant increase in IFNγ, TNFα, and IL-6 [34].

Beispiel 3: Die Platelet derived growth factor BB-chain (PDGF-BB) Serumkonzentration in NF1 Patienten mit einem PNF ist signifikant erniedrigt.Example 3: Platelet derived BB-chain (PDGF-BB) serum concentration in NF1 patients with a PNF is significantly decreased.

Die Untersuchung der PDGF-BB Konzentration in Serumproben von NF1 Patienten mit PNF (n = 39), sind wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt und ausgewertet worden. Wie aus der ersichtlich, weisen die Werte in NF1 Patienten für PDGF-BB einen erhöhten Wert verglichen zu den gesunden Patienten auf. Besonders erhöhte Werte von PDGF-BB zeigen sich in NF1 Pateinten mit MPNST und ohne PNF. Zudem weisen NF1 Patienten mit PNF signifikant erniedrigte Werte von PDGF-BB verglichen zu den Kontrollpatienten, siehe .Examination of PDGF-BB concentration in serum samples from NF1 patients with PNF (n = 39) were performed and evaluated as described in Example 2. Like from the As can be seen, the levels in NF1 patients for PDGF-BB are elevated compared to healthy patients. Particularly elevated levels of PDGF-BB are evident in NF1-containing proteins with MPNST and no PNF. In addition, NF1 patients with PNF have significantly decreased levels of PDGF-BB compared to control patients, see ,

Beispiel 4: IGFBP1, RANTES sind Serummarker für die Anwesenheit eines MPNST Tumors in NF1 PatientenExample 4: IGFBP1, RANTES are serum markers for the presence of an MPNST tumor in NF1 patients

Eine weitere Aufteilung der NF1 Kohorten in drei klinische Gruppen (NF1-Patienten mit (i) nur cNF, (ii) mit PNF und (iii) mit MPNST, siehe auch Tabelle 1, fördern zwei weitere Proteine, IGFBP1 und RANTES, welche einen signifikanten Unterschied in NF1-Patienten mit MPNST zu denen ohne MPNST aufzeigen, zu Tage. Jedoch kann kein Unterschied für diese beiden Proteine zwischen den Kontrollgruppen und den NF1-Patienten ohne MPNST (n = 74) festgestellt werden ( , B). Volumetrische Analysen der Ganzkörper MRI Daten der NF1-Patienten deuteten auf eine Korrelation zwischen der internen Tumorlast und dem Risiko für die maligne Transformation von PNF in MPNST hin [4]. Daher wurde versucht, die Serumkonzentration der sechs identifizierten Serumbiomarker mit der internen Tumorlast für die 87 NF1-Patienten, die zur Verfügung standen, zu korrelieren. Überraschenderweise zeigt die Serumkonzentration von IGFBP1, aber nicht einer der anderen fünf Marker eine Korrelation mit der der internen Tumorlast ( ). Dies steht im Einklang mit dem Ergebnis, dass das IGFBP1 Serumlevel mit der Anwesenheit eines MPNST korreliert ( ) und identifiziert IGFBP1 somit als potenziellen Risikomarker für maligne Transformation.Further division of NF1 cohorts into three clinical groups (NF1 patients with (i) only cNF, (ii) with PNF, and (iii) with MPNST, see also Table 1, promote two additional proteins, IGFBP1 and RANTES, which have a significant Difference in NF1 patients with MPNST to those without MPNST, but no difference can be seen for these two proteins between the control groups and the NF1 patients without MPNST (n = 74) ( , B). Volumetric analysis of whole body MRI data of NF1 patients suggested a correlation between the internal tumor burden and the risk of malignant transformation of PNF into MPNST [4]. Therefore, it was attempted to correlate the serum concentration of the six identified serum biomarkers with the internal tumor burden for the 87 NF1 patients that were available. Surprisingly, the serum concentration of IGFBP1, but not one of the other five markers, correlates with that of the internal tumor burden ( ). This is consistent with the finding that the IGFBP1 serum level correlates with the presence of an MPNST ( ) and thus identifies IGFBP1 as a potential risk marker for malignant transformation.

Beispiel 5: RANTES wird von infiltrierenden Lymphozyten als auch von MPNST Tumorzellen sezerniertExample 5: RANTES is secreted by infiltrating lymphocytes as well as MPNST tumor cells

Die Paraffinschnitte der Tumoren wurden entparaffiniert, rehydriert und gewaschen. Es erfolgte dann eine Vorbehandlung bei einem ph-Wert von 6.1 sowie Kochen, und hiernach eine Kühlung auf Eis für 15 min. Nach einem Waschschritt wurden die Schnitte mit Peroxidase-Blocker-Lösung für 5 min behandelt und dann mit dem primären polyklonalen Kaninchen anti-Rantes (1:100, ab9679, Abcam Inc.) inkubiert. Nach erneutem Waschen erfolgte die Inkubation mit dem biotinyliertem Sekundärantikörper, Streptavidin Peroxidase und DAB unter Nutzung des ”Dako REALTM Detection system” (Dako REALTM Detection system, peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse, code K5001, Dako, Denmark A/S) für automatisiertes Färben. Schließlich erfolgte eine Färbung der Zellkerne mit Hämatoxylin. In sind überwiegend Tumorzellen zu sehen. Es sind die Tumorzellen, die mittels des anti-Rantes Antikörper angefärbt wurden. Aus ist ersichtlich wie die Entzündungszellen in den Tumor einwandern. Es sind hauptsächlich Entzündungszellen, die angefärbt werden können (im unteren Bereich des Bildes sind Entzündungszellen zu sehen (Pfeile), im oberen die Tumorzellen).The paraffin sections of the tumors were deparaffinized, rehydrated and washed. It was then pretreated at a pH of 6.1 and boiling, and then cooling on ice for 15 min. After a washing step, the sections were treated with peroxidase-blocking solution for 5 min and then incubated with the primary polyclonal rabbit anti-Rantes (1: 100, ab9679, Abcam Inc.). After washing again, the incubation with the biotinylated secondary antibody, streptavidin peroxidase and DAB using the "Dako REALTM detection system" (Dako REALTM detection system, peroxidase / DAB +, Rabbit / Mouse, code K5001, Dako, Denmark A / S) for automated To dye. Finally, a staining of the cell nuclei with hematoxylin. In are predominantly tumor cells to see. It is the tumor cells stained by the anti-Rantes antibody. Out it can be seen how the inflammatory cells migrate into the tumor. They are mainly inflammatory cells that can be stained (in the lower part of the picture are inflammatory cells (arrows), in the upper the tumor cells).

Beispiel 6: IGFBP1 ist ein Marker für die Anwesenheit eines MPNST TumorsExample 6: IGFBP1 is a marker for the presence of an MPNST tumor

Zur Bestimmung der IGFBP1 Sekretion von MPNST Zelllinien in serumfreie Kulturüberstände wurden die MPNST Zelllinien ST88-14, 1507-2, S462, T462 T265 und STS26T in DMEM Glutamax-I mit 5% FBS von Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland) kultiviert. Die MPNST Zelllinien S462, 1507.2, wurden von V. F. Mautner, University Hospital Eppendorf, Germany hergestellt und zur Verfügung gestellt [60]. Die MPNST Zelllinie STS26T wurde von G. H. De Vries (Hines VA Hospital, Illinois, USA) [61] zur Verfügung gestellt. Weiterhin wurde die MPNST Zelllinie ST88-14 freundlicherweise von J. DeClue (NIH, Bethesda, USA) [62] zur Verfügung gestellt.To determine the IGFBP1 secretion of MPNST cell lines in serum-free culture supernatants, the MPNST cell lines ST88-14, 1507-2, S462, T462 T265 and STS26T were cultured in DMEM glutamax-I with 5% FBS from Invitrogen (Karlsruhe, Germany). The MPNST cell lines S462, 1507.2, were manufactured and provided by V.F. Mautner, University Hospital Eppendorf, Germany [60]. The MPNST cell line STS26T was provided by G.H. De Vries (Hines VA Hospital, Ill., USA) [61]. Furthermore, the MPNST cell line ST88-14 was kindly provided by J. DeClue (NIH, Bethesda, USA) [62].

1 × 10⁴ Zellen der jeweiligen Zelllinien werden in eine 24 Well-Platte vorgelegt. Nach 24, 36 und 48 Stunden wird der Zellkulturüberstand zur weiteren Untersuchung abgenommen und bis zur weiteren Verwendung eingefroren. Zur Durchführung eines ELISA zum Nachweis von humanem IGFBP1 in Zellkulturüberständen, Serum oder Plasma wird das Testkit (Abcam: ab100539) verwendet, das eine mit einem Antikörper gegen IGFBP1 beschichtete Mikrotiterplatte enthält. Proben und Standards werden in die Wells pipettiert, sodass darin enthaltenes IGFBP1 fest an die Platte gebunden wird. Nichtgebundenes Material wird durch Waschen entfernt. Anschließend wird ein mit Biotin gekoppelter Antikörper gegen IGFBP1 zugegeben. Nach einem weiteren Waschschritt zur Entfernung des überschüssigen Antikörper-Enzym-Komplexes folgt die Zugabe von HRP-gebundenem Streptavidin. Nach einem letzten Waschschritt wird Substratlösung zugegeben. Das Substrat wird durch das gebundene Enzym umgesetzt und es kommt zu einem Farbumschlag der Lösung. Nach Abstoppen der Reaktion folgt die Messung der Farbintensität, die proportional zur Menge an IGFBP1 in der Probe ist.1 × 10 ⁴ cells of the respective cell lines are placed in a 24-well plate. After 24, 36 and 48 hours, the cell culture supernatant is removed for further examination and frozen until further use. To perform an ELISA to detect human IGFBP1 in cell culture supernatants, serum or plasma, the test kit (Abcam: ab100539) containing a microtiter plate coated with an antibody to IGFBP1 is used. Samples and standards are pipetted into the wells so that IGFBP1 contained therein is firmly bound to the plate. Unbound material is removed by washing. Subsequently, a biotin-coupled antibody to IGFBP1 is added. After a further washing step to remove the excess antibody-enzyme complex, the addition of HRP-bound streptavidin follows. After a final wash, substrate solution is added. The substrate is reacted by the bound enzyme and there is a color change of the solution. After stopping the reaction, the color intensity measurement follows, which is proportional to the amount of IGFBP1 in the sample.

Wie in dargestellt, produzieren die untersuchten MPNST Zelllinien IGFBP1 und sezernieren dies in das Medium.As in As shown, the MPNST cell lines studied produce IGFBP1 and secrete this into the medium.

Beispiel 7: TNF alpha und Interferon gamma werden von T-Lymphozyten von NF1 Patienten verstärkt exprimiert.Example 7: TNF alpha and interferon gamma are amplified by T lymphocytes of NF1 patients.

Zur Untersuchung des erworbenen Zytokinprofils von T-Zellen können die Zellen für 6 Stunden mit 10 ng/mL Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) und 1 μg/mL Ionomycin (Sigma) bei 37°C und 5% CO₂ im Brutschrank stimuliert werden. PMA-Ionomycin simuliert die Stimulation des T-Zell-Rezeptor und Costimulation, wodurch sämtliche T-Zellen unabhängig von ihrer Rezeptorspezifität angeregt und zur Zytokinproduktion stimuliert werden. Zur intrazellulären Akkumulation der Zytokine wurde Brefeldin A (5 g/mL) zugesetzt. Die Zellen werden fixiert, anschließend mit BD Perm/WashT-Puffer permeabilisiert und dann intrazellulär mit den entsprechenden Antikörpern angefärbt. Die T-Zellen können mittels FACS Analyse durch das Anfärben der spezifischen Oberflächenrezeptoren CD3, CD4 und CD8 mit kommerziell erhältlichen Antikörpern identifiziert werden. Die intrazellulären Zytokine werden mittels anti-TNFalpha (Maus anti-human TNFalpha) sowie anti-IFNgamma (Maus anti-human IFNgamma) detektiert. Die statistische Darstellung der experimentellen Ergebnisse in zeigt, dass durchschnittlich die CD4+ als auch CD8+ T-Lymphozyten von NF1 Patienten mehr TNFalpha produzieren verglichen zu den T Lymphozyten der Kontrollpatienten. Zudem zeigen die CD8+ T-Zellen von NF1 Patienten im Stimulationstest mehr IFNgamma produzierende Zellen als die CD8+ T-Zellen von Kontrollpatienten.To study the acquired cytokine profile of T cells, the cells can be incubated for 6 hours with 10 ng / mL phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and 1 μg / mL ionomycin (Sigma) at 37 ° C and 5% CO ₂ be stimulated in the incubator. PMA-ionomycin simulates stimulation of the T cell receptor and costimulation, stimulating all T cells regardless of their receptor specificity and stimulating them to produce cytokines. For intracellular accumulation of cytokines, Brefeldin A (5 g / mL) was added. The cells are fixed, then permeabilized with BD Perm / WashT buffer and then stained intracellularly with the appropriate antibodies. The T cells can be identified by FACS analysis by staining the specific surface receptors CD3, CD4 and CD8 with commercially available antibodies. The intracellular cytokines are detected by anti-TNFalpha (mouse anti-human TNFalpha) and anti-IFNgamma (mouse anti-human IFNgamma). The statistical representation of the experimental results in shows that on average the CD4 + as well as CD8 + T lymphocytes of NF1 patients produce more TNFalpha compared to the T lymphocytes of control patients. In addition, the CD8 + T cells of NF1 patients in the stimulation test show more IFNgamma-producing cells than the CD8 + T cells of control patients.

Beispiel 8: IL-6, IFNγ, TNF-α und EGFR sowie IGFBP1 und RANTES eignen sich als diagnostische Marker für eine NF1 Erkrankung oder einem malignen peripheren Nervenscheidentumor (MPNST)Example 8: IL-6, IFNγ, TNF-α and EGFR, and IGFBP1 and RANTES are useful diagnostic markers for NF1 disease or malignant peripheral nerve sheath tumor (MPNST)

Das diagnostische Potenzial der erfindungsgemäß aufgefunden Faktoren wurde mittels AUC für individuellen ROC-Kurven, wie in Material und Methodenteil beschreiben, bestimmt. Die Spezifität wurde bei einer Sensitivität von 90% bestimmt (Tabelle 2, ). Für alle sechs Kandidaten ist die AUC statistisch signifikant (P < 0,05). Die größte AUC für die NF1 Marker zeigt IFNγ (0,900), gefolgt von TNFα (0,877), IL-6 (0,834) und EGFR (0,728). Allerdings hängen die erhöhten Level der pro-inflammatorischen Zytokine nicht von der Tumorlast ab, da diese Zytokine auch in Patienten mit anderen Tumorarten gefunden wurden [36]. Allerdings zeigen die Daten einen Anstieg des systemischen, proinflammatorischen Status in NF1-Patienten im Vergleich zu Nicht-NF1-Kontroligruppen. Dies unterstreicht die Annahme, dass ein erhöhtes Zytokinlevel in NF1 durch eine systemische NF1+/– Umgebung begünstigt bzw. hervorgerufen wird. Ob dies durch einen Anstieg der Mastzellen und Monozyten-Aktivität oder durch eine generelle Änderung im Immunstatus dieser Patienten induziert wird, bleibt unklar [35, 37].The diagnostic potential of the factors found according to the invention was determined by AUC for individual ROC curves as described in the Material and Methods section. Specificity was determined at a sensitivity of 90% (Table 2, ). For all six candidates, the AUC is statistically significant (P <0.05). The largest AUC for the NF1 markers shows IFNγ (0.900), followed by TNFα (0.877), IL-6 (0.834) and EGFR (0.728). However, the elevated levels of pro-inflammatory cytokines do not depend on the Tumor burden, as these cytokines were also found in patients with other types of tumors [36]. However, data show an increase in systemic proinflammatory status in NF1 patients compared to non-NF1 control groups. This underlines the hypothesis that an elevated cytokine level in NF1 is favored by a systemic NF1 +/- environment. Whether this is induced by an increase in mast cells and monocyte activity or by a general change in the immune status of these patients remains unclear [35, 37].

In MPNST-Patienten war die AUC von IGFBP1 (0,770) größer als die AUC von RANTES (0,651) ( ). RANTES ist als eines der inflammatorischen Zytokine bekannt, die zytotaktische Aktivität in Immunzellen die T-Zellen Monozyten herstellen [38]. RANTES ist auch dafür bekannt, in Brustkarzinomen exprimiert zu werden [39] und korreliert mit einem weiterfortgeschrittenen Stadium dieser Krankheit, welches auf eine Rolle in der Krebsentwicklung bzw. dessen Verlauf hindeutet. Erhöhte Serumlevel von RANTES und IGFBP1 sind möglicherweise das Ergebnis einer erhöhten Sekretion durch eine Tumorzelle oder durch Immunzellen, in Antwort auf einen neoplastischen Prozess oder durch beide Mechanismen.In MPNST patients, the AUC of IGFBP1 (0.770) was greater than the AUC of RANTES (0.651) ( ). RANTES is known as one of the inflammatory cytokines that produce cytotactic activity in immune cells of T cell monocytes [38]. RANTES is also known to be expressed in breast carcinoma [39] and correlates with a more advanced stage of the disease, suggesting a role in cancer development and progression, respectively. Increased serum levels of RANTES and IGFBP1 may be the result of increased secretion by a tumor cell or by immune cells, in response to a neoplastic process or by both mechanisms.

IGFBP1 bindet die Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren (IGFs)-I und IGF-II und verstärkt ihre Halbwertszeit. Das Plasmalevel von IGFBP1 wird durch Hormone außerhalb der Wachstumshormonachse reguliert inklusive Insulin-Glucagon und Kortisol [40, 41]. Eine entgegengesetzte Korrelation wurde vor kurzem für die IGFBP1 Level und die Krebsentwicklung nahegelegt [42, 43]. Die Beobachtungen, dass IGF-1 und Wachstumsfaktor-Rezeptoren in PNF und MPNST von NF1-Patienten exprimiert werden sowie das IGF1 Rezeptorlevel mit einem erhöhten Mitoseindex von PNF korrelieren, deutet auf eine Empfindlichkeit dieser Tumore gegen IGFBP1-regulierte Faktoren hin [10, 44]. Zusammenfassend, lässt sich sagen, dass IGFBP1 möglicherweise den IGF-Zugang zu PNF und MPNST moduliert, allerdings sollte dieser Mechanismus erst noch weiter untersucht werden.IGFBP1 binds the insulin-like growth factors (IGFs) -I and IGF-II and enhances their half-life. The plasma level of IGFBP1 is regulated by hormones outside the growth hormone axis, including insulin glucagon and cortisol [40, 41]. An opposite correlation has recently been suggested for IGFBP1 levels and cancer development [42, 43]. The observation that IGF-1 and growth factor receptors in PNF and MPNST are expressed by NF1 patients and that IGF1 receptor levels correlate with an increased mitotic index of PNF indicates that these tumors are sensitive to IGFBP1-regulated factors [10, 44] , In conclusion, IGFBP1 may modulate IGF access to PNF and MPNST, but this mechanism should be further explored.

Kürzlich identifizierten zwei Studien, MIA und Adrenomedullin als potenzielle NF1-Tumormarker an Kohorten von n = 42 und 32 [21, 23]. Adrenomedullin zeigt eine Tendenz auch mit MPNST zu korrelieren, obwohl die MPNST Gruppe zu klein war um eine signifikante Aussage zu zulassen (n = 5). Die MIA Konzentration war entweder deutlich erhöht in NF1-Patienten mit PNF oder eine große Anzahl von Neurofibroma korrelierte mit der internen Tumorlast. Beide dieser Faktoren scheinen mit der Tumorlast in NF1 zu korrelieren, obwohl nicht auszuschließen ist, dass dies auch durch eine veränderte systemische Umgebung, bedingt durch die Haploinsuffizienz hervorgerufen wird. Es wäre daher interessant näher zu untersuchen, ob eine systemtische inflammatorische Umgebung während der Früherkennung der Tumorgenese in NF1 -Patienten eine Rolle spielt.Recently, two studies, MIA and adrenomedullin, identified as potential NF1 tumor markers on cohorts of n = 42 and 32 [21, 23]. Adrenomedullin shows a tendency to also correlate with MPNST, although the MPNST group was too small to allow a significant statement (n = 5). The MIA concentration was either significantly increased in NF1 patients with PNF or a large number of neurofibromas correlated with the internal tumor burden. Both of these factors seem to correlate with the tumor burden in NF1, although it can not be ruled out that this is also caused by a changed systemic environment due to haploinsufficiency. It would therefore be interesting to further investigate whether a systemic inflammatory environment plays a role during the early detection of tumorigenesis in NF1 patients.

Beispiel 9: IGFBP1 und RANTES und PDGF-BB als therapeutische Targets zur Behandlung von NF1 assoziierten TumorenExample 9: IGFBP1 and RANTES and PDGF-BB as therapeutic targets for the treatment of NF1-associated tumors

Um die therapeutische Fähigkeit von den erfindungsgemäßen Serummarker auf das Wachstum von MPNST zu testen, können beispielsweise MPNST Zelllinien S462, ST88-14, NSF-1, verwendet werden, die in DMEM Glutamax-I mit 5% FBS von Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland) kultiviert werden. Als Positivkontrolle wird der inhibierende Effekt von Imatinib Mesylat auf das MPNST Wachstum verwendet, welcher wie folgt durchzuführen und in Holtkamp et al., Carcinogenesis 27 (2006), 664–71 beschrieben ist. Imatinib Mesylat von Novartis Pharma AG (Basel, Schweiz) kann in Dimethyl Sulphoxid (DMSO) gelöst werden. Zellen werden (2 × 10³) in 300 μl Medium in 24 Well-Platten ausgesät um adheränt zu werden. Imatinib wird in einer Konzentration von 2 μM und 10 μM in 100 μl einer maximal 0.1%igen DMSO Lösung verwendet. Die Negativkontrollen weisen ebenfalls nicht mehr als eine 0.1%ige DMSO Konzentration auf. 300 μl Medium, die Imatinib oder DMSO enthaltenen Lösungen werden nach Zugabe zu den Zellen am Tag 3 und 5 gewechselt. Die Zellproliferation wird am Tag 4 und Tag 7 nach Imatinab Behandlung mittels CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay von Promega (Mannheim, Deutschland) durch Messung der Absorption bei 490 nm bestimmt. Die Experimente werden mindestens als Doppelbestimmungen durchgeführt und drei Mal wiederholt.To test the therapeutic ability of the serum markers according to the invention for the growth of MPNST, it is possible, for example, to use MPNST cell lines S462, ST88-14, NSF-1, which are expressed in DMEM glutamax-I with 5% FBS from Invitrogen (Karlsruhe, Germany). be cultivated. The positive control used is the inhibitory effect of imatinib mesylate on MPNST growth, which is to be performed as follows and in Holtkamp et al., Carcinogenesis 27 (2006), 664-71 is described. Imatinib mesylate from Novartis Pharma AG (Basel, Switzerland) can be dissolved in dimethyl sulphoxide (DMSO). Cells are seeded (2 x 10 ³ ) in 300 μl of medium in 24 well plates to be clotted. Imatinib is used at a concentration of 2 μM and 10 μM in 100 μl of a 0.1% DMSO solution. The negative controls also have no more than a 0.1% DMSO concentration. 300 μl of medium, solutions containing imatinib or DMSO are changed on day 3 and 5 after addition to the cells. Cell proliferation is determined on Day 4 and Day 7 after imatinab treatment by CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay from Promega (Mannheim, Germany) by measuring absorbance at 490 nm. The experiments are performed at least as duplicate determinations and repeated three times.

Schlussfolgerung: Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Experimente beinhalten die bisher größte Studie bezüglich der Anzahl von NF1-Patienten (n = 104), welche je für potenzielle Serummarker für diese seltene, genetisch bedingte, Tumorerkrankung vorgenommen wurde. Es konnten vier potenzielle Biomarker identifizieren werden, welche in der Diagnose von NF1 eingesetzt werden können und zwei weitere Marker (IGFBP1 und RANTES), die mit der Anwesenheit von MPNST korrelieren. Interessanterweise scheint IGFBP1 auch mit der internen Tumorlast zu korrelieren und deutet auf ein erhöhtes Risiko für eine maligne Transformation in NF1-Patienten hin. Weiterhin zeigen die vorliegenden erfindungsgemäßen Daten, dass NF1-Patienten systemische pro-inflammatorische Profile aufwiesen, welche wahrscheinlich durch eine NF1-Haploinsuffizienz hervorgerufen wird. Serumbiomarker, die bei der Früherkennung der malignen Umwandlung helfen sind extrem nützlich, da therapeutische Eingriffe vorher initiiert werden könnten bevor der Tumor sich weiter entwickelt und Metastasen entstehen.Conclusion: The experiments carried out within the scope of the present invention include the largest ever study of the number of NF1 patients (n = 104) ever for potential serum markers for this rare, genetic tumor disease. Four potential biomarkers could be identified that can be used in the diagnosis of NF1 and two additional markers (IGFBP1 and RANTES) that correlate with the presence of MPNST. Interestingly, IGFBP1 also appears to correlate with internal tumor burden, indicating an increased risk of malignant transformation in NF1 patients. Furthermore, the present data of the present invention shows that NF1 patients had systemic pro-inflammatory profiles, which is likely to be caused by NF1-haploinsufficiency. Serum biomarkers used in the early detection of malignant transformation Help is extremely useful as therapeutic intervention may be initiated before the tumor develops and metastases develop.

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