DE102011118018A1 - New minicircle comprising nucleic acid sequence of interest and transposase recognition sequences on both sides of nucleic acid sequence of interest, useful for insertional mutagenesis or genetic transformation of eukaryotic target cell - Google Patents

New minicircle comprising nucleic acid sequence of interest and transposase recognition sequences on both sides of nucleic acid sequence of interest, useful for insertional mutagenesis or genetic transformation of eukaryotic target cell Download PDF

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Abstract

Minicircle comprising (a) at least one nucleic acid sequence of interest, and (b) transposase recognition sequences for both sides of (a), is new, where (b) are recognized for a specific transposase or a derivative of a transposase and used for transposition, and the specific transposase is preferably a sleeping beauty transposase or a PiggyBac transposase. Independent claims are included for: (1) a cell comprising the minicircle; (2) the insertional mutagenesis or genetic transformation of an eukaryotic target cell comprising (a1) providing the minicircle comprising (a) within the target cell, (b1) transfection of the target cell with a vector comprising a nucleic acid sequence encoded for a transposase, which is specific for (b), (c1) expression of the transposase from the vector and (d1) recombination of (a) with a nucleic acid of the target cell; (3) a cell obtained by the insertional mutagenesis or genetic transformation of an eukaryotic target cell; and (4) a kit for the insertional mutagenesis or genetic transformation of an eukaryotic target cell comprising the minicircle and the vector.

Description

Technisches GebietTechnical area

Die vorliegende Erfindung liegt im Gebiet der Biotechnologie. Genauer betrifft die Erfindung die Bereitstellung von Minicircle-basierten Vektoren für die Transformation von Zellen mittels Transposons.The present invention is in the field of biotechnology. More particularly, the invention relates to the provision of minicircle-based vectors for the transformation of cells by means of transposons.

Hintergrundbackground

Herkömmliche Verfahren zur Gentherapie verwenden meist Plasmid-DNS als Vektoren zum Einschleusen von erwünschten DNS-Abschnitten in die Zielzellen. Plasmide haben in solchen Anwendungen jedoch mehrere Nachteile. Zum einen besteht die Möglichkeit unkontrollierter Plasmidreplikation nach der Transformation, die zur Verbreitung von auf dem Plasmid vorhandenen Resistenzgenen gegen Antibiotika führen kann. Außerdem enthalten Plasmide weitere prokaryotische DNS-Sequenzen, die z. B. in Eukaryonten zu immunogenen Reaktionen führen können. Nichtvirale Vektoren mit möglichst wenigen prokaryotischen Sequenzen sind daher für die Gentherapie sehr nützlich.Conventional methods for gene therapy usually use plasmid DNA as vectors for introducing desired DNA segments into the target cells. However, plasmids have several disadvantages in such applications. On the one hand, there is the possibility of uncontrolled plasmid replication after transformation, which can lead to the spread of existing on the plasmid resistance genes to antibiotics. In addition, plasmids contain other prokaryotic DNA sequences, the z. B. in eukaryotes can lead to immunogenic reactions. Nonviral vectors with as few prokaryotic sequences as possible are therefore very useful for gene therapy.

Zu diesem Zweck wurden Minicircles entwickelt, worunter man kleine, zirkuläre DNS-Moleküle versteht, die eine gewünschte Expressionskassette und möglichst wenige unerwünschte prokaryotische Sequenzen enthalten. Ein Verfahren zur Herstellung von Minicircles wurde in WO 96/26270 beschrieben.For this purpose, minicircles have been developed, which are understood to mean small, circular DNA molecules containing a desired expression cassette and as few unwanted prokaryotic sequences as possible. A process for the preparation of minicircles has been disclosed in WO 96/26270 described.

Bigger et al. (J. Biol. Chem. 2001, 276: 23018–23027) beschreiben die Herstellung von Minicircles mittels der Einführung von Plasmiden mit loxP-Stellen in Bakterien, die die Cre-Rekombinase exprimieren können. Das Plasmid umfasst ferner eine eukaryotische Expressionskassette und eine Markersequenz. Nach Induktion von Cre wird das Plasmid in Minicircle und Miniplasmid gespalten, wobei der Minicircle nur die Expressionskassette enthält. Außerdem sind die loxP-Stellen mutiert, so dass die Reversibilität der Rekombination verringert wird. Bigger et al. (J. Biol. Chem. 2001, 276: 23018-23027) describe the preparation of minicircles by introducing plasmids with loxP sites in bacteria capable of expressing cre recombinase. The plasmid further comprises a eukaryotic expression cassette and a marker sequence. Upon induction of Cre, the plasmid is cleaved into minicircle and miniplasmid, with the minicircle containing only the expression cassette. In addition, the loxP sites are mutated so that the reversibility of recombination is reduced.

Weitere Publikationen beschreiben ebenfalls die Herstellung von Minicircles unter Verwendung anderer Rekombinationssysteme, z. B. in Kreiss et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998, 49: 560–567) mittels λ-Integrase und in Chen et al. (Mol. Ther. 2003, 8: 495–500) mittels ΦC31-Integrase. Daher sind Minicircles heute als alternative Vektoren zur Transfektion von eukaryotischen Zellen etabliert.Other publications also describe the preparation of minicircles using other recombination systems, e.g. In Kreiss et al. (Appl. Microbiol Biotechnol 1998, 49: 560-567) by means of λ integrase and in Chen et al. (Mol. Ther. 2003, 8: 495-500) using ΦC31-integrase. Therefore, minicircles are now established as alternative vectors for the transfection of eukaryotic cells.

Zur permanenten genetischen Transformation von Zielzellen kann das Einschleusen von Transpositionskassetten auf einem Vektor dienen, die mittels einer Transposase vom Vektor in eine zelluläre Nukleinsäure überführt werden können.For the permanent genetic transformation of target cells, the introduction of transposition cassettes on a vector can be used, which can be converted by means of a transposase from the vector into a cellular nucleic acid.

Es ist jedoch bekannt, dass in vielen Transposonsystemen die Transpositionseffizienz mit wachsender Länge der Transpositionskassette abnimmt (siehe z. B. D. J. Lampe et al., Genetics 1998, 149(1): 179–187 ; J. C. Way et al., Genetics 1985, 111(4): 705–713 ). Die Länge von DNS-Abschnitten, die effizient mittels Transposition in die DNS einer Zielzelle eingebracht werden können, ist daher beschränkt. Es besteht daher Bedarf an Verfahren, die eine effiziente Transformation zellulärer DNS mittels Transposition auch längerer DNS-Abschnitte erlauben.However, it is known that in many transposon systems the transposition efficiency decreases with increasing length of the transposition cassette (see eg. DJ Lampe et al., Genetics 1998, 149 (1): 179-187 ; JC Way et al., Genetics 1985, 111 (4): 705-713 ). The length of DNA segments that can be efficiently transposed into the DNA of a target cell is therefore limited. There is therefore a need for methods that allow efficient transformation of cellular DNA by transposing even longer DNA segments.

Kurze Beschreibung der ErfindungBrief description of the invention

Die vorliegende Erfindung basiert auf der Idee, die Minicircle-Technologie zur Transfektion von Zellen mit der Transformation mittels Transposonsystemen zu kombinieren. Neben den vorgenannten Vorteilen, die Transfektion mit Minicircles bekanntermaßen bietet, führt das Einschleusen einer Transpositionskassette, z. B. einer Dornröschen-(Sleeping Beauty)-basierten Transpositionskassette, auf einem Minicircle überraschenderweise zu höheren Transpositionssraten als die Einführung auf herkömmlichen Vektoren, wie etwa einem Plasmid.The present invention is based on the idea to combine the minicircle technology for the transfection of cells with the transformation by means of transposon systems. In addition to the aforementioned advantages, which offers known transfection with minicircles, the introduction of a transposition cassette, z. A Sleeping Beauty-based transposition cassette on a minicircle surprisingly at higher transposition rates than the introduction on conventional vectors such as a plasmid.

Dementsprechend bezieht sich die Erfindung auf ein Minicircle umfassend mindestens eine Nukleinsäuresequenz von Interesse, die in eine andere genetische Umgebung transponiert werden kann, und Transposase-Erkennungssequenzen zu beiden Seiten der Nukleinsäure von Interesse, charakterisiert dadurch, dass die Transposase-Erkennungssequenzen von einer spezifischen Transposase, oder dem Derivat einer Transposase, erkannt und zur Rekombination verwendet werden können, wobei die spezifische Transposase vorzugsweise eine Dornröschen-Transposase (Sleeping-Beauty-Transposase) oder eine PiggyBac-Transposase ist.Accordingly, the invention relates to a minicircle comprising at least one nucleic acid sequence of interest that can be transposed into another genetic environment, and transposase recognition sequences on both sides of the nucleic acid of interest, characterized in that the transposase recognition sequences of a specific transposase, or the derivative of a transposase, and can be used for recombination, wherein the specific transposase is preferably a Sleeping Beauty Transposase or a PiggyBac Transposase.

In einer Ausführungsform kann die mindestens eine Nukleinsäuresequenz von Interesse eine Expressionskassette mit mindestens einem Gen, mindestens einer Isolatorsequenz oder einer Kombination davon, oder auch mehrere Gene, mehrere Isolatorsequenzen oder eine Kombination davon umfassen.In one embodiment, the at least one nucleic acid sequence of interest may comprise an expression cassette comprising at least one gene, at least one isolator sequence or a combination thereof, or else several genes, a plurality of isolator sequences or a combination thereof.

Der Minicircle kann mindestens eine Identifikationssequenz, innerhalb oder außerhalb des Bereichs zwischen den Transposase-Erkennungssequenzen, umfassen. Wenn mehrere Identifikationssequenzen vorliegen, können diese identisch oder unterschiedlich sein.The minicircle may comprise at least one identification sequence, inside or outside the region between the transposase recognition sequences. If there are multiple identification sequences, they can be identical or different.

Ferner kann die Sequenz des Minicircles ein Paar Rekombinase-Erkennungssequenzen umfassen, die zu beiden Seiten der Nukleinsäure von Interesse innerhalb der Transposase-Erkennungssequenzen liegen.Further, the sequence of the minicircle may comprise a pair of recombinase recognition sequences located on either side of the nucleic acid of interest within the transposase recognition sequences.

In einer Ausführungsform enthält der Minicircle keinen Selektionsmarker zur Selektion bei der Amplifikation in prokaryotischen Zellen. Der Minicircle kann ein ringförmiges, vorzugsweise ein ringförmiges und superspiralisiertes, DNS-Molekül sein. In one embodiment, the minicircle does not contain a selection marker for selection in amplification in prokaryotic cells. The minicircle may be an annular, preferably an annular and supercoiled, DNA molecule.

In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung auch Parentalplasmide, aus denen irgendein Minicircle gemäß der Erfindung durch Rekombination gewonnen werden kann. Ein Parentalplasmid ist hierbei ein Plasmid, das die komplette Sequenz des gewünschten Minicircles (Minicircle-Region) und zusätzlich ein Plasmidrückgrat (Miniplasmid-Region) enthält, wobei Minicircle-Region und Miniplasmid-Region durch Rekombinase-Erkennungssequenzen getrennt sind, die so angeordnet sind, dass sie von einer Rekombinase spezifisch rekombiniert werden können.In another embodiment, the invention also includes parent plasmids from which any minicircle according to the invention can be recovered by recombination. A parental plasmid is a plasmid containing the complete sequence of the desired minicircle and additionally a plasmid backbone (miniplasmid region), the minicircle region and miniplasmid region being separated by recombinase recognition sequences arranged that they can be specifically recombined by a recombinase.

Die Erfindung bezieht sich auch auf Zellen, die einen Minicircle gemäß einer der erwähnten Ausführungsformen umfassen.The invention also relates to cells comprising a minicircle according to one of the mentioned embodiments.

Unter einem weiteren Gesichtspunkt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Insertionsmutagenese oder zur genetischen Transformation einer eukaryotischen Zielzelle, das Verfahren umfassend Bereitstellen eines erfindungsgemäßen Minicircles umfassend eine Nukleinsäure von Interesse innerhalb der Zielzelle, und Transfektion der Zielzelle mit einem Vektor umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die für eine Transposase kodiert, die für die Transposase-Erkennungssequenzen des Minicircles spezifisch ist, wobei die Expression der Transposase von dem Vektor zur Rekombination der Nukleinsäuresequenz von Interesse mit einer Nukleinsäure der Zielzelle führt.In another aspect, the invention relates to a method of insertional mutagenesis or genetic transformation of a eukaryotic target cell, the method comprising providing a minicircle of the invention comprising a nucleic acid of interest within the target cell, and transfecting the target cell with a vector comprising a nucleic acid sequence encoding encoding a transposase specific for the minicircle transposase recognition sequences, wherein expression of the transposase from the vector results in recombination of the nucleic acid sequence of interest with a nucleic acid of the target cell.

Das Bereitstellen des Minicircles kann durch Transfektion der Zielzelle mit dem Minicircle oder auch durch Erzeugung des Minicircles innerhalb der Zielzelle erreicht werden. Ferner können das Bereitstellen des Minicircles und die Transfektion mit dem Vektor zugleich in einer Kotransfektion oder nacheinander in beliebiger Reihenfolge durchgeführt werden. Die Zielzelle kann eine Wirbeltierzelle, z. B. eine menschliche Zelle, sein.The provision of the minicircle can be achieved by transfecting the target cell with the minicircle or else by creating the minicircle within the target cell. Furthermore, the provision of the minicircle and the transfection with the vector can be carried out simultaneously in a cotransfection or sequentially in any order. The target cell may be a vertebrate cell, e.g. A human cell.

In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung auch Zellen, die durch ein Verfahren gemäß der Erfindung erhalten wurden.In another embodiment, the invention also includes cells obtained by a method according to the invention.

Schließlich umfasst die Erfindung auch ein Kit zur Insertionsmutagenese oder zur genetischen Transformation einer eukaryotischen Zielzelle umfassend einen Minicircle gemäß einer der erwähnten Ausführungsformen und einen Vektor, der für eine Transposase kodiert, die für die Transposase-Erkennungssequenzen des Minicircles spezifisch ist. Für die Transposase-Erkennungssequenzen im Minicircle kann eine Dornröschen-Transposase spezifisch sein und die vom Vektor kodierte Transposase kann diese Dornröschen-Transposase oder ein Derivat davon sein, z. B. die hyperaktive Dornröschen-Transposase SB100X (auch SB100 genannt).Finally, the invention also encompasses a kit for insertion mutagenesis or for genetic transformation of a target eukaryotic cell comprising a minicircle according to one of the mentioned embodiments and a vector which codes for a transposase which is specific for the transposase recognition sequences of the minicircle. For the transposase recognition sequences in the minicircle, a Sleeping Beauty transposase may be specific and the transposase encoded by the vector may be this Sleeping Beauty transposase or a derivative thereof, e.g. For example, the hyperactive Sleeping Beauty Transposase SB100X (also called SB100).

Beschreibung der AbbildungenDescription of the pictures

1A zeigt die Nukleinsäuresequenz des DR-Elements am äußeren Ende eines IR-Elements (SEQ ID NO: 1). 1A shows the nucleic acid sequence of the DR element at the outer end of an IR element (SEQ ID NO: 1).

1B zeigt die Nukleinsäuresequenz des DR-Elements am inneren Ende eines IR-Elements (SEQ ID NO: 2). 1B shows the nucleic acid sequence of the DR element at the inner end of an IR element (SEQ ID NO: 2).

1C zeigt die Aminosäuresequenz der Dornröschen-Transposase SB10 (SEQ ID NO: 3). 1C shows the amino acid sequence of Sleeping Beauty Transposase SB10 (SEQ ID NO: 3).

1D zeigt die Aminosäuresequenz der Dornröschen-Transposase SB100X (SEQ ID NO: 4). 1D shows the amino acid sequence of Sleeping Beauty Transposase SB100X (SEQ ID NO: 4).

1E zeigt die Nukleinsäuresequenz eines forward-Primers, der zur Amplifikation einer GFP-kodierenden Sequenz aus dem Plasmid pCMV-GFP verwendet werden kann (SEQ ID NO: 5). 1E shows the nucleic acid sequence of a forward primer which can be used to amplify a GFP coding sequence from the plasmid pCMV-GFP (SEQ ID NO: 5).

1F zeigt die Nukleinsäuresequenz eines reverse-Primers, der zur Amplifikation einer GFP-kodierenden Sequenz aus dem Plasmid pCMV-GFP verwendet werden kann (SEQ ID NO: 6). 1F shows the nucleic acid sequence of a reverse primer which can be used to amplify a GFP coding sequence from the plasmid pCMV-GFP (SEQ ID NO: 6).

2 zeigt eine Skizze des Minicircles MC-IR-GFP mit einer GFP-Expressionskassette als Nukleinsäuresequenz von Interesse; GFP: GFP-kodierende Sequenz; Prom: Promotorsequenz; pA: Polyadenylierungssequenz; IR: IR-Element (Transposase-Erkennungssequenz); rec-tag: bei der Rekombination gebildeter Rest der Rekombinase-Erkennungssequenzen und Identifikationssequenz. 2 shows a sketch of the minicircle MC-IR-GFP with a GFP expression cassette as a nucleic acid sequence of interest; GFP: GFP coding sequence; Prom: promoter sequence; pA: polyadenylation sequence; IR: IR element (transposase recognition sequence); rec-tag: remainder of the recombinase recognition sequences and identification sequence formed during recombination.

3a zeigt eine Skizze des Parentalplasmids pP-IR-GFP, aus dem der Minicircles MC-IR-GFP gebildet werden kann; GFP: GFP-kodierende Sequenz; Prom: Promotorsequenz; IR: IR-Element (Transposase-Erkennungssequenz); rec: Rekombinase-Erkennungssequenz für parA-Resolvase; 2tag: zwei Identifikationssequenzen; Rückgrat: Plasmidrückgrat, das die für die Amplifikation des Plasmids notwendigen Sequenzen und eine Expressionskassette für die patA-Resolvase enthält. Die Rekombinase-Erkennungssequenzen zur Spaltung in Miniplasmid und Minicircle sind dunkelgrau dargestellt. 3a shows a sketch of the parent plasmid pP-IR-GFP, from which the minicircles MC-IR-GFP can be formed; GFP: GFP coding sequence; Prom: promoter sequence; IR: IR element (transposase recognition sequence); rec: recombinase recognition sequence for parA resolvase; 2 day: two identification sequences; Backbone: Plasmid backbone containing the sequences necessary for amplification of the plasmid and an expression cassette for the patA resolvase. The recombinase recognition sequences for cleavage into miniplasmid and minicircle are shown in dark gray.

3b zeigt eine Skizze des Parentalplasmids pP11-IR-GFP, aus dem der Minicircles MC-IR-GFP gebildet werden kann; GFP: GFP-kodierende Sequenz; Prom: Promotorsequenz; IR: IR-Element (Transposase-Erkennungssequenz); rec: Rekombinase-Erkennungssequenz für parA-Resolvase; 1 tag: eine Identifikationssequenz; Rückgrat: Plasmidrückgrat, das die für die Amplifikation des Plasmids notwendigen Sequenzen und eine Expressionskassette für die parA-Resolvase enthält. Die Rekombinase-Erkennungssequenzen zur Spaltung in Miniplasmid und Minicircle sind dunkelgrau dargestellt. 3b shows a sketch of the parent plasmid pP11-IR-GFP, from which the minicircles MC-IR-GFP can be formed; GFP: GFP coding sequence; Prom: promoter sequence; IR: IR element (transposase recognition sequence); rec: Recombinase recognition sequence for parA resolvase; 1 day: an identification sequence; Backbone: Plasmid backbone containing the sequences necessary for the amplification of the plasmid and an expression cassette for the parA resolvase. The recombinase recognition sequences for cleavage into miniplasmid and minicircle are shown in dark gray.

4 zeigt eine Vektorkarte des Plasmids pT2/BH (Addgene Zugangsnummer 26556), das geeignete IR-Elemente enthält und als Ausgangsmaterial für die Klonierung von Ursprungsplasmiden für Dornröschen-Minicircles verwendet werden kann. 4 Figure 4 shows a vector map of the plasmid pT2 / BH (Addgene Accession No. 26556) which contains appropriate IR elements and can be used as starting material for the cloning of original plasmids for Sleeping Beauty minicircles.

5 zeigt eine schematische Darstellung eines geeigneten Verfahrens von der Klonierung von Ausgangsplasmiden (oberer Teil), über deren Klonierung zur Erzeugung von Parentalplasmiden (mittlerer Teil, z. B. pP-SB10 und pP-IR-GFP) und deren Rekombination (jeweilige Bildung und Aufreinigung von Minicircles; darunter) bis zur Transfektion oder Kotransfektion einer eukaryotischen Zielzelle (unten). Die beiden unten gezeigten Minicircles enthalten die Expressionskassette für eine Transposase (hier SB10; links) und eine GFP-Expressionkassette begrenzt durch IR-Elemente. Die Namen der Konstrukte sind jeweils in ihrer Mitte angegeben. GFP: GFP-kodierende Sequenz; Prom: Promotorsequenz; pA: Polyadenylierungssequenz; IR IR-Element (Transposase-Erkennungssequenz); rec-tag: bei der Rekombination gebildeter Rest der Rekombinase-Erkennungssequenzen und zugleich 2 spezifische Identifikationssequenzen; MCS: multiple Klonierungsstelle; SB10: SB10-kodierende Sequenz; AmpR: Ampizillin-Resistenzkassette; ori: Replikationsursprung. Die Rekombinase-Erkennungssequenzen zur Spaltung in Miniplasmid und Minicircle sind dunkelgrau dargestellt. 5 shows a schematic representation of a suitable method from the cloning of starting plasmids (upper part), via their cloning to generate parent plasmids (middle part, eg pP-SB10 and pP-IR-GFP) and their recombination (respective formation and purification from minicircles) to transfection or cotransfection of a eukaryotic target cell (bottom). The two minicircles shown below contain the transposase expression cassette (here SB10, left) and a GFP expression cassette bounded by IR elements. The names of the constructs are given in their middle. GFP: GFP coding sequence; Prom: promoter sequence; pA: polyadenylation sequence; IR IR element (transposase recognition sequence); rec-tag: a residue of the recombinase recognition sequences formed during recombination and at the same time 2 specific identification sequences; MCS: multiple cloning site; SB10: SB10 coding sequence; AmpR: ampicillin resistance cassette; ori: origin of replication. The recombinase recognition sequences for cleavage into miniplasmid and minicircle are shown in dark gray.

6A zeigt die Nukleinsäuresequenz des linken IR/DR-Elements Lmut44 (SEQ ID NO: 7). 6A shows the nucleic acid sequence of the left IR / DR element Lmut44 (SEQ ID NO: 7).

6B zeigt die Nukleinsäuresequenz des rechten IR/DR-Elements Rmut13delta13 (SEQ ID NO: 8). 6B shows the nucleic acid sequence of the right IR / DR element Rmut13delta13 (SEQ ID NO: 8).

7 zeigt schematisch einen bevorzugten Aufbau von Parentalplasmiden zur Herstellung von Minicicles gemäß der Erfindung. NOI: Nukleinsäure von Interesse; FRT: Rekombinase-Erkennungssequenzen für Flp-Rekombinase; IR/DR: Transposase-Erkennungssequenzen; rec: Rekombinase-Erkennungssequenz für parA-Resolvase. 7 schematically shows a preferred construction of Parentalplasmiden for the production of minicycles according to the invention. NOI: nucleic acid of interest; FRT: recombinase recognition sequences for Flp recombinase; IR / DR: transposase recognition sequences; rec: recombinase recognition sequence for parA resolvase.

Ausführliche Beschreibung der ErfindungDetailed description of the invention

MINICIRCLESMINI CIRCLES

Die vorliegende Erfindung betrifft unter einem Gesichtspunkt einen Minicircle, umfassend mindestens eine Nukleinsäuresequenz von Interesse, die in eine andere genetische Umgebung transponiert werden kann, und Transposase-Erkennungssequenzen zu beiden Seiten der Expressionskassette, charakterisiert dadurch, dass die Transposase-Erkennungssequenzen von einer Transposase, oder dem Derivat einer Transposase, erkannt und zur Transposition verwendet werden können. Bevorzugte Transposasen sind Dornröschen-Transposasen (Sleepingbeauty-Transposasen) und PiggyBac-Transposasen.The present invention relates in one aspect to a minicircle comprising at least one nucleic acid sequence of interest that can be transposed into another genetic environment, and transposase recognition sequences on either side of the expression cassette, characterized in that the transposase recognition sequences of a transposase, or the derivative of a transposase, can be recognized and used for transposition. Preferred transposases are sleeping beauty transposases and PiggyBac transposases.

„Minicircle” im Sinne dieser Erfindung bezeichnet eine zirkuläre doppelsträngige DNS, die mindestens eine Nukleinsäuresequenz von Interesse enthält, und im Wesentlichen frei ist von prokaryotischen Nukleinsäuresequenzen, wie sie typischerweise in Plasmiden vorgefunden werden, wie etwa Replikationsstartpunkten, Markergenen oder Resistenzgenen. Insbesondere von Promotoren enthalten Minicircles, wenn überhaupt, nur solche, die zur Expression von Genen der Expressionskassette dienen. Dadurch sind Minicircles besonders geeignet zum Einbringen von gewünschten Nukleinsäuresequenzen in Zielzellen, da Wirkungen unerwünschter DNS-Elemente, wie etwa die Expression oder Rekombination von Resistenzgenen, ausgeschlossen werden können und z. B. überflüssige und funktionslose Sequenzen vermieden werden."Minicircle" in the sense of this invention refers to a circular double-stranded DNA which contains at least one nucleic acid sequence of interest and is substantially free of prokaryotic nucleic acid sequences as typically found in plasmids, such as origins of replication, marker genes or resistance genes. In particular of promoters, minicircles contain, if at all, only those which serve for the expression of genes of the expression cassette. As a result, minicircles are particularly suitable for introducing desired nucleic acid sequences in target cells, since effects of undesired DNA elements, such as the expression or recombination of resistance genes, can be excluded and z. B. superfluous and functionless sequences can be avoided.

Ein „Markergen” im Sinne der Erfindung ist eine DNS-Sequenz, die einer Zelle bzw. einem Organismus unter bestimmten Bedingungen einen Überlebensvorteil verschafft (z. B. Resistenzgene gegen bestimmte Antibiotika) oder zum Auffinden erfolgreich transformierter oder transfizierter Zellen eingesetzt wird. Beispielsweise kann ein Markergen ein Gen zur Expression eines fluoreszierenden Proteins sein, wie etwa GFP.A "marker gene" within the meaning of the invention is a DNA sequence which gives a cell or an organism a survival advantage under certain conditions (eg resistance genes to certain antibiotics) or is used to find successfully transformed or transfected cells. For example, a marker gene may be a gene for expression of a fluorescent protein, such as GFP.

Eine „Nukleinsäuresequenz von Interesse” kann jede doppelsträngige DNS-Sequenz sein, die in eine eukaryotische Zielzelle eingebracht und in eine Nukleinsäure der Zielzelle transponiert werden soll. Bevorzugt ist eine Nukleinsäuresequenz von Interesse eine Expressionskassette für ein oder mehr Gene sein, z. B. 1, 2, 3, 4, 5 oder mehr Gene. In einer anderen Ausführungsform kann es sich um eine Nukleinsäuresequenz handeln, die nicht für ein Protein kodiert. Beispielsweise kann die Nukleinsäuresequenz von Interesse dazu dienen, einen Abstand zwischen zwei DNS-Abschnitten zu generieren oder DNS-bindende Faktoren (z. B.A "nucleic acid sequence of interest" may be any double-stranded DNA sequence that is to be introduced into a eukaryotic target cell and transposed into a nucleic acid of the target cell. Preferably, a nucleic acid sequence of interest is an expression cassette for one or more genes, e.g. B. 1, 2, 3, 4, 5 or more genes. In another embodiment, it may be a nucleic acid sequence that does not encode a protein. For example, the nucleic acid sequence of interest may serve to generate a gap between two DNA segments or DNA binding factors (eg.

Nukleinsäuren oder Proteine) unter bestimmten Bedingungen zu binden bzw. zu entlassen und so in die Genregulation der Zielzelle einzugreifen. Weiterhin kann es sich bei der Nukleinsäuresequenz von Interesse um eine RNS-kodierende Sequenz (z. B. für siRNA oder shRNA) handeln oder um andere genetische Elemente, die in der Zielzelle wirksam werden sollen, z. B. Isolatorsequenzen (also Sequenzmotive, die, wenn sie in das Genom integriert werden, die regulierende Wirkung eines chromosomalen Abschnitts auf seine benachbarten Regionen beeinflussen). Auch kann eine Nukleinsäuresequenz von Interesse eine Markersequenz sein, die im Verlauf einer Insertionsmutagenese in die zelluläre DNS eingebracht – und gegebenenfalls auch wieder entfernt – werden soll. Mittels DNS-Sequenzierung oder PCR ausgehend von der Markersequenz kann dann beispielsweise die Insertionsstelle der Sequenz bestimmt werden. Außerdem kann eine Nukleinsäuresequenz von Interesse eine beabsichtigte Wirkung in Form einer Stimulation zellulärer oder immunologischer Reaktionen (z. B. durch CpG-Motive, siehe A. Krieg et al., Nature 1995, 374: 546–9 ) haben.Nucleic acids or proteins) under certain conditions to bind or dismiss and thus interfere with the gene regulation of the target cell. Furthermore, the nucleic acid sequence of interest may be an RNA coding sequence (eg, for siRNA or shRNA) or other genetic elements to be effective in the target cell, e.g. B. isolator sequences (ie Sequence motifs which, when integrated into the genome, affect the regulatory effect of one chromosomal segment on its neighboring regions). Also, a nucleic acid sequence of interest may be a marker sequence which is introduced into the cellular DNA in the course of an insertion mutagenesis - and optionally also removed again. By means of DNA sequencing or PCR starting from the marker sequence, the insertion site of the sequence can then be determined, for example. In addition, a nucleic acid sequence of interest may have an intended effect in the form of stimulation of cellular or immunological responses (eg, by CpG motifs, see A. Krieg et al., Nature 1995, 374: 546-9 ) to have.

Eine „Expressionskassette” ist eine DNS-Sequenz, die ein oder mehr Gene enthält sowie Sequenzen, die die Expression der Gene kontrollieren. Insbesondere umfasst eine Expressionskassette Promotorsequenzen, offene Leserahmen, die für die zu exprimierenden Polypeptide kodieren, und 3'-untranslatierte Bereiche, die bei Expression in Eukaryoten gewöhnlich eine Polyadenylierungssequenz enthalten. Eine Expressionskassette kann auch mehr als ein Gen (z. B. 2, 3, 4, 5 oder mehr Gene) enthalten, insbesondere einen Cluster von Genen, wie sie gewöhnlich für die Stammzellenprogrammierung verwendet werden. Ein solcher Cluster kann beispielsweise 3, 4 oder 5 Gene enthalten.An "expression cassette" is a DNA sequence that contains one or more genes and sequences that control the expression of the genes. In particular, an expression cassette comprises promoter sequences, open reading frames that encode the polypeptides to be expressed, and 3 'untranslated regions that usually contain a polyadenylation sequence when expressed in eukaryotes. An expression cassette may also contain more than one gene (eg, 2, 3, 4, 5 or more genes), particularly a cluster of genes commonly used for stem cell programming. Such a cluster may contain, for example, 3, 4 or 5 genes.

„Transposase-Erkennungssequenzen” sind solche DNS-Sequenzen, die von einer natürlichen Transposase oder einem Derivat einer natürlichen Transposase erkannt, gebunden und zur Reaktion gebracht werden können, so dass unter geeigneten Bedingungen die Rekombination der sich zwischen zwei Erkennungssequenzen befindenden DNS mit einem anderen (trans) oder demselben (cis) DNS-Molekül ermöglicht wird. Transposasen wiederum sind Enzyme aus Transposon-Systemen, die für den Transfer von Transposons zu anderen Bereichen des Genoms verantwortlich sind. Eine Transposase wird als „spezifisch” für gegebene Erkennungssequenzen betrachtet, wenn sie diese erkennen, binden und zur Reaktion bringen kann, so dass unter geeigneten Bedingungen die Transposition der sich zwischen zwei Erkennungssequenzen befindenden DNS in ein anderes (trans) oder dasselbe (cis) DNS-Molekül ermöglicht wird."Transposase recognition sequences" are those DNA sequences which can be recognized, bound and reacted by a natural transposase or a derivative of a natural transposase such that, under appropriate conditions, the recombination of the DNA located between two recognition sequences with another ( trans) or the same (cis) DNA molecule. In turn, transposases are enzymes from transposon systems responsible for the transfer of transposons to other areas of the genome. A transposase is considered to be "specific" to given recognition sequences if it recognizes, binds and reacts them so that, under appropriate conditions, the transposition of the DNA located between two recognition sequences into another (trans) or the same (cis) DNA Molecule is enabled.

Als „Derivate” einer gegebenen Transposase werden im Sinne dieser Erfindung solche Transposasen verstanden, die für dieselben Erkennungssequenzen spezifisch sind wie die gegebene Transposase. Die Aminosäuresequenz eines Derivats ist im Allgemeinen mit der Aminosäuresequenz der ursprünglichen Transposase verwandt und beispielsweise zu mindestens 60%, oder zu mindestens 70%, oder zu mindestens 80%, oder zu mindestens 90%, oder zu mindestens 95%, oder zu mindestens 99% mit ihr identisch.For the purposes of this invention, "derivatives" of a given transposase are understood as meaning those transposases which are specific for the same recognition sequences as the given transposase. The amino acid sequence of a derivative is generally related to the amino acid sequence of the original transposase and, for example, at least 60%, or at least 70%, or at least 80%, or at least 90%, or at least 95%, or at least 99%. identical with her.

Die Minicircles der Erfindung enthalten mehrere Transposase-Erkennungssequenzen. Bevorzugt enthalten Minicircles der Erfindung zwei Transposase-Erkennungssequenzen, je eine zu beiden Seiten der Nukleinsäuresequenz von Interesse, so dass sich die Nukleinsäure von Interesse innerhalb der beiden Transposase-Erkennungssequenzen befindet. Die Transposase-Erkennungssequenzen können sich unmittelbar an die Nukleinsäure von Interesse anschließen, oder die Sequenzen können durch einen Spacer getrennt sein. Spacer können zu beiden Seiten der Nukleinsäure von Interesse angebracht sein, oder nur an einer Seite. Die Spacer haben vorzugsweise eine Länge von 1–1000 bp, z. B. 1, 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 oder 1000 bp. Wenn zu beiden Seiten der Nukleinsäure von Interesse Spacer vorliegen, können diese gleiche oder unterschiedliche Längen haben. Mit „Spacer” wird hier jegliche DNS-Sequenz bezeichnet, die zwischen der Nukleinsäure von Interesse und den Transposase-Erkennungssequenzen liegt. Insbesondere kann ein Spacer auch eine oder mehrere Identifikationssequenzen wie unten beschrieben umfassen.The minicircles of the invention contain several transposase recognition sequences. Preferably, minicircles of the invention contain two transposase recognition sequences, one on either side of the nucleic acid sequence of interest, such that the nucleic acid of interest is within the two transposase recognition sequences. The transposase recognition sequences may be directly attached to the nucleic acid of interest, or the sequences may be separated by a spacer. Spacers may be attached to either side of the nucleic acid of interest, or only on one side. The spacers preferably have a length of 1-1000 bp, z. 1, 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 or 1000 bp. If spacers are present on both sides of the nucleic acid of interest, they may have the same or different lengths. By "spacer" is meant herein any DNA sequence that is between the nucleic acid of interest and the transposase recognition sequences. In particular, a spacer may also comprise one or more identification sequences as described below.

Je nach Art der Transposase, die zur Transposition verwendet wird, können die Erkennungssequenzen unterschiedlich beschaffen sein. In manchen Ausführungsformen enthalten die Erkennungssequenzen Wiederholungen. Beispiele für verschiedene Arten von Wiederholungen sind lange terminale Wiederholungen (LTRs), inverse Wiederholungen (IRs) oder direkte Wiederholungen (DRs). Wiederholungen dieser Typen können auch kombiniert miteinander Auftreten, zum Beispiel als DRs innerhalb von IRs (IR/DR). Mit „Wiederholungen” werden hierbei nicht nur vollständig identische Sequenzen bezeichnet, sondern auch Sequenzen, die hinreichend ähnlich zueinander sind, dass eine Homologie erkannt werden kann. Beispielsweise sind die in 1A und B dargestellten DR-Sequenzen aus einer Erkennungssequenz von Dornröschen-Transposasen zu etwa 80% identisch zueinander.Depending on the type of transposase used for transposition, the recognition sequences may be of different nature. In some embodiments, the recognition sequences contain repeats. Examples of different types of repetitions are long terminal repeats (LTRs), inverse repeats (IRs), or direct repeats (DRs). Repetitions of these types can also be combined with one another, for example as DRs within IRs (IR / DR). "Repetitions" here are not only completely identical sequences, but also sequences that are sufficiently similar to each other that a homology can be detected. For example, the in 1A and B represented DR sequences from a recognition sequence of Sleeping Beauty transposases about 80% identical to each other.

Dem Fachmann ist auch klar, dass Mutationen in Erkennungssequenzen eingefügt werden können, solange ihre Funkion dadurch nicht in unerwünschtem Ausmaß beeinträchtigt wird. In jedem Fall müssen die Erkennungssequenzen von einer solchen Beschaffenheit sein und in einer solchen Orientierung und Lage im Minicircle angeordnet sein, dass sie von einer spezifischen Transposase erkannt, gebunden und zur Reaktion gebracht werden können, so dass unter geeigneten Bedingungen die Transposition der sich innerhalb der Transposase-Erkennungssequenzen befindenden DNS ermöglicht wird.It will also be apparent to those skilled in the art that mutations can be introduced into recognition sequences, as long as their function is not adversely affected thereby. In any case, the recognition sequences must be of such a nature and be placed in such an orientation and location in the minicircle that they can be recognized, bound and reacted by a specific transposase such that, under appropriate conditions, the transposition within the DNA is Transposase recognition sequences DNA is enabled.

Grundsätzlich können Erkennungssequenzen jeder beliebigen Transposase in Minicircles der Erfindung verwendet werden. Beispiele für Transposasen umfassen PiggyBac-Transposasen, Dornröschen-Transposasen und deren Derivate. Die Aminosäuresequenz eines Derivats ist im Allgemeinen mit der Aminosäuresequenz der ursprünglichen Transposase verwandt und beispielsweise zu mindestens 60%, oder zu mindestens 70%, oder zu mindestens 80%, oder zu mindestens 90%, oder zu mindestens 95%, oder zu mindestens 99% mit ihr identisch. Das Derivat einer Transposase besitzt ebenfalls Transposase-Aktivität und kann für dieselben oder andere Erkennungssequenzen wie die ursprüngliche Transposase spezifisch sein. In principle, recognition sequences of any transposase can be used in minicircles of the invention. Examples of transposases include PiggyBac transposases, Sleeping Beauty transposases and their derivatives. The amino acid sequence of a derivative is generally related to the amino acid sequence of the original transposase and, for example, at least 60%, or at least 70%, or at least 80%, or at least 90%, or at least 95%, or at least 99%. identical with her. The derivative of a transposase also possesses transposase activity and may be specific for the same or different recognition sequences as the original transposase.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Minicircle zwei Erkennungssequenzen vom IR/DR-Typ, für welche Dornröschen-Transposasen (auch Sleeping-Beauty- oder SB-Transposasen genannt) spezifisch sind. Die Erkennungssequenzen, die von SB-Transposasen erkannt werden, sind IR-Sequenzen von etwa 210–250 Basenpaaren Länge und enthalten jeweils zwei DR-Sequenzen, eine an jedem Ende, die zu über 80% identisch miteinander sind. Die DR-Sequenz am äußeren, vom Mittelpunkt des zu transponierenden DNS-Abschnitts weiter entfernten, Ende hat hierbei die Sequenz von SEQ ID NO: 1 (siehe auch 1A) und die DR-Sequenz am inneren, dem Mittelpunkt des zu transponierenden DNS-Abschnitts näher gelegenen, Ende hat die Sequenz von SEQ ID NO: 2 (siehe auch 1B). Eine SB-Transposase kann sich zweier IR-Sequenzen für eine Transposition auch dann bedienen, wenn die IR Sequenzen keine exakten Wiederholungen darstellen, sondern in den Bereichen zwischen den jeweiligen DRs Sequenzunterschiede enthalten, solange die DRs selbst den in SEQ ID NO: 1 und 2 aufgeführten Sequenzen entsprechen (siehe Z. Ivics et al., Cell 1997, 91: 501–510 ). Dementsprechend hat/haben in weiter bevorzugten Ausführungsformen mindestens eine oder beide der Transposase-Erkennungssequenzen eine Länge von 210–250 Basenpaaren (beispielsweise von 225–240 Basenpaaren), wobei am von der Nukleinsäure von Interesse weiter entfernten Ende die Sequenz von SEQ ID NO: 1 liegt und am zu der Nukleinsäure von Interesse näheren Ende die Sequenz von SEQ ID NO: 2 liegt.In a preferred embodiment, the minicircle contains two IR / DR type recognition sequences, for which Sleeping Beauty transposases (also called Sleeping Beauty or SB transposases) are specific. The recognition sequences recognized by SB transposases are IR sequences of about 210-250 base pairs in length and each contain two DR sequences, one at each end, which are over 80% identical to one another. The DR sequence at the outer end, farther from the center of the DNA segment to be transposed, in this case has the sequence of SEQ ID NO: 1 (see also FIG 1A ) and the DR sequence at the inner end closer to the midpoint of the DNA segment to be transposed has the sequence of SEQ ID NO: 2 (see also US Pat 1B ). An SB transposase can use two IR sequences for a transposition even if the IR sequences do not represent exact repetitions, but contain sequence differences in the regions between the respective DRs, as long as the DRs themselves have the sequences shown in SEQ ID NO: 1 and 2 correspond to listed sequences (see Z. Ivics et al., Cell 1997, 91: 501-510 ). Accordingly, in further preferred embodiments, at least one or both of the transposase recognition sequences have a length of 210-250 base pairs (e.g., 225-240 base pairs), at the end farther from the nucleic acid of interest, the sequence of SEQ ID NO: 1 and at the end closer to the nucleic acid of interest is the sequence of SEQ ID NO: 2.

Dornröschen-Transposasen (SB-Transposasen) basieren auf der künstlichen Transposase SB10 (SEQ ID NO: 3; siehe auch 1C), die wiederum auf der Grundlage der inaktiven Transposasen verschiedener Tc1-artiger Elemente (TcEs) aus mehreren Spezies der echten Knochenfische entworfen wurde (siehe Z. Ivics et al., Cell 1997, 91: 501–510 ). Während die natürlich vorkommenden TcEs alle inaktiv sind, wurde die SB10-Transposase so mutiert, dass sie an den IR/DR-Sequenzen von TcEs (beispielsweise dem T-Element aus Tanichtbys albonubes) Transpositionen katalysieren kann und voll funktionsfähig ist. Eine weitere SB-Transposase ist SB100X (auch SB100 genannt), ein Derivat von SB10, das eine etwa 100fach erhöhte Transpositionsrate gegenüber SB10 aufweist (SEQ ID NO: 4; siehe L. Mátés et al., Nat. Genet. 2009, 41: 753–761 ; siehe auch 1C).Sleeping beauty transposases (SB transposases) are based on the artificial transposase SB10 (SEQ ID NO: 3; see also 1C ), which in turn was designed based on the inactive transposases of several Tc1-like elements (TcEs) from several species of true bony fish (see Z. Ivics et al., Cell 1997, 91: 501-510 ). While the naturally occurring TcEs are all inactive, the SB10 transposase has been mutated to catalyze and is fully functional at the IR / DR sequences of TcEs (for example, the T element from Tanichtbys albonubes) transpositions. Another SB transposase is SB100X (also called SB100), a derivative of SB10 that has an approximately 100-fold increased transposition rate to SB10 (SEQ ID NO: 4; L. Mátés et al., Nat. Genet. 2009, 41: 753-761 ; see also 1C ).

2 zeigt eine Skizze eines beispielhaften Minicircles gemäß der Erfindung mit einer GFP-Expressionskassette als Nukleinsäuresequenz von Interesse. 2 shows a sketch of an exemplary minicircles according to the invention with a GFP expression cassette as a nucleic acid sequence of interest.

Das SB-Transposon-System bietet den besonderen Vorteil, dass es in einer Vielzahl verschiedener Wirbeltierzellen aus unterschiedlichsten Spezies aktiv ist (siehe Z. Ivics et al., Cell 1997, 91: 501–510 ) und daher einen vielseitigen Einsatz der Minicircles in Rekombinations- und Integrationsexperimenten zulässt. Insbesondere können SB-Minicircles zur Herstellung induzierter pluripotenter Stammzellen verwendet werden.The SB transposon system has the particular advantage that it is active in a large number of different vertebrate cells from a wide variety of species (see Z. Ivics et al., Cell 1997, 91: 501-510 ) and therefore allows a versatile use of minicircles in recombination and integration experiments. In particular, SB minicircles can be used to prepare induced pluripotent stem cells.

Minicircles gemäß der vorliegenden Erfindung können sehr unterschiedliche Größen haben, zum Beispiel zwischen 500 und 15000 bp, wie etwa 500 bp, 1000 bp, 1500 bp, 2000 bp, 2500 bp, 3000 bp, 4000 bp, 5000 bp, 6000 bp, 8000 bp, 10000 bp, 12000 bp oder 15000 bp. Bevorzugt sind Größen zwischen 1000 bp und 6000 bp, besonders bevorzugt sind Größen zwischen 2000 bp und 4000 bp.Minicircles according to the present invention can have very different sizes, for example between 500 and 15000 bp, such as 500 bp, 1000 bp, 1500 bp, 2000 bp, 2500 bp, 3000 bp, 4000 bp, 5000 bp, 6000 bp, 8000 bp , 10000 bp, 12000 bp or 15000 bp. Preferably, sizes between 1000 bp and 6000 bp, more preferably sizes between 2000 bp and 4000 bp.

Vorzugsweise sind die Minicircles der Erfindung superspiralisiert.Preferably, the minicircles of the invention are supercoiled.

Bevorzugte Minicircles der Erfindung können in zwei Bereiche unterteilt werden, einen „inneren” und einen „äußeren” Bereich. Der innere Bereich umfasst die Region umfassend die Nukleinsäure von Interesse bis einschließlich der beiden Transposase-Erkennungssequenzen und ist damit zugleich eine Transpositionskassette. Der äußere Bereich umfasst. die Region zwischen den äußeren Enden der beiden Transposase-Erkennungssequenzen.Preferred minicircles of the invention may be divided into two regions, an "inner" and an "outer" region. The inner region comprises the region comprising the nucleic acid of interest up to and including the two transposase recognition sequences and is thus also a transposition cassette. The outer area includes. the region between the outer ends of the two transposase recognition sequences.

Gemäß der Erfindung sind Minicircles mit äußeren Bereichen ≤ 500 bp bevorzugt. Besonders bevorzugt sind Minicircles mit äußeren Bereichen ≤ 300 bp, z. B. mit äußeren Bereichen von 30, 50, 75, 100, 150, 200, 250 oder 300 bp.According to the invention, minicircles with outer ranges ≦ 500 bp are preferred. Particularly preferred are minicircles with outer ranges ≤ 300 bp, z. B. with outer areas of 30, 50, 75, 100, 150, 200, 250 or 300 bp.

Es wurde beobachtet, dass überraschenderweise von Transposase-Erkennungssequenzen flankierte DNS-Sequenzen durch die entsprechende Transposase effizienter transponiert werden, wenn die DNS-Sequenzen auf Minicircles statt auf Plasmiden vorliegen. Die dadurch auftretende höhere Transpositionsrate führt dazu, dass die Häufigkeit und Effizienz der Integration gewünschter DNS-Sequenzen in die DNS einer Zielzelle erheblich gesteigert werden kann, wenn diese Sequenzen in Form von Transpositionskassetten auf Minicircles bereitgestellt werden. Dies gilt insbesondere, wenn die Minicircles superspiralisiert sind.It has been observed that DNA sequences flanked by transposase recognition sequences are surprisingly transposed more efficiently by the corresponding transposase if the DNA sequences are present on minicircles instead of on plasmids. The resulting higher transposition rate leads to the frequency and efficiency of the integration of desired DNA Sequences into the DNA of a target cell can be significantly increased when these sequences are provided in the form of transposition cassettes on minicircles. This is especially true when the minicircles are supercoiled.

Eine Bereitstellung von Transpositionskassetten in Minicircles beispielsweise zum Zweck der Insertionsmutagenese oder Transformation in einer Zielzelle ermöglicht damit zum einen, die generellen Vorteile der Minicircle-Technologie zu nutzen, die in der Vermeidung des Einbringens unnötiger und eventuell immunogener prokaryotischer Sequenzen in die Zielzellen liegen. Zusätzlich wird jedoch auch die Transpositionseffizienz gesteigert, was einen bedeutenden weiteren Vorteil der hier beschriebenen Technologie darstellt. Wie bereits im Abschnitt „Hintergrund” beschrieben, ist es bekannt, dass in vielen Transposonsystemen die Transpositionseffizienz mit wachsender Länge der Transpositionskassette abnimmt. Die Länge von DNS-Abschnitten, die effizient mittels Transposition in die DNS einer Zielzelle eingebracht werden können, ist daher beschränkt. Die beobachtete Erhöhung der Transpositionseffizienz bei Bereitstellen der Transpositionskassette auf einem Minicircle kann daher vorteilhaft genutzt werden, um längere DNS-Abschnitte mit einer Effizienz in die DNS einer Zielzelle zu transponieren, die mit bisherigen Verfahren nur bei erheblich kürzeren Abschnitten erreicht werden konnte. Insbesondere für die Transposition von Abschnitten, die mehrere Gene enthalten, sind Minicircle-Transposon-Konstrukte sehr interessant.Provision of transposition cassettes in minicircles, for example, for the purpose of insertional mutagenesis or transformation in a target cell thus allows, on the one hand, to take advantage of the general advantages of minicircle technology in avoiding the introduction of unnecessary and possibly immunogenic prokaryotic sequences into the target cells. In addition, however, the transposition efficiency is also increased, which represents a significant further advantage of the technology described herein. As already described in the Background section, it is known that in many transposon systems, the transposition efficiency decreases as the length of the transposition cassette increases. The length of DNA segments that can be efficiently transposed into the DNA of a target cell is therefore limited. The observed increase in transposition efficiency in providing the transposition cassette on a minicircle can therefore be used to advantage in transposing longer DNA segments into the DNA of a target cell with efficiency that could only be achieved at significantly shorter intervals with previous methods. Especially for the transposition of sections containing multiple genes, minicircle transposon constructs are very interesting.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist die Nukleinsäuresequenz von Interesse im Minicircle eine Expressionskassette mit mindestens einem Gen. Das Gen kodiert vorzugsweise für ein therapeutisch nützliches Protein. Jedoch können auch beliebige andere Gene in den Minicircles der Erfindung verwendet werden. Das Gen kann für ein Wildtyp-Protein, ein mutiertes Protein oder auch für ein Fusionsprotein kodieren, z. B. für ein GFP-Fusionsprotein. Die Expressionskassette kann auch mehrere Gene oder andere genetische Elemente enthalten. Wie oben erwähnt, kann es sich dabei beispielsweise um eine Sequenz handeln, die nicht für ein Protein kodiert, sondern lediglich dazu dient, einen Abstand zwischen zwei DNS-Abschnitten zu generieren oder DNS-bindende Faktoren (z. B. Nukleinsäuren oder Proteine) unter bestimmten Bedingungen zu binden bzw. zu entlassen und so in die Genregulation der Zielzelle einzugreifen. Weiterhin kann es sich bei der Sequenz in der Expressionskassette um eine RNS-kodierende Sequenz (z. B. für siRNA oder shRNA) handeln oder um andere genetische Elemente, die in der Zielzelle wirksam werden sollen, z. B. Isolatorsequenzen (also Sequenzmotive, die, wenn sie in das Genom integriert werden, die regulierende Wirkung eines chromosomalen Abschnitts auf seine benachbarten Regionen beeinflussen). Auch kann eine Nukleinsäuresequenz von Interesse eine Markersequenz sein, die im Verlauf einer Insertionsmutagenese in die zelluläre DNS eingebracht – und gegebenenfalls auch wieder entfernt – werden soll. Mittels DNS-Sequenzierung oder PCR ausgehend von der Markersequenz kann dann beispielsweise die Insertionsstelle der Sequenz bestimmt werden. Außerdem kann eine Nukleinsäuresequenz von Interesse eine beabsichtigte Wirkung in Form eine Stimulation zellulärer oder immunologischer Reaktionen (z. B. durch CpG-Motive, siehe A. Krieg et al., Nature 1995, 374: 546–9 ) haben.According to one embodiment of the invention, the nucleic acid sequence of interest in the minicircle is an expression cassette having at least one gene. The gene preferably encodes a therapeutically useful protein. However, any other genes can also be used in the minicircles of the invention. The gene may encode a wild-type protein, a mutant protein or even a fusion protein, e.g. For a GFP fusion protein. The expression cassette may also contain multiple genes or other genetic elements. As mentioned above, this may be, for example, a sequence that does not code for a protein, but merely serves to generate a distance between two DNA segments or DNA-binding factors (eg nucleic acids or proteins) bind or release certain conditions and thus intervene in the gene regulation of the target cell. Furthermore, the sequence in the expression cassette may be an RNA coding sequence (eg for siRNA or shRNA) or other genetic elements to be effective in the target cell, e.g. B. isolator sequences (that is, sequence motifs which, when integrated into the genome, affect the regulatory effect of one chromosomal segment on its neighboring regions). Also, a nucleic acid sequence of interest may be a marker sequence which is introduced into the cellular DNA in the course of an insertion mutagenesis - and optionally also removed again. By means of DNA sequencing or PCR starting from the marker sequence, the insertion site of the sequence can then be determined, for example. In addition, a nucleic acid sequence of interest may have an intended effect in the form of stimulation of cellular or immunological responses (eg, by CpG motifs, see A. Krieg et al., Nature 1995, 374: 546-9 ) to have.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform enthalten die Minicircles im inneren Bereich, die Nukleinsäure von Interesse flankierend, ein Paar Rekombinase-Erkennungssequenzen, für die eine entsprechende Rekombinase spezifisch ist. Eine für gegebene Rekombinase-Erkennungssequenzen spezifische Rekombinase ist hierbei jedes Enzym, das eine richtungsspezifische Rekombination an den Rekombinase-Erkennungssequenzen katalysieren kann. Im vorliegenden Fall müssen die beiden Rekombinase-Erkennungssequenzen so orientiert sein, dass bei der Rekombination der dazwischen liegende DNS-Abschnitt als ein zyklisches Molekül ausgeschnitten wird.In another embodiment, the minicircles in the inner region, flanking the nucleic acid of interest, contain a pair of recombinase recognition sequences for which a corresponding recombinase is specific. A recombinase specific for given recombinase recognition sequences is any enzyme capable of catalyzing directional recombination at the recombinase recognition sequences. In the present case, the two recombinase recognition sequences must be oriented such that upon recombination, the intervening DNA segment is excised as a cyclic molecule.

Mit Hilfe dieser Rekombinase-Erkennungssequenzen kann nach einer Insertionsmutagenese die Nukleinsäure von Interesse, die mittels der Transposase ins Genom der Zielzelle integriert wurde, durch Bereitstellen der entsprechenden, für die Erkennungssequenzen spezifischen Rekombinase innerhalb der Zielzelle wieder aus dem Genom entfernt oder ausgetauscht werden. Die Bereitstellung erfolgt vorzugsweise durch induzierbare Expression der Rekombinase in der Zielzelle. Bevorzugte Rekombinase-Erkennungssequenzen für solche Ausführungsformen der Erfindung sind FRT-Sequenzen, für die die Flp-Rekombinase aus dem Plasmid 2 μ spezifisch ist (siehe z. B. B. J. Andrews et al., Cell 1985, 40(4): 795–803 ). Es können jedoch auch andere Rekombinasen und Rekombinase-Erkennungssequenzen verwendet werden.With the aid of these recombinase recognition sequences, after insertion mutagenesis, the nucleic acid of interest which has been integrated into the genome of the target cell by means of the transposase can be removed from the genome or exchanged again by providing the corresponding recombinase specific for the recognition sequences within the target cell. The provision is preferably carried out by inducible expression of the recombinase in the target cell. Preferred recombinase recognition sequences for such embodiments of the invention are FRT sequences for which the Flp recombinase from the plasmid is 2 μ specific (see eg. BJ Andrews et al., Cell 1985, 40 (4): 795-803 ). However, other recombinases and recombinase recognition sequences may also be used.

HERSTELLUNG VON MINICIRCLESMANUFACTURE OF MINICIRCLES

Die Minicircles der Erfindung können mittels Rekombination aus entsprechenden Plasmiden hergestellt werden, wie in WO 96/26270 oder EP 1620559 beschrieben. Hierbei geht man von einem Plasmid („Parentalplasmid”) aus, das die komplette Sequenz des gewünschten Minicircles (Minicircle-Region) und zusätzlich ein Plasmidrückgrat (Miniplasmid-Region) enthält (siehe 3). Zwischen der Minicircle-Region und der Miniplasmid-Region befinden sich beiderseits Rekombinase-Erkennungssequenzen, für die eine entsprechende Rekombinase spezifisch ist. Eine für gegebene Rekombinase-Erkennungssequenzen spezifische Rekombinase ist hierbei jedes Enzym, das eine richtungsspezifische Rekombination an den Rekombinase-Erkennungssequenzen katalysieren kann.The minicircles of the invention may be prepared by recombination from appropriate plasmids as described in U.S. Pat WO 96/26270 or EP 1620559 described. This is based on a plasmid ("parent plasmid"), which contains the complete sequence of the desired minicircle (minicircle region) and additionally a plasmid backbone (miniplasmid region) (see 3 ). Between the minicircle region and the miniplasmid region there are recombinase recognition sequences on both sides for which a corresponding recombinase is specific. One for given recombinase Recognition sequences specific recombinase here is any enzyme that can catalyze a direction-specific recombination at the recombinase recognition sequences.

Das Parentalplasmid wird durch die spezifische Rekombinase zu einem Minicircle und einem verbleibenden Rest, dem Miniplasmid, rekombiniert. Hierbei müssen die beiden Rekombinase-Erkennungssequenzen so orientiert sein, dass bei der Rekombination die Trennung in Minicircle und Miniplasmid erfolgt und nicht ein einzelnes modifiziertes Plasmid entsteht.The parent plasmid is recombined by the specific recombinase into a minicircle and a remainder, the miniplasmid. Here, the two recombinase recognition sequences must be oriented so that the recombination into minicircle and miniplasmid occurs and not a single modified plasmid is formed.

Die Rekombinase-Erkennungssequenzen können sich unmittelbar an die Transpositionskassette anschließen, oder die Sequenzen können durch einen Spacer getrennt sein. Spacer können zu beiden Seiten der Transpositionskassette angebracht sein, oder nur an einer Seite. Die Spacer haben vorzugsweise eine Länge von 1–1000 bp, z. B. 1, 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 oder 1000 bp. Wenn zu beiden Seiten der Transpositionskassette Spacer vorliegen, können diese gleiche oder unterschiedliche Längen haben. Mit „Spacer” wird hier jegliche DNS-Sequenz bezeichnet, die zwischen der Transpositionskassette und den Rekombinase-Erkennungssequenzen liegt. Insbesondere kann ein Spacer auch eine oder mehrere Identifikationssequenzen wie unten beschrieben umfassen.The recombinase recognition sequences may be immediately adjacent to the transposition cassette, or the sequences may be separated by a spacer. Spacers may be attached to either side of the transposition cassette, or only on one side. The spacers preferably have a length of 1-1000 bp, z. 1, 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 or 1000 bp. If there are spacers on both sides of the Transposition Cassette, they may have the same or different lengths. By "spacer" is meant herein any DNA sequence located between the transposition cassette and the recombinase recognition sequences. In particular, a spacer may also comprise one or more identification sequences as described below.

Beispiele für mögliche Rekombinasen sind die Integrasen aus den Bakteriophagen λ (siehe A. Landy et al., Science 1977, 197(4309): 1147–1160 ), P22 und Φ80 (siehe J. M. Leong et al., J. Biol. Chem. 1985, 260(7): 4468–4470 ), die HP1-Integrase aus Haemophilus influenzae (siehe M. A. Hauser et al., J. Biol. Chem. 1992, 267(10): 6859–6864 ), die Cre-Integrase aus dem Phagen P1, die Integrase aus. dem Plasmid pSAM2 (siehe EP350341 ), die Flp-Rekombinase aus dem Plasmid 2 μ (siehe B. J. Andrews et al., Cell 1985, 40(4): 795–803 ) oder die ΦC31-Integrase (siehe J. R. Bateman et al., Genetics 2006, 173(2): 769–777 ). Alternativ können auch Rekombinasen aus Transposons der Tn3-Familie verwendet werden, wie die parA-Resolvase aus RP4 (siehe L. Eberl et al., Mol. Microbiol. 1994, 12(1): 131–141 ), die Resolvasen der Transposons Tn3, Tn21 oder Tn522 (siehe W. M. Stark et al., Trends Genes. 1992, 8(12): 432–439 ), oder die Gin-Invertase aus dem Bakteriophagen μ.Examples of possible recombinases are the integrases from the bacteriophages λ (see A. Landy et al., Science 1977, 197 (4309): 1147-1160 ), P22 and Φ80 (see JM Leong et al., J. Biol. Chem. 1985, 260 (7): 4468-4470 ), the HP1 integrase from Haemophilus influenzae (see Hauser, MA, et al., J. Biol. Chem. 1992, 267 (10): 6859-6864 ), the Cre integrase from phage P1, the integrase. the plasmid pSAM2 (see EP350341 ), the Flp recombinase from the plasmid 2 μ (see BJ Andrews et al., Cell 1985, 40 (4): 795-803 ) or the ΦC31 integrase (see JR Bateman et al., Genetics 2006, 173 (2): 769-777 ). Alternatively, recombinases from transposons of the Tn3 family may be used, such as the RPA para-resolvase (see Eberl et al., Mol. Microbiol. 1994, 12 (1): 131-141 ), the resolvases of the transposons Tn3, Tn21 or Tn522 (see WM Stark et al., Trends Genes. 1992, 8 (12): 432-439 ), or the gin invertase from the bacteriophage μ.

Wie dem Fachmann offensichtlich ist, muss hierbei darauf geachtet werden, dass die verwendeten Rekombinase-Erkennungssequenzen von eventuell innerhalb der Minicircle-Region (z. B. in der Transpositionskassette) vorhandenen weiteren Rekombinase-Erkennungssequenzen (wie vorstehend beschrieben) verschieden sind und nicht von demselben Enzym rekombiniert werden können. Eine beispielhafte Anordnung von Rekombinase- und Transposase-Erkennungssequenzen auf einem erfindungsgemäßen Parentalplasmid ist in 7 abgebildet. Die „rec”-Sequenzen werden hierbei zur Herstellung des Minicircles genutzt. Die Transpositionskassette wird durch die IR/DR-Sequenzen beschränkt und enthält die Nukleinsäure von Interesse (NOI), die zusätzlich von zwei FRT-Sequenzen flankiert wird. Nach der Transposition kann die Nukleinsäure von Interesse durch Expression von Flp-Rekombinase und Rekombination der FRT-Sequenzen wieder aus dem Genom der Zielzelle ausgeschnitten werden.As will be apparent to those skilled in the art, care must be taken that the recombinase recognition sequences used are different from, and not different from, any recombinase recognition sequences (as described above) present within the minicircle region (eg, in the transposition cassette) Enzyme can be recombined. An exemplary arrangement of recombinase and transposase recognition sequences on a parental plasmid according to the invention is described in U.S. Pat 7 displayed. The "rec" sequences are used to make the minicircle. The transposition cassette is restricted by the IR / DR sequences and contains the nucleic acid of interest (NOI), which is additionally flanked by two FRT sequences. After transposition, the nucleic acid of interest can be excised from the genome of the target cell by expression of Flp recombinase and recombination of the FRT sequences.

Erfindungsgemäße Parentalplasmide können durch dem Fachmann bekannte mikrobiologische Strategien und Methoden hergestellt werden. Als Ausgangspunkt kann beispielsweise das Plasmid pT2/BH (Addgene Zugangsnummer 26556; siehe 4) dienen, das zwei IR/DR-Elemente enthält. Dazwischen befindet sich eine multiple Klonierungsstelle (MCS), in die ein oder mehr Expressionskassetten hineinkloniert werden können. Die dabei entstehende Transpositionskassette wird von Restriktionsschnittstellen für BamHI flankiert und kann mit diesem Enzym herausgeschnitten werden, wenn innerhalb der Transpositionskassette keine BamHI-Schnittstelle vorliegt. Alternativ kann ein solches Fragment auch durch Amplifikation mittels PCR ausgehend von Primern, die außerhalb des, aber nahe zum gewünschten Sequenzfragment liegen, gewonnen werden.Parental plasmids according to the invention can be prepared by microbiological strategies and methods known to the person skilled in the art. As a starting point, for example, the plasmid pT2 / BH (Addgene accession number 26556, see 4 ) containing two IR / DR elements. In between is a multiple cloning site (MCS) into which one or more expression cassettes can be cloned. The resulting transposition cassette is flanked by restriction sites for BamHI and can be excised with this enzyme if there is no BamHI site within the transposition cassette. Alternatively, such a fragment can also be obtained by amplification by PCR from primers that are outside, but close to, the desired sequence fragment.

Das erhaltene Restriktionsfragment, das die Transpositionskassette umfasst, kann nun in ein Vorläuferplasmid kloniert werden, das den Miniplasmid-Bereich sowie die Rekombinase-Erkennungssequenzen des gewünschten Parentalplasmids enthält. Falls erforderlich, kann das Fragment auch zunächst in ein weiteres Plasmid umkloniert werden, um ein mit dem Vorläuferplasmid kompatibles Restriktionsenzym verwenden zu können. Die Klonierung eines PCR-Fragments kann entweder auf die gleiche Weise oder über einen Shuttle-Vektor zur Klovierung von PCR-Fragmenten erfolgen. In allen Fällen muss sich die Insertionsstelle auf dem Vorläuferplasmid in dem Gebiet zwischen den Rekombinase-Erkennungssequenzen befinden, das nicht den Miniplasmid-Bereich enthält. Dadurch entsteht das zur Bildung von Minicircle und Miniplasmid notwendige Parentalplasmid.The resulting restriction fragment comprising the transposition cassette can now be cloned into a precursor plasmid containing the miniplasmid region as well as the recombinase recognition sequences of the desired parental plasmid. If necessary, the fragment may also be first cloned into another plasmid in order to use a precursor plasmid-compatible restriction enzyme. The cloning of a PCR fragment can be carried out either in the same way or via a shuttle vector for the cloning of PCR fragments. In all cases, the insertion site on the precursor plasmid must be in the region between the recombinase recognition sequences that does not contain the miniplasmid region. This creates the necessary for the formation of minicircle and miniplasmid Parentalplasmid.

Alternativ können auch die Transposase-Erkennungssequenzen mit der dazwischen liegenden MCS (eine „leere” Transpositionskassette) zuerst aus pT2/BH ins Vorläuferplasmid kloniert werden und anschließend die gewünschte Expressionskassette zwischen die IR/DR-Elemente auf dem resultierenden leeren Parentalplasmid eingefügt werden.Alternatively, the transposase recognition sequences with the intermediate MCS (an "empty" transposition cassette) can first be cloned from pT2 / BH into the precursor plasmid and then the desired expression cassette inserted between the IR / DR elements on the resulting empty parental plasmid.

Dieses „Einfügen” kann mittels klassischer Ligation geeigneter DNS-Enden (stumpf oder „klebrig”) erfolgen oder auch per Rekombination (wie in Hartley, J. L., Temple, G. F., and Brasch, M. A. (2000) DNA Cloning Using in vitro Site-Specific Recombination. Genome Research 10, 1788–1795 ) beschrieben, wobei darauf zu achten ist, dass die im zuletzt genannten Fall verwendeten Rekombinationsmechanismen nicht störend mit denen der Spaltung in Minicircle und Miniplasmid interagieren. This "insertion" can be done by classical ligation of appropriate DNA ends (blunt or "sticky") or by recombination (as in Hartley, JL, Temple, GF, and Brasch, MA (2000) DNA Cloning Using In Vitro Site-Specific Recombination. Genome Research 10, 1788-1795 It should be noted that the recombination mechanisms used in the latter case do not interfere with those of minicircle and miniplasmid cleavage.

Selbstverständlich kann ein geeignetes Parentalplasmid auch auf der Grundlage anderer Plasmide als der genannten konstruiert werden. Die verwendeten Restriktionsenzyme können ebenfalls andere sein. Entscheidend ist die Struktur des entstehenden Parentalplasmid, das eine Transpositionskassette zwischen zwei geeignet orientierten Rekombinase-Erkennungssequenzen enthalten muss.Of course, a suitable parental plasmid can also be constructed on the basis of plasmids other than those mentioned. The restriction enzymes used may also be different. Crucial is the structure of the resulting parental plasmid, which must contain a transposition cassette between two suitably oriented recombinase recognition sequences.

Die Rekombination des Parentalplasmids kann in vitro oder in vivo erfolgen. Ein Vorteil der in vivo-Rekombination in Wirtszellen ist, dass das Parentalplasmid nicht aufgereinigt zu werden braucht, sofern die Expression der entsprechenden Rekombinase in den Wirtszellen induziert werden kann. Das hierfür notwendige Gen, das für die Rekombinase kodiert, kann in der Wirtszelle auf einem anderen Nukleinsäuremolekül vorliegen. Besonders vorteilhaft ist es, wenn das Rekombinase-Gen auf denn Parentalplasmid innerhalb der Miniplasmid-Region vorliegt. Vorzugsweise ist die Expression der Rekombinase induzierbar, zum Beispiel über eine Temperaturänderung oder Zugabe eines Metaboliten. Nach Induktion der Rekombinase-Expression in der Wirtszelle wird das Parentalplasmid in zwei superspiralisierte, zirkuläre Moleküle, den Minicircle und das Miniplasmid, gespalten, die nach Zelllyse voneinander getrennt werden können oder bereits in der Zelle die auf der Nukleinsäuresequenz kodierte Information realisieren.Recombination of the parental plasmid can be in vitro or in vivo. An advantage of in vivo recombination in host cells is that the parental plasmid need not be purified if the expression of the corresponding recombinase can be induced in the host cells. The necessary gene coding for the recombinase may be present in the host cell on another nucleic acid molecule. It is particularly advantageous if the recombinase gene is present on the parent plasmid within the miniplasmid region. Preferably, the expression of the recombinase is inducible, for example via a change in temperature or addition of a metabolite. After induction of recombinase expression in the host cell, the parental plasmid is cleaved into two supercoiled circular molecules, the minicircle and the miniplasmide, which can be separated from each other after cell lysis or already in the cell to encode the information encoded on the nucleic acid sequence.

Wirtszelle kann somit auch die Zielzelle sein, wobei dafür die Expressionssteuerung der Rekombinase in eukaryotischen Zellen gewährleistet sein muss. Umgekehrt kann die Transposase auch in prokaryotischen Zellen induzierbar sein, z. B. um diese im Genom zu modifizieren.The host cell can thus also be the target cell, whereby the expression control of the recombinase must be ensured in eukaryotic cells. Conversely, the transposase may also be inducible in prokaryotic cells, e.g. B. to modify them in the genome.

Alternativ kann ein Minicircle auch durch herkömmliche Restriktions- und Ligationstechniken aus einem Parentalplasmid hergestellt werden. Hierbei wird der Bereich des Plasmids, der den Minicircle bilden soll, zum Beispiel mittels eines Restriktionsenzyms aus dem Plasmid herausgeschnitten und zu einem Minicircle ligiert. Der Minicircle kann auch aus mehreren getrennten Abschnitten zusammengesetzt werden. Zu beachten ist hierbei jedoch, dass ein so hergestellter Minicircle im Allgemeinen nicht superhelikal ist, sofern er nicht nachträglich in vitro superspiralisiert wird.Alternatively, a minicircle may also be prepared by conventional restriction and ligation techniques from a parent plasmid. Here, the region of the plasmid which is to form the minicircle, for example, cut out of the plasmid by means of a restriction enzyme and ligated to a minicircle. The mini-circle can also be composed of several separate sections. It should be noted, however, that a minicircle produced in this way is generally not superhelical unless it is subsequently supercoiled in vitro.

In einer Ausführungsform der Erfindung kann der Minicircle und/oder sein Parentalplasmid weiterhin mindestens eine Identifikationssequenz zur Aufreinigung des Minicircles, aber auch zu anderen Zwecken enthalten. Als Identifikationssequenz kann jede Sequenz dienen, die die Trennung der Minicircles von den Miniplasmiden ermöglicht. Insbesondere kann es sich dabei um Sequenzen handeln, die an einen spezifischen Liganden binden und so den Minicircle mit dem Liganden komplexieren können. Bei dem Liganden kann es sich um ein DNS-bindendes Protein oder um eine Nukleinsäure handeln. Die Aufreinigung kann anschließend z. B. über chromatographische Verfahren, insbesondere gegen die Identifikationssequenz gerichtete Affinitätschromatographie unter Verwendung des immobilisierten Liganden, vorgenommen werden. Geeignete Aufreinigungssysteme umfassen z. B. die Tripelhelix-Affinitätschromatographie (THAC; siehe P. Wils et al., Gene Therapy 1997, 4(4): 323–330 ), das lacO/lacI-System (siehe J. Lundeberg et al., Genet. Anal. Techn. Appl. 1990, 747–52 ), das repU/dso-System (siehe A. Müller et al., Nucleic Acids Research 1995, 23(11): 1894–1900 ) oder Systeme aus dem Repressor des Bakteriophagen λ oder des Bakteriophagen 434 und dem entsprechenden Promotor, für welchen der jeweilige Repressor spezifisch ist.In one embodiment of the invention, the minicircle and / or its parent plasmid may furthermore contain at least one identification sequence for purifying the minicircle, but also for other purposes. The identification sequence can be any sequence that allows the minicircles to be separated from the miniplasmids. In particular, these can be sequences which bind to a specific ligand and thus can complex the minicircle with the ligand. The ligand may be a DNA-binding protein or a nucleic acid. The purification can then z. B. on chromatographic methods, in particular directed against the identification sequence affinity chromatography using the immobilized ligand made. Suitable purification systems include, for. For example, triple helix affinity chromatography (THAC; P. Wils et al., Gene Therapy 1997, 4 (4): 323-330 ), the lacO / lacI system (see J. Lundeberg et al., Genet. Anal. Techn. Appl. 1990, 747-52 ), the repU / dso system (see A. Muller et al., Nucleic Acids Research 1995, 23 (11): 1894-1900 or systems from the repressor of bacteriophage λ or bacteriophage 434 and the corresponding promoter for which the particular repressor is specific.

Die Identifikationssequenz kann sich vor der Rekombination im Minicircle- oder im Miniplasmid-Bereich des Parentalplasmids befinden. Bevorzugt sind Ausführungsformen, in denen sich die Identifikationssequenz im Minicircle-Bereich des Parentalplasmids, oder in besonders bevorzugten Ausführungsformen in der Transpositionskassette befindet, d. h. zusammen mit der Nukleinsäure von Interesse zwischen den Transposase-Erkennungssequenzen. Findet in einem solchen Minicircle-Bereich eines Parentalplasmids (oder seinen Ursprungs- oder Vorläuferplasmiden) während des Herstellungsprozesses eine spontane und unbeabsichtigte Rekombination zwischen den Transposase-Erkennungssequenzen oder den Rekombinase-Erkennungssequenzen statt, entsteht ein defektes Produkt, in dem neben den Nukleinsäuresequenz von Interesse auch die Identifikationssequenz deletiert ist. Durch gegen die Identifikationssequenz gerichtete Affinitätsaufreinigung werden somit nur intakte Minicircles isoliert. Dadurch wird das Problem der Verunreinigung von Minicircle-Präparationen durch defekte Deletionsprodukte ohne Transpositionskassette vermieden.The identification sequence may be located in the minicircle or miniplasmid region of the parental plasmid prior to recombination. Embodiments in which the identification sequence is in the minicircle region of the parent plasmid, or in particularly preferred embodiments in the transposition cassette, are preferred. H. together with the nucleic acid of interest between the transposase recognition sequences. If spontaneous and unintentional recombination between the transposase recognition sequences or the recombinase recognition sequences takes place in such a minicircle region of a parent plasmid (or its parent or precursor plasmids) during the production process, a defective product is formed, in which besides the nucleic acid sequence of interest as well the identification sequence is deleted. By directed against the identification sequence affinity purification thus only intact minicircles are isolated. This avoids the problem of contamination of minicircle preparations by defective deletion products without a transposition cassette.

Ein Minicircle kann auch mehr als eine Identifikationssequenz enthalten. Hierbei können die Identifikationssequenzen identisch sein und als direkte Wiederholungen oder durch einen Spacer getrennte Wiederholungen vorliegen. Es können aber auch zwei oder mehr verschiedene Identifikationssequenzen zu unterschiedlichen Zwecken verwendet werden. Beispielsweise kann eine Sequenz, die mit einem Oligonukleotid-Liganden eine Tripelhelix ausbilden kann, außerhalb der Transpositionskassette vorliegen, um die Minicircles vor der Transfektion aufzureinigen, und zugleich eine lacOs-Sequenz innerhalb der Transpositionskassette enthalten sein, um nach der Transfektion die Transposition ins Genom nachzuweisen oder ihre Effizienz zu messen.A minicircle may also contain more than one identification sequence. In this case, the identification sequences can be identical and can be present as direct repeats or repeats separated by a spacer. But it can also two or more different identification sequences are used for different purposes. For example, a sequence capable of forming a triple helix with an oligonucleotide ligand may be present outside the transposition cassette to purify the minicircles prior to transfection, and at the same time contain a lacOs sequence within the transposition cassette to detect transposition into the genome after transfection or to measure their efficiency.

Veranschaulicht am Parentalplasmid aus 7 ist der Bereich innerhalb der rec-Sequenzen, in dem auch die Nukleinsäure von Interesse (NOI) liegt, geeignet, um eine oder mehrere Identifikatonssequenzen aufzunehmen, mit denen ein Minicircle identifiziert und vom bei der Herstellung entstehenden Miniplasmid getrennt werden soll. Der Bereich zwischen den IR/DR-Sequenzen, in der die NOI liegt, ist geeignet, um eine oder mehrere Identifikationssequenzen aufzunehmen, mit denen ein transponiertes genetisches Element identifiziert und gegebenenfalls aus dem Genom reisoliert werden soll. Der Miniplasmid-Bereich außerhalb der rec-Sequenzen ist geeignet, um eine oder mehrere Identifikatonssequenzen aufzunehmen, mit denen ein Miniplasmid identifiziert und vom bei der Herstellung entstehenden Minicircle getrennt werden soll.Illustrated at the Parental Plasmid 7 For example, the region within the rec sequences in which the nucleic acid of interest (NOI) is located is capable of accepting one or more identifying sequences for identifying a minicircle and separating it from the miniplasmid resulting from its production. The region between the IR / DR sequences in which the NOI is located is suitable for receiving one or more identification sequences with which a transposed genetic element is to be identified and optionally reisolated from the genome. The miniplasmic region outside the rec sequences is suitable for containing one or more identification sequences for identifying a miniplasmide and separating it from the minicircle resulting from the preparation.

ZELLENCELLS

Unter einem anderen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung auch eine Zelle, die einen Minicircle gemäß der Erfindung enthält. Hierbei kann es sich um eine Zelle aus einer beliebigen Spezies handeln. Insbesondere sind prokaryotische und eukaryotische Zellen, die Minicircles gemäß der Erfindung enthalten, von der Erfindung umfasst. In manchen Ausführungsformen ist die Zelle eine Wirbeltierzelle, bevorzugt eine menschliche Zelle. In manchen Ausführungsformen ist die Zelle eine Stammzelle, bevorzugt eine embryonale Stammzelle oder induzierbare pluripotente Zelle.In another aspect, the invention also relates to a cell containing a minicircle according to the invention. This can be a cell from any species. In particular, prokaryotic and eukaryotic cells containing minicircles according to the invention are encompassed by the invention. In some embodiments, the cell is a vertebrate cell, preferably a human cell. In some embodiments, the cell is a stem cell, preferably an embryonic stem cell or inducible pluripotent cell.

Zellen, die einen Minicircle gemäß der Erfindung enthalten, können durch herkömmliche Transfektionsverfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Verwendet werden kann beispielsweise die chemische Transfektion mittels Calciumphosphat (siehe F. L. Graham et al., Virology 1973, 52(2): 456–467 ), mittels Dendrimeren (seihe H. L. Fu et al., Journal of Control Release 2007, 124(3): 181–188 ) oder mittels kationischen Polymeren (siehe EP 1505089 ). Weitere Methoden sind Lipofektion (siehe P. L. Felgner et al., P. N. A. S. 1987, 84(21): 7413–7417 ), Elektroporation (siehe E. Neumann et al., EMBO J. 1982, 1(7): 841–845 ), optische Transfektion (siehe M. Tsukakoshi et al., Applied Physics B-Photophysics and Laser Chemistry 1984, 35(3): 135–140 ), Magnetofektion (siehe F. Scherer et al., Gene Ther. 2009, 9(2): 102–109 ) oder Impalefektion (siehe T. E. McKnight et al., Nano Letters 2004, 4(7): 1213–1219 ). Auch können partikelbasierte Verfahren wie die Genkanone angewendet werden (siehe US 5,219,746 ). Bevorzugte Verfahren sind die Calciumphosphat-Transfektion, die Lipofektion und die Elektroporation.Cells containing a minicircle according to the invention may be prepared by conventional transfection methods known to those skilled in the art. For example, chemical transfection using calcium phosphate can be used (see Graham, FL, et al., Virology 1973, 52 (2): 456-467 ), by means of dendrimers (see HL Fu et al., Journal of Control Release 2007, 124 (3): 181-188 ) or by cationic polymers (see EP 1505089 ). Other methods include lipofection (see PL Felgner et al., PNAS 1987, 84 (21): 7413-7417 ), Electroporation (see E. Neumann et al., EMBO J. 1982, 1 (7): 841-845 ), optical transfection (see Tsukakoshi, Ts., Applied Physics B-Photophysics and Laser Chemistry 1984, 35 (3): 135-140 ), Magnetofection (see F. Scherer et al., Gene Ther. 2009, 9 (2): 102-109 ) or impalfection (see TE McKnight et al., Nano Letters 2004, 4 (7): 1213-1219 ). Also, particle-based methods such as the gene gun can be used (see US 5,219,746 ). Preferred methods are calcium phosphate transfection, lipofection and electroporation.

Des Weiteren kann ein Minicircle gemäß der Erfindung direkt in der Zielzelle hergestellt werden, wie schon vorstehend erwähnt. Hierbei wird die Zielzelle zunächst mit einem Parentalplasmid des Minicircles transfiziert und anschließend die Expression der entsprechenden Rekombinase in der Zielzelle veranlasst, so dass die Prozessierung des Parentalplasmids mittels Rekombination zu Minicircle und Miniplasmid ermöglicht wird. Hierfür muss die Expressionssteuerung der Rekombinase in eukaryotischen Zellen gewährleistet sein, und ein für die Rekombinase kodierendes Gen muss in der Zielzelle vorliegen. Das Rekombinase-Gen kann sowohl in die genomische DNS der Zielzelle integriert sein oder auch auf einem anderen Nukleinsäuremolekül vorliegen. Besonders vorteilhaft ist es, wenn das Rekombinase-Gen auf dem Parentalplasmid innerhalb der Miniplasmid-Region vorliegt.Furthermore, a minicircle according to the invention can be prepared directly in the target cell, as already mentioned above. In this case, the target cell is first transfected with a parent plasmid of the minicircle and then causes the expression of the corresponding recombinase in the target cell, so that the processing of Parentalplasmids is made possible by recombination to minicircle and miniplasmide. For this, the expression control of the recombinase must be ensured in eukaryotic cells, and a gene coding for the recombinase must be present in the target cell. The recombinase gene can be integrated into the genomic DNA of the target cell or else present on another nucleic acid molecule. It is particularly advantageous if the recombinase gene is present on the parent plasmid within the miniplasmid region.

VERFAHREN ZUR INSERTIONSMUTAGENESE ODER TRANSFORMATIONMETHOD FOR INSERTION MUTAGENIC OR TRANSFORMATION

Unter einem weiteren Gesichtspunkt umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Insertionsmutagenese oder zur genetischen Transformation einer eukaryotischen Zielzelle. Die Zielzelle kann eine beliebige eukaryotische Zelle sein, ist aber vorzugsweise eine Wirbeltierzelle. Besonders bevorzugt sind menschliche Zellen, einschließlich beispielsweise embryonaler Stammzellen oder induzierbarer pluripotenter Zellen.In a further aspect, the invention includes a method for insertion mutagenesis or for genetic transformation of a eukaryotic target cell. The target cell may be any eukaryotic cell, but is preferably a vertebrate cell. Particularly preferred are human cells including, for example, embryonic stem cells or inducible pluripotent cells.

Im Rahmen dieses Verfahrens wird ein Minicircle gemäß der Erfindung in der Zielzelle bereitgestellt und die Zielzelle mit einem Vektor transfiziert, der ein Gen für eine entsprechende, für die Transposase-Erkennungssequenzen des Minicircles spezifische Transposase enthält. Insbesondere kann die Transposase eine SB-Transposase oder eine Piggy-Bac-Transposase sein. Besonders bevorzugt sind Vektoren, die für die Transposasen SB10 oder SB100X kodieren.In the process, a minicircle according to the invention is provided in the target cell and the target cell is transfected with a vector containing a gene for a corresponding transposase specific for the minicircle transposase recognition sequences. In particular, the transposase may be an SB transposase or a piggy-bac transposase. Especially preferred are vectors which code for the transposases SB10 or SB100X.

Wie bereits vorstehend beschrieben, umfasst das Bereitstellen des Minicircles in der Zielzelle vorzugsweise die Transfektion der Zielzelle mit dem Minicircle. Hierzu geeignete Transfektionsverfahren sind dem Fachmann bekannt, wie ebenfalls vorstehend beschrieben. Besonders bevorzugte Verfahren sind die Calciumphosphat-Transfektion, die Lipofektion und die Elektroporation. Alternativ zur Transfektion mit dem Minicircle kann der Minicircle jedoch auch direkt in der Zielzelle hergestellt werden.As described above, providing the minicircle in the target cell preferably involves transfecting the target cell with the minicircle. Transfection methods suitable for this purpose are known to the person skilled in the art, as also described above. Particularly preferred methods are calcium phosphate transfection, lipofection and electroporation. Alternative to However, transfection with the minicircle can also produce the minicircle directly in the target cell.

Bei dem Vektor, der das entsprechende Transposase-Gen enthält (Transposase-Vektor), kann es sich um einen beliebigen Typ Vektor aus dem Stand der Technik handeln, der zur Transfektion von eukaryotischen Zielzellen geeignet ist. Insbesondere kann der Vektor ein Plasmid, ein Miniplasmid, ein Cosmid, ein Minicircle, ein einzel-, doppel- oder mehrsträngiges lineares DNS-Molekül, eine RNS, ein Protein, ein vitaler Vektor oder ein zelluläres Zwischenprodukt der viralen Vermehrung, ein virus-like-particle (VLP) oder ein Mikroorganismus sein. Besonders bevorzugt im Sinne der Erfindung ist ein Minicircle, da hierbei der wichtige Vorteil gewahrt bleibt, kein unnötiges fremdes Material in die Zielzelle einzubringen, das beispielsweise zu unerwünschten immunogenen Nebenwirkungen führen könnte. Entscheidend ist, dass die Expressionssteuerung der Transposase in eukaryotischen Zellen gewährleistet ist. Vorzugsweise ist die Expression der Transposase in der Zielzelle induzierbar, beispielsweise über eine Temperaturänderung oder die Zugabe eines Metaboliten.The vector containing the corresponding transposase gene (transposase vector) may be any type of vector of the art suitable for transfecting eukaryotic target cells. In particular, the vector may be a plasmid, a miniplasmid, a cosmid, a minicircle, a single, double or multiple stranded linear DNA molecule, an RNA, a protein, a vital vector or a cellular viral propagule intermediate, a virus-like particle (VLP) or a microorganism. Particularly preferred in the context of the invention is a minicircle, since this preserves the important advantage of not introducing any unnecessary foreign material into the target cell, which could, for example, lead to undesired immunogenic side effects. It is crucial that the expression control of the transposase is ensured in eukaryotic cells. Preferably, the expression of the transposase in the target cell is inducible, for example via a temperature change or the addition of a metabolite.

Die Transfektion der Zielzelle mit dem Transposase-Vektor kann vor, zugleich mit oder nach der Bereitstellung des Minicircles in der Zielzelle erfolgen. Beispielsweise können der Transposase-Vektor und der Minicircle in einer Kotransfektion zugleich in die Zielzelle eingebracht werden. Wird der Minicircle innerhalb der Zielzelle aus dem Parentalplasmid erzeugt, kann die Transfektion mit dem Transposase-Vektor vor, zugleich mit oder nach des Transfektion mit dem Parentalplasmid erfolgen. Eine Ausführungsform des Verfahrens ist schematisch in 5 dargestellt.The transfection of the target cell with the transposase vector can occur before, simultaneously with or after the provision of the minicircle in the target cell. For example, the transposase vector and the minicircle can be introduced simultaneously into the target cell in a cotransfection. If the minicircle is generated within the target cell from the parental plasmid, the transfection with the transposase vector can take place before, at the same time as or after the transfection with the parent plasmid. An embodiment of the method is shown schematically in FIG 5 shown.

Nachdem sowohl der Minicircle als auch der Transposase-Vektor in der Zielzelle bereitgestellt wurden, wird die Expression des Transposase-Gens in der Zielzelle eingeleitet. Dies führt zur Rekombination der Transposase-Erkennungssequenzen und zur Integration der Nukleinsäuresequenz von Interesse im Genom der Zielzelle.After both the minicircle and the transposase vector have been provided in the target cell, expression of the transposase gene is initiated in the target cell. This results in recombination of the transposase recognition sequences and integration of the nucleic acid sequence of interest in the genome of the target cell.

KITSKITS

Des Weiteren umfasst die Erfindung unter einem weiteren Gesichtspunkt auch Kits zur Insertionsmutagenese oder zur genetischen Transformation einer eukaryotischen Zielzelle. Ein Kit umfasst hierbei einen Minicircle gemäß der Erfindung und einen entsprechenden Transposase-Vektor, der für eine für die Transposase-Erkennungssequenzen auf dem Minicircle spezifische Transposase kodiert. In einer besonderen Ausführungsform stammen die Transposase-Erkennungssequenzen im Minicircle aus dem SB-Transposon, während der Transposase-Vektor für eine SB-Transposase, z. B. SB10 oder SB100X, kodiert. In einer weiteren Ausführungsform kann die Transposase auf einem Minicircle kodiert sein bzw. beide – die Transposase und die Transpositionskassette – jeweils auf unterschiedlichen Minicirclemolekülen oder demselben Minicirclemolekül liegen.Furthermore, in a further aspect, the invention also includes kits for insertion mutagenesis or for genetic transformation of a eukaryotic target cell. A kit hereby comprises a minicircle according to the invention and a corresponding transposase vector which codes for a transposase specific for the transposase recognition sequences on the minicircle. In a particular embodiment, the transposase recognition sequences in the minicircle are from the SB transposon, while the transposase vector is derived from an SB transposase, e.g. B. SB10 or SB100X, encoded. In a further embodiment, the transposase can be coded on a minicircle or both - the transposase and the transposition cassette - each lie on different minicirclem molecules or the same minicirclemolecule.

Der Minicircle und/oder der Transposase-Vektor können in dem Kit trocken, z. B. lyophilisiert, vorliegen. Alternativ können sie auch in einem Puffer gelöst und die Lösung flüssig oder gefroren sein. Des Weiteren können sie gemischt oder voneinander getrennt in verschiedenen Behältern vorhanden sein. Zusätzlich zum Minicircle und dem Transposase-Vektor kann der Kit auch weitere Bestandteile enthalten, die zur Ausführung eines Verfahrens gemäß der Erfindung nützlich sind, wie etwa Chemikalien, Reagenzien, Puffer, Lösungsmittel oder Medien für die Ausführung der Verfahren der Erfindung. Insbesondere kann der Kit Reagenzien enthalten, die für eine chemische Transfektion oder eine Lipofektion notwendig sind. Manche oder alle der Reagenzien können in abgemessenen Einheitsmengen vorliegen, z. B. um den Pipettieraufwand des Nutzers auf ein Mindestmaß zu beschränken.The minicircle and / or the transposase vector can be stored dry in the kit, e.g. B. lyophilized, are present. Alternatively, they may be dissolved in a buffer and the solution may be liquid or frozen. Furthermore, they may be mixed or separate from one another in different containers. In addition to the minicircle and the transposase vector, the kit may also contain other ingredients useful for carrying out a method according to the invention, such as chemicals, reagents, buffers, solvents or media for carrying out the methods of the invention. In particular, the kit may contain reagents necessary for chemical transfection or lipofection. Some or all of the reagents may be in measured unit amounts, e.g. B. to minimize the pipetting effort of the user to a minimum.

Zusätzlich kann der Kit auch Beschreibungen des Minicircles und/oder des Transposase-Vektors, wie etwa Vektorkarten oder Sequenzen enthalten. Ebenso können Anweisungen zur Durchführung der betreffenden Ausführungsform der Erfindung Bestandteil des Kits sein.In addition, the kit may also contain descriptions of the minicircle and / or transposase vector, such as vector maps or sequences. Likewise, instructions for carrying out the relevant embodiment of the invention may be part of the kit.

BeispieleExamples

BEISPIEL 1:EXAMPLE 1:

Konstruktion eines Parentalplasmids (GFP-Parentalplamid) für Minicircles umfassend eine Transpositionskassette für GFPConstruction of a parental plasmid (GFP-parentalplamide) for minicircles comprising a transposition cassette for GFP

Das Plasmid pCMV-GFP (3487 bp, Artikel-Nr. PF463, PlasmidFactory, Bielefeld, DE), das eine Expressionskassette für Grün fluoreszierendes Protein (GFP) enthält, wird als Ausgangsmaterial zur gezielten Amplifikation der darauf enthalten GFP-Expressionskassette verwendet. Die beiden Primer (Forward: 5'-CGCCGAATTCGCCGGTTAATTAAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATG-3', s. auch 1E; und Reverse: 5'-GCGCGAATTCCGGCGTTAATTAACCCCTGAACCTGAACATAAAATGAATGCAATTGTTG-3' s. auch 1F) erzeugen durch PCR ein EcoRI-Fragment, das die genannte Expressionskassette umfasst. Das Fragment wird mittels Agarosegelelektrophorese und eines NucleoSpin® Extract II Gel-Extraktions-Kits (Macherey-Nagel, Düren, DE) aufgereinigt.The plasmid pCMV-GFP (3487 bp, Item No. PF463, Plasmid Factory, Bielefeld, DE) containing a Green Fluorescent Protein (GFP) expression cassette is used as a starting material for targeted amplification of the GFP expression cassette contained thereon. The two primers (Forward: 5'-CGCCGAATTCGCCGGTTAATTAAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATG-3 ', see also 1E ; and reverse: 5'-GCGCGAATTCCGGCGTTAATTAACCCCTGAACCTGAACATAAAATGAATGCAATTGTTG-3's. also 1F ) generate by PCR an EcoRI fragment comprising said expression cassette. The fragment is purified by agarose gel electrophoresis and a NucleoSpin Extract II ® Gel Extraction Kit (Macherey-Nagel, Düren, DE).

Das Plasmid pT2/BH (Addgene Zugangsmummer 26556; siehe 4) enthält das linke IR/DR-Element Lmut44 (s. auch 6A; SEQ ID NO: 7) und das rechte IR/DR-Element Rmut13delta13 (s. auch 6B; SEQ ID NO: 8). Dazwischen befindet sich eine multiple Klonierungsstelle (MCS), in die die amplifzierte Expressionskassette hineinkloniert werden kann. Dieses Plasmid wird mit dem Enzym EcoRI (Artikel Nr. R0101L, NEB, Frankfurt, DE) in der MCS geschnitten und mit Alkalischer Phosphatase (Artikel Nr. M0290L, NEB, Frankfurt, DE) dephosphoryliert. Anschließend wird das EcoRI-Fragment mit der GFP-Expressionskassette mit T4-Ligase (Artikel Nr. M0202L, NEB, Frankfurt, DE) in den linearisierten Vektor ligiert, um das Plasmid pT2-IR-GFP zu erhalten.The plasmid pT2 / BH (Addgene accession number 26556, see 4 ) contains the left IR / DR element Lmut44 (see also 6A ; SEQ ID NO: 7) and the right IR / DR element Rmut13delta13 (see also 6B ; SEQ ID NO: 8). In between is a multiple cloning site (MCS) into which the amplified expression cassette can be cloned. This plasmid is cut with the enzyme EcoRI (Article No. R0101L, NEB, Frankfurt, DE) in the MCS and dephosphorylated with alkaline phosphatase (Article No. M0290L, NEB, Frankfurt, DE). Subsequently, the EcoRI fragment is ligated with the GFP expression cassette with T4 ligase (Item No. M0202L, NEB, Frankfurt, DE) into the linearized vector to obtain the plasmid pT2-IR-GFP.

Nach Vermehrung und Herstellung des Plasmids wird die Transpositionskassette, die die IR/DR-Elemente und zwischen ihnen die Expressionskassette umfasst, mit BamHI (Artikel Nr. R0136L, NEB, Frankfurt, DE) aus dem Plasmid ausgeschnitten. Die überhängenden Einzelstrangenden werden mit Klenow-Polymerase (DNA-Polymerase I, Artikel Nr. M0210L, NEB, Frankfurt, DE) aufgefüllt und das Fragment wie oben beschrieben aufgereinigt.After amplification and preparation of the plasmid, the transposition cassette comprising the IR / DR elements and between them the expression cassette is excised from the plasmid with BamHI (Article No. R0136L, NEB, Frankfurt, DE). The overhanging single stranded ends are filled in with Klenow polymerase (DNA polymerase I, article no. M0210L, NEB, Frankfurt, DE) and the fragment is purified as described above.

Das Vorläuferplasmid, das zur Aufnahme der Transpositionskassette dient (siehe P. Mayrhofer et al., J. Gene Med. 2008, 10(11): 1253–1269 ), enthält eine MCS, die von Rekombinase-Erkennungssequenzen der parA-Resolvase flankiert ist, zwei Identifikationssequenzen und eine Expressionskassette der parA-Resolvase außerhalb der Rekombinase-Erkennungssequenzen. Dieses Plasmid wird mit dem Enzym EcoRV (Artikel Nr. R0195L, NEB, Frankfurt, DE) in der MCS geschnitten und mit Alkalischer Phosphatase (Artikel Nr. M0290L, NEB, Frankfurt, DE) dephosphoryliert. Anschließend wird die Transpositionskassette mit T4-Ligase in den linearisierten Vektor ligiert, um das GFP-Parentalplasmid pP-IR-GFP (3a; Klonierungschritte in 5, rechts) zu erhalten.The precursor plasmid used to accommodate the transposition cassette (see P. Mayrhofer et al., J. Gene Med. 2008, 10 (11): 1253-1269 ), an MCS flanked by parA resolvase recombinase recognition sequences contains two identification sequences and a parA resolvase expression cassette outside of the recombinase recognition sequences. This plasmid is cut with the enzyme EcoRV (Article No. R0195L, NEB, Frankfurt, DE) in the MCS and dephosphorylated with alkaline phosphatase (Article No. M0290L, NEB, Frankfurt, DE). Subsequently, the transposition cassette with T4 ligase is ligated into the linearized vector to give the GFP parental plasmid pP-IR-GFP ( 3a ; Cloning steps in 5 , right).

BEISPIEL 2:EXAMPLE 2

Konstruktion eines weiteren Parentalplasmids (GFP-Parentalplamid) für Minicircles umfassend eine Transpositionskassette für GFPConstruction of another parental plasmid (GFP parental plasmid) for minicircles comprising a transposition cassette for GFP

Das Plasmid pCMV-GFP (3487 bp, Artikel-Nr. PF463, PlasmidFactory, Bielefeld, DE), das eine Expressionskassette für Grün fluoreszierendes Protein (GFP) enthält, wird als Ausgangsmaterial zur gezielten Amplifikation der darauf enthalten GFP-Expressionskassette verwendet. Die beiden Primer (Forward: 5'-CGCCGAATTCGCCGGTTAATTAAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATG-3', s. auch 1E; und Reverse: 5'-GCGCGAATTCCGGCGTTAATTAACCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTG-3' s. auch 1F) erzeugen durch PCR ein EcoRI-Fragment, das die genannte Expressionskassette umfasst. Das Fragment wird mittels Agarosegelelektrophorese und eines NucleoSpin® Extract II Gel-Extraktions-Kits (Macherey-Nagel, Düren, DE) aufgereinigt.The plasmid pCMV-GFP (3487 bp, Item No. PF463, Plasmid Factory, Bielefeld, DE) containing a Green Fluorescent Protein (GFP) expression cassette is used as a starting material for targeted amplification of the GFP expression cassette contained thereon. The two primers (Forward: 5'-CGCCGAATTCGCCGGTTAATTAAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATG-3 ', see also 1E ; and reverse: 5'-GCGCGAATTCCGGCGTTAATTAACCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTG-3's. also 1F ) generate by PCR an EcoRI fragment comprising said expression cassette. The fragment is purified by agarose gel electrophoresis and a NucleoSpin Extract II ® Gel Extraction Kit (Macherey-Nagel, Düren, DE).

Das Plasmid pT2/BH (Addgene Zugangsmummer 26556; siehe 4) enthält das linke IR/DR-Element Lmut44 (s. auch 6A; SEQ ID NO: 7) und das rechte IR/DR-Element Rmut13delta13 (s. auch 6B; SEQ ID NO: 8). Dazwischen befindet sich eine multiple Klonierungsstelle (MCS), in die die amplifizierte Expressionskassette hineinkloniert werden kann. Dieses Plasmid wird mit dem Enzym EcoRI (Artikel Nr. R0101L, NEB, Frankfurt, DE) in der MCS geschnitten und mit Alkalischer Phosphatase (Artikel Nr. M0290L, NEB, Frankfurt, DE) dephosphoryliert. Anschließend wird das EcoRI-Fragment mit der GFP-Expressionskassette mit T4-Ligase (Artikel Nr. M0202L, NEB, Frankfurt, DE) in den linearisierten Vektor ligiert, um das Plasmid pT2-IR-GFP zu erhalten.The plasmid pT2 / BH (Addgene accession number 26556, see 4 ) contains the left IR / DR element Lmut44 (see also 6A ; SEQ ID NO: 7) and the right IR / DR element Rmut13delta13 (see also 6B ; SEQ ID NO: 8). In between is a multiple cloning site (MCS) into which the amplified expression cassette can be cloned. This plasmid is cut with the enzyme EcoRI (Article No. R0101L, NEB, Frankfurt, DE) in the MCS and dephosphorylated with alkaline phosphatase (Article No. M0290L, NEB, Frankfurt, DE). Subsequently, the EcoRI fragment is ligated with the GFP expression cassette with T4 ligase (Item No. M0202L, NEB, Frankfurt, DE) into the linearized vector to obtain the plasmid pT2-IR-GFP.

Nach Vermehrung und Herstellung des Plasmids wird die Transpositionskassette, die die IR/DR-Elemente und zwischen ihnen die Expressionskassette umfasst, mit BamHI (Artikel Nr. R0136L, NEB, Frankfurt, DE) aus dem Plasmid ausgeschnitten. Die überhängenden Einzelstrangenden werden mit Klenow-Polymerase (DNA-Polymerase I, Artikel Nr. M0210L, NEB, Frankfurt, DE) aufgefüllt und das Fragment wie oben beschrieben aufgereinigt.After amplification and preparation of the plasmid, the transposition cassette comprising the IR / DR elements and between them the expression cassette is excised from the plasmid with BamHI (Article No. R0136L, NEB, Frankfurt, DE). The overhanging single stranded ends are filled in with Klenow polymerase (DNA polymerase I, article no. M0210L, NEB, Frankfurt, DE) and the fragment is purified as described above.

Das Vorläuferplasmid pP11, das zur Aufnahme der Transpositionskassette dient (siehe P. Mayrhofer et al., J. Gene Med. 2008, 10(11): 1253–1269 , nun jedoch ohne MCS, ohne Spacer und mit einer statt zwei Identifikationssequenzen) enthält eine MCS, die von Rekombinase-Erkennungssequenzen der parA-Resolvase flankiert ist, und eine Expressionskassette der parA-Resolvase außerhalb der Rekombinase-Erkennungssequenzen. Dieses Plasmid wird mit dem Enzym PmeI (Artikel Nr. R0560L, NEB, Frankfurt, DE) in der MCS geschnitten und mit Alkalischer Phosphatase (Artikel Nr. M0290L, NEB, Frankfurt, DE) dephosphoryliert. Anschließend wird die Transpositionskassette mit T4-Ligase in den linearisierten Vektor ligiert, um das GFP-Parentalplasmid pP11-IR-GFP (3b) zu erhalten.The precursor plasmid pP11, which serves to accommodate the transposition cassette (see P. Mayrhofer et al., J. Gene Med. 2008, 10 (11): 1253-1269 but now without MCS, without spacer and with one instead of two identification sequences) contains an MCS flanked by parA resolvase recombinase recognition sequences and a parA resolvase expression cassette outside of the recombinase recognition sequences. This plasmid is cut with the enzyme PmeI (Article No. R0560L, NEB, Frankfurt, DE) in the MCS and dephosphorylated with alkaline phosphatase (Article No. M0290L, NEB, Frankfurt, DE). Subsequently, the transposition cassette with T4 ligase is ligated into the linearized vector to give the GFP parental plasmid pP11-IR-GFP ( 3b ) to obtain.

BEISPIEL 3:EXAMPLE 3

Konstruktion eines Parentalplasmids (SB10-Parentalplasmid) für Minicircles umfassend eine SB10-ExpressionskassetteConstruction of a parental plasmid (SB10 parental plasmid) for minicircles comprising an SB10 expression cassette

Das Plasmid pSB10 (4732 bp, Addgene Zugangsnummer 24551), das für die Dornröschen-Transposase SB10 kodiert, wird mit den Restriktionsenzymen SalI (Artikel Nr. R0138L, NEB, Frankfurt, DE) und EcoRI (Artikel Nr. R0101L, NEB, Frankfurt, DE) verdaut, wobei ein Fragment entsteht, das die Expressionskassette umfasst. Die überhängenden Einzelstrangenden werden mit Klenow-Polymerase (DNA-Polymerase I, Artikel Nr. M0210L, NEB, Frankfurt, DE) aufgefüllt und das Fragment wie oben beschrieben aufgereinigt.The plasmid pSB10 (4732 bp, Addgene accession number 24551) which codes for the Sleeping Beauty Transposase SB10 is cloned with the restriction enzymes SalI (Article No. R0138L, NEB, Frankfurt, DE) and EcoRI (Article No. R0101L, NEB, Frankfurt, DE), resulting in a fragment comprising the expression cassette. The overhanging single stranded ends are filled in with Klenow polymerase (DNA polymerase I, article no. M0210L, NEB, Frankfurt, DE) and the fragment is purified as described above.

Das Vorläuferplasmid aus Beispiel 1 (siehe P. Mayrhofer et al., J. Gene Med. 2008, 10(11): 1253–1269 ) enthält eine MCS, die von Rekombinase-Erkennungssequenzen der parA-Resolvase flankiert ist, zwei Identifikationssequenzen und eine Expressionskassette der parA-Resolvase außerhalb der Erkennungssequenzen. Dieses Plasmid wird mit dem Enzym EcoRV (Artikel Nr. R0195L, NEB, Frankfurt, DE) in der MCS geschnitten und mit Alkalischer Phosphatase (Artikel Nr. M0290L, NEB, Frankfurt, DE) dephosphoryliert. Anschließend wird die Transpositionskassette mit T4-Ligase in den linearisierten Vektor ligiert, um das SB10-Parentalplasmid pP-SB10 (Klonierungschritte in 5, links) zu erhalten.The precursor plasmid of Example 1 (see P. Mayrhofer et al., J. Gene Med. 2008, 10 (11): 1253-1269 ) contains an MCS flanked by parA resolvase recombinase recognition sequences, two identification sequences, and a parA resolvase expression cassette outside of the recognition sequences. This plasmid is cut with the enzyme EcoRV (Article No. R0195L, NEB, Frankfurt, DE) in the MCS and dephosphorylated with alkaline phosphatase (Article No. M0290L, NEB, Frankfurt, DE). Subsequently, the transposition cassette is ligated with T4 ligase into the linearized vector to generate the SB10 parental plasmid pP-SB10 (cloning steps in FIG 5 , left).

Statt des Vorläuferplasmids aus Beispiel 1 ( P. Mayrhofer et al., J. Gene Med. 2008, 10(11): 1253–1269 ) kann auch pP11 aus Beispiel 2 verwendet werden, um die SB10-Transpositionskassette aufzunehmen. Dieses Plasmid wird dafür mit dem Enzym PmeI (Artikel Nr. R0560L, NEB, Frankfurt, DE) in der MCS geschnitten und mit Alkalischer Phosphatase (Artikel Nr. M0290L, NEB, Frankfurt, DE) dephosphoryliert. Anschließend wird die Transpositionskassette mit T4-Ligase in den linearisierten Vektor ligiert, um das SB10-Parentalplasmid pP11-SB10 zu erhalten.Instead of the precursor plasmid from Example 1 ( P. Mayrhofer et al., J. Gene Med. 2008, 10 (11): 1253-1269 ), pP11 of Example 2 can also be used to accommodate the SB10 transposition cassette. For this purpose, this plasmid is cut with the enzyme PmeI (Article No. R0560L, NEB, Frankfurt, DE) in the MCS and dephosphorylated with alkaline phosphatase (Article No. M0290L, NEB, Frankfurt, DE). Subsequently, the transposition cassette is ligated with T4 ligase into the linearized vector to obtain the SB10 parental plasmid pP11-SB10.

Statt des Plasmids pSB10 kann in diesem Verfahren ebenso das Plasmid pSB100X ( L. Mátés et al., Nat. Genet. 2009, 41: 753–761 ) verwendet werden, das für die Dornröschen-Transposase SB100X kodiert. Dabei wird das SB100X-Parentalplasmid als pP-SB100X (2 tag) erhalten.Instead of the plasmid pSB10, the plasmid pSB100X ( L. Mátés et al., Nat. Genet. 2009, 41: 753-761 ) encoding the Sleeping Beauty Transposase SB100X. The SB100X parental plasmid is obtained as pP-SB100X (2 days).

BEISPIEL 4:EXAMPLE 4

Herstellung von Minicircles aus GFP- bzw. SB10-ParentalplasmidenProduction of minicircles from GFP or SB10 parental plasmids

Die Kultivierung wird bei 37°C in einem MBR-Bioreaktor (MBR BIO REACTOR, Schweiz) mit einem Gesamtvolumen von 7 1 bei einer Füllmenge von 51 durchgeführt. Die Anpassung des pHs auf pH 7 wird mit 2 M Natriumhydroxidlösung und 2 M Phosphorsäure durchgeführt. Die Flussrate der Luft wird auf 5 l/min eingestellt. Die Sauerstoffkonzentration (60%) wird durch die Variierung der Rührergeschwindigkeit im Bereich von 500 bis 2000 pro Minute kontrolliert. Es wird LB-Medium ohne Zugabe von Antibiotika verwendet. Das Verfahren wird sowohl mit pP-IR-GFP- als auch p2-SB10-Parentalplasmiden durchgeführt.The cultivation is carried out at 37 ° C in a MBR bioreactor (MBR BIO REACTOR, Switzerland) with a total volume of 7 1 at a capacity of 51. The adjustment of the pH to pH 7 is carried out with 2 M sodium hydroxide solution and 2 M phosphoric acid. The flow rate of the air is set to 5 l / min. The oxygen concentration (60%) is controlled by varying the stirrer speed in the range of 500 to 2000 per minute. LB medium is used without the addition of antibiotics. The procedure is carried out with both pP-IR-GFP and p2-SB10 parental plasmids.

Der Bioreaktor wird mit 50 ml einer Vorkultur von E. coli K12, die mit Parentalplasmid transformiert und für etwa 15 h bei 28°C kultiviert wurden, angeimpft. Die Vorkulturen werden unter selektiven Bedingungen unter Zugabe von 75 mg/ml Kanamycin kultiviert. Das LB-Medium der Vorkulturen wird mit Glucose angereichert, um eine vorzeitige Expression der parA-Resolvase, die unter der Kontrolle des PBAD-Promotors steht, zu verhindern.The bioreactor is inoculated with 50 ml of a preculture of E. coli K12 transformed with parental plasmid and cultured for approximately 15 hours at 28 ° C. The precultures are cultured under selective conditions with the addition of 75 mg / ml kanamycin. The LB medium of the precultures is enriched with glucose to prevent premature expression of the parA resolvase, which is under the control of the P BAD promoter.

Die Expression der parA-Resolvase wird bei einer OD600 zwischen 3,5 und 5,0 durch die Zugabe von L-Arabinose zum Medium induziert. Nach einer Stunde weiteren Wachstums werden die Zellen mittels Zentrifugation für 6 min bei 9039 g geerntet, in Lagerbeutel überführt, eingefroren und bei –20°C gelagert, bevor die Rekombinationsprodukte aufgereinigt werden.The expression of the parA resolvase is induced at an OD 600 between 3.5 and 5.0 by the addition of L-arabinose to the medium. After one hour of further growth, the cells are harvested by centrifugation for 6 min at 9039 g, transferred to storage bags, frozen and stored at -20 ° C before the recombination products are purified.

Während der Kultivierung im Bioreaktor werden mit einem automatischen Probensammler Proben entnommen und bei 4°C zur weiteren Analyse gelagert. Die OD600 wird gemessen und die Plasmide werden aufgereinigt (NucleoBond® PC 100, Macherey-Nagel, Düren), um die Plasmidausbeute und die Rekombinationseffizienz zu bestimmen.During cultivation in the bioreactor, samples are taken with an automatic sampler and stored at 4 ° C for further analysis. The OD 600 is measured and the plasmids are to determine purified (NucleoBond ® PC 100, Macherey-Nagel, Duren) plasmid yield and the recombination efficiency.

Aus der erhaltenen Biomasse werden die Rekombinationsprodukte Minicircle und Miniplasmid mittels kommerziell erhältlicher Plasmidisolierungskits (NucleoBond® PC 10000, Macherey & Nagel, Düren) aufgereinigt.The recombination minicircle and miniplasmid are using commercially available Plasmidisolierungskits (NucleoBond ® PC 10000, Macherey & Nagel, Düren) purified from the resulting biomass.

Zur Isolierung des Minicircles aus der Mischung aus Minicircle und Miniplasmid wir eine spezifische Affinitätschromatographie verwendet. Hierzu wird ein biotinylierter Repressor des Lactose-Operons an Streptavidin Sepharose High Performance (GE Healthcare) gekoppelt (vgl. Mayrhofer et al., 2008 ).For the isolation of the minicircle from the mixture of minicircle and miniplasmid we used a specific affinity chromatography. For this purpose, a biotinylated repressor of the lactose operon is coupled to streptavidin Sepharose High Performance (GE Healthcare) (cf. Mayrhofer et al., 2008 ).

Mit 5 ml dieser Chromatograhiematrix wird eine XK 16 Chromatographiesäule befüllt und mit dem fünffachen Säulenvolumen 50 mM Tris pH 8, 400 mM NaCl equilibriert. Die Mischung der Rekombinationsprodukte (1 mg/ml in 50 mM Tris pH 8, 400 mM NaCl) wird anschließend in einem ÄKTA-System (GE Healthcare) bei einer Flussrate von 0,5 ml/min auf das Säulenmaterial aufgetragen. Die Säule wird mit 50 mM Tris pH 8, 400 mM NaCl bei einer Flussrate von 1 ml/min gewaschen bis das am Gerät detektierte UV260nm-Signal auf eine stabile Basislinie absinkt. Nun wird die Minicircle-DNS mit 50 mM Tris pH8, 500 mM NaCl, 5 mM IPTG eluiert, danach wird die Säule mit 50 mM Tris pH 8, 1 M NaCl und 50 mM Tris pH 8 gewaschen und zur weiteren Verwendung erneut eqilibriert.An XK 16 chromatography column is filled with 5 ml of this chromatographic matrix and equilibrated with five times the column volume 50 mM Tris pH 8, 400 mM NaCl. The mixture of recombination products (1 mg / ml in 50 mM Tris pH 8, 400 mM NaCl) is then applied to the column material in an ÄKTA system (GE Healthcare) at a flow rate of 0.5 ml / min. The column is washed with 50 mM Tris pH 8, 400 mM NaCl at a flow rate of 1 ml / min until the UV 260 nm signal detected on the instrument drops to a stable baseline. The minicircle DNA is then eluted with 50 mM Tris pH8, 500 mM NaCl, 5 mM IPTG, then the column is washed with 50 mM Tris pH 8, 1 M NaCl and 50 mM Tris pH 8 and re-equilibrated for further use.

Durch Präzipitation wird die DNS aus der Hochsalzmischung entfernt und schließlich in Wasser resuspendiert. Precipitation removes the DNA from the high salt mixture and finally resuspends in water.

Die DNS der MC-IR-GFP und MC-SB10 werden jeweils auf eine Konzentration von 1 mg/ml eingestellt.The DNA of the MC-IR-GFP and MC-SB10 are each adjusted to a concentration of 1 mg / ml.

Statt des Parentalplasmids pP-SB10 kann alternativ auch das Parentalplasmid pP-SB100X als Ausgangsmaterial verwendet werden. Dabei wird der Minicircle MC-SB100X erhalten.Instead of the parent plasmid pP-SB10, alternatively, the parent plasmid pP-SB100X can be used as the starting material. This will get the minicircle MC-SB100X.

Außerdem kann statt des Parentalplasmids pP-IR-GFP kann alternativ auch das Parentalplasmid pP11-IR-GFP als Ausgangsmaterial verwendet werden. Dabei wird der Minicircle MC-IR-GFP mit einer statt mit zwei tag-Sequenzen erhalten.In addition, instead of the parent plasmid pP-IR-GFP, alternatively the parent plasmid pP11-IR-GFP can be used as starting material. The minicircle MC-IR-GFP is obtained with one instead of two tag sequences.

BEISPIEL 5:EXAMPLE 5

Kotransfektion von Zielzellen mit GFP- und SB10-Minicircles und Transposition der ExpressionskassetteCotransfection of target cells with GFP and SB10 minicircles and transposition of the expression cassette

Jurkat-Zellen (humane T-Zell-Leukämie-Linie, DSMZ) werden in RPMI 1640-Medium in Anwesenheit von FCS (fötalem Kälberserum; PAA, Linz) bei 37°C und 5% CO2 kultiviert.Jurkat cells (human T cell leukemia line, DSMZ) are cultured in RPMI 1640 medium in the presence of FCS (fetal calf serum, PAA, Linz) at 37 ° C and 5% CO 2 .

Zur Transfektion werden die Zellen in serumfreiem Medium resuspendiert, so dass eine Zelldichte von ca. 7,5 × 105 Zellen/ml entsteht. 400 μl dieser Zellsuspension werden mit 20 μg MC-IR-GFP und 10 μg MC-SB10 versetzt und durch vorsichtiges Umschwenken gut durchmischt. Der elektroporative Gentransfer erfolgt anschießend mit einem Bio-Rad Gene-Pulser II (Bio-Rad, Foster City, CA, USA). Hierzu werden die Zellen in entsprechende Küvetten mit einem Elektrodenabstand von 4 mm gegeben und bei einer am Gerät eingestellten Spannung von 200 V und einer Kapazität von 1600 μF elektroporiert. Die Küvette mit der Zellsuspension wird unmittelbar danach für 5 min auf Eis gelagert, anschließend werden die Zellen in Kulturschalen mit vorgewärmtem Kulturmedium (37°C, mit FCS) pipettiert und wie oben beschrieben weiter kultiviert.For transfection, the cells are resuspended in serum-free medium to give a cell density of approximately 7.5 × 10 5 cells / ml. 400 μl of this cell suspension are mixed with 20 μg of MC-IR-GFP and 10 μg of MC-SB10 and mixed thoroughly by gently inverting. The electroporative gene transfer is then carried out with a Bio-Rad Gene-Pulser II (Bio-Rad, Foster City, CA, USA). For this purpose, the cells are placed in corresponding cuvettes with an electrode gap of 4 mm and electroporated at a set voltage of 200 V and a capacity of 1600 μF. The cuvette with the cell suspension is immediately stored on ice for 5 min, then the cells are pipetted into culture dishes with prewarmed culture medium (37 ° C., with FCS) and cultivated further as described above.

Die Kotransfektion der beiden DNS (20 μg MC-IR-GFP und 10 μg MC-SB10) führt zur konstitutiven Expression der SB10-Transposase in den Zielzellen. Nach Erreichen einer ausreichenden Menge an SB10 Protein in der Zelle interagiert dieses mit den für die Transposition relevanten DNS-Strukturen und die Transposition erfolgt. Eine Transfektion unter Weglassen von MC-SB10 (also ohne Transposase-Expression) führt zu keiner Transposition, wohl aber zur Expression des GFP vom episomalen Vektor aus.The cotransfection of the two DNAs (20 μg MC-IR-GFP and 10 μg MC-SB10) leads to the constitutive expression of the SB10 transposase in the target cells. After reaching a sufficient amount of SB10 protein in the cell, this interacts with the transposition-relevant DNA structures and the transposition takes place. Transfection omitting MC-SB10 (ie without transposase expression) leads to no transposition, but to the expression of GFP from the episomal vector.

Die Detektion und Quantifizerung durch die GFP-Expression fluoreszenter Zellen erfolgt zu definierten Zeitpunkten, z. B. 24 h, 48 h, etc. nach Transfektion mit einem handelsüblichen Fluoreszenzmikroskop mit entsprechendem Filtersatz. Die Bestimmung der Effizienz der Transposition beruht auf der Annahme, dass, neben einer sich über die Zeit ausverdünnenden transienten GFP-Expression nicht-transponierter Sequenzen, die GFP-Expression der im Chromosom der Zielzelle integrierten Expressionseinheiten mit der Zeit konstant bleibt. Als Maß für die Transpositionseffizienz wird deshalb der konstante Basiswert der GFP-Expression verwendet, der nach dem Abklingen der transienten Expression gemessen wird.The detection and quantification by the GFP expression of fluorescent cells occurs at defined times, eg. B. 24 h, 48 h, etc. after transfection with a commercially available fluorescence microscope with a corresponding filter set. The determination of the efficiency of the transposition is based on the assumption that, in addition to a time-deficient transient GFP expression of non-transposed sequences, GFP expression of the expression units integrated into the chromosome of the target cell remains constant over time. As a measure of the transposition efficiency, therefore, the constant basal level of GFP expression is used, which is measured after the transient expression has subsided.

Statt des Minicircles MC-SB10, kann in diesem Verfahren alternativ auch 10 μg des Minicircle MC-SB100X mit 20 μg MC-IR-GFP versetzt und analog vorgegangen werden.Instead of the minicircle MC-SB10, alternatively 10 μg of the minicircle MC-SB100X can be mixed with 20 μg MC-IR-GFP in this method and the procedure can be analogous.

Darüber hinaus kann auch lediglich eine der beiden kotransfizierten DNS ein Minicircle sein, während das andere ein Standardplasmid ist (siehe auch Beispiel 6).In addition, only one of the two cotransfected DNA can be a minicircle, while the other is a standard plasmid (see also Example 6).

Die Verfahren aus den Beispielen 1–5 sind auch schematisch in 5 dargestellt.The processes of Examples 1-5 are also schematically shown in FIG 5 shown.

Die Transposition nach Kotransfektion kann durch die Verwendung induzierbarer und in eukaryontischen Zellen funktionsfähiger Promotoren gesteuert werden. Im hier gezeigten Beispiel erfolgte sie unreguliert.Transposition after cotransfection can be controlled by the use of inducible promoters which are functional in eukaryotic cells. In the example shown here it was unregulated.

BEISPIEL 6:EXAMPLE 6

Vergleich der Transpositionseffizienz zwischen Transposon-Minicircle und Transposon-PlasmidComparison of transposition efficiency between transposon minicircle and transposon plasmid

Der Versuch aus Beispiel 5 wird wiederholt, allerdings wird statt des Minicircles MC-IR-GFP eine äquimolare Menge des Vergleichsplasmids pT2-IR-GFP (siehe Beispiel 2) transfiziert. Die Transpositionseffizienz wird mit derjenigen aus Beispiel 5 verglichen.The experiment of Example 5 is repeated, but instead of the minicircle MC-IR-GFP, an equimolar amount of the comparison plasmid pT2-IR-GFP (see Example 2) is transfected. The transposition efficiency is compared with that of Example 5.

Die Effizienz der Transposition im Vergleich zwischen Plasmid-basierter Transposition (Transfektion mit pP-IR-GFP) und Minicircle-basierter Transposition (Transfektion mit MC-IR-GFP, siehe Beispiel 5) zeigt, dass die Zahl der durch Minicircle-Transposons transformierten Zellen höher ist als die, deren Transposon auf einem Plasmid kodiert vorliegt. Die Effizienz wird nicht dadurch gesteigert, dass die SB10 Transposase Minicircle-basiert statt Plasmid-basiert vorliegt, sofern äquimolare Mengen an MC-SB10- und pSB10-DNS pro Zelle verglichen werden.The efficiency of transposition compared between plasmid-based transposition (transfection with pP-IR-GFP) and minicircle-based transposition (transfection with MC-IR-GFP, see Example 5) shows that the number of cells transformed by minicircle transposons is higher than that whose transposon is encoded on a plasmid. Efficiency is not enhanced by the fact that SB10 transposase is minicircle-based rather than plasmid-based, provided that equimolar amounts of MC-SB10 and pSB10 DNA per cell are compared.

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Claims (14)

Ein Minicircle umfassend: a) mindestens eine Nukleinsäuresequenz von Interesse, und b) Transposase-Erkennungssequenzen zu beiden Seiten der Nukleinsäure von Interesse, charakterisiert dadurch, dass die Transposase-Erkennungssequenzen von einer spezifischen Transposase, oder dem Derivat einer Transposase, erkannt und zur Transposition verwendet werden können, wobei die spezifische Transposase vorzugsweise eine Dornröschen-Transposase oder eine PiggyBac-Transposase ist.A minicircle comprising: a) at least one nucleic acid sequence of interest, and b) transposase recognition sequences on both sides of the nucleic acid of interest, characterized in that the transposase recognition sequences of a specific transposase, or the derivative of a transposase, can be recognized and used for transposition, wherein the specific transposase is preferably a Sleeping Beauty Transposase or a PiggyBac Transposase. Der Minicircle aus Anspruch 1, wobei die mindestens eine Nukleinsäuresequenz von Interesse eine Expressionskassette mit mindestens einem Gen, mindestens einer Isolatorsequenz oder einer Kombination davon umfasst.The minicircle of claim 1, wherein the at least one nucleic acid sequence of interest comprises an expression cassette having at least one gene, at least one isolator sequence or a combination thereof. Der Minicircle aus einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei der Minicircle mindestens eine Identifikationssequenz innerhalb des Bereichs zwischen den Transposase-Erkennungssequenzen umfasst, oder wobei der Minicircle mindestens eine Identifikationssequenz außerhalb des Bereichs zwischen den Transposase-Erkennungssequenzen umfasst.The minicircle of any one of claims 1 or 2, wherein the minicircle comprises at least one identification sequence within the region between the transposase recognition sequences, or wherein the minicircle comprises at least one identification sequence out of the region between the transposase recognition sequences. Der Minicircle aus einem der Ansprüche 1–3, wobei der Minicircle ein Paar Rekombinase-Erkennungssequenzen umfasst, die zu beiden Seiten der Nukleinsäure von Interesse innerhalb der Transposase-Erkennungssequenzen liegen.The minicircle of any one of claims 1-3, wherein the minicircle comprises a pair of recombinase recognition sequences located on either side of the nucleic acid of interest within the transposase recognition sequences. Der Minicircle aus einem der Ansprüche 1–4, wobei der Minicircle keinen Selektionsmarker zur Amplifikation in prokaryotischen Zellen enthält.The minicircle of any of claims 1-4, wherein the minicircle does not contain a selection marker for amplification in prokaryotic cells. Der Minicircle aus einem der Ansprüche 1–5, wobei der Minicircle ein ringförmiges, superspiralisiertes DNS-Molekül ist.The minicircle of any of claims 1-5, wherein the minicircle is an annular, supercoiled DNA molecule. Eine Zelle umfassend den Minicircle aus einem der Ansprüche 1–6.A cell comprising the minicircle of any of claims 1-6. Verfahren zur Insertionsmutagenese oder zur genetischen Transformation einer eukaryotischen Zielzelle, das Verfahren umfassend: a) Bereitstellen eines Minicircles umfassend eine Nukleinsäuresequenz von Interesse aus einem der Ansprüche 1–6 innerhalb der Zielzelle; b) Transfektion der Zielzelle mit einem Vektor umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die für eine Transposase kodiert, die für die Transposase-Erkennungssequenzen des Minicircles spezifisch ist; c) Expression der Transposase von dem Vektor; und d) Rekombination der Nukleinsäuresequenz von Interesse mit einer Nukleinsäure der Zielzelle.A method for insertion mutagenesis or for genetic transformation of a eukaryotic target cell, the method comprising a) providing a minicircle comprising a nucleic acid sequence of interest from any one of claims 1-6 within the target cell; b) transfecting the target cell with a vector comprising a nucleic acid sequence encoding a transposase specific for the minicircle transposase recognition sequences; c) expression of the transposase from the vector; and d) recombination of the nucleic acid sequence of interest with a nucleic acid of the target cell. Das Verfahren aus Anspruch 8, wobei das Bereitstellen aus Schritt a) durch Transfektion der Zielzelle mit dem Minicircle oder durch Erzeugung des Minicircles innerhalb der Zielzelle erreicht wird.The method of claim 8, wherein the providing from step a) is achieved by transfecting the target cell with the minicircle or by generating the minicircle within the target cell. Das Verfahren aus einem der Ansprüche 8 oder 9, wobei die Schritte a) und b) i) zugleich in einer Kotransfektion durchgeführt werden; oder ii) wobei Schritt a) vor Schritt b) durchgeführt wird; oder iii) wobei Schritt a) nach Schritt b) durchgeführt wird.The method of any one of claims 8 or 9, wherein steps a) and b) i) be carried out simultaneously in a cotransfection; or ii) wherein step a) is performed prior to step b); or iii) wherein step a) is performed after step b). Das Verfahren aus einem der Ansprüche 8–10, wobei die Zielzelle eine Wirbeltierzelle ist, und vorzugsweise eine menschliche Zelle ist.The method of any of claims 8-10, wherein the target cell is a vertebrate cell, and is preferably a human cell. Eine Zelle erhalten durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8–11.A cell obtained by a method according to any one of claims 8-11. Ein Kit zur Insertionsmutagenese oder zur genetischen Transformation einer eukaryotischen Zielzelle umfassend: a) den Minicircle aus einem der Ansprüche 1–8, und b) einen Vektor, der für eine Transposase kodiert, die für die Transposase-Erkennungssequenzen des Minicircles spezifisch ist.A kit for insertion mutagenesis or genetic transformation of a eukaryotic target cell comprising: a) the minicircle of any one of claims 1-8, and b) a vector encoding a transposase specific for the minicircle transposase recognition sequences. Das Kit aus Anspruch 13, wobei für die Transposase-Erkennungssequenzen im Minicircle a) eine Dornröschen-Transposase spezifisch ist und die vom Vektor b) kodierte Transposase die Dornröschen-Transposase oder ein Derivat davon ist, wobei die Dornröschen-Transposase vorzugsweise die hyperaktive Dornröschen-Transposase SB100X ist.The kit of claim 13, wherein for the transposase recognition sequences in minicircle a) a Sleeping Beauty transposase is specific and the transposase encoded by vector b) is the Sleeping Beauty transposase or a derivative thereof, the Sleeping Beauty transposase preferably being the hyperactive Sleeping Beauty Transposase SB100X is.
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