DE102010031401A1

DE102010031401A1 - Method for enriching bacteria, viruses and cells and subsequent nucleic acid isolation

Info

Publication number: DE102010031401A1
Application number: DE201010031401
Authority: DE
Inventors: Dr. Hillebrand Timo
Original assignee: AJ Innuscreen GmbH
Current assignee: AJ Innuscreen GmbH
Priority date: 2010-07-15
Filing date: 2010-07-15
Publication date: 2012-01-19
Also published as: WO2012007581A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung von Bakterien, Zellen oder Viren aus biologischen Proben, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe in eine flüssige Probe überführt und mit magnetischen Partikeln versetzt und anschließend diese magnetischen Partikel mit den adsorbierten Bakterien, Zellen oder Viren aus der flüssigen Probe entfernt werden. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur nachfolgenden Isolierung von Nukleinsäuren aus den angereicherten Bakterien, Zellen oder Viren aus biologischen Proben, dadurch gekennzeichnet, dass die angereicherten Bakterien, Zellen oder Viren nach bekannten Verfahren lysiert und die Nukleinsäuren nach einem bekannten Verfahren isoliert wird.The invention relates to a method for enriching bacteria, cells or viruses from biological samples, characterized in that the sample is transferred to a liquid sample and mixed with magnetic particles and then these magnetic particles with the adsorbed bacteria, cells or viruses from the liquid sample be removed. The invention further relates to a method for the subsequent isolation of nucleic acids from the enriched bacteria, cells or viruses from biological samples, characterized in that the enriched bacteria, cells or viruses are lysed by known methods and the nucleic acids are isolated by a known method.

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein universelles und stark vereinfachtes Verfahren zur Kombination von Anreicherung von Bakterien, Viren oder Zellen aus einer Probe und der nachfolgenden Isolierung der Nukleinsäure aus diesen Targets. Das Verfahren kann dabei manuell oder vollautomatisiert durchgeführt werden.The invention relates to a universal and greatly simplified method for combining enrichment of bacteria, viruses or cells from a sample and the subsequent isolation of the nucleic acid from these targets. The method can be carried out manually or fully automated.

Stand der TechnikState of the art

Unter klassischen Bedingungen erfolgt die Isolierung von DNA aus Zellen und Geweben dadurch, dass die Nukleinsäuren enthaltenden Ausgangsmaterialien unter stark denaturierenden und reduzierenden Bedingungen, teilweise auch unter Verwendung von proteinabbauenden Enzymen, aufgeschlossen und die austretenden Nukleinsäurefraktionen über Phenol-/Chloroform-Extraktionsschritte gereinigt und die Nukleinsäuren mittels Dialyse oder Ethanolpräzipitation aus der wässrigen Phase gewonnen werden ( Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T., 1989, CSH, ”Molecular Cloning” ).Under classical conditions, DNA is isolated from cells and tissues by disrupting the starting materials containing the nucleic acids under strongly denaturing and reducing conditions, in some cases also using protein-degrading enzymes, and purifying the exiting nucleic acid fractions by phenol / chloroform extraction steps and the nucleic acids obtained by dialysis or ethanol precipitation from the aqueous phase ( Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T., 1989, CSH, "Molecular Cloning" ).

Diese ”klassischen Verfahren” zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Zellen und besonders aus Geweben sind sehr zeitaufwendig (teilweise länger als 48 h), erfordern einen erheblichen apparativen Aufwand und sind darüber hinaus auch nicht unter Feldbedingungen realisierbar. Außerdem sind solche Methoden auf Grund der verwendeten Chemikalien wie Phenol und Chloroform in einem nicht geringen Maße gesundheitsgefährdend.These "classical methods" for the isolation of nucleic acids from cells and especially from tissues are very time-consuming (sometimes longer than 48 h), require a considerable amount of equipment and are moreover not feasible under field conditions. In addition, such methods due to the chemicals used such as phenol and chloroform in a not insignificant health hazard.

Die klassische Methodik der Isolierung von Nukleinsäuren wurde in den zurückliegenden Jahren deutlich verbessert. Die „neuen” Verfahren basieren auf einer von Vogelstein und Gillespie (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 61 5–619 ) entwickelten und erstmals beschriebenen Methode zur präparativen und analytischen Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen.The classical methodology of isolating nucleic acids has been significantly improved in recent years. The "new" procedures are based on one of Vogelstein and Gillespie (Proc Natl Acad Sci., USA, 1979, 76, 61 5-619 ) and first described method for the preparative and analytical purification of DNA fragments from agarose gels.

Die Methode kombiniert die Auflösung einer zu isolierende DNA-Bande enthaltende Agarose in einer gesättigten Lösung eines chaotropen Salzes (NaJ) mit einer Bindung der DNA an Glaspartikel. Die an die Glaspartikel fixierte DNA wird anschließend mit einer Waschlösung (20 mM Tris HCl [pH 7,2]; 200 mM NaCl; 2 mM EDTA; 50% v/v Ethanol) gewaschen und danach von den Trägerpartikeln abgelöst.The method combines the dissolution of a DNA band containing agarose to be isolated in a saturated solution of a chaotropic salt (NaJ) with a binding of the DNA to glass particles. The DNA fixed to the glass particles is then washed with a washing solution (20 mM Tris HCl [pH 7.2], 200 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50% v / v ethanol) and then removed from the carrier particles.

Diese Methode erfuhr bis heute eine Reihe von Modifikationen und wird zum gegenwärtigen Zeitpunkt für unterschiedliche Verfahren der Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren aus unterschiedlichen Herkünften angewendet ( Marko, M. A., Chipperfield, R. und Birnboim, H. G., 1982, Anal. Biochem., 121, 382–387 ).This method has undergone a number of modifications and is currently used for different methods of extracting and purifying nucleic acids from different sources ( Marko, MA, Chipperfield, R. and Birnboim, HG, 1982, Anal. Biochem., 121, 382-387 ).

Darüber hinaus existieren heute weltweit auch eine Vielzahl von Reagenziensystemen, vor allem zur Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen und für die Isolierung von Plasmid-DNA aus bakteriellen Lysaten, aber auch für die Isolierung von längerkettigen Nukleinsäuren (genomische DNA, zelluläre Gesamt-RNA) aus Blut, Geweben oder auch Zellkulturen.In addition, a large number of reagent systems exist worldwide today, especially for the purification of DNA fragments from agarose gels and for the isolation of plasmid DNA from bacterial lysates, but also for the isolation of longer-chain nucleic acids (genomic DNA, total cellular RNA). from blood, tissues or even cell cultures.

Alle diese kommerziell verfügbaren Kits basieren auf dem hinlänglich bekannten Prinzip der Bindung von Nukleinsäuren an mineralische Träger unter Anwesenheit von Lösungen unterschiedlicher chaotroper Salze und verwenden als Trägermaterialien Suspensionen feingemahlener Glaspulver (z. B. Glasmilk, BIO 101, La Jolla, CA ), Diatomenerden (Fa. Sigma) oder auch Silicagele. (Diagen, DE 41 39 664 A1 ).All of these commercially available kits are based on the well-known principle of binding nucleic acids to mineral carriers in the presence of solutions of different chaotropic salts and using as support materials suspensions of finely ground glass powder (e.g. Glass Milk, BIO 101, La Jolla, CA ), Diatomaceous earth (Sigma) or also silica gels. (Qiagen, DE 41 39 664 A1 ).

Ein für eine Vielzahl unterschiedlicher Anwendungen praktikables Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren ist in US 5,234,809 (Boom) dargestellt. Dort ist ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus nukleinsäurehaltigen Ausgangsmaterialien durch die Inkubation des Ausgangsmaterials mit einem chaotropen Puffer und einer DNA-bindenden festen Phase beschrieben. Die chaotropen Puffer realisieren sowohl die Lyse des Ausgangsmaterials als auch die Bindung der Nukleinsäuren an die feste Phase.A practical method for isolating nucleic acids for a multitude of different applications is known in US 5,234,809 (Boom) shown. There is described a method for isolating nucleic acids from nucleic acid-containing starting materials by incubating the starting material with a chaotropic buffer and a DNA-binding solid phase. The chaotropic buffers realize both the lysis of the starting material and the binding of the nucleic acids to the solid phase.

Das Verfahren ist gut geeignet, um Nukleinsäuren aus kleinen Probenmengen zu isolieren und findet speziell im Bereich der Isolierung viraler Nukleinsäuren seine praktische Anwendung.The method is well suited for isolating nucleic acids from small sample quantities and finds its practical application especially in the field of isolation of viral nucleic acids.

Spezifische Modifikationen dieser Verfahren betreffen den Einsatz von neuartigen Trägermaterialien, welche für bestimmte Fragestellungen applikative Vorteile zeigen ( WO-A 95/34569 ). Weitere verbesserte Extraktions-Varianten betrafen dann den Einsatz von neuartigen Lyse-/Bindungspuffern.Specific modifications of these methods relate to the use of novel support materials which show applicational advantages for certain questions ( WO-A 95/34569 ). Further improved extraction variants then involved the use of novel lysis / binding buffers.

Die Patentschriften EP 1135479 offenbart, dass für die Adsorption von Nukleinsäuren an die dem Fachmann bekannten und eingesetzten silikatischen Materialien auch sogenannte antichaotrope Salze als Bestandteil von Lyse-/Bindungspuffer-Systemen sehr effizient und erfolgreich eingesetzt werden können. Vorteil dieses Verfahrens ist, dass durch die Umgehung der Verwendung von chaotropen Salzen eine deutlich geringere gesundheitliche Gefährdung von den Extraktionssystemen ausgeht. Allerdings werden für eine effiziente Isolierung von Nukleinsäuren aus einer komplexen biologischen Probe insbesondere in Hinblick auf eine möglichst ausbeutestarke Nukleinsäure-Gewinnung im Lysepuffer wiederum hohe Salzkonzentrationen (> 1.5 M) benötigt. So offenbart die Patentschrift, dass die Verwendung findenden Lysepuffer Salzkonzentrationen zwischen 1,5 M–3 M enthalten.The patents EP 1135479 discloses that for the adsorption of nucleic acids to the silicate materials known and used in the art and so-called antichaotropic salts can be used very efficiently and successfully as part of lysis / binding buffer systems. The advantage of this method is that by avoiding the use of chaotropic salts, a significantly lower health risk emanates from the extraction systems. However, for the efficient isolation of nucleic acids from a complex biological sample, in particular high salt concentrations (> 1.5 M) are required, in particular with regard to the highest possible yield of nucleic acid in the lysis buffer. Thus, the patent discloses that use Lysis buffer containing salt concentrations between 1.5 M-3 M.

In der Patentschrift DE 4321904 wird ein Verfahren beschrieben, dass bei Kombination von chaotropen Hochsalzpuffern mit alkoholischen Komponenten eine effiziente Isolierung von Nukleinsäuren möglich ist. Die in der Patentschrift ausgewiesenen Lysepuffer enthalten dabei immer Salzkonzentrationen von 4 M–8 M, insbesondere werden als Salze Guanidinhydrochlorid, Guanidinthiocyanat oder Kaliumjodid eingesetzt. Es ist bekannt, dass diese Salze eine Lyse des Ausgangsmaterials sowie eine potente Inaktivierung nukleolytischer Enzyme realisieren. Nach Lyse des Ausgangsmaterials erfolgt dann die Zugabe eines Alkohols. Die Patentschrift offenbart, dass die Zugabe der alkoholischen Komponenten zum Hochsalz-Lysepuffer eine besonders gute Effizienz der Anbindung der Nukleinsäuren an die eingesetzten silikatischen Filtermaterialien vermittelt.In the patent DE 4321904 describes a method that when combining chaotropic high salt buffers with alcoholic components, efficient isolation of nucleic acids is possible. The lysis buffers identified in the patent always contain salt concentrations of 4 M-8 M; in particular, guanidine hydrochloride, guanidine thiocyanate or potassium iodide are used as salts. It is known that these salts realize a lysis of the starting material as well as a potent inactivation of nucleolytic enzymes. After lysis of the starting material then the addition of an alcohol. The patent discloses that the addition of the alcoholic components to the high salt lysis buffer mediates a particularly good efficiency of binding of the nucleic acids to the silicate filter materials used.

Die Analyse des Standes der Technik verdeutlicht eindrucksvoll, dass eine Vielzahl von Möglichkeiten existiert, Nukleinsäuren an feste Trägermaterialien, insbesondere mineralische Trägermaterialien auf Siliziumbasis oder aber auch an magnetische oder paramagnetische Trägermaterialien, zu binden, nachfolgend zu waschen und die Nukleinsäuren vom Trägermaterial wieder abzulösen. Es wird dabei sehr deutlich, dass für die Isolierung von Nukleinsäuren aus komplexen biologischen Proben sowohl sog. chaotrope Salze oder sog. antichaotrope Salze eingesetzt werden.The analysis of the prior art illustrates impressively that there are a large number of possibilities for binding nucleic acids to solid support materials, in particular mineral support materials based on silicon or even to magnetic or paramagnetic support materials, to subsequently wash and to detach the nucleic acids from the support material again. It becomes very clear that so-called chaotropic salts or so-called antichaotropic salts are used for the isolation of nucleic acids from complex biological samples.

Alle diese Verfahren arbeiten dabei unabhängig der für die Anbindung der Nukleinsäuren nach dem gleichen Prozessablauf:

1. Lyse der Probe
2. Optional Zugabe des für die Anbindung der Nukleinsäure notwendigen Bindungspuffers (oder eines Alkohols)
3. Inkontaktbringen des Reaktionsansatzes mit einer nukleinsäurebindenden festen Phase (Trägermaterial) und nachfolgende Anbindung der Nukleinsäure an dieses Material)
4. Waschen der am Trägermaterial gebundenen Nukleinsäure
5. Ablösen der gebundenen Nukleinsäure vom Trägermaterial

All of these methods work independently of the binding of the nucleic acids according to the same process flow:

1. Lysis of the sample
2. Optionally adding the binding buffer (or an alcohol) necessary for the binding of the nucleic acid
3. contacting the reaction mixture with a nucleic acid-binding solid phase (carrier material) and subsequent attachment of the nucleic acid to this material)
4. Washing the nucleic acid bound to the carrier material
5. detachment of the bound nucleic acid from the carrier material

Der Stand der Technik offenbart, dass diese Verfahren für die Isolierung von Nukleinsäuren aus kleinvolumigen Proben sehr effizient funktionieren. Sollen dagegen große Probenvolumina bearbeitet werden, dann verlieren diese Verfahren deutlich an Effizienz und werden darüber hinaus auch in ihrer Durchführung zunehmend kompliziert.The prior art discloses that these methods work very efficiently for the isolation of nucleic acids from small volume samples. If, on the other hand, large sample volumes are to be processed, then these methods clearly lose their efficiency and, in addition, become increasingly complicated in their implementation.

Das Problem wird insbesondere dann wesentlich, wenn große Volumen an Proben aufgearbeitet werden sollen, wenn z. B. in Bezug auf eine diagnostische Testdurchführung eine höhere Sensitivität nur durch die Vergrößerung des Probenvolumens erzielbar ist.The problem becomes particularly important when large volumes of samples are to be processed, if z. B. in terms of a diagnostic test performance, a higher sensitivity can be achieved only by increasing the sample volume.

Technische Lösungen basieren darauf, dass man die Probe in gewohnter Weise mit einem größeren Volumen an Lysepuffer versetzt, nachfolgend den Bindungspuffer zugibt und den Ansatz mittels einer „Trichtervorrichtung” sukzessive über eine Filtermembran zur Anbindung der Nukleinsäure leitet. Mittels diesbezüglicher kommerzieller Systeme können dann z. B. 1 ml einer Probe zur Isolierung viraler Nukleinsäure eingesetzt werden. Diese Verfahren sind aber extrem teuer und aufwendig in der Durchführung.Technical solutions are based on adding a larger volume of lysis buffer to the sample in the usual way, subsequently adding the binding buffer and successively passing the mixture through a filter membrane for binding the nucleic acid by means of a "funnel device". By means of this commercial systems can then z. B. 1 ml of a sample for the isolation of viral nucleic acid. However, these methods are extremely expensive and expensive to carry out.

Weitere Möglichkeiten zur Bearbeitung größerer Probenvolumina mit dem Ziel der Isolierung von Nukleinsäuren insbesondere aus pathogenen Mikroorganismen basieren auf dem Einsatz sog. immunomagnetischer Verfahren. Diese Verfahren basieren auf dem Einsatz von z. B. magnetischen Beads (Partikel), welche mit einem Fängermolekül gekoppelt sind (z. B. mit einem targetspezifischen Antikörper). Diese Beads werden mit der biologischen Probe in Kontakt gebracht und für mehrere Stunden inkubiert. Dabei soll das Target spezifisch an den Antikörper binden. Die Beads werden nachfolgend separiert und gewaschen. Dann erfolgt das Ablösen der gebundenen Targets. Im Falle der geplanten Isolierung von Nukleinsäuren aus den gebundenen Analyten lysiert man den gebundenen Analyten und führt nachfolgend eine bekannte Nukleinsäureisolierung durch.Further possibilities for processing larger sample volumes with the aim of isolating nucleic acids, in particular from pathogenic microorganisms, are based on the use of so-called immunomagnetic methods. These methods are based on the use of z. B. magnetic beads (particles) which are coupled to a capture molecule (eg., With a target-specific antibody). These beads are contacted with the biological sample and incubated for several hours. The target is to specifically bind to the antibody. The beads are subsequently separated and washed. Then the detachment of the bound targets takes place. In the case of the planned isolation of nucleic acids from the bound analytes, the bound analyte is lysed and subsequently carries out a known nucleic acid isolation.

Diese Verfahren sind aufwendig und extrem teuer, da sie immer auf der Verwendung von an magnetische Beads gekoppelte Antikörper basieren. Darüber hinaus sind solche Verfahren auch nicht robust, da die Beads mit den gekoppelten Antikörpern auch immer gekühlt sein müssen. Insbesondere für einen z. B. mobilen diagnostischen Einsatz unter Feldbedingungen sind diese Verfahren nicht geeignet. Ein weiteres diesbezügliches Verfahren findet man im Journal of Virology (Vol. 83, No. 10; 2009) . Dabei handelt es sich um die immunomagnetische Anreicherung von Virusantigen in Urinproben. Dabei konnten 1.5 ml Probe eingesetzt werden. Das Verfahren nutzt magnetische Beads, welche mit einem Protein (ApoH) gekoppelt sind. Diese Beads dienen der Bindung von Virusantigen aus der Probe. Die Inkubation von Probe mit Beads beträgt 2 h. Danach werden die Beads separiert und mehrmals gewaschen. Nachfolgend erfolgt die Lyse der Viren mittels eines Lysepuffers. Der Lysepuffer wird dann auf eine Filtersäule gegeben und die Nukleinsäure in an sich bekannter Weise an der Filtersäule gebunden, gewaschen und nachfolgend die virale Nukleinsäure isoliert. Auch dieses Verfahren ist wieder extrem teuer und nicht robust für einen Feldeinsatz.These methods are expensive and extremely expensive, as they are always based on the use of antibodies coupled to magnetic beads. In addition, such methods are also not robust, since the beads must always be cooled with the coupled antibodies. In particular, for a z. B. mobile diagnostic use under field conditions, these methods are not suitable. Another related process can be found in Journal of Virology (Vol. 83, No. 10; 2009) , This is the immunomagnetic enrichment of virus antigen in urine samples. It was possible to use 1.5 ml of sample. The method uses magnetic beads which are coupled to a protein (ApoH). These beads serve to bind virus antigen from the sample. The incubation of sample with beads is 2 h. Thereafter, the beads are separated and washed several times. Subsequently, the lysis of the virus is carried out by means of a lysis buffer. The lysis buffer is then placed on a filter column and the nucleic acid bound in a conventional manner to the filter column, washed and subsequently isolated the viral nucleic acid. Again, this process is extremely expensive and not robust for field use.

Diese Verfahren zeigen, dass es möglich ist, größere Probenvolumina zu bearbeiten. Es zeigt sich aber auch, dass es sich um zwei getrennte Verfahrensabläufe handelt:

1. Selektive oder unselektive Anbindung von Mikroorganismen an mit Beads gekoppelte Antikörper
2. Lyse der gebundenen Targets
3. Extraktion der freigesetzten Nukleinsäuren über die Verwendung dem Fachmann bekannter Verfahren; z. B. über die Anbindung der Nukleinsäuren an eine feste Phase.

These methods show that it is possible to process larger sample volumes. However, it also turns out that these are two separate processes:

1. Selective or unselective attachment of microorganisms to beads coupled with antibodies
2. Lysis of the bound targets
3. Extraction of the liberated nucleic acids by the use of methods known to those skilled in the art; z. B. via the attachment of nucleic acids to a solid phase.

Es ist hervorzuheben, dass für die Isolierung der Nukleinsäuren ein zusätzliches Trägermaterial eingesetzt werden muss.It should be emphasized that an additional carrier material must be used for the isolation of the nucleic acids.

Damit werden diese Verfahren aufwendig und sind auch nur sehr schwer zu automatisieren.Thus, these methods are complex and are also very difficult to automate.

Aufgabe der ErfindungObject of the invention

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, die Nachteile der im Stand der Technik beschriebenen Lösungen zu beseitigen.The object of the present invention was to eliminate the disadvantages of the solutions described in the prior art.

Lösung der AufgabeSolution of the task

Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst.The problem has been solved according to the features of the claims.

Erfindungsgemäß wurde ein universelles Verfahren zur Anreicherung und nachfolgenden Isolierung von Nukleinsäuren aus Bakterien, Viren oder auch Zellen bereitgestellt, das einfach, schnell, robust (auch geeignet für einen Einsatz unter Feldbedingungen) und preiswert ist. Dieses Verfahren gestattet, auch große Probenvolumina (> 10 ml) einfach und effizient zu bearbeiten. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es auch möglich, dass der Prozess einfach zu automatisieren ist.According to the invention, a universal method for enrichment and subsequent isolation of nucleic acids from bacteria, viruses or even cells has been provided, which is simple, fast, robust (also suitable for use under field conditions) and inexpensive. This method allows to easily and efficiently process even large sample volumes (> 10 ml). With the method according to the invention, it is also possible that the process is easy to automate.

Die vorliegende Erfindung löst die Problemstellung dabei in einer überraschenden Weise.The present invention solves the problem in a surprising manner.

Zufällige experimentelle Beobachtungen zeigten, das die Verwendung von einfachen magnetischen, vorzugsweise paramagnetischen, Beads (z. B. Partikel aus Eisenoxyd mit OH-Funktionalisierung), die routinemäßig für die Isolierung von Nukleinsäuren nach den bekannten und ausführlich beschriebenen Verfahrensabläufen eingesetzt werden, noch andere Eigenschaften besitzen.Random experimental observations have shown that the use of simple magnetic, preferably paramagnetic, beads (eg, OH-functionalized iron oxide particles) routinely employed for the isolation of nucleic acids according to the known and well-described procedures also has other properties have.

Obwohl diese Beads keine Antikörper auf der Oberfläche besitzen, binden sie überraschenderweise hocheffizient Zellen, Bakterien und Viren, aber keine Proteine. Es zeigt sich, dass die Inkubation einer diesbezüglichen Beads-Lösung mit einer Zellsuspension von NIH 3T3 Zellen dazu führt, dass alle Zellen der Suspension an die Beads adsorbierten. Diese Beobachtung lies sich auch auf die unspezifische Adsorption von Bakterien oder Viren beobachten.Although these beads do not have antibodies on the surface, they surprisingly efficiently bind cells, bacteria and viruses, but no proteins. It turns out that the incubation of a corresponding bead solution with a cell suspension of NIH 3T3 cells results in all cells of the suspension adsorbing to the beads. This observation could also be observed on the nonspecific adsorption of bacteria or viruses.

Entsprechend der Zielstellung der vorliegenden Erfindung konnte ein völlig neuartiges Verfahren entwickelt werden, welches es erlaubt.

erstens, Viren, Bakterien oder Zellen etc. einer Probe unspezifisch an magnetische oder paramagnetische Materialien zu adsorbieren und
zweitens, die virale, bakterielle oder zelluläre etc. Nukleinsäure der gebundenen Viren, Bakterien oder Zellen etc. über dasselbe Trägermaterial zu isolieren.

According to the objective of the present invention, a completely new method could be developed, which allows it.

firstly, to adsorb viruses, bacteria or cells etc. of a sample nonspecifically to magnetic or paramagnetic materials, and
secondly, to isolate the viral, bacterial or cellular etc. nucleic acid of the bound viruses, bacteria or cells etc. via the same carrier material.

Das erfindungsgemäße Verfahren kombiniert dabei erstmalig die Adsorption von Bakterien, Viren oder Zellen etc. einer Probe an ein Trägermaterial mit der nachfolgenden Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren unter Verwendung desselben Trägermaterials.For the first time, the method according to the invention combines the adsorption of bacteria, viruses or cells etc. of a sample onto a carrier material with the subsequent isolation and purification of nucleic acids using the same carrier material.

Dabei kann das Verfahren als „single-Tube-Prozess” oder auch in Form eines automatisierten „Walk-Away-Verfahrens” durchgeführt werden.The process can be carried out as a "single-tube process" or in the form of an automated "walk-away process".

Das eingesetzte Trägermaterial ist preiswert, da es sich nicht um Antikörper-gekoppelte Beads handelt. Darüber hinaus sind die Beads auch ohne Kühlung stabil und somit auch für den mobilen Feldeinsatz geeignet.The carrier material used is inexpensive, since it is not antibody-coupled beads. In addition, the beads are stable even without cooling and thus suitable for mobile field use.

Es gibt keine wirkliche Limitation des Verfahrens in Bezug auf das Volumen der Probe und auch nicht in Bezug auf die Art der Probe. Gerade der letzte Punkt ist mit einem entscheidenden Vorteil behaftet, da damit auch Proben effizient bearbeitet werden können, die mit den bekannten Methoden der Nukleinsäureisolierung nur aufwendig bearbeitet werden können, insbesondere Proben mit hohem inhibitorischen Potenzial. Der Vorteil begründet sich im erfindungsgemäßen Verfahren. Im ersten Verfahrensschritt werden die Zellen, Bakterien oder Viren aus einer Probe an die Beads adsorbiert. Da Proteine nicht an die Beads adsorbiert werden, erfolgt damit gleichzeitig eine Trennung von eventuell vorhandenen freien (außerhalb von Zellen) existierenden Proteinen. Damit kann dann die Probe verworfen werden und in diesem Zusammenhang auch die inhibitorischen Matrixkomponenten. Die an den Beads befindlichen Zellen, Bakterien oder Viren etc. können nun mit Wasser gewaschen werden. Für die nachfolgende Nukleinsäureisolierung hat man dann bereits saubere Zellen, Bakterien oder Viren etc.. Dies vereinfacht dann den Prozess der eigentlichen Nukleinsäureisolierung enorm, da aufwendige Waschschritte entfallen können.There is no real limitation on the method in terms of the volume of the sample and also not in terms of the type of sample. Especially the last point has a decisive advantage, because it also allows samples to be processed efficiently, which can only be processed with the known methods of nucleic acid isolation consuming, especially samples with high inhibitory potential. The advantage is based on the method according to the invention. In the first process step, the cells, bacteria or viruses are adsorbed from a sample to the beads. Since proteins are not adsorbed to the beads, this is at the same time a separation of any existing free (outside of cells) existing proteins. Thus, the sample can be discarded and in this context, the inhibitory matrix components. The cells, bacteria or viruses etc. on the beads can now be washed with water. For the subsequent nucleic acid isolation then you have clean cells, bacteria or viruses etc .. This then simplifies the process of the actual nucleic acid isolation enormously, since expensive washing steps can be omitted.

Der Prozessablauf ist einfach, extrem schnell und überaus effizient und kombiniert erfindungsgemäß eine Anreicherung von Targets mit der nachfolgenden Extraktion der Nukleinsäure. Damit unterscheidet sich das erfindungsgemäße Verfahren von den bisher üblichen Verfahren zu Isolierung von Nukleinsäuren, da zuerst Zellen, Bakterien, Viren etc. einer Probe in Kontakt mit einem Trägermaterial gebracht werden. Bisherige Verfahren beginnen dagegen immer mit der Lyse der Probe (Zellen, Bakterien, Viren etc.) und bringen dann die freigesetzten Nukleinsäuren in Kontakt mit einem Trägermaterial (optional nach Zugabe eines Bindungspuffers). The process sequence is simple, extremely fast and extremely efficient and, according to the invention, combines an enrichment of targets with the subsequent extraction of the nucleic acid. Thus, the method according to the invention differs from the previously customary methods for isolating nucleic acids, since cells, bacteria, viruses etc. of a sample are first brought into contact with a carrier material. In contrast, previous methods always start with the lysis of the sample (cells, bacteria, viruses, etc.) and then bring the released nucleic acids into contact with a carrier material (optionally after addition of a binding buffer).

Neuartig ist auch, dass sich das erfindungsgemäße Verfahren einem so einfachen Mittel wie magnetischen oder paramagnetischen Materialien bedient, die üblicherweise für die Isolierung von Nukleinsäuren eingesetzt werden, nicht jedoch für die Adsorption von Zellen, Bakterien, Viren etc..It is also novel that the method of the invention uses such a simple means as magnetic or paramagnetic materials, which are usually used for the isolation of nucleic acids, but not for the adsorption of cells, bacteria, viruses, etc ..

Der erfindungsgemäße Ablauf des Verfahrens realisiert sich wie folgt:

1. Bereitstellen einer flüssigen Probe, welche Zellen, Bakterien, Viren etc. enthält
2. Zugabe der beschriebenen Beads zur Probe und Inkubation
3. Separation der Beads mittels eines Magneten und Verwerfen des Überstandes
4. Optional waschen der Beads mit den gebundenen Zellen, Bakterien, Viren etc.
5. Zugabe eines Lysepuffers zu den Beads und Lyse der Zellen, Bakterien, Viren etc.
6. Optional Zugabe eines Bindungspuffers oder Alkohols
7. Waschen der Beads
8. Trocknen der Beads
9. Elution der Nukleinsäuren von den Beads mit Wasser oder einem Niedrigsalzpuffer

The process of the method according to the invention is realized as follows:

1. Providing a liquid sample containing cells, bacteria, viruses, etc.
2. Addition of the described beads to the sample and incubation
3. Separation of the beads by means of a magnet and discarding the supernatant
4. Optional washing of the beads with the bound cells, bacteria, viruses etc.
5. Addition of a lysis buffer to the beads and lysis of the cells, bacteria, viruses etc.
6. Optionally add a binding buffer or alcohol
7. Washing the beads
8. Dry the beads
9. Elution of the nucleic acids from the beads with water or a low salt buffer

Für die Lyse/Bindung der Nukleinsäuren können prinzipiell alle bekanten Reagenzien eingesetzt werden, die für die bisher bekanten Methoden der Isolierung von Nukleinsäuren eingesetzt werden.For the lysis / binding of the nucleic acids, in principle all known reagents can be used, which are used for the hitherto known methods of isolating nucleic acids.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann dabei universell für die Isolierung von Nukleinsäuren aus flüssigen Proben oder aus festen Proben, die in einen flüssigen Zustand überführt wurden, eingesetzt werden.The method according to the invention can be used universally for the isolation of nucleic acids from liquid samples or from solid samples which have been converted into a liquid state.

Ein besonderer Vorteil des Verfahrens gestattet es dabei, dass über die Nutzung von großen Probenvolumina eine höhere diagnostische Sensitivität erreichbar wird. Dies ist u. a. in der Lebensmitteldiagnostik wichtig. Hier erfolgt der Nachweis von Lebensmittelpathogenen durch eine Kultivierung der Ausgangsprobe in einem Stomacher-Beutel und einem spezifischen Kultivierungsmedium. Die Erregerkultivierung benötigt mehrere Stunden bis Tage. Danach wird 1 ml der Kultur für die Nukleinsäureisolierung und nachfolgende PCR eingesetzt. Damit ist die Zeitspanne bis zum Vorliegen des diagnostischen Ergebnisses extrem lange. Mittels der erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Kultivierungszeit deutlichst reduziert werden, da anstelle der üblichen 1 ml Probe ein sehr viel größeres Probenvolumen eingesetzt und damit die Sensitivität erhöht werden. Nach Adsorption der Bakterien wird die Nukleinsäure isoliert und kann in der diagnostischen PCR eingesetzt werden. Das Ergebnis liegt dann sehr viel früher vor. Dieses Beispiel zeigt exemplarisch. das Potenzial dieser neuen Methode.A particular advantage of the method makes it possible that a higher diagnostic sensitivity can be achieved through the use of large sample volumes. This is u. a. important in food diagnostics. Here, the detection of food pathogens by culturing the original sample in a Stomacher bag and a specific culture medium. Pathogen cultivation takes several hours to days. Thereafter, 1 ml of the culture is used for the nucleic acid isolation and subsequent PCR. Thus, the time until the presence of the diagnostic result is extremely long. By means of the method according to the invention, the cultivation time can be significantly reduced since, instead of the usual 1 ml sample, a much larger sample volume is used and thus the sensitivity is increased. After adsorption of the bacteria, the nucleic acid is isolated and can be used in diagnostic PCR. The result is much earlier. This example shows an example. the potential of this new method.

Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Die Ausführungsbeispiele stellen dabei keine Limitierung der Erfindung dar.The invention will be explained in more detail with reference to embodiments. The embodiments do not represent a limitation of the invention.

Ausführungsbeispieleembodiments

Ausführungsbeispiel 1:Embodiment 1

Anreicherung von NIH 3T3 Zellen aus einer Suspension und nachfolgende Isolierung der genomischen DNA aus den ZellenEnrichment of NIH 3T3 cells from a suspension and subsequent isolation of the genomic DNA from the cells

Jeweils 2,5 × 10⁶ NIH 3T3 Zellen wurden in 1 ml Wasser resuspendiert.Each 2.5 x 10 ⁶ NIH 3T3 cells were resuspended in 1 ml of water.

Zugabe von 15 μl einer Bead-Suspension (Eisenoxydpartikel mit OH-Funktionalisierung; Menge ca. 5 mg) zur Zellsuspension. Mischen der Probe und Inkubation unter Schütteln für 30 min bei Raumtemperatur.Add 15 μl of a bead suspension (iron oxide particles with OH-functionalization, amount about 5 mg) to the cell suspension. Mix the sample and incubate with shaking for 30 min at room temperature.

Separation der Beads mittels eines Magneten.Separation of the beads by means of a magnet.

Überführen des Überstandes in ein neues Gefäß. Der Überstand wurde nachfolgend auf das Vorhandensein von nichtadsorbierten Zellen untersucht (Isolierung der Nukleinsäure mittels eines Standardverfahrens aus dem Überstand, nach erfolgter Zentrifugation zur Pelletierung von eventuell vorkommenden Zellen).Transfer the supernatant into a new vessel. The supernatant was assayed for the presence of non-adsorbed cells (isolation of the nucleic acid by a standard procedure from the supernatant, after centrifugation to pellet any cells that may be present).

Die Beads wurden nachfolgend mit einem Hochsalzpuffer (4M Guanidinthiocyanat) zur Zelllyse für 10 min bei Raumtemperatur und kontinuierlichem Schütteln inkubiert. Nachfolgend erfolgte die Zugabe von Isopropanol (gleiches Volumen wie der eingesetzte Lysepuffer). Der Ansatz wurde kurz mittels einer Pipette gemischt und für 2 min inkubiert. Dieser Schritt dient der Anbindung der nach Lyse freigesetzten Nukleinsäuren an die Beads. Nachfolgend wurden die Beads mittels eines Magneten separiert und der Überstand verworfen. Die Beads wurden dann zweimal mit 80%-igem Ethanol gewaschen und final bei 70°C für 3 min der restliche Ethanol entfernt. Nach Zugabe eines Niedrigsalzpuffers (10 mM Tris HCl) wurden die Beads resuspendiert und für 3 min bei 70°C inkubiert. Final wurden die Beads mittels eines Magneten separiert und der Überstand in ein neues Gefäß überführt. Zur Analyse der Isolierung der Nukleinsäuren wurde die DNA auf einem Agarosegel aufgetragen. Als Kontrolle dienten die korrespondierenden Überständer nach Adsorption der Zellen an die Beads. Diese Überstände wurde ebenfalls für die DNA Isolierung mittels eines Standardverfahrens eingesetzt. Es zeigt sich, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren effizient die Zellen zuerst an die Beads adsorbierten und nachfolgend mittels derselben Beads aus den Zellen die DNA isoliert werden konnte. In den korrespondierenden Überstände war keine DNA enthalten.The beads were subsequently incubated with a high salt buffer (4M guanidine thiocyanate) for cell lysis for 10 minutes at room temperature with continuous shaking. Subsequently, the addition of isopropanol (same volume as the lysis buffer used). The batch was briefly mixed by means of a pipette and incubated for 2 min. This step serves to attach the liberated after lysis nucleic acids to the beads. Subsequently, the beads were separated by means of a magnet and the supernatant discarded. The beads were then washed twice with 80% ethanol and finally the residual ethanol was removed at 70 ° C for 3 min. After addition of a low salt buffer (10 mM Tris HCl) the beads were resuspended and incubated for 3 min at 70 ° C. Finally, the beads were separated by means of a magnet and the supernatant was transferred to a new vessel. To analyze the isolation of the nucleic acids, the DNA was applied to an agarose gel. As a control, the corresponding supernatants were used after adsorption of the cells to the beads. These supernatants were also used for DNA isolation by a standard procedure. It turns out that with the method according to the invention, the cells were first adsorbed efficiently to the beads and subsequently the DNA could be isolated from the cells by means of the same beads. The corresponding supernatants contained no DNA.

1 zeigt die Analyse der isolierten Nukleinsäuren auf einem Agarosegel. 1 shows the analysis of the isolated nucleic acids on an agarose gel.

Die einzelnen Proben in 1 zeigen:

1 DNA aus den an die Beads gebundenen Zellen; Probe 1
2 Überstand von Probe 1 (keine DNA)
3 DNA aus den an die Beads gebundenen Zellen; Probe 2
4 Überstand von Probe 2 (keine DNA)
5 DNA aus den an die Beads gebundenen Zellen; Probe 3
6 Überstand von Probe 3 (keine DNA)
7 DNA aus den an die Beads gebundenen Zellen; Probe 4
8 Überstand von Probe 4 (keine DNA)

The individual samples in 1 demonstrate:

1 DNA from the cells bound to the beads; Sample 1
2 supernatant from sample 1 (no DNA)
3 DNA from the cells bound to the beads; Sample 2
4 supernatant from sample 2 (no DNA)
5 DNA from the cells bound to the beads; Sample 3
6 supernatant from sample 3 (no DNA)
7 DNA from the cells bound to the beads; Sample 4
8 supernatant from sample 4 (no DNA)

Ausführungsbeispiel 2:Embodiment 2:

Anreicherung von NIH 3T3 Zellen aus einer Suspension und nachfolgende Isolierung der genomischen DNA aus den Zellen unter Verwendung von zwei verschiedenen BeadsEnrichment of NIH 3T3 cells from a suspension and subsequent isolation of the genomic DNA from the cells using two different beads

Ziel der Untersuchung war, zu überprüfen, ob auch unfunktionalisierte Eisenoxydpartikel für die Adsorption von Zellen und eine nachfolgende Isolierung von DNA eingesetzt werden können. Verwendet wurden Eisenoxyd-Beads ohne Funktionalisierung sowie OH-funktionalisierte Eisenoxyd-Beads. Jeweils 2,5 × 10⁶ NIH 3T3 Zellen wurden in 1 ml Wasser resuspendiert.The aim of the investigation was to check whether unfunctionalized iron oxide particles can be used for the adsorption of cells and subsequent isolation of DNA. Iron oxide beads without functionalization and OH-functionalized iron oxide beads were used. Each 2.5 x 10 ⁶ NIH 3T3 cells were resuspended in 1 ml of water.

Zugabe von 15 μl einer Bead-Suspension (Eisenoxydpartikel mit OH-Funktionalisierung bzw. ohne Funktionalisierung; Menge ca. 5 mg) zur Zellsuspension. Mischen der Probe und Inkubation unter Schütteln für 30 min bei Raumtemperatur.Add 15 μl of a bead suspension (iron oxide particles with OH functionalization or without functionalization, amount about 5 mg) to the cell suspension. Mix the sample and incubate with shaking for 30 min at room temperature.

Die Beads wurden nachfolgend mit einem Hochsalzpuffer (4M Guanidinthiocyanat) zur Zelllyse für 10 min bei Raumtemperatur und kontinuierlichem Schütteln inkubiert. Nachfolgend erfolgte die Zugabe von Isopropanol (gleiches Volumen wie der eingesetzte Lysepuffer). Der Ansatz wurde kurz mittels einer Pipette gemischt und für 2 min inkubiert. Dieser Schritt dient der Anbindung der nach Lyse freigesetzten Nukleinsäuren an die Beads. Nachfolgend wurden die Beads mittels eines Magneten separiert und der Überstand verworfen. Die Beads wurden dann zweimal mit 80%igem Ethanol gewaschen und final bei 70°C für 3 min der restliche Ethanol entfernt. Nach Zugabe eines Niedrigsalzpuffers (10 mM Tris HCl) wurden die Beads resuspendiert und für 3 min bei 70°C inkubiert. Final wurden die Beads mittels eines Magneten separiert und der Überstand in ein neues Gefäß überführt. Zur Analyse der Isolierung der Nukleinsäuren wurde die DNA auf einem Agarosegel aufgetragen. Als Kontrolle dienten die korrespondierenden Überständer nach Adsorption der Zellen an die Beads. Diese Überständen wurde ebenfalls für die DNA-Isolierung mittels eines Standardverfahrens eingesetzt. Es zeigt sich, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sowohl mit funktionalisierten Beads als auch mit unfunktionalisierten Beads effizient die Zellen zuerst an die Beads adsorbierten und nachfolgend mittels derselben Beads aus den Zellen die DNA isoliert werden konnte.The beads were subsequently incubated with a high salt buffer (4M guanidine thiocyanate) for cell lysis for 10 minutes at room temperature with continuous shaking. Subsequently, the addition of isopropanol (same volume as the lysis buffer used). The batch was briefly mixed by means of a pipette and incubated for 2 min. This step serves to attach the liberated after lysis nucleic acids to the beads. Subsequently, the beads were separated by means of a magnet and the supernatant discarded. The beads were then washed twice with 80% ethanol and finally the residual ethanol was removed at 70 ° C for 3 min. After addition of a low salt buffer (10 mM Tris HCl), the beads were resuspended and incubated for 3 min at 70 ° C. Finally, the beads were separated by means of a magnet and the supernatant was transferred to a new vessel. To analyze the isolation of the nucleic acids, the DNA was applied to an agarose gel. As a control, the corresponding supernatants were used after adsorption of the cells to the beads. These supernatants were also used for DNA isolation by a standard procedure. It turns out that with the method according to the invention, both with functionalized beads and with unfunctionalized beads, the cells were first adsorbed efficiently to the beads and subsequently the DNA could be isolated from the cells by means of the same beads.

Dabei wurde der Beweis erbracht, dass auch native Eisenoxydpartikel für eine effiziente Adsorption von Zellen und eine nachfolgende Isolierung der DNA geeignet sind. In den korrespondierenden Überstände war keine DNA enthalten.Proof has been furnished that native iron oxide particles are also suitable for efficient adsorption of cells and subsequent isolation of the DNA. The corresponding supernatants contained no DNA.

2 zeigt die Analyse der isolierten Nukleinsäuren auf einem Agarosegel. 2 shows the analysis of the isolated nucleic acids on an agarose gel.

Die einzelnen Proben in 2 zeigen:

1 DNA Leiter
2 DNA aus den an die OH-funktionalisierten Beads gebundenen Zellen; Probe 1
3 Überstand von Probe 1 (keine DNA)
4 DNA aus, den an die OH-funktionalisierten Beads gebundenen Zellen; Probe 2
5 Überstand von Probe 2 (keine DNA)
6 DNA aus den an die unfunktionalisierten Beads gebundenen Zellen; Probe 3
7 Überstand von Probe 3 (keine DNA)
8 DNA aus den an die unfunktionalisierten Beads gebundenen Zellen; Probe 4
9 Überstand von Probe 4 (keine DNA)

The individual samples in 2 demonstrate:

1 DNA ladder
2 DNA from the cells bound to the OH-functionalized beads; Sample 1
3 supernatant from sample 1 (no DNA)
4 DNA from, the cells bound to the OH-functionalized beads; Sample 2
5 supernatant from sample 2 (no DNA)
6 DNA from the cells bound to the unfunctionalized beads; Sample 3
7 supernatant from sample 3 (no DNA)
8 DNA from the cells bound to the unfunctionalized beads; Sample 4
9 supernatant from sample 4 (no DNA)

Ausführungsbeispiel 3: Embodiment 3

Anreicherung von NIH 3T3 Zellen aus einer Suspension und nachfolgende Isolierung der genomischen DNA aus den Zellen. Testung des Einflusses der Inkubationszeit von Beads und Zellen.Enrichment of NIH 3T3 cells from a suspension and subsequent isolation of the genomic DNA from the cells. Testing the influence of the incubation time of beads and cells.

Ziel der Untersuchung war, zu überprüfen, ob die Adsorption der Zellen an die Beads auch in sehr kurzer Zeit effizient möglich ist. Jeweils 2,5 × 10⁶ NIH 3T3 Zellen wurden in 1 ml Wasser resuspendiert. Zugabe von 15 μl einer Bead-Suspension (Eisenoxydpartikel mit OH-Funktionalisierung bzw. ohne Funktionalisierung; Menge ca. 5 mg) zur Zellsuspension. Mischen der Probe und Inkubation unter Schütteln für 2 min bzw. für 15 min bei Raumtemperatur. Separation der Beads mittels eines Magneten. Überführen des Überstandes in ein neues Gefäß. Der Überstand wurde nachfolgend auf das Vorhandensein von nichtadsorbierten Zellen untersucht (Isolierung der Nukleinsäure mittels eines Standardverfahrens aus dem Überstand, nach erfolgter Zentrifugation zur Pelletierung von eventuell vorkommenden Zellen).The aim of the investigation was to check whether the adsorption of the cells to the beads is also efficiently possible in a very short time. Each 2.5 x 10 ⁶ NIH 3T3 cells were resuspended in 1 ml of water. Add 15 μl of a bead suspension (iron oxide particles with OH functionalization or without functionalization, amount about 5 mg) to the cell suspension. Mix the sample and incubate with shaking for 2 min or 15 min at room temperature. Separation of the beads by means of a magnet. Transfer the supernatant into a new vessel. The supernatant was assayed for the presence of non-adsorbed cells (isolation of the nucleic acid by a standard procedure from the supernatant, after centrifugation to pellet any cells that may be present).

Die Beads wurden nachfolgend mit einem Hochsalzpuffer (4M Guanidinthiocyanat) zur Zelllyse für 10 min bei Raumtemperatur und kontinuierlichem Schütteln inkubiert. Nachfolgend erfolgte die Zugabe von Isopropanol (gleiches Volumen wie der eingesetzte Lysepuffer). Der Ansatz wurde kurz mittels einer Pipette gemischt und für 2 min inkubiert. Dieser Schritt dient der Anbindung der nach Lyse freigesetzten Nukleinsäuren an die Beads. Nachfolgend wurden die Beads mittels eines Magneten separiert und der Überstand verworfen. Die Beads wurden dann zweimal mit 80%igem Ethanol gewaschen und final bei 70°C für 3 min der restliche Ethanol entfernt. Nach Zugabe eines Niedrigsalzpuffers (10 mM Tris HCl) wurden die Beads resuspendiert und für 3 min bei 70°C inkubiert. Final wurden die Beads mittels eines Magneten separiert und der Überstand in ein neues Gefäß überführt. Zur Analyse der Isolierung der Nukleinsäuren wurde die DNA auf einem Agarosegel aufgetragen. Als Kontrolle dienten die korrespondierenden Überständer nach. Adsorption der Zellen an die Beads. Diese Überständen wurde ebenfalls für die DNA-Isolierung mittels eines Standardverfahrens eingesetzt. Es zeigt sich, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren die Adsorption der Zellen an die Beads auch bei sehr kurzen Inkubationszeiten möglich ist. In den korrespondierenden Überstände war keine DNA enthalten.The beads were subsequently incubated with a high salt buffer (4M guanidine thiocyanate) for cell lysis for 10 minutes at room temperature with continuous shaking. Subsequently, the addition of isopropanol (same volume as the lysis buffer used). The batch was briefly mixed by means of a pipette and incubated for 2 min. This step serves to attach the liberated after lysis nucleic acids to the beads. Subsequently, the beads were separated by means of a magnet and the supernatant discarded. The beads were then washed twice with 80% ethanol and finally the residual ethanol was removed at 70 ° C for 3 min. After addition of a low salt buffer (10 mM Tris HCl), the beads were resuspended and incubated for 3 min at 70 ° C. Finally, the beads were separated by means of a magnet and the supernatant was transferred to a new vessel. To analyze the isolation of the nucleic acids, the DNA was applied to an agarose gel. As a control served the corresponding superstores. Adsorption of the cells to the beads. These supernatants were also used for DNA isolation by a standard procedure. It turns out that with the method according to the invention the adsorption of the cells to the beads is possible even with very short incubation times. The corresponding supernatants contained no DNA.

3 zeigt die Analyse der isolierten Nukleinsäuren auf einem Agarosegel. 3 shows the analysis of the isolated nucleic acids on an agarose gel.

Die einzelnen Proben in 3 zeigen:

1 DNA Leiter
2 Inkubation 2 min; DNA aus den an die Beads gebundenen Zellen; Probe 1
3 Überstand von Probe 1 (keine DNA)
4 Inkubation 2 min; DNA aus den an die Beads gebundenen Zellen; Probe 2
5 Überstand von Probe 2 (keine DNA)
6 Inkubation 15 min DNA aus den an die Beads gebundenen Zellen; Probe 3
7 Überstand von Probe 3 (keine DNA)
8 Inkubation 15 min; DNA aus den an die gebundenen Zellen; Probe 4
9 Überstand von Probe 4 (keine DNA)

The individual samples in 3 demonstrate:

1 DNA ladder
2 incubation 2 min; DNA from the cells bound to the beads; Sample 1
3 supernatant from sample 1 (no DNA)
4 incubation 2 min; DNA from the cells bound to the beads; Sample 2
5 supernatant from sample 2 (no DNA)
6 Incubation 15 min DNA from the cells bound to the beads; Sample 3
7 supernatant from sample 3 (no DNA)
8 incubation 15 min; DNA from the bound cells; Sample 4
9 supernatant from sample 4 (no DNA)

Ausführungsbeispiel 4:Embodiment 4

Anreicherung von Salmonellen aus einer wässrigen Probe und nachfolgende Isolierung der bakteriellen Nukleinsäure sowie Nachweis der isolierten DNA auf einem kommerziellen StreifentestEnrichment of Salmonella from an aqueous sample and subsequent isolation of the bacterial nucleic acid and detection of the isolated DNA on a commercial strip test

Jeweils ca. 500 bzw. 250 Salmonellen wurden in 1.0 ml, 1.5 ml bzw. 10 ml Wasser gespiked. Die Anreicherung der Bakterien und die Isolierung der bakteriellen Nukleinsäure erfolgte wie folgt.Approximately 500 or 250 Salmonella were spiked into 1.0 ml, 1.5 ml and 10 ml of water, respectively. The accumulation of the bacteria and the isolation of the bacterial nucleic acid was carried out as follows.

Zugabe von 5 μl einer Bead-Suspension (Eisenoxydpartikel mit OH-Funktionalisierung; Menge ca. 1.5 mg) zur jeweiligen Probe. Mischen der Probe und Inkubation unter Schütteln für 30 min bei Raumtemperatur.Addition of 5 μl of a bead suspension (iron oxide particles with OH functionalization, amount about 1.5 mg) to the respective sample. Mix the sample and incubate with shaking for 30 min at room temperature.

Die Beads wurden nachfolgend mit Lösungen aus einem kommerziellen Kit zur Isolierung von Nukleinsäuren (innuPREP DNA Mini Kit; Analytik Jena AG) behandelt. Die Beads wurden dazu mit 300 μl eines Lysepuffers (Lysis Solution TLS) sowie 25 μl Proteinase K (20 mg/ml) versetzt und resuspendiert. Dann erfolgte eine Inkubation bei 70°C für 15 min. Nach Lyse erfolgte die Zugabe von 300 μl eines Bindungspuffers (Binding Solution TBS). Die Probe wurde sorgfältig gemischt und für 2 min bei Raumtemperatur inkubiert. Dieser Schritt dient der Anbindung der nach Lyse freigesetzten bakteriellen Nukleinsäuren an die Beads. Nachfolgend wurden die Beads mittels eines Magneten separiert und der Überstand verworfen. Die Beads wurden dann zweimal mit Waschpuffer (Washing Solution MS) gewaschen und final bei 70°C für 3 min der restliche Ethanol entfernt. Nach Zugabe eines Niedrigsalzpuffers (Elution Buffer) wurden die Beads resuspendiert und für 3 min bei 70°C inkubiert. Final wurden die Beads mittels eines Magneten separiert und der Überstand in ein neues Gefäß überführt.The beads were subsequently treated with solutions from a commercial kit for the isolation of nucleic acids (innuPREP DNA Mini Kit, Analytik Jena AG). The beads were mixed with 300 ul of a lysis buffer (Lysis Solution TLS) and 25 ul proteinase K (20 mg / ml) and resuspended. Then incubation was carried out at 70 ° C for 15 min. After lysis, 300 μl of a binding buffer (Binding Solution TBS) were added. The sample was mixed thoroughly and incubated for 2 min at room temperature. This step serves to attach the released after lysis bacterial nucleic acids to the beads. Subsequently, the beads were separated by means of a magnet and the supernatant discarded. The beads were then washed twice with Washing Solution MS and finally the residual ethanol was removed at 70 ° C for 3 min. After addition of a low-salt buffer (elution buffer), the beads were resuspended and incubated for 3 min at 70 ° C. Finally, the beads were separated by means of a magnet and the supernatant was transferred to a new vessel.

Der Nachweis einer erfolgreichen Anreicherung und Nukleinsäureextraktion aus den Proben erfolgte mittel eines kommerziellen Testsystems zum Nachweis von Salmonellen (rapidSTRIPE Salmonella Assay).The proof of a successful enrichment and nucleic acid extraction from the samples was carried out by means of a commercial test system for Detection of Salmonella (rapidSTRIPE Salmonella Assay).

Es zeigt sich, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Salmonellen an die eingesetzten Beads adsorbierten und nachfolgend mittels derselben Beads aus den Salmonellen. DNA isoliert und nachgewiesen werden konnte. Wichtig ist dabei, dass sich das Verfahren auch dazu eignet, aus großvolumigen Proben (10 ml) Bakterien anzureichern und nachfolgend Nukleinsäuren zu isolieren. Dies ist entscheidend, wenn eine größere Sensitivität nur über ein größeres Probenvolumen möglich wird.It turns out that with the method according to the invention Salmonella adsorbed on the beads used and subsequently by means of the same beads from the Salmonella. DNA could be isolated and detected. It is important that the method is also suitable for enriching bacteria from large-volume samples (10 ml) and subsequently isolating nucleic acids. This is crucial if greater sensitivity is only possible over a larger sample volume.

Darüber hinaus zeigt sich, dass die Isolierung der Nukleinsäuren mit Reagenzien von kommerziell verfügbaren Kits durchführbar ist.In addition, it has been found that isolation of the nucleic acids with reagents from commercially available kits is feasible.

Auf 4 ist der Nachweis der angereicherten Salmonellen mittels des rapidSTRIPE Salmonella Assays auf Lateral Flow Teststreifen zu erkennen.On 4 the detection of enriched salmonella can be detected by means of the rapidSTRIPE Salmonella assay on lateral flow test strips.

Die einzelnen Proben in 4 zeigen:

1 ca. 500 Kopien Salmonellen aus 1.0 ml Wasser
2 ca. 500 Kopien Salmonellen aus 1.5 ml Wasser
3 ca. 250 Kopien Salmonellen aus 1.0 ml Wasser
4 ca. 250 Kopien Salmonellen aus 1.5 ml Wasser
5 ca. 500 Kopien Salmonellen aus 10 ml Wasser
6 Positivkontrolle
7 Negativkontrolle

The individual samples in 4 demonstrate:

1 about 500 copies of salmonella from 1.0 ml of water
2 about 500 copies of salmonella from 1.5 ml of water
3 about 250 copies of salmonella from 1.0 ml of water
4 about 250 copies of salmonella from 1.5 ml of water
5 about 500 copies of salmonella from 10 ml of water
6 positive control
7 negative control

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

DE 4139664 A1 [0008]
US 5234809 [0009]
WO 95/34569 A [0011]
EP 1135479 [0012]
DE 4321904 [0013]

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T., 1989, CSH, "Molecular Cloning" [0002]
Vogelstein and Gillespie (Proc Natl Acad Sci., USA, 1979, 76, 61 5-619 [0004]
Marko, MA, Chipperfield, R. and Birnboim, HG, 1982, Anal. Biochem., 121, 382-387 [0006]
Glass Milk, BIO 101, La Jolla, CA [0008]
Journal of Virology (Vol 83, No. 10, 2009) [0020]

Claims

Method for enrichment of bacteria, cells or viruses from biological samples, characterized in that the sample is transferred into a liquid sample and mixed with magnetic particles and then these magnetic particles are removed with the adsorbed bacteria, cells or viruses from the liquid sample.

A method according to claim 1, characterized in that it is the ferromagnetic or paramagnetic particles in the magnetic particles.

Method according to claim 1 or 2, characterized in that the magnetic particles are a) silicate magnetic particles or b) particles of iron oxide is.

A method according to claim 3, characterized in that the iron oxide particles are non-functionalized or functionalized iron oxide particles, preferably OH- or COO-functionalized

A method according to claim 3 or 4, characterized in that the iron oxide particles have a size of 10 nm to 5 microns, preferably from 50 nm to 1 micron, more preferably from 100 to 300 nm.

Method according to one of claims 1 to 5, characterized in that the cells are eukaryotic or prokaryotic cells.

Method according to one of claims 1 to 6, characterized in that the biological samples are blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, saliva, water, urine, stool samples, cell culture suspensions, culture media or culture media from stomacher bags of food diagnostics.

Method according to one of claims 1 to 7, characterized in that the output volume is arbitrary.

Process for the subsequent isolation of nucleic acids from the bacteria, cells or viruses enriched according to one of claims 1 to 8 from biological samples, characterized in that the enriched bacteria, cells or viruses are lysed by known methods and the nucleic acids are isolated by a known method.

Method according to claim 9, characterized by the following steps: a) Separation of the magnetic particles with the adsorbed bacteria, cells or viruses from the liquid sample by means of a magnet and discarding the supernatant b) washing the magnetic particles with the adsorbed bacteria, cells or viruses c) adding a lysis buffer to the washed magnetic particles with the adsorbed bacteria, cells or viruses and lysing the biomolecules to release the nucleic acids d) addition of a binding buffer or alcohol to attach the nucleic acids to a solid phase e) washing the solid phase with the bound nucleic acids f) elution of the nucleic acids from the solid phase with water or a low salt buffer.

A method according to claim 10, characterized in that the same magnetic particles as in claim 1 are used as the solid phase.

Use of the method according to one of claims 7 to 11 as a "one-tube method" or "walk-away process".

Use of magnetic particles according to claim 1 for isolation of bacteria, cells or viruses from biological samples.

Use of magnetic particles according to claim 1 for the separation of bacteria, cells or viruses from free proteins of a biological sample.