DE102009045924A1 - Analysis of influence of substances on nerve fibers of projection systems comprises culturing e.g. first tissue sample isolated from first region of CNS of animal, adding substance to be examined, determining and analysis of fiber property - Google Patents

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    • G01N33/5058—Neurological cells

Abstract

Analysis of the influence of substances on nerve fibers of projection systems, comprises (a) culturing e.g. (i) at least a first tissue sample, which is isolated from a first region of the CNS of an animal, (ii) at least a second tissue sample, which is isolated from a second region of the CNS of an animal, under cell culture conditions, (b) adding the substance to be examined, (c) determining whether the tissue samples between (i) and (ii) fiber tracts have formed, and (d) analysis of the fiber properties in the resulting images. Analysis of the influence of substances on nerve fibers of projection systems, comprises (a) culturing (i) at least a first tissue sample, which is isolated from a first region of the CNS of an animal, (ii) at least a second tissue sample, which is isolated from a second region of the CNS of an animal, under cell culture conditions, where the tissue samples (i) and (ii) are applied at the beginning of the culture side by side on a membrane, (b) adding the substance to be examined, (c) determining whether the tissue samples between (i) and (ii) fiber tracts have formed, and representing the fiber tracts with imaging methods, and (d) analysis of the fiber properties in the resulting images, where step (d) comprises (d1) thinning and extracting the fibers, (d2) determining nodal point of the extracted fibers and continuously reconstructing the fiber tracts between the nodal points, (d3) continuous representation, graph-based and/or interpolated representation of the fibers, where at least one of the following fiber parameters is determined as follows: (d4) determining the fiber density by calculating the proportion of foreground structures in the total image size or the number of edges by the graph-based representation of the fibers, (d5) determining the linearity of the fiber growth by calculating the angular distribution along the main growth direction and/or by main component analysis to determine the variation of orthogonal to the main growth direction based on the continuous representation and/or the interpolated representation and/or by analyzing the curvature along the fibers based on the continuous representation. Independent claims are included for: (1) a computer program product, in which step (d) of the process is carried out; (2) a computer or a data processing system on which the computer program product is installed; (3) a disk on which the computer program product is stored; and (4) a test system, preferably for the examination of the influence of substances on nerve fibers of projection system, comprising a computer program product, a computer or a data processing system or a disk and at least one of the other components comprising cell culture media, tracer, fixative, reference substances, an imaging system and manual.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und Testsystem zur Untersuchung des Einflusses von Substanzen, einschließlich Wirkstoffen oder Wirkstoffkandidaten, auf Nervenfasern von Projektionssystemen, insbesondere deren Wachstum und Ausrichtung.The present invention relates to a method and assay system for investigating the influence of substances, including drugs or drug candidates, on nerve fibers of projection systems, in particular their growth and alignment.

Stand der Technik:State of the art:

Das zielgerichtete Wachstum von neuronalen Fortsätzen und Faserprojektionen ist bei normalen physiologischen Wachstumsvorgängen sowie bei Regenerations- und Reorganisationsprozessen nach Schädigung des Nervensystems (z. B. ischämische und traumatische Ereignisse des Gehirns bzw. Verletzungen des Rückenmarks) von Bedeutung. Weiterhin resultieren pathophysiologische Krankheitsbilder wie Parkinson und Schizophrenie in Veränderungen und Verlust neuronaler Strukturen, verbunden mit Schädigungen der beteiligten Projektionssysteme. Aufgrund der Tatsache, dass viele neurologische Erkrankungen bis heute nur unzureichend erforscht sind und ein wachsendes Interesse besteht, Substanzen zu entwickeln, die regenerative Prozesse unterstützen können, steht die Suche nach geeigneten Modellen zur Wirkstofftestung im Vordergrund. Methoden, welche eine zuverlässige Quantifizierung dieser Ergebnisse erlauben, sind in Kombination mit den entsprechenden Wachstumsmodellen von besonderer Bedeutung.The targeted growth of neuronal processes and fiber projections is important in normal physiological growth processes as well as in regeneration and reorganization processes after damage to the nervous system (eg ischemic and traumatic events of the brain or injuries of the spinal cord). Furthermore, pathophysiological conditions such as Parkinson's and schizophrenia result in changes and loss of neuronal structures, associated with damage to the involved projection systems. Due to the fact that many neurological diseases are still insufficiently researched and there is a growing interest in developing substances that can support regenerative processes, the search for suitable models for drug testing is in the foreground. Methods that allow reliable quantification of these results are of particular importance in combination with the corresponding growth models.

Es wurden bislang vorwiegend Zellkulturmodelle verwendet, um den Einfluss bestimmter Substanzen auf das Zellwachstum zu untersuchen ( D' Ambrosi et al., Neuroscience 2001, 108: 527–534 ). Dabei beziehen sich die Substanztestungen zum großen Teil auf Primärzell-Kulturen und Einzelzell-Kulturen. In diesen Modellen werden Zellen genutzt, die während der Präparation aus ihrem intakten Umfeld gelöst werden und damit kommt es zur Zerstörung von Zell-Zell-Verbindungen, Verschaltungen und Interaktionen. Aussagen zum Verhalten der Zellen im Zellverbund und zum Einfluss der Substanzen auf die Entwicklung von Projektionssystemen können nicht mehr getroffen werden.So far, predominantly cell culture models have been used to investigate the influence of certain substances on cell growth ( D 'Ambrosi et al., Neuroscience 2001, 108: 527-534 ). The substance tests are largely based on primary cell cultures and single-cell cultures. These models use cells that are released from their intact environment during dissection, destroying cell-cell connections, interconnections, and interactions. Statements about the behavior of the cells in the cell network and the influence of the substances on the development of projection systems can no longer be made.

Die Vorteile von Primärzell-Kulturen und Einzelzell-Kulturen sind ihre einfache Zugänglichkeit und der überschaubare präparative Aufwand, der benötigt wird, um in kurzer Zeit eine große Anzahl potentieller Substanzen zu testen. Bedeutende Nachteile dieser Modelle bestehen in der Künstlichkeit des Systems (Loslösen der Zellen aus dem Zellverband), da entweder primäre Zellen von embryonalem Gewebe bzw. Zelllinien verwendet werden, die in ihrem Verhalten deutlich von den in vivo-Bedingungen abweichen. Weiterhin können durch präparative Maßnahmen (Zellpassagierung) sowie durch das Fehlen des natürlichen Zellverbundes bzw. der afferenten und efferenten neuronalen Verschaltungen adaptive Veränderungen in Morphologie und Funktion entstehen. Somit können die erhaltenen Aussagen und Ergebnisse nicht zweifelsfrei auf die in vivo Bedingungen übertragen werden.The advantages of primary cell cultures and single cell cultures are their easy accessibility and the manageable preparative effort needed to test a large number of potential substances in a short time. Significant disadvantages of these models are the artificial nature of the system (detachment of the cells from the cell structure), since either primary cells of embryonic tissue or cell lines are used, which differ significantly in their behavior from the in vivo conditions. Furthermore, adaptive changes in morphology and function can occur through preparative measures (cell passage) as well as through the absence of the natural cell network or the afferent and efferent neuronal interconnections. Thus, the statements and results obtained can not be unequivocally transferred to the in vivo conditions.

Der Einsatz von organotypischen Gewebe-Kulturen einzelner Hirnregionen, in denen intakte Gewebeschnitte kultiviert werden, ermöglicht umfassendere Aussagen zum Verhalten der Zellen im Zellverband, da die unmittelbaren Nachbarschaftsbeziehungen erhalten bleiben, womit diese Kultivierungstechnik für vielfältige Studien verwendet werden kann ( Noraberg et al., Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 2005, 4: 435–452 ; Cho et al., Curr Neuropharmacol. 2007, 5: 19–33 ). DE 10 2004 048 462 B4 offenbart z. B. ein Modellsystem zum Testen von pharmazeutischen Zubereitungen auf die Wirksamkeit bei entzündlichen Prozessen. In diesem werden Gewebeschnitte eines neuronalen Gewebes (wie z. B. des Hippocampus) ex vivo auf einer Membran mit einer Porengröße von mindestens 0,02 μm kultiviert. Die Gewebeschnitte werden unter geeigneten Kulturbedingungen proinflammatorischen Botenstoffen oder Inflammogenen ausgesetzt, um die Wirksamkeit dieser pharmazeutischen Zubereitungen hinsichtlich ihrer antientzündlichen Effekte im Nervensystem zu testen.The use of organotypic tissue cultures of individual brain regions, in which intact tissue sections are cultivated, allows more comprehensive statements on the behavior of the cells in the cell structure, since the immediate neighborhood relationships are preserved, so that this cultivation technique can be used for a variety of studies ( Noraberg et al., Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 2005, 4: 435-452 ; Cho et al., Curr Neuropharmacol. 2007, 5: 19-33 ). DE 10 2004 048 462 B4 discloses z. A model system for testing pharmaceutical preparations for efficacy in inflammatory processes. In it, tissue sections of a neuronal tissue (such as the hippocampus) are cultured ex vivo on a membrane having a pore size of at least 0.02 μm. The tissue sections are exposed to proinflammatory messengers or inflammogens under suitable culture conditions to test the efficacy of these pharmaceutical preparations for their anti-inflammatory effects in the nervous system.

Dagegen bietet diese Kulturform, die Einzelschnitt-Kultivierung, keine Möglichkeit der Analyse von Projektionssystemen, d. h. die Beobachtung von Faserverbindungen und -verschaltungen zwischen räumlich weiter entfernten bzw. tieferen Hirnstrukturen (z. B. dem Mesencephalon) und dem Cortex. Gewebe-Kulturen einzelner regional getrennter Hirnregionen, welche im Vergleich zu Einzelzell-Kulturen ein komplexeres System darstellen, spiegeln weiterhin nur partiell die in vivo-Situationen wieder, da sie keine Aussagen über die Ausbildung von Faserbahnen zwischen den in vivo kommunizierenden Regionen ermöglichen. Die Entwicklung von Projektionsbahnen bzw. das Studium des targetorientierten Faserwachstums kann durch die Kultivierung einzelner Gewebeschnitte somit nicht berücksichtigt werden.On the other hand, this culture form, single-cut cultivation, does not offer a possibility of analyzing projection systems, ie. H. the observation of fiber connections and interconnections between more distant and deeper brain structures (eg the mesencephalon) and the cortex. Tissue cultures of individual regionally separate brain regions, which represent a more complex system compared to single-cell cultures, still only partially reflect the in vivo situations, since they do not make any statements about the formation of fiber tracts between the in vivo communicating regions. The development of projection pathways or the study of target-oriented fiber growth can thus not be taken into account by the cultivation of individual tissue sections.

Ein weiterer Nachteil der zur Verfügung stehenden Testsysteme besteht in dem Fehlen eines Gesamtverfahrens (Kombination von Gewebe-Co-Kultur-Technik, Substanzapplikation und computergestützter, bildbasierter Auswertung/Analyse des Faserwachstums), welches die Kultivierung und Auswertung einschließt und zu einer verbesserten Genauigkeit, Ausbeute und Vergleichbarkeit führt.A further disadvantage of the available test systems is the lack of an overall method (combination of tissue co-culture technique, substance application and computer-assisted image-based analysis / analysis of fiber growth), which includes culturing and evaluation and improved accuracy, yield and comparability.

Die Auswertung der Bilddaten wurde bisher größtenteils manuell vorgenommen. Weiterhin stehen kommerzielle Softwaresysteme wie NeuroLucida (MBF Bioscience, Williston, VT, USA) zur Verfügung, mit deren Hilfe sich gewisse geometrische Eigenschaften bestimmen lassen, nach manueller Einzeichnung der Fasern. Automatische Auswertungsverfahren beschränkten sich bisher überwiegend auf die Untersuchung der Eigenschaften gesamter Gewebsregionen ( Pakura et al. SSIAI 2002: 62–66 ). Zum dreidimensionalen Tracing von Neuronen in konfokalen und teils auch in lichtmikroskopischen Datensätzen existieren ebenfalls verschiedene Ansätze, die größtenteils semi-automatisch die neuronalen Strukturen extrahieren. Die ausgewerteten Eigenschaften beziehen sich meist auf die Baumstrukturen der Fortsätze sowie deren Längen ( He et al., Microsc. Microanal. 2003. 9, 296–310 ; Meijering et al. Cytometry Part A 2004, Gillies et al. International Journal of Machine Graphics and Vision 1998, 7 ).The evaluation of the image data has mostly been done manually. Furthermore, there are commercial software systems such as NeuroLucida (MBF Bioscience, Williston, VT, USA) With the help of which certain geometric properties can be determined, after manual marking of the fibers. Automatic evaluation methods have so far been limited mainly to the examination of the properties of entire tissue regions ( Pakura et al. SSIAI 2002: 62-66 ). For the three-dimensional tracing of neurons in confocal and partly also in light microscopic data sets, there are also different approaches, which mostly semi-automatically extract the neuronal structures. The evaluated properties mostly refer to the tree structures of the extensions as well as their lengths ( He et al., Microsc. Microanal. 2003. 9, 296-310 ; Meijering et al. Cytometry Part A 2004, Gillies et al. International Journal of Machine Graphics and Vision 1998, 7 ).

Methoden zur Auswertung von Bilddaten biologischer Präparate werden auch in folgenden Patentveröffentlichungen genannt: US 5,850,464 offenbart ein Verfahren zur Identifizierung von Myelin-ummantelten Axonfasern in Bilddaten, die durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) erhalten wurden. Das Verfahren soll durch Graustufenanalyse die Co-Lokalisation von Myelinmantel und Axonen aufzeigen. US 5,231,580 offenbart eine Methode zur Auswertung der Eigenschaften von Nervenfasern aus Querschnitten (cross sections) mit Hilfe einer elektronischen Kamera. US 6,993,170 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung geometrischer Eigenschaften von Blutgefässen (wie Durchmesser und Fläche) durch automatisierte Bildanalyse von gefärbten histologischen Gewebeschnitten.Methods for the evaluation of image data of biological preparations are also mentioned in the following patent publications: US 5,850,464 discloses a method for identifying myelin sheathed axon fibers in image data obtained by transmission electron microscopy (TEM). The method is intended to show the co-localization of myelin sheath and axons by grayscale analysis. US 5,231,580 discloses a method for evaluating the properties of nerve fibers from cross sections using an electronic camera. US 6,993,170 discloses a method for determining geometric characteristics of blood vessels (such as diameter and area) by automated image analysis of stained histological tissue sections.

Hinsichtlich der Auswertung der Fasern haben die existierenden Verfahren verschiedene Nachteile. Die Nachteile einer manuellen qualitativen Auswertung sind die Subjektivität und schlechte Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, was eine statistische Aussage über die Daten erschwert. Die meisten automatischen oder semi-automatischen Methoden zur Extraktion, Rekonstruktion und Analyse von Neuronen oder neuronalen Fasern beruhen auf dreidimensionalen Bildgebungsverfahren. Automatisch extrahierte Maße beschränken sich auf die Länge der Fortsätze, die Fläche oder den Verzweigungsgrad. Zusammengefasst kann festgestellt werden, dass die erhältlichen kommerziellen Softwarelösungen und Bildverarbeitungsmethoden entweder einen hohen Anteil an manueller Bearbeitung erfordern oder auf eine dreidimensionale Rekonstruktion der Daten abzielen. Beides ist nicht optimal für eine Quantifizierung des Einflusses verschiedener Substanzen auf das neuronale Wachstum in Gewebe-Co-Kulturmodellen unter den genannten Bedingungen. Eine besondere Schwierigkeit besteht dabei in der Extraktion und Analyse von einzelnen Fasern aus zweidimensionalen Daten. Daher beschränken sich die quantitativen Untersuchungen üblicherweise auf die Auswertung der Faserdichte und ähnlicher globaler Maße.With regard to the evaluation of the fibers, the existing methods have various disadvantages. The disadvantages of a manual qualitative evaluation are the subjectivity and poor reproducibility of the results, which makes a statistical statement about the data difficult. Most automatic or semi-automatic methods for extraction, reconstruction and analysis of neurons or neuronal fibers are based on three-dimensional imaging techniques. Automatically extracted dimensions are limited to the length of the extensions, the area, or the degree of branching. In summary, the available commercial software solutions and image processing methods either require a high amount of manual processing or are aimed at a three-dimensional reconstruction of the data. Both are not optimal for quantifying the influence of various substances on neuronal growth in tissue co-culture models under the conditions mentioned. A particular difficulty is the extraction and analysis of individual fibers from two-dimensional data. Therefore, quantitative studies are usually limited to the evaluation of fiber density and similar global dimensions.

Aufgabe:Task:

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und ein Testsystem (Kit) bereitzustellen, welche die Untersuchung des Einflusses von Substanzen auf Nervenfasern bzw. Faserbahnen von Projektionssystemen ex vivo ermöglicht. Insbesondere soll durch die Erfindung ein System bereit gestellt werden, welches die Kultivierung von Projektionssystemen erlaubt und weiterhin den Einfluss von Substanzen auf das Faserwachstum intakter Projektionssysteme angemessen widerspiegelt. Ferner soll die Erfindung ein integriertes System aus ex vivo und in silico Methoden, d. h. Zellkulturtechnik und quantitativer computergestützter Auswertung, angeben.The object of the invention is to provide a method and a test system (kit) which makes it possible to investigate the influence of substances on nerve fibers or fiber webs of projection systems ex vivo. In particular, the invention is intended to provide a system which allows the cultivation of projection systems and further adequately reflects the influence of substances on the fiber growth of intact projection systems. Furthermore, the invention is an integrated system of ex vivo and in silico methods, d. H. Cell culture technology and quantitative computer-aided evaluation, specify.

Erfindung:Invention:

Erfindungsgemäß wird die Erfindung gelöst durch ein Verfahren zur Untersuchung des Einflusses von Substanzen auf Nervenfasern von Projektionssystemen umfassend:

  • a.) Kultivierung i.) mindestens einer ersten Gewebeprobe, die aus einer ersten Region des zentralen Nervensystems eines Tieres isoliert wurde, ii.) mindestens einer zweiten Gewebeprobe, die aus einer zweiten Region des zentralen Nervensystems eines Tieres isoliert wurde, unter Zellkulturbedingungen, wobei die Gewebeproben i.) und ii.) bei Beginn der Kultivierung nebeneinander auf einem Träger aufgebracht werden,
  • b.) Zugabe der zu untersuchenden Substanz (Testsubstanz),
  • c.) Untersuchung, ob sich zwischen den Gewebeproben i.) und ii.) Faserprojektionen ausgebildet haben
  • d.) Auswertung der Fasereigenschaften, bevorzugt computergestützt.
According to the invention, the invention is solved by a method for investigating the influence of substances on nerve fibers of projection systems comprising:
  • a.) culturing i.) at least a first tissue specimen isolated from a first region of the central nervous system of an animal, ii.) at least a second tissue specimen isolated from a second region of the central nervous system of an animal under cell culture conditions the tissue samples i.) and ii.) are applied next to each other on a support at the beginning of the cultivation,
  • b.) addition of the substance to be investigated (test substance),
  • c.) Investigation of whether fiber projections have formed between the tissue samples i.) and ii.)
  • d.) Evaluation of the fiber properties, preferably computer-aided.

Unter einem Projektionssystem werden im Sinne der Erfindung afferente und efferente Faserverbindungen und -verschaltungen zwischen zwei unterschiedlichen Strukturen oder Regionen des zentralen Nervensystems, bevorzugt räumlich weiter entfernten Hirnstrukturen, wie z. B. dem Mesencephalon und dem Cortex, verstanden. Unter Faserprojektionen oder Projektionsbahnen werden die einzelnen Faserbahnen verstanden, die Teil eines Projektionssystems sind. Die Faserbahnen werden aus Fasern gebildet, die gezielt in eine Richtung verlaufen.Under a projection system afferent and efferent fiber connections and interconnections between two different structures or regions of the central nervous system, preferably spatially further distant brain structures, such. As the mesencephalon and the cortex understood. Fiber projections or projection paths are understood to mean the individual fiber webs which are part of a projection system. The fiber webs are formed from fibers that run in a targeted direction.

Die in der Erfindung verwendeten Gewebeproben i.) und ii.) stammen somit aus zwei unterschiedlichen Regionen des zentralen Nervensystems. Die erste Gewebeprobe i.) stammt bevorzugt aus dem Mittelhirn (Mesencephalons), besonders bevorzugt dem ventralen tegmentalen Areal/Substantia nigra-Komplex (VTA/SN-Komplex), oder dem Striatum, oder dem Rückenmark. Die zweite Gewebeprobe ii.) stammt bevorzugt aus dem Cortex, besonders bevorzugt dem präfrontalen Cortex (PFC).The tissue samples i.) And ii.) Used in the invention thus come from two different regions of the central nervous system. The first tissue sample i.) Is preferably derived from the midbrain (mesencephalon), more preferably the ventral tegmental area / substantia nigra complex (VTA / SN complex), or the striatum, or the spinal cord. The second tissue sample ii.) Is preferably derived from the cortex, particularly preferably the prefrontal cortex (PFC).

Die Erfindung kann vorteilhaft sowohl auf andere dopaminerge Projektionssysteme, bestehend aus VTA/SN-Komplex und Striatum (STR) oder Cortex und STR, als auch auf andere existierende Projektionssysteme angewendet werden. In diesem Zusammenhang sind auch Gewebekombinationen zwischen Rückenmark und Cortex zu nennen. Weiterhin sind Kombinationen von drei Gewebeproben (Triple-Kulturen) möglich, z. B. bestehend aus VTA/SN-Komplex, STR und Cortex.The invention can be advantageously applied to other dopaminergic projection systems consisting of VTA / SN complex and striatum (STR) or cortex and STR, as well as other existing projection systems. Tissue combinations between the spinal cord and the cortex should also be mentioned in this context. Furthermore, combinations of three tissue samples (triple cultures) are possible, for. Consisting of VTA / SN complex, STR and cortex.

Die Gewebeproben sind bevorzugt Gewebeschnitte, die vorzugsweise eine Dicke von 150 μm bis 400 μm, bevorzugt 200 bis 350 μm aufweisen. Der Durchmesser der einzelnen Gewebeschnitte hängt von der in vivo-Größe der einzelnen Hirnareale, der Tierspezies und dem Alter des Tieres ab, wobei die Gewebeschnitte vorzugsweise einen Durchmesser zwischen 0,05 cm bis 2,0 cm, bevorzugt 0,1 cm bis 0,5 cm aufweisen.The tissue samples are preferably tissue sections which preferably have a thickness of 150 μm to 400 μm, preferably 200 to 350 μm. The diameter of the individual tissue sections depends on the in vivo size of the individual brain areas, animal species and the age of the animal, wherein the tissue sections preferably have a diameter between 0.05 cm to 2.0 cm, preferably 0.1 cm to 0, 5 cm.

Die Gewebeproben stammen bevorzugt von Vertebraten, insbesondere Säugetieren, einschließlich transgener und knock-out Tiere, besonders bevorzugt aus Ratten und Mäusen.The tissue samples are preferably derived from vertebrates, especially mammals, including transgenic and knock-out animals, more preferably from rats and mice.

Die Gewebeproben enthalten lebende Zellen, bei denen die Nachbarschaftsbeziehungen und Signaltransduktionswege zwischen den Zellen erhalten sind. Die Gewebeproben bestehen bevorzugt aus nativem Gewebe. Die Gewebeproben werden bevorzugt frisch aus dem Tier isoliert und nach der Isolierung bis zu 4 Wochen unter Zellkulturbedingungen kultiviert, bevorzugt für 8 bis 20 Tage. Es ist auch eine verzögerte Kultivierung der Gewebeproben möglich, wobei das Gewebe nach Isolation sofort auf eine Form haltbar gemacht wird, so dass nach Beendigung des Prozesses lebendes Gewebe zur Verfügung steht.The tissue samples contain live cells that preserve the neighborhood relationships and signal transduction pathways between the cells. The tissue samples are preferably made of native tissue. The tissue samples are preferably freshly isolated from the animal and cultured after isolation for up to 4 weeks under cell culture conditions, preferably for 8 to 20 days. It is also a delayed cultivation of the tissue samples possible, the tissue is immediately preserved after isolation on a form, so that after completion of the process living tissue is available.

Das erfindungsgemäße Verfahren, welches auf einer Co-Kultur von organotypischem Gewebe basiert, bietet ihrerseits die Möglichkeit, physiologische und pharmakologische Eigenschaften neuronaler Kreisläufe, die Entwicklung von Faserprojektionen zwischen miteinander kultivierten Hirnregionen sowie die Beeinflussung des Wachstums durch verschiedene Substanzen unter kontrollierten ex vivo-Bedingungen, zu studieren. Die ursprüngliche Gewebeorganisation, die zelluläre Kommunikation und afferente und efferente Verschaltungen bleiben erhalten und somit wird die Physiologie des Organs bzw. Gewebeschnittes erheblich besser widergespiegelt, als bei primären Einzelzell-Kulturmodellen bzw. Einzelschnitt-Kulturen. Neben der Bestimmung von globalen Maßen wie der Faserdichte, Länge der Fortsätze und dem Verzweigungsgrad ermöglicht die bioinformatische Auswertung die Beurteilung des Wachstums einzelner Fasern (insbesondere die „Geradlinigkeit” des Faser-Verlaufs sowie ihrer Zielorientierung) und ist damit besonders gut geeignet, den Einfluss verschiedener Substanzen auf die targetorientierte (Re)-Generation neuronaler Fasern zu beschreiben.The method according to the invention, which is based on a co-culture of organotypic tissue, in turn offers the possibility of physiological and pharmacological properties of neuronal circuits, the development of fiber projections between cultured brain regions as well as influencing the growth by different substances under controlled ex vivo conditions, to study. The original tissue organization, cellular communication, and afferent and efferent interconnections are retained, and thus the physiology of the organ or tissue section is significantly better reflected than in single cell primary cell culture models. In addition to the determination of global dimensions such as the fiber density, length of extensions and the degree of branching, the bioinformatic evaluation allows the assessment of the growth of individual fibers (in particular the "straightness" of the fiber course and their target orientation) and is thus particularly well suited to the influence of different To describe substances on the target-oriented (Re) generation of neuronal fibers.

Die Gewebeproben i.) und ii.) sind zueinander auf der Membran vorzugsweise in einem Abstand von 0 bis 0,8 cm, besonders bevorzugt von 0,05 cm bis 0,2 cm aufgebracht.The tissue samples i.) And ii.) Are applied to one another on the membrane, preferably at a distance of 0 to 0.8 cm, particularly preferably 0.05 cm to 0.2 cm.

Der Träger ist bevorzugt eine Membran oder aus einem Trägermaterial (wie Glas oder Kunststoff), das eine Zellhaftung und/oder Adhäsion der Gewebeproben ermöglicht.The carrier is preferably a membrane or of a carrier material (such as glass or plastic), which enables cell adhesion and / or adhesion of the tissue samples.

Die Membran ist bevorzugt semipermeabel, insbesondere für Gase, z. B. für ein im Rahmen der Kultivierung verwendetes Kulturgas (wie CO2), sowie für Flüssigkeiten, wie z. B. ein Nährmedium.The membrane is preferably semipermeable, especially for gases, e.g. B. for a culturing used in the cultivation (such as CO 2 ), as well as for liquids, such as. B. a nutrient medium.

Weiterhin ist die Membran bevorzugt porös und weist vorzugsweise einen Porendurchmesser von 0,02 μm bis 10 μm, bevorzugt von 0,2 μm bis 1 μm auf Darüber hinaus sind die Membranen bevorzugt für chemische oder biochemische Verbindungen, die im Kulturmedium gelöst oder suspendiert vorliegen, so wie im Rahmen der Erfindung zu testende Substanzen, Faktoren und Moleküle, durchlässig. Derartige Membranen sind dem Fachmann bekannt und können kommerziell erworben werden. Weiterhin bestehen diese Membranen bevorzugt aus Materialien, die die oben genannten Eigenschaften aufweisen, porös und durchlässig für die angegebenen Gase, Flüssigkeiten, Verbindungen und/oder Substanzen sind und weiterhin eine geeignete Adhäsion der Gewebeproben ermöglichen.Furthermore, the membrane is preferably porous and preferably has a pore diameter of from 0.02 μm to 10 μm, preferably from 0.2 μm to 1 μm. In addition, the membranes are preferably for chemical or biochemical compounds which are dissolved or suspended in the culture medium, as in the context of the invention to be tested substances, factors and molecules, permeable. Such membranes are known in the art and can be purchased commercially. Furthermore, these membranes are preferably made of materials which have the above-mentioned properties, are porous and permeable to the specified gases, liquids, compounds and / or substances and further enable a suitable adhesion of the tissue samples.

Das Trägermaterial ist bevorzugt transparent. Bevorzugt wird das Trägermaterial mit Stoffen beschichtet, welche eine Zellhaftung und/oder Adhäsion der Gewebeproben ermöglichen und/oder unterstützen. Derartige Stoffe sind insbesondere Adhäsionsproteine, bevorzugt Kollagen, Fibronektin und/oder Laminin.The carrier material is preferably transparent. The carrier material is preferably coated with substances which enable and / or support cell adhesion and / or adhesion of the tissue samples. Such substances are, in particular, adhesion proteins, preferably collagen, fibronectin and / or laminin.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst in Schritt b.) die Zugabe einer zu testenden Substanz. Die Erfindung ermöglicht damit ein Screening von Wirkstoffkandidaten hinsichtlich ihres Effekts auf das Faserwachstums innerhalb von Projektionssystemen. Damit eignet sich das Verfahren insbesondere für ein systematisches Screening von z. B. wachstumsmodulatorischen Substanzen und Wirkstoffen. Die Art der applizierten oder injizierten Stoffe, Substanzen und/oder Zellen (einschließlich Stammzellen und Vorläuferzellen, sowie markierte Stammzellen/Vorläuferzellen) sowie die Applikationsart (Applikation ins Medium, Applikation auf den Schnitt, Mikroinjektion in das Gewebe), Applikationsintervalle und die Substanzkonzentration können vorteilhaft variiert werden. Dabei können zu testende Substanzkombinationen gemeinsam und/oder jeweils zeitlich versetzt appliziert werden.The method according to the invention comprises in step b.) The addition of a substance to be tested. The invention thus enables screening of drug candidates for their effect on fiber growth within projection systems. Thus, the method is particularly suitable for a systematic screening of z. B. growth modulatory substances and agents. The type of substances applied or injected, Substances and / or cells (including stem cells and progenitor cells, as well as labeled stem cells / progenitor cells) as well as the mode of administration (application into the medium, application to the cut, microinjection into the tissue), application intervals and the substance concentration can advantageously be varied. In this case, substance combinations to be tested can be applied together and / or at different times.

Die im Rahmen der Erfindung zu testenden Substanzen umfassen sowohl feste, flüssige und gasförmige chemische als auch biochemische Verbindungen (wie z. B. Proteine, Peptide, siRNA) bzw. deren Metaboliten oder ein Substanzgemisch. Im Rahmen der Erfindung kann vorteilhaft auch der Einfluss, den Zellen auf Projektionssysteme haben, getestet werden. Der Begriff Testsubstanz umfasst daher auch Zellen (einschließlich Zelllinien, Stammzellen und Vorläuferzellen, sowie markierte Stammzellen/Vorläuferzellen). Der Begriff Testsubstanz schließt auch Vektoren, die zum Einschleusen von DNA oder anderen Substanzen (wie Peptiden oder siRNA) in eine Zelle dienen (wie Plasmide, Viruspartikel, Liposomen) mit ein.The substances to be tested in the context of the invention include both solid, liquid and gaseous chemical compounds as well as biochemical compounds (such as, for example, proteins, peptides, siRNA) or their metabolites or a mixture of substances. Within the scope of the invention, the influence which cells have on projection systems can also be advantageously tested. The term test substance therefore also includes cells (including cell lines, stem cells and progenitor cells, as well as labeled stem cells / precursor cells). The term test substance also includes vectors which are used to introduce DNA or other substances (such as peptides or siRNA) into a cell (such as plasmids, virus particles, liposomes).

Bevorzugt wird vor, parallel oder nach Zugabe der zu untersuchenden Substanz ein Tracer zugeben, der in Schritt c.) durch bildgebende Verfahren detektiert wird. Als Tracer eignen sich z. B. polare Tracer wie Biocytin, lipophile Fluoreszenztracer wie Carbocyanide (z. B. DiI) oder weitere Farbstoffe (insbesondere Fluoreszenz- oder Lumineszenzfarbstoffe) oder auch radioaktiv markierte Stoffe. Dabei kann der jeweilige Tracer in das Medium und/oder auf das Gewebe appliziert beziehungsweise per Mikroinjektion in das Gewebe oder durch geeignete Methoden in die Zellen eingebracht werden. Bevorzugte Tracer im Rahmen dieser Erfindung sind Tracer die in Abhängigkeit von ihrer jeweiligen Lipophilie und aufgrund einer geeigneten Applikationsart eine Aufnahme in die Zellen ermöglichen.Preference is given to adding a tracer before, in parallel or after addition of the substance to be investigated, which is detected in step c.) By means of imaging methods. As a tracer z. As polar tracers such as biocytin, lipophilic fluorescent tracers such as carbocyanides (eg DiI) or other dyes (especially fluorescent or luminescent) or radioactively labeled substances. In this case, the respective tracer can be applied to the medium and / or to the tissue or introduced into the tissue by microinjection into the tissue or by suitable methods. Preferred tracers in the context of this invention are tracers which, depending on their respective lipophilicity and due to a suitable mode of administration, allow uptake into the cells.

Der Tracer wird vorzugsweise auf eine der co-kultivierten Gewebeproben aufgebracht oder wie oben beschrieben in Zellpopulationen oder Einzelzellen eingebracht. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht auch die gleichzeitige Analyse verschiedener Projektionsbahnen. Dabei wird bevorzugt eine Kombination mehrerer verschiedener Tracer (z. B. unterschiedlicher Fluoreszenzfarbstoffe) zur parallelen Detektion verwendet. Die kombiniert angewendeten Tracer werden auf die selbe oder bevorzugt auf eine weitere co-kultivierte Gewebeprobe aufgebracht. Dadurch wird ein Tracing verschiedener Projektionsbahnen und somit die gleichzeitige Beobachtung afferenter und efferenter Verschaltungen ermöglicht.The tracer is preferably applied to one of the co-cultured tissue samples or introduced into cell populations or single cells as described above. The inventive method also allows the simultaneous analysis of different projection paths. In this case, preference is given to using a combination of a plurality of different tracers (for example different fluorescent dyes) for parallel detection. The combined applied tracers are applied to the same or preferably to another co-cultured tissue sample. This allows a tracing of different projection paths and thus the simultaneous observation of afferent and efferent interconnections.

Der Tracer ermöglicht vorteilhaft die Detektion der ausgebildeten Fasern z. B. durch immunohistochemische Methoden (z. B. Detektion von Biocytin mittels eines Streptavidin-Enzymkonjugats und Farbreaktion mit einem chromogenen Substrat oder mittels einem mit Streptavidin gekoppeltem Fluorochrom) oder mittels Fluoreszenzmikroskopie, z. B. über die Kopplung mit einem fluoreszenzmarkierten Stoff oder über seine Fluoreszenz (Eigenfluoreszenz).The tracer advantageously allows the detection of the formed fibers z. By immunohistochemical methods (e.g., detection of biocytin using a streptavidin-enzyme conjugate and color reaction with a chromogenic substrate or by means of a streptavidin-coupled fluorochrome) or by fluorescence microscopy, e.g. B. via the coupling with a fluorescence-labeled substance or its fluorescence (autofluorescence).

Die Untersuchung in Schritt c.) erfolgt bevorzugt durch Mikroskopie, z. B. Durchlicht-, Fluoreszenz- oder Laserscanningmikroskopie [LSM] (wie konfokale Laserscanningmikroskopie oder Multiphotonenmikroskopie).The examination in step c.) Is preferably carried out by microscopy, z. B. Transmitted light, fluorescence or laser scanning microscopy [LSM] (such as confocal laser scanning microscopy or multiphoton microscopy).

Die Mikroskopie kann am lebenden Gewebe oder nach Fixation (z. B. mit Paraformaldehyd) erfolgen. Für die Fixierung wird vorzugsweise eine Fixationslösung, die Paraformaldehyd oder ein anderes geeignetes Fixationsmittel enthält, bevorzugt direkt oberhalb und unterhalb der Membran aufgebracht. Bevorzugt werden die Gewebe-Co-Kulturen auf dem Träger verbleibend fixiert. Weiterhin sind auch andere, für Säugergewebe verwendete, Fixationslösungen und -schritte einsetzbar.Microscopy can be done on living tissue or after fixation (eg with paraformaldehyde). For fixation, a fixation solution containing paraformaldehyde or another suitable fixative is preferably applied directly above and below the membrane. Preferably, the tissue co-cultures are fixed on the carrier remaining. Furthermore, other fixation solutions and steps used for mammalian tissue can also be used.

Weiterhin erfolgt im Rahmen der Erfindung optional ein zusätzlicher Bleich- bzw. ein Reinigungsschritt (mit dafür vorgesehenen organischen Lösungen z. B. einem Gemisch aus Benzylbenzoat/Benzylalkohol) des Gewebes vor, parallel oder nach Durchführung des Schrittes c, um die Qualität der mikroskopischen Auswertung zu erhöhen.Furthermore, within the scope of the invention, an additional bleaching or cleaning step (with organic solutions provided for this purpose, for example a mixture of benzyl benzoate / benzyl alcohol) of the fabric before, in parallel or after carrying out step c, is carried out to the quality of the microscopic evaluation to increase.

Die Kultivierung der Gewebeproben erfolgt bevorzugt unter Standardkulturbedingungen für Säuger-Gewebe bzw. -Organe. Vorteilhaft ist es jedoch auch möglich die Auswirkungen der Testsubstanz(en) auf die Ausbildungen der Projektionssysteme unter speziellen Bedingungen zu prüfen. Somit können beispielsweise die regenerativen Eigenschaften von Testsubstanzen innerhalb pathologischer Mechanismen, wie z. B. nach vorheriger Hypoxie/Ischämie, getestet werden. Dazu wird die Gewebe-Co-Kultur gezielt pathologischen Bedingungen (wie z. B. Sauerstoffmangel, Glucosemangel) ausgesetzt.The culture of the tissue samples is preferably carried out under standard culture conditions for mammalian tissues or organs. However, it is also advantageously possible to test the effects of the test substance (s) on the configurations of the projection systems under special conditions. Thus, for example, the regenerative properties of test substances within pathological mechanisms, such. After previous hypoxia / ischemia. For this purpose, tissue co-culture is specifically exposed to pathological conditions (such as, for example, oxygen deficiency, glucose deficiency).

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird es auch möglich, die Auswirkung mehrerer Substanzen gleichzeitig auf die Gewebe-Co-Kultur zu untersuchen, z. B. die Auswirkung einer Testsubstanz in Gegenwart eines bekannten Rezeptoragonisten oder -antagonisten oder Wachstumsfaktors. Außerdem kann die Auswirkung eines Lösungsmittels (z. B. DMSO) bzw. einer Testsubstanz, gelöst in einem Lösungsmittel, auf die Gewebe-Co-Kultur geprüft werden.In the method according to the invention it is also possible to investigate the effect of several substances simultaneously on the tissue co-culture, for. The effect of a test substance in the presence of a known receptor agonist or antagonist or growth factor. In addition, the effect of a solvent (eg DMSO) or a test substance dissolved in a solvent on the tissue co-culture can be tested.

Die Erfindung gibt vorteilhaft ein Verfahrensablauf an, welcher die Co-Kultivierung, Substanz-Behandlung und die quantitative Auswertung (Schritt d des erfindungsgemäßen Verfahrens) von Projektionssystemen ermöglicht, um den Einfluss von Stoffen und pharmazeutischen Zubereitungen, insbesondere hinsichtlich ihrer wachstumsmodulatorischen Wirkung zu untersuchen. The invention advantageously indicates a process sequence which permits co-cultivation, substance treatment and quantitative evaluation (step d of the method according to the invention) of projection systems in order to investigate the influence of substances and pharmaceutical preparations, in particular with regard to their growth-modulatory effect.

Die quantitative Analyse des Wachstums wird bevorzugt auf der Basis von digitalen mikroskopischen Bilddaten durchgeführt. Um eine hohe Quantität bei der Auswertung zu erzielen, werden die geometrischen sowie kontrast- und intensitätsbezogenen Eigenschaften der neuronalen Fasern bevorzugt automatisch extrahiert und quantifiziert. Damit eignet sich das beschriebene Verfahren besonders für ein systematisches Screening von Substanzen, um ihren Einfluss auf Wachstum und Regenerationsfähigkeit von neuronalem Gewebe zu analysieren. Die Auswertung basiert auf einer Software, die verschiedene Methoden der digitalen Bildverarbeitung implementiert. Hierbei handelt es sich um eine Verarbeitungskette aus mehreren Schritten, welche zum Teil auf existierenden Methoden (Hintergrundkorrektur, Intelligent scissors, Skelettierung) und neuen Methoden (graphbasierte Faserbeschreibung, Selektion der Startpunkte für die konturbasierte Segmentierung) basiert.The quantitative analysis of the growth is preferably carried out on the basis of digital microscopic image data. In order to achieve a high quantity in the evaluation, the geometric as well as contrast and intensity-related properties of the neuronal fibers are preferably automatically extracted and quantified. Thus, the method described is particularly suitable for a systematic screening of substances in order to analyze their influence on growth and regeneration capacity of neuronal tissue. The evaluation is based on a software that implements various methods of digital image processing. This is a multi-step processing chain based in part on existing methods (background correction, intelligent scissors, skeletonization) and new methods (graph-based fiber description, selection of starting points for contour-based segmentation).

Der Auswertungsschritt d.) wird bevorzugt Computer-implementiert durchgeführt und umfasst folgende Teilschritte:

  • d1.) Skelettierung und Extraktion der Fasern,
  • d2.) Bestimmung von Knotenpunkten der extrahierten Fasern und kontinuierliche Rekonstruktion der Faserverläufe zwischen den Knotenpunkten, bevorzugt durch konturbasierte Methoden, insbesondere nach der Intellligent scissors Methode oder durch Interpolation der diskreten Daten,
  • d3.) kontinuierliche Darstellung und/oder graphbasierte und/oder interpolierte Darstellung der Fasern, wobei mindestens eine der folgenden Faserparameter wie folgt bestimmt wird:
  • d4.) Bestimmung der Faserdichte durch Berechnung des Anteils der Vordergrundstrukturen an der gesamten Bildgröße (pixelbasiert) oder über die Anzahl der Kanten (optional mit Wichtung über die Länge) mittels der graphbasierten Darstellung der Fasern,
  • d5.) Bestimmung der Geradlinigkeit des Faserwachstums durch Berechnung der Winkelverteilung entlang der Hauptwachstumsrichtung oder mittels Hauptkomponentenanalyse zur Bestimmung der Variation orthogonal zur Hauptwachstumsrichtung (2. Hauptkomponente) auf Basis der kontinuierlichen Darstellung und/oder der interpolierten Darstellung und/oder durch Analyse der Krümmung entlang der Fasern auf Basis der kontinuierlichen Darstellung.
The evaluation step d.) Is preferably carried out computer-implemented and comprises the following sub-steps:
  • d1.) Skeletonization and extraction of the fibers,
  • d2.) Determination of nodes of the extracted fibers and continuous reconstruction of the fiber paths between the nodes, preferably by contour-based methods, in particular by the Intelligent scissors method or by interpolation of the discrete data,
  • d3.) continuous representation and / or graph-based and / or interpolated representation of the fibers, wherein at least one of the following fiber parameters is determined as follows:
  • d4.) Determining the fiber density by calculating the proportion of the foreground structures on the total image size (pixel-based) or on the number of edges (optionally with weighting over the length) by means of the graph-based representation of the fibers,
  • d5.) Determining the straightness of the fiber growth by calculating the angular distribution along the main growth direction or by principal component analysis for determining the variation orthogonal to the main growth direction (2nd main component) on the basis of the continuous representation and / or the interpolated representation and / or by analysis of the curvature along the Fibers based on continuous presentation.

Die im Schritt d2.) genannten diskreten Daten sind entweder die Pixel (aus denen das Bild aufgebaut ist) oder die Knotenpunkte.The discrete data mentioned in step d2.) Are either the pixels (which make up the image) or the nodes.

Die kontinuierliche Darstellung gibt den kompletten Faserverlauf möglichst detailgetreu wieder und wird bevorzugt durch kontinuierliche Rekonstruktion der Faserverläufe zwischen den Knotenpunkten, insbesondere Anfang- und Endpunkt der Fasern, mittels konturbasierter Methoden erhalten, insbesondere nach der Intelligent scissors Methode.The continuous representation reproduces the complete fiber progression as faithfully as possible and is preferably obtained by continuous reconstruction of the fiber progressions between the nodal points, in particular the beginning and end point of the fibers, by means of contour-based methods, in particular according to the Intelligent Scissors method.

Die graphbasierte Darstellung wird durch Verbindung der Knotenpunkte mit einzelnen Linien erhalten (z. B. wie Braumann UD et al. 2006 in Handels et al. (Hrsg.) Bildverarbeitung für die Medizin 2006 – Algorithmen, Systeme, Anwendungen, S. 379–383. Springer Verlag, Reihe Informatik aktuell ).The graph-based representation is obtained by connecting the nodes to individual lines (eg, like Braumann UD et al. 2006 in Handels et al. (Ed.) Image Processing for Medicine 2006 - Algorithms, Systems, Applications, pp. 379-383. Springer publishing house, row computer science aktuell ).

Die interpolierte Darstellung wird bevorzugt durch Interpolation der diskreten Daten, bevorzugt der Pixel, erhalten.The interpolated representation is preferably obtained by interpolation of the discrete data, preferably the pixels.

Der bevorzugte schematische Ablauf der Bildverarbeitungskette wird im Folgenden kurz beschrieben:

  • 1. optionale Vorverarbeitung der Bilder: ggf. Umwandlung von Farbtönen in Graustufen (Standardmethode), – Nichtlineare Glättung mittels Total-Variation-Filter und/oder oszillierenden Funktionen (z. B. nach Vese, Osher 2004 Journal of Mathematical Imaging and Vision 20 (1–2), 07–18 – Morphologische Top-Hat-Transformation zum Hervorheben linearer Strukturen (z. B. gemäß Wolfram Mathematica 7.0) ,
  • 2. Skelettierung und Extraktion der Faserstücke, Bestimmung von Knotenpunkten (Eigenentwicklung),
  • 3. Graphrepräsentation der Fasern (Eigenentwicklung),
  • 4. konturbasierte Extraktion der Faserverläufe mit sub-pixel-Genauigkeit (eigene Implementierung, Standardmethode nach Intelligent scissors for image composition – Mortensen, Barrett 1995, Computer Graphics, SIGGRAPH 95 191–198 ,
  • 5. optional: Nachkorrektur der extrahierten Fasern durch automatische Konsistenzprüfung (Eigenentwicklung),
  • 6. optional: bei ungenügender Genauigkeit der automatischen Verfahren, können die Endpunkte interessanter Fasern auch manuell markiert werden, die Extraktion erfolgt dann wieder automatisch,
  • 7. Auswertung der Faserdichte, Berechnung des Anteils der Vordergrundstrukturen an der gesamten Bildgröße (auch mit lokaler Gewichtung oder auf verschiedenen Skalen) (Eigenentwicklung),
  • 8. alternative Auswertung der Faserdichte über die graphbasierte Darstellung. Da Linienstrukturen in einem zweidimensionalen Bild prinzipiell eine Nullmenge darstellen, sind pixelbasierte Verfahren zur Bestimmung der Faserdichte eigentlich recht unzuverlässig und auflösungsabhängig. Durch unsere spezifische Darstellung der Fasern als Kanten in einem Graphen kann auch die Anzahl der Kanten als Maß für die Anzahl linearer Strukturen im Bild genommen werden, das unabhängig von der Dicke der Faserstrukturen und der Auflösung der Bilddaten ist. Bei Bedarf kann mit der Länge der Kanten gewichtet werden, um lange Strukturen besser zu berücksichtigen (sonst werden kurze, unterbrochene Stücken übermäßig gewichtet)
  • 9. Auswertung der Geradlinigkeit des Faserwachstums, Berechnung der Winkelverteilung entlang der Hauptwachstumsrichtung durch Extrapolation der diskreten Daten, Hauptkomponentenanalyse zur Bestimmung der Variation orthogonal zur Hauptwachstumsrichtung, diese wird als Maß der Geradlinigkeit benutzt (auch normiert auf die Länge),
  • 10. Darstellung der Werte (Boxplots der Verteilungen, Darstellungen der Fasern, farbliche Darstellung der Winkelvariation (Eigenentwicklung)).
The preferred schematic sequence of the image processing chain is briefly described below:
  • 1. optional preprocessing of images: if necessary, conversion of shades into gray scale (standard method), - non-linear smoothing by means of total variation filter and / or oscillating functions (eg after Vese, Osher 2004 Journal of Mathematical Imaging and Vision 20 (1-2), 07-18 - Morphological Top Hat Transform to Highlight Linear Structures (eg according to Wolfram Mathematica 7.0) .
  • 2. Skeletonization and extraction of the fiber pieces, determination of nodes (own development),
  • 3. Graph representation of the fibers (own development),
  • 4. Contour-based extraction of fiber gradients with sub-pixel accuracy (own Implementation, Intelligent scissors for image composition standard method - Mortensen, Barrett 1995, Computer Graphics, SIGGRAPH 95 191-198 .
  • 5. optional: post-correction of the extracted fibers by automatic consistency check (own development),
  • 6. optional: with insufficient accuracy of the automatic procedures, the endpoints of interesting fibers can also be marked manually, the extraction then takes place automatically again,
  • 7. Evaluation of the fiber density, calculation of the proportion of foreground structures at the total image size (also with local weighting or on different scales) (own development),
  • 8. alternative evaluation of the fiber density via the graph-based representation. Since linear structures in a two-dimensional image represent a null quantity in principle, pixel-based methods for determining the fiber density are actually quite unreliable and dependent on resolution. Due to our specific representation of the fibers as edges in a graph, the number of edges can be taken as a measure of the number of linear structures in the image, which is independent of the thickness of the fiber structures and the resolution of the image data. If necessary, the length of the edges can be weighted to take better account of long structures (otherwise short, interrupted pieces are overweighted)
  • 9. Evaluation of the straightness of the fiber growth, calculation of the angular distribution along the main growth direction by extrapolation of the discrete data, principal component analysis to determine the variation orthogonal to the main growth direction, this is used as a measure of straightness (also normalized to the length),
  • 10. Representation of the values (boxplots of the distributions, representations of the fibers, color representation of the angle variation (self-development)).

Die computergestützte Auswertungsmethode vermeidet vorteilhaft die oben erwähnten Mangel des Standes der Technik (vor allem das Problem der Subjektivität). Die besonderen Merkmale dieser Methode stellen die Extraktion einzelner Fasern aus den Bilddaten sowie die Analyse der allgemeinen Wachstumseigenschaften mittels geeigneter Kenngrößen dar. Um die Eigenschaften projizierender Systeme zu analysieren sind Maße (wie beispielsweise die „Geradlinigkeit” des Wachstums) von Interesse, die normalerweise nicht bestimmt werden bzw. aus den meisten Ansätzen (wie der Auswertung von Cross-Sections) nicht bestimmt werden können.The computer-aided evaluation method advantageously avoids the above-mentioned deficiency of the prior art (above all the problem of subjectivity). The special features of this method are the extraction of individual fibers from the image data as well as the analysis of the general growth properties by means of suitable parameters. To analyze the properties of projecting systems, measures (such as the "straightness" of the growth) of interest, which normally is not determined can not be determined from most approaches (such as the evaluation of cross-sections).

Der Faserverlauf wird aus den Bildern entweder automatisch oder durch ein semi-automatisches Verfahren mit minimaler Interaktion gewonnen. Die Ermittlung der Geradlinigkeit des Wachstums und der Dicke der Fasern, sowie ggf. weiterer Parameter erfolgt bevorzugt vollständig automatisch.The fiber progression is obtained from the images either automatically or by a semi-automatic method with minimal interaction. The determination of the straightness of the growth and the thickness of the fibers, as well as possibly further parameters, preferably takes place completely automatically.

Die computergestützte Auswertung des targetorientierten Faserwachstums, besonders der Beschreibung der „Geradlinigkeit des Wachstums” erfolgt bevorzugt mittels Analyse der Winkelverteilung und/oder Hauptkomponentenanalyse auf der Basis digitaler Bilder aus mikroskopischen Bildgebungsverfahren, z. B. Durchlicht-, Fluoreszenz- oder Laserscanningmikroskopie (wie konfokale Laserscanningmikroskopie oder Multiphotonenmikroskopie).The computer-assisted evaluation of the target-oriented fiber growth, in particular the description of the "straightness of the growth", preferably takes place by means of analysis of the angular distribution and / or principal component analysis on the basis of digital images from microscopic imaging methods, e.g. B. transmitted light, fluorescence or laser scanning microscopy (such as confocal laser scanning microscopy or multiphoton microscopy).

Um den Faserverlauf möglichst exakt reproduzieren zu können, werden in Schritt d.) zunächst Knotenpunkte des Fasergraphen bevorzugt automatisch (oder auch semi-automatisch – s. unten) bestimmt und zwischen Ihnen der Verlauf der Faser konturbasiert bestimmt. Dazu wird bevorzugt die ”intelligent scissors” Methode benutzt. Es sind jedoch auch andere konturbasierte Verfahren einsetzbar. Mittels dieser Methoden ist es möglich, trotz vorhandener ”Lücken” in den Bilddaten, die aus einer vesikulären Speicherung des Tracers sowie projektionsbedingt durch die zweidimensionale Bildgebung entstehen, kontinuierliche Verläufe zu gewinnen. Hierzu werden bevorzugt verschiedene Kombinationen an Ausgangsknoten zur Initialisierung der konturbasierten Methode benutzt. Vorteilhaft können anschließend falsch detektierte Fasern automatisch entfernt werden. Dazu wird bevorzugt das Integral der Grauwerte entlang der Faser bestimmt. Basierend auf diesen Werten werden nur Fasern, die einen vorher festgelegten Schwellenwert überschreiten, ausgewählt (und die anderen entfernt). Daran schließt sich bevorzugt eine Normalisierung bzgl. der Länge der Fasern an.In order to be able to reproduce the course of the fiber as exactly as possible, in step d.) First, nodes of the fiber graph are determined automatically (or semi-automatically - see below) and the progression of the fiber is determined on a contour-based basis. For this, the "intelligent scissors" method is preferred. However, other contour-based methods can also be used. By means of these methods, it is possible, despite existing "gaps" in the image data resulting from a vesicular storage of the tracer and due to the projection caused by the two-dimensional imaging, to gain continuous courses. For this purpose, different combinations of output nodes are preferably used to initialize the contour-based method. Advantageously, subsequently incorrectly detected fibers can be removed automatically. For this purpose, the integral of the gray values along the fiber is preferably determined. Based on these values, only fibers exceeding a predetermined threshold are selected (and the others removed). This is followed by normalization with respect to the length of the fibers.

Alternativ erfolgt eine semi-automatische Extraktion der Fasern aus den Bildern. Dazu werden Anfang und Ende einer Faser manuell markiert und ihr Verlauf dann automatisch mittels einer konturbasierten Methode erfasst.Alternatively, a semi-automatic extraction of the fibers takes place from the images. For this purpose, the beginning and end of a fiber are marked manually and their course is then automatically recorded by means of a contour-based method.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Computerprogrammprodukt welches Schritt d.) des erfindungsgemäßen Verfahrens implementiert und optional zusätzlich mindestens einen der vorherigen Schritte a.) bis c.), insbesondere die Schritte b.) und c.), automatisiert. Bevorzugt werden neben der Auswertung bevorzugt die Schritte Präparation, Kultivierung, Zugabe der zu untersuchenden Substanz, Tracerzugabe und/oder Bildaufnahme automatisiert bzw. teilautomatisiert.The invention also provides a computer program product which implements step d.) Of the method according to the invention and optionally additionally automates at least one of the preceding steps a.) To c.), In particular steps b.) And c.). In addition to the evaluation, the steps of preparation, cultivation, addition of the substance to be investigated, addition of tracer and / or image acquisition are preferably automated or partially automated.

Das Computerprogrammprodukt liegt bevorzugt als eigenständiges interaktives Interface für Wolfram Mathematica 7.0 vor. Es besteht aus dem Mathematica Code für das User Interface und Visualisierung sowie einige Vorverarbeitungsschritte zusammen mit einer C-Bibliothek, die verschiedene Bildverarbeitungsmethoden beinhaltet.The computer program product is preferably an independent interactive interface for Wolfram Mathematica 7.0. It consists of the Mathematica code for the user interface and visualization as well as some preprocessing steps together with a C library containing various image processing methods.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Computer oder eine Datenverarbeitungsanlage auf dem das erfindungemäße Computerprogrammprodukt installiert ist. Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Datenträger auf dem das erfindungemäße Computerprogrammprodukt gespeichert ist. Der Begriff Datenträger umfasst insbesondere optische (z. B. CD, DVD, Blueray) und elektronische Speichermedien (ROM, USB-Stick, Speicherkarten).The subject of the invention is also a computer or a data processing system on which the computer program product according to the invention is installed. The invention likewise relates to a data carrier on which the computer program product according to the invention is stored. The term data carrier comprises in particular optical (eg CD, DVD, Blueray) and electronic storage media (ROM, USB stick, memory cards).

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Testsystem, insbesondere zur Untersuchung von Projektionssystemen, insbesondere des Einflusses von Substanzen auf Nervenfasern von Projektionssystemen, umfassend ein erfindungsgemäßes Computerprogrammprodukt bzw. Computer, Datenverarbeitungsanlage oder Datenträger und mindestens einen der weiteren Komponenten ausgewählt aus:

  • – Zellkulturmedien,
  • – Tracer,
  • – Fixierungsmittel,
  • – Referenzsubstanzen,
  • – ein bildgebendes System (bevorzugt ein. Mikroskop),
  • – Handbuch.
The invention also provides a test system, in particular for the examination of projection systems, in particular the influence of substances on nerve fibers of projection systems, comprising a computer program product or computer, data processing system or data carrier and at least one of the further components selected from:
  • - cell culture media,
  • - tracers,
  • Fixative,
  • - reference substances,
  • An imaging system (preferably a microscope),
  • - Manual.

Mit dem oben genannten Testsystem kann der Anwender den Einfluss von Substanzen auf das Wachstum und die Ausrichtung von Nervenfasern, innerhalb von ex vivo rekonstruierten Projektionssystemen, bestehend aus verschiedenen Gewebeproben, untersuchen.With the above test system, the user can study the influence of substances on the growth and alignment of nerve fibers within ex vivo reconstructed projection systems consisting of different tissue samples.

Bevorzugt enthält das Testsystem zur direkten Anwendung zusätzlich:

  • i.) mindestens eine erste Gewebeprobe, die aus einer ersten Region des zentralen Nervensystems eines Tieres isoliert wurde,
  • ii.) mindestens eine zweite Gewebeprobe, die aus einer zweiten Region des zentralen Nervensystems eines Tieres isoliert wurde, wobei die Gewebeproben i.) und ii.) nebeneinander auf einer Membran aufgebracht sind.
The test system for direct application preferably additionally contains:
  • i.) at least a first tissue sample isolated from a first region of the central nervous system of an animal,
  • ii.) at least one second tissue sample isolated from a second region of the central nervous system of an animal, wherein the tissue samples i.) and ii.) are applied side by side on a membrane.

Die Gewebeproben sind bevorzugt wie oben beschrieben ausgewählt und auf der Membran aufgebracht.The tissue samples are preferably selected as described above and applied to the membrane.

Die Tracer sind bevorzugt wie oben beschrieben ausgewählt. Als Referenzsubstanzen eignen sich beispielsweise Wirkstoffe mit bekannter Wirkung auf das ZNS oder bekannte Rezeptoragonisten oder -antagonisten sowie Wachstumsfaktoren.The tracers are preferably selected as described above. As reference substances are, for example, drugs with known effect on the CNS or known receptor agonists or antagonists and growth factors.

Das erfindungsgemäße Testsystem besteht vorteilhaft aus einem einfachen, leicht zugänglichen Gewebe-Co-Kultursystem, welches den komplexen Aufbau der neuronalen Verschaltungen und Strukturen sowie der neuronalen Projektionsbahnen angemessen widerspiegelt.The test system according to the invention advantageously consists of a simple, easily accessible tissue co-culture system which adequately reflects the complex structure of the neuronal interconnections and structures as well as of the neuronal projection pathways.

Als funktionales Testsystem werden organotypische Gewebe-Co-Kulturen, welche bei geringerer Zeit- und Kostenaufwendung, im Vergleich zu Ganztiermodellen einen hohen Durchsatz an Substanzen ermöglichen, eingesetzt. Im Rahmen der Erfindung werden vorzugsweise Gewebe-Co-Kulturen des dopaminergen Systems eingesetzt.As a functional test system, organotypic tissue co-cultures, which allow a high throughput of substances with less time and cost expenditure compared to whole animal models, are used. In the context of the invention, tissue co-cultures of the dopaminergic system are preferably used.

Die Erfindung wird nachfolgend durch Abbildungen und Ausführungsbeispiele näher erläutert, ohne auf diese beschränkt zu sein.The invention will be explained in more detail by illustrations and embodiments, without being limited to these.

1 zeigt die vorverarbeiteten Bilddaten, jedoch als Dithering anstelle von Graustufen, 1 shows the preprocessed image data, but as dithering instead of grayscale,

2 zeigt die extrahierten Pixel, die zu Fasern gehören. 2 shows the extracted pixels belonging to fibers.

3 zeigt eine graphbasierte Darstellung der extrahierten Graphenstrukturen (Originalbild im Hintergrund). 3 shows a graph-based representation of the extracted graphene structures (original image in the background).

4 und 5 zeigen Beispiele extrahierter Faserverläufe am Ende der Bildverarbeitungsschritte, dazu wurden die Fasern gedreht und auf das gleiche Koordinatensystem gebracht, von diesen Daten werden dann die Wachstumscharakteristiken berechnet. 4 and 5 show examples of extracted fiber trajectories at the end of the image processing steps, to which the fibers were rotated and brought to the same coordinate system, from these data then the growth characteristics are calculated.

6 zeigt ein Beispiel automatisch extrahierter, kontinuierlicher Faserverläufe. 6 shows an example of automatically extracted, continuous fiber traces.

Ausführungsbeispiel 1Embodiment 1

Co-Kultivierung:Co-cultivation:

Die Präparation der organtypischen Gewebe-Kulturen erfolgte nach Franke et al., 2003 ; Heine et al., 2006, 2007 . Dazu wurden von 1–5 Tage alten Wistar Ratten die Gehirne unter sterilen Bedingungen unter einer Laminarbox entnommen. Aus dem Mesencephalon wurde der ventrales tegmentales Areal/Substantia nigra-Komplex (VTA/SN-Komplex) bzw. aus dem Cortex der präfrontale Cortex (PFC) präpariert. Mit Hilfe eines Vibratoms wurden 200 μm bis 350 μm dicke Schnitte angefertigt. Danach erfolgte das Auflegen der Schnitte als Gewebe-Co-Kulturen auf semipermeable Membranen (Millicell, Firma Millipore) im Abstand von 0,5–1 mm, welche in 6-Kultur-Wellplatten (Nunclon Surface, Firma Roskilde) gelegt wurden. Der Durchmesser der Gewebeproben betrug dabei 0,15–0,3 cm. Die Kulturen wurden von unten mit nährstoffhaltigem Zellkulturmedium (50% Minimal Essential Medium, 25% Hanks Balanced Salt Solution und 25% hitzeinaktiviertes Pferdeserum) versorgt und hatten von oben Kontakt mit sauerstoffhaltiger Atmosphäre (5% CO2).The preparation of the organotypic tissue cultures was carried out according to Franke et al., 2003 ; Heine et al., 2006, 2007 , To do this, the brains were removed from 1-5 day old Wistar rats under sterile conditions under a laminar box. From the mesencephalon, the ventral tegmental area / substantia nigra complex (VTA / SN complex) or from the cortex the prefrontal cortex (PFC) was prepared. Using a Vibratoms 200 to 350 micron thick sections were made. This was followed by placing the sections as tissue co-cultures on semipermeable membranes (Millicell, Millipore) at a distance of 0.5-1 mm, which were placed in 6-well culture plates (Nunclon Surface, Roskilde). The diameter of the tissue samples was 0.15-0.3 cm. The cultures were fed from below with nutrient-containing cell culture medium (50% minimal essential medium, 25% Hanks Balanced Salt Solution and 25% heat-inactivated horse serum) and had contact from above with oxygen-containing atmosphere (5% CO 2 ).

Substanz-Behandlung mit anschließendem Tracing:Substance treatment followed by tracing:

Alle 2 bis 3 Tage erfolgte der Austausch des Mediums bzw. die Behandlung mit den entsprechenden Substanzen, welche in das Medium appliziert wurden. Die Kulturen befanden sich für 12 Tage im Brutschrank. 2 Tage vor Beendigung der Inkubationszeit durch Fixation mit einem Medium, welches Paraformaldehyd und Pikrinsäure enthielt, erfolgte die Behandlung mit dem löslichen Tracer Biocytin. Dabei wurden die Biocytin-Kristalle auf den VTA/SN-Komplex aufgelegt. Unter Verwendung der ABC-Methode (Kopplung mit dem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex) in Kombination mit einer DAB-Schwermetall-Lösung (3,3'-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid/Nickel/Cobalt) wurde die Biocytin-Markierung sichtbar gemacht.Every 2 to 3 days, the medium was replaced or the treatment with the corresponding substances, which were applied in the medium. The cultures were in the incubator for 12 days. 2 days before the end of the Incubation time by fixation with a medium containing paraformaldehyde and picric acid, the treatment was carried out with the soluble tracer biocytin. The biocytin crystals were applied to the VTA / SN complex. Using the ABC method (coupling with the avidin-biotin-peroxidase complex) in combination with a DAB heavy metal solution (3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride / nickel / cobalt), the biocytin label was visualized.

Computergestützte Auswertung:Computer-aided evaluation:

Mittels einer Kamera die mit einem Mikroskop verbunden war, wurden digitale Bilddaten, die die auswachsenden Fasern des co-kultivierten Projektionssystems enthielten, erzeugt. Mit Hilfe dieser mikroskopischen Bilddaten wurden die Verläufe einzelner Fasern aus der Narbenregion in die Zielregion computergestützt detektiert und ausgewertet. Die Extraktion der Fasern erfolgte einmal automatisch durch eine Verbindung von Schwellwertbildung und graphbasierter sowie konturbasierter Segmentierungsmethode. Hierbei wurde das Bild zuerst durch Schwellenwertbildung und vorhergehender Normalisierung der Bildwerte in Vordergrund (Faserbereich) und Hintergrund aufgeteilt. Durch die Wahl eines geeigneten Schwellenwertes konnten grobe Teile des Faserverlaufs gefunden werden. Diese Stückchen wurden mittels Skelettierung zu linearen Strukturen vereinfacht, von denen Anfangs- bzw. Endpunkte bestimmt werden können. Diese Punkte können daraufhin zu einer graphbasierten Beschreibung der Fasern benutzt werden (analog Braumann UD et al. 2006 in Handels et al. (Hrsg.) Bildverarbeitung für die Medizin 2006 Algorithmen, Systeme, Anwendungen, S. 379–383. Springer Verlag, Reihe Informatik aktuell ). Mittels dieser Beschreibung ließen sich verschiedene abstrahierte Fasereigenschaften (bspw. Längenmasse basierend auf Abständen in Graphen) bestimmen. Um jedoch den Faserverlauf exakter reproduzieren zu können, wurden die Knotenpunkte des ”Fasergraphen” genutzt, um zwischen ihnen den Verlauf der Faser konturbasiert zu bestimmen. Hierbei kam die ”intelligent scissors” Methode zum Einsatz (es sind jedoch auch andere konturbasierte Verfahren einsetzbar). Mittels dieser Methoden ist es möglich, trotz vorhandener ”Lücken” in den Bilddaten, die aus einer vesikulären Speicherung des Tracers sowie projektionsbedingt durch die zweidimensionale Bildgebung entstehen, kontinuierliche Verläufe zu gewinnen. Hierbei wurden verschiedene Kombinationen an Ausgangsknoten zur Initialisierung der konturbasierten Methode benutzt. Es schloss sich eine automatische Entfernung falsch detektierter Fasern (Schwellwert über Integral der Grauwerte entlang der Faser) und eine Normalisierung bzgl. der Länge an.By means of a camera connected to a microscope, digital image data containing the growing fibers of the co-cultured projection system was generated. With the aid of these microscopic image data, the progress of individual fibers from the scar region into the target region was computer-assisted detected and evaluated. The extraction of the fibers was done once automatically by a combination of thresholding and graph-based as well as contour-based segmentation method. Here, the image was first divided by thresholding and prior normalizing the image values into foreground (fiber area) and background. By choosing a suitable threshold, it was possible to find coarse parts of the fiber path. These pieces were simplified by skeletonization into linear structures, from which start and end points can be determined. These points can then be used for a graph-based description of the fibers (analog Braumann UD et al. 2006 in Handels et al. (Ed.) Bildverarbeitung für die Medizin 2006 Algorithms, Systems, Applications, pp. 379-383. Springer publishing house, row computer science aktuell ). By means of this description, it was possible to determine various abstracted fiber properties (for example, length based on distances in graphs). However, in order to be able to reproduce the fiber path more precisely, the nodes of the "fiber graph" were used to contour-contour the course of the fiber between them. Here, the "intelligent scissors" method was used (however, other contour-based methods can also be used). By means of these methods, it is possible, despite existing "gaps" in the image data resulting from a vesicular storage of the tracer and due to the projection caused by the two-dimensional imaging, to gain continuous courses. Different combinations of parent nodes were used to initialize the contour-based method. This was followed by an automatic removal of falsely detected fibers (threshold over integral of the gray values along the fiber) and a normalization with respect to the length.

Um eine kleinere Unterauswahl der Bilddaten auszuwerten, wurde die Variante mit semi-automatischer Extraktion der Fasern aus den Bildern angewandt. Es werden Anfang und Ende einer Faser manuell markiert und ihr Verlauf dann automatisch mittels einer konturbasierten Methode erfasst. Diese Methode hat eine etwas höhere Genauigkeit, da weniger falsch-positive Daten auftreten, was besonders für „proof-of-principle”-Studien optimal ist.In order to evaluate a smaller sub-selection of the image data, the variant with semi-automatic extraction of the fibers from the images was used. The beginning and end of a fiber are marked manually and their course is then automatically recorded using a contour-based method. This method has a slightly higher accuracy as there are fewer false positives, which is optimal for proof-of-principle studies.

Nachdem die Faserverläufe in den Bilddaten extrahiert wurden, konnte das Wachstum quantifiziert werden. Die Verteilung des Winkelspektrums einzelner Abschnitte einer Faser wurde durch Extrapolation einer graduell feiner werdenden Unterteilung bestimmt. Sowie die Variation der zweiten Hauptkomponente des Faserwachstumsprozesses untersucht. Beide Maße sind in der Lage, die Geradlinigkeit der Fasern, bezogen auf die Hauptwachstumsrichtung, zu quantifizieren.After the fiber traces were extracted in the image data, the growth could be quantified. The distribution of the angular spectrum of individual sections of a fiber was determined by extrapolation of a gradually finer subdivision. As well as the variation of the second major component of the fiber growth process studied. Both dimensions are able to quantify the straightness of the fibers, relative to the main growth direction.

Durch die erfindungsgemäße Lösung konnten statistisch signifikante Unterschiede in der „Geradlinigkeit” des Faserwachstums zwischen unterschiedlich behandelten Gewebe-Co-Kulturen (Behandlung mit: 2-Methylthio-ATP [2MeSATP, P2X/Y-Rezeptor-selektiver Agonist] bzw. Vorbehandlung mit Pyridoxalphosphat-6-azophenyl-2',4'-disulfonsäure [P2X/Y-Rezeptorantagonist] in Kombination mit 2MeSATP) bestimmt werden.By means of the solution according to the invention, statistically significant differences in the "straightness" of fiber growth between differently treated tissue co-cultures (treatment with 2-methylthio-ATP [2MeSATP, P2X / Y receptor-selective agonist] or pretreatment with pyridoxal phosphate) could be achieved. 6-azophenyl-2 ', 4'-disulfonic acid [P2X / Y receptor antagonist] in combination with 2MeSATP).

7 zeigt die Verteilung der Mittelwerte der Winkelverteilung der Fasern innerhalb der Gruppen (links: Rezeptoragonist, rechts: Vorbehandlung mit Rezeptorantagonist in Kombination mit Rezeptoragonist). 7 shows the distribution of the mean values of the angular distribution of the fibers within the groups (left: receptor agonist, right: pretreatment with receptor antagonist in combination with receptor agonist).

8 zeigt die Verteilung der Standard-Abweichung der Winkelverteilung der Fasern (links: Rezeptoragonist, rechts: Vorbehandlung mit Rezeptorantagonist in Kombination mit Rezeptoragonist) 8th shows the distribution of the standard deviation of the angular distribution of the fibers (left: receptor agonist, right: pretreatment with receptor antagonist in combination with receptor agonist)

Ausführungsbeispiel 2Embodiment 2

Weiterhin konnte mit Hilfe der angefertigten mikroskopischen Bild-Daten die Menge der auswachsenden Fasern (Faserdichten), welche den Narbenbereich passierten und in das Zielgebiet des Projektionssystems auswuchsen, bestimmt werden. Dafür wurden die Fasern analog zu Beispiel 1 extrahiert. Anschließend ließ sich die Faserdichte (Verhältnis der Bildpunkte, die zu einer Faser oder einem Vesikel gehören, zu der Anzahl der Bildpunkte die zum Hintergrund gehören) quantitativ auswerten.Furthermore, with the aid of the prepared microscopic image data, it was possible to determine the amount of growing fibers (fiber densities) which passed the scar area and grew into the target area of the projection system. For this, the fibers were extracted analogously to Example 1. Subsequently, the fiber density (ratio of the pixels belonging to a fiber or a vesicle to the number of pixels belonging to the background) could be quantitatively evaluated.

Durch die beschriebene Lösung waren wir in der Lage, statistisch signifikante Unterschiede in den Faserdichten im Narbenbereich der unterschiedlich behandelten Gewebe-Co-Kulturen (Behandlung mit: Adenosin-5'-O-(2-thiodiphosphat) [ADPβS, P2Y1-Rezeptor-selektiver Agonist] bzw. Vorbehandlung mit Pyridoxalphosphat-6-azophenyl-2',4'-disulfonsäure [P2X/Y-Rezeptorantagonist] in Kombination mit ADPβS) zu bestimmen.The described solution enabled us to detect statistically significant differences in the fiber densities in the scar area of the differently treated tissue co-cultures (treatment with: adenosine 5'-O- (2-thiodiphosphate) [ADPβS, P2Y 1 receptor selective agonist] or pretreatment with pyridoxal phosphate-6-azophenyl-2 ', 4'-disulfonic acid [P2X / Y receptor antagonist] in combination with ADPβS).

9 zeigt die Verteilung der Faserdichten innerhalb der beiden getesteten Gruppen (links: Rezeptoragonist, rechts: Vorbehandlung mit Rezeptorantagonist in Kombination mit Rezeptoragonist). 9 shows the distribution of fiber densities within the two tested groups (left: receptor agonist, right: receptor antagonist in combination with receptor agonist).

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Claims (11)

Verfahren zur Untersuchung des Einflusses von Substanzen auf Nervenfasern von Projektionssystemen umfassend: a.) Kultivierung i.) mindestens einer ersten Gewebeprobe, die aus einer ersten Region des zentralen Nervensystems eines Tieres isoliert wurde, ii.) mindestens einer zweiten Gewebeprobe, die aus einer zweiten Region des zentralen Nervensystems eines Tieres isoliert wurde, unter Zellkulturbedingungen, wobei die Gewebeproben i.) und ii.) bei Beginn der Kultur nebeneinander auf einer Membran aufgebracht sind, b.) Zugabe der zu untersuchenden Substanz, c.) Bestimmung, ob sich zwischen den Gewebeproben i.) und ii.) Faserbahnen ausgebildet haben sowie Darstellung der Faserbahnen mit bildgebenden Methoden und d.) Auswertung der Fasereigenschaften in den erhaltenen Bildern, wobei Schritt d.) folgende Teilschritte umfasst: d1.) Skelettierung und Extraktion der Fasern, d2.) Bestimmung von Knotenpunkten der extrahierten Fasern und kontinuierliche Rekonstruktion der Faserverläufe zwischen den Knotenpunkten d3.) kontinuierliche Darstellung und/oder graphbasierte und/oder interpolierte Darstellung der Fasern, wobei mindestens eine der folgenden Faserparameter wie folgt bestimmt wird: d4.) Bestimmung der Faserdichte durch Berechnung des Anteils der Vordergrundstrukturen an der gesamten Bildgröße oder über die Anzahl der Kanten mittels der graphbasierten Darstellung der Fasern, d5.) Bestimmung der Geradlinigkeit des Faserwachstums durch Berechnung der Winkelverteilung entlang der Hauptwachstumsrichtung und/oder mittels Hauptkomponentenanalyse zur Bestimmung der Variation orthogonal zur Hauptwachstumsrichtung auf Basis der kontinuierlichen Darstellung und/oder der interpolierten Darstellung und/oder durch Analyse der Krümmung entlang der Fasern auf Basis der kontinuierlichen Darstellung.Method for investigating the influence of substances on nerve fibers of projection systems comprising: a.) Cultivation i.) at least a first tissue sample isolated from a first region of the central nervous system of an animal, ii.) at least one second tissue specimen isolated from a second region of the central nervous system of an animal, under cell culture conditions, wherein the tissue samples i.) and ii.) are applied next to one another on a membrane at the beginning of the culture, b.) adding the substance to be investigated, c.) determining whether fibrous webs have formed between the tissue samples i.) and ii.) and imaging of the fibrous webs using imaging methods and d.) evaluation of the fiber properties in the obtained images, wherein step d.) comprises the following substeps: d1.) Skeletonization and extraction of the fibers, d2.) Determination of nodes of the extracted fibers and continuous reconstruction of the fiber paths between the nodes d3.) continuous representation and / or graph-based and / or interpolated representation of the fibers, wherein at least one of the following fiber parameters is determined as follows: d4.) determination of the fiber density by calculating the proportion of the foreground structures on the total image size or on the number of edges by means of the graph-based representation of the fibers, d5.) Determining the straightness of the fiber growth by calculating the angular distribution along the main growth direction and / or using principal component analysis to determine the variation orthogonal to the main growth direction based on the continuous representation and / or the interpolated representation and / or by analyzing the curvature along the fibers based on the continuous representation. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Gewebeprobe i.) aus dem Mittelhirn, Striatum oder Rückenmark und/oder die zweite Gewebeprobe aus dem Cortex stammt.A method according to claim 1, characterized in that the first tissue sample i.) Comes from the midbrain, striatum or spinal cord and / or the second tissue sample from the cortex. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass vor Schritt c.) ein Tracer zugeben wird, der in Schritt c.) durch bildgebende Verfahren detektiert wird.Method according to claim 1 or 2, characterized in that before step c.) A tracer is added, which is detected in step c.) By means of imaging methods. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich die Länge der Fasern und/oder deren Verzweigungsgrad bestimmt wird.Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that in addition the length of the fibers and / or their degree of branching is determined. Computerprogrammprodukt, welches Schritt d.) des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4 durchführt.Computer program product, which performs step d.) Of the method according to one of claims 1 to 4. Computerprogrammprodukt nach Anspruch 5, welches zusätzlich mindestens einen der Schritte a.), b.) und/oder c.) automatisiert.Computer program product according to claim 5, which additionally automates at least one of the steps a.), B.) And / or c.). Computer oder eine Datenverarbeitungsanlage auf dem das Computerprogrammprodukt nach Anspruch 5 oder 6 installiert ist.A computer or a data processing system on which the computer program product according to claim 5 or 6 is installed. Datenträger auf dem das Computerprogrammprodukt nach Anspruch 5 oder 6 gespeichert ist.A data carrier on which the computer program product according to claim 5 or 6 is stored. Testsystem, insbesondere zur Untersuchung des Einflusses von Substanzen auf Nervenfasern von Projektionssystemen, umfassend ein Computerprogrammprodukt nach Anspruch 5 oder einen Computer oder eine Datenverarbeitungsanlage nach Anspruch 7 oder einen Datenträger nach Anspruch 8 und mindestens einen der weiteren Komponenten ausgewählt aus: – Zellkulturmedien, – Tracer, – Fixierungsmittel, – Referenzsubstanzen, – ein bildgebendes System, – Handbuch.Test system, in particular for investigating the influence of substances on nerve fibers of projection systems, comprising a computer program product according to claim 5 or a computer or a data processing system according to claim 7 or a data carrier according to claim 8 and at least one of the further components selected from: - cell culture media, - tracers, Fixative, - reference substances, - an imaging system, - Manual. Testsystem nach Anspruch 9 zusätzlich umfassend: i.) mindest eine erste Gewebeprobe, die aus einer ersten Region des zentralen Nervensystems eines Tieres isoliert wurde, ii.) mindestens eine zweite Gewebeprobe, die aus einer zweiten Region des zentralen Nervensystems eines Tieres isoliert wurde, wobei die Gewebeproben i.) und ii.) nebeneinander auf einer Membran aufgebracht sind.Test system according to claim 9 additionally comprising: i.) at least a first tissue sample isolated from a first region of the central nervous system of an animal, ii.) at least one second tissue specimen isolated from a second region of the central nervous system of an animal, wherein the tissue samples i.) and ii.) are applied side by side on a membrane. Testsystem nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebeproben Gewebeschnitte sind, die vorzugsweise eine Dicke von 150 μm bis 350 μm, bevorzugt 200 bis 300 μm aufweisen, wobei die Gewebeproben i.) und ii.) bevorzugt zueinander einen Abstand von 0,05 cm bis 0,2 cm aufweisen.Test system according to claim 9 or 10, characterized in that the tissue samples are tissue sections, which preferably have a thickness of 150 microns to 350 microns, preferably 200 to 300 microns, wherein the tissue samples i.) And ii.) Preferably to each other a distance of 0 , From 05 cm to 0.2 cm.
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