DE102009013147A1

DE102009013147A1 - Method for spectroscopy analysis e.g. Raman-spectroscopy, of surface or volume section of sample e.g. biological cell, in measuring arrangement, involves integrating radiations registered in focus volume over duration of measuring interval

Info

Publication number: DE102009013147A1
Application number: DE200910013147
Authority: DE
Inventors: Carsten Dr. Bolwien
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2009-03-05
Filing date: 2009-03-05
Publication date: 2010-09-16

Abstract

The method involves stimulating radiation emission in a sample over an excitation optical path of a measuring arrangement. Emitted radiations from a focus volume of a measuring optical path of the arrangement are collected within a temporal measuring interval. The focus volume is moved over a surface or volume section of a sample by an optical scanner unit, where the surface or volume section corresponds to multiple of the focus volume. The radiations registered in the moved focus volume over the duration of the measuring interval are integrated. An independent claim is also included for a device for executing a method for spectroscopy analysis of a surface or volume section of a sample.

Description

Die Erfindung betrifft das technische Gebiet der spektroskopischen Analyse und Fluoreszenzmessung, besonders von mikropartikulären Proben mit zu analysierenden Oberflächen- oder Volumenabschnitten im Größenbereich von 1 bis 100 μm. Es wird ein verbessertes Messverfahren zur Registrierung der in dem Oberflächen- oder Volumenabschnitt einer Probe emittierten elektromagnetischen Strahlung bereitgestellt, welches die Nachteile von optischen Messeinheiten mit kleiner numerischer Apertur überwindet und eine hochempfindliche und schnelle Messung des gesamten Oberflächen- oder Volumenabschnitts ermöglicht.The The invention relates to the technical field of spectroscopic analysis and fluorescence measurement, especially of microparticulate Samples with surface or volume sections to be analyzed in Size range from 1 to 100 μm. It will an improved measuring method for registering the in the surface or volume portion of a sample emitted electromagnetic Radiation provided, which the disadvantages of optical measuring units with small numerical aperture overcomes and a highly sensitive and fast measurement of the entire surface or volume section allows.

Stand der TechnikState of the art

Bei der spektroskopischen Analyse ist es wünschenswert, einen möglichst großen Abschnitt einer Probe in einem einzigen Messdurchgang zu erfassen. Bei heterogenen Oberflächen von Proben oder Volumina, beispielsweise partikulären Proben oder kompartimentierten biologischen Zellen, oder bei Oberflächen, die mit Beschichtungen zur „surface enhanced” Ramanstreuung (SERS) versehen sind, besteht das technische Problem, dass innerhalb des zu untersuchenden Volumen- oder Flächenabschnitts der Probe optisch „aktive”, das heißt elektromagnetische Strahlung emittierende, Zonen, zum Beispiel bestimmte Zellkompartimente oder SERS-„hot-spots”, nur sporadisch vorhanden und insbesondere inhomogen verteilt sind. Aktive Zonen, deren Emissionen spektroskopisch analysierbar wären, liegen wie Inseln zwischen überwiegend optisch inaktiven Abschnitten. Das Gesamtsignal aus dem von der Probe regist rierten Volumen- oder Flächenabschnitten ist klein, trotz gegebenenfalls hoher lokaler Emission innerhalb der optisch aktiven Zonen.at In spectroscopic analysis, it is desirable to have a as large a section of a sample in one single measurement passage to capture. For heterogeneous surfaces of samples or volumes, for example particulate samples or compartmentalized biological cells, or on surfaces, those with coatings for "surface enhanced" Raman scattering (SERS), the technical problem is that within of the volume or area section to be examined Sample optically "active", that is electromagnetic Radiation emitting zones, for example certain cell compartments or SERS "hot-spots", only sporadically available and in particular are distributed inhomogeneous. Active zones whose emissions could be analyzed spectroscopically lie like islands between predominantly optically inactive sections. The total signal from the of the Sample registered volume or area sections is small, despite possibly high local emission within the optical active zones.

Zur verbesserten Analyse der Signale aus den optisch aktiven Zonen, soll das repräsentative Emissionsspektrum mit hoher Signalqualität und in kurzer Messzeit erfasst werden. Im Stand der Technik existieren bisher nicht zufriedenstellende Ansätze zur Lösung dieses Problems: Im Messstrahlengang werden beispielsweise optisch abbildende Einrichtungen (Objektive) mit kleiner numerischer Apertur eingesetzt, welche ein großes Fokusvolumen und damit verbundenes Detektionsvolumen aufweisen. Dadurch soll es ermöglicht werden, dass die emittierte Strahlung aus einem größeren Abschnitt der Probe gleichzeitig registriert werden kann. Nachteilig ist dabei vor allem, dass aufgrund der kleinen numerischen Apertur nur ein kleiner Raumwinkel zur Registrierung der in der Regel diffus emittierten Strahlung zur Verfügung steht, und deshalb innerhalb des Fokusvolumens nur ein geringer Anteil der Strahlung registriert werden kann.to improved analysis of the signals from the optically active zones, should the representative emission spectrum with high signal quality and recorded in a short measuring time. In the prior art exist so far unsatisfactory approaches to solving this Problems: In the measurement beam path, for example, optically imaging Devices (objectives) with small numerical aperture used, which a large focus volume and associated detection volume exhibit. This should make it possible for the emitted radiation from a larger section the sample can be registered at the same time. The disadvantage is especially that due to the small numerical aperture only one Small solid angle for the registration of the usually diffuse emitted Radiation is available, and therefore within the Focus volume registered only a small proportion of radiation can be.

Um schwache Signale zu kompensieren, müssen zusätzliche Maßnahmen ergriffen werden, die die Intensität der Emission und/oder die Empfindlichkeit der Messung erhöhen. Zur Verstärkung der Emission wird vor allem die Intensität der Anregungsstrahlung, die zur Anregung (insbesondere Fluoreszenz oder Ramanstreuung) der Emission eingesetzt wird erhöht. Dies hat bekannte Nachteile wie die Gleichung von lichtempfindlichen Strukturen in der Probe zur Folge. Außerdem ist der apparative Aufwand zur Bereitstellung einer höheren Lichtleistung des Anregungslichts, insbesondere in Form einer Laserlichtquelle, hoch und letztlich auch überproportional teuer. In einigen Fällen ist die weitere Steigerung der Lichtleistung von technischer Seite gar nicht möglich.Around To compensate for weak signals must be additional Measures are taken that reduce the intensity increase the emission and / or the sensitivity of the measurement. To intensify the emission, above all, the intensity the excitation radiation, the excitation (in particular fluorescence or Raman scattering) of the emission is increased. This has known disadvantages such as the equation of photosensitive Structures in the sample result. In addition, the apparatus is Effort to provide a higher light output the excitation light, in particular in the form of a laser light source, high and ultimately disproportionately expensive. In some Cases is the further increase in the light output of technical side not possible.

Alternativ oder zusätzlich wird deshalb die Messempfindlichkeit, beispielsweise durch Verlängern der Integrationszeit bei der Messung, erhöht. Eine lange Integrationszeit ist nachteilig, weil es die Gesamtmesszeit der Analyse verlängert und einen hohen Probendurchsatz und/oder die Analyse transienter Vorgänge in der Probe erschwert oder verhindert.alternative or additionally, therefore, the measurement sensitivity, for example by extending the integration time during the measurement, elevated. A long integration time is disadvantageous because it extends the total measurement time of analysis and one high sample throughput and / or the analysis of transient processes difficult or prevented in the sample.

Alternativ werden Maßnahmen ergriffen, die eine Registrierung der von der Probe emittierten Strahlung über einen möglichst großen Raumwinkel ermöglichen. Objektive mit hoher numerischer Apertur weisen typischerweise ein kleines Fokusvolumen und Detektionsvolumen auf, innerhalb dessen die von der Probe emittierte Strahlung registriert werden kann. Dadurch können pro Messung die Signale nur eines kleinen Abschnitts der Probe registriert oder analysiert werden. Zwar ist die Messung an der Stelle des Fokusvolumens hochempfindlich, nachteilig ist aber, dass das Fokusvolumen zur Messung stets gezielt auf die optisch aktive Zone in der Probe gerichtet werden muss, um gegebenenfalls ein verwertbares Signal zu erhalten. Dies ist nur in wenigen Fällen überhaupt technisch zufriedenstellend möglich. Es verlangt vor allem, dass die Probe, möglichst unter optischer Kontrolle in der Ausgangszone und in der Messzone des Fokusvolumens, festgehalten werden kann, damit die ausgewählte aktive Zone während der gesamten Messung innerhalb des Fokusvolumens bleibt. Dies ist besonders problematisch, wenn es sich bei der Probe um eine heterogene Struktur, beispielsweise eine biologische Zelle mit spektroskopisch unterschiedlich „aktiven” und gegebenenfalls nicht ortsfesten Kompartimenten handelt.alternative Measures are taken which require registration of the radiation emitted by the sample over as much as possible enable large solid angles. Lenses with high Numerical aperture typically have a small focus volume and detection volume within which the emitted from the sample Radiation can be registered. This allows per measurement the signals of only a small portion of the sample are registered or to be analyzed. Although the measurement is highly sensitive at the location of the focus volume, However, it is disadvantageous that the focus volume is always targeted for the measurement must be directed to the optically active zone in the sample, to obtain a usable signal if necessary. This is only in a few cases technically satisfactory possible. Above all, it requires that the sample, if possible under optical control in the exit zone and in the measuring zone of the focus volume, can be recorded so that the selected active zone throughout the measurement within the Focus volume remains. This is especially problematic when it the sample is a heterogeneous structure, such as a biological cell with spectroscopically different "active" and optionally non-stationary compartments.

Kleine partikuläre Proben wie biologische Zellen oder deren Teile, wie Organellen, Zellkern, etc. können außerdem unter dem Einfluss der Anregungsstrahlung wie in einer sogenannten „optischen Pinzette” an einer bestimmten Position, nämlich in der Regel im Zentrum der optischen Achse des Anregungsstrahlengangs, festgehalten werden, so dass sich der Fokus des Messstrahlengangs, der in der Regel konfokal zum Strahlengang der Anregungsstrahlung (Anregungsstrahlengang) verläuft, nicht mehr ohne weiteres gezielt auf andere Abschnitte der Probe richten lässt.little one particulate samples such as biological cells or their parts, like organelles, nucleus, etc. can as well under the influence of the excitation radiation as in a so-called "optical Tweezers "at a certain position, viz usually in the center of the optical axis of the excitation beam path, be held so that the focus of the measuring beam path, the usually confocal to the beam path of the excitation radiation (Excitation beam) runs, not more readily directed to other sections of the sample.

Beispielsweise wenn bei der spektroskopischen Analyse von biologischen Zellen sich der Zellkern als prominente Struktur innerhalb der Zelle stets in der optischen Achse der Anregungsstrahlung anordnet, kann von anderen Zellkompartimenten, Cytoplasma, Membranabschnitten, Organellen, kein repräsentatives Emissionspektrum registriert werden. Dieses Problem stellt sich auch, wenn versucht wird, einzelne Messungen zeitlich nacheinander an räumlich nebeneinander liegenden, angrenzenden oder sich überlappenden Flächen- oder Volumenabschnitten der biologischen Zelle durchzuführen: Auch wenn die Zelle selbst auf einem Substrat fixiert ist, „folgt” der Zellkern dem Anregungslichtkegel bei einzelnen Messungen benachbarter Abschnitte der Probe. Es existiert eine „Sogwirkung” der durch das Anregungslicht gebildeten optischen Pinzette für prominente Strukturen die innerhalb einer Probe beweglich sind, also insbesondere der Zellkern einer Zelle. Die Erfassung repräsentativer Emissionsspektren von Probenabschnitten, die zu solchen prominenten beweglichen Strukturen benachbart sind, ist mit bekannten sequenziellen Verfahren nicht oder nur unzureichend möglich.For example when in the spectroscopic analysis of biological cells themselves the nucleus is always prominent within the cell as a prominent structure the optical axis of the excitation radiation can order from others Cell compartments, cytoplasm, membrane sections, organelles, no representative emission spectrum can be registered. This problem also arises when trying to time individual measurements one after the other next to each other, adjacent to one another or overlapping area or volume sections to perform the biological cell: even if the cell itself fixed on a substrate, "follows" the Cell nucleus the excitation light cone in individual measurements of adjacent Sections of the sample. There is a "suction effect" of formed by the excitation light optical tweezers for prominent structures that are mobile within a sample, in particular the cell nucleus of a cell. The capture of representative Emission spectra of sample sections leading to such prominent movable structures are adjacent, is known with sequential Procedure not or only insufficiently possible.

Ebenfalls im Stand der Technik unbefriedigend gelöst ist die spektroskopische Analyse von SERS-aktivierten Oberflächen, beispielsweise im Rahmen der Materialprüfung. SERS-Oberflächen weisen sporadisch verteilte sogenannte „hot spots” mit hoher optischer Aktivität (hohe Strahlungsemission) auf. Es soll mit ausreichend hoher Messgeschwindigkeit und/oder hoher Empfindlichkeit ein großer Flächen- oder Volumenabschnitt der Probe in möglichst einer Messung analysiert werden, um ein repräsentatives Emissionsspektrum von der Probe zu erhalten. Dazu muss der Flächen- oder Volumenabschnitt zumindest so groß gewählt werden, dass eine ausreichend große Zahl an „hot spots” darin enthalten ist.Also unsolved satisfactorily in the prior art is the spectroscopic Analysis of SERS-enabled surfaces, for example as part of the material testing. SERS surfaces have sporadically distributed so-called "hot spots" with high optical activity (high radiation emission). It should have a sufficiently high measuring speed and / or high Sensitivity a large area or volume section the sample is analyzed in one possible measurement, to get a representative emission spectrum from the sample to obtain. This requires the area or volume section at least so great that one is sufficient large number of "hot spots" included is.

Ein weiteres Problem, das im Zusammenhang mit der SERS-Methode steht, besteht darin, dass durch die Metallinseln, welche die Anregungswellenlänge absorbieren und damit für eine Verstärkung des Signals sorgen, bei einer Steigerung der Lichtleistung der Anregungsstrahlung letztlich zuviel Energie absorbieren können und damit die Gefahr besteht, dass die zu analysierende Oberfläche der Probe zerstört wird; die Lichtleistung der Anregungsstrahlung ist also besonders bei der SERS-Methode nicht beliebig steigerbar.One another problem related to the SERS method, is that through the metal islands, which the excitation wavelength absorb and thus for a reinforcement of the Signal provide, with an increase in the light output of the excitation radiation can ultimately absorb too much energy and thus the There is a risk that the surface to be analyzed may be Sample is destroyed; the light output of the excitation radiation So, especially with the SERS method, it can not be increased arbitrarily.

Aufgabenstellungtask

Eine Aufgabe der Erfindung ist es, ein spektroskopisches Analyseverfahren so weiterzubilden, dass die Analyse von vor allem inhomogenen oder heterogenen Strukturen, besonders mit sporadisch und heterogen verteilten spektroskopisch optisch aktiven Zonen, wie kompartimentierte Zellen, Volumina und/oder Oberflächen mit SERS „hot spots”, einfacher, schneller und/oder präziser durchgeführt werden kann. Dabei soll möglichst die Messgenauigkeit oder Sensitivität des Systems verbessert und dabei möglichst die Messzeit zur Erfassung repräsentativer Spektren verringert werden.A The object of the invention is a spectroscopic analysis method so on, that the analysis of above all inhomogeneous or heterogeneous structures, especially with sporadically and heterogeneously distributed spectroscopically optically active zones, such as compartmented cells, Volumes and / or surfaces with SERS "hot spots", easier, faster and / or more precise can be. It should as possible the accuracy or Sensitivity of the system improved and possible reduces the measurement time for acquiring representative spectra become.

In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur spektroskopischen Analyse eines Flächen- oder Volumenabschnitts einer Probe in einer Messanordnung mit Anregungsstrahlengang und Messstrahlengang, wobei über den Anregungsstrahlengang in der Probe Strahlungsemission angeregt und emittierte Strahlung von einem Fokusvolumen des Messstrahlengangs innerhalb eines zeitlichen Messintervalls aufgefangen wird, welches vor allem dadurch gekennzeichnet ist, dass

– das Fokusvolumen über den Flächen- oder Volumenabschnitt, welcher einem Mehrfachen des Fokusvolumens entspricht, bewegt wird und
– die im bewegten Fokusvolumen über die Dauer des Messintervalls registrierte Strahlung integriert wird.

In a first aspect, the invention relates to a method for the spectroscopic analysis of a surface or volume section of a sample in a measuring arrangement with excitation beam path and measurement beam path, wherein radiation emission is excited via the excitation beam path in the sample and emitted radiation is absorbed by a focus volume of the measurement beam path within a time measurement interval , which is mainly characterized in that

- The focus volume over the area or volume portion which corresponds to a multiple of the focus volume is moved, and
- the radiation registered in the moving focus volume over the duration of the measurement interval is integrated.

Die im bewegten Fokusvolumen registrierte Strahlung wird bevorzugt so integriert, dass in einem, vorzugsweise einzigen, zeitlichen Messintervall ein Summensignal erhalten wird, welches den gesamten Flächen- oder Volumenabschnitt der Probe repräsentiert.The Radiation registered in the moving focus volume is preferably so integrated, that in a, preferably single, time measurement interval a sum signal is obtained, which the entire area or Volume section of the sample represents.

Die spektroskopische Analyse im Sinne der Erfindung ist bevorzugt ausgewählt aus: Fluoreszenz-Spektroskopie, Raman-Spektroskopie, SERS, IR-Spektroskopie und verwandten oder davon abgeleiteten spektroskopischen Verfahren.The spectroscopic analysis in the sense of the invention is preferably selected from: fluorescence spectroscopy, Raman spectroscopy, SERS, IR spectroscopy and related or derived spectroscopic methods.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Vorrichtung, die geeignet ist und insbesondere speziell ausgebildet ist zur Durchführung des Verfahrens der spektroskopischen Analyse eines Flächen- oder Volumenabschnitts einer Probe gemäß der Erfindung. Die Vorrichtung enthält dabei zumindest: mikroskop-optische Anordnung, Anregungsstrahlungsquelle zur Anregung elektromagnetischer Strahlung in einer Probe und Messeinrichtung mit Messstrahlengang zur Registrierung von der Probe emittierter elektromagnetischer Strahlung der Probe, wobei der Messstrahlengang eine numerische Apertur und ein Fokusvolumen zur Registrierung emittierter Strahlung aufweist. Die Vorrichtung ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, dass das Fokusvolumen um ein Mehrfaches kleiner ist als der zu analysierende Flächen- oder Volumenabschnitt der Probe und dass das Fokusvolumen während der Messung über den Flächen- oder Volumenabschnitt bewegbar ist.In a further aspect, the invention relates to a device which is suitable and in particular is specially adapted for carrying out the method of spectroscopic analysis of a surface or volume portion of a sample according to the invention. The device contains at least: microscope-optical arrangement, excitation radiation source for exciting electromagnetic radiation in a sample and measuring device with measuring beam path for registration of the sample emitted electromagnetic radiation of the sample, wherein the measurement beam path has a numerical aperture and a focus volume for registration of emitted radiation. The device according to the invention is characterized in that the focus volume is smaller by a multiple than the area or volume section of the sample to be analyzed and that the focus volume can be moved during the measurement over the area or volume section.

Die Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem also primär durch die Bereitstellung eines neuartigen Verfahrens der insbesondere spektroskopischen oder fluoreszenzoptischen Analyse einer Probe, besonders einer partikulären Probe oder einer Probe mit heterogen und/oder sporadisch verteilten optisch aktiven Zonen innerhalb der zu untersuchenden Flächen- oder Volumenabschnitte. Die Probe wird dabei zumindest innerhalb des zu untersuchenden Flächen- oder Volumenabschnitts mittels Anregungsstrahlung (Anregungsstrahlengang) angeregt, elektromagnetische Strahlung zu emittieren. Bevorzugterweise emittieren ein oder mehrere optisch aktive Zonen innerhalb des untersuchten Flächen- oder Volumenabschnitts der Probe diese Strahlung. Diese Strahlung, insbesondere Fluoreszenz und Ramanstreustrahlung, wird von einer optischen Messeinrichtung zu deren Registrierung aufgefangen. Die optische Messeinrichtung weist dazu also zumindest einen Messstrahlengang (Detektionsstrahlengang) auf, der im Flächen- oder Volumenabschnitt der Probe fokussiert wird und dort einen Fokus, also ein räumlich abgegrenztes Fokusvolumen bildet, innerhalb dessen die emittierte Strahlung registriert werden kann (Detektionsvolumen). Der Messstrahlengang weist eine im Wesentlichen durch die Bauart der Messeinrichtung, insbesondere des Objektivs und dessen Frontlinse bedingte numerische Apertur und ein damit im direkten Zusammenhang stehendes begrenztes Fokusvolumen des Messstrahlengangs auf.The Invention solves the underlying technical problem primarily by providing a novel method in particular spectroscopic or fluorescence optical analysis a sample, especially a particulate sample or a Sample with heterogeneously and / or sporadically distributed optically active Zones within the area or volume to be examined. The sample is thereby at least within the surface area to be examined. or volume section by means of excitation radiation (excitation beam path) stimulated to emit electromagnetic radiation. preferably, emit one or more optically active zones within the examined one Area or volume portion of the sample this radiation. This radiation, in particular fluorescence and Raman radiation, is from an optical measuring device to their registration collected. The optical measuring device has so at least a measuring beam path (detection beam path), which in the area or volume portion of the sample is focused and there is a focus, thus forms a spatially delimited focus volume, within which the emitted radiation can be registered (detection volume). The measuring beam path has a substantially by the type the measuring device, in particular the lens and its front lens conditional numerical aperture and one directly related standing limited focus volume of the measuring beam path.

Die zur Analyse durchgeführte mindestens eine, bevorzugt aber die einzige, Messung findet also innerhalb eines bevorzugt einzigen zeitlichen Messintervalls statt. Innerhalb dieses Messintervalls wird die emittierte Strahlung aus einem Flächen- oder Volumenabschnitt der Probe registriert und mindestens ein Messwert, der die Emission der optisch aktiven Zone(n) in dem gesamten Flächen- oder Volumen-Abschnitt repräsentiert, registriert. Dieser Messwert ist in einer ersten Variante der Erfindung ein Skalar, welcher der in diesem Flächen- oder Volumenabschnitt emittierten elektromagnetischen Strahlung proportional ist.The for analysis carried out at least one, but preferably the only measurement thus takes place within a single preferred one time measurement interval. Within this measurement interval the emitted radiation is a surface or volume section the sample is registered and at least one reading that indicates the emission the optically active zone (s) in the entire surface or Volume section represents, registered. This reading In a first variant of the invention, a scalar, which is the in this area or volume section emitted electromagnetic Radiation is proportional.

In einer alternativen und bevorzugten Variante ist das Messergebnis ein Spektrum (Spektrogramm) der im gemessenen Flächen- oder Volumenabschnitt einer Probe emittierten elektromagnetischen Strahlung. Dazu wird die spektrale Verteilung der Strahlung ermittelt, indem insbesondere die Frequenz/Wellenlänge gegen ihre Intensität aufgetragen wird. Bevorzugte Ausführungsformen sind die Ramanspektroskopie und die Fluoreszenzspektroskopie.In an alternative and preferred variant is the measurement result a spectrum (spectrogram) of the measured area or volume portion of a sample emitted electromagnetic Radiation. For this purpose, the spectral distribution of the radiation is determined, in particular by the frequency / wavelength against their Intensity is applied. Preferred embodiments are Raman spectroscopy and fluorescence spectroscopy.

Die Erfindung sieht primär ein Verfahren vor, worin das Fokusvolumen des Messstrahlengangs zur Registrierung der Emissionen während der Messung, das heißt besonders zumindest innerhalb des Messintervalls, den zu messenden Flächen- oder Volumenabschnitt der Probe, gegebenenfalls mehrfach, bevorzugt wiederkehrend und bevorzugt mit hoher Frequenz beziehungsweise Geschwindigkeit des Fokusvolumens, besonders in lateraler Ausdehnung der Probe (x-Richtung, y-Richtung), überstreicht, so dass Emissionen von sich im jeweils momentanen Fokusvolumen befindlichen optisch aktiven Zonen aufgefangen und alle während der Messung in dem gesamten Flächen-/Volumenabschnitt aufgefangenen Emissionen und innerhalb des Messintervalls zeitlich zu einem Summensignal integriert werden oder werden können. Sie löst so das zugrunde liegende technische Problem vollständig.The The invention primarily provides a method wherein the focus volume of the measuring beam path for registration of emissions during the measurement, that is especially at least within the Measuring interval, the area or volume section to be measured the sample, optionally several times, preferably recurring and preferably with high frequency or speed of Focus volume, especially in lateral extension of the sample (x-direction, y-direction), so that emissions by itself in each momentary focus volume located optically active Zones are collected and all during the measurement throughout Area / volume intercepted emissions and integrated into a sum signal within the measuring interval be or can become. It's the reason for that lying technical problem completely.

Die Erfindung erlaubt, dass das Verfahren in einer bekanntermaßen für die Registrierung schwacher Emissionen, beispielsweise Fluoreszenz oder Ramanstreuung, geeigneten optischen Einrichtung, insbesondere eine Mikroskop-basierte Anordnung, mit hoher numerischer Apertur, insbesondere 0,7 oder größer, im Falle von Immersionsobjektiven bevorzugt größer als 1,0, durchgeführt werden kann. Eine gemäß der Erfindung wählbare und bevorzugte hohe numerische Apertur gestattet es, die Emissionen über einen möglichst großen Raumwinkel aufzunehmen. Der damit bisher verbundene Nachteil, bekanntermaßen Signale eines nur sehr begrenzten Fokusvolumens, insbesondere 1 μm³ (1 fL) oder kleiner, registrieren zu können, wird durch die Lehre der Erfindung, das Fokusvolumen wäh rend der Messung über den zu messenden Flächen- oder Volumenabschnitt der Probe zu bewegen und die Messsignale aus dem Fokusvolumen zeitlich zu integrieren, überwunden.The invention allows the method in a known for the registration of low emissions, such as fluorescence or Raman scattering, suitable optical device, in particular a microscope-based arrangement, with high numerical aperture, in particular 0.7 or larger, in the case of immersion objectives preferably larger as 1.0, can be performed. A selectable according to the invention and preferred high numerical aperture allows to record the emissions over the largest possible solid angle. The previously associated disadvantage, known to be able to register signals of only a very limited focus volume, in particular 1 micron ³ (1 fL) or smaller, is the teaching of the invention, the focus volume currency rend the measurement over the surface or volume section to be measured to overcome the sample and temporally integrate the measurement signals from the focus volume, overcome.

Dank der vorliegenden Erfindung ist es vorteilhaft möglich, mit einer so genannten und bekanntermaßen „hoch geöffneten” Optik mit numerischer Apertur von bevorzugt 0,7 oder größer, besonders bevorzugt 1,0 oder größer, dennoch die Emissionen aus einem großen Flächen- oder Volumenabschnitt einer Probe, besonders aber aus der gesamten Probe, innerhalb einer bevorzugt einzigen Messung, das heißt innerhalb eines einzigen abgeschlossenen zeitlichen Messintervalls, zu registrieren und gegebenenfalls zu analysieren. Die Registrierung erfolgt bevorzugt in Form eines repräsentativen Emissionsspektrums von dem Flächen- oder Volumenabschnitt der Probe.thanks The present invention advantageously makes it possible to with a so-called and known "high open "optics with numerical aperture of preferably 0.7 or greater, more preferably 1.0 or greater, yet emissions from one large area or volume section of a sample, but especially from the entire sample, within a preferred single measurement, that is within a single completed time measurement interval, to register and, if necessary, to analyze. Registration is preferably in the form of a representative Emission spectrum of the area or volume section the sample.

Der Flächenabschnitt beziehungsweise Volumenabschnitt der Probe, innerhalb dessen erfindungsgemäß die emittierte Strahlung registriert wird, beträgt erfindungsgemäß ein Vielfaches, bevorzugt mindestens das Zehnfache, besonders bevorzugt mindestens das Hundertfache des vom statischen Fokusvolumen der eingesetzten optischen Anordnung registrierten Flächenabschnitt der Probe: Bei einem Fokusvolumen von 1 µm³ wird näherungsweise von einem statisch registrierten Flächenabschnitt auf der Probe von 1 µm² ausgegangen (x- und y-Richtung). Durch das erfindungsgemäße Vorgehen kann dieser Flächenabschnitt auf bevorzugt 100 µm² oder mehr, bevorzugt 500 µm² oder mehr, vergrößert sein.According to the invention, the area section or volume section of the sample within which the emitted radiation is registered is a multiple, preferably at least ten times, more preferably at least one hundred times the area section of the sample registered by the static focus volume of the optical arrangement used: With a focal volume of 1 μm ³ is approximately assumed by a statically registered surface portion on the sample of 1 micron ² (x and y direction). By virtue of the procedure according to the invention, this surface section can be enlarged to preferably 100 μm ² or more, preferably 500 μm ² or more.

Bevorzugt wird das Fokusvolumen durch eine in einem optischen System der Messeinrichtung vorgesehene optische Scannereinheit, bevorzugt in zumindest einer Raumrichtung periodisch bewegt wird. In einer Variante wird das Fokusvolumen nach einem strukturierten Muster geordnet bewegt (Scanning). In einer alternativen Variante wird das Fokusvolumen stochastisch oder quasi-stochastisch bewegt (Wobble).Prefers is the focus volume through a in an optical system of the measuring device provided optical scanner unit, preferably in at least one Spatial direction is moved periodically. In a variant that will Focus volume ordered according to a structured pattern (scanning). In an alternative variant, the focus volume becomes stochastic or quasi-stochastically moved (wobble).

Bevorzugt beträgt die Grundfrequenz der insbesondere periodischen Bewegung des Fokusvolumens zumindest im Bereich des zu untersuchenden Flächenabschnitts beziehungsweise Volumenabschnitts der Probe, zumindest über die Dauer des Messintervalls, von 1 bis 1000 Hz, bevorzugt von 2 bis 200 Hz.Prefers is the fundamental frequency of the particular periodic Movement of the focus volume at least in the area to be examined Surface section or volume section of the sample, at least over the duration of the measurement interval, from 1 to 1000 Hz, preferably from 2 to 200 Hz.

Bevorzugt beträgt die Amplitude der Bewegung des Fokusvolumens, zumindest über die Dauer des Messintervalls, 1 bis 100 µm, bevorzugt 2 bis 10 µm.Prefers is the amplitude of the movement of the focus volume, at least about the duration of the measuring interval, 1 to 100 μm, preferably 2 up to 10 μm.

Bevorzugt beträgt die Geschwindigkeit der Bewegung des Fokusvolumens zumindest im Bereich des zu untersuchenden Flächenabschnitts beziehungsweise Volumenabschnitts, zumindest über die Dauer des Messintervalls, im Mittel mindestens 1 mm/s, bevorzugt 2 mm/s oder mehr, mehr bevorzugt 10 mm/s oder mehr, vorzugsweise bis 100 mm/s. Besonders bevorzugt beträgt die Geschwindigkeit der Bewegung des Fokusvolumens im Bereich des zu untersuchenden Flächenabschnitts beziehungsweise Volumenabschnitts, zumindest über die Dauer des Messintervalls, stets 2 mm/s oder mehr, besonders stets 10 mm/s oder mehr. Bevorzugt werden maximale Geschwindigkeiten bis 100 mm/s gewählt.Prefers is the speed of movement of the focus volume at least in the area of the surface section to be examined or volume section, at least over the duration the measuring interval, on average at least 1 mm / s, preferably 2 mm / s or more, more preferably 10 mm / s or more, preferably up to 100 mm / s. Particularly preferably, the speed of the Movement of the focus volume in the region of the surface to be examined or volume section, at least over the duration of the measuring interval, always 2 mm / s or more, especially always 10 mm / s or more. Maximum speeds of up to 100 mm / s are preferred selected.

Bevorzugt wird die Geometrie und/oder Position des Flächen- oder Volumenabschnitts (Scanbereich), der von dem sich erfindungsgemäß bewegenden Fokusvolumen zumindest während der Messung überstrichen wird, anhand mikrophotographischer Daten der Probe, die insbesondere unmittelbar zuvor erhoben wurden, bevorzugt automatisch, besonders bevorzugt durch automatische Bildanalyse gestützt, festgelegt. Bevorzugt ist die Messung ausschließlich auf diesen Abschnitt beschränkt.Prefers is the geometry and / or position of the area or Volume section (scan area), of the moving according to the invention Focus volume swept over at least during the measurement is, based on photomicrographic data of the sample, in particular collected immediately before, preferably automatically, especially preferably supported by automatic image analysis. Preferably, the measurement is exclusively on this section limited.

Bevorzugt hält der Anregungsstrahl die Probe, insbesondere einer partikulären Probe, bevorzugt einer biologischen Zelle, zumindest für die Dauer der Messung ortsfest; insbesondere vermittelst der Wirkung der „optischen Pinzette”. Vorzugsweise werden die Tiefpasseigenschaften des mechanischen Systems der Probe ausgenützt, indem die Bewegungsparameter der erfindungsgemäßen Scanbewegung bevorzugt so gewählt werden, dass die Probe zwar im Anregungsstrahl festgehalten wird, dessen bevorzugt vorgesehenen Scanbewegungen im einzelnen aber nicht folgen kann.Prefers the excitation beam holds the sample, in particular one particulate sample, preferably a biological cell, stationary for at least the duration of the measurement; especially by means of the effect of "optical tweezers". Preferably, the low pass characteristics of the mechanical system become the sample exploited by the motion parameters of scanning movement according to the invention preferably be chosen so that the sample is indeed held in the excitation beam whose but preferably do not follow preferred scanning movements in detail can.

Detaillierte Beschreibung der ErfindungDetailed description the invention

Im Zusammenhang mit der Erfindung wird ein „Flächenabschnitt” der Probe als die in x- und y-Richtung, und zwar senkrecht zur optischen Achse des Messstrahlengangs (z-Richtung), aufgespannte Fläche angesehen. Besonders entspricht dies der primären Ebene der Probe, beispielsweise die Ebene eines Objektträgers oder der Boden eines Zellkulturgefäßes worauf die Probe angeordnet oder fixiert ist, oder eine SERS-aktive Oberfläche eines Materials. Im Zusammenhang mit der Erfindung wird ein „Volumenabschnitt” der Probe als der in x- und y-Richtung, also senkrecht zur optischen Achse des Messstrahlengangs, und in z-Richtung, das heißt in Richtung der optischen Achse, ausgedehnte Raum angesehen.in the In connection with the invention, a "surface section" of Sample as the in x- and y-direction, perpendicular to the optical Axis of the measuring beam path (z-direction), spanned surface considered. This is especially the primary level the sample, for example the plane of a slide or the bottom of a cell culture vessel on the sample is placed or fixed, or a SERS-active surface of a material. In the context of the invention, a "volume portion" of Sample as the in x and y direction, that is perpendicular to the optical Axis of the measuring beam path, and in the z direction, that is viewed in the direction of the optical axis, extended space.

Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter „mikroskop-basierter Anordnung” oder „mikroskopoptisches System” im einfachsten Fall ein Lichtmikroskop mit Abbe'scher Abbildung verstanden. Weitere Ausführungen solcher Anordnungen, die insbesondere für ramanspektroskopische Analysen und/oder Fluoreszenzanalysen geeignet sind, kennt der Fachmann. Besonders bevorzugt sind Fluoreszenzmikroskope und Konfokalmikroskope.In the context of the invention is under "microscope-based arrangement" or "microscopically In the simplest case, a light microscope with Abbe's image is understood. Other embodiments of such arrangements, which are particularly suitable for Raman spectroscopic analyzes and / or fluorescence analyzes, the skilled person knows. Particularly preferred are fluorescence microscopes and confocal microscopes.

Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter „numerischer Apertur” (Formelzeichen: NA, n. A. oder AN) das Produkt aus dem Sinus des halben objektseitigen Öffnungswinkels (Akzeptanzwinkel) α und dem Brechungsindex n der Umgebung verstanden. An Luft (n = 1) ist die numerische Apertur immer kleiner als 1. Sie kann Werte größer als 1 annehmen, wenn der Raum zwischen Probe und Objektiv mit einer Immersionsflüssigkeit gefüllt wird, deren Brechungsindex n größer ist als 1. Immersionsobjektive besitzen insbesondere eine numerische Apertur von 1,2 bis 1,4. Ein optisch abbildendes Element, insbesondere ein Objektiv, wird durch seine Vergrößerung, seine numerische Apertur, den optischen Arbeitsabstand und den rückwärtigen Abbildungsabstand charakterisiert. Der Öffnungswinkel des Objektivs wird durch eine Blende in der hinteren Brennebene des Objektivs bestimmt. Aus bautechnischer Sicht ist aber vor allem die Fassung der ersten Linse limitierend. Analog zur numerischen Apertur ist vor allem in der Fotografie das Öffnungsverhältnis be kannt; das Öffnungsverhältnis bezieht sich dabei auf den bildseitigen Öffnungswinkel.in the In connection with the invention, the term "numerical Aperture "(symbol: NA, n.A. or AN) the product from the sine of half the object-side opening angle (Acceptance angle) α and the refractive index n of the environment Understood. In air (n = 1) the numerical aperture is always smaller as 1. It can accept values greater than 1 if the space between sample and lens with an immersion liquid is filled, whose refractive index n larger is as 1. Immersionsobjektive own in particular a numerical Aperture from 1.2 to 1.4. An optically imaging element, in particular a lens, through its magnification, becomes its numerical aperture, the optical working distance and the backward Imaging distance characterized. The opening angle of the Lens is through a shutter in the rear focal plane of the Objectively determined. From a structural point of view, however, is above all limiting the version of the first lens. Analogous to numeric Aperture is the aperture ratio, especially in photography known; the aperture ratio refers to it on the image-side opening angle.

Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter einem „Fokusvolumen” die räumliche Ausdehnung des „theoretischen” Brennpunkts des Messstrahlengangs verstanden. Ohne an die Theorie gebunden sein zu wollen, ist der in Praxis entstehende Brennpunkt kein mathematischer Punkt, sondern ein Fokusraum, der desto kleiner wird, je größer die numerische Apertur des verwendeten Objektivs ist. Da die numerische Apertur nur einen gewissen bauartbedingten maximalen Wert annehmen kann, bleibt das Volumen des Fokus stets endlich; es ist letztlich „beugungsbegrenzt”. Unter „Fokusvolumen” wird auch derjenige Raum verstanden, worin die Emissionen der Probe vom Messstrahlengang (Detektionsstrahlengang) „aufgefangen” und in der Messeinrichtung (Detektor) registriert werden können. Je nach Bauart der optischen Anordnung kann das Detektionsvolumen kleiner als das Fokusvolumen sein, aber entspricht in bevorzugter Ausführung im Wesentlichen dem Fokusvolumen. Bei hohen numerischen Aperturen, d. h. etwa 1,2 (Wasserimmersion) oder 1,4 (Ölimmersion) werden Volumina von etwa 1 bis 2 fL (Femtoliter) erreicht. Bildet man den Objektraum über eine konfokale Lochblende (Konfokalmikroskop) auf einen Messdetektor ab, so entsteht ein Detektionsvolumen von weniger als 1 fL.in the In connection with the invention is under a "focus volume" the Spatial extension of the "theoretical" focus understood the measuring beam path. Without being bound by theory to want to, the focus in practice is not mathematical Point, but a focus space, the smaller, the bigger is the numerical aperture of the lens used. Because the numeric Aperture only assume a certain design-related maximum value can, the volume of the focus always remains finite; it is ultimately "diffraction-limited". Under "Focus Volume" is also the one room understood, wherein the emissions of the sample from the measuring beam path (Detection beam path) "intercepted" and in the measuring device (detector) can be registered. Depending on the design of the optical arrangement, the detection volume smaller than the focus volume, but is more preferable Execution essentially the focus volume. At high numerical apertures, d. H. about 1.2 (water immersion) or 1.4 (Oil immersion) are volumes of about 1 to 2 fL (femtoliters) reached. Forming the object space via a confocal Aperture plate (confocal microscope) on a measuring detector from, so arises a detection volume of less than 1 fL.

Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter der „Amplitude” die momentan gewählte oder maximal erreichbare Ausdehnung des Scanfelds in einer Raumrichtung, bevorzugt in x- oder y-Richtung (bei zweidimensionalem Scan) das heißt des vom sich bewegenden Fokusvolumen überstrichenen Flächen-/Volumenabschnitts. Im Falle eines kreisförmigen Scanfelds entspricht der Amplitudenwert dem Durchmesser dieses Kreises. Im Falle eines ellipsenförmigen Flächenabschnitts entspricht der Amplitudenwert vor allem dem Durchmesser der Ellipse in Längsrichtung.in the In connection with the invention, the "amplitude" is the currently selected or maximum achievable extent of Scan field in a spatial direction, preferably in the x or y direction (in two-dimensional scan) that is, that of the moving one Focus volume swept area / volume section. In the case of a circular scan field, the amplitude value corresponds the diameter of this circle. In the case of an elliptical Area section corresponds to the amplitude value above all the diameter of the ellipse in the longitudinal direction.

Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter einer „Grundfrequenz” die Frequenz eines insbesondere periodischen Vorgangs verstanden, bei dem sich ein bestimmtes Muster ständig wiederholt. So beschreibt die Grundfrequenz, wie häufig eine solche Muster-Wiederholung stattfindet. In der Realität sind periodische Schwin gungen aber auch nicht periodische Bewegungen immer mit einem gewissen Anteil an Nebenwellen oder Oberwellen behaftet. Ein zeitliche Abfolge lässt sich durch die Überlagerung von sinusförmigen Schwingungen beschreiben (Fourier-Komponenten; Fourier-Transformation). Periodische Signale sind nur aus Fourier-Komponenten zusammengesetzt, bei denen die Frequenz ein Vielfaches der Grundfrequenz der Grundschwingung beträgt. Die anderen höherfrequenten Komponenten, deren Frequenz ein Vielfaches der Grundfrequenz betragen, werden auch Harmonische, Partial-, Teil, oder Oberschwingungen bezeichnet. Ihr relativer Anteil am Gesamtsignal ist vor allem von systembedingten Parametern wie Resonanzen und frequenzabhängigen Kopplungen abhängig.in the In connection with the invention is under a "fundamental frequency" the Frequency of a particular periodic process understood at which a certain pattern constantly repeats itself. So describes the fundamental frequency, how common such pattern repetition takes place. In reality, there are periodic oscillations but also not periodic movements always with a certain Proportion of spurious waves or harmonics. A chronological sequence is due to the superimposition of sinusoidal vibrations describe (Fourier components; Fourier transformation). periodic Signals are composed only of Fourier components in which the frequency is a multiple of the fundamental frequency of the fundamental is. The other higher-frequency components, whose frequency is a multiple of the fundamental frequency be also called harmonic, partial, partial, or harmonics. Their relative share of the total signal is mainly of systemic Parameters such as resonances and frequency-dependent couplings dependent.

Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter einer „biologischen Probe” eine oder mehrere biologische Zellen, einzeln oder in Zellverbünden, Gewebe, Transplantate, Implantate, Organ- und Gewebeersatzpräparate und Teile davon verstanden. Als biologische Zellen gelten hier vor allem tierische und menschliche Zellen, wie Gewebe-, Embryonalzellen oder Stammzellen, Bakterienzellen und Bakteriensporen, Mykoplasmen, Pilzzellen, -hyphen und -sporen. Dabei muss die biologische Probe nicht notwendigerweise solche Zellen enthalten; Detektion und Identifikation in einer Probe potentiell enthaltener Zellen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die biologische Probe ist eine potentiell mindestens eine biologische Zelle enthaltende Zusammensetzung; darunter sind auch klinische Proben, Biopsien, sowie flüssige und überwiegend nicht flüssige biologische Proben von Geweben, Transplantaten, Organ- und Gewebeersatzpräparaten und Teilen davon und Rückstände der Sterilfiltration zu verstehen.in the The invention relates to a "biological Sample "one or more biological cells, individually or in cell networks, tissues, transplants, implants, organ and tissue replacement preparations and parts thereof. When biological cells are primarily animal and human cells, such as tissue, embryonic or stem cells, bacterial cells and Bacterial spores, mycoplasmas, fungal cells, hyphae and spores. there the biological sample does not necessarily contain such cells; Detection and identification potentially contained in a sample Cells are also the subject of the present invention. The biological sample is a potentially at least one biological Cell-containing composition; including clinical ones Samples, biopsies, as well as liquid and mostly not liquid biological samples of tissues, transplants, Organ and tissue replacement preparations and parts thereof and To understand residues of sterile filtration.

Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter „Partikel” oder „partikulär” auch eine biologische Zelle oder ein Teil einer biologischen Zelle verstanden, die in einer biologischen Probe, beispielsweise in Form einer Flüssigkeit vorliegen kann. Unter „Partikel” werden auch alle individualisierbaren oder kategorisierbaren Zellen oder Zellfragmente, die in biologischen Proben, besonders in Zellverbünden, Geweben, Transplantaten, Implantaten, Organ- und Gewebeersatzpräparaten oder Teilen davon vorhanden sind, verstanden. Ist in die Fragestellung der Analyse primär auf die Charakterisierung von Vita lität oder Differenzierungsstadium von Gewebezellen gerichtet, so erlaubt die Vorauswahl anhand der Kategorisierung der im mikroskopischen Bild detektierten Gewebezellen, beispielsweise Chondrozyten, die gezielte spektroskopische Analyse dieser Zellen auf „Vitalitätsmarken” beziehungsweise „Gewebetypmarker” die anhand von spezifischen Kennwerten der Raman-Spektrogramme erkennbar sind.in the The invention also refers to "particles" or "particulate" understood a biological cell or a part of a biological cell, in a biological sample, for example in the form of a liquid may be present. Under "particles" are also all individualizable or categorizable cells or cell fragments, in biological samples, especially in cell networks, Tissues, transplants, implants, organ and tissue replacement preparations or parts thereof are understood. Is in the question analysis primarily on the characterization of health or stage of differentiation of tissue cells, so allowed the preselection based on the categorization of the microscopic Image detected tissue cells, such as chondrocytes, the Targeted spectroscopic analysis of these cells on "vitality brands" or "tissue type markers" recognizable by specific characteristics of the Raman spectrograms are.

Die Erfindung erlaubt Messungen von größeren Flächen- oder Volumenabschnitten einer Probe in einer einzigen Messung mittels Integration lokaler Signale. Die Messung kann vorteilhafterweise mit höherer Geschwindigkeit, höherem Probendurchsatz und/oder bevorzugt höherer Empfindlichkeit bei der Registrierung der Emission durchgeführt werden. Die Erfindung ermöglicht erstmals die zuverlässige und einfache Registrierung gemittelter, repräsentativer Spektren von Flächen- oder Volumenabschnitten partikulärer und/oder inhomogener Proben oder Oberflächen.The Invention allows measurements of larger area or volume sections of a sample in a single measurement using Integration of local signals. The measurement can be advantageous with higher speed, higher sample throughput and / or preferably higher sensitivity in registering the Emission are carried out. The invention allows the first time the reliable and easy registration averaged, representative spectra of area or volume sections particulate and / or inhomogeneous samples or surfaces.

Die Erfindung erlaubt es, die spektroskopische Messung mit derart hohem Signal/Rausch-Abstand und so empfindlich durchzuführen, dass auf eine in bekannten Verfahren übliche intensive Anregungsstrahlung, welche, insbesondere in biologischen Systemen, nachteilhaft schädigend oder bleichend wirken könnte, verzichtet werden kann. Die erfindungsgemäße Methode ist deshalb besonders vorteilhaft zur Analyse von lebenden biologischen Zellen oder lichtempfindlichen Proben einsetzbar. Beispiele solcher Proben sind Gewebeschnitte, Gewebe- und Zellkulturen.The Invention allows the spectroscopic measurement with such high Signal-to-noise ratio and so sensitive to perform that on an usual in known methods intensive Excitation radiation, which, especially in biological systems, could be detrimentally harmful or bleaching omitted can be. The method of the invention is therefore particularly advantageous for the analysis of living biological Cells or photosensitive samples can be used. Examples of such Samples are tissue sections, tissue and cell cultures.

Die Erfindung ermöglicht vorteilhafterweise, dass sowohl bei der Medikamentenentwicklung, als auch bei der Bereitstellung individueller Therapeutika, das heißt beispielsweise biologischer Implantate und Gewebepräparate, primär biologische Flüssigkeiten als Proben untersucht werden können, ohne dass die Zusammensetzung der untersuchten biologischen Flüssigkeit verändert oder verschlechtert wird. Besonders werden die in der biologischen Flüssigkeit gegebenenfalls enthaltenen Partikel, das heißt besonders biologische Zellen, besonders Gewebezellen, in ihren Vitalfunktionen nicht beeinflusst und in ihrer Integrität nicht gestört.The Invention advantageously allows both at drug development, as well as providing individualized Therapeutics, that is, for example, biological implants and tissue preparations, primarily biological fluids as samples can be examined without affecting the composition the examined biological fluid changed or worsened. Especially those in the biological Liquid optionally contained particles, that is especially biological cells, especially tissue cells, in their vital functions not influenced and not disturbed in their integrity.

Ein besonderer Vorteil der Erfindung liegt auf dem Gebiet der spektroskopischen Messung und der Analyse partikulärer Proben, besonders von biologischen Zellen. Diese weisen meist ungefähr sphärische oder rotationsellipsoide Formen auf. Die Zellen sind nicht notwendigerweise auf ein Substrat fixiert oder darin eingebettet; oft sind diese Zellen als ganze oder Kompartimente davon, Organellen oder der Zellkern, leicht beweglich. Durch das Anregungslicht im Anregungsstrahlengang wird die partikuläre Probe, also insbesondere die Zelle oder deren Teile, nach dem Prinzip der „optischen Pinzette” im Bereich des Strahls festgehalten.One particular advantage of the invention is in the field of spectroscopic Measurement and analysis of particulate samples, especially of biological cells. These usually have approximately spherical or rotationally ellipsoidal forms. The cells are not necessarily fixed to or embedded in a substrate; often these are Cells as whole or compartments thereof, organelles or the nucleus, easy to move. By the excitation light in the excitation beam path becomes the particulate sample, so in particular the cell or their parts, according to the principle of "optical tweezers" in the Area of the beam held.

Nun wird durch die erfindungsgemäß eingesetzte hohe Bewegungsgeschwindigkeit des sich bei der Messung bewegenden Fokusvolumens und des damit verbundenen Anregungsstrahl, der in der Regel koaxial zum Messstrahlengang verläuft, vorteilhaft erreicht, dass die partikuläre Probe oder biologische Zelle oder deren Teile aufgrund ihrer Eigenträgheit oder der Eigenträgheit von Teilen davon, beispielsweise der Zellkern, der schnellen Bewegung des Anregungsstrahls nicht folgen kann.Now is by the invention used high Movement speed of the moving during the measurement focus volume and the associated excitation beam, which is usually coaxial with Measuring beam path runs, advantageously achieved that the particulate sample or biological cell or parts thereof because of their self-indulgence or self-indulgence of parts of it, for example the nucleus, the fast movement the excitation beam can not follow.

Ohne an die Theorie gebunden sein zu wollen, werden hier die materialbedingten Tiefpasseigenschaften von eingebetteten Strukturen in der Probe wirkungsvoll ausgenützt. Es kann so vorteilhafterweise gewährleistet werden, dass alle Bereiche innerhalb des zu messenden Flächen-/Volumenabschnitts der Probe, bevorzugt gleich gedichtet oder alternativ schwerpunktmäßig in die Messung einbezogen werden, bevorzugt auch dann, wenn sich der primär zu analysierende Flächen-/Volumenabschnitt der Probe innerhalb dessen die Emissionen registriert werden, außerhalb der „optischen Achse” einer konventionellen, das heißt unbewegten, stationären Anregungsstrahlung befindet.Without to be bound to the theory, here are the material-related Low pass properties of embedded structures in the sample exploited effectively. It can be so beneficial be ensured that all areas within the to be measured area / volume portion of the sample, preferably equal to poetry or alternatively focus be included in the measurement, preferably even if the surface / volume section to be analyzed primarily the sample within which the emissions are registered, outside the "optical axis" of a conventional, the means stationary, stationary excitation radiation located.

Ohne an die Theorie gebunden sein zu wollen, kann der Anregungsstrahl der Messanordnung bevorzugt gezielt genutzt werden, die partikuläre Probe beziehungsweise biologische Zelle im Ganzen an Ort und Stelle zu halten, durch die entsprechend der mechanischen und fluid-mechanischen Trägheitseigenschaften der Probe erfindungsgemäß bevorzugt gewählten Bewegungsgeschwindigkeiten des erfindungsgemäß während der Messung bevorzugt schnell wandern den Fokusvolumens und damit des, bevorzugt konfokalen, Anregungsstrahls können in der so im Ganzen festgehaltenen Probe bestimmte ausgewählte Flächen-/Volumenabschnitte innerhalb der Probe oder alternativ die gesamte Probe gleichgewichtet in einer einzigen Messung die angeregten Emissionen registriert und gegebenenfalls analysiert werden, ohne dass es zu Bewegungsartefakten durch die Probe kommt. Eine schwerwiegende Art von Bewegungsartefakten ist auch die „Sogwirkung” der optischen Pinzette der Anregungsstrahlung, welche insbesondere auf prominente bewegliche Strukturen der Zelle wie den Zellkern ausgeübt wird, so dass sich dieser von selbst in den Fokus der Anregung und damit der Messung bewegt.Without wishing to be bound by theory, the excitation beam of the measuring arrangement can preferably be selectively used to hold the particulate sample or biological cell in place as a whole, by virtue of the preferred movement velocities according to the invention in accordance with the mechanical and fluid-mechanical inertia properties of the sample In accordance with the invention, during the measurement, preferably fast migration of the focus volume and thus of the, preferably confocal, excitation beam, certain selected area / volume sections within the sample or alternatively the entire sample may be equally weighted in a single measurement in the thus retained sample the excited emissions are recorded and, if necessary, analyzed without movement artifacts passing through the sample. A serious type of motion artifact is also the "suction effect" of the optical tweezer of the excitation radiation, which is exerted in particular on prominent mobile structures of the cell, such as the cell nucleus, so that it automatically moves into the focus of the excitation and thus of the measurement.

Die Erfindung erlaubt also, die Vorteile der optischen Pinzette der Anregungsstrahlung bei der Fixierung der zu untersuchenden Probe auszunützen, ohne dass die nachteiligen Auswirkungen der Sogwirkung der optischen Pinzette, wodurch prominente bewegliche Strukturen innerhalb der Probe, vor allem der Zellkern einer biologischen Zelle, in den Fokus der Messung gezogen werden, in Kauf genommen werden müssen.The Thus, the invention allows the advantages of optical tweezers Excitation radiation during fixation of the sample to be examined exploit without the adverse effects of Suction effect of optical tweezers, causing prominent moving Structures within the sample, especially the nucleus of a biological Cell, to be drawn into the focus of the measurement, accepted Need to become.

Die Erfindung sieht bevorzugt vor, mittels zusätzlich aufgenommener mikroskopischer Bilddaten des Gesamtprobenfelds (Mikrophotographie) die Koordinaten der Probe oder Probenabschnitte, insbesondere die Koordinaten von Zellkompartimenten, Organellen, Zytoplasma etc., zu bestimmen. Dies geschieht bevorzugt durch automatisierte Analyse der mikrophotographischen Aufnahme. Dies geschieht in an sich bekannter Weise.The Invention preferably provides, by means of additionally recorded microscopic image data of the total sample field (photomicrograph) the coordinates of the sample or sample sections, in particular the coordinates of cell compartments, organelles, cytoplasm, etc. This is preferably done by automated analysis of the photomicrograph Admission. This happens in a conventional manner.

Die Erfindung erlaubt so, beispielsweise nach einer mikrophotographischen Prüfung oder bildverarbeitenden Analyse der zu untersuchenden Probe, insbesondere der biologischen Zelle, den Scanbereich auf einen bestimmten Flächen-/Volumenabschnitt innerhalb der Probe auszurichten und zu beschränken; im Falle einer biologischen Zelle vor allem auf bevorzugte Abschnitte der Zellmembran, bestimmte Organellen oder ähnliche Strukturen im Cytoplasma.The Invention thus allows, for example, after a photomicrograph Examination or image-processing analysis of the examined Sample, especially the biological cell, the scan area a certain area / volume section within the To align and confine the sample; in the case of a biological Cell mainly on preferred sections of the cell membrane, certain Organelles or similar structures in the cytoplasm.

Die bevorzugt durchgeführte mikrophotographische Voranalyse der zu untersuchenden Probe erlaubt ebenfalls automatische Erkennung dergleichen Struktur, beispielsweise für die wiederholte Messung einer Mehrzahl gleichartiger Werkstücke oder Proben, welche so nacheinander bevorzugt automatisiert analysiert werden können. Die Strukturerkennung innerhalb einer Probe erfolgt in an sich bekannter Weise.The preferably carried out photomicrographic pre-analysis the sample to be examined also allows automatic detection of the same Structure, for example, for the repeated measurement of a plurality similar workpieces or samples, which one after the other preferably be analyzed automatically. The structure recognition within a sample takes place in a conventional manner.

Die Erfindung sieht bevorzugt eine dynamische Anpassung, Größe und/oder des Scanfelds des erfindungsgemäß wandernden Fokusvolumens vor. Beispielsweise können so in einer Probe immer gleiche Zellkompartimente von biologischen Zellen gemessen werden. Dies kann wiederholt an derselben Zelle geschehen; dies kann aber auch an mehreren gleichartigen Zellen innerhalb eines zu untersuchenden Präparats, beispielsweise eines Gewebeabschnitts oder einer Zellkultur, erfolgen.The Invention preferably provides a dynamic fit, size and / or the scan field of the invention migratory Focus volume. For example, so in a sample always the same cell compartments of biological cells measured become. This can happen repeatedly on the same cell; this But also on several similar cells within one to be examined preparation, for example, a tissue section or a cell culture.

In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung werden Proben, insbesondere biologische Zellen, mit Anregungsstrahlung bestrahlt, die eine unelastische Streustrahlung, das heißt Raman-Streustrahlung in der bestrahlten Probe anregt. Die von der Probe innerhalb des Fokusvolumens des Messstrahlengangs der Analyseanordnung emittierte Raman-Streustrahlung wird über dem Messstrahlengang zugeordnete Detektoren und Sensoren detektiert, und die Intensität und bevorzugt die spektrale Verteilung der Raman-Streustrahlung wird analysiert. Dabei wird zumindest ein für den Flächen- oder Volumenabschnitt der Probe bzw. Zelle repräsentatives Raman-Spektrum registriert.In In a preferred embodiment of the invention, samples, in particular biological cells, irradiated with excitation radiation, which is an inelastic Stray radiation, that is Raman scattered radiation in the irradiated Sample stimulates. That of the sample within the focus volume of the Beam path of the analysis array emitted Raman scattered radiation becomes over the measuring beam path associated detectors and Sensors detected, and the intensity and preferably the Spectral distribution of Raman scattered radiation is analyzed. there becomes at least one for the area or volume section the sample or cell representative Raman spectrum registered.

Von dem mindestens einen Raman-Spektrum können einer oder bevorzugt mehrere charakteristische Kennwerte isoliert (Intensität an bestimmten Frequenzbändern) werden. Es ist bevorzugt vorgesehen, die ermittelten Kennwerte mit bekannten und hinterlegten Kennwerten, vorzugsweise nach an sich bekannten Analyseverfahren, zu vergleichen. In einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird durch den erfindungsgemäßen Kennwertvergleich, bei ausreichender Übereinstimmung bestimmter Kennwerte, der zurückgehaltene Partikel charakterisiert, das heißt vor allem der Zelltyp, Zellspezies und/oder der Differenzierungsgrad der Zelle bestimmt, sodass beispielsweise das Vorhandensein einer bestimmten Zellspezies beziehungsweise einer Zelle mit einem bestimmten Differenzierungsgrad in der biologischen Flüssigkeit nachgewiesen werden kann.From the at least one Raman spectrum may be one or preferred several characteristic parameters isolated (intensity at certain frequency bands). It is preferred provided, the determined characteristics with known and deposited Characteristic values, preferably according to known analysis methods, to compare. In a preferred variant of the invention Method is characterized by the characteristic comparison according to the invention, with sufficient agreement of certain characteristic values, the retained particle is characterized, that is especially the cell type, cell species and / or the degree of differentiation the cell determines, for example, the presence of a certain cell species or a cell with a certain degree of differentiation can be detected in the biological fluid.

Es versteht sich, dass das erfindungsgemäße Messverfahren nicht auf die Raman-Spektroskopie beschränkt ist. Das Verfahren kann auf jegliche spektroskopische Verfahren ausgeweitet werden, in denen in einer einzigen Messung ein möglichst großer Flächen-/Volumenabschnitt an einer Probe analysiert werden soll. Die Erfindung betrifft deshalb auch die Fluoreszenzspektroskopie, die Infrarotspektroskopie und Sonderformen wie FREI sowie abgeleitete Formen davon.It it is understood that the measuring method according to the invention is not limited to Raman spectroscopy. The procedure can be extended to any spectroscopic method, in which in a single measurement the largest possible Area / volume section on a sample are analyzed should. The invention therefore also relates to fluorescence spectroscopy, Infrared spectroscopy and special forms such as FREI and derived Forms of it.

Ein besonderer Vorteil der Erfindung liegt auch auf dem Gebiet der spektroskopischen Messung und der Analyse SERS-modifizierter Oberflächen, welche typischerweise heterogenen und sporadisch verteilte „hot spots” der SERS aufweisen. Es ist dazu insbesondere vorgesehen, die Probe vor der Analyse an der Oberfläche mit Metall oder Metallkolloiden zu beschichten oder anzureichern. Die Beschichtung und Bindung des oder der Metalle geschieht in an sich bekannter Weise, vorzugsweise durch lokale Derivatisierung der Oberfläche. Besonders bevorzugt ist die Anreicherung der Probenoberfläche mit Goldkolloiden. Die elektronischen Eigenschaften der aufgetragenen Metalle sind geeignet, im Sinne der bekannten „surface enhanced” Ramanstreuung (SERS) Raman-Emissionen der bestrahlten Probe zu erhöhen. Durch die Intensitätssteigerung der Ramanstreuung nach den an sich bekannten Prinzipien lässt sich die Integrationszeit der Messung verkürzen und/oder die Empfindlichkeit erhöhen. Außerdem ermöglicht die Kombination mit SERS eine weitere Verbesserung des Signal/Rausch-Abstands.A particular advantage of the invention also lies in the field of spectroscopic measurement and analysis of SERS-modified surfaces, which are typically heterogeneous and sporadically distributed Have "hot spots" of the SERS. It is intended in particular to coat or enrich the sample prior to analysis on the surface with metal or metal colloids. The coating and bonding of the metal or metals is done in a conventional manner, preferably by local derivatization of the surface. Particularly preferred is the enrichment of the sample surface with gold colloids. The electronic properties of the applied metals are suitable for increasing Raman emissions of the irradiated sample in the sense of the well-known surface-enhanced Raman scattering (SERS). By increasing the intensity of the Raman scattering according to the principles known per se, the integration time of the measurement can be shortened and / or the sensitivity can be increased. In addition, the combination with SERS allows a further improvement of the signal-to-noise ratio.

Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter „SERS” vor allem eine ultrasensitive Variante der Ramanstreuung für Moleküle auf und in der Nähe von metallischen Nanostrukturen verstanden. Beispielsweise verstärken sphärische Nanopartikel aus Silber oder Gold mit Durchmessern von typischerweise 20 bis 100 nm die Raman-Streuung. Es kommt aufgrund kollektiver Schwingungen des freien Elektronengases im Metall zu einer elektromagnetischen Felderhöhung im Nahfeld der Metallpartikel, welche das Raman-Signal von Molekülen um bis zu 14 Größenordnungen verstärken. Dieser ver stärkte Effekt ist jedoch nur in solchen Zonen zu erwarten, in denen solche verstärkenden Strukturen vorhanden sind. Zonen verstärkter Raman-Streuung werden im Zusammenhang mit der Erfindung auch als „hot spots” bezeichnet.in the Connection with the invention is under "SERS" before especially an ultrasensitive variant of Raman scattering for Molecules on and near metallic Understood nanostructures. For example, spherical reinforce Nanoparticles of silver or gold with diameters of typically 20 to 100 nm the Raman scattering. It comes because of collective Vibrations of the free electron gas in the metal to an electromagnetic Field elevation in the near field of the metal particles, which the Raman signal of molecules up to 14 orders of magnitude strengthen. This ver strengthened effect is however only to be expected in those zones where such reinforcing Structures are present. Zones of enhanced Raman scattering are in the context of the invention as "hot spots ".

Die Erfindung erlaubt es, mindestens ein oder mehrere „hot spots” innerhalb des Flächen- oder Volumenabschnitts der Probe zu registrieren, weil der gemessene Flächen-/Volumenabschnitt groß ist. Das erfindungsgemäße Verfahren bietet vorteilhafterweise die Möglichkeit, größere Flächen-/Volumenabschnitte mit einer höheren Antreffwahrscheinlichkeit von „hot spots” in einer einzigen Messung zu überdecken, zum anderen braucht auf Objektive mit hoher numerischer Apertur, welche die Empfindlichkeit der Messung erhöhen, nicht verzichtet werden.The Invention allows at least one or more "hot spots "within the area or volume section to register the sample because the measured area / volume section is great. The inventive method advantageously offers the possibility of larger Area / volume sections with a higher hit probability to cover from "hot spots" in a single measurement, on the other hand, on lenses with high numerical aperture, which does not increase the sensitivity of the measurement become.

Ein bevorzugtes Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Materialprüfung, besonders die Prüfung von Oberflächen. In der Praxis werden für Raman-spektroskopische Untersuchungen Materialoberflächen regelmäßig Techniken der Oberflächenverstärkten Ramanstreuung (SERS) eingesetzt. Die Erfindung erlaubt es, gezielt große Oberflächenabschnitte der zu untersuchenden Materialprobe in einer Messung zu analysieren, so dass gewährleistet werden kann, dass eine repräsentative Anzahl an optisch aktiven „hot-spots” innerhalb dieses Oberflächenabschnitts vorhanden ist. Auf diese Weise kann die Messzeit verringert und die Sensitivität und Aussagekraft verbessert werden.One preferred field of application of the invention is the material testing, especially the testing of surfaces. In the Become a practice for Raman spectroscopic investigations Material surfaces regularly techniques Surface Enhanced Raman Scattering (SERS) used. The invention allows targeted large surface sections to analyze the material sample to be examined in one measurement, that can be guaranteed that a representative Number of optically active "hot spots" within this Surface section is present. This way you can the measuring time is reduced and the sensitivity and informative value be improved.

Um eine repräsentative Anzahl von „hot-spots” innerhalb des analysierten Oberflächenabschnitts anzutreffen, ist man in bekannten Verfahren auf die Verwendung eines maximal 20-fach vergrößerten Objektivs mit entsprechend großem Fokusvolumen und kleiner numerischer Apertur im Messstrahlengang beschränkt. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, stärker vergrößernde Objektive mit höherer Öffnung einzusetzen, um zumindest denselben Oberflächenabschnitt der Probe, der von dem bekanntermaßen maximal einsetzbaren 20-fach Objektiv gemessen werden kann, beispielsweise eine Kreisfläche mit einem Durchmesser von etwa 10 µm, mit nun höherer Genauigkeit und Empfindlichkeit zu messen. Bevorzugt werden dazu 60-fach Objektive eingesetzt.Around a representative number of "hot spots" within of the analyzed surface section is in known methods, the use of a maximum of 20 times enlarged lens with a correspondingly large Focus volume and small numerical aperture in the measurement beam path limited. With the invention Process is possible, more powerful Use higher-aperture lenses to at least the same surface portion of the sample, the from the known maximum usable 20x objective can be measured, for example, a circular area with a diameter of about 10 microns, with now higher Accuracy and sensitivity to measure. Preferred are 60 times Lenses used.

Die Erfindung sieht dazu bevorzugt die mikrophotographische und/oder spektroskopische Voruntersuchung der Probe vor, um insbesondere die Inhomogenität des zu untersuchenden Flächen-/Volumenabschnitts und Verteilung der „hot spots” abzuschätzen. In bevorzugter Ausführung sieht die Erfindung im Zusammenhang mit der Analyse von SERS-Oberflächen vor, dass mindestens ungefähr 10 bis ungefähr 100 und gegebenenfalls mehr optisch aktive „hot spots” innerhalb des zu analysierenden Flächen-/Volumenabschnitts lokalisierbar sind. Dadurch kann ein verbessertes Signal-Rauschverhältnis für die Erfassung eines repräsentativen Emissionsspektrums der Probe innerhalb einer möglichst kurzen Messzeit erreicht werden.The For this purpose, the invention preferably provides the microphotographic and / or spectroscopic pre-examination of the sample before, in particular the inhomogeneity of the surface / volume section to be examined and Estimate the distribution of "hot spots". In a preferred embodiment, the invention provides context with the analysis of SERS surfaces that at least about 10 to about 100 and optionally more optically active "hot spots" within the can be localized to be analyzed area / volume section are. This can improve the signal-to-noise ratio for the acquisition of a representative emission spectrum reached the sample within a shortest possible measuring time become.

Eine bevorzugte Größe eines Scanbereichs zur Registrierung eines repräsentativen Emissionsspektrums einer SERS-Oberfläche beträgt bevorzugt von 5 bis 200 µm², bevorzugt in Form eines etwa quadratischen Scanbereichs von etwa 2 µm × 2 µm bis etwa 14 µm × 14 µm. Besonders bevorzugt hat der Scanbereich eine Größe von etwa 100 µm², insbesondere die Abmessungen 10 µm × 10 µm (x- und y-Richtung; zweidimensionales Scanfeld).A preferred size of a scan area for registration of a representative emission spectrum of a SERS surface is preferably from 5 to 200 μm ² , preferably in the form of an approximately square scan area of from about 2 μm × 2 μm to about 14 μm × 14 μm. The scan area particularly preferably has a size of approximately 100 μm ² , in particular the dimensions 10 μm × 10 μm (x and y direction, two-dimensional scan field).

Eine bevorzugte Variante der Erfindung sieht vor, die Bewegung des Fokusvolumens des Messstrahlengangs in drei Raumrichtungen (x-, y- und z-Richtung) so zu steuern, dass die Oberfläche einer partikulären, insbesondere sphärischen Probe „abgetastet” wird, nicht jedoch ihr Inneres. Dies ist vorzugsweise für solche Fälle sinnvoll, in denen optisch aktive Bereiche, ausschließlich oder überwiegend auf der Oberfläche der partikulären Probe vorhanden sind. Auf diese Weise lässt sich insbesondere der Signal/Rausch-Abstand des registrierten Signals vergrößern. Bevorzugte Anwendungsgebiete für die Oberflächenanalyse dreidimensionaler Proben sind funktionalisierte Partikel, insbesondere funktionalisierte Nanopartikel („beads”). Es kann so gewährleistet werden, dass nur die funktionalisierten Bereiche dieser Strukturen abgetastet und dort repräsentative Spektren aufgenommen werden. Insbesondere findet die erfindungsgemäße Methode Anwendung bei der Raman-spektroskopischen Analyse von SERS-ZonenA preferred variant of the invention provides for the movement of the focus volume of the measurement beam path in three spatial directions (x, y and z direction) to be controlled in such a way that the surface of a particulate, in particular spherical sample is "scanned", but not its interior , This is preferably for such Useful cases in which optically active areas, exclusively or predominantly on the surface of the particulate sample are present. In this way, in particular, the signal-to-noise ratio of the registered signal can be increased. Preferred areas of application for the surface analysis of three-dimensional samples are functionalized particles, in particular functionalized nanoparticles ("beads"). It can thus be ensured that only the functionalized regions of these structures are scanned and representative spectra recorded there. In particular, the method according to the invention finds application in the Raman spectroscopic analysis of SERS zones

Ebenso sieht die Erfindung bevorzugt vor, eine automatisierte Anpassung der Größe des Scanbereichs vorzunehmen, um das Mess ergebnis zu verbessern. In einer vereinfachten optionalen Ausführung wird auf die automatische Anpassung der Größe des Scanbereichs verzichtet. Hier wird der Scanbereich aufgrund von Voranalysen gefundenen Abschätzungen vor der Messung fest eingestellt.As well the invention preferably provides an automated adaptation the size of the scan area to make the Improve measurement results. In a simplified optional version will be on the automatic adjustment of the size the scanning area is omitted. Here is the scan area due to Pre-analysis found estimates before the measurement set.

In einer besonders bevorzugten Variante sieht die Erfindung die, bevorzugt automatische, Anpassung der Form des Scanbereichs an die Form/den Umriss der partikulären Probe, insbesondere der biologischen Zelle, vor. Diese werden bevorzugt eingesetzt, um dreidimensionale partikuläre Proben, besonders biologische Zellen, Nanopartikel und ähnliche, besonders deren Oberfläche, zu analysieren.In In a particularly preferred variant, the invention provides the preferred automatic, adjustment of the shape of the scan area to the shape / Outline of the particulate sample, especially the biological cell, in front. These are preferably used to form three-dimensional particulate Samples, especially biological cells, nanoparticles and the like, especially their surface, to analyze.

Die Erfindung sieht bevorzugt auch konkrete Bewegungsmuster oder Bewegungsabfolgen vor, die das Fokusvolumen während des Messintervalls über den Flächen-/Volumenabschnitt beschreiben kann. In einer bevorzugten Ausführung überstreicht das Fokusvolumen des Messstrahlengangs geometrisch definiert geformte zwei- oder dreidimensionale Flächen- oder Volumenabschnitte. Bevorzugt sind dies kreisscheibenförmige, ellipsoide oder kalottenförmige Abschnitte oder Abschnitte ähnlicher Form.The The invention also prefers concrete movement patterns or sequences of movements that the focus volume exceeds during the measurement interval can describe the area / volume section. In a preferred The design covers the focus volume of the measuring beam path geometrically defined two- or three-dimensional surface or volume sections. These are preferably circular disk-shaped, ellipsoidal or dome-shaped sections or sections more similar Shape.

In einer besonders bevorzugten Ausführung der Erfindung findet bei der zeitlichen Integration eine Gleichgewichtung aller vom Fokusvolumen innerhalb des abgescannten Flächen-/Volumenabschnitts der Messung statt. Vorzugsweise wird dazu das ortsvariable Fokusvolumen mit konstanter Geschwindigkeit über den Scanbereich geführt, so dass die Verweildauer des Fokusvolumens in jedem Bereich des gescannten Flächen- oder Volumenabschnitts gleich groß ist. In erster Näherung, wonach für kleine Ablenkungswinkel tanα ungefähr gleich α ist, bedeutet dies zweckmäßigerweise eine konstante Winkelgeschwindigkeit des ablenkenden optischen Elements (Scanners). Um dies auf einfache Weise zu erreichen, wird am Scanner zunächst eine größere Winkelamplitude einer harmonischen Schwingung (Sinusschwingung) für die Ablenkung eingestellt. Die Auslenkung (Amplitude) wird so gewählt, dass nur der annähernd lineare Bewegungsanteil des Fokusvolumens aus der harmonischen Sinusschwingung über den Flächen- oder Volumenabschnitt streicht und zur Messung herangezogen wird. Dies erfolgt in bevorzugter Ausführung indem der Anregungsstrahl kurzzeitig ausgeblendet oder insbesondere der Anregungslaser abgeschaltet wird (blanking), wenn und solange sich das sich ortsvariable Fokusvolumen im oder nahe dem Umkehrpunkt seiner insbesondere sinusförmigen Bewegung befindet. In einer alternativen Variante sieht die Erfindung dazu vor, den Scanbereich größer als die zu untersuchende Probe beziehungsweise den zu untersuchenden Flächen-/Volumenabschnitt zu wählen, besonders in denjenigen Fällen, in denen außerhalb des zu untersuchenden Flächen-/Volumenabschnitts keine Emissionen zu erwarten sind. Dies ist beispielsweise an einer vereinzelten biologischen Zelle der Fall, bei welcher außerhalb der Zellbegrenzungen gar keine emittierenden Strukturen mehr vorliegen.In a particularly preferred embodiment of the invention finds in the temporal integration, an equal weighting of all of the focus volume within the scanned area / volume portion of the measurement instead of. Preferably, the spatially variable focus volume with constant speed over the scanning area, so that the dwell time of the focus volume in each area of the Scanned area or volume section is the same size. In first approximation, according to which for small deflection angles tanα is approximately equal to α, means this expediently a constant angular velocity of the deflecting optical element (scanner). To do this on easy The first thing to do is to make a larger scan Angular amplitude of a harmonic oscillation (sinusoidal oscillation) set for the distraction. The deflection (amplitude) is chosen so that only the approximately linear Motion component of the focus volume from the harmonic sinusoidal wave over sweeps the surface or volume section and for measurement is used. This is done in a preferred embodiment by the excitation beam temporarily hidden or in particular the excitation laser is switched off (blanking), if and as long as the variable focus volume at or near the turning point his particular sinusoidal movement is located. In In an alternative variant, the invention provides for the scan area larger than the sample to be examined or to select the surface / volume section to be examined, especially in those cases where outside of the surface / volume section to be examined no emissions are to be expected. This is, for example, an isolated one biological cell of the case in which outside the Cell boundaries no longer exist any emitting structures.

In einer bevorzugten Variante ist eine gewichtete, insbesondere eine mittengewichtete, Registrierung vorgesehen. Die Gewichtung eines bestimmten Bereichs des Flächen- oder Volumenabschnitts der Probe wird erfindungsgemäß bevorzugt durch Erhöhung der Aufenthaltswahrscheinlichkeit beziehungsweise Aufenthaltsdauer des sich bewegenden Fokusvolumens in diesem Bereich, bei mittengewichteter Registrierung im Zentrum des zu messenden Flächen-/Volumenabschnitts während der Messung erreicht.In A preferred variant is a weighted, in particular a middle weighted, registration provided. The weight of a certain area of the area or volume section the sample is preferred according to the invention Increase the probability of residence or Duration of the moving focus volume in this area, with center weighted registration in the center of the to be measured Area / volume section during the measurement reached.

In einer bevorzugten Variante ist es vorgesehen, durch gezielte Modulation der Wanderbewegung des Fokusvolumens während der Messung bestimmte Bereiche innerhalb des Flächen-/Volumenabschnitts stärker zu gewichten und gegebenenfalls andere Bereiche auszublenden. In einer bevorzugten Variante ist vorgesehen, durch mikrophotographische Voruntersuchungen, beispielsweise durch Bildanalyse, innerhalb der Probe oder des zu analysierenden Flächen-/Volumenabschnitts der Probe optisch hochaktive Zonen zu identifizieren und diese interessanten Bereiche dann gewichtet oder selektiv in der Messung zu berücksichtigen. Zur Registrierung von Emissionen kreisrunder oder sphärischer Flächen- oder Volumenabschnitte sind Bewegungsabläufe, die zu einer mittengewichteten Registrierung der Emissionen führen, besonders bevorzugt.In A preferred variant is provided by targeted modulation the traveling motion of the focus volume during the measurement certain areas within the area / volume section weight more and possibly other areas hide. In a preferred variant is provided by preliminary photomicrographs, for example by image analysis, within the sample or area / volume section to be analyzed identify the sample optically highly active zones and these interesting Then consider areas weighted or selectively in the measurement. For registration of emissions more circular or spherical Surface or volume sections are movements, which lead to a center-weighted registration of emissions, particularly preferred.

Das „Ausblenden” uninteressanter oder für die Registrierung repräsentativer Emissionen störender Strukturen innerhalb der Probe erfolgt bevorzugt auf Grundlage ein oder mehrerer der folgenden Grundprinzipien: a) der auszublendende Bereich wird durch Begrenzung des Scanbereichs nicht von Fokusvolumen überstrichen; b) die Aufenthaltszeit des Fokusvolumens im auszublendenden Bereich ist gering, vor allem erreicht durch hohe Wandergeschwindigkeit des Fokusvolumens beim Überstreichen des Bereichs, so dass der Anteil der Signale aus diesem Bereich bei der zeitlichen Integration des Gesamtsignals der Emissionsmessung möglichst minimal ist; c) in Zeitabschnitten, in denen das Fokusvolumen den auszublendenden Bereich überstreicht, wird die Anregungsstrahlung abgeschaltet, so dass dort keine Emission oder Hintergrundstrahlung erzeugt wird (blanking).The "fading out" of uninteresting or registration-representative emissions of interfering structures within the sample is preferably based on one or more of the following basic principles pien: a) the area to be blanked out is not covered by the focus volume due to the limitation of the scan area; b) the residence time of the focus volume in the area to be hidden is low, above all achieved by high migration speed of the focus volume when sweeping the area, so that the proportion of signals from this area is as minimal as possible when integrating the total signal of the emission measurement; c) in periods of time in which the focus volume sweeps over the area to be blanked, the excitation radiation is switched off so that no emission or background radiation is generated there (blanking).

Die erfindungsgemäß vorgesehene Bewegung des Fokusvolumens innerhalb des Messintervalls ist bevorzugt durch eine hohe Geschwindigkeit, das heißt eine hohe Schnelle, gekennzeichnet. Die Amplitude der Bewegung wird gewählt oder automatisch eingestellt abhängig von dem zu messenden Flächen-/Volumenabschnitt. Sie beträgt vorzugsweise von 1 µm bis 100 µm. Im Zusammenhang mit der Messung von biologischen Zellen sind Amplituden von 1 µm bis 20 µm, besonders 2 µm bis 10 µm bevorzugt. Die Erfindung sieht bevorzugt eine automatische Anpassung der Amplitude an jede einzelne zu messende Zelle vor. Wie vorstehend näher erläutert, erfolgt die Anpassung bevorzugt automatisch durch Bildanalyse der mikrophotographischen Aufnahme der Zelle.The Movement of the focus volume provided according to the invention within the measuring interval is preferred by a high speed, that means a high speed, marked. The amplitude the movement is selected or automatically set depending on the area / volume section to be measured. It is preferably from 1 .mu.m to 100 .mu.m. In connection with the measurement of biological cells are amplitudes from 1 μm to 20 μm, especially 2 μm to 10 μm preferred. The invention preferably provides an automatic Adjust the amplitude to each cell to be measured. As explained in more detail above, the adjustment takes place preferably automatically by image analysis of the photomicrograph the cell.

Bevorzugt wird die Bewegung in Form einer Oszillation periodisch durchgeführt oder besitzt mindestens eine periodische Komponente. Das Abscannen eines Flächen- oder Volumenabschnitts in x- und y-Richtung erfolgt im einfachsten Fall bevorzugt durch die Überlagerung einer bevorzugt gleichförmigen schnellen Scanbewegung in x-Richtung (fast scanning) mit einer bevorzugt gleichförmigen langsameren Scanbewegung in y-Richtung (slow scanning). Dabei bestimmt die Frequenz der slow scanning-Achse die „Bildwiederholrate” und die Frequenz der fast scanning-Achse die Geschwindigkeit des Fokus und damit die „Messzeit” der einzelnen Flächenabschnitte innerhalb des gescannten Flächen-/Volumenabschnitts. In einer besonders bevorzugten Variante wird die Geschwindigkeit der Scanbewegung in y-Richtung so gewählt, dass nach Durchlaufen einer Scanbewegung in y-Richtung durch schrittweise Verschieben des Fokusvolumens in x-Richtung eine bevorzugt benachbarte „Scanspur” gewählt wird, die nun ebenfalls durch die dem Fokusvolumen aufgeprägte Ablenkung in y-Richtung abgescannt wird (zeilenweise Abscannen). Dabei beträgt die Frequenz der Bewegung in x-Richtung, die bevorzugt mit der Bewegung in y-Richtung synchronisiert ist, Quotient aus der Frequenz der Bewegung in y-Richtung durch die Anzahl der Scanzeilen. Davon abweichende Scanverfahren und -muster sind möglich, ohne dass dadurch die erfindungsgemäße Lehre verlassen werden würde.Prefers the movement is performed periodically in the form of an oscillation or has at least one periodic component. The scanning a surface or volume section in the x and y directions takes place in the simplest case preferably by the superposition a preferably uniform rapid scanning movement in x-direction (fast scanning) with a preferably uniform slower scan movement in the y direction (slow scanning). It determines the frequency of the slow scanning axis is the "refresh rate" and the frequency of the fast scanning axis the speed of focus and thus the "measuring time" of the individual surface sections within the scanned area / volume section. In In a particularly preferred variant, the speed of the Scan movement in the y-direction chosen so that after passing through a Scanning movement in the y-direction by gradually shifting the focus volume in the x-direction, a preferably adjacent "scan track" is selected which is now also impressed by the focus volume Scanning deflection in y-direction (scan by line). The frequency of the movement in the x-direction, which is preferably synchronized with the movement in the y-direction, Ratio of the frequency of the movement in y-direction by the number the scan line. Deviating scanning methods and patterns are different possible, without thereby the inventive Teaching would be abandoned.

Die Frequenz der Bewegung oder Oszillation, insbesondere die Grundfrequenz einer periodischen Bewegung in mindestens einer Raumrichtung beträgt 1 bis 1000 Hz, bevorzugt 2 bis 200 Hz, besonders bevorzugt von 5 bis 100 Hz. Die Frequenz der Bewegung oder Oszillation des Fokusvolumens wird erfindungsgemäß so gewählt, dass die in einer bevorzugten Ausführung der Erfindung zu analysierende partikuläre Probe oder biologische Zelle im Anregungsstrahlengang zwar festgehalten wird, aber den erfindungsgemäß schnellen Scanbewegungen des Strahls nicht folgen kann. Auf diese Art und Weise können, wie vorstehend beschrieben, die Vorteile der optischen Pinzette ausgenutzt und gleichzeitig eine hochempfindliche Messung der Probe oder biologischen Zelle angefertigt werden. Unter Anwendung des erfindungsgemäßen Prinzips kann der Fachmann die dazu jeweils günstige oder optimale Ablenkfrequenz individuell für jedes zu messende Objekt festlegen oder abstimmen. Hier kann auf die Erfahrungen und Kenntnisse auf dem Gebiet der optischen Pinzette in der Mikroskopie und Mikrospektroskopie zurückgegriffen werden.The Frequency of movement or oscillation, in particular the fundamental frequency a periodic movement in at least one spatial direction 1 to 1000 Hz, preferably 2 to 200 Hz, more preferably from 5 to 100 Hz. The frequency of movement or oscillation of the focus volume is chosen according to the invention such that those to be analyzed in a preferred embodiment of the invention particulate sample or biological cell in the excitation beam path is held, but the invention fast Scan movements of the beam can not follow. In this way and Way, as described above, the advantages exploited the optical tweezers and at the same time a highly sensitive Measurement of the sample or biological cell can be made. Under Application of the principle according to the invention can the skilled person for each favorable or optimal deflection frequency set individually for each object to be measured or vote. Here on the experience and knowledge on the Field of optical tweezers in microscopy and microspectroscopy be resorted to.

Im Falle der Messung von biologischen Zellen, worin, wie vorstehend dargestellt, einzelne Zellstrukturen nach dem Prinzip der „optischen Pinzette” nachteilhafterweise im Anregungsstrahlengang damit im Fokusvolumen des Messstrahlengangs festgehalten werden können, muss die Scangeschwindigkeit zumindest so hoch gewählt werden, dass der vorstehend beschriebene nachteilige Effekt der Sogwirkung von Strukturen in den Anregungsstrahl nicht auftritt oder unterdrückt wird. Zur Abschätzung der nötigen Minimalgeschwindigkeit, um beispielsweise Zellorganellen nicht mitzuziehen kann die „escape force” eines Partikels in einer optischen Pinzette, also die Kraft, die eine optische Pinzette bei gegebener Laserleistung aufbringen kann, um ein Partikel zu halten, in bekannter Weise berechnet oder gemessen werden, beispielsweise über Anlegen eines querenden Flüssigkeitsstroms, welcher eine entsprechende Stokes'sche Reibung vermittelt, bis das Partikel abreißt. Im Folgenden sind praktische Überlegungen dargestellt, die dem Fachmann ermöglichen, die für den entsprechenden Fall notwendige minimale Bewegungsgeschwindigkeit des den Scanbereich überstreichenden Fokusvolumens zu berechnen.in the Case of measuring biological cells, wherein, as above shown, individual cell structures according to the principle of "optical Tweezers "disadvantageously in the excitation beam path so that they are recorded in the focus volume of the measurement beam path can, the scanning speed must be at least as high be chosen that the disadvantageous described above Effect of the suction effect of structures in the excitation beam is not occurs or is suppressed. To the estimate the necessary minimum speed, for example cell organelles The "escape force" can not be dragged along Particles in an optical tweezers, so the force, the one optical tweezers at a given laser power can apply to to hold a particle, calculated or measured in a known manner be, for example, by applying a traversing liquid flow, which mediates a corresponding Stokes friction until the Particles break off. The following are practical considerations presented, which enable the skilled person, for the corresponding case necessary minimum movement speed of the scan area sweeping focus volume to calculate.

Vornehmlich im Falle der spektroskopischen Messung einer SERS-Oberfläche oder bei anderen Proben, worin die emittierenden optisch aktiven Strukturen auf der Oberfläche der Probe im allgemeinen ortsfest fixiert sind, treten die nachteiligen Effekte der „optischen Pinzette” nicht auf.especially in the case of spectroscopic measurement of a SERS surface or in other samples, wherein the emitting optically active Structures on the surface of the sample in general fixed stationary, the adverse effects of the "optical Tweezers "not up.

In bevorzugter Ausführung wird, bei gegebener Messzeit, die Oberfläche mehrmals, das heißt mindestens zweimal abgescannt. Bei einer Messzeit von beispielsweise einer Sekunde beträgt die slow scanning-Frequenz bevorzugt 5 Hertz oder mehr.In preferred embodiment is, given a measuring time, the Surface several times, that is at least twice scanned. At a measuring time of, for example, one second the slow scanning frequency is preferably 5 hertz or more.

Die Bewegung oder Oszillation des Fokusvolumens innerhalb des Messintervalls erfolgt vorzugsweise in geordneten, und besonders periodischen Bewegungsabläufen. Die Erfindung versteht darunter solche Bewegungsmuster, die unter den Begriff „Scanning” fallen. Alternativ sind quasi-stochastische oder stochastische Bewegungsabläufe vorgesehen. Nicht deterministische Bewegungsmuster werden unter dem Begriff „Wobble” verstanden.The Movement or oscillation of the focus volume within the measurement interval is preferably carried out in ordered, and especially periodic movements. The invention understands such movement patterns, which under the term "scanning". Alternatively they are quasi-stochastic or stochastic motion sequences intended. Non-deterministic patterns of movement are subsumed understood the term "wobble".

Die Erfindung stellt auch eine Vorrichtung oder Messanordnung zur Registrierung elektromagnetischer Strahlung, welche innerhalb eines Volumen- oder Flächenabschnitts einer Probe emittiert wird, bereit. Diese Messanordnung ist primär dadurch gekennzeichnet, dass sie zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besonders geeignet und dazu ausgebildet ist. Die Anordnung weist erfindungsgemäß zumindest folgende Komponenten auf:

– Mikroskop-optische Anordnung, insbesondere ein Mikroskop, bevorzugt mit Anregungsstrahlungsquelle mit Anregungsstrahlengang zur Anregung elektromagnetischer Strahlung, beson ders Raman-Strahlung, Fluoreszenz oder ähnliche, in einer Probe und
– mindestens eine Messeinrichtung mit Messstrahlengang zur Registrierung der von der Probe emittierten elektromagnetischen Strahlung, wobei zumindest der Messstrahlengang eine numerische Apertur und ein Fokusvolumen, innerhalb dessen die emittierte Strahlung registriert werden kann, aufweist,

wobei die Vorrichtung bevorzugt dadurch gekennzeichnet ist, dass das Fokusvolumen um ein Mehrfaches kleiner ist als der in der Messung zu analysierende Flächen- oder Volumenabschnitt der Probe und dass das Fokusvolumen während der Messung über den Flächen-/Volumenabschnitt, insbesondere oszillierend, bewegbar ist.The invention also provides an apparatus or measuring arrangement for registering electromagnetic radiation emitted within a volume or area portion of a sample. This measuring arrangement is primarily characterized in that it is particularly suitable for carrying out the method according to the invention and designed for this purpose. The arrangement according to the invention comprises at least the following components:

Microscope-optical arrangement, in particular a microscope, preferably with excitation radiation source with excitation beam path for excitation of electromagnetic radiation, in particular Raman radiation, fluorescence or the like, in a sample and
At least one measuring device having a measuring beam path for registering the electromagnetic radiation emitted by the sample, wherein at least the measuring beam path has a numerical aperture and a focal volume within which the emitted radiation can be registered,

wherein the device is preferably characterized in that the focus volume is several times smaller than the area or volume section of the sample to be analyzed in the measurement, and that the focus volume is movable during the measurement over the area / volume section, in particular in an oscillating manner.

Bevorzugt ist die Vorrichtung so ausgebildet, dass im Fokusvolumen über den Verlauf der Messung vom Flächen- oder Volumenabschnitt registrierte emittierte Strahlung zeitlich zu einem Summensignal integrierbar ist.Prefers the device is designed so that in the focus volume over the course of the measurement of the area or volume section registered emitted radiation in time to a sum signal is integrable.

In einer bevorzugten Ausführung enthält die Vorrichtung zumindest noch mindestens eine Analyseeinheit, die geeignet ist zur spektralen Analyse der Anregungszone von der Probe im Flächen-/Volumenabschnitt emittierten Strahlung, besonders Raman-Streustrahlung und/oder Fluoreszenz.In A preferred embodiment includes the device at least one more analysis unit that is suitable for the spectral analysis of the excitation zone of the sample in the area / volume section emitted radiation, especially Raman scattered radiation and / or fluorescence.

In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung wird die Messeinrichtung, das heißt die optischen Mittel zur Registrierung der emittierten elektromagnetischen Strahlung, mit einer Scanning-Einheit zur Erzeugung der Wanderbewegung des Fokusvolumens während der Messung in Verbindung gebracht. Diese Scanning-Einheit (Scanner) lenkt den Messstrahlengang und bevorzugt den bevorzugt koaxialen Anregungsstrahl in seiner Ausbreitungsrichtung (Winkelablenkung) und/oder in der Strahllage (Parallelverschiebung) ab, so dass der Fokus des Messstrahlengangs, zumindest innerhalb des Messintervalls, zumindest über den zu messenden Flächen- oder Volumenabschnitt der Probe bewegt werden kann.In In a preferred embodiment of the invention, the measuring device, that is, the optical means for registering the emitted ones electromagnetic radiation, with a scanning unit for generating the Movement of focus volume during measurement in Connected. This scanning unit (scanner) directs the Measuring beam path and preferably the preferred coaxial excitation beam in its propagation direction (angular deflection) and / or in the beam position (Parallel displacement), so that the focus of the measuring beam path, at least within the measuring interval, at least about the area or volume section of the sample to be measured can be moved.

Einschwing- oder Ausschwingvorgänge der Ablenkmittel im Scanner am Anfang oder am Ende der eigentlichen Messung werden in einer bevorzugten Variante aus der eigentlichen Messphase ausgeschlossen.settling or decay of the deflection means in the scanner on The beginning or end of the actual measurement will be in a preferred Variant excluded from the actual measurement phase.

Geeignete Scanner-Einheiten sind mit optischen Elementen, bevorzugt Spiegel, Prisma oder ähnlichen bekannten Mitteln zur Strahlablenkung ausgestattet. Dieses optische Element ist vorzugsweise ein sowohl für Anregungs-, als auch für Emissionslicht reflektierendes Element, also insbesondere ein Spiegel. Bevorzugt ist ein piezoelektrisch gesteuerter Strahlteiler, beispielsweise ein halbdurchlässiger Spiegel. In einer alternativen bevorzugten Variante ist das optische Element ein Vollspiegel mit 100% Reflektivität. Bevorzugt ist das optische Element bevorzugt in mindestens einer Achse, vorzugsweise in zwei Achsen, drehbar. Es ist bevorzugt im parallelen Strahlengang der erfindungsgemäß eingesetzten Mikroskop-optischen Einrichtung angeordnet.suitable Scanner units are equipped with optical elements, preferably mirrors, Prism or similar known means for beam deflection fitted. This optical element is preferably both for excitation, as well as for emission light reflective Element, so in particular a mirror. Preferably, a piezoelectric controlled beam splitter, for example, a semipermeable Mirror. In an alternative preferred variant, the optical Element a full mirror with 100% reflectivity. Is preferred the optical element preferably in at least one axis, preferably in two axes, rotatable. It is preferably in the parallel beam path the microscope optical microscope used in the invention Arranged arrangement.

Über das optische Element wird bevorzugt der Anregungsstrahl von der bevorzugt ortsunveränderlichen Anregungsstrahlungsquelle in ein sich bevorzugt scannend über den Flächen- oder Volumenabschnitt bewegendes also ortsveränderliches Lichtbündel umgewandelt (Scanning). Die von der Probe im Lichtkegel dieses Anregungsstrahls emittierte Strahlung wird im erfindungsgemäß während der Messung ortsveränderlichen Fokusvolumen des Messstrahlengangs registriert und der Messstrahl in Richtung des Messsensors an einem, bevorzugt demselben, optischen Element abgelenkt (Descanning), und zwar so, dass die Bewegung des Fokusvolumens kompensiert wird und der Messstrahl der emittierten Strahlung am Messsensor ortsunveränderlich wird.The excitation beam is preferably converted by the preferably spatially immutable excitation radiation source via the optical element into a light beam which is movable in a preferably scanning manner over the area or volume section (scanning). The radiation emitted by the sample in the light cone of this excitation beam is registered in the focus volume of the measurement beam path which is spatially variable during the measurement, and the measurement beam is registered in the direction of the measurement sensor one, preferably the same, deflected optical element (Descanning), in such a way that the movement of the focus volume is compensated and the measuring beam of the emitted radiation at the measuring sensor is stationary.

Bevorzugt ist die optische Anordnung so ausgestaltet, dass der Messstrahlengang der Messeinrichtung und der Anregungsstrahlengang der Anregungsstrahlungsquelle dieselbe optische Achse besitzen; das Fokusvolumen des Messstrahlengangs liegt zentriert zum Anregungsstrahl. Anregungsstrahlung und Fokusvolumen bewegen sich daher bevorzugt gleichartig „scannend”, wohingegen sowohl die Anregungsstrahlungsquelle als auch der Detektor der Messeinrichtung in der Mikroskop-optischen Anordnung stillstehen, das heißt dort ortsfest fixiert sind.Prefers the optical arrangement is designed so that the measuring beam path the measuring device and the excitation beam path of the excitation radiation source have the same optical axis; the focus volume of the measuring beam path is centered to the excitation beam. Excitation radiation and focus volume therefore prefer to move in a similar way "scanning", whereas both the excitation radiation source and the detector resting the measuring device in the microscope-optical arrangement, that is, fixed there fixed.

Es versteht sich, dass analoge Systeme und Scaneinrichtungen zur Ablenkung von elektromagnetischer Strahlung, insbesondere von emittierter Strahlung und bevorzugt auch von Anregungslicht, ebenfalls eingesetzt werden können, sofern sie die Bedingungen an die erfindungsgemäß gewählte Geschwindigkeit der Bewegung des Fokusvolumens während der Messung erzielen können. Alternative Scaneinrichtungen sind zum Beispiel aus dem Bereich der elektromechanischen Bildfernübertragung, Spiegelrad etc. bekannt. Der Fachmann kennt alternative Verwirklichungsmöglichkeiten der Strahlablenkung. Im Falle eines drehbar gelagerten Strahlteilers oder Spiegel ist es außerdem bevorzugt, die Drehachse möglichst nahe an das fokussierende Objektiv zu platzieren, um die konstante Ausleuchtung des Objektivs auch bei größeren Scanwinkeln zu gewährleisten.It is understood that analog systems and scanning devices for diversion of electromagnetic radiation, in particular of emitted Radiation and preferably also of excitation light, also used can, provided that the conditions to the inventively chosen Speed of movement of focus volume during can achieve the measurement. Alternative scanning devices are, for example, in the field of electromechanical remote image transmission, Mirror wheel, etc. known. The person skilled in the art knows alternative possibilities of realization the beam deflection. In the case of a rotatably mounted beam splitter or mirror, it is also preferred, the axis of rotation as possible Close to the focusing lens to place the constant Illumination of the lens even at larger scan angles to ensure.

Im Falle eines zweidimensionalen Scanning erfolgt die Bewegung des Fokusvolumens in zwei Raumrichtungen (x- und y-Richtung), bevorzugt in der primären Ausbreitungsebene des zu untersuchenden Präparats/Probe. Dazu sind bevorzugt ein mindestens in zwei nicht parallelen, bevorzugt senkrecht ineinander angeordneten Drehachsen drehbares optisches Element oder alternativ mindestens zwei optische Elemente mit jeweils mindestens einer Drehachse, die bevorzugt senkrecht zu einander stehen, zur Ablenkung des Strahlengangs und zur Erzeugung der Scanbewegung vorgesehen. Diese Vereinfachung ist für die meisten Messungen ausreichend genau, da praktischerweise das Fokusvolumen in der dritten Raumrichtung (z-Richtung), das heißt in Richtung der optischen Achse des Messstrahlengangs in der Regel um das zwei- bis vierfache weiter ausgedehnt ist als in x- und y-Richtung, das heißt in der Ebene des Flächenabschnitts der Probe.in the Case of a two-dimensional scanning, the movement of the Focus volume in two spatial directions (x and y direction), preferably in the primary propagation plane of the examined Preparation / sample. These are preferably at least in two non-parallel, preferably arranged vertically one inside the other Rotary axes rotatable optical element or alternatively at least two optical elements each having at least one axis of rotation, the preferably perpendicular to each other, for deflecting the beam path and provided for generating the scanning movement. This simplification is sufficiently accurate for most measurements, as it is practical the focus volume in the third spatial direction (z-direction), that is in the direction of the optical axis of the measuring beam path in the rule which is two to four times wider than in the x and y direction, that is, in the plane of the surface portion of the Sample.

In einer weiteren bevorzugten Variante findet die Ablenkung des Fokusvolumens über den Flächen- oder Volumenabschnitt der Probe in allen drei Raumrichtungen statt (dreidimensionales Scanning). Neben der Ablenkung in x- und y-Richtung in der primären Ausbreitungsebene der Probe wird durch zusätzliche Maßnamen eine Ablenkung des Fokusvolumens in z-Richtung, das heißt in Richtung der optischen Achse des Messstrahlengangs, erreicht. Die Ablenkung in z-Richtung erfolgt in an sich bekannter Weise. Durch den dreidimen sionalen Scan können insbesondere dreidimensional ausgestaltete Oberflächen oder partikuläre Proben wie biologische Zellen, welche in der Regel eine sphärische oder ellipsoide Auszählung haben, verbessert erfasst und analysiert werden.In Another preferred variant involves the deflection of the focus volume the area or volume section of the sample in all three Spatial directions instead (three-dimensional scanning). In addition to the distraction in the x and y directions in the primary propagation plane the sample becomes one by additional measures Distraction of the focus volume in the z-direction, ie in Direction of the optical axis of the measuring beam path achieved. The Deflection in the z direction takes place in a manner known per se. By The three-dimensional scan can be particularly three-dimensional designed surfaces or particulate samples like biological cells, which are usually spherical or ellipsoidal enumeration have been detected and improved to be analyzed.

Anstelle aufwändiger Scanningeinheiten, die eine zu jedem Zeitpunkt der Messung weitgehend kontrollierte Bewegung des Fokusvolumens ermöglichen, können auch weniger aufwändige Einrichtungen verwendet werden. Dies sind beispielsweise einfache Spiegel oder Prismen, die mittels piezoelektrischen oder elektrodynamischem Prinzip zur Schwingung angeregt werden. Dabei können Resonanzen der mechanischen Kopplungen gezielt ausgesucht werden. In einer bevorzugten Variante werden die systembedingten Tiefpasseigenschaften der mechanischen Kopplungen innerhalb der zur Erzeugung der Fokusvolumen-Bewegungen eingesetzten Scanningeinheit gezielt eingesetzt und gegebenenfalls modifiziert, um eine gewichtete Registrierung zu ermöglichen.Instead of elaborate scanning units, one at any one time the measurement largely controlled movement of the focus volume can also make less expensive Facilities are used. These are simple, for example Mirrors or prisms made by piezoelectric or electrodynamic Principle to be excited to vibrate. It can resonances The mechanical couplings are selected specifically. In a preferred variant are the system-related low-pass characteristics the mechanical couplings within the used for generating the focus volume movements Scanning unit used selectively and optionally modified, to allow a weighted registration.

In einer besonders einfachen Ausgestaltung der Erfindung wird die Bewegung des Fokusvolumens (Scanning) auf eine Raumrichtung beschränkt (eindimensionales Scanning). In diesem Fall braucht das zur Strahlablenkung verwendete optische Element nur in einer Drehachse gelagert sein.In a particularly simple embodiment of the invention is the movement of the focus volume (scanning) limited to one spatial direction (one-dimensional scanning). In this case, this needs to beam deflection used optical element to be stored only in a rotation axis.

In einer bevorzugten vereinfachten Ausführung wird das optische Element zur Erzeugung der Scanbewegung mit einer Sinusschwingung beauftragt. Die dabei auftretenden zeitlichen Ungleichgewichte bei der Integration der Messung über das Scanfeld mit stärkerer Gewichtung der Emissionen im Bereich der Umkehrpunkte der Bewegung des Fokusvolumens wird in dieser Variante vernachlässigt.In a preferred simplified embodiment, the optical Element for generating the scanning movement with a sine wave instructed. The occurring temporal imbalances in the integration of the measurement over the scan field with stronger Weighting of emissions in the area of reversal points of the movement of the focus volume is neglected in this variant.

Bevorzugt weist die erfindungsgemäße Anregungsstrahlungseinheit mindestens eine Lichtquelle zur Erzeugung der Anregungsstrahlung auf. Bevorzugt ist diese Lichtquelle mindestens ein Laser mit quasi monochromatischem Emissionsspektrum. Alternativ ist die Lichtquelle eine Gasentladungslampe und/oder eine Glühemissionslampe, beispielsweise Wolframlampe oder Nernst-Stift, wobei bevorzugt zur Einengung des Emissionsspektrums dieser Lampen ein geeigneter Monochromator, beispielsweise ein optisches Gitter oder eine Kom bination mehrerer optischer Gitter vorgeschaltet ist. Bevorzugt weist die Anregungsstrahlungseinheit so genannte Plasmalinefilter oder entsprechende Mittel zum Filtern der Hauptwellenlänge auf. Weiter bevorzugt weist die Anregungsstrahlungseinheit mindestens einen so genannten Bandpassfilter oder entsprechende Mittel zur Parallelisierung von Laserlicht auf.The excitation radiation unit according to the invention preferably has at least one light source for generating the excitation radiation. Preferably, this light source is at least one laser with quasi mono chromatic emission spectrum. Alternatively, the light source is a gas discharge lamp and / or an incandescent lamp, for example tungsten lamp or Nernst pin, preferably for the narrowing of the emission spectrum of these lamps, a suitable monochromator, such as an optical grating or a com bination of several optical grating is connected upstream. The excitation radiation unit preferably has so-called plasmaline filters or corresponding means for filtering the main wavelength. More preferably, the excitation radiation unit has at least one so-called bandpass filter or corresponding means for parallelizing laser light.

In einer bevorzugten Variante weist die Anregungsstrahlung insbesondere für die Messung biologischer Proben/Zellen eine spektrale Verteilung im nahen Infrarot-Bereich auf. Bevorzugt sind Wellenlängen von 700 bis 1200 nm. Besonders bevorzugt weist die Anregungsstrahlung eine Wellenlänge von etwa 785 ± 60 nm, bevorzugter 785 ± 30 nm, 785 ± 10 nm und am meisten bevorzugt von etwa 785 nm auf. Ohne an die Theorie gebunden zu sein, weist dieser Wellenlängenbereich für die Raman-Spektroskopie lebender biologischer Zellen in flüssigen Medien oder in Zellverbänden oder Geweben eine Reihe von Vorteilen auf: Die Absorption der Anregungsstrahlung im flüssigen Medium ist tolerierbar gering, die unerwünschte Emission von Fluoreszenzstrahlung ist tolerierbar gering, der schädigende Einfluss auf Struktur und Lebensfunktion der bestrahlten lebenden Zellen ist minimal. Gleichzeitig erleichtert die in diesem Wellenlängenbereich angeregte Raman-Streustrahlung die Aufnahme zellspezifischer Raman-Spektren (so genannter „fingerprint”-Bereich).In a preferred variant, the excitation radiation in particular for the measurement of biological samples / cells a spectral Distribution in the near infrared range. Preference is given to wavelengths from 700 to 1200 nm. Particularly preferred is the excitation radiation a wavelength of about 785 ± 60 nm, more preferably 785 ± 30 nm, 785 ± 10 nm and most preferred from about 785 nm up. Without being bound by theory, points this wavelength range for Raman spectroscopy living biological cells in liquid media or in Cell aggregates or tissues have a number of advantages: The absorption of the excitation radiation in the liquid medium is tolerably low, the unwanted emission of fluorescence radiation is tolerably low, the damaging influence on structure and life function of the irradiated living cells is minimal. At the same time facilitates the in this wavelength range excited Raman scattered radiation, the uptake of cell-specific Raman spectra (so-called "fingerprint" area).

In einer weiteren Variante der Erfindung ist eine Anregungsstrahlung im UV-Bereich vorgesehen. Bevorzugte Wellenlängen sind 300 ± 100 nm, besonders bevorzugt 300 ± 50 nm. Die nachfolgenden Ausführungen gelten somit auch für die UV-Raman-Spektroskopie, wobei Strahlungsintensitäten, Materialauswahl der optischen Medien und Detektorenempfindlichkeiten gegenüber einer IR-Spektroskopie entsprechend angepasst werden.In Another variant of the invention is an excitation radiation provided in the UV range. Preferred wavelengths are 300 ± 100 nm, more preferably 300 ± 50 nm. The following explanations therefore also apply to UV-Raman spectroscopy, whereby radiation intensities, Material selection of optical media and detector sensitivities adjusted accordingly to an IR spectroscopy become.

Zur Erzeugung der Anregungsstrahlung ist bevorzugt Hochenergielaser mit einer Anregungsenergie von mehr als 50 mW, besonders bevorzugt im Bereich von 50 bis 500 mW, vorgesehen. In einer bevorzugten Variante wird ein Laser mit etwa 100 mW verwendet. Bevorzugt sind Diodenlaser. Der Fachmann erkennt, dass die auf die bestrahlte Probe effektiv wirkende Strahlungsenergie vom konkret verwendeten optischen System und der optischen Anordnung abhängt. Je nach optischem Aufbau sind gegebenenfalls Lichtquellen mit höherer oder entsprechend niederer Strahlungsenergie erforderlich. Die auf die biologische Zelle während der Messung eingestrahlte Strahlungsenergie ist nach unten hin begrenzt durch die je nach Anwendungsgebiet nicht verlängerbare Messzeit (Integrationszeit) am Sensor/Detektor und dessen Signal/Rausch-Verhältnis Sie ist nach oben hin begrenzt durch die bei höherer Energie einsetzenden nachteiligen Auswirkungen auf die Probe, vor allem auf die Integrität und Lebensfunktion einer bestrahlten Zelle. Bevorzugt betragen Strahlungsenergien (berechnet für den Ort der bestrahlten Zelle und integriert über die Bestrahlungsdauer) für den NIR-Bereich mindestens etwa 0,1 J bis maximal etwa 10 J, vorzugsweise etwa 0,5 bis etwa 5 J.to Generation of the excitation radiation is preferably high energy laser with an excitation energy of more than 50 mW, particularly preferred in the range of 50 to 500 mW, provided. In a preferred variant a laser with about 100 mW is used. Preference is given to diode lasers. The person skilled in the art realizes that the effect on the irradiated sample is effective acting radiant energy from the actual optical system used and the optical arrangement depends. Depending on the optical design are possibly light sources with higher or corresponding low radiation energy required. The on the biological Cell radiated during the measurement radiant energy is limited at the bottom by the not extendable depending on the field of application Measuring time (integration time) at the sensor / detector and its signal-to-noise ratio It is bounded at the top by the higher energy adverse effects on the sample, especially on the integrity and vital function of an irradiated Cell. Radiation energies (calculated for the location of the irradiated cell and integrated over the irradiation time) for the NIR range at least about 0.1 J to a maximum of about 10J, preferably about 0.5 to about 5 years.

Das in der Analyseeinheit zur Registrierung/Detektion und Analyse der emittierten Raman-Streustrahlung vorgesehene CCD-Array (CCD-Chip) ist vorzugsweise so ausgeführt, dass es für den nahinfraroten Bereich beziehungsweise für einen Spektralbereich von Wellenzahl 200 bis 3500 cm^–1 besonders empfindlich ist. Der Fachmann sieht hierfür an sich bekannte Maßnahmen vor. Bevorzugt sind Ausführungen von CCD-Arrays mit schneller Messzeit (Integrationszeit) bei gutem Signal/Rausch-Verhältnis, besonders ist dies eine so genannte „open electrode”-CCD, rückgedünnte CCD, Tiefentladungs-CCD („deep depletion”-CCD) oder eine Elektronenvervielfacher-CCD. Um das Signal/Rausch-Verhältnis zu verbessern, wird das CCD-Array bevorzugt gekühlt; bevorzugte Kühltemperaturen sind etwa –50°C bis etwa –100°C.The CCD array (CCD chip) provided in the analysis unit for registration / detection and analysis of the emitted Raman scattering radiation is preferably designed to be particularly sensitive to the near-infrared region or to a spectral range of 200 to 3500 cm ^-1 , The expert provides for this known measures. Embodiments of CCD arrays with a fast measurement time (integration time) with a good signal-to-noise ratio are preferred, in particular a so-called "open electrode" CCD, back-thinned CCD, deep discharge CCD ("deep depletion" CCD) or a electron multiplier CCD. In order to improve the signal-to-noise ratio, the CCD array is preferably cooled; preferred cooling temperatures are about -50 ° C to about -100 ° C.

Die erfindungsgemäß registrierte elektromagnetische Strahlung kann in an sich bekannter Weise registriert und gegebenenfalls spektrophotometrisch analysiert werden. Zur Spektroskopie findet bevorzugt eine räumliche Auftrennung der Spektralanteile der emittierten Strahlung statt. Übliche Verfahren sind die Beugung am Gitter, am Spalt sowie die Verwendung von Prismen. Räumlich aufgetrennte Spektren können beispielweise durch geeignete CCD-Arrays oder durch wandernde Fotozellen aufgezeichnet werden. Im Falle der CCD-Arrays beträgt das Messintervall des erfindungsgemäßen Verfahrens weniger oder gleich der Integrationszeit der CCD-Zellen.The Electromagnetic registered according to the invention Radiation can be registered in a conventional manner and optionally be analyzed spectrophotometrically. For spectroscopy finds preferably a spatial separation of the spectral components the emitted radiation instead. Usual procedures are the diffraction at the grating, at the gap and the use of prisms. Spatially separated spectra can, for example recorded by suitable CCD arrays or by traveling photocells become. In the case of CCD arrays, the measurement interval is the method according to the invention less or equal to the integration time of the CCD cells.

Typische Messintervalle betragen bevorzugt 0,1 bis 1 sek. In einer bevorzugten Variante der Erfindung werden mehrere Messungen „gemittelt”, um die Rauschanteile im Messsignal zu verringern. Für besonders empfindliche Messungen können hier in an sich bekannter Weise CCD-Zellen mit langsamer Integrationszeit verwendet werden. Für die Aufzeichnung von Infrarotsignalen sind hier vorzugsweise NIR optimierte und bevorzugt Peltier-gekühlte CCD-Kameras vorgesehen.typical Measuring intervals are preferably 0.1 to 1 sec. In a preferred Variant of the invention, several measurements are "averaged", to reduce the noise in the measurement signal. For especially sensitive Measurements can here in a conventional manner CCD cells be used with slow integration time. For the Recording of infrared signals here are preferably optimized NIR and preferably Peltier-cooled CCD cameras provided.

Gemäß eines Aspekts der Erfindung weist die Vorrichtung vorzugsweise mindestens eine mikroskop-optische Einheit oder Vorrichtung, das heißt Mikroskopeinheit, zur bildgebenden mikroskopischen oder mikrophotographischen Analyse der Probe. Bevorzugt ist diese optische Einheit ein Durchlichtmikroskop mit bevorzugt Wahlweise zuschaltbarer, Phasenkontrastoptik, vorzugsweise für die differentielle Interphasenkontrast-Mikroskopie (DIS), besonders bevorzugt ein Fluoreszenzmikroskop.According to one Aspect of the invention preferably comprises the device at least a microscopic optical unit or device, that is Microscope unit, for imaging microscopic or photomicrographic Analysis of the sample. This optical unit is preferably a transmitted-light microscope preferably with optional switchable, phase-contrast optics, preferably for differential interphase contrast microscopy (DIS), particularly preferably a fluorescence microscope.

Bevorzugt weist die Mikroskopeinheit Optiken auf, die eine ausreichende Durchlässigkeit im Wellenlängenbereich der Anregungsstrahlung und im Wellenlängenbereich der emittierten Raman-Streustrahlung besitzen, besonders für diese Wellenlängenbereiche optimiert ist. Vorzugsweise wird die Anregungsstrahlungseinheit über geeignete Maßnahmen in den Strahlengang der Mikroskopeinheit, eingekoppelt. Beispielsweise ist die an einem Fluoreszenzmikroskop herkömmlicher Weise vorgesehene Lichtquelle zur Erzeugung von Fluoreszenz durch die erfindungsgemäße Anregungsstrahlungseinheit ersetzt oder ergänzt.Prefers the microscope unit has optics that have sufficient permeability in the wavelength range of the excitation radiation and in the wavelength range have the emitted Raman scattered radiation, especially for this wavelength ranges is optimized. Preferably the excitation radiation unit will take appropriate measures in the beam path of the microscope unit, coupled. For example the conventionally provided in a fluorescence microscope Light source for generating fluorescence by the inventive Excitation radiation unit replaced or supplemented.

Durch geeignete optische Maßnahmen, insbesondere Sperrfilter wird bevorzugt gewährleistet, dass in der Mikroskopeinheit die Anregungsstrahlung vom Beobachtungsstrahlengang und vom Beleuchtungsstrahlengang des bildgebenden Teils der Mikroskopeinheit und vom Strahlengang der emittierten und vorzugsweise mittels der Mikroskopeinheit Raman-Streustrahlung oder Fluoreszenz getrennt wird. So wird es möglich, die erfindungsgemäße Vorrichtung in üblichen, konfektionierten Mikroskopsystemen zu integrieren. Bevorzugt wird dazu auch die zur Analyse der spektralen Verteilung der Raman-Streustrahlung geeignete Analyseeinheit in die Mikroskopeinheit in tegriert. Dies wird vorzugsweise dadurch realisiert, dass die Analyseeinheit in den Beobachtungsstrahlengang, zum Beispiel Kameraanschluss, in geeigneter Weise eingekoppelt wird.By suitable optical measures, in particular blocking filter is preferably ensured that in the microscope unit the excitation radiation from the observation beam path and the illumination beam path the imaging part of the microscope unit and the beam path the emitted and preferably by means of the microscope unit Raman scattered radiation or fluorescence is separated. This makes it possible to use the invention Device in conventional, ready-made microscope systems to integrate. Preference is also given to the analysis of the spectral Distribution of Raman scattered radiation suitable analysis unit in The microscope unit integrated in. This is preferably done by realized that the analysis unit in the observation beam, for example camera connection, is coupled in a suitable manner.

Neben der Anregungsstrahlungseinheit kann an der Mikroskopeinheit vorzugsweise zusätzlich mindestens eine weitere Beleuchtungsquelle zur Herstellung der mikroskopischen Bilder, besonders eine Lichtquelle für die Fluoreszenzmikroskopie. Dies ist typischerweise eine Hochdruckquecksilberdampflampe. Die Mikroskopeinheit ist demgemäß vorzugsweise mit an sich bekannten Filtern zur Durchführung der Fluoreszenzmikroskopie ausgestattet.Next the excitation radiation unit may preferably be attached to the microscope unit additionally at least one further illumination source for Production of microscopic images, especially a light source for fluorescence microscopy. This is typical a high pressure mercury vapor lamp. The microscope unit is accordingly preferred with filters known per se for performing fluorescence microscopy fitted.

Weiter ist die Mikroskopeinheit zur Registrierung und späteren Analyse der von den in der Messzone der Vorrichtung angeordneten Partikeln oder biologischen Zeilen gewonnenen mikroskopischen Bildern mit mindestens einer Bildregistriereinheit, vorzugsweise einer CCD-Kamera mit geeigneter Optik, ausgestattet. Besonders bevorzugt ist die Bildregistriereinheit mit einer bevorzugt vorgesehenen Recheneinheit verbunden, die geeignet ist, gegebenenfalls mittels geeigneter Bildanalysealgorithmen, die mit der Mikroskopeinheit aufgenommenen mikroskopischen Bilder der Partikel oder biologischen Zellen zu analysieren und die Ergebnisse der Analyse anzuzeigen und/oder zu speichern.Further is the microscope unit for registration and later Analysis of those arranged in the measuring zone of the device Particles or biological lines obtained microscopic images with at least one image registration unit, preferably a CCD camera equipped with appropriate optics. Particularly preferred is the Image registration unit with a preferably provided computing unit which is suitable, if appropriate by means of suitable image analysis algorithms, the microscopic images taken with the microscope unit to analyze the particles or biological cells and the results of the View and / or save analysis.

In einer bevorzugten Ausführung weist die Vorrichtung mindestens ein Rechengerät auf. Dies ist bevorzugt zumindest mit der Analyseeinheit zur Analyse der emittierten Raman-Streustrahlung oder Fluoreszenz verbunden. Das Rechengerät ist auch geeignet zur Bestimmung von Kennwerten der aufgenommenen Raman-Spektren (Spektrum-Kennwerte) und der Kennwerte der aufgenommenen mikroskopischen Bilder der Partikel (Bild-Kennwerte). Das Rechengerät ist weiter geeignet zum Vergleich der ermittelten Spektrum-Kennwerte beziehungsweise Bild-Kennwerte mit hinterlegten, vorzugsweise vorbestimmten Spektrum-Kennwerten beziehungsweise Bild-Kennwerten.In In a preferred embodiment, the device comprises at least a computing device. This is preferred at least with the Analysis unit for the analysis of the emitted Raman scattered radiation or fluorescence connected. The calculator is also suitable for determining characteristic values of the recorded Raman spectra (spectrum characteristics) and the characteristics of the recorded microscopic images of the particles (Image characteristics). The computing device is further suitable for Comparison of the determined spectrum characteristics or image characteristics with stored, preferably predetermined spectrum characteristics or Image characteristics.

Die Figuren zeigen:The Figures show:

1 Abhängigkeit der lateralen Fokusgröße (lateralen Halbwertsbreite, FWHM) von der gewählten numerischen Apertur (NA) bei einer Wellenlänge von 785 nm 1 Dependence of the lateral focus size (lateral half-width, FWHM) on the selected numerical aperture (NA) at a wavelength of 785 nm

2 Abhängigkeit des Raumwinkels von der gewählten numerischen Apertur (NA) 2 Dependence of the solid angle on the selected numerical aperture (NA)

3 Schematische Darstellungen des Fokusvolumens zur Registrierung von emittierter Strahlung einer biologischen Zelle; 3A: kleines Fokusvolumen und großer Raumwinkel bei hoher NA, es wird viel Signalanteil von einem sehr kleinen Volumenabschnitt der Probe registriert; 3B: großes Fokusvolumen und kleiner Raumwinkel bei kleiner NA, es wird nur ein geringer Signalanteil von einem großen Volumenabschnitt der Probe registriert; 3C (erfindungsgemäß): kleines Fokusvolumen und großer Raumwinkel bei hoher NA, das während der Messung über die Probe bewegt wird (hier: geordnetes Bewegungsmuster, Scanning), es kann viel Signalanteil von einem großen Volumenabschnitt der Probe registriert werden. 3 Schematic representations of the focus volume for registration of emitted radiation of a biological cell; 3A : small focus volume and large solid angle at high NA, much signal is registered from a very small volume portion of the sample; 3B : large focus volume and small solid angle at low NA, only a small signal portion of a large volume portion of the sample is registered; 3C (according to the invention): small focus volume and large solid angle at high NA, which is moved over the sample during the measurement (here: ordered movement pattern, scanning), it can be registered a lot of signal portion of a large volume portion of the sample.

4 Schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen optischen Anordnung. Diese enthält eine mikroskopoptische Einheit (Mikroskop) (100) eine Anregungsstrahlungsquelle (200), einen Messsensor (300) und eine optische Einheit (400) zur Ablenkung des Anregungsstrahlengangs (250) und des bevorzugt koaxialen Messstrahlengangs (350). Das Mikroskop (100) weist bevorzugt mindestens eine Kamera (110) für die mikrophotographische Erfassung der zu untersuchenden Probe (500), mindestens eine abbildende Tubuslinse (120) und mindestens ein Objektiv (140) auf. Zusätzlich ist mindestens ein Strahlteiler/Spiegel (130) im Strahlengang des Mikroskops (100) vorgesehen, über welchen der Anregungsstrahlengang (250) und der bevorzugt koaxiale Messstrahlengang (350) eingekoppelt werden. Zur Trennung/Vereinigung von Anregungsstrahlengang (250) und Messstrahlengang (350) ist bevorzugt mindestens ein Strahlteiler/Kantenfilter (230) vorgesehen. Die Anordnung zur Erzeugung der Anregungsstrahlung weist bevorzugt mindestens eine Tubuslinse (220) und bevorzugt mindestens eine Lochblende/Pinhole (210) auf. Die Messanordnung zur Registrierung der emittierten Strahlung weist bevorzugt mindestens eine Tubuslinse (320) und bevorzugt mindestens eine Lochblende/Pinhole (310) auf. Zur Bevorzugt spektralen Analyse der emittierten Strahlung weist die Messanordnung ein frequenz-/wellenlängenselektives strahlablenkendes Element (340) insbesondere ein Gitter, auf sowie bevorzugt mindestens eine Optik (330) und bevorzugt mindestens eine abbildende Optik (360) zur Abbildung der vom Element (340) räumlich getrennten Spektralverteilung auf dem bevorzugt zweidimensionalen Messsensor (300). 4 Schematic representation of an optical arrangement according to the invention. This contains one Microscope Optical Unit (Microscope) ( 100 ) an excitation radiation source ( 200 ), a measuring sensor ( 300 ) and an optical unit ( 400 ) for deflecting the excitation beam path ( 250 ) and the preferably coaxial measuring beam path ( 350 ). The microscope ( 100 ) preferably has at least one camera ( 110 ) for the photomicrography of the sample to be examined ( 500 ), at least one imaging tube lens ( 120 ) and at least one lens ( 140 ) on. In addition, at least one beam splitter / mirror ( 130 ) in the beam path of the microscope ( 100 ) is provided, via which the excitation beam path ( 250 ) and the preferably coaxial measuring beam path ( 350 ) are coupled. For separation / combination of excitation beam path ( 250 ) and measuring beam path ( 350 ) is preferably at least one beam splitter / edge filter ( 230 ) intended. The arrangement for generating the excitation radiation preferably has at least one tube lens ( 220 ) and preferably at least one pinhole (Pinhole) ( 210 ) on. The measuring arrangement for registering the emitted radiation preferably has at least one tube lens ( 320 ) and preferably at least one pinhole (Pinhole) ( 310 ) on. For the preferred spectral analysis of the emitted radiation, the measuring arrangement has a frequency / wavelength-selective beam deflecting element ( 340 ), in particular a grid, and preferably at least one optic ( 330 ) and preferably at least one imaging optic ( 360 ) for mapping the element ( 340 ) spatially separated spectral distribution on the preferably two-dimensional measuring sensor ( 300 ).

Ausführungsbeispiel: Abschätzung der minimalen ScangeschwindigkeitEmbodiment: Estimation the minimum scan speed

Zur beispielsweise Berechnung der minimalen Scangeschwindigkeit, das heißt der Bewegungsgeschwindigkeit der Anregungsstrahlung, die benötigt wird, um das unerwünschte Festhalten von Probenstrukturen, insbesondere Zellkerne an der optischen Achse des Anregungsstrahlengangs zu verhindern, soll die „escape force”, d. h. die Kraft, die eine „optische Pinzette” bei gegebener Laserleistung maximal aufbringen kann, um das Partikel zu halten, für ein Polystyren bead mit 1 µm Durchmesser in Wasser als Modell für eine Zellorganelle bei einer Laserleistung von 50 mW nach Tlusty T., Meller A., and Bar-Ziv R., Optical gradient forces of strongly localized fields, Phys. Rev. Lett. 81, 1738–1741 (1998) , berechnet werden. Es ergibt sich eine „escape force” von ca. 10 pN.For example, to calculate the minimum scanning speed, that is, the movement speed of the excitation radiation, which is needed to prevent the unwanted retention of sample structures, in particular cell nuclei on the optical axis of the excitation beam path, the "escape force", ie the force, the " For a polystyrene bead of 1 μm diameter in water as a model for a cell organelle at a laser power of 50 mW, optical tweezers can maximally apply at a given laser power to hold the particle Tlusty T., Meller A., and Bar-Ziv R., Optical gradient forces of strongly localized fields, Phys. Rev. Lett. 81, 1738-1741 (1998) , be calculated. This results in an "escape force" of about 10 pN.

Im Fall von Stokesscher Reibung: Fesc = 6πηrνesc ergibt sich eine „escape” Geschwindigkeit von 530 µm/s, um der optischen Pinzette zu entkommen. Damit sollte in erster Näherung die Bewegung des Laserfokus schneller sein als dieser Wert, um ein Partikel abreißen zu lassen.In the case of Stokes friction: F esc = 6πηrν esc results in an "escape" speed of 530 microns / s to escape the optical tweezers. Thus, in a first approximation, the movement of the laser focus should be faster than this value in order to tear off a particle.

Die folgenden genaueren theoretischen ( Tlusty et al. aaO ) und experimentell bestätigten ( Simmons RM, Finer JT, Chu S, Spudich JA. Quantitative measurements of force and displacement using an optical trag. Biophys. J. 70(4): 1813–22 (1996) ). Zusammenhänge bei Variation der Größe des Partikels bzw. der Laserleistung erlaubt eine einfache Abschätzung der nötigen Geschwindigkeit bei veränderten Bedingungen:

The following more precise theoretical ( Tlusty et al. cit ) and experimentally confirmed ( Simmons RM, Finer JT, Chu S, Spudich JA. Quantitative measurements of force and displacement using an optical carrier. Biophys. J. 70 (4): 1813-22 (1996) ). Correlations with variation of the size of the particle or the laser power allows a simple estimation of the necessary speed under changed conditions:

Da νesc ∝ Fesc gelten die Proportionalitäten auch direkt für die nötige Geschwindigkeit des Fokus. Bei einer Verdoppelung der Laserleistung muss also eine doppelte Fokusgeschwindigkeit genutzt werden, um ein Mitziehen zu verhindern.There ν esc Α F esc Proportionalities also apply directly to the necessary speed of focus. When doubling the laser power so a double focus speed must be used to prevent entrainment.

Die escape-Kraft F_esc hat bei gegebenen Werten für Laserleistung I₀, Fokusdurchmesser ω und Verhältnis der Dielektrizitätskonstanten α eine obere Grenze unabhängig von Durchmesser und Exzentrizität der Partikel ( Simmons et al. aaO ): Fesc ≤ αI0ω22π The escape force F _esc has an upper limit irrespective of the diameter and eccentricity of the given values for laser power I ₀ , focus diameter ω and ratio of the dielectric constant α Particles ( Simmons et al. cit ): F esc ≤ αI 0 ω 2 2π

Berechnet man mit obiger Stokes'scher Reibung eine minimale Scangeschwindigkeit, so ist man im Experiment für alle Bedingungen auf der sicheren Seite. Damit ergibt sich für den Fall

eine maximale „escape force” von 100 pN und dann eine minimal nötige Fokusgeschwindigkeit von 50 mm/s.If one calculates a minimal scan speed with the above Stokes friction, one is on the safe side in the experiment for all conditions. This results in the case

a maximum "escape force" of 100 pN and then a minimum necessary focus speed of 50 mm / s.

Man beachte, dass es sich hierbei um eine Rechnung mit sehr starkem Unterschied in den Brechungsindices handelt. Bei biologischen Zellen finden sich in der Literatur deutlich kleinere Unterschiede (z. B.. Kemmler et al.: Kemmler M, Fratz M, Giel D, Saum N, Brandenburg A, and Hoffmann Ch. Noninvasive time-dependent cytometry monitoring by digital holography. J. Biomed. Opt. 12: 064002 (2007) ), mit einem resultierenden α von 0.06 und somit einem Faktor 5 kleinerem F_esc bzw. ν_esc, so dass 10 mm/s für alle Partikelgrößen ausreichen.Note that this is an invoice with a very large difference in refractive indices. In biological cells, there are significantly smaller differences in the literature (eg. Kemmler et al .: Kemmler M, Fratz M, Giel D, Hem N, Brandenburg A, and Hoffmann Ch. Noninvasive time-dependent cytometry monitoring by digital holography. J. Biomed. Opt. 12: 064002 (2007) ), with a resulting α of 0.06 and thus a factor of 5 smaller F _esc and ν _esc , _respectively , so that 10 mm / s is sufficient for all particle sizes.

Die obige Abschätzung stellt sicher, dass auch sehr große Strukturen im Bereich mehrerer Fokusdurchmesser nicht mitgezogen werden. Die bei Zellorganellen relevanten Größenbereiche liegen im Bereich von 1 bis 2 Fokusdurchmessern. Ohne an die Theorie gebunden sein zu wollen, liegt die „escape force” bekanntermaßen ( Tlusty et al. aaO ) um ca. einen Faktor 5 niedriger, so dass bei biologischen Proben im Allgemeinen eine Scangeschwindigkeit von 2 mm/s ausreichend ist.The above estimation ensures that even very large structures in the range of several focus diameters are not taken along. The size ranges relevant for cell organelles are in the range of 1 to 2 focal diameters. Without wishing to be bound by theory, the "escape force" is known ( Tlusty et al. cit ) is lower by about a factor of 5, so that in general a scanning speed of 2 mm / s is sufficient for biological samples.

Im Hinblick auf die technische Realisierung, wo der Aufwand der Realisierung mit der Höhe der zu realisierenden Geschwindigkeit skaliert, ist man damit deutlich auf der sicheren Seite. Entsprechende Geschwindigkeiten lassen sich mit Galvano- oder Piezoscannern leicht erreichen.in the Regard to the technical realization, where the effort of realization scaled with the height of the speed to be realized, you are clearly on the safe side. Corresponding speeds can be easily reached with galvano or piezo scanners.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNGQUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.This list The documents listed by the applicant have been automated generated and is solely for better information recorded by the reader. The list is not part of the German Patent or utility model application. The DPMA takes over no liability for any errors or omissions.

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

- Tlusty T., Meller A., and Bar-Ziv R., Optical gradient forces of strongly localized fields, Phys. Rev. Lett. 81, 1738-1741 (1998) [0106]
Tlusty et al. supra [0108]
- Simmons RM, Finer JT, Chu S, Spudich YEAH. Quantitative measurements of force and displacement using an optical carrier. Biophys. J. 70 (4): 1813-22 (1996) [0108]
- Simmons et al. supra [0110]
Kemmler et al .: Kemmler M, Fratz M, Giel D, Hem N, Brandenburg A, and Hoffmann Ch. Noninvasive time-dependent cytometry monitoring by digital holography. J. Biomed. Opt. 12: 064002 (2007) [0112]
Tlusty et al. supra [0113]

Claims

A method for the spectroscopic analysis of a surface or volume portion of a sample in a measuring arrangement with excitation beam path and measuring beam path, wherein via the excitation beam in the sample radiation emission excited and emitted radiation is absorbed by a focus volume of the measuring beam path within a time measurement interval, characterized in that the focus volume on the surface or volume portion corresponding to a multiple of the focus volume is moved and the radiation registered in the moving focus volume over the duration of the measurement interval is integrated.

The method of claim 1, wherein the focus volume by an optical scanner unit provided in the measuring device is moved.

The method of claim 1 or 2, wherein the focus volume at least over the duration of the measurement interval in at least a spatial direction is moved periodically.

Method according to one of the preceding claims, wherein the focus volume at least over the duration of the measurement interval is ordered according to a structured pattern (scanning).

Method according to one of the preceding claims, wherein the focus volume at least over the duration of the measurement interval is stochastically or quasi-stochastically moved (wobble).

Method according to one of the preceding claims, wherein the fundamental frequency of the movement of the focus volume at least over the duration of the measurement interval is 5 to 1000 Hz.

Method according to one of the preceding claims, where the amplitude of the fundamental frequency of the movement of the focus volume at least over the duration of the measurement interval 1 to 100 microns is.

Method according to one of the preceding claims, wherein the speed of movement of the focus volume at least over the duration of the measurement interval is always 2 mm / s or more.

Method according to one of the preceding claims, where geometry and / or position of the surface or volume section determined automatically on the basis of photomicrographic data of the sample become.

Method according to one of the preceding claims, wherein the excitation beam is the sample at least for the duration keeps the measurement stationary.

Method according to one of the preceding claims, wherein the spectroscopic analysis is selected from: Fluorescence spectroscopy, Raman spectroscopy, SERS, IR spectroscopy and related or derived spectroscopic methods.

Device suitable for carrying the method of spectroscopic analysis of a surface or Volume section of a sample according to any preceding claim, containing: microscope optical arrangement, excitation radiation source with excitation beam path for excitation of radiation emission in one Sample and measuring device with measuring beam path for registration of radiation emitted by the sample, wherein the measuring beam path a focus volume, characterized in that the to be analyzed Area or volume section of the sample a multiple corresponds to the focus volume and that the focus volume during the measurement over at least the entire surface area or volume portion is movable.

Apparatus according to claim 12, configured in such a way that the speed of movement of the focus volume at least over the duration of the measurement interval is always 2 mm / s or more.