DE102008054660A1 - Polyketide biosynthesis genes - Google Patents
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- C12P17/181—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system, e.g. Salinomycin, Septamycin
Abstract
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Verfahren zur gezielten Isolierung von Polyketidbiosynthesegenen aus Metagenomen bereit. Weiterhin werden erstmalig die Nuklein- und Aminosäuresequenzen des PKS-Clusters von Psymberin, sowie Expressionssysteme zur Herstellung dieser Polyketids offenbart.The present invention provides a novel method for the targeted isolation of polyketide biosynthesis genes from metagenomes. Furthermore, for the first time, the nucleic acid and amino acid sequences of the PKS cluster of psymberin, as well as expression systems for the production of this polyketide are disclosed.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Gensequenzen, sowie die mittels dieses Verfahrens isolierte Gensequenz und Fragmente derselben, die für Peptide zur Biosynthese von Polyketiden codiert.The The invention relates to a method for the isolation of gene sequences, and the gene sequence and fragments isolated by this method same for peptides for biosynthesis of polyketides coded.
Schwämme
(Porifera) stellen die wichtigste Quelle mariner Produkte mit therapeutischem
Potential dar (
Eine direkte Kultivierung einzelner Symbionten führte in den meisten Fällen nicht zum Erfolg, womit die Isolierung eines bestimmten, interessierenden PKS Genclusters für die Biosynthese von Polyketiden aus einem solchen Metagenom ein großes Problem darstellt. Unter anderem wird nämlich z. B. die Herstellung und Durchmusterung von extrem großen DNA-Bibliotheken erforderlich und die Identifizierung des korrekten PKS Genclusters stellt eine große Herausforderung dar.A direct cultivation of individual symbionts resulted in the Most cases do not succeed, bringing the isolation of a specific, interesting PKS gene cluster for biosynthesis of polyketides from such a metagenome a big one Problem presents. Among other things, namely z. B. the Production and screening of extremely large DNA libraries required and the identification of the correct PKS gene cluster represents a big challenge.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Lösung zu diesem Problem bereit und offenbart einen neuen Ansatz zur spezifischen Amplifikation von PKS-Genregionen, der auf der Substratspezifität von Kethosynthasedomänen beruht.The The present invention provides a solution to this problem ready and reveals a new approach to specific amplification of PKS gene regions based on the substrate specificity of Kethosynthasedomänen based.
In einem ersten Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Nukleinsäure umfasssend zumindest ein Biosynthesegen für ein Polyketid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Psymberin oder Mycalamid. In einer spezifischen Ausführungsform umfasst die Nukleinsäure eine Sequenz umfasst die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO 1–19, 39, 75, einem Homolog dieser Sequenzen und dem Komplement der Sequenzen oder des Homologs, wobei das Homolog zumindest 75% Sequenzidentität aufweist, oder unter Hochsalzbedingungen mit der Nukleinsäure hybridisiert.In In a first aspect, the present invention relates to a Nucleic acid comprising at least one biosynthetic gene for a polyketide selected from the group consisting of psymberin or mycamide. In a specific embodiment the nucleic acid comprises a sequence selected is selected from the group consisting of SEQ ID NO 1-19, 39, 75, a homolog of these sequences and the complement of the sequences or the homolog, wherein the homolog has at least 75% sequence identity or under high salt conditions with the nucleic acid hybridized.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Peptid für das eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren codiert. In einer spezifischen Ausführungsform weist das Peptid eine Aminosäuresequenz auf, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO 20–38 oder einem Homolog dieser Sequenzen, wobei das Homolog zumindest eine Sequenzidentität Identität zu SEQ ID NO 20 von 36%, zu SEQ ID NO 21 von 54%, zu SEQ ID NO 22 von 44%, zu SEQ ID NO 23 von 41%, zu SEQ ID NO 24 von 52%, zu SEQ ID NO 25 von 42%, zu SEQ ID NO 28 von 44%, zu SEQ ID NO 29 von 94%, zu SEQ ID NO 30 von 96%, zu SEQ ID NO 31 von 96%, zu SEQ ID NO 32 von 94%, zu SEQ ID NO 33 von 98%, zu SEQ ID NO 34 von 95%, zu SEQ ID NO 35 von 97%, zu SEQ ID NO 36 von 98%, zu SEQ ID NO 37 von 96% oder zu SEQ ID NO 38 von 96% aufweist.In In another aspect, the present invention relates to a peptide for the one of the invention Nucleic acids encoded. In a specific embodiment For example, the peptide has an amino acid sequence selected is selected from the group consisting of SEQ ID NO 20-38 or a Homolog of these sequences, wherein the homolog at least one sequence identity Identity to SEQ ID NO 20 of 36%, to SEQ ID NO 21 of 54%, to SEQ ID NO 22 of 44%, to SEQ ID NO 23 of 41%, to SEQ ID NO 24 from 52%, to SEQ ID NO 25 from 42%, to SEQ ID NO 28 from 44%, to SEQ ID NO 29 of 94%, to SEQ ID NO 30 of 96%, to SEQ ID NO 31 from 96%, to SEQ ID NO 32 from 94%, to SEQ ID NO 33 from 98%, to SEQ ID NO 34 of 95%, to SEQ ID NO 35 of 97%, to SEQ ID NO 36 of 98%, to SEQ ID NO 37 of 96% or to SEQ ID NO 38 of 96%.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren umfassenden Vektor sowie eine rekombinante Wirtszelle, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder den erfindungsgemäßen Vektor umfasst.In In another aspect, the present invention relates to one the nucleic acids according to the invention comprehensive vector and a recombinant host cell, the inventive Nucleic acids or the invention Vector includes.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines Polyketids umfassend den Schritt der Kultivierung einer erfindungsgemäßen rekombinaten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression der Biosynthesegene und Produktion des Polyketids durch die Wirtszelle erlauben.In In another aspect, the present invention relates to a process for producing a polyketide comprising the step the cultivation of a recombinant according to the invention Host cell under conditions affecting the expression of the biosynthetic genes and allow production of the polyketide by the host cell.
In
einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf
ein Verfahren zur Isolierung zumindest eines Polyketid-Biosynthesegens,
umfassend die Schritte: a) Bereitstellen von zumindest einem Primerpaar,
das auf der Substratspezifität einer Kethosynthasedomäne
einer trans-AT Polyketidsynthase basiert; und b) Isolierung von
zumindest einem Polyketid-Biosynthesegen unter Verwendung des zumindest
einen Primerpaars aus Schritt a). In einer spezifischen Ausführungsform
umfasst Schritt b) die Amplifikation der vom Primerpaar eingeschlossenen
Nukleinsäureregion. In weiteren spezifischen Ausführungsformen
ist das zumindest eine Primerpaar spezifisch ist für ein
Motiv das bei phylogenetisch benachbarten Kethosynthasedomänen von
trans-AT Polyketidsynthasen konserviert ist, oder ist zumindest
ein Primer des Primerpaars spezifisch ist für zumindest
4 zusammenhängende Aminosäurereste eines der in
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Verfahren zur gezielten Isolierung von Polyketidbiosynthesegenen aus Metagenomen bereit, wobei sich die Substratspezifität der Polyketidketten-verlängernden Ketosynthase (KS) Domänen zunutze gemacht wird.The The present invention provides a new method for targeted isolation of polyketide biosynthesis genes from metagenomes, where the substrate specificity of the polyketide chain-extending Ketosynthase (KS) domains is exploited.
Definitionendefinitions
Unter dem Term „Nukleinsäure” im Sinne der vorliegenden Erfindung wird insbesondere – aber nicht darauf beschränkt – natürliche, vorzugsweise lineare, verzweigte oder zirkuläre Nukleinsäuren wie RNA, insbesondere mRNA, einzelsträngige und doppelsträngige virale RNA, siRNA, miRNA, snRNA, tRNA, hnRNA oder Ribozyme, genomische, bakterielle oder virale DNA (einzelsträngig und doppelsträngig), chromosomale und episomale DNA, frei zirkulierende Nukleinsäure und dergleichen, synthetische oder modifizierte Nukleinsäuren, beispielsweise Plasmide oder Oligonukleotide, insbesondere für die PCR verwendete Primer, Sonden oder Standards, mit Digoxigenin, Biotin oder Fluoreszenzfarbstoffen markierte Nukleinsäuren oder sogenannte PNAs („peptide nucleic acids”) verstanden. Eine Nukleinsäure besteht häufig aus zwei komplementären Strängen. Daher soll bei einer durch diese Erfindung beanspruchten Nukleinsäure generell auch immer das reverse Komplement dieser Nukleinsäure als mitbeansprucht gelten.The term "nucleic acid" in the context of the present invention particularly, but not limited to, natural, preferably linear, branched or circular nucleic acids such as RNA, in particular mRNA, single-stranded and double-stranded viral RNA, siRNA, miRNA, snRNA, tRNA, hnRNA or ribozymes, genomic, bacterial or viral DNA (single-stranded and double-stranded), chromosomal and episomal DNA, free-circulating nucleic acid and the like, synthetic or modified nucleic acids, for example plasmids or oligonucleotides, in particular primers, probes or standards used with the PCR, with digoxigenin, Biotin or fluorescent dyes labeled nucleic acids or so-called PNAs ("peptide nucleic acids") understood. A nucleic acid often consists of two complementary strands. Therefore, in the case of a nucleic acid claimed by this invention, the reverse complement of this nucleic acid should generally also be considered as being claimed.
Unter dem Term „Hochsalzpuffer” wird insbesondere – aber nicht darauf beschränkt – ein Puffer aufweisend eine hohe Salzkonzentration (bevorzugt chaotrope Substanzen), bevorzugt ≥ 100 mM, bevorzugter ≥ 500 mM und noch bevorzugter ≥ 1 M, verstanden.Under The term "high-salt buffer" is especially - but not limited to this - having a buffer a high salt concentration (preferably chaotropic substances), preferably ≥ 100 mM, more preferably ≥500 mM, and more preferably ≥1 M, understood.
Unter dem Term „Hochsalzbedingungen” wird im Folgenden ein Milieu verstanden, das einen Hochsalzpuffer verwendet, bevorzugt einen Hochsalzpuffer enthaltend chaotrope Salze. Durch Hochsalz, bevorzugt aufweisend chaotrope Salze, wird die Löslichkeit von Nukleinsäuren in Wasser herabgesetzt. Grund ist das Aufbrechen von Wasserstoffbrücken und damit verbunden eine Verringerung der Stabilisierung von Sekundär- und Tertiär- Strukturen der Nukleinsäuren in Wasser. Wird nun eine polare Oberfläche als Wasserstoffbrückendonor angeboten, binden die Nukleinsäuren an dieser Oberfläche, da sie dort eine bessere Stabilisierung erfahren als in Wasser. Wird die Salzkonzentration verringert, wird Wasser wieder ein besserer Wasserstoffbrückendonor als die polare Oberfläche, und die Nukleinsäuren lassen sich wieder von der Oberfläche ablösen.Under the term "high salt conditions" is hereafter understood a medium that uses a high salt buffer, preferably a high salt buffer containing chaotropic salts. By high salt, preferably having chaotropic salts, the solubility becomes of nucleic acids in water decreased. Reason is the break up of hydrogen bonds and associated reduction the stabilization of secondary and tertiary Structures of nucleic acids in water. Will now be a polar Surface offered as a hydrogen bond donor, bind the nucleic acids to this surface, because they experience better stabilization there than in water. When the salt concentration is reduced, water becomes better again Hydrogen bond donor as the polar surface, and the nucleic acids are released from the surface peel off.
Unter dem Term „chaotrope Substanzen” bzw. „chaotrope Salze” werden insbesondere – aber nicht darauf beschränkt – Substanzen, die die Sekundär-, Tertiär- und/oder Quartärnärstruktur von Proteinen und/oder Nukleinsäuren ändern und zumindest die Primärstruktur intakt lassen, die Löslichkeit polarer Substanzen in Wasser verringern und/oder hydrophobe Wechselwirkungen verstärken, verstanden. Bevorzugte chaotrope Substanzen sind Guanidinhydrochlorid, Guanidinium(iso)thiocyanat, Natriumiodid, Natriumperchlorat, Kaliumiodid, Natrium(iso)thiocyanat und/oder Harnstoff.Under the term "chaotropic substances" or "chaotropic Salts "are in particular - but not on it limited - substances that are the secondary, Tertiary and / or quaternary structure of proteins and / or nucleic acids change and at least leave the primary structure intact, the solubility reduce polar substances in water and / or hydrophobic interactions reinforce, understood. Preferred chaotropic substances are guanidine hydrochloride, guanidinium (iso) thiocyanate, sodium iodide, Sodium perchlorate, potassium iodide, sodium (iso) thiocyanate and / or Urea.
Die Begriffe „Protein”, „Peptid”, „Polypeptid” und „Enzym” werden synonym verwendet, sofern nicht Gegenteiliges beschrieben wird.The Terms "protein", "peptide", "polypeptide" and "enzyme" used synonymously unless the contrary is described.
Unter dem Begriff „Amplifikation” oder „Amplifikationsreaktion” wird ein Verfahren verstanden, das es ermöglicht, die Konzentration eines oder mehrerer Analyte – bevorzugt Nuk leinsäuren – mindestens zu verdoppeln. Man unterscheidet hier zwischen isothermen und thermocyclischen Amplifikationsreaktionen. Bei ersteren bleibt die Temperatur während des gesamten Verfahren stets gleich, während bei letzterer thermische Zyklen durchlaufen werden, mit deren Hilfe die Reaktion und die Amplifikation gesteuert wird.Under the term "amplification" or "amplification reaction" understood a method that allows the concentration one or more analytes - preferably nucleic acids - at least to double. A distinction is made here between isothermal and thermocyclic Amplification reactions. In the former, the temperature remains during the same throughout the procedure, while in the latter case undergo thermal cycles, which help the reaction and the amplification is controlled.
Bevorzugte isotherme Amplifikationsreaktionen sind z. B.
- • Loop mediated isothermal amplification (LAMP),
- • Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA),
- • Rolling Circle Chain Reaction (RCCR), oder Rolling Circle Amplification (RCA), und/oder
- • Transcription mediated amplification (TMA) Bevorzugte thermocyclische Amplifikationsreaktionen sind z. B.
- • Ligase-Kettenreaktion (LCR), und/oder
- • Polymerase Ketttenreaktion (PCR)
- Loop mediated isothermal amplification (LAMP),
- Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA),
- • Rolling Circle Chain Reaction (RCCR), or Rolling Circle Amplification (RCA), and / or
- Transcription mediated amplification (TMA) Preferred thermocyclic amplification reactions are e.g. B.
- Ligase chain reaction (LCR), and / or
- Polymerase chain reaction (PCR)
Unter dem Term „Polymerase Kettenreaktion” (PCR) wird ein Verfahren zur in vitro-Vervielfältigung von Nukleinsäuren verstanden, wie es z. B. in Bartlett & Stirling (2003) beschrieben ist.Under the term "polymerase chain reaction" (PCR) a method for in vitro amplification of nucleic acids understood how it z. As described in Bartlett & Stirling (2003).
Unter dem Term „Ligase-Kettenreaktion” (LCR) wird ein Nachweisverfahren für geringste Mengen von Nukleinsäuren verstanden, das ähnlich wie die Polymerase-Kettenreaktion funktioniert, nur unter Verwendung eines anderen Enzyms (anstatt der Polymerase eine Ligase). Zwei Proben pro DNA-Strang werden zu einer Probe ligiert. Die entstehenden, oft nur 30–50 bp langen Amplifikate eines Zyklus dienen in den folgenden Zyklen selbst wieder als Ansatzpunkt für die supplementierten Primer.Under the term "ligase chain reaction" (LCR) becomes Detection method for smallest amounts of nucleic acids understood, similar to the polymerase chain reaction works, only using a different enzyme (instead the polymerase a ligase). Two samples per DNA strand become a sample ligated. The resulting, often only 30-50 bp long amplificates of one cycle serve in the following cycles themselves again as a starting point for the supplemented primer.
Unter dem Term „Loop-mediated Isothermal Amplification” (LAMP) wird eine Methode zur isothermalen Nukleinsäureamplifikation verstanden, bei welcher 6 verschiedene Primer eingesetzt werden, die bestimmte Regionen auf der Target-Sequenz erkennen und daran binden. LAMP nutzt eine DNA-Polymerase mit Strand-displacement Aktivität und läuft bei einer konstanten Temperatur von etwa 65°C ab. Amplifikation und Detektion der Target-Sequenz findet in einem einzigen Schritt statt.Under the term "loop-mediated isothermal amplification" (LAMP) becomes a method for isothermal nucleic acid amplification understood in which 6 different primers are used, recognize the specific regions on the target sequence and it tie. LAMP utilizes a DNA polymerase with strand-displacement activity and runs at a constant temperature of about 65 ° C from. Amplification and detection of the target sequence takes place in one single step instead.
Unter dem Term „Nucleic Acid Sequence Based Amplification” (NASBA), wird ein Verfahren zur Amplifikation von RNA verstanden (Compton 1991). Dabei wird eine RNA-Matrix zu einem Reaktionsgemisch gegeben, und ein erster Primer bindet an die komplementäre Sequenz im Bereich des 3'-Endes der Matrix. Anschließend wird mit einer Reversen Transkriptase der zur Matrix komplementäre DNA-Strang polymerisiert. Mit Hilfe von RNase H wird dann die RNA-Matrix verdaut (RNase H verdaut nur RNA in RNA-DNA Hybriden, nicht single-stranded RNA). Anschließend wird ein zweiter Primer an das 5' Ende des DNA-Stranges gebunden. Dieser wird von der T7 RNA Polymerase als Startpunkt für die Synthese eines zum DNA-Strang komplementären RNA-Moleküls verwendet, welches dann wieder als Ausgangsmatrix verwendet werden kann. NASBA wird bei einer konstanten Temperatur von normalerweise 41°C. durchgeführt und liefert unter bestimmten Umständen schnellere und bessere Resultate als PCR.Under the term "nucleic acid sequence based amplification" (NASBA), is a process for the amplification of RNA understood (Compton 1991). An RNA matrix is added to a reaction mixture, and a first primer binds to the complementary sequence in the region of the 3'-end of the matrix. Subsequently, with a reverse transcriptase complementary to the matrix DNA strand polymerized. With the help of RNase H then the RNA matrix Digested (RNase H digested only RNA in RNA-DNA hybrids, not single-stranded RNA). Subsequently, a second primer is attached to the 5 'end bound to the DNA strand. This is from the T7 RNA polymerase as a starting point for the synthesis of a DNA strand complementary to RNA molecule, which is then used again as the starting matrix can be used. NASBA is at a constant temperature of normally 41 ° C. performed and delivered under certain circumstances faster and better results as a PCR.
Unter dem Term „Transcription Mediated Amplification” (TMA) wird ein von der US-Firma Gen-Probe entwickeltes isothermes Amplifikationsverfahren verstanden, das der NASBA ähnlich ist und bei dem ebenfalls RNA Polymerase und Reverse Transkriptase verwendet werden (Hill, 2001)Under the term "Transcription Mediated Amplification" (TMA) becomes an isothermal amplification process developed by the US company Gen-Probe understood, which is similar to the NASBA and in which also RNA Polymerase and reverse transcriptase are used (Hill, 2001)
Der
Term „Rolling Circle Chain Reaction” (RCCR) oder ”Rolling
circle Amplification” (RCA) betrifft ein Amplifikationsverfahren,
das die allgemeine Nukleinsäure-Replikation nach dem rolling-circle-Prinzip
imitiert und unter anderem in der
Unter dem Begriff ”Nested PCR” wird ein Verfahren verstanden, bei dem ein bereits vervielfältigtes DNA-Fragment (oder ein Teil davon) ein weiteres Mal amplifziert wird; dieser Vorgang erfolgt mit einem zweiten Primerpaar, das innerhalb des in der ersten Reaktion verwendeten Primerpaars angeordnet ist.Under The term "Nested PCR" is understood to mean a method in which an already duplicated DNA fragment (or part of it) is amplified a second time; this process takes place with a second primer pair, which is within the first Reaction used primer pair is arranged.
Unter dem Begriff „Promotor” wird vorliegend eine Nukleinsäuresequenz verstanden, die die regulierte Expression eines Gens ermöglicht. Sie liegt upstream, d. h. 5' zum RNA-kodierenden Bereich des Gens. Eine wichtige Eigenschaft eines Promotors ist die spezifische Wechselwirkung mit bestimmten DNA-bindenden Proteinen, welche den Start der Transkription des Gens durch die RNA-Polymerase vermitteln und als Transkriptionsfaktoren bezeichnet werden. Die wichtigsten prokaryotischen Transkriptionsfaktoren sind die Sigma-Faktoren. Die mit Abstand meisten Promotoren bei z. B. E. coli werden über den Faktor Sigma-70 er kannt und weisen die folgenden Promotorelemente auf: 1) ein AT-basenpaarreiches UP-Element oberhalb der -35-Region (was auch direkt mit der α-Untereinheit der bakteriellen RNA-Polymerase interagieren kann), 2) die -35-Region, mit der Konsensussequenz: 5'-TTGACA-3',3) die -10-Region (Pribnow-Box), mit der Konsensussequenz: 5'-TATAAT-3'. Weiterhin sind starke Promotoren direkt vor dem Startpunkt der Transkription reich an AT-Basenpaaren. Die Konsensussequenzen geben nur einen ungefähren Anhaltspunkt für den Aufbau eines Promotors. Ein bestimmter Sigma-70-abhängiger Promotor kann an mehreren Stellen von diesen Sequenzen abweichen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor ein induzierbarer Promotor. Ein Beispiel für einen induzierbaren Promotor ist der künstlich erzeugte tac-Promoter, der zur Erhöhung des Genexpressionslevels in Bakterienzellen (z. B. E. coli) und somit zur Überexpression rekombinanter Proteine genutzt werden kann. Dieser synthetische Promotor besteht aus der -35 Region des starken trp-Promotor aus E. coli und der -10 Region des IPTG und Laktose regulierbaren/induzierbaren lac-Promotors. Der induzierbare tac-Promoter ist ca. 3-mal stärker als der trp-Promoter und ca. 10-mal stärker als der lac-Promoter.Under The term "promoter" in the present case is a nucleic acid sequence understood that allows the regulated expression of a gene. It is upstream, d. H. 5 'to the RNA coding region of the gene. An important property of a promoter is the specific interaction with certain DNA-binding proteins that initiate transcription of the gene through the RNA polymerase and as transcription factors be designated. The most important prokaryotic transcription factors are the sigma factors. By far the most promoters at z. B. E. coli are known and know about the factor Sigma-70 the following promoter elements: 1) an AT-base pair-rich UP element above the -35 region (which is also directly with the α subunit the bacterial RNA polymerase), 2) the -35 region, with the consensus sequence: 5'-TTGACA-3 ', 3) the -10 region (Pribnow box), with the consensus sequence: 5'-TATAAT-3 '. Furthermore, strong promoters right before the start point of transcription, rich in AT base pairs. The consensus sequences give only approximate clues for the construction of a promoter. A specific sigma-70 dependent Promoter may differ from these sequences in several places. In In a preferred embodiment, the promoter is a inducible promoter. An example of an inducible Promotor is the artificially generated tac promoter used to Increase gene expression level in bacterial cells (e.g. B. E. coli) and thus for overexpression recombinant Proteins can be used. This synthetic promoter exists from the -35 region of the strong trp promoter from E. coli and the -10 region of the IPTG and lactose regulatable / inducible lac promoter. The inducible tac promoter is about 3 times stronger than the trp promoter and about 10 times stronger than the lac promoter.
Unter dem Begriff „Biosynthese” wird vorliegend die enzymatische Herstellung eines Polyketids verstanden, bevorzugt mittels einer oder mehrerer Polyketidsynthasen, bevorzugt einer trans-AT-Polyketidsynthase. Der Begriff „Biosynthesegen” umfasst damit jedes Gen, welches für ein Protein codiert, das Teil einer solchen Polyketidsynthase ist.Under the term "biosynthesis" is used herein understood enzymatic preparation of a polyketide, preferably by means of one or more polyketide synthases, preferably one trans-AT-polyketide synthase. The term "biosynthesis gene" includes so that any gene coding for a protein, the part such polyketide synthase.
Weiterhin umfasst der Begriff „Biosynthesegen” auch Fragmente eines Biosynthesegens, die für ein trunkiertes Protein einer Polyketidsynthase codieren, das die gleiche Funktion aufweist, wie das Volllängenprotein. Dem Fachmann ist hinlänglich bekannt, dass durch Trunkierung (d. h. Deletion einzelner Bereiche, bevorzugt der Enden) eines Proteins eine gesteigerte oder verringerte Enzymaktivität herbeigeführt werden kann. Unter gleicher Funktion wird hier die prinzipiell gleiche biochemische Funktion verstanden, unabhängig davon, ob diese mit einer erhöhten oder erniedrigten Effektivität oder Geschwindigkeit ausgeführt wird. Als Beispiel für ein Biosynthesegen sei ein Gen für eine KS-Domäne genannt, deren biochemische Funktion es ist, αβ-gesättigte Intermediate zu verlängern (siehe beispielsweise die KS der Klade V), oder ein Gen, dessen Genprodukt in einer PKS die biochemische Funktion ausübt, einen Methylrest zu transferieren (z. B. psyB). Jede trunkierte Version solcher Gene, die zu trunkierten Genprodukten führen, die noch dieselbe biochemische Funktion ausführen fallen somit ebenfalls unter den Begriff „Biosynthesegen”. Weitere Beispiele für Biosynthesegene und spezifische Ausführungsformen der Erfindung sind die in Tabelle 1 aufgelisteten Gene psyA–psyN.Farther The term "biosynthesis gene" also includes fragments a biosynthetic gene coding for a truncated protein encode a polyketide synthase that has the same function like the full-length protein. The skilled person is sufficient known that truncation (i.e., deletion of individual regions, preferably the ends) of a protein increased or decreased Enzyme activity can be brought about. Under same function here is the same principle biochemical Function understood, regardless of whether this with a increased or decreased efficiency or speed is performed. As an example of a biosynthesis gene be a gene for a KS domain called whose it is biochemical function, αβ-saturated Extend intermediates (see, for example, the KS clade V), or a gene whose gene product in a PKS biochemical Function to transfer a methyl radical (z. PsyB). Any truncated version of such genes that were too truncated Gene products that still perform the same biochemical function thus also fall under the term "biosynthesis gene". Further examples of biosynthetic genes and specific embodiments of the invention are the genes psyA-psyN listed in Table 1.
Unter dem Begriff „Metagenom” wird vorliegend eine Menge von zumindest zwei Genomen verschiedener Spezies verstanden. Ein Metagenom umfasst damit die gesamte genomische Information dieser zumindest zweier Spezies. In einer spezifischen Ausführungsform umfasst das Metagenom das Genom eines Schwamms und das von zumindest einem Prokaryoten. In einer weiteren Ausführungsform lebt der Prokaryot in Symbiose mit dem Schwamm.Under The term "metagenome" is used in the present context understood by at least two genomes of different species. One Metagenome thus includes the entire genomic information of this at least two species. In a specific embodiment The metagenome includes the genome of a sponge and that of at least a prokaryote. In another embodiment lives the prokaryote in symbiosis with the sponge.
Ein Primer wird im Sinne der vorliegenden Anmeldung dann als „spezifisch” für eine gegebene Aminosäuresequenz angesehen, wenn er – bevorzugt unter stringenten Bedingungen – mit dem sense- oder antisense-Strang einer Nukleinsäure hybridisiert oder zu diesem identisch ist, die für die gegebene Aminosäuresequenz oder einen Teil davon kodiert. Da der Aminosäurecode degeneriert ist, können für eine gegebene Aminosäuresequenz mehrere geeignete Primer verwendet werden. Dem Fachmann ist bekannt, welche Basentripletts für welche Aminosäurereste codieren. Der Primer sollte eine minimale Länge aufweisen, die es ihm ermöglicht, mit einer Nukleinsäure zu hybridisieren, die für zumindest 2, zumindest 3, oder zumindest 4 zusammenhängende Aminosäurereste der gegebenen Aminosäuresequenz kodiert. In einer spezifischen Ausführungsform hybridisiert der Primer mit einer Nukleinsäure, die für zumindest 5, 6, 7 oder mehr als 7 zusammenhängende Aminosäurereste der gegebenen Aminosäuresequenz kodiert.One For the purposes of the present application, primer is then termed "specific" for a given amino acid sequence, if he - preferred under stringent conditions - with the sense or antisense strand a nucleic acid hybridized or identical to this is that for the given amino acid sequence or encoded a part of it. Because the amino acid code degenerates can, for a given amino acid sequence several suitable primers are used. The person skilled in the art is aware which base triplets for which amino acid residues encode. The primer should have a minimum length, which allows it to interact with a nucleic acid to hybridize for at least 2, at least 3, or at least 4 contiguous amino acid residues of encoded amino acid sequence. In a specific embodiment the primer hybridizes with a nucleic acid suitable for at least 5, 6, 7 or more than 7 contiguous amino acid residues encoded the given amino acid sequence.
Ein
Primer wird im Sinne der Erfindung auch dann als spezifisch für
die definierten Aminosäuremotive angesehen, wenn er für
eine Aminosäuresequenz spezifisch ist, die zumindest 2,
zumindest 3, oder zumindest 4 zusammenhängende Aminosäurereste
eines der in
Polyketidsynthasen
lassen sich über ihre Struktur und Funktion in drei Klassen
einteilen. Typ I Enzyme sind multifunktionelle, häufig
modular aufgebaute Proteine. Bakterielle modulare Typ I PKS erzeugen
eine große Menge therapeutisch wichtiger Naturstoffe, wie
z. B. Erythromycin, Epothilone und FK506 (
Jedes dieser Enzyme umfasst wenigstens eine β-Ketosynthase (KS), eine Acyltransferase (AT) sowie ein Acyl-Carrier-Protein (ACP), die den nächsten Baustein zum Aufbau des Polyketids auswählen, aktivieren und unter Bildung eines β-Ketoacyl-S-ACP Intermediats, eine decarboxylative Claisen-Kondensation zwischen dem nächsten Baustein und der wachsenden Polyketidkette katalysieren. Während des Syntheseprozesses überträgt eine AT Domäne den korrespondierenden Acyl-CoA Baustein auf eine ACP Domäne und eine KS Domäne verlängert die Polyketidkette mit dieser Acyl-Einheit, wobei zusätzliche Domänen das resultierende β-oxo Intermediat weiter modifizieren können. Die Reihenfolge der Module in den PKS gibt hierbei die Reihenfolge der Biosyntheseschritte zwingend vor. Somit kann durch Variation der Domänen/Module eine hohe strukturelle Diversität in den entstehenden Polyketiden erzeugt werden.each these enzymes comprise at least one β-ketosynthase (KS), an acyltransferase (AT) and an acyl carrier protein (ACP), that select the next building block to build the polyketide, activate and form a β-ketoacyl-S-ACP intermediate, a decarboxylative Claisen condensation between the next Block and the growing polyketide chain catalyze. While of the synthesis process transfers an AT domain the corresponding acyl-CoA building block on an ACP domain and a KS domain prolongs the polyketide chain with this acyl moiety, with additional domains further modify the resulting β-oxo intermediate can. The order of the modules in the PKS is given here the order of biosynthesis steps mandatory. Thus, can by variation of the domains / modules a high structural Diversity can be generated in the resulting polyketides.
Eine
besondere und evolutionär abgegrenzte Enzymfamile der PKS
bilden die trans-AT-PKS, die freistehende AT verwenden, um die zur
Herstellung des Polyketids benötigten Bausteine in trans
zu selektieren (
Die vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden Entdeckung, dass die KS von trans-AT-PKS ein einzigartiges phylogenetisches Muster aufweisen, bei dem die nächstverwandten KS-Domänen für dieselben oder ähnliche Substrate spezifisch sind. Demgegenüber werden unterschiedliche Substrate, z. B. β-hydroxylierte und olefinische, von evolutionär klar unterscheidbaren, d. h. nicht engverwandten, KS prozessiert. Die phylogenetische Analyse eines oder mehrerer KS liefert somit nützliche Informationen über die Struktur der involvierten Intermediate.The present invention is based on the surprising discovery that the KS of trans-AT-PKS is a unique phylogenetic Pattern in which the closest related KS domains specific for the same or similar substrates are. In contrast, different substrates, eg. B. β-hydroxylated and olefinic, by evolutionary clearly distinguishable, d. H. not closely related, KS processed. The phylogenetic analysis of one or more KS thus provides useful information about the structure of the involved Intermediate.
Erfindungsgemäß wird der umgekehrte Weg eingeschlagen, bei dem aufgrund der chemischen Struktur des Polyketids Rückschlüsse auf die involvierten KS gezogen werden können. Es zeigte sich überraschender Weise, dass dieser Ansatz die Identifikation von konservierten Sequenzmustern/Motiven innerhalb dieser substratspezifischen KS Domänen ermöglicht. Aufgrund dieser konservierten Motive können dann erfindungsgemäß Primer generiert werden, die spezifisch sind für KS Domänen mit einer bestimmten, gewünschten Substratspezifität. Mithilfe dieser Primer ist dann die Amplifikation solcher KS Domänen möglich, die für ein bestimmtes Substrat spezifisch sind. Diese Amplikons können dann zur Identifizierung und Isolierung eines oder mehrerer Polyketid-Biosynthesegene, z. B. in Genclustern verwendet werden, z. B. durch PCR, Screening von Fosmid-Bibliotheken oder Genome Walking.According to the invention, the reverse path is taken, in which due to the chemical Struk Polyketide conclusions can be drawn on the KS involved. It has surprisingly been found that this approach allows the identification of conserved sequence patterns / motifs within these substrate-specific KS domains. Because of these conserved motifs, it is then possible in accordance with the invention to generate primers which are specific for KS domains having a specific, desired substrate specificity. These primers then allow the amplification of such KS domains that are specific to a particular substrate. These amplicons may then be used to identify and isolate one or more polyketide biosynthetic genes, e.g. B. be used in gene clusters, for. By PCR, screening of Fosmid libraries or genome walking.
Einer der Hauptvorteile der vorliegenden Erfindung liegt somit darin, dass ausgehend vom Polyketid gezielt eine in dessen Biosynthese involvierte KS Domäne einer trans-AT-PKS identifiziert werden kann, um in einem nächsten Schritt deren Nukleotidsequenz, sowie die Nukleotidsequenz des sie umfassenden Polyketid-Biosynthese-Genclusters zu identifizieren und zu isolieren. Der vorliegende Erfindung liegt demnach die überraschende Entdeckung zugrunde, dass ausgehend von der chemischen Struktur, d. h. den funktionellen Gruppen eines Polyketids, konservierte Motive innerhalb von KS Domänen identifiziert werden können, die in die Biosynthese dieses Polyketids involviert sind. Basierend auf diesen konservierten Motiven lassen sich dann Primer ableiten die zur Amplifikation und Isolierung der in die Biosynthese dieses Polyketids involvierten Gene genutzt werden können.one The main advantages of the present invention are therefore that that starting from the polyketide targeted one in its biosynthesis involved KS domain of a trans AT PKS identified in a next step their nucleotide sequence, and the nucleotide sequence of the polyketide biosynthetic gene cluster comprising it to identify and isolate. The present invention is Accordingly, based on the surprising discovery that starting from the chemical structure, d. H. the functional groups of a Polyketides, conserved motifs within KS domains can be identified in the biosynthesis of this Polyketides are involved. Based on these conserved motifs then can be derived primers for amplification and isolation used the genes involved in the biosynthesis of this polyketide can be.
Nukleinsäuren und Peptide der vorliegenden ErfindungNucleic acids and Peptides of the present invention
Ein
Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure,
die zumindest ein Gen umfasst, das für ein Polypeptid codiert
welches an der Biosynthese der Polyketide Psymberin (auch bekannt
als Irciniastatin A), oder Mycalamid beteiligt ist. In einer Ausführungsform
liegt die Nukleinsäure in isolierter Form vor. In einer
weiteren Ausführungsform ist die Nukleinsäure
das Komplement einer Nukleinsäure, die zumindest ein Gen
umfasst, das für ein Polypeptid codiert welches an der
Biosynthese der Polyketide Psymberin oder Mycalamid beteiligt ist.
In einer weiteren Ausführungsform ist das Gen ein prokaryotisches
Gen und/oder Teil eines polycistronischen Genabschnitts oder Gen-Clusters
das/der für zumindest ein Protein codiert, das an der Biosynthese eines
Polyketids beteiligt ist. In einer Ausführungsform gehört
das Gen zu den Typ I PKS; in einer bevorzugten Ausführungsform
gehört das Gen zu der evolutionär abgegrenzten
Enzymfamilie der trans-ATP PKS. Trans-AT PKS verwenden freistehende
Acetyltransferasen (AT), um die zur Herstellung des Polyketids benötigten
Bausteine in trans zu selektieren (
In einer bevorzugten Ausführungsform wurde die erfindungsgemäße Nukleinsäure aus dem Metagenom eines Schwamms amplifiziert. Eukaryotische Schwämme (Porifera) gehen mit diversen Prokaryoten Symbiosen ein, wobei diese Prokaryoten vielfach noch nicht isoliert kultiviert werden konnten. Das dadurch aus Schwamm und Prokaryoten entstehende Metagenom umfasst das Genom des eukaryotischen Schwamms sowie die prokaryotischen Genome der einzelnen Symbionten. In einer Ausführungsform gehört der Schwamm zu den Demospongiae, den Dictyoceratida oder den Irciniidae. In einer bevorzugten Ausführungsform gehört der Schwamm zu Psammocinia sp.; noch bevorzugter ist der Schwamm Psammocinia aff. bulbosa. In einer bevorzugten Ausführungsform gehört der Schwamm zu den Demospongiae. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen gehört der Schwamm zu der Familie der Spongiidae, der Thorectidae, der Halichondriidae, der Callyspongiidae, der Chalinidae, der Mycalidae, der Coelosphaeridae, der Tedaniidae, der Plakinidae, oder der Triaenosina. Im Sinne dieser Erfindung bevorzugte Vertreter dieser Familien sind Spongia spp., Cacospongia spp., C. mycofijiensis, Halichondria spp., Callyspongia spp., Haliclona spp., Mycale spp., M. hentscheli, Lyssodendoryx spp., Tedania spp., Plakortis spp., Theonella swinhoei, und Discodermia spp.In In a preferred embodiment, the inventive Nucleic acid amplified from the metagenome of a sponge. Eukaryotic sponges (Porifera) go with various prokaryotes Symbioses, these prokaryotes often not yet isolated could be cultivated. The resulting sponge and prokaryotes The resulting metagenome includes the genome of the eukaryotic sponge as well as the prokaryotic genomes of the individual symbionts. In a Embodiment, the sponge belongs to the Demospongiae, the Dictyoceratida or the Irciniidae. In a preferred embodiment the sponge belongs to Psammocinia sp .; even more preferred is the sponge Psammocinia aff. bulbosa. In a preferred embodiment the sponge belongs to the Demospongiae. In further preferred Embodiments include the sponge to the family Spongiidae, Thorectidae, Halichondriidae, Callyspongiidae, the Chalinidae, the Mycalidae, the Coelosphaeridae, the Tedaniidae, the Plakinidae, or the Triaenosina. For the purposes of this invention preferred representatives of these families are Spongia spp., Cacospongia spp., C. mycofijiensis, Halichondria spp., Callyspongia spp., Haliclona spp., Mycale spp., M. hentscheli, Lyssodendoryx spp., Tedania spp., Plakortis spp., Theonella swinhoei, and Discodermia spp.
Die Amplifikation der Nukleinsäure aus dem Metagenom kann mittels eines beliebigen, dem Fachmann bekannten, Verfahrens zur Nukleinsäureamplifikation durchgeführt werden. In einer Ausführungsform erfolgt die Amplifikation der erfindungsgemäßen Nukleinsäure mittels einer isothermen oder einer thermocyclischen Amplifikationsreaktion. Bevorzugt erfolgt die Amplifikation mittels Ligase-Kettenreaktion (LCR), und/oder Polymerase Ketttenreaktion (PCR); noch bevorzugter ist die PCR eine nested PCR.The Amplification of the nucleic acid from the metagenome can by means of any method of nucleic acid amplification known to those skilled in the art be performed. In one embodiment the amplification of the invention Nucleic acid by means of an isothermal or a thermocyclic Amplification reaction. The amplification preferably takes place by means of Ligase chain reaction (LCR), and / or polymerase chain reaction (PCR); more preferably, the PCR is a nested PCR.
In einer Ausführungsform umfasste die erfindungsgemäße Nukleinsäure zumindest eine Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO 1–19, 39, einem Homolog dieser Sequenzen und dem Komplement der Sequenzen oder des Homologs. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Nukleinsäure zumindest eine Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 (psyA, psyB, psyC, psyD, psyE, psyF, psyG, psyH, psyI, psyJ, psyK, psyL, psyM und psyN), einem Homolog dieser Sequenzen und/oder dem Komplement der Sequenzen oder des Homologs. In einer weiteren Ausführungsform weist das Homolog zumindest 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, bevorzugt 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,7%, 99,9% Sequenzidentität mit der verglichenen Nukleinsäure auf, und/oder hybridisiert unter Hochsalzbedingungen mit der Nukleinsäure.In one embodiment, the nucleic acid according to the invention comprises at least one sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO 1-19, 39, a homolog of these sequences and the complement of the sequences or the homolog. In a preferred embodiment, the nucleic acid according to the invention comprises at least one sequence which is selected from the group consisting of SEQ ID NO 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 (psyA, psyB, psyC, psyD, psyE, psyF, psyG, psyH, psyI, psyJ, psyK, psyL, psyM and psyN), a homolog of these sequences and / or the complement of the sequences or the homolog. In a further embodiment, the homolog has at least 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, preferably 97%, 98%, 99%. , 99.5%, 99.7%, 99.9% sequence identity with the nucleic acid being compared, and / or hybridizes with the nucleic acid under high salt conditions.
In einer weiteren Ausführungsform codiert die erfindungsgemäße Nukleinsäure für ein Protein, das zumindest eine Identität zu SEQ ID NO 23 von 41%, zu SEQ ID NO 24 von 52%, zu SEQ ID NO 25 von 42%, zu SEQ ID NO 28 von 44%, zu SEQ ID NO 29 von 94%, zu SEQ ID NO 30 von 96%, zu SEQ ID NO 31 von 96%, zu SEQ ID NO 32 von 94%, zu SEQ ID NO 33 von 98%, zu SEQ ID NO 34 von 95%, zu SEQ ID NO 35 von 97%, zu SEQ ID NO 36 von 98%, zu SEQ ID NO 37 von 96% oder zu SEQ ID NO 38 von 96% aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform codiert die erfindungsgemäße Nukleinsäure für ein Protein, das zumindest eine Identität zu SEQ ID NO 23 von 50%, zu SEQ ID NO 24 von 55%, zu SEQ ID NO 25 von 50% oder zu SEQ ID NO 28 von 50% aufweist.In Another embodiment encodes the invention Nucleic acid for a protein containing at least one Identity to SEQ ID NO 23 of 41%, to SEQ ID NO 24 of 52%, to SEQ ID NO 25 of 42%, to SEQ ID NO 28 of 44%, to SEQ ID NO 29 from 94%, to SEQ ID NO 30 from 96%, to SEQ ID NO 31 from 96%, too SEQ ID NO 32 of 94%, to SEQ ID NO 33 of 98%, to SEQ ID NO 34 of 95%, to SEQ ID NO 35 of 97%, to SEQ ID NO 36 of 98%, to SEQ ID NO 37 of 96% or to SEQ ID NO 38 of 96%. In a preferred Embodiment encodes the invention Nucleic acid for a protein containing at least one Identity to SEQ ID NO 23 of 50%, to SEQ ID NO 24 of 55% to SEQ ID NO 25 of 50% or to SEQ ID NO 28 of 50%.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Peptid, Polypeptid, Protein oder Enzym, für das eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren codiert.One Another aspect of the present invention is a peptide, polypeptide, Protein or enzyme for which one of the inventive Nucleic acids encoded.
In einer Ausführungsform weist das Peptid eine Aminosäuresequenz auf, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO 20–38.In In one embodiment, the peptide has an amino acid sequence which is selected from the group consisting of SEQ ID NO 20-38.
In einer weiteren Ausführungsform weist das Peptid zumindest eine Identität zu SEQ ID NO 20 von 36%, zu SEQ ID NO 21 von 54%, zu SEQ ID NO 22 von 44%, zu SEQ ID NO 23 von 41%, zu SEQ ID NO 24 von 52%, zu SEQ ID NO 25 von 42%, zu SEQ ID NO 28 von 44%, zu SEQ ID NO 29 von 94%, zu SEQ ID NO 30 von 96%, zu SEQ ID NO 31 von 96%, zu SEQ ID NO 32 von 94%, zu SEQ ID NO 33 von 98%, zu SEQ ID NO 34 von 95%, zu SEQ ID NO 35 von 97%, zu SEQ ID NO 36 von 98%, zu SEQ ID NO 37 von 96% oder zu SEQ ID NO 38 von 96% auf. In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Peptid zumindest eine Identität zu SEQ ID NO 23 von 50%, zu SEQ ID NO 24 von 55%, zu SEQ ID NO 25 von 50% oder zu SEQ ID NO 28 von 50% auf. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das Peptid eine Sequenzidentität von mindestens 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% oder 99,5% auf.In In another embodiment, the peptide is at least an identity to SEQ ID NO 20 of 36%, to SEQ ID NO 21 from 54%, to SEQ ID NO 22 of 44%, to SEQ ID NO 23 of 41%, to SEQ ID NO 24 from 52%, to SEQ ID NO 25 from 42%, to SEQ ID NO 28 from 44%, to SEQ ID NO 29 of 94%, to SEQ ID NO 30 of 96%, to SEQ ID NO 31 from 96%, to SEQ ID NO 32 from 94%, to SEQ ID NO 33 from 98%, to SEQ ID NO 34 of 95%, to SEQ ID NO 35 of 97%, to SEQ ID NO 36 of 98%, to SEQ ID NO 37 of 96% or to SEQ ID NO 38 of 96%. In a preferred embodiment, the peptide at least an identity to SEQ ID NO 23 of 50%, to SEQ ID NO 24 of 55%, to SEQ ID NO 25 of 50%, or to SEQ ID NO 28 of 50%. In a further preferred embodiment, the Peptide has a sequence identity of at least 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% or 99.5%.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Vektor, der die erfindungsgemäße Nukleinsäure umfasst. Bevorzugt ist dieser Vektor ein Cosmid, ein YAC, BAC oder ein Virus, noch bevorzugter ist der Vektor ein Plasmid. In einer Ausführungsform umfasst der Vektor weiterhin einen Promotor unter dessen Kontrolle die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure steht. Bevorzugt ist dieser Promotor ein induzierbarer Promotor. In einer weiteren Ausführungsform steht die erfindungsgemäße Nukleinsäure unter der Kontrolle eines induzierbaren Expressionssystems. In einer spezifischen Ausführungsform ist das induzierbare Expressionssystem das Tetracyclin Operator/Repressor (TetO2/TetR) System.In In another embodiment, the invention relates to a Vector containing the nucleic acid according to the invention includes. Preferably, this vector is a cosmid, a YAC, BAC or a virus, more preferably the vector is a plasmid. In a Embodiment, the vector further comprises a promoter under whose control the expression of the invention Nucleic acid is. Preferably, this promoter is an inducible Promoter. In a further embodiment, the inventive Nucleic acid under the control of an inducible expression system. In a specific embodiment, the inducible expression system is the tetracycline operator / repressor (TetO2 / TetR) system.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine rekombinante Wirtszelle, die eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder Vektoren umfasst. Damit stellt die vorliegende Erfindung auch ein Expressions-/und Produktionssystem für Polyketide bereit. Vorzugsweise ist diese rekombinante Wirtszelle nach der Transformation/Transfektion in der Lage Polyketide zu synthetisieren. In einer Ausführungsform ist die die rekombinante Wirtszelle eine E. coli Zelle, in weiteren Ausführungsformen ist die rekombinante Wirtszelle eine Wirtszelle aus Pseudomonas spp., Bacillus spp., Streptomyces spp. oder Acinetobacter baylyi.In In another embodiment, the invention relates to a recombinant host cell, which is one of the inventive Nucleic acids or vectors. Thus represents the present Invention also an expression / and production system for Polyketides ready. Preferably, this recombinant host cell after transformation / transfection able to synthesize polyketides. In one embodiment, this is the recombinant host cell an E. coli cell, in other embodiments is the recombinant host cell, a host cell from Pseudomonas spp., Bacillus spp., Streptomyces spp. or Acinetobacter baylyi.
Erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Polyketideninvention Process for the preparation of polyketides
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Vektoren oder rekombinanten Wirtszellen in einem Verfahren zur Herstellung eines Polyketids. Hierbei wird ein Expressionssystem verwendet, welches die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren erlaubt.One Another aspect of the invention relates to the use of the invention Nucleic acids, vectors or recombinant host cells in a process for producing a polyketide. This is used an expression system which expresses the expression of the invention Nucleic acids allowed.
In einer Ausführungsform ist das Expressionssystem eine rekombinante Wirtszelle, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder Vektoren umfasst und zur Expression der Genprodukte der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in der Lage ist. Die exprimierten Genprodukte können dann zur Synthese des Polyketids in vivo oder in vitro genutzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das hergestellte Polyketid Psymberin oder Mycalamid. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren oder das Expressionsystem die Verwendung von zumindest einer Nukleinsäure umfassend eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe Bestehend aus SEQ ID NO 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 (psy A, psyB, psyC, psyD, psyE, psyF, psyG, psyH, Asyl, psyJ, psyK, psyL, psyM und psyN) oder einem Homolog dieser Sequenzen.In In one embodiment, the expression system is a recombinant Host cell containing the nucleic acids according to the invention or vectors and for expression of the gene products of the nucleic acids according to the invention be able to. The expressed gene products can then be used for the synthesis of the polyketide in vivo or in vitro. In a preferred embodiment, the produced Polyketide Psymberin or Mycalamide. In a further preferred Embodiment includes the method or the expression system comprising the use of at least one nucleic acid a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 (psy A, psyB, psyC, psyD, psyE, psyF, psyG, psyH, asylum, psyJ, psyK, psyL, psyM and psyN) or a homolog of these sequences.
In einer spezifischen Ausführungsform findet die Kultivierung einer erfindungsgemäßen rekombinanten Wirtszelle unter Bedingungen statt, die die Expression der Biosynthesegene und Produktion des Polyketids durch die Wirtszelle erlauben. Solche Bedingungen sind dem Fachmann hinlänglich bekannt oder lassen sich im Wege simpler Routineexperimente für ein gegebenes Polyketid erhalten. In einer spezifischen Ausführungsform ist die rekombinante Wirtszelle eine Wirtszelle aus Pseudomonas spp., Bacillus spp., Streptomyces spp., Coryne bacterium spp., Acinetobacter baylyi, Pseudomonas stutzeri, Bacillus subtilis oder Bacillus amyloliquefaciens. Falls das zumindest eine erfindungsgemäße Gen, welches sich in der Wirtszelle befindet unter der Kontrolle eines induzierbare Expressionssystem (z. B. des Tetracyclin Operator/Repressor (TetO2/TetR) Systems) steht, kann durch Zugabe der jeweiligen induzierenden Substanz die Expression des Genprodukts gezielt induziert werden.In a specific embodiment finds the cultivation a recombinant host cell according to the invention under conditions that control the expression of the biosynthetic genes and allow production of the polyketide by the host cell. Such Conditions are well known to those skilled in the art or can be integrated in the course of simple routine experiments given polyketide. In a specific embodiment the recombinant host cell is a Pseudomonas host cell spp., Bacillus spp., Streptomyces spp., Coryne bacterium spp., Acinetobacter baylyi, Pseudomonas stutzeri, Bacillus subtilis or Bacillus amyloliquefaciens. If that is at least one gene of the invention, which is in the host cell under the control of a inducible expression system (eg of the tetracycline operator / repressor (TetO2 / TetR) Systems) can be induced by adding the respective inducing Substance expression of the gene product can be specifically induced.
Zur Herstellung des Polyketids werden die Gene des Genclusters in die Genome der Expressionswirte integriert. Die Integration erfolgt dabei sukzessive durch homologe Rekombination kürzerer (in etwa bis 40 kb) Abschnitte des Genclusters. Um die Gene effizient zu transferieren, können bevorzugt transformierbare Bakterien wie Pseudomonas stutzeri, Acinetobacter baylyi, Bacillus subtilis oder Bacillus amyloliquefaciens verwendet werden, die linearisierte DNA aufnehmen können. Im Bedarfsfall werden die natürlichen Promotoren des Genclusters gegen wirtseigene Promotoren ersetzt (z. B. den baeB-Promotor bei B. amyloliquefaciens). Alternativ zur Integration in das Genom können Gene auf einem oder verteilt auf mehreren kompatiblen Plasmiden durch Konjugation, Protoplastentransformation oder Elektroporation in die Expressionswirte transferiert werden. Die Expression erfolgt dann von frei replizierenden Plasmiden oder wiederum nach Integration in das Genom.to Production of the polyketide are the genes of the gene cluster in the Integrated genomes of expression hosts. The integration takes place successively by homologous recombination shorter (approximately up to 40 kb) sections of the gene cluster. To keep the genes efficient can preferably transform transformable bacteria such as Pseudomonas stutzeri, Acinetobacter baylyi, Bacillus subtilis or Bacillus amyloliquefaciens which are linearized DNA can record. If necessary, the natural Replaced promoters of the gene cluster against host promoters (eg the baeB promoter in B. amyloliquefaciens). Alternative to Integration into the genome can spread or distribute genes on several compatible plasmids by conjugation, protoplast transformation or electroporation into the expression hosts. Expression is then carried out by freely replicating plasmids or again after integration into the genome.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin den Schritt der Isolierung des produzierten Polyketids. In einer Ausführungsform erfolgt diese Isolierung mittels HPLC und/oder präparativer Säulenchromatographie.In In another embodiment, the method further comprises the step of isolating the produced polyketide. In a Embodiment, this isolation is carried out by means of HPLC and / or preparative column chromatography.
Erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung von Polyketid-Biosynthesegeneninvention Process for the isolation of polyketide biosynthesis genes
Die Isolierung des zumindest einen Polyketid-Biosynthesegens unter Verwendung des zumindest einen Primerpaars umfasst in einer Ausführungsform die Amplifikation der vom jeweiligen Primerpaar eingeschlossenen Nukleinsäureregion mittels des Primerpaars. Somit wird eine Nukleinsäureregion der Kethosynthasedomäne amplifiziert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird diese Amplifikation mittels PCR durchgeführt, noch bevorzugter mittels einer nested PCR.The Isolation of the at least one polyketide biosynthetic gene using of the at least one primer pair comprises in one embodiment the amplification of the trapped by the respective primer pair Nucleic acid region by means of the primer pair. Thus, will a nucleic acid region of the kethosynthase domain amplified. In a preferred embodiment this amplification is performed by PCR, more preferably by means of a nested PCR.
In einem weiteren Aspekt ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Isolierung von zumindest einem Polyketid-Biosynthesegen gerichtet und umfasst die Schritte des Bereitstellens von zumindest einem Primerpaar, das aufgrund der Substratspezifität einer Kethosynthasedomäne einer trans-AT Polyketidsynthase erstellt worden ist, und die Isolierung von zumindest einem Polyketid-Biosynthesegen unter Verwendung dieses zumindest einen Primerpaars.In In another aspect, the present invention is a method for isolating at least one polyketide biosynthesis gene and comprises the steps of providing at least one primer pair, due to the substrate specificity of a kethosynthase domain a trans-AT polyketide synthase has been created, and isolation at least one polyketide biosynthesis gene using this at least one primer pair.
Die erfindungsgemäße Bereitstellung, d. h. das „Design” der Primer basiert auf der überraschenden Entdeckung, dass die KS von trans-AT PKS ein einzigartiges phylogenetisches Muster aufweisen, bei dem die nächstverwandten KS Domänen für dieselben oder ähnliche Substrate spezifisch sind. Somit kann, ausgehend von den funktionellen Gruppen eines Polyketids, ein konserviertes Motiv innerhalb von KS Domänen identifiziert werden, auf dessen Basis Primer hergestellt werden können, die für ein solches konserviertes Motiv – und damit für eine KS Domäne, die in die Biosynthese des Polyketids involviert ist – spezifisch sind. Die Amplifikation und Isolierung der KS Domäne und damit der die KS Domäne umfassenden PKS sowie weiteren in die Biosynthese des Polyketids involvierten Genen, die häufig in einem Gencluster vorliegen, wird somit erfindungsgemäß ermöglicht.The inventive provision, d. H. the "design" of Primer is based on the surprising discovery that the KS of trans-AT PKS a unique phylogenetic pattern exhibit, in which the closest related KS domains specific for the same or similar substrates are. Thus, starting from the functional groups of a Polyketide, a conserved motif within KS domains be identified on the basis of which primers are produced can, for such a conserved motive - and thus for a KS domain involved in the biosynthesis of Polyketide is involved - are specific. The amplification and isolation of the KS domain and thus of the KS domain comprehensive PKS and others in the biosynthesis of the polyketide involved genes that are often present in a gene cluster, is thus made possible according to the invention.
Ob eine gegebene KS oder KS Domäne zu einer zweiten KS oder KS Domäne ähnlich oder phylogenetisch benachbart ist, kann zum Beispiel durch Sequenzvergleiche bestimmt werden, bei denen zueinander ähnlichere Sequenzen phylogenetisch enger benachbarten KS oder KS Domänen entsprechen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird hierfür eine phylogenetische Analyse eingesetzt. In einer spezifischen Ausführungsform wird für die phylogenetische Analyse ein Kladogramm erstellt. In einer weiteren spezifischen Ausführungsform wird das Kladogramm mit der Bayesischen Methode und wie in Beispiel 3 beschrieben erstellt.If a given KS or KS domain to a second KS or KS domain similar or phylogenetically adjacent can, for example, be determined by sequence comparisons, in which mutually similar sequences phylogenetic closely adjacent KS or KS domains. In a preferred embodiment of this is a used phylogenetic analysis. In a specific embodiment a cladogram is created for the phylogenetic analysis. In a further specific embodiment, the Kladogram with the Bayesian method and as described in Example 3 created.
In einer weiteren Ausführungsform wird nach der phylogenetischen Analyse für die KS die Domänenarchitektur des N-terminal benachbarten Moduls analysiert und aus der Polyketidstruktur das Substrat der KS-Domäne abgeleitet. Unter der Domänenarchitektur versteht man hierbei die Abfolge von Domänen in einem Modul, wie z. B. KS DH KR ACP.In a further embodiment, according to the phylogenetic analysis for the KS, the domain architecture of the N-terminal adjacent module is analyzed and from the polyketide structure the substrate of the Derived KS domain. Domain architecture refers to the sequence of domains in a module, such as a domain. B. KS DH KR ACP.
In
einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße
Verfahren auf die gerichtete Isolation zumindest eines in die Polyketid-Biosynthese
involvierten Gens ausgerichtet, d. h. es wird/werden ausgehend von
den funktionellen Gruppen eines Polyketids das/die zur Herstellung
dieses Polyketids nötige(n) Gen(e) isoliert. In einer beispielhaften,
jedoch bevorzugten Ausführungsform ist das Polyketid-Biosynthesegen
in die Biosynthese von Psymberin involviert. Psymberin (
Die unter Verwendung dieser Primer erzeugten Amplifikate können dann zur Isolierung der Nukleinsäuresequenz für die KS Domäne, der Nukleinsäuresequenz für die die KS Domäne umfassende PKS, sowie der Nukleinsäuresequenz des gesamten zur Polyketidsynthese nötigen Genclusters verwendet werden. Verfahren zur Isolierung solcher Nukleinsäuresequenzen sind dem Fachmann wohlbekannt und schließen beispielsweise Genome-Walking oder das Screening von Cosmid- oder Fosmid-Bibliotheken ein. Die isolierten Nukleinsäuren können dann mittels Sequenzierung bestimmt/identifiziert werden.The amplicons generated using these primers can then to isolate the nucleic acid sequence for the KS domain, the nucleic acid sequence for the KS domain comprehensive PKS, as well as the nucleic acid sequence of the entire gene cluster required for polyketide synthesis be used. Method for isolating such nucleic acid sequences are well known to those skilled in the art and include, for example Genome walking or the screening of cosmid or fosmid libraries one. The isolated nucleic acids can then be determined / identified by means of sequencing.
In
einer spezifischen Ausführungsform ist zumindest ein Primer
spezifisch für 2, 3, 4, 5, 6, oder mehr als 6 zusammenhängende
Aminosäurereste eines der in
In
einer weiteren spezifischen Ausführungsform sind beide
Primer des Primerpaars spezifisch für zumindest 2, 3, 4,
5, 6 oder mehr als 6 zusammenhängende Aminosäurereste
der in
In einer anderen spezifischen Ausführungsform hat das verwendete Primerpaar die Nukleotidsequenz: 5'-GCN HTN GAR GAY GCN GGN TAY GC-3' (EDAGY; SEQ ID NO: 72) und 5'-C NAR CAT NCC NGC YTK RTA RTA-3' (YYQAGMLA; SEQ ID NO: 73).In Another specific embodiment has the one used Primer pair the nucleotide sequence: 5'-GCN HTN GAR GAY GCN GGN TAY GC-3 '(EDAGY; SEQ ID NO: 72) and 5'-C NAR CAT NCC NGC YTK RTA RTA-3' (YYQAGMLA; SEQ ID NO: 73).
In einer weiteren Ausführungsform wird für die Amplifikation der vom zumindest einen Primerpaar eingeschlossenen Nukleinsäureregion der KS Domäne neben dem zumindest einen, erfindungsgemäßen Primerpaar ein zweites Primerpaar verwendet, wobei das erste und das zweite Primerpaar verschachtelt sind, d. h. das eine Primerpaar vollständig innerhalb des vom anderen Primerpaar zu amplifizierenden Nukleinsäurebereichs liegt. Das zweite Primerpaar ist in einer bevorzugten Ausführungsform ein erfindungsgemäß hergestelltes Primerpaar und basiert damit ebenfalls auf der Substratspezifität einer Kethosynthasedomäne einer trans-AT Polyketidsynthase. In einer anderen Ausführungsform ist das zweite Primerpaar ein degeneriertes Primerpaar. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist dieses Primerpaar spezifisch für die Aminosäuresequenz KSDPQQF (forward) bzw. KSHGTGR (reverse). In einer noch bevorzugteren Ausführungsform hat das zweite Primerpaar die Nukleotidsequenz 5'-MGN GAR GCN NWN SMN ATG GAY CCN CAR CAN MG-3' bzw. 5'-GGR TCN CCN ARN SWN GTN CCN GTN CCR TG-3'.In Another embodiment is for the amplification the nucleic acid region enclosed by the at least one primer pair the KS domain in addition to the at least one invention Primer pair used a second primer pair, wherein the first and the second primer pair are nested, d. H. the one primer pair completely within that to be amplified by the other primer pair Nucleic acid range is located. The second primer pair is in a preferred embodiment of a manufactured according to the invention Primer pair and thus also based on the substrate specificity a kethosynthase domain of a trans-AT polyketide synthase. In another embodiment, the second primer pair a degenerate primer pair. In a particularly preferred embodiment this primer pair is specific for the amino acid sequence KSDPQQF (forward) or KSHGTGR (reverse). In an even more preferred Embodiment, the second primer pair has the nucleotide sequence 5'-MGN GAR GCN NWN SMN ATG GAY CCN CAR CAN MG-3 'and 5'-GGR TCN, respectively CCN ARN SWN GTN CCN GTN CCR TG-3 '.
In spezifischen Ausführungsformen wird die Amplifikation mit den zwei Primerpaaren gleichzeitig oder zweistufig durchgeführt.In specific embodiments, the amplification with the two primer pairs carried out simultaneously or in two stages.
Bei der zweistufigen Amplifikation wird in der ersten Amplifikationsrunde das außenliegende Primerpaar verwendet. Danach werden in einer zweiten Amplifikationsrunde die Amplifikate aus der ersten Amplifikationsrunde mit den innenliegenden, verschachtelten Primern amplifiziert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die mit den zumindest zwei Primerpaaren durchzuführende Amplifikation eine nested PCR.In the two-stage amplification in the first round of amplification is the outer primer few used. Thereafter, in a second round of amplification, the amplificates from the first round of amplification are amplified with the internal, nested primers. In a further preferred embodiment, the amplification to be carried out with the at least two primer pairs is a nested PCR.
In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die Isolation des zumindest einen Polyketid-Biosynthesegens aus einem Metagenom. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Metagenom das Genom zumindest eines Eukaryoten und zumindest eines Prokaryoten. Bevorzugt befinden sich Eukaryot und Prokaryot in einer Symbiose. In einer weiteren Ausführungsform ist der Eukaryot ein Schwamm, bevorzugt gehört dieser Schwamm zu den Demospongiae, den Dictyoceratida oder den Irciniidae. In einer bevorzugten Ausführungsform gehört der Schwamm zu Psammicinia sp.; noch bevorzugter ist der Schwamm Psammocinia aff. bulbosa.In In another embodiment, the isolation of the at least one polyketide biosynthetic gene from a metagenome. In a preferred embodiment comprises the metagenome the genome of at least one eukaryote and at least one prokaryote. Preferably, eukaryotic and prokaryotic are in symbiosis. In another embodiment, the eukaryote is a Sponge, preferably this sponge belongs to the Demospongiae, the Dictyoceratida or the Irciniidae. In a preferred embodiment the sponge belongs to Psammicinia sp .; even more preferred is the sponge Psammocinia aff. bulbosa.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das zu isolierende Polyketid-Biosynthesegen in die Biosynthese von Psymberin, den Mycalamiden, den Onnamiden, den Theopederinen, den Icadamiden, Pederin, den Laulimaliden (Fijianoliden), den Latrunculinen, Mycothiazol, Pateamin A, den Spongistatinen (Altohyrtinen), Discodermolid, Dictyostatin, Tedanolid und/oder Calyculin involviert, d. h. Teil einer Polyketidsynthase, die eines dieser Polyketide synthetisiert.In In another preferred embodiment, this is to be isolated Polyketide Biosynthesis Gene in the Biosynthesis of Psymberin, the Mycalamides, Onnamids, Theopederines, Cadadamids, Pederin, Laulimalides (Fijianoliden), the Latrunculinen, Mycothiazol, Pateamin A, the Spongistatins (altohyrtins), discodermolide, dictyostatin, tedanolide and / or calyculin, d. H. Part of a polyketide synthase, which synthesizes one of these polyketides.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren weiterhin den Schritt der Isolierung des gesamten für die Polyketidsynthese benötigten Genbereichs basierend auf den Sequenzinformationen des isolierten zumindest einen Polyketid-Biosynthesegens. In einer spezifischen Ausführungsform erfolgt diese Isolierung des gesamten Genbereichs unter Verwendung einer Library. In weiteren spezifischen Ausführungsformen ist die Library eine Cosmid-, YAC-, BAC- oder Fosmid-Library. In einer weiteren spezi fischen Ausführungsform wurde die Library aus einem Metagenom erzeugt. In weiteren spezifischen Ausführungsformen der Erfindung ist das Metagenom das Metagenom eines Schwammes.In In another embodiment, the invention comprises Procedure continues the step of isolating the whole for the polyketide synthesis required gene region based on the sequence information of the isolated at least one polyketide biosynthetic gene. In a specific embodiment, this isolation takes place of the entire gene region using a library. In further specific embodiments, the library is a cosmid, YAC, BAC or Fosmid library. In another specific embodiment the library was created from a metagenome. In more specific Embodiments of the invention is the metagenome the metagenome a sponge.
BEISPIELEEXAMPLES
Beispiel 1example 1
Die Aminosäuresequenzen von 138 bekannten trans-AT-PKS-Modulen wurden aus der GenBank Datenbank entnommen und unter manueller Kontrolle mittels ClustalX geordnet und ausgerichtet („Alignment”). Hierbei wurden Deletionen und nicht ausrichtbare Sequenzbereiche ausgeschlossen.The Amino acid sequences of 138 known trans-AT PKS modules were taken from the GenBank database and under manual control ordered and aligned by means of ClustalX ("Alignment"). in this connection Deletions and non-alignable sequence regions were excluded.
Hiernach wurde eine phylogenetische Analyse der Volllängen-KS-Domänen der bearbeiteten Aminosäuresequenzen mittels der MrBayes Software (v3) unter Verwendung des „WAG replacement models” und einer Gammaverteilung mit vier Kategorien durchgeführt. Die Markovketten-Monte Carlo Analyse lief für 2,5 Millionen Zyklen, wobei alle 100 Generationen ein Sample entnommen wurde. Die Konvergenz wurde mittels Plots der Maximum-Likelihood-Werte und einer Standardabweichung von < 0,05 bewertet. Der Consensus-Baum und die späteren Kladenwahrscheinlichkeiten wurden nach Verwerfen derjenigen Bäume berechnet, die vor dem Erreichen der Konvergenz als Sample entnommen worden waren.hereafter was a phylogenetic analysis of full-length KS domains of the processed amino acid sequences by Mr Bayes Software (v3) using the "WAG replacement model" and a Gamma distribution performed with four categories. The Markov chains-Monte Carlo's analysis ran for 2.5 million cycles, with all 100 generations a sample was taken. The convergence was Plots of the maximum likelihood values and a standard deviation of <0.05. The consensus tree and the later cladding probabilities were calculated after discarding those trees before had been taken as a sample of convergence.
Die auf dem Neighborhood-Joining-Verfahren beruhende phylogenetische Analyse wurde mittels der Programme Seqboot, Protdist, Neighbor und Consens der PHYLIP-Software durchgeführt. Die Bootstrap-Analyse wurde mit 1000 Pseudoreplikatsequenzen durchgeführt. Für die Maximum-Parsimony-Analyse wurde die heuristische Suchoption der Software PAUP*4.0b10 verwendet.The phylogenetic based on the Neighborhood Joining method Analysis was carried out by means of the programs Seqboot, Protdist, Neighbor and consens of the PHYLIP software. The bootstrap analysis was performed with 1000 pseudoreplicase sequences. For the maximum parsimony analysis became the heuristic search option the software PAUP * 4.0b10 used.
Das
in
Alle in diesem Kladogramm gegebenen Kladen wurden weiterhin eingehend getrennt analysiert, um Sequenzmuster aufzuspüren, welche die Bereitstellung von für diese Motive spezifische Primer erlauben.All Clades given in this cladogram have been further detailed analyzed separately to detect sequence patterns which the provision of primers specific to these motifs allow.
Weiterhin wurde ein Tyrosinrest in einem EDAGY-Motiv identifiziert, der in 84% aller trans-AT-KS konserviert ist, jedoch in den ubiquitären sup KS nicht auftritt.Farther a tyrosine residue was identified in an EDAGY motif that was expressed in 84% of all trans-AT-KS is conserved, but in the ubiquitous sup KS does not occur.
Beispiel 2: Isolierung der Metagenom-DNA und Bereitstellung einer LibraryExample 2: Isolation of Metagenomic DNA and providing a library
Isolierunginsulation
Proben der Schwämme P. aff. bulbos und M. hentscheli wurden gesammelt und bei –80°C eingefroren. Das Metagenom aus P. aff. bulbos wurde zur Isolierung des Psymberin-PKS-Genclusters verwendet, während das Metagenom aus M. hentscheli die Quelle für die Mycalamid-Biosynthese-Gencluster bereitstellte.rehearse sponges P. aff. bulbos and M. hentscheli were collected and frozen at -80 ° C. The metagenome of P. aff. bulbos was used to isolate the psymberin PKS gene cluster, while the M. hentscheli metagenome is the source of provided the myclamide biosynthetic gene clusters.
Die
Gesamt-DNA aus den Proben wurde mittels eines dem Fachmann bekannten
Verfahrens isoliert, um den hohen Gehalt an Polysacchariden zu entfernen
(
Die isolierte DNA wurde danach zweimal mit 10 ml Phenol/CHCl3/Isoamylalkohol (25:24:1; v:v:v) und einmal mit 10 ml CHCl3 extrahiert. Jeder Extraktion folgte ein Zentrifugationsschritt bei 11.000 rpm für 5 min.The isolated DNA was then extracted twice with 10 ml phenol / CHCl 3 / isoamyl alcohol (25: 24: 1, v: v: v) and once with 10 ml CHCl 3 . Each extraction was followed by a centrifugation step at 11,000 rpm for 5 min.
Um Polysaccharide zu entfernen, wurde die obere wässrige Phase, die die DNA enthielt, mit einer 10%igen (w/v) wässrigen Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) Lösung mit einer Endkonzentration von 0,5% behandelt. Die Mischung wurde für 15 min bei 60°C inkubiert und das Präzipitat wurde mittels Zentrifugation bei 11.000 rpm für 15 min entfernt.Around To remove polysaccharides, the upper aqueous phase, containing the DNA, with a 10% (w / v) aqueous Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) solution with a final concentration treated by 0.5%. The mixture was at 60 ° C for 15 min incubated and the precipitate was centrifuged at 11,000 rpm for 15 min.
Die Nukleinsäuren wurden mit 2 Volumina vorgekühlten Ethanols (98%) und 1/10 Volumen einer 3 M Natriumacetatlösung (pH 7) gefällt. Das nach einem 30 minütigem Zentrifugationsschritt bei 11.000 rpm bei 4°C erhaltene Präzipitat wurde zweimal mit kaltem 70%igen Ethanol gewaschen. Die krude DNA (ca. 5 μg) wurde für 10–15 min an der Luft getrocknet und in Tris-Puffer (10 mM, pH 8,5) resuspendiert.The Nucleic acids were pre-cooled with 2 volumes Ethanols (98%) and 1/10 volume of a 3 M sodium acetate solution (pH 7) like. This after a 30 minute centrifugation step at 11,000 rpm at 4 ° C resulting precipitate was washed twice with cold 70% ethanol. The crude DNA (approx. 5 μg) was left in the air for 10-15 min and resuspended in Tris buffer (10 mM, pH 8.5).
LibraryLibrary
Zur Herstellung der Library wurde das CopyControl Fosmid Library Production Kit (Epicentre Biotechnologies) verwandt, wobei das Protokoll des Herstellers modifiziert wurde. Die DNA wurde in einem 1% (w/v) low-melting point Agarosegel aufgetrennt und Fragmente mit einer Größe von ca. 35 kb wurden mittels Gelverdaus mit GELase isoliert. Hierbei wurde 1 U der GELase Enzymlösung zu jeweils 300 μl geschmolzener Agarose hinzugegeben, gefolgt von einer Inkubation von 2 h bei 45°C. Nach Inaktivierung des Enzyms (70°C, 10 min) und Entfernung von unverdauter Agarose durch Zentrifugation für 20 min bei 11.000 rpm wurde die DNA bei Raumtemperatur mit 2,5 Volumina von 98%igem Ethanol und 1/10 Volumen von 3 M Natriumacetat (pH 5,2) gefällt. Nach einem Zentrifugationsschritt für 30 min bei 11.000 rpm und zwei Waschschritten mit 70%igem Ethanol bei 4°C wurde die pelletierte DNA in 50 μl Tris-Puffer (10 mM, pH 8,5) aufgenommen. Diese metagenomische DNA wurde mit Isopropanol und 3 M Nariumacetat (pH 5,2) gefällt.to Production of the library was the CopyControl Fosmid Library Production Kit (Epicenter Biotechnologies), the protocol of the Manufacturer was modified. The DNA was low-melting in a 1% (w / v) Pointed agarose gel and fragments of one size of about 35 kb were isolated by gel digestion with GELase. in this connection 1 U of the GELase enzyme solution was added to 300 μl each time molten agarose, followed by incubation from 2 h at 45 ° C. After inactivation of the enzyme (70 ° C, 10 min) and removal of undigested agarose by centrifugation for 20 min at 11,000 rpm, the DNA was at room temperature with 2.5 volumes of 98% ethanol and 1/10 volume of 3M sodium acetate (pH 5.2). After a centrifugation step for 30 min at 11,000 rpm and two washes with 70% ethanol at 4 ° C, the pelleted DNA was in 50 μl Tris buffer (10 mM, pH 8.5). This metagenomic DNA was used with Isopropanol and 3 M Nariumacetat (pH 5.2) like.
Ungefähr 250 ng von blunt-ended DNA (mit Tris-Puffer eluiert; 10 mM, pH 8.5) wurden in einem Ligationsschrit mit dem pCC1FOS Vektor über Nacht und bei 16°C nach Herstellerangaben verwendet, wobei jedoch keine T4 DNA Ligase eingesetzt wurde. Die DNA wurde dann in den Lamdaphagen gepackt und zur Transfektion den EPI300-T1R E. coli Zellen gemäß den Angaben des Herstellers verwendet.Approximately 250 ng of blunt-ended DNA (eluted with Tris buffer, 10 mM, pH 8.5) was used in a ligation step with the pCC1FOS vector overnight at 16 ° C according to the manufacturer's instructions, but using no T4 DNA ligase. The DNA was then packed into the Lamdaphagen and used to transfect the EPI300-T1 R E. coli cells according to the manufacturer's used.
Für die Herstellung von Libraries von großer Größe wurden alle Schritte von der DNA-Präparation bis zum Ausplattieren der Library an einem Tag (und ohne Einfrieren der Proben) durchgeführt.For the production of libraries of large size All steps were taken from DNA preparation to plating the library in one day (and without freezing the samples) performed.
Beispiel 3: Isolierung eines Psymberin KS GenfragmentsExample 3: Isolation of an psymberin KS gene fragments
In
einem ersten Schritt wurde zunächst die Komplexität
der DNA-Probe mittels einer ersten PCR-Amplifikation erniedrigt.
Hierbei wurden degenerierte Primer eingesetzt, die bereits zuvor
für die Isolierung der Gene von Pederin und Omnamid genutzt
wurden (
Diese verwendeten Primer waren für die Aminosäuremotive KSDPQQF bzw. KSHGTGR spezifisch. Der forward-Primer hatte die Sequenz 5'-MGNGARGCNNWNSMNATG GAYCCNCARCANMG-3'; der reverse-Primer hatte die Sequenz 5'-GGRTCNCCNA RNSWNGTNCCNGTNCCRTG-3'.These primers used were for the amino acid motifs KSDPQQF or KSHGTGR specific. The forward primer had the sequence 5'-MGNGARGCNNWNSMNATG GAYCCNCARCANMG-3 '; had the reverse primer the sequence 5'-GGRTCNCCNA RNSWNGTNCCNGTNCCRTG-3 '.
Die PCR fand unter folgenden Bedingungen statt: 96°C für 45 s, 55°C für 45 s, 72°C für 1 min (40 x), dann 72°C für 10 min. Verwendet wurde Taq Polymerase (NEB).The PCR took place under the following conditions: 96 ° C for 45 s, 55 ° C for 45 s, 72 ° C for 1 min (40x), then 72 ° C for 10 min. used became Taq Polymerase (NEB).
Das Amplifikat wurde mittels Agarosegel aufgetrennt und die bei 700 bp laufende DNA mittels Gelverdau wie oben beschrieben aufgereinigt. 1 μl dieses aufgereinigten PCR Amplifikats wurde als Template für eine zweite PCR-Runde verwendet.The Amplificate was separated by agarose gel and at 700 bp running DNA gel digestion as described above. 1 μl of this purified PCR amplificate was used as a template used for a second round of PCR.
Für
die zweite PCR-Runde wurde als Ziel die Acetyl-abgeleitete Startereinheit
ausgewählt, die für gewöhnlich durch
KS verlängert wird, die zu Klade VI gehören. In
einem zusätzlich durchgeführten Alignment, dass
alle veröffentlichten Klade VI Sequenzen enthielt, wurde
das einzigartige Sequenzmotiv YYQ/KAGML (Klade VIa-Motiv,
Die verwendeten Primer waren spezifisch für das EDGAY-Motiv, sowie für das YYQAGML-Motiv. Der forward-Primer hatte die Sequenz 5'-GCNHTNGARGAYG CNGGNTAYGC-3' (SEQ ID NO: 72); der reverse Primer hatte die Sequenz 5'-CANRCATNCCNGCY TKRTARTA-3' (SEQ ID NO: 73).The used primers were specific for the EDGAY motif, as well as for the YYQAGML motif. The forward primer had the Sequence 5'-GCNHTNGARGAYG CNGGNTAYGC-3 '(SEQ ID NO: 72); the reverse primer the sequence had 5'-CANRCATNCCNGCY TKRTARTA-3 '(SEQ ID NO: 73).
Die Reaktionsbedingungen waren: 95°C für 300 s, 95°C für 60 s, 52°C für 60 s und 74°C für 100 s (35 X), 74°C für 10 min. Es wurde Taq Polymerase (NEB) verwendet.The Reaction conditions were: 95 ° C for 300 s, 95 ° C for 60 s, 52 ° C for 60 s and 74 ° C for 100 s (35X), 74 ° C for 10 min. It Taq polymerase (NEB) was used.
Die Amplifikation ergab ein einzelnes PCR-Produkt mit der erwarteten Größe, dessen Sequenzierung ergab, dass es in der Tat in die Acetyl-spezifische Klade VIa gehörte.The Amplification gave a single PCR product with the expected Size, whose sequencing revealed that it was in indeed belonged to the acetyl-specific clade VIa.
Diese Resultate belegen, dass mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens einzelne PKS-Gene in komplexen Metagenomen mit einer außergewöhnlichen Genauigkeit ausgewählt und amplifiziert werden können.These Results prove that by means of the invention Procedure single PKS genes in complex metagenomes with a exceptional accuracy selected and can be amplified.
Beispiel 4: Isolierung des Psymberin PKS-GenclustersExample 4: Isolation of the psymberin PKS gene cluster
Eine
Fosmid-Library aus Gesamt-DNA des Psymberin-positiven Schwamms P.
aff. bulbosa wurde erzeugt (410.000 Klone) und nach einer vorbekannten
Strategie (
Die Durchmusterung wurde mittels PCR und unter Verwendung von spezifischen Primern durchgeführt, die aus dem Amplikon der Klade VI abgeleitet wurden.The Screening was performed by PCR and using specific Primers performed from the amplicon of the clade VI were derived.
Innerhalb
von drei Runden des „Primer Walkings” konnten
so fünf positive Fosmide isoliert werden.
Wie
aus z. B.
Hinsichtlich
der Architektur der PKS-Domänen sind PsyA und die ersten
fünf Module von PsyD nahezu identisch zu den Omnamid- (OmnB
und OnnI) und Pederin- (PedI und PedF) Biosynthesewegen (
Beispiel 5: Isolierung eines Mycalamid KS GenfragmentsExample 5: Isolation of a Mycalamide KS gene fragments
Erneut wurde in einem ersten Schritt zunächst die Komplexität der DNA-Probe mittels einer ersten PCR-Amplifikation erniedrigt, wobei die verwendeten Primer ebenfalls die Sequenzen 5'-MGNGARGCNNWNSMNATGGAYCCNCARCANMG-3' (forward) und 5'-GGRTCNC CNARNSWNGTNCCNGTNCCRTG-3' (reverse) hatten.Again In a first step, complexity first became apparent the DNA sample is lowered by means of a first PCR amplification, where the primers used are also the sequences 5'-MGNGARGCNNWNSMNATGGAYCCNCARCANMG-3 ' (forward) and 5'-GGRTCNC CNARNSWNGTNCCNGTNCCRTG-3 '(reverse).
Die erste PCR-Runde fand unter folgenden Bedingungen statt: 96°C für 45 s, 55°C für 45 s, 72°C für 1 min (40 x), dann 72°C für 10 min. Verwendet wurde Taq Polymerase (NEB).The first round of PCR took place under the following conditions: 96 ° C for 45 s, 55 ° C for 45 s, 72 ° C for 1 min (40x), then 72 ° C for 10 min. Taq polymerase (NEB) was used.
Das Amplifikat wurde mittels Agarosegel aufgetrennt und die bei 700 bp laufende DNA mittels Gelverdau wie oben beschrieben aufgereinigt. 1 μl dieses aufgereinigten PCR Amplifikats wurde als Template für eine zweite PCR-Runde verwendet.The Amplificate was separated by agarose gel and at 700 bp running DNA gel digestion as described above. 1 μl of this purified PCR amplificate was used as a template used for a second round of PCR.
Für
die zweite PCR-Runde wurde als Ziel ein Motiv verwendet, welches
in KS detektiert wurde, die αβ-gesättigte
Intermediate verlängert (Klade V). Das identifizierte Motiv
hat die Consensussequenz EPI/VE/DTAC (s.
Die verwendeten Primer waren spezifisch für das EDGAY-Motiv, sowie für das EPI/VE/DTAC-Motiv. Der forward-Primer hatte die Sequenz 5'-GCNHTNGARGAYG CNGGNTAYGC-3' (SEQ ID NO: 72); der reverse Primer hatte die Sequenz 5'-RCANGCNGTNTCDATNGGTTC-3' (SEQ ID NO: 74).The used primers were specific for the EDGAY motif, as well as for the EPI / VE / DTAC motif. The forward primer had the sequence 5'-GCNHTNGARGAYG CNGGNTAYGC-3 '(SEQ ID NO: 72); of the reverse primer had the sequence 5'-RCANGCNGTNTCDATNGGTTC-3 '(SEQ ID NO: 74).
Die Reaktionsbedingungen waren: 95°C für 105 s, 95°C für 60 s, 51°C für 60 s und 74°C für 100 s (35 X), 74°C für 10 min. Es wurde Hot Start Taq Polymerase (Jena Biosciences) verwendet.The Reaction conditions were: 95 ° C for 105 s, 95 ° C for 60 s, 51 ° C for 60 s and 74 ° C for 100 s (35X), 74 ° C for 10 min. It Hot Start Taq Polymerase (Jena Biosciences) was used.
Die Amplifikation ergab erneut ein einzelnes PCR-Produkt mit der erwarteten Größe von 211 bp. Weiterhin zeigte eine anschließend durchgeführte Sequenzierung ebenfalls, dass lediglich ein einzelnes KS-Genfragment amplifiziert worden war, welches perfekt in die vorausgesagte Klade passte (SEQ ID NO: 75).The Amplification again gave a single PCR product with the expected Size of 211 bp. Furthermore, one showed afterwards performed sequencing also that only one single KS gene fragment had been amplified, which was perfect fit into the predicted clade (SEQ ID NO: 75).
Diese Resultate belegen erneut, dass mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens einzelne PKS-Gene in komplexen Metagenomen mit einer außergewöhnlichen Genauigkeit ausgewählt und amplifiziert werden können.These Results prove again that by means of the invention Procedure single PKS genes in complex metagenomes with a exceptional accuracy selected and can be amplified.
Beispiel 6: Isolierung des Mycalamid PKS-GenclustersExample 6: Isolation of the Mycalamide PKS Gene Cluster
Das oben unter Beispiel 4 beschriebene Durchmusterungsverfahren einer Fosmid-Library aus Mycalamid-positiven Proben des Schwammes M. hentscheli wird mit Primern wiederholt, die für das in Beispiel 5 erhaltene KS-Genfragment spezifisch sind.The The screening method described above under Example 4 Fosmid library from mycamide-positive samples of the sponge M. hentscheli is repeated with primers similar to those obtained in Example 5 KS gene fragment are specific.
Aus den detektierten positiven Fosmiden wird die Gensequenz des gesamten PKS-Genclusters bestimmt, der für die Mycalamidbiosynthese benötigt wird.Out the detected positive fosmids will become the gene sequence of the whole PKS gene cluster determined for mycamide biosynthesis is needed.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNGQUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION
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Zitierte PatentliteraturCited patent literature
- - US 5854033 [0028] US 5854033 [0028]
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