DE102007063902B3 - Aptamers that bind to a target molecule involved in hemostasis - Google Patents

Aptamers that bind to a target molecule involved in hemostasis Download PDF

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Abstract

Aptamer, das an ein an der Hämostase beteiligtes Zielmolekül bindet, wobei das Aptamer ein Aptamer ist, das an aktiviertes Protein C bindet, wobei das Aptamer mit einer Dissoziationskonstante KD im Bereich von ≥ 0,001 nM bis ≤ 80 nM an aktiviertes Protein C bindet, und wobei das Aptamer eine Länge im Bereich von ≥ 20 Nukleotide bis ≤ 160 Nukleotide aufweist, und wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer ein Sequenzmotiv aufweist ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
5'-TATCCCGN1ATGGG-3' (SEQ ID NO: 1) worin:
N1 ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanin, Cytosin, Adenin, Thymin, Uracil, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifiziertes Nukleotid, oder eine Deletion;
und/oder 5'-TATCACGTATGGG-3' (SEQ ID NO: 3).An aptamer that binds to a target molecule involved in hemostasis, the aptamer being an aptamer that binds to activated protein C, the aptamer binding to activated protein C with a dissociation constant K D in the range of ≥ 0.001 nM to ≤ 80 nM, and wherein the aptamer has a length in the range of ≥20 nucleotides to ≤160 nucleotides, and wherein the activated protein C-binding aptamer comprises a sequence motif selected from the group comprising:
5'-TATCCCGN 1 ATGGG-3 '(SEQ ID NO: 1) wherein:
N 1 is selected from the group comprising guanine, cytosine, adenine, thymine, uracil, 2'-fluoro, 2'-methoxy and / or 2'-amino-modified nucleotide, or a deletion;
and / or 5'-TATCACGTATGGG-3 '(SEQ ID NO: 3).

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Figure DE102007063902B3_0001

Description

Die Erfindung betrifft Aptamere, die an ein an der Hämostase beteiligtes Zielmolekül binden, wobei das Aptamer ein Aptamer ist, das an aktiviertes Protein C bindet.The invention relates to aptamers that bind to a target molecule involved in hemostasis, wherein the aptamer is an aptamer that binds to activated protein C.

Aktiviertes Protein C (APC) ist eine Serinprotease und die aktive Form des im Blut zirkulierenden Zymogens Protein C. Als sogenannter ”endogener Inhibitor” inaktiviert aktiviertes Protein C die aktivierten Gerinnungsfaktoren Va und VIIIa und kontrolliert dadurch die plasmatische Gerinnungsaktivierung. Eine verminderte Bildung von aktiviertem Protein C oder eine Störung der Aktivität des aktivierten Protein C ist mit einem erhöhten Risiko zur Entwicklung von venösen Thrombosen verbunden und spielt in der Pathogenese von Mikrozirkulationsstörungen, wie sie zum Beispiel im Rahmen der schweren Sepsis auftreten, eine entscheidende Rolle. Ein rekombinant hergestelltes Konzentrat von aktiviertem Protein C wird beispielsweise in der Behandlung der schweren Sepsis eingesetzt.Activated Protein C (APC) is a serine protease and the active form of the blood circulating zymogen protein C. As a so-called "endogenous inhibitor", activated protein C inactivates the activated coagulation factors Va and VIIIa and thereby controls the plasmatic coagulation activation. Decreased production of activated protein C or disruption of activated protein C activity is associated with an increased risk of developing venous thrombosis and plays a crucial role in the pathogenesis of microcirculatory disorders, such as those associated with severe sepsis. A recombinantly produced concentrate of activated protein C is used, for example, in the treatment of severe sepsis.

Trotz der zentralen Rolle, die aktiviertes Protein C in der Pathogenese, Pathophysiologie und Therapie von verschiedenen vaskulären und inflammatorischen Erkrankungen spielt, ist kein routinetaugliches diagnostisches Testverfahren verfügbar, mit dem die Konzentration von aktiviertem Protein C in Plasma oder Vollblut gemessen werden kann.Despite the central role played by activated protein C in the pathogenesis, pathophysiology, and therapy of various vascular and inflammatory diseases, there is no routine diagnostic test available to measure the level of activated protein C in plasma or whole blood.

Der Nachweis von aktiviertem Protein C wird durch seine geringen Plasmakonzentrationen und einem gleichzeitig vorliegendem 10.000-fachen Überschuss von Protein C erschwert.The detection of activated protein C is hampered by its low plasma concentrations and a concurrent 10,000-fold excess of protein C.

Hinzu kommt, dass die Aminosäuresequenz von aktiviertem Protein C bis auf ein zwölf Aminosäuren langes Propeptid identisch mit der von Protein C ist.In addition, the amino acid sequence of activated protein C is identical to that of protein C except for a twelve amino acid propeptide.

Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von aktiviertem Protein C, zum Beispiel durch Bestimmung der Protein C-Propeptidkonzentration, sind zwar bekannt, jedoch aufgrund vielfacher technischer Probleme in der Diagnose nicht einsetzbar.Although methods for determining the activity of activated protein C, for example by determining the protein C-propeptide concentration, are known, they can not be used in the diagnosis because of numerous technical problems.

Die Schrift WO 92/14843 A1 beschreibt Aptamere, die spezifisch an Biomoleküle binden und Verfahren zur Herstellung dieser Aptamere. Weiterhin beschreiben Gal S. W. et al. in „Selection of a RNA aptamer that binds to human activated protein C and inhibits ist protease function”, 1998, Eur. J. Biochem., Vol. 252, Bd 3, S. 553–562, RNA Aptamere gegen humanes aktiviertes Protein C.The font WO 92/14843 A1 describes aptamers that bind specifically to biomolecules and methods of making these aptamers. Furthermore, Gal SW et al. in "Selection of a RNA aptamer that binds to human activated protein C and inhibits is protease function", 1998, Eur. J. Biochem., Vol. 252, Vol. 3, pp. 553-562, RNA aptamers against human activated protein C ,

Weiterhin ist aus der Schrift US 6989241 ein monoklonaler Antikörper gegen aktiviertes Protein C zur Differenzierung zwischen aktiviertem Protein C und Protein C bekannt. Jedoch ist die Affinität dieses Antikörpers zu Protein C nur um eine Zehnerpotenz geringer. Dementsprechend ist ein auf der Basis dieses Antikörpers entwickeltes Testverfahren zwar grundsätzlich zur Bestimmung von aktiviertem Protein C geeignet, erfordert jedoch aufgrund der geringen Affinitätsunterschiede Inkubationszeiten von mehr als 19 Stunden und zeigt eine eingeschränkte Spezifität. Darüber hinaus ist eine komplizierte präanalytische Probenbearbeitung erforderlich.Furthermore, from the Scriptures US 6989241 a monoclonal antibody against activated protein C known for differentiation between activated protein C and protein C. However, the affinity of this antibody for protein C is only one order of magnitude lower. Accordingly, a test procedure developed on the basis of this antibody is basically suitable for the determination of activated protein C, but requires incubation times of more than 19 hours due to the low affinity differences and shows a limited specificity. In addition, a complicated preanalytical sample processing is required.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein Mittel zur Verfügung zu stellen, das wenigstens einen der vorgenannten Nachteile des Standes der Technik überwindet. Insbesondere bestand die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Mittel zur Verfügung zu stellen, das einen Nachweis von aktiviertem Protein C ermöglicht.The object of the invention was to provide a means which overcomes at least one of the aforementioned disadvantages of the prior art. In particular, the object of the present invention was to provide a means that allows detection of activated protein C.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Aptamer, das an ein an der Hämostase beteiligtes Zielmolekül bindet, wobei das Aptamer ein Aptamer ist, das an aktiviertes Protein C bindet, wobei das Aptamer mit einer Dissoziationskonstante KD im Bereich von ≥ 0,001 nM bis ≤ 80 nM an aktiviertes Protein C bindet, und wobei das Aptamer eine Länge im Bereich von ≥ 20 Nukleotide bis ≤ 160 Nukleotide aufweist, und wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer ein Sequenzmotiv aufweist ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
5'-TATCCCGN1ATGGG-3' (SEQ ID NO: 1) worin:
N1 ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanin, Cytosin, Adenin, Thymin, Uracil, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifiziertes Nukleotid, oder eine Deletion;
und/oder 5'-TATCACGTATGGG-3' (SEQ ID NO: 3).According to the invention, the object is achieved by an aptamer which binds to a target molecule involved in hemostasis, the aptamer being an aptamer which binds to activated protein C, the aptamer having a dissociation constant K D in the range of ≥ 0.001 nM to ≦ 80 nM binds to activated protein C, and wherein the aptamer has a length in the range of ≥ 20 nucleotides to ≤ 160 nucleotides, and wherein the activated protein C binding aptamer comprises a sequence motif selected from the group comprising:
5'-TATCCCGN 1 ATGGG-3 '(SEQ ID NO: 1) wherein:
N 1 is selected from the group comprising guanine, cytosine, adenine, thymine, uracil, 2'-fluoro, 2'-methoxy and / or 2'-amino-modified nucleotide, or a deletion;
and / or 5'-TATCACGTATGGG-3 '(SEQ ID NO: 3).

Ein weiterer Gegenstand betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von aktiviertem Protein C in biologischen Proben, wobei wenigstens ein an aktiviertes Protein C bindendes Aptamer mit der biologischen Probe, vorzugsweise einer biologischen Flüssigkeit, inkubiert wird und ein Bindungsereignis zwischen dem Aptamer und aktiviertem Protein C nachgewiesen wird.A further subject relates to a method for the determination of activated protein C in biological samples, wherein at least one activated protein C binding aptamer with the biological sample, preferably a biological fluid, and a binding event between the aptamer and activated protein C is detected.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.Further advantageous embodiments of the invention will become apparent from the dependent claims.

Unter dem Begriff ”Aptamer” sind im Sinne dieser Erfindung Oligonukleotide zu verstehen, die spezifisch und mit hoher Affinität an ein Zielmolekül, insbesondere an ein an der Hämostase beteiligtes Zielprotein wie aktiviertes Protein C binden.For the purposes of this invention, the term "aptamer" is to be understood as meaning oligonucleotides which bind specifically and with high affinity to a target molecule, in particular to a target protein involved in hemostasis, such as activated protein C.

Die Erfinder konnten überraschender Weise Aptamere selektieren, die aktiviertes Protein C mit hoher Affinität binden können. Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere wird dadurch zur Verfügung gestellt, dass diese aktiviertes Protein C mit hoher Affinität und hoher Selektivität binden können. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Aptamere spezifisch an aktiviertes Protein C gegenüber dem inaktiven Zymogen Protein C binden.The inventors have surprisingly been able to select aptamers capable of binding activated protein C with high affinity. A particular advantage of the activated protein C binding aptamers according to the invention is provided by the fact that these activated protein C can bind with high affinity and high selectivity. In particular, the aptamers according to the invention can specifically bind to activated protein C in relation to the inactive zymogen protein C.

Insbesondere zeichnen sich die erfindungsgemäßen Aptamere durch eine hohe Affinität im nanomolaren und sub-nanomolaren Bereich und eine ausgeprägte Spezifität für aktiviertes Protein C gegenüber dem inaktiven Zymogen Protein C aus. Diese Eigenschaften ermöglichen eine zuverlässige Bestimmung von aktiviertem Protein C auch bei Anwesenheit eines großen Überschusses an inaktivem Zymogen Protein C, und eine reproduzierbare Bestimmung von aktiviertem Protein C in biologischen Proben. Die Affinität und Spezifität der erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere sind vorzugsweise besser oder zumindest vergleichbar der von Antikörpern. Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass die erfindungsgemäß zur Verfügung gestellten Aptamere im Gegensatz zu Antikörpern kostengünstig synthetisch herstellbar sind.In particular, the aptamers of the invention are characterized by a high affinity in the nanomolar and sub-nanomolar range and a pronounced specificity for activated protein C over the inactive zymogen protein C. These properties allow a reliable determination of activated protein C even in the presence of a large excess of inactive zymogen protein C, and a reproducible determination of activated protein C in biological samples. The affinity and specificity of the activated protein C binding aptamers according to the invention are preferably better or at least comparable to that of antibodies. A further advantage is that the aptamers provided according to the invention, in contrast to antibodies, are inexpensive to produce synthetically.

Die Selektion der erfindungsgemäßen Aptamere erfolgte entsprechend dem bekannten SELEX®(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)-Verfahren, beispielsweise beschrieben in US 5,475,096 , US 5,270,163 und EP 0 533 838 , auf die hiermit Bezug genommen wird, insbesondere dem so genannten Counter-SELEX®-Verfahren. Hierzu erfolgte zunächst die Synthese eines randomisierten DNA-Pools. Aptamere wurden schematisch durch folgende Schritte generiert. Aptamere aus dem DNA-Pool wurden angereichert, indem der Pool mit aktiviertem Protein C zur Bindung gebracht wurde und der Bindungskomplex von ungebundener ssDNA abgetrennt wurde. Um eine Anreicherung von Matrixbindern zu unterdrücken erfolgte vor ausgewählten Selektionsschritt eine Prä-Selektion gegen Streptavidin Beads. Nach der Inkubation mit aktiviertem Protein C wurde die gebundene ssDNA eluiert, amplifiziert und die erhaltene dsDNA in ssDNA überführt, bevor mit diesen ssDNAs das Verfahren wiederholt wurde. Dieses wurde 11-fach wiederholt. Nach erfolgter Klonierung des selektierten Aptamer-Pools wurde die Sequenz individueller Aptamere durch Sequenzierung und Sequenzanalysen ermittelt und die Bindungseigenschaften durch Bindungsstudien charakterisiert. Selektierte Aptamere mit bekannter Struktur sind mit herkömmlichen Methoden der Nukleinsäuresynthese und/oder Vervielfältigung herstellbar.The selection of the aptamers according to the invention was carried out according to the known SELEX® (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) method, for example described in US 5,475,096 . US 5,270,163 and EP 0 533 838 , which is hereby incorporated by reference, in particular the so-called Counter- SELEX® method. First, the synthesis of a randomized DNA pool was carried out. Aptamers were generated schematically by the following steps. Aptamers from the DNA pool were enriched by binding the pool with activated protein C and separating the binding complex from unbound ssDNA. In order to suppress an accumulation of matrix binders, a pre-selection against streptavidin beads took place before the selected selection step. After incubation with activated protein C, the bound ssDNA was eluted, amplified, and the resulting dsDNA transferred to ssDNA before the procedure was repeated with these ssDNAs. This was repeated 11 times. After cloning the selected aptamer pool, the sequence of individual aptamers was determined by sequencing and sequence analysis, and the binding properties were characterized by binding studies. Selected aptamers of known structure can be prepared by conventional methods of nucleic acid synthesis and / or amplification.

Die Bindungsfähigkeit der selektierten Aptamere wird durch die Affinität der Bindung üblicherweise ausgedrückt über die Dissoziationskonstante beschrieben.The binding ability of the selected aptamers is described by the affinity of the bond, usually expressed in terms of the dissociation constant.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bindet das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer mit einer Dissoziationskonstante KD im Bereich von ≥ 0,002 nM bis ≤ 8 nM, vorzugsweise im Bereich von ≥ 0,005 nM bis ≤ 5 nM, bevorzugt im Bereich von ≥ 0,01 nM bis ≤ 2 nM, besonders bevorzugt im Bereich von ≥ 0,05 nM bis ≤ 1,5 nM, ganz besonders bevorzugt im Bereich von ≥ 0,1 nM bis ≤ 1,3 nM, an aktiviertes Protein C.In a preferred embodiment of the present invention, the activated protein C binding aptamer with a dissociation constant K D in the range of ≥ 0.002 nM to ≤ 8 nM, preferably in the range of ≥ 0.005 nM to ≤ 5 nM, preferably in the range of ≥ 0, 01 nM to ≤ 2 nM, more preferably in the range of ≥ 0.05 nM to ≤ 1.5 nM, very particularly preferably in the range of ≥ 0.1 nM to ≤ 1.3 nM, of activated protein C.

Die Dissoziationskonstanten KD wurden durch nichtlineare Regression mittels einer 4-Parameter-Logistik-Funktion bestimmt. Die Bestimmung erfolgte durch nichtlineare Regression der erhaltenen Datenpunkte von an aktiviertes Proteins C gebundenen radioaktiv-markierter Aptamere gegenüber der Konzentration des verwendeten aktivierten Proteins C, wie in Beispiel 3 beschrieben. Zur Berechnung wurde die Funktion ”Logistische Dosisantwort in Pharmakologie/Chemie” der Software Origin 7.5 (OriginLab, Northampton, MA, USA) verwendet.The dissociation constants K D were determined by non-linear regression using a 4-parameter logistics function. The determination was carried out by non-linear regression of the data points of radioactively-labeled aptamers bound to activated protein C in relation to the concentration of the activated protein C used, as described in Example 3. For the calculation, the function "Logistic Dose Response in Pharmacology / Chemistry" of the software Origin 7.5 (OriginLab, Northampton, MA, USA) was used.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Anzahl an Nukleotiden im Bereich von ≥ 20 Nukleotide bis ≤ 120 Nukleotide, vorzugsweise im Bereich von ≥ 40 Nukleotide bis ≤ 88 Nukleotide, auf. Besonders bevorzugt weist das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Anzahl an Nukleotiden im Bereich von ≥ 44 Nukleotide bis ≤ 120 Nukleotide, vorzugsweise im Bereich von ≥ 44 Nukleotide bis ≤ 88 Nukleotide bevorzugt im Bereich von ≥ 44 bis ≤ 52 Nukleotide auf.In a further preferred embodiment of the present invention, the activated protein C binding aptamer has a number of nucleotides in the range of ≥ 20 nucleotides to ≤ 120 Nucleotides, preferably in the range of ≥ 40 nucleotides to ≤ 88 nucleotides, on. The activated protein C binding aptamer particularly preferably has a number of nucleotides in the range from ≥ 44 nucleotides to ≦ 120 nucleotides, preferably in the range from ≥ 44 nucleotides to ≦ 88 nucleotides, preferably in the range from ≥ 44 to ≦ 52 nucleotides.

Wenn im Folgenden nicht anderes angegeben umfasst der Begriff ”Nukleotid” die Begriffe ”Ribonukleotid” und ”Desoxyribonukleotid”. Entsprechend umfasst der Begriff ”2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifiziertes Nukleotid” 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Ribonukleotide und Desoxyribonukleotide.Unless otherwise stated below, the term "nucleotide" includes the terms "ribonucleotide" and "deoxyribonucleotide". Accordingly, the term "2'-fluoro, 2'-methoxy and / or 2'-amino-modified nucleotide" 2'-fluoro, 2'-methoxy and / or 2'-amino-modified ribonucleotides and deoxyribonucleotides ,

Erfindungsgemäße Aptamere können eine DNA- oder eine RNA-Sequenz aufweisen. Es versteht sich, dass für den Fall, dass erfindungsgemäße Aptamere eine RNA-Sequenz aufweisen, in den angegebenen Sequenzmotiven und Sequenzen Thymidin durch Uridin ersetzt ist.Aptamers according to the invention may have a DNA or an RNA sequence. It is understood that in the case that aptamers according to the invention have an RNA sequence, thymidine is replaced by uridine in the specified sequence motifs and sequences.

Die erfindungsgemäß geeigneten RNA-Sequenzen entsprechen den erfindungsgemäßen DNA Sequenzen, wobei T durch U ersetzt ist.The RNA sequences suitable according to the invention correspond to the DNA sequences according to the invention, T being replaced by U.

Vorzugsweise weisen Aptamere eine DNA-Sequenz auf. Aptamere auf DNA-Basis besitzen in vorteilhafter Weise eine erhöhte Stabilität.Preferably, aptamers have a DNA sequence. DNA-based aptamers advantageously have increased stability.

Weiterhin geeignet sind Aptamere, die eine Sequenz umfassend 2'-modifizierte Nukleotide, beispielsweise 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide, aufweisen. Auch geeignet sind Aptamere, die 2'-modifizierte Ribonukleotide, beispielsweise 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Ribonukleotide, aufweisen. Weiterhin können Aptamere Desoxyribonukleotide und 2'-modifizierte Ribonukleotide, beispielsweise 2'-Fluor-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Ribonukleotide aufweisen.Also suitable are aptamers which have a sequence comprising 2'-modified nucleotides, for example 2'-fluoro, 2'-methoxy and / or 2'-amino-modified nucleotides. Also suitable are aptamers which have 2'-modified ribonucleotides, for example 2'-fluoro, 2'-methoxy and / or 2'-amino-modified ribonucleotides. Furthermore, aptamers may have deoxyribonucleotides and 2'-modified ribonucleotides, for example 2'-fluoro, 2'-methoxy and / or 2'-amino-modified ribonucleotides.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnten an aktiviertes Protein C bindende Aptamere selektiert werden, die zwei Hauptgruppen zugeordnet werden konnten, wobei die Sequenzen der Aptamere innerhalb einer Hauptgruppe ein gemeinsames Sequenzmotiv aufweisen. Dieses gemeinsame Sequenzmotiv variiert innerhalb einer Hauptgruppe nur in einzelnen Basenpositionen.In the context of the present invention, it was possible to select activating protein C-binding aptamers which could be assigned to two main groups, the sequences of the aptamers having a common sequence motif within one main group. This common sequence motif varies within a main group only in individual base positions.

”C” steht vorliegend entsprechend dem üblichen hier verwendeten Ein-Buchstaben-Code der Basen für Cytosin, entsprechend stehen ”A” für Adenin, ”G” für Guanin und ”T” für Thymin, ”U” für Uracil."C" in this case corresponds to the usual one-letter code of the bases for cytosine used here, correspondingly "A" stands for adenine, "G" for guanine and "T" for thymine, "U" for uracil.

Insbesondere die Position N1 des Sequenzmotivs SEQ ID NO: 1 ist hochvariabel. So kann die Position N1 verschiedene Basen oder Nukleotide oder eine Deletion umfassen. Beispielsweise kann an der Position N1 ein Ribonukleotid in einem DNA-Aptamer umfasst sein. Weiterhin können insbesondere an der Position N1 modifizierte Nukleotide, insbesondere modifizierte Ribonukleotide umfasst sein.In particular, the position N 1 of the sequence motif SEQ ID NO: 1 is highly variable. Thus, position N 1 may comprise different bases or nucleotides or a deletion. For example, at position N 1, a ribonucleotide may be included in a DNA aptamer. Furthermore, in particular at the position N 1 modified nucleotides, in particular modified ribonucleotides may be included.

In bevorzugten Ausführungsformen weisen die Sequenzmotive ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 3 des an aktiviertes Protein C bindende Aptamers keine modifizierten Nukleotide auf.In preferred embodiments, the sequence motifs selected from the group comprising SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 3 of the activated protein C-binding aptamer have no modified nucleotides.

Ohne auf eine bestimmte Theorie festgelegt zu sein, wird angenommen, dass die Sequenzmotive ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ ID NOs: 1 und 3 eine essentielle Bedeutung bei der Bindung der erfindungsgemäßen Aptamere an aktiviertes Protein C aufweisen.Without being bound by any particular theory, it is believed that the sequence motifs selected from the group comprising SEQ ID NOs: 1 and 3 have an essential meaning in the binding of the aptamers according to the invention to activated protein C.

Unter den an aktiviertes Protein C bindenden Aptameren, die ein Sequenzmotiv 5'-TATCCCGN1ATGGG-3' (SEQ ID NO: 1) aufweisen, wurden vier Untergruppen identifiziert, die eine jeweils gemeinsame Base N1 ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanin, Cytosin, Adenin und/oder Thymin aufweisen.Among the activated protein C-binding aptamers having a sequence motif 5'-TATCCCGN 1 ATGGG-3 '(SEQ ID NO: 1), four subgroups were identified, each having a common base N 1 selected from the group comprising guanine, cytosine , Adenine and / or thymine.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer ein Sequenzmotiv ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

Figure DE102007063902B3_0002
In a preferred embodiment of the present invention, the activated protein C binding aptamer comprises a sequence motif selected from the group comprising:
Figure DE102007063902B3_0002

Hierbei können die Sequenzmotive SEQ ID NOs: 4 bis 7 modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen. Here, the sequence motifs SEQ ID NOs: 4 to 7 may have modified nucleotides, preferably selected from the group comprising locked nucleic acids, 2'-fluoro, 2'-methoxy and / or 2'-amino-modified nucleotides.

Ohne auf eine bestimmte Theorie festgelegt zu sein, wird angenommen, dass die Sequenzmotive ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ ID NOs: 4 bis 7 eine besonders gute Bindung der erfindungsgemäßen Aptamere an aktiviertes Protein C vermitteln können.Without wishing to be bound by any particular theory, it is assumed that the sequence motifs selected from the group comprising SEQ ID NOs: 4 to 7 can mediate particularly good binding of the aptamers according to the invention to activated protein C.

Die Aptamer-Sequenzen SEQ ID NOs: 8 bis 19 weisen eine gemeinsame Konsensussequenz 5'-TATCCCGTATGGG-3' (SEQ ID NO: 4) auf, die die Base Thymin an Position 8 innerhalb der Gruppe der Sequenzen SEQ ID NO: 1 aufweist.The aptamer sequences SEQ ID NOs: 8 to 19 have a common consensus sequence 5'-TATCCCGTATGGG-3 '(SEQ ID NO: 4) having the base thymine at position 8 within the group of SEQ ID NO: 1.

In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

Figure DE102007063902B3_0003
Figure DE102007063902B3_0004
und/oder deren Varianten, Mutanten und/oder Teile, wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer Modifikationen aufweisen kann, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder das Aptamer modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen kann.In preferred embodiments of the present invention, the activated protein C-binding aptamer comprises a sequence selected from the group comprising:
Figure DE102007063902B3_0003
Figure DE102007063902B3_0004
and / or their variants, mutants and / or parts, wherein the activated protein C-binding aptamer may have modifications, preferably selected from the group comprising 5'-PEG and / or 3'-CAP modifications, and / or the aptamer modified nucleotides, preferably selected from the group comprising Locked nucleic acids, 2'-fluoro, 2'-methoxy and / or 2'-amino-modified nucleotides may have.

Teile der vorgenannten Aptamer-Sequenzen umfassen das Sequenzmotiv 5'-TATCCCGTATGGG-3' (SEQ ID NO: 4).Portions of the aforementioned aptamer sequences include the sequence motif 5'-TATCCCGTATGGG-3 '(SEQ ID NO: 4).

Varianten der erfindungsgemäßen Sequenzen können durch Modifikationen, wie Alkylierung, insbesondere Methylierung, Arylierung oder Acetylierung von zumindest einem Nukleotid, Einbau von Enantiomeren und/oder durch Fusion der Aptamere mit einem oder mehreren Nukleotiden oder einer Nukleinsäuresequenz entstehen. Mutanten können beispielsweise durch Substitution, Deletion, Insertion, Translokation, Inversion und/oder Addition von zumindest einem Nukleotid erhalten werden.Variants of the sequences according to the invention can be formed by modifications, such as alkylation, in particular methylation, arylation or acetylation of at least one nucleotide, incorporation of enantiomers and / or fusion of the aptamers with one or more nucleotides or a nucleic acid sequence. Mutants can be obtained, for example, by substitution, deletion, insertion, translocation, inversion and / or addition of at least one nucleotide.

Die Aptamer-Sequenzen SEQ ID NOs: 20 bis 31 weisen eine gemeinsame Konsensussequenz 5'-TATCCCGGATGGG-3' (SEQ ID NO: 5) auf, die die Base Guanin an Position 8 innerhalb der Gruppe der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 aufweist.The aptamer sequences SEQ ID NOs: 20 to 31 have a common consensus sequence 5'-TATCCCGGATGGG-3 '(SEQ ID NO: 5), which has the base guanine at position 8 within the group of sequences according to SEQ ID NO: 1 ,

In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

Figure DE102007063902B3_0005
Figure DE102007063902B3_0006
und/oder deren Varianten, Mutanten und/oder Teile, wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer Modifikationen aufweisen kann, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder das Aptamer modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen kann. Teile der Aptamer-Sequenzen umfassen das Sequenzmotiv 5'-TATCCCGGATGGG-3' (SEQ ID NO: 5).In preferred embodiments of the present invention, the activated protein C-binding aptamer comprises a sequence selected from the group comprising:
Figure DE102007063902B3_0005
Figure DE102007063902B3_0006
and / or their variants, mutants and / or parts, wherein the activated protein C-binding aptamer may have modifications, preferably selected from the group comprising 5'-PEG and / or 3'-CAP modifications, and / or the aptamer modified nucleotides, preferably selected from the group comprising Locked nucleic acids, 2'-fluoro, 2'-methoxy and / or 2'-amino-modified nucleotides may have. Portions of the aptamer sequences include the sequence motif 5'-TATCCCGGATGGG-3 '(SEQ ID NO: 5).

In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

Figure DE102007063902B3_0007
und/oder deren Varianten, Mutanten und/oder Teile, wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer Modifikationen aufweisen kann, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder das Aptamer modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen kann. Teile der Aptamer-Sequenzen umfassen das Sequenzmotiv 5'-TATCCCGAATGGG-3' (SEQ ID NO: 6).In preferred embodiments of the present invention, the activated protein C-binding aptamer comprises a sequence selected from the group comprising:
Figure DE102007063902B3_0007
and / or their variants, mutants and / or parts, wherein the activated protein C-binding aptamer may have modifications, preferably selected from the group comprising 5'-PEG and / or 3'-CAP modifications, and / or the aptamer modified nucleotides, preferably selected from the group comprising Locked nucleic acids, 2'-fluoro, 2'-methoxy and / or 2'-amino-modified nucleotides may have. Portions of the aptamer sequences include the sequence motif 5'-TATCCCGAATGGG-3 '(SEQ ID NO: 6).

Die Aptamer-Sequenzen SEQ ID NOs: 32 bis 34 weisen eine gemeinsame Konsensussequenz 5'-TATCCCGAATGGG-3' (SEQ ID NO: 6) auf, die die Base Adenin an Position 8 innerhalb der Gruppe der Sequenzen SEQ ID NO: 1 aufweist.The aptamer sequences SEQ ID NOs: 32 to 34 have a common consensus sequence 5'-TATCCCGAATGGG-3 '(SEQ ID NO: 6) having the base adenine at position 8 within the group of SEQ ID NO: 1.

In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

Figure DE102007063902B3_0008
und/oder deren Varianten, Mutanten und/oder Teile, wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer Modifikationen aufweisen kann, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder das Aptamer modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen kann. Teile der Aptamer-Sequenzen umfassen das Sequenzmotiv 5'-TATCCCGCATGGG-3' (SEQ ID NO: 7).In preferred embodiments of the present invention, the activated protein C-binding aptamer comprises a sequence selected from the group comprising:
Figure DE102007063902B3_0008
and / or their variants, mutants and / or parts, wherein the activated protein C-binding aptamer may have modifications, preferably selected from the group comprising 5'-PEG and / or 3'-CAP modifications, and / or the aptamer modified nucleotides, preferably selected from the group comprising Locked nucleic acids, 2'-fluoro, 2'-methoxy and / or 2'-amino-modified nucleotides may have. Portions of the aptamer sequences include the sequence motif 5'-TATCCCGCATGGG-3 '(SEQ ID NO: 7).

Die Aptamer-Sequenzen SEQ ID NOs: 35 und 36 weisen eine gemeinsame Konsensussequenz 5'-TATCCCGCATGGG-3' (SEQ ID NO: 7) auf, die die Base Cytosin an Position 8 innerhalb der Gruppe der Sequenzen SEQ ID NO: 1 aufweist.The aptamer sequences SEQ ID NOs: 35 and 36 have a common consensus sequence 5'-TATCCCGCATGGG-3 '(SEQ ID NO: 7) having the base cytosine at position 8 within the group of SEQ ID NO: 1.

In weiter bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

Figure DE102007063902B3_0009
Figure DE102007063902B3_0010
Figure DE102007063902B3_0011
und/oder deren Varianten, Mutanten und/oder Teile, wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer Modifikationen aufweisen kann, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder das Aptamer modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen kann. Die Sequenzen SEQ ID NO: 97 bis 115 und/oder Teile dieser Aptamer-Sequenzen umfassen das Sequenzmotiv 5'-TATCCCGN1ATGGG-3' (SEQ ID NO: 1), insbesondere die Sequenzmotive 5'-TATCCCGTATGGG-3' (SEQ ID NO: 4), 5'-TATCCCGGATGGG-3' (SEQ ID NO: 5), 5'-TATCCCGAATGGG-3' (SEQ ID NO: 6) oder 5'-TATCCCGCATGGG-3' (SEQ ID NO: 7).In further preferred embodiments of the present invention, the activated protein C-binding aptamer comprises a sequence selected from the group comprising:
Figure DE102007063902B3_0009
Figure DE102007063902B3_0010
Figure DE102007063902B3_0011
and / or their variants, mutants and / or parts, wherein the activated protein C-binding aptamer may have modifications, preferably selected from the group comprising 5'-PEG and / or 3'-CAP modifications, and / or the aptamer modified nucleotides, preferably selected from the group comprising Locked nucleic acids, 2'-fluoro, 2'-methoxy and / or 2'-amino-modified nucleotides may have. The sequences SEQ ID NO: 97 to 115 and / or parts of these aptamer sequences include the sequence motif 5'-TATCCCGN 1 ATGGG-3 '(SEQ ID NO: 1), in particular the sequence motifs 5'-TATCCCGTATGGG-3' (SEQ ID NO: 4), 5'-TATCCCGGATGGG-3 '(SEQ ID NO: 5), 5'-TATCCCGAATGGG-3' (SEQ ID NO: 6) or 5'-TATCCCGCATGGG-3 '(SEQ ID NO: 7).

In auch bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

Figure DE102007063902B3_0012
und/oder deren Varianten, Mutanten und/oder Teile, wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer Modifikationen aufweisen kann, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder das Aptamer modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen kann. Die Sequenzen SEQ ID NO: 116 und 117 und/oder Teile dieser Aptamer-Sequenzen umfassen das Sequenzmotiv 5'-TATCACGGATGGGC-3' (SEQ ID NO: 118), das sich von dem Sequenzmotive SEQ ID NO: 1 dadurch unterscheidet, dass Adenin an der Position 5 enthalten ist.In also preferred embodiments of the present invention, the activated protein C-binding aptamer comprises a sequence selected from the group comprising:
Figure DE102007063902B3_0012
and / or their variants, mutants and / or parts, wherein the activated protein C-binding aptamer may have modifications, preferably selected from the group comprising 5'-PEG and / or 3'-CAP modifications, and / or the aptamer modified nucleotides, preferably selected from the group comprising Locked nucleic acids, 2'-fluoro, 2'-methoxy and / or 2'-amino-modified nucleotides may have. The sequences SEQ ID NO: 116 and 117 and / or parts of these aptamer sequences comprise the sequence motif 5'-TATCACGGATGGGC-3 '(SEQ ID NO: 118), which differs from the sequence motif SEQ ID NO: 1 in that adenine is contained at position 5.

In noch bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

Figure DE102007063902B3_0013
und/oder deren Varianten, Mutanten und/oder Teile, wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer Modifikationen aufweisen kann, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder das Aptamer modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen kann. Die Sequenzen SEQ ID NO: 119 und 120 und/oder Teile dieser Aptamer-Sequenzen umfassen das Sequenzmotiv 5'-TATCCCAAATGGGG-3' (SEQ ID NO: 121), das sich von dem Sequenzmotive SEQ ID NO: 1 dadurch unterscheidet, dass Adenin an der Position 7 enthalten ist, oder das Sequenzmotiv 5'-TATCCCGTATAGGG-3' (SEQ ID NO: 122), das sich von dem Sequenzmotive SEQ ID NO: 1 dadurch unterscheidet, dass Adenin an der Position 11 enthalten ist.In still preferred embodiments of the present invention, the activated protein C-binding aptamer comprises a sequence selected from the group comprising:
Figure DE102007063902B3_0013
and / or their variants, mutants and / or parts, wherein the activated protein C-binding aptamer may have modifications, preferably selected from the group comprising 5'-PEG and / or 3'-CAP modifications, and / or the aptamer modified nucleotides, preferably selected from the group comprising Locked nucleic acids, 2'-fluoro, 2'-methoxy and / or 2'-amino-modified nucleotides may have. The sequences SEQ ID NO: 119 and 120 and / or parts of these aptamer sequences comprise the sequence motif 5'-TATCCCAAATGGGG-3 '(SEQ ID NO: 121), which differs from the sequence motif SEQ ID NO: 1 in that adenine at position 7, or the sequence motif 5'-TATCCCGTATAGGG-3 '(SEQ ID NO: 122), which differs from the sequence motif SEQ ID NO: 1 in that adenine is contained at position 11.

In auch bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer das Sequenzmotiv 5'-TATCACGTATGGG-3' (SEQ ID NO: 3).In also preferred embodiments of the present invention, the activated protein C-binding aptamer comprises the sequence motif 5'-TATCACGTATGGG-3 '(SEQ ID NO: 3).

In weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

Figure DE102007063902B3_0014
Figure DE102007063902B3_0015
und/oder deren Varianten, Mutanten und/oder Teile, wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer Modifikationen aufweisen kann, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder das Aptamer modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen kann. Teile der Aptamer-Sequenzen umfassen jeweils das Sequenzmotiv 5'-TATCACGTATGGG-3' (SEQ ID NO: 3).In further embodiments of the present invention, the activated protein C binding aptamer comprises a sequence selected from the group comprising:
Figure DE102007063902B3_0014
Figure DE102007063902B3_0015
and / or their variants, mutants and / or parts, wherein the activated protein C-binding aptamer may have modifications, preferably selected from the group comprising 5'-PEG and / or 3'-CAP modifications, and / or the aptamer modified nucleotides, preferably selected from the group comprising Locked nucleic acids, 2'-fluoro, 2'-methoxy and / or 2'-amino-modified nucleotides may have. Portions of the aptamer sequences each comprise the sequence motif 5'-TATCACGTATGGG-3 '(SEQ ID NO: 3).

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz auf ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

Figure DE102007063902B3_0016
und/oder deren Varianten, Mutanten und/oder Teile, wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer Modifikationen aufweisen kann, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder das Aptamer modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen kann. Die Sequenzen SEQ ID NO: 46, 123 und 124 und/oder Teile dieser Aptamer-Sequenzen umfassen das Sequenzmotiv 5'-ATCGCTTCAGGG-3' (SEQ ID NO: 125).In another embodiment of the present invention, the activated protein C-binding aptamer comprises a sequence selected from the group comprising:
Figure DE102007063902B3_0016
and / or their variants, mutants and / or parts, wherein the activated protein C-binding aptamer may have modifications, preferably selected from the group comprising 5'-PEG and / or 3'-CAP modifications, and / or the aptamer modified nucleotides, preferably selected from the group comprising Locked nucleic acids, 2'-fluoro, 2'-methoxy and / or 2'-amino-modified nucleotides may have. The sequences SEQ ID NO: 46, 123 and 124 and / or parts of these aptamer sequences comprise the sequence motif 5'-ATCGCTTCAGGG-3 '(SEQ ID NO: 125).

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz
5'-ACGTGAATGTCTGGCTGGTGTAGGTCTGGGCTGGACGTGGGGCTAGTGA-3' (SEQ ID NO: 47) auf.In another embodiment of the present invention, the activated protein C binding aptamer has a sequence
5'-ACGTGAATGTCTGGCTGGTGTAGGTCTGGGCTGGACGTGGGGCTAGTGA-3 '(SEQ ID NO: 47).

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz
5'-ACGTGAATGTCTGGCTGGTGTAGGTCTGGGCTGGACGTGGGGCTAGTGA-3' (SEQ ID NO: 126) auf.In another embodiment of the present invention, the activated protein C binding aptamer has a sequence
5'-ACGTGAATGTCTGGCTGGTGTAGGTCTGGGCTGGACGTGGGGCTAGTGA-3 '(SEQ ID NO: 126).

In weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung weist das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz auf ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

Figure DE102007063902B3_0017
Figure DE102007063902B3_0018
Figure DE102007063902B3_0019
Figure DE102007063902B3_0020
Figure DE102007063902B3_0021
und/oder deren Varianten, Mutanten und/oder Teile, wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer Modifikationen aufweisen kann, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder das Aptamer modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen kann.In further embodiments of the present invention, the activated protein C binding aptamer comprises a sequence selected from the group comprising:
Figure DE102007063902B3_0017
Figure DE102007063902B3_0018
Figure DE102007063902B3_0019
Figure DE102007063902B3_0020
Figure DE102007063902B3_0021
and / or their variants, mutants and / or parts, wherein the activated protein C-binding aptamer may have modifications, preferably selected from the group comprising 5'-PEG and / or 3'-CAP modifications, and / or the aptamer modified nucleotides, preferably selected from the group comprising Locked nucleic acids, 2'-fluoro, 2'-methoxy and / or 2'-amino-modified nucleotides may have.

Hierbei umfassen die Sequenzen SEQ ID NOs: 48 bis 85 die vorgenannten SEQ ID NOs: 8 bis 36 und 39 bis 47, wobei diese jeweils von zwei Sequenzen 5'-GCCTGTTGTGAGCCTCCTAAC-3' (SEQ ID NO: 86) und 5'-CATGCTTATTCTTGTCTCCC-3' (SEQ ID NO: 87) flankiert werden. Diese Sequenzen SEQ ID NO: 86 und SEQ ID NO: 87 entsprechen den Primerbindungssequenzen, die bei der Selektion der erfindungsgemäßen Aptamere verwendet wurden.Here, the sequences SEQ ID NOs: 48 to 85 include the aforementioned SEQ ID NOs: 8 to 36 and 39 to 47, each of two sequences 5'-GCCTGTTGTGAGCCTCCTAAC-3 '(SEQ ID NO: 86) and 5'-CATGCTTATTCTTGTCTCCC -3 '(SEQ ID NO: 87) flanking. These sequences SEQ ID NO: 86 and SEQ ID NO: 87 correspond to the primer binding sequences used in the selection of the aptamers of the present invention.

Überraschend konnte festgestellt werden, dass insbesondere die erfindungsgemäßen Aptamere der Sequenzen SEQ ID NOs: 49, 58, 70 und 83 eine sehr gute Affinität der Bindung an aktiviertes Protein C aufwiesen. Insbesondere in Filterbindungsexperimenten konnte festgestellt werden, dass die bestimmte Dissoziationskonstante KD im Bereich von ≥ 0,1 nM bis ≤ 0,4 nM lag.Surprisingly, it was found that in particular the aptamers according to the invention of the sequences SEQ ID NOs: 49, 58, 70 and 83 had a very good affinity for binding to activated protein C. In particular in filter binding experiments it could be determined that the determined dissociation constant K D was in the range of ≥ 0.1 nM to ≤ 0.4 nM.

In weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung weist das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz auf ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

Figure DE102007063902B3_0022
Figure DE102007063902B3_0023
Figure DE102007063902B3_0024
Figure DE102007063902B3_0025
und/oder deren Varianten, Mutanten und/oder Teile, wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer Modifikationen aufweisen kann, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder das Aptamer modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen kann.In further embodiments of the present invention, the activated protein C binding aptamer comprises a sequence selected from the group comprising:
Figure DE102007063902B3_0022
Figure DE102007063902B3_0023
Figure DE102007063902B3_0024
Figure DE102007063902B3_0025
and / or their variants, mutants and / or parts, wherein the activated protein C-binding aptamer may have modifications, preferably selected from the group comprising 5'-PEG and / or 3'-CAP modifications, and / or the aptamer modified nucleotides, preferably selected from the group comprising Locked nucleic acids, 2'-fluoro, 2'-methoxy and / or 2'-amino-modified nucleotides may have.

Hierbei umfassen die Sequenzen SEQ ID NOs: 127 bis 152 die vorgenannten SEQ ID NOs: 97 bis 117, 119, 120, 123, 124 und 126, wobei diese jeweils von zwei Sequenzen 5'-GCCTGTTGTGAGCCTCCTAAC-3' (SEQ ID NO: 86) und 5'-CATGCTTATTCTTGTCTCCC-3' (SEQ ID NO: 87) flankiert werden. Diese Sequenzen SEQ ID NO: 86 und SEQ ID NO: 87 entsprechen den Primerbindungssequenzen, die bei der Selektion der erfindungsgemäßen Aptamere verwendet wurden.Here, the sequences SEQ ID NOs: 127 to 152 include the aforementioned SEQ ID NOs: 97 to 117, 119, 120, 123, 124 and 126, each of which comprises two sequences 5'-GCCTGTTGTGAGCCTCCTAAC-3 '(SEQ ID NO: 86 ) and 5'-CATGCTTATTCTTGTCTCCC-3 '(SEQ ID NO: 87). These sequences SEQ ID NO: 86 and SEQ ID NO: 87 correspond to the primer binding sequences used in the selection of the aptamers of the present invention.

Aptamere können sich unter definierten Bedingungen in eine spezifische dreidimensionale Struktur beispielsweise so genannte Haarnadelstrukturen falten. Vorzugsweise weist das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer wenigstens eine erste Haarnadel-Struktur umfassend einen Stamm und eine Schleife auf.Aptamers can fold under defined conditions in a specific three-dimensional structure, for example, so-called hairpin structures. Preferably, the activated protein C-binding aptamer has at least one first hairpin structure comprising a stem and a loop.

Unter dem Begriff ”Haarnadelstruktur” oder ”Hairpin” ist im Sinne der vorliegenden Erfindung eine spezielle Form der Sekundärstruktur bei Nukleinsäuresequenzen insbesondere Aptameren zu verstehen, die sich aus zwei zueinander komplementären Sequenz-Abschnitten im so genannten Stamm (stem) und einem weiteren Sequenzabschnitt in der so genannten Schleife (loop) zusammensetzen, zu verstehen. Hierbei können im Stamm eine oder mehrere Basen einzelsträngige Bereiche so genannte Ausbuchtungen (Bulge) ausbilden.For the purposes of the present invention, the term "hairpin structure" or "hairpin" is to be understood as meaning a special form of secondary structure in the case of nucleic acid sequences, in particular aptamers, which consists of two mutually complementary sequence segments in the so-called stem and a further sequence segment in the US Pat so-called loop (loop) composed, to understand. Here, one or more bases in the trunk can form single-stranded areas called bulges.

Es ist bevorzugt, dass der Stamm der ersten Haarnadel-Struktur im Bereich von ≥ 4 Basenpaare bis ≤ 15 Basenpaare, vorzugsweise im Bereich von ≥ 9 Basenpaare bis ≤ 13 Basenpaare, bevorzugt im Bereich von ≥ 11 Basenpaare bis ≤ 12 Basenpaare aufweist. Es ist weiter bevorzugt, dass die Schleife der ersten Haarnadel-Struktur im Bereich von ≥ 5 Nukleotide bis ≤ 30 Nukleotide, vorzugsweise im Bereich von ≥ 6 Nukleotide bis ≤ 18 Nukleotide, aufweist.It is preferred that the strain of the first hairpin structure in the range of ≥ 4 base pairs to ≤ 15 base pairs, preferably in the range of ≥ 9 base pairs to ≤ 13 base pairs, preferably in the range of ≥ 11 base pairs to ≤ 12 base pairs. It is further preferred that the loop of the first hairpin structure in the range of ≥ 5 nucleotides to ≤ 30 nucleotides, preferably in the range of ≥ 6 nucleotides to ≤ 18 nucleotides having.

In vorteilhafter Weise kann eine Anzahl gepaarter Nukleotide im Bereich von ≥ 4 Basenpaare bis ≤ 15 Basenpaare, insbesondere im Bereich von ≥ 9 Basenpaare bis ≤ 13 Basenpaare, bevorzugt im Bereich von ≥ 11 Basenpaare bis ≤ 12 Basenpaare, im Stamm der ersten Haarnadel-Struktur dazu beitragen, dass eine hochaffine Bindung des Aptamers zu aktiviertem Protein C ausbildbar ist.Advantageously, a number of paired nucleotides in the range of ≥ 4 base pairs to ≤ 15 base pairs, in particular in the range of ≥ 9 base pairs to ≤ 13 base pairs, preferably in the range of ≥ 11 base pairs to ≤ 12 base pairs, in the trunk of the first hairpin structure contribute to the formation of a high-affinity binding of the aptamer to activated protein C.

Ohne auf eine bestimmte Theorie festgelegt zu sein wird angenommen, dass eine Anzahl gepaarter Nukleotide insbesondere im Bereich von ≥ 9 Basenpaare bis ≤ 13 Basenpaare dazu beitragen kann, dass eine stabile Ausbildung des Stammes der ersten Haarnadel-Struktur ermöglicht wird.Without being bound by theory, it is believed that a number of paired nucleotides, particularly in the range of ≥ 9 base pairs to ≦ 13 base pairs, may contribute to enabling stable formation of the stem of the first hairpin structure.

In bevorzugten Ausführungsformen weist das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine zweite Haarnadel-Struktur umfassend einen Stamm und eine Schleife auf. Vorzugsweise ist die zweite Haarnadel-Struktur in der Schleife der ersten Haarnadel-Struktur angeordnet.In preferred embodiments, the activated protein C-binding aptamer has a second hairpin structure comprising a stem and a loop. Preferably, the second hairpin structure is disposed in the loop of the first hairpin structure.

In weiter bevorzugten Ausführungsformen weist das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine zweite Haarnadel-Struktur umfassend einen Stamm und eine Schleife auf, wobei die zweite Haarnadel-Struktur in der Schleife der ersten Haarnadel-Struktur angeordnet ist.In further preferred embodiments, the activated protein C-binding aptamer comprises a second hairpin structure comprising a stem and a loop, wherein the second hairpin structure is disposed in the loop of the first hairpin structure.

In besonders bevorzugten Ausführungsformen weist das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer das Sequenzmotiv SEQ ID NO: 1 auf, wobei das Sequenzmotiv SEQ ID NO: 1 die zweite Haarnadel-Struktur umfasst. In weiter bevorzugten Ausführungsformen weist der Stamm der ersten Haarnadel-Struktur eine Nukleotidabfolge Cytidin-Thymidin (CT) auf, die einen einzelsträngigen Bereich, eine Ausbuchtung, ausbildet.In particularly preferred embodiments, the activated protein C-binding aptamer has the sequence motif SEQ ID NO: 1, wherein the sequence motif SEQ ID NO: 1 comprises the second hairpin structure. In further preferred embodiments, the stem of the first hairpin structure has a nucleotide sequence cytidine-thymidine (CT) that forms a single-stranded region, a bulge.

Es konnte festgestellt werden, dass insbesondere eine Nukleotidabfolge Cytidin-Thymidin (CT) im Stamm der erste Haarnadelstruktur, die einen einzelsträngigen Bereich, einen so genannten Bulge ausbildet, zu einer Verbesserung der Bindung des Aptamers an aktiviertes Protein C beitragen kann.It has been found that in particular a nucleotide sequence cytidine-thymidine (CT) in the stem of the first hairpin structure, which forms a single-stranded region, a so-called bulge, can contribute to an improvement in the binding of the aptamer to activated protein C.

In bevorzugten Ausführungsformen weist das erfindungsgemäße an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz auf ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ ID NOs: 58, 88 bis 92 auf. In besonders bevorzugten Ausführungsformen weisen erfindungsgemäße an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz auf ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ ID NOs: 58, 88 bis 92, wobei diese eine Sekundärstruktur aufweisen, die eine erste Haarnadel-Struktur umfassend einen Stamm und eine Schleife und eine zweite Haarnadel-Struktur umfassend einen Stamm und eine Schleife ausbildet, wobei die zweite Haarnadel-Struktur in der Schleife der ersten Haarnadel-Struktur angeordnet ist.In preferred embodiments, the activated protein C-binding aptamer of the invention has a sequence selected from the group comprising SEQ ID NOs: 58, 88 to 92. In particularly preferred embodiments, activated protein C-binding aptamers of the invention have a sequence selected from the group comprising SEQ ID NOs: 58, 88 to 92, which have a secondary structure comprising a first hairpin structure comprising a stem and a loop and a second hairpin structure comprising a trunk and a loop is formed, wherein the second hairpin structure is arranged in the loop of the first hairpin structure.

In ganz besonders bevorzugten Ausführungsformen weisen erfindungsgemäße an aktiviertes Protein C bindende Aptamer aufweisend Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ ID NOs: 58, 88 bis 92 eine Sekundärstruktur auf, die eine erste Haarnadel-Struktur umfassend einen Stamm und eine Schleife und eine zweite Haarnadel-Struktur umfassend einen Stamm und eine Schleife umfasst, wobei die zweite Haarnadel-Struktur in der Schleife der ersten Haarnadel-Struktur angeordnet ist, und wobei das Sequenzmotiv SEQ ID NO: 1 die zweite Haarnadel-Struktur umfasst.In particularly preferred embodiments, inventive activated protein C-binding aptamer comprising sequences selected from the group comprising SEQ ID NOs: 58, 88 to 92 have a secondary structure comprising a first hairpin structure comprising a stem and a loop and a second hairpin. A structure comprising a stem and a loop, wherein the second hairpin structure is arranged in the loop of the first hairpin structure, and wherein the sequence motif SEQ ID NO: 1 comprises the second hairpin structure.

In weiter ganz besonders bevorzugten Ausführungsformen weisen erfindungsgemäße an aktiviertes Protein C bindende Aptamere der Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ ID NOs: 58, 88 bis 92 einen Stamm der ersten Haarnadel-Struktur auf mit im Bereich von ≥ 9 Basenpaare bis ≤ 13 Basenpaare, bevorzugt im Bereich von ≥ 11 Basenpaare bis ≤ 12 Basenpaare und/oder eine Nukleotidabfolge Cytidin-Thymidin (CT) im Stamm der erste Haarnadelstruktur, die einen einzelsträngigen Bereich, einen so genannten Bulge ausbildet. In ebenfalls ganz besonders bevorzugten Ausführungsformen weisen erfindungsgemäße an aktiviertes Protein C bindende Aptamere aufweisend Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ ID NOs: 58, 88 bis 92 eine Schleife der ersten Haarnadel-Struktur mit einer Anzahl Nukleotide im Bereich von ≥ 6 Nukleotide bis ≤ 18 Nukleotide auf.In further very particularly preferred embodiments, inventive aptamers of the sequences selected from the group comprising SEQ ID NOs: 58, 88 to 92 which bind to activated protein C have a strain of the first hairpin structure in the range from ≥ 9 base pairs to ≦ 13 base pairs. preferably in the range from ≥ 11 base pairs to ≦ 12 base pairs and / or a nucleotide sequence cytidine-thymidine (CT) in the stem of the first hairpin structure, which forms a single-stranded region, a so-called bulge. In very particularly preferred embodiments, inventive activated protein C-binding aptamers comprising sequences selected from the group comprising SEQ ID NOs: 58, 88 to 92 have a loop of the first hairpin structure with a number of nucleotides in the range of ≥ 6 nucleotides to ≦ 18 Nucleotides on.

In besonders bevorzugten Ausführungsformen weist das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz auf ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

Figure DE102007063902B3_0026
Figure DE102007063902B3_0027
wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer Modifikationen aufweisen kann, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder das Aptamer modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen kann.In particularly preferred embodiments, the activated protein C-binding aptamer comprises a sequence selected from the group comprising:
Figure DE102007063902B3_0026
Figure DE102007063902B3_0027
wherein the activated protein C-binding aptamer may have modifications, preferably selected from the group comprising 5'-PEG and / or 3'-CAP modifications, and / or the aptamer-modified nucleotides, preferably selected from the group comprising Locked nucleic acids , 2'-fluoro, 2'-methoxy and / or 2'-amino-modified nucleotides may have.

In anderen Ausführungsformen weist das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz auf ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

Figure DE102007063902B3_0028
Figure DE102007063902B3_0029
In other embodiments, the activated protein C-binding aptamer comprises a sequence selected from the group comprising:
Figure DE102007063902B3_0028
Figure DE102007063902B3_0029

Überraschend konnte festgestellt werden, dass insbesondere die erfindungsgemäßen Aptamere der Sequenzen SEQ ID NOs: 58, 88 bis 92 eine sehr gute Affinität der Bindung an aktiviertes Protein C aufwiesen, wobei die durch Filterbindungsexperimente bestimmte Dissoziationskonstante KD im Bereich von ≥ 0,1 nM bis ≤ 1,3 nM lag.Surprisingly, it was found that in particular the aptamers according to the invention of the sequences SEQ ID NOs: 58, 88 to 92 had a very good affinity for binding to activated protein C, the dissociation constant K D determined by filter binding experiments ranging from ≥ 0.1 nM to ≤ 1.3 nM.

Locked-Nukleinsäuren (LNA, Locked Nucleic Acid) entsprechen einem konformationsfixierten Analogon von DNA. Die Oligonukleotide der Locked-Nukleinsäuren enthalten ein oder mehrere bizyklische Ribonukleoside, bei denen die 2'OH-Gruppe mit dem C4-Kohlenstoffatom über eine Methylengruppe verbunden ist. Vorteilhafter Weise zeigen Locked-Nukleinsäuren im Vergleich zu nicht modifizierter DNA eine höhere Stabilität gegenüber Nukleasen sowie bessere Hybridisierungseigenschaften, wodurch eine Verbesserung der Affinität und/oder Spezifität der Bindung des Aptamers erzielt werden kann.Locked nucleic acids (LNA, Locked Nucleic Acid) correspond to a conformationally fixed analogue of DNA. The oligonucleotides of the locked nucleic acids contain one or more bicyclic ribonucleosides in which the 2'OH group is linked to the C4 carbon atom via a methylene group. Advantageously, locked nucleic acids show higher stability towards nucleases as compared to unmodified DNA as well as better hybridization properties, whereby an improvement of the affinity and / or specificity of the binding of the aptamer can be achieved.

Eine weitere bevorzugte chemische Modifikation ist beispielsweise die Anfügung einer so genannten ”3'-CAP”- oder ”5'-CAP”-Struktur, eines modifizierten Guanosin-Nukleotids (7-Methyl-guanosin) an das 3'-Ende oder 5'-Ende. Die Modifikation des 3'-Endes oder 5'-Endes kann das Aptamer in vorteilhafter Weise vor einem schnellen Abbau durch Nukleasen, insbesondere in einem Organismus oder einer biologischen Probe schützen.Another preferred chemical modification is, for example, the addition of a so-called "3'-CAP" or "5'-CAP" structure, a modified guanosine nucleotide (7-methyl-guanosine) to the 3'-end or 5 ' -The End. Modification of the 3'-end or 5'-end may advantageously protect the aptamer from rapid degradation by nucleases, particularly in an organism or biological sample.

In anderen Ausführungsformen kann insbesondere das 5'-Ende des Aptamers pegyliert sein. Eine 5'-PEG-Modifikationen kann beispielsweise wenigstens eine Polyethylenglykol-Einheit umfassen, bevorzugt im Bereich von 1 bis 900 Polyethylenglykol-Einheiten, vorzugsweise im Bereich von 1 bis 450 Polyethylenglykol-Einheiten. Bevorzugt verwendbar sind lineare Polyethylenglykol(PEG)-Einheiten HO-(CH2CH2O)n-H, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 900, bevorzugt im Bereich von 1 bis 450 ist.In other embodiments, in particular, the 5'-end of the aptamer may be pegylated. For example, a 5'-PEG modification may comprise at least one polyethylene glycol unit, preferably in the range of 1 to 900 polyethylene glycol units, preferably in the range of 1 to 450 polyethylene glycol units. Preference is given to using linear polyethylene glycol (PEG) units HO- (CH 2 CH 2 O) n -H, where n is an integer in the range from 1 to 900, preferably in the range from 1 to 450.

Von Vorteil bei einer chemischen Modifikation, einer Änderung des Phosphorzuckerrückgrates oder einer Verwendung von enzymatisch nicht erkennbaren veränderten Nukleotidbausteinen ist, dass die verwendeten Nukleinsäuren gegen einen enzymatischen Abbau insbesondere in einem Organismus oder einer biologischen Probe stabilisiert sind.An advantage of a chemical modification, a change in the Phosphorzuckerrückgrates or a use of enzymatically unrecognizable altered nucleotide units is that the nucleic acids used are stabilized against enzymatic degradation, especially in an organism or a biological sample.

In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die erfindungsgemäßen Aptamere als Phosphorothioat-DNA oder peptide nucleic acid (PNA) vorliegen. Durch diese Modifikationen können die Aptamere gegen Nukleinsäure-spaltende Enzyme stabilisiert werden. Die Stabilisierung berührt die Affinität der modifizierten DNA-Aptamere nicht, kann jedoch die Zersetzung der Aptamere in einem Organismus oder einer biologischen Probe durch abbauende Enzyme wie Nukleasen oder DNasen verzögern, vermindern oder sogar verhindern.In another embodiment of the present invention, the aptamers according to the invention may be present as phosphorothioate DNA or peptide nucleic acid (PNA). These modifications allow the aptamers to be stabilized against nucleic acid-cleaving enzymes. Stabilization does not affect the affinity of the modified DNA aptamers, but may retard, diminish or even prevent the degradation of the aptamers in an organism or biological sample by degrading enzymes such as nucleases or DNases.

Vorzugsweise weisen die Nukleotide der Sequenzmotive (SEQ ID NO: 1) und/oder (SEQ ID NO: 3) keine Modifikationen auf. Bevorzugt sind Nukleotide in Stamm und/oder Schleife der Aptamere modifiziert.Preferably, the nucleotides of the sequence motifs (SEQ ID NO: 1) and / or (SEQ ID NO: 3) have no modifications. Preferably, nucleotides are modified in strain and / or loop of the aptamers.

Ein weiterer Gegenstand betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von aktiviertem Protein C in biologischen Proben, wobei wenigstens ein erfindungsgemäßes an aktiviertes Protein C bindendes Aptamer mit der biologischen Probe, vorzugsweise einer biologischen Flüssigkeit, inkubiert wird und ein Bindungsereignis zwischen dem Aptamer und aktiviertem Protein C nachgewiesen wird.A further subject relates to a method for the determination of activated protein C in biological samples, wherein at least one inventive activated protein C binding aptamer is incubated with the biological sample, preferably a biological fluid, and a binding event between the aptamer and activated protein C is detected ,

In bevorzugten Ausführungsformen ist das Verfahren ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von aktiviertem Protein C in biologischen Proben. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist das Verfahren zur Bestimmung von aktiviertem Protein C in biologischen Proben ein diagnostisches Testverfahren. Die erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere sind insbesondere in der klinischen Analytik vorteilhaft verwendbar.In preferred embodiments, the method is a method for the quantitative determination of activated protein C in biological samples. In particularly preferred embodiments, the method for determining activated protein C in biological samples is a diagnostic test procedure. The aptamers of the invention which bind to activated protein C are advantageously usable in particular in clinical analysis.

Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere wird dadurch zur Verfügung gestellt, dass diese aktiviertes Protein C mit hoher Affinität und hoher Selektivität binden können. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Aptamere spezifisch an aktiviertes Protein C gegenüber dem inaktiven Zymogen Protein C binden. Dies ermöglicht, die erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere zur Bestimmung von aktiviertem Protein C in biologischen Proben, insbesondere in Blut und anderen Körperflüssigkeiten zu verwenden. Insbesondere sind die erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere in einem routinetauglichen Testverfahren verwendbar. A particular advantage of the activated protein C binding aptamers invention is provided by the fact that these activated protein C can bind with high affinity and high selectivity. In particular, the aptamers according to the invention can specifically bind to activated protein C in relation to the inactive zymogen protein C. This makes it possible to use the activated protein C-binding aptamers according to the invention for the determination of activated protein C in biological samples, in particular in blood and other body fluids. In particular, the aptamers of the invention which bind to activated protein C can be used in a routine-suitable test procedure.

Eine ”biologische Probe” im Sinne der Erfindung ist ein bereitgestelltes oder durch Probenentnahme erhaltenes biologisches Material. Biologische Proben sind insbesondere biologische Materialien, die von humanen Individuen insbesondere Patienten isoliert werden, beispielsweise biologische Gewebe und Flüssigkeiten. Bevorzugte biologische Proben sind biologische Flüssigkeiten insbesondere Körperflüssigkeiten, vorzugsweise Blut oder Blutprodukte, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Blutplasma, Serum und/oder Vollblut. Die Proben können vorbehandelt sein, beispielsweise durch Mischen, Zugabe von Enzymen oder Markern, oder aufgereinigt sein.A "biological sample" within the meaning of the invention is a biological material provided or obtained by sampling. Biological samples are, in particular, biological materials isolated from human individuals, in particular patients, for example biological tissues and fluids. Preferred biological samples are biological fluids, in particular body fluids, preferably blood or blood products, preferably selected from the group comprising blood plasma, serum and / or whole blood. The samples may be pretreated, for example by mixing, addition of enzymes or markers, or purified.

Die Probe wird mit wenigstens einem erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamer inkubiert. Unter einer Inkubation im Sinne der Erfindung ist eine Kontaktierung der Probe, insbesondere der darin enthaltenen Verbindungen, Stoffe und Proteine, mit einem Aptamer zu verstehen.The sample is incubated with at least one aptamer binding to activated protein C according to the invention. An incubation within the meaning of the invention means contacting the sample, in particular the compounds, substances and proteins contained therein, with an aptamer.

Beispielsweise kann wenigstens ein erfindungsgemäßes an aktiviertes Protein C bindendes Aptamer der biologischen Probe, vorzugsweise einer biologischen Flüssigkeit, zugesetzt werden. Weiterhin kann die Probe mit zuvor immobilisiertem Aptamer inkubiert werden, beispielsweise durch Zugabe der Probe in eine mit Aptameren beschichtete Vertiefung einer ELISA-Platte.For example, at least one inventive aptamer binding to activated protein C may be added to the biological sample, preferably a biological fluid. Furthermore, the sample may be incubated with previously immobilized aptamer, for example by adding the sample to an aptamer-coated well of an ELISA plate.

Gelangt ein Aptamer zu seinem Zielprotein aktiviertes Protein C, bindet es an dieses. Das Bindungsereignis zwischen Aptamer und aktiviertem Protein C wird erfindungsgemäß nachgewiesen. Das Bindungsereignis kann elektrochemisch, optisch, mikrogravimetrisch, kalorimetrisch oder piezoelektrisch nachgewiesen werden.If an aptamer arrives at its target protein activated protein C, it binds to it. The binding event between aptamer and activated protein C is detected according to the invention. The binding event can be detected electrochemically, optically, microgravimetrically, calorimetrically or piezoelectrically.

Das Bindungsereignis kann auch markierungsfrei nachgewiesen werden, wobei das Aptamer beispielsweise auf einer Oberfläche fixiert und die Änderung der Schichtdicke nach Anlagerung aktiviertem Protein C bestimmt wird, beispielsweise optisch über eine Änderung des Evaneszenz-Feldes.The binding event can also be detected without labeling, wherein the aptamer is fixed, for example, on a surface and the change in the layer thickness after attachment of activated protein C is determined, for example optically via a change in the evanescent field.

Vorzugsweise wird eine Bindungsbildung zwischen Aptamer und aktiviertem Protein C in einer Indikatorreaktion nach einer direkten oder indirekten Kopplung eines Bindungspartners mit einer gut nachweisbaren Markierungssubstanz nachgewiesen. Bevorzugt ist hierfür das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer mit einer Markierung versehen.Preferably, binding formation between aptamer and activated protein C is detected in an indicator reaction following direct or indirect coupling of a binding partner with a well-detectable label. For this purpose, the aptamer binding to activated protein C is preferably provided with a label.

Die Markierung kann durch Lumineszenz, Farbreaktionen, enzymatisch, elektrochemisch oder radioaktiv nachgewiesen werden. Bevorzugt sind Markierungen durch Fluoreszenz, Chemilumineszenz oder Biolumineszenz nachweisbar. Bevorzugt ist ein Nachweis mittels Fluoreszenz. Bevorzugte Fluoreszenzfarbstoffe sind Bisbenzimidazole, die kovalent an Aptamere gekoppelt werden können. Bevorzugte Fluoreszenzfarbstoffe sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Fluoreszein, Fluoreszein-5-isothiocyanat (FITC), Carbocyanin-Farbstoffe, insbesondere Indocarbocyanin-Farbstoffe und Indodicarbocyanin-Farbstoffe, beispielsweise erhältlich unter der Handelsbezeichnung Cy3 und Cy5 bei der Firma Amersham Biosciences Europe GmbH. Verwendbar sind weiterhin n-Hydroxy-Succinimidester der Fluoreszenzfarbstoffe, beispielsweise erhältlich unter der Bezeichnung Alexa Fluor®-Farbstoffe bei der Firma Invitrogen. Verwendbare Farbstoffe zur Färbung von DNA sind beispielsweise das zu den Phenantrinen gehörende Ethidiumbromid, oder die zu den Cyaninen gehörenden SYBR-Farbstoffe (SybrGreen®) der Fa. Molecular Probes. Zur Markierung von doppelsträngiger DNA oder RNA geeignet sind weiterhin interkalierende Farbstoffe, wie Phenantrine beispielsweise Propidiumjodid.The label can be detected by luminescence, color reactions, enzymatic, electrochemical or radioactive. Preferably, labels are detectable by fluorescence, chemiluminescence or bioluminescence. Preference is given to detection by means of fluorescence. Preferred fluorescent dyes are bisbenzimidazoles which can be covalently coupled to aptamers. Preferred fluorescent dyes are selected from the group comprising fluorescein, fluorescein-5-isothiocyanate (FITC), carbocyanine dyes, in particular indocarbocyanine dyes and indodicarbocyanine dyes, for example available under the trade name Cy3 and Cy5 from Amersham Biosciences Europe GmbH. Suitable are also N-hydroxy-succinimide esters of the fluorescent dyes, such as available under the designation Alexa Fluor ® dyes at the company Invitrogen. Suitable dyes for staining of DNA, for example, which belongs to the Phenantrinen ethidium bromide, or belonging to the cyanine dyes SYBR (SYBR Green ®.) Made by Molecular Probes. Also suitable for labeling double-stranded DNA or RNA are intercalating dyes, such as phenantrins, for example, propidium iodide.

Ein Nachweis von Aptamer-gebundenem aktiviertem Protein C kann ebenfalls über die amidolytische Aktivität des aktivierten Protein C erfasst werden. Hierzu können chromogene oder fluorogene Peptidsubstrate eingesetzt werden, welche von aktiviertem Protein C gespalten werden.Detection of aptamer-linked activated protein C can also be detected via the amidolytic activity of the activated protein C. For this chromogenic or fluorogenic peptide substrates can be used, which are cleaved by activated protein C.

Des weiteren kann der Nachweis von Aptamer-gebundenem aktiviertem Protein C durch Antikörper oder markierte Antikörper erfolgen, welche in der Lage sind an aktiviertes Protein C zu binden. In besonders bevorzugten Ausführungsformen kann der Nachweis von aktiviertem Protein C durch die Zugabe der Probe zu immobiliserten Aptameren und anschließender Detektion des gebundenen aktivierten Protein C durch dessen amidolytsiche Aktivität oder über entsprechende Antikörper erfolgen.Furthermore, detection of aptamer-linked activated protein C may be by antibodies or labeled antibodies capable of binding to activated protein C. In particularly preferred embodiments, the detection of activated protein C may be accomplished by adding the sample to immobilized aptamers and subsequent detection of the bound activated protein C by its amidolytic activity or via appropriate antibodies.

Die Auswertung kann mittels entsprechenden Messgeräten, beispielsweise im Fluoreszenzmikroskop, oder durch Durchflußzytometrie, beispielsweise im Cytofluorimeter erfolgen. Eine bevorzugte chemische Markierung zur Chemilumineszenz ist Luminol. Eine bevorzugte Biolumineszenz umfasst die Emission sichtbaren Lichts als Folge einer durch Enzyme katalysierten Redoxreaktion. Weiterhin kann der Nachweis mit Enzymen als Markierungssubstanzen geführt werden, die Substrate zu farbigen Produkten umsetzen, vorzugsweise Peroxidase, Luciferase, beta-Galactosidase oder alkalische Phosphatase.The evaluation can be carried out by means of appropriate measuring devices, for example in the fluorescence microscope, or by flow cytometry, for example in the cytofluorimeter. A preferred chemical label for chemiluminescence is luminol. Preferred bioluminescence involves the emission of visible light as a result of an enzyme-catalyzed redox reaction. Furthermore, the detection can be performed with enzymes as labeling substances that convert substrates to colored products, preferably peroxidase, luciferase, beta-galactosidase or alkaline phosphatase.

Weiterhin kann der Nachweis radioaktiv über Markierung mittels radioaktiver Isotope erfolgen. Ein Nachweis kann weiterhin mittels eines so genannten ELISA (enzyme-linked immunosorbent assays) erfolgen. Die vorgenannten Verfahren schließen vorzugsweise intensive Waschschritte ein, um ungebundene und/oder unspezifisch gebundene Aptamere und/oder Nachweisreagenzien abzutrennen.Furthermore, the detection can be made radioactively via labeling by means of radioactive isotopes. Evidence can also be provided by means of a so-called ELISA (enzyme-linked immunosorbent assays). The aforementioned methods preferably include intensive washing steps to separate unbound and / or unspecifically bound aptamers and / or detection reagents.

In anderen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer an einer festen Phase immobilisiert werden, vorzugsweise über ein Spacer-Molekül. Dieses kann beispielsweise eine Linkernukleinsäure sein. Eine Immobilisierung kann mittels kovalenter Kopplung oder nicht-kovalenter Kopplung mittels geeigneter Affinitätspaare beispielsweise Biotin/Streptavidin erfolgen. Feste Phasen können ausgewählt sein aus Platten, Streifen, Membranen, Filmen, Gelen und/oder Perlen. Geeignete Trägermaterialien sind anorganische und organische Polymere, insbesondere biodegradierbare Polymere oder Biopolymere, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cellulose, Dextran, Agar, Agarose und/oder Sephadex, oder so genannte Magnetic Beads.In other embodiments of the method according to the invention, the aptamer binding to activated protein C can be immobilized on a solid phase, preferably via a spacer molecule. This may be, for example, a linker nucleic acid. Immobilization may be by means of covalent coupling or non-covalent coupling by means of suitable affinity pairs, for example biotin / streptavidin. Solid phases can be selected from plates, strips, membranes, films, gels, and / or beads. Suitable carrier materials are inorganic and organic polymers, in particular biodegradable polymers or biopolymers, preferably selected from the group comprising cellulose, dextran, agar, agarose and / or Sephadex, or so-called magnetic beads.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere zur Aufreinigung von aktiviertem Protein C. Die an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere sind beispielsweise zur Affinitätsreinigung und/oder Affinitätschromatographie geeignet.The invention furthermore relates to the use of the activated protein C-binding aptamers according to the invention for the purification of activated protein C. The aptamers which bind to activated protein C are suitable, for example, for affinity purification and / or affinity chromatography.

Die Erfindung betrifft weiterhin einen Kit umfassend wenigstens ein erfindungsgemäßes an aktiviertes Protein C bindendes Aptamer. In einer bevorzugten Ausgestaltung des Kits kann dieser signalgebende Substanzen oder Vorrichtungen enthalten, vorzugsweise Fluororeszenzfarbstoffe, Chemilumineszenz-Cofaktoren, Enzymsubstrate oder markierte Antikörper.The invention furthermore relates to a kit comprising at least one aptamer which binds to activated protein C according to the invention. In a preferred embodiment of the kit, it may contain signaling substances or devices, preferably fluorescent dyes, chemiluminescent cofactors, enzyme substrates or labeled antibodies.

Eine Verwendung der erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere ermöglicht in vorteilhafter Weise insbesondere Diagnoseverfahren zur Bestimmung der Konzentration an aktiviertem Protein C in der Hämostase-Diagnostik und der erweiterten Sepsisdiagnostik. Weiterhin ermöglicht eine Verwendung der erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere in der Diagnostik eine Bestimmung einer gestörten Konzentration an aktiviertem Protein C und somit eine Diagnostik von Erkrankungen, die mit einer Störung des Systems Protein C/aktiviertes Protein C einhergehen.Use of the activated protein C-binding aptamers according to the invention advantageously makes it possible, in particular, to use diagnostic methods for determining the concentration of activated protein C in hemostasis diagnostics and advanced sepsis diagnostics. Furthermore, use of the activated protein C-binding aptamers according to the invention in diagnosis makes it possible to determine a disturbed concentration of activated protein C and thus to diagnose diseases which are associated with a disruption of the protein C / activated protein C system.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere zur Diagnose, therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Blutgerinnung in Zusammenhang stehen, Blutungserkrankungen, vorzugsweise hämorrhagischen Diathesen, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Hämophilie, insbesondere Hämophilie A, und/oder von Willebrand-Syndrom, und/oder Blutungskomplikationen, die durch eine erhöhte Konzentration an aktiviertem Protein C ausgelöst werden.The invention further relates to the use of the activated protein C-binding aptamers according to the invention for the diagnosis, therapeutic and / or prophylactic treatment of disorders associated with impaired blood clotting, bleeding disorders, preferably hemorrhagic diatheses, preferably selected from the group comprising hemophilia , in particular hemophilia A, and / or von Willebrand syndrome, and / or bleeding complications, which are triggered by an increased concentration of activated protein C.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamers, dessen pharmakologisch akzeptablen Salzen, Derivaten und/oder Konjugaten, zur Herstellung eines Arzneimittels.The invention further relates to the use of an inventive activated protein C binding aptamer, its pharmacologically acceptable salts, derivatives and / or conjugates, for the manufacture of a medicament.

Die erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere sind geeignet mit hoher Affinität an aktiviertes Protein C zu binden und dessen Aktivität zu modulieren, insbesondere zu inhibieren. Insbesondere sind die erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere der Sequenzen SEQ ID NOs: 58, 88 bis 92, geeignet, die antikoagulatorische Enzymaktivität von aktiviertem Protein C zu blockieren.The activated protein C binding aptamers according to the invention are suitable to bind with high affinity to activated protein C and to modulate its activity, in particular to inhibit. In particular, the activated protein C-binding aptamers of the invention of SEQ ID NOs: 58, 88 to 92, are capable of blocking the activated protein C anticoagulant enzyme activity.

Darüber hinaus konnte festgestellt werden, dass insbesondere die erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere der Sequenzen SEQ ID NOs: 58, 88 bis 92 geeignet sind, eine allosterische Konformationsänderung im Molekül des aktivierten Proteins C zu induzieren. Ohne auf eine bestimmte Theorie festgelegt zu sein, wird angenommen, dass diese allosterische Konformationsänderung die Inaktivierung von aktiviertem Protein C durch den physiologischen Inhibitor Protein C-Inhibitor verstärken kann. Weiterhin wird ohne auf eine bestimmte Theorie festgelegt zu sein angenommen, dass die durch die erfindungsgemäßen Aptamere induzierte allosterische Konformationsänderung von aktiviertem Protein C zu einer Bildung von Komplexen des aktivierten Protein C mit Protein C-Inhibitor führt.In addition, it has been found that, in particular, the activated protein C-binding aptamers according to the invention of the sequences SEQ ID NOs: 58, 88 to 92 are suitable for inducing an allosteric conformational change in the molecule of the activated protein C. Without being bound to any particular theory, it is believed that this allosteric conformational change is the inactivation of activated protein C by the physiological inhibitor may enhance protein C inhibitor. Furthermore, without being bound by any particular theory, it is assumed that the allosteric conformational change of activated protein C induced by the aptamers according to the invention leads to the formation of complexes of the activated protein C with protein C inhibitor.

Eine Verabreichung der erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere, deren pharmakologisch akzeptablen Salzen, Derivaten und/oder Konjugaten ermöglicht in vorteilhafter Weise eine therapeutische Beeinflussung der Aktivität von aktiviertem Protein C.Administration of the activated protein C-binding aptamers according to the invention, their pharmacologically acceptable salts, derivatives and / or conjugates advantageously makes it possible to therapeutically influence the activity of activated protein C.

Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung eines erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindenden Aptamers, dessen pharmakologisch akzeptablen Salzen, Derivaten und/oder Konjugaten, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Diagnose, therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Blutgerinnung in Zusammenhang stehen, Blutungserkrankungen, vorzugsweise hämorrhagischen Diathesen, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Hämophilie, insbesondere Hämophilie A, und/oder von Willebrand-Syndrom, und/oder Blutungskomplikationen, die durch eine erhöhte Konzentration an aktiviertem Protein C ausgelöst werden.More particularly, the invention relates to the use of an activated protein C-binding aptamer of the invention, its pharmacologically acceptable salts, derivatives and / or conjugates, for the manufacture of a medicament for the diagnosis, therapeutic and / or prophylactic treatment of disorders associated with impaired blood clotting Bleeding disorders, preferably hemorrhagic diatheses, preferably selected from the group comprising hemophilia, in particular hemophilia A, and / or von Willebrand syndrome, and / or bleeding complications, which are triggered by an increased concentration of activated protein C.

Blutungskomplikationen, die durch eine erhöhte Konzentration an aktiviertem Protein C ausgelöst werden, sind insbesondere Blutungen, die als Folge einer Überdosierung mit aktiviertem Protein C auftreten oder Blutungen, die in Folge einer gesteigerten Bildung von aktiviertem Protein C als Folge einer sekundären Thrombinämie auftreten.Bleeding complications that are triggered by an increased concentration of activated protein C are, in particular, bleeding that occurs as a result of overactivation with activated protein C, or bleeding that occurs as a result of increased production of activated protein C as a result of secondary thrombinemia.

Rekombinat hergestelltes aktiviertes Protein C wird beispielsweise in der Behandlung der schweren Sepsis verwendet. Insbesondere sind erfindungsgemäße an aktiviertes Protein C bindende Aptamere geeignet, als Antidot für rekombinates aktiviertes Protein C im Falle einer absoluten oder relativen Überdosierung und dadurch ausgelösten Blutungen, zu wirken. Weiterhin sind erfindungsgemäße an aktiviertes Protein C bindende Aptamere insbesondere geeignet, als Surrogattherapeutikum in der Substitution mit Faktor VIII-Konzentrat bei Patienten mit Hamophilie A. Insbesondere kann durch die erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindende Aptamere die Halbwertszeit und/oder Wirksamkeit des Faktor VIII-Konzentrats verbessert werden. Weiterhin sind erfindungsgemäße an aktiviertes Protein C bindende Aptamere insbesondere zur Behandlung erworbener hämorrhagischer Diathesen, die durch eine überschießende Bildung von aktiviertem Protein C als Folge einer generalisierten Thrombinbildung entstehen können, geeignet. Eine derartige Konstellation kann beispielsweise bei Patienten nach kardiochirurgischen Eingriffen vorliegen.Recombinant-produced activated protein C is used, for example, in the treatment of severe sepsis. In particular, aptamers according to the invention which bind to activated protein C are suitable for acting as an antidote for recombinant activated protein C in the case of absolute or relative overdosage and thereby triggered bleeding. Furthermore, aptamers according to the invention which bind to activated protein C are particularly suitable as surrogate therapeutics in the substitution with factor VIII concentrate in patients with hemophilia A. In particular, the aptamers binding to activated protein C according to the invention may have the half-life and / or efficacy of the factor VIII concentrate be improved. Furthermore, aptamers according to the invention which bind to activated protein C are particularly suitable for the treatment of acquired hemorrhagic diatheses, which can arise as a result of excessive formation of activated protein C as a consequence of generalized thrombin formation. Such a constellation can be present for example in patients after cardiac surgery.

Insbesondere sind erfindungsgemäße an aktiviertes Protein C bindende Aptamere zur diagnostischen und/oder therapeutischen Behandlung von Patienten geeignet, die mit Konzentraten von aktiviertem Protein C behandelt werden, oder die durch das Überwiegen des gerinnungshemmend wirkenden aktivierten Proteins C eine Blutungsneigung aufweisen. Weiterhin sind erfindungsgemäße an aktiviertes Protein C bindende Aptamere geeignet, zur Behandlung von Patienten mit einem angeborenen Mangel des Blutgerinnungsfaktors VIII, wobei durch Verabreichen der erfindungsgemäßen an aktiviertes Protein C bindende Aptamere die Halbwertzeit und Effektivität von verabreichtem Faktor VIII-Konzentrat verbessert werden kann.In particular, activated protein C-binding aptamers of the present invention are useful for the diagnostic and / or therapeutic treatment of patients treated with activated protein C concentrates, or who are prone to bleeding by the predominance of the anticoagulant activated protein C. Further, activated protein C-binding aptamers of the present invention are useful for treating patients with a congenital deficiency of blood coagulation factor VIII, and by administering the activated protein C-binding aptamers of the invention, the half-life and effectiveness of administered factor VIII concentrate can be improved.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Arzneimittel umfassend erfindungsgemäße an aktiviertes Protein C bindende Aptamere. Das Arzneimittel umfasst erfindungsgemäße an aktiviertes Protein C bindende Aptamere vorzugsweise als pharmakologisch akzeptables Salz, bevorzugt als Salze anorganischer Säuren, beispielsweise Phosphorsäure, oder als Salze organischer Säuren beispielsweise Salzsäure oder Schwefelsäure. Arzneimittel können weiterhin pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffen und/oder Träger umfassen.The invention further relates to medicaments comprising aptamers according to the invention which bind to activated protein C. The medicament comprises inventive aptamers which bind to activated protein C, preferably as a pharmacologically acceptable salt, preferably as salts of inorganic acids, for example phosphoric acid, or as salts of organic acids, for example hydrochloric acid or sulfuric acid. Pharmaceuticals may further comprise pharmaceutically acceptable excipients and / or carriers.

In vorteilhafter Weise ist das Arzneimittel zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Blutgerinnung in Zusammenhang stehen, Blutungserkrankungen, vorzugsweise hämorrhagischen Diathesen bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Hämophilie, insbesondere Hämophilie A, und/oder von Willebrand-Syndrom, und/oder Blutungskomplikationen, die durch eine erhöhte Konzentration an aktiviertem Protein C ausgelöst werden, geeignet.Advantageously, the medicament is for the prophylactic or therapeutic treatment of disorders associated with disturbed blood clotting, bleeding disorders, preferably hemorrhagic diatheses preferably selected from the group comprising hemophilia, in particular hemophilia A, and / or von Willebrand syndrome, and / or bleeding complications triggered by an increased concentration of activated protein C.

Das Arzneimittel ist oral, transmucosal, rektal, pulmonal, enteral und/oder parenteral verabreichbar. Bevorzugt ist eine Verabreichung durch Injektion.The drug is orally, transmucosally, rectally, pulmonarily, enterally and / or parenterally administrable. Preference is given to administration by injection.

Wenn nicht anders ausgeführt, weisen die verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke die Bedeutung auf, wie sie gemeinhin von einem Durchschnittsfachmann in dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden wird.Unless otherwise stated, the technical and scientific terms used are as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs.

Alle Veröffentlichungen, Patentanmeldungen, Patente und weiteren hier angegebenen Literaturangaben sind voll inhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen. All publications, patent applications, patents, and other references cited herein are incorporated by reference in their entirety.

Beispiele und Figuren, die der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung dienen, sind nachstehend angegeben.Examples and figures which serve to illustrate the present invention are given below.

In den Figuren zeigt:In the figures shows:

1 Sequenzen von DNA-Aptameren, die an aktiviertes Protein C binden. Die Sequenz der 1a entspricht der Sequenz SEQ ID NO: 58, die Sequenz der 1b entspricht der Sequenz SEQ ID NO: 88. Die Sequenzen weisen jeweils eine Konsensussequenz SEQ ID NO. 1 auf. 1 Sequences of DNA aptamers that bind to activated protein C. The sequence of 1a corresponds to the sequence SEQ ID NO: 58, the sequence of 1b corresponds to the sequence SEQ ID NO: 88. The sequences each have a consensus SEQ ID NO. 1 on.

2 Sequenzen von DNA-Aptameren, die an aktiviertes Protein C binden. Die Sequenz der 2a entspricht der Sequenz SEQ ID NO: 89, die Sequenz der 2b entspricht der Sequenz SEQ ID NO: 90, die Sequenz der 2c entspricht der Sequenz SEQ ID NO: 91, und die Sequenz der 2d entspricht der Sequenz SEQ ID NO: 92. Die Sequenzen weisen jeweils eine Konsensussequenz SEQ ID NO. 1 auf. 2 Sequences of DNA aptamers that bind to activated protein C. The sequence of 2a corresponds to the sequence SEQ ID NO: 89, the sequence of 2 B corresponds to the sequence SEQ ID NO: 90, the sequence of 2c corresponds to the sequence SEQ ID NO: 91, and the sequence of 2d corresponds to the sequence SEQ ID NO: 92. The sequences each have a consensus SEQ ID NO. 1 on.

Die Berechnung der Sekundärstrukturen basierte auf dem im Internet verfügbaren Faltungsprogramm mfold, M. Zuker, Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction, Nucleic Acid Res. 31 (13), 3406–15 (2003).The computation of secondary structures was based on the folding program available on the Internet, mfold, M. Zuker, Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction, Nucleic Acid Res. 31 (13), 3406-15 (2003).

Beispiel 1example 1

In-vitro Selektion (SELEX®/Counter-SELEX®)In vitro selection (SELEX ® / Counter-SELEX ® )

Zur Selektion von DNA-Aptameren gegen aktiviertes Protein C (APC) wurde als APC-Quelle das als Medikament bei schwerer Sepsis eingesetzte Drotrecogin Alpha (Xigris®) verwendet. Zur für die Selektion notwendigen Immobilisierung der Ziel-Proteine wurden 100 μg des APC biotinyliert und an Streptavidin-beschichtete, magnetische Beads gekoppelt (Dynabeads M-280 Streptavidin [Dynal, Invitrogen]). Zur Biotinylierung wurde bezüglich der eingesetzten APC-Moleküle ein 3fach molarer Überschuss an NHS-Biotin verwendet (Pierce, Rockford, USA). Die Inkubation erfolgte in PBS-Puffer (1 × PBS, pH 7,4) in einem Gesamtvolumen von 100 μl für 30 min auf Eis und anschließend für 10 min bei Raumtemperatur (RT). Nicht-gebundenes NHS-Biotin wurde anschließend mittels Säulchen-Chromatographie entfernt (Micro Bio-Spin 6 Chromatography columns, Biorad, München, Deutschland). Das auf diese Weise gewonnene biotinylierte APC wurde mit 5 mg der magnetischen Beads in einem Gesamtvolumen von 600 μl PBS (0,1% BSA) für 30 min bei RT unter ständiger Bewegung inkubiert. Anschließend wurden die Beads 1× mit 500 μl PBS (0,1% BSA) gewaschen und letztlich in 1 ml PBS (0,1% BSA) aufgenommen. Als DNA-Aptamer-Startbibliothek wurde der sogenannte D1-Pool mit einer 49-Basen-langen, von zwei Primerbindungsstellen flankierten, variablen Sequenzregion eingesetzt (5'-GCCTGTTGTGAGCCTCCTAAC-N49-CATGCTTATTCTTGTCTCCC-3' SEQ ID NO: 95). Dieser wurde von der Firma Metabion (Martinsried, Deutschland) synthetisiert und HPLC-gereinigt erhalten.For the selection of DNA aptamers to activated protein C (APC) the drotrecogin alpha (Xigris ®) used as a medicament in severe sepsis was used as APC source. For the immobilization of the target proteins necessary for the selection, 100 μg of the APC were biotinylated and coupled to streptavidin-coated magnetic beads (Dynabeads M-280 streptavidin [Dynal, Invitrogen]). For biotinylation, a 3-fold molar excess of NHS-biotin was used with respect to the APC molecules used (Pierce, Rockford, USA). The incubation was carried out in PBS buffer (1 × PBS, pH 7.4) in a total volume of 100 μl for 30 min on ice and then for 10 min at room temperature (RT). Unbound NHS-biotin was subsequently removed by column chromatography (Micro Bio-Spin 6 Chromatography columns, Biorad, Munich, Germany). The biotinylated APC thus obtained was incubated with 5 mg of the magnetic beads in a total volume of 600 μl PBS (0.1% BSA) for 30 min at RT under constant agitation. Subsequently, the beads were washed 1 × with 500 μl PBS (0.1% BSA) and finally taken up in 1 ml PBS (0.1% BSA). The DNA aptamer start library used was the so-called D1 pool with a 49-base long variable sequence region flanked by two primer binding sites (5'-GCCTGTTGTGAGCCTCCTAAC-N 49 -CATGCTTATTCTTGTCTCCC-3 'SEQ ID NO: 95). This was synthesized by the company Metabion (Martinsried, Germany) and obtained by HPLC purification.

Initial wurden 500 pmol des D1-Pools mit 80 μl (8 μg) immobilisiertem APC in einem Gesamtvolumen von final 160 μl in Selektionspuffer (1 × PBS, pH 7,4, 0,1% BSA, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2) inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Beads 1× mit 150 μl Selektionspuffer gewaschen und gebundene DNA bei 80°C in 55 μl Aqua eluiert. Der so selektierte Pool wurde anschließend mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in 5 getrennten 100 μl Reaktionen (jeweils 90 μl Mastermix + 10 μl Probe) unter Verwendung der Primer (HPLC-pure, Metabion) 5'-GCCTGTTGTGAGCCTCCTAAC-3' (forward, SEQ ID NO: 86) und 5'-GGGAGACAAGAATAAGCATG-3' (Reverse, SEQ ID NO: 96), mit 5'-Biotin-Modifikation) amplifiziert und anschließend eine Einzelstrangtrennung durchgeführt. Hierzu wurden die PCR-Produkte über die an das 5'-Ende der Reverse-Primer gekoppelten Biotin-Moleküle an die bereits beschriebenen magnetischen Beads gebunden. Hierbei wurden die Beads (500 μl [5 mg] je Einzelstrangtrennung) zuerst 3× mit jeweils 1000 μl BW-Puffer (5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1,0 M NaCl) gewaschen und anschließend in 500 μl 2 × BW-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,0 mM EDTA, 2,0 M NaCl) aufgenommen. Nach Zugabe der PCR-Produkte (5 × 100 μl) wurde diese Ansätze für 45 Minuten bei RT unter ständiger Bewegung inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Beads jeweils 2× mit BW-Puffer und 1× mit 2 × BW-Puffer gewaschen (jeweils 1000 μl) um nicht gebundene Bestandteile der PCR-Reaktionsmixe zu entfernen. Anschließend wurden die Beads in 50 μl 0,1 M NaOH aufgenommen und für 3 Minuten bei RT inkubiert. Nach der Immobilisierung der Beads wurden die in der NaOH-Lösung befindlichen Aptamere in ein neues Reaktionsgefäß überführt und der Vorgang mit weiteren 50 μl NaOH wiederholt. Zur Neutralisation des pH-Wertes wurde eine im Vorfeld optimierte Menge einer 0,1 molaren HCl-Lösung zu der Aptamer-Lösung pipettiert. Nach Durchführung der vorstehend beschriebenen Einzelstrangtrennung wurden 50 pmol der so gewonnenen Aptamere in den nächsten Selektionszyklus eingesetzt. Zur Erhöhung der Spezifität wurde ab der dritten Runde ein Counter-Selex gegen die verwendeten Streptavidin-Beads durchgeführt und die Anzahl der Waschschritte nach Bindung der Aptamere an das immobilisierte APC schrittweise erhöht. Aufgrund der durch die Selektion bedingten Anreicherung APC-bindender Aptamer-Sequenzen wurde die Anzahl der zur Amplifikation durchgeführten PCR-Zyklen nach jedem Selektionszyklus neu angepasst. Insgesamt wurden 12 Selektionszyklen durchgeführt. Eine Übersicht der während der Selektion variierten Parameter findet sich in Tabelle 1. Tabelle 1. Übersicht zu den gewählten Selektionsparametern Runde Einsatz ssDNA Counter-SELEX Waschschritte PCR-Zyklen [#] [pmol] [ja/nein] [Anzahl] [Anzahl] 1 500 nein 1 18 2 50 nein 2 18 3 50 ja 4 18 4 50 ja 8 18 5 50 ja 8 12 6 50 ja 8 9 7 50 ja 8 12 8 50 ja 8 12 9 50 ja 8 11 10 50 ja 8 10 11 50 ja 8 9 12 50 ja 8 10 Initially, 500 pmol of the D1 pool was incubated with 80 μl (8 μg) of immobilized APC in a final final volume of 160 μl in selection buffer (1X PBS, pH 7.4, 0.1% BSA, 1mM MgCl 2 , 1mM CaCl 2 ) incubated. After incubation, the beads were washed 1 × with 150 μl of selection buffer and bound DNA was eluted at 80 ° C. in 55 μl of aqua. The pool selected in this way was subsequently separated by means of polymerase chain reaction (PCR) into 5 separate 100 μl reactions (90 μl master mix + 10 μl sample each) using the primers (HPLC-pure, Metabion) 5'-GCCTGTTGTGAGCCTCCTAAC-3 '(forward, SEQ ID NO: 86) and 5'-GGGAGACAAGAATAAGCATG-3 '(reverse, SEQ ID NO: 96), amplified with 5'-biotin modification), followed by single-strand separation. For this purpose, the PCR products were bound to the already described magnetic beads via the biotin molecules coupled to the 5 'end of the reverse primer. Here, the beads (500 .mu.l [5 mg] per single-strand separation) were first washed 3 times with 1000 .mu.l BW buffer (5 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 1.0 M NaCl) and then taken up in 500 μl 2 x BW buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1.0 mM EDTA, 2.0 M NaCl). After addition of the PCR products (5 × 100 μl), these mixtures were incubated for 45 minutes at RT under constant agitation. After incubation, the beads were washed 2X each with BW buffer and 1X with 2X BW buffer (1000μl each) to remove unbound components of the PCR reaction mixes. Subsequently, the beads were taken up in 50 μl of 0.1 M NaOH and incubated for 3 minutes at RT. After immobilization of the beads, the aptamers in the NaOH solution were transferred to a new reaction vessel and the process was repeated with a further 50 μl of NaOH. To neutralize the pH, a pre-optimized amount of a 0.1 molar HCl solution was pipetted to the aptamer solution. After carrying out the above-described single-strand separation were 50 pmol of the aptamers thus obtained are used in the next selection cycle. To increase the specificity, a counter-selex was carried out against the streptavidin beads used from the third round and the number of washing steps after binding of the aptamers to the immobilized APC was increased stepwise. Because of the selection-related enrichment of APC-binding aptamer sequences, the number of PCR cycles performed for amplification was readjusted after each selection cycle. In total, 12 selection cycles were performed. An overview of the parameters varied during the selection can be found in Table 1. Table 1. Overview of the selected selection parameters round Use ssDNA Counter-SELEX washes PCR cycles [#] [Pmol] [Yes No] [Number] [Number] 1 500 No 1 18 2 50 No 2 18 3 50 Yes 4 18 4 50 Yes 8th 18 5 50 Yes 8th 12 6 50 Yes 8th 9 7 50 Yes 8th 12 8th 50 Yes 8th 12 9 50 Yes 8th 11 10 50 Yes 8th 10 11 50 Yes 8th 9 12 50 Yes 8th 10

Beispiel 2Example 2

Klonierung and SequenzierungCloning and sequencing

Zur Analyse der Sequenzen der selektierten Aptamere wurde der nach 10 Selektionsrunden gewonnene Aptamer-Pool (Einzelstrang-DNA) re-amplifiziert (5 Zyklen mit Primern 5'-GCCTGTTGTGAGCCTCCTAAC-3' (forward, SEQ ID NO: 86) und 5'-GGGAGACAAGAATAAGCATG-3' (Reverse, SEQ ID NO: 96), in 100 μl Reaktionsgesamtvolumen bei Einsatz von 0,75 pmol Einzelstrang-DNA) und die so hergestellten PCR-Produkte mittels TA-Cloning in pCR II-Vektoren (TA Cloning® Kit, Invitrogen) ligiert. Anschließend wurden chemisch kompetente E.coli-Zellen (XL-10 Gold, Stratagene) mit den Vektoren transformiert und auf LB-Agar mit 100 μg/ml Ampicillin ausplattiert. Von den über Nacht bei Inkubation bei 37°C entstandenen colony forming units (CFU) wurde eine Auswahl in 5 ml Suspensionskulturen (LB mit 100 μg/ml Ampicillin) unter ständiger Bewegung über Nacht bei 37°C weiter vermehrt und die Vektoren nach Zentrifugation der Zellen bei 5.000 rpm/min für 15 min mittels des QIAprep Spin Mini Kit (Qiagen) aufgereinigt. Die Sequenzierung der Vektor-Inserts (Aptamer-Sequenzen) erfolgte unter Verwendung von M13-Sequenzierprimern mittels eines ABI 3130xl Genetic Analyzer.To analyze the sequences of the selected aptamers, the aptamer pool (single-stranded DNA) obtained after 10 rounds of selection was re-amplified (5 cycles with primers 5'-GCCTGTTGTGAGCCTCCTAAC-3 '(forward, SEQ ID NO: 86) and 5'-GGGAGACAAGAATAAGCATG -3 '(reverse, SEQ ID NO: 96) in 100 .mu.l total reaction volume with the use of 0.75 pmol single-stranded DNA) and the PCR products thus produced by TA cloning into pCR II vector (TA Cloning ® Kit, Invitrogen). Subsequently, chemically competent E. coli cells (XL-10 Gold, Stratagene) were transformed with the vectors and plated on LB agar with 100 μg / ml ampicillin. Of the colony-forming units (CFU) produced overnight at 37 ° C., a selection in 5 ml suspension cultures (LB containing 100 μg / ml ampicillin) was further propagated with constant movement overnight at 37 ° C. and the vectors after centrifugation of the Purify cells at 5,000 rpm for 15 min using the QIAprep Spin Mini Kit (Qiagen). Sequencing of the vector inserts (aptamer sequences) was performed using M13 sequencing primers using an ABI 3130xl Genetic Analyzer.

Beispiel 3Example 3

Bestimmung der Dissoziationskonstante KD einzelner an aktiviertes Protein C bindender Aptamere (Filterbindungstests)Determination of the dissociation constant K D of individual to activated protein C binding aptamers (filter binding assays)

Zur Überprüfung der APC-Bindungseigenschaften wurden die zu untersuchenden Aptamere mittels einer Polynukleotid-Kinase (PNK) am 5'-Ende mit 32p-ATP markiert. Hierzu wurden 5 pmol der Aptamere mit 10 μCi 32p-ATP in Anwesenheit von 10 U PNK in einem Gesamtvolumen von 10 μl für 45 min bei 37°C inkubiert. Zur Entfernung von ungebundenem 32p-ATP wurden die Ansätze anschließend mit 40 μl Aqua versetzt und über G25-Säulen (Microspin G-25 Colums, Amersham) aufgereinigt. Die so radioaktiv-markierten Aptamere wurden in einer Konzentration von final 0,4 nM in Selektionspuffer mit verschiedenen Konzentrationen an APC, ausgehend vont 100 nM und nachfolgende, halb-logarithmische Verdünnungsstufen, in einem Gesamtvolumen von 25 μl für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden jeweils 20 μl der Ansätze mittels eines Vakuumsystems über eine Nitrozellulose-Membran (Schleicher und Schuell, 0,45 μM) filtriert. Anschließend erfolgten mehrere Waschschritte (4 × 200 μl) mit Waschpuffer (1 × PBS, pH 7,4, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2) um überschüssige, nicht-proteingebundene Radioaktivität von der Membran zu entfernen. Die Aufnahme der jeweiligen Strahlungsintensitäten erfolgte mittels eines Phosphor-Screens. Zur Auswertung der Daten wurde ein FUJIFILM FLA-3000 mit entsprechender AIDA Imagequant Software verwendet. Durch nicht-lineare Regression der erhaltenen Datenpunkte, der gebundenen Radioaktivität über APC-Konzentration, konnten die einzelnen KDs ermittelt werden. Zur Berechnung wurde die Funktion ”Logistische Dosisantwort in Pharmakologie/Chemie” der Software Origin 7.5 (OriginLab, Northampton, MA, USA) verwendet.To test the APC binding properties, the aptamers to be tested were labeled with 32 p-ATP at the 5 'end using a polynucleotide kinase (PNK). For this purpose, 5 pmol of the aptamers were incubated with 10 .mu.Ci 32 p-ATP in the presence of 10 U PNK in a total volume of 10 .mu.l for 45 min at 37.degree. To remove unbound 32 P-ATP, the batches were then treated with 40 ul of Aqua and purified on G25 columns (Microspin G-25 Colums, Amersham). The thus radiolabelled aptamers were incubated at a final concentration of 0.4 nM in selection buffer with various concentrations of APC starting at 100 nM and subsequent half-log dilution steps in a total volume of 25 μl for 30 minutes at 37 ° C , After the incubation, in each case 20 μl of the mixtures were filtered by means of a vacuum system over a nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, 0.45 μM). Subsequently several washes (4 x 200 μl) with wash buffer (1 x PBS, pH 7.4, 1 mM MgCl 2 , 1 mM CaCl 2 ) to remove excess non-protein bound radioactivity from the membrane. The recording of the respective radiation intensities took place by means of a phosphor screen. To evaluate the data, a FUJIFILM FLA-3000 with corresponding AIDA Imagequant software was used. By non-linear regression of the data points obtained, the radioactivity bound to APC concentration, the individual K D s could be determined. For the calculation, the function "Logistic Dose Response in Pharmacology / Chemistry" of the software Origin 7.5 (OriginLab, Northampton, MA, USA) was used.

Hinsichtlich der Bindung einzelner Aptamere an das zur Selektion verwendete Xigris® konnten mit der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise folgende KDs ermittelt werden: Versuchsserie 1: Testung einzelner Aptamer aus dem nach 10 Selektionsrunden erhaltenen Aptamer-Pool Aptamer SEQ ID NO: HS02 (SEQ ID NO: 58): 0,12 ± 0,02 nM HS03 (SEQ ID NO: 70): 0,19 ± 0,03 nM HS04 (SEQ ID NO: 49): 0,21 ± 0,02 nM HS08 (SEQ ID NO: 83): 0,30 ± 0,09 nM Versuchsserie 2: Testung von auf (SEQ ID NO: 58) basierenden Aptamer-Varianten Aptamer SEQ ID NO: HS02-88 (SEQ ID NO: 58): 0,43 ± 0,08 nM HS02-62 (SEQ ID NO: 88): 0,56 ± 0,13 nM HS02-52 (SEQ ID NO: 89): 0,35 ± 0,09 nM HS02-52G (SEQ ID NO: 90): 0,47 ± 0,11 nM HS02-48G (SEQ ID NO: 91): 0,40 ± 0,13 nM HS02-44G (SEQ ID NO: 92): 0,17 ± 0,06 nM With regard to the binding of individual aptamers to the used for selection Xigris ® following K D s could be determined using the procedure described above: Test series 1: screening of individual aptamer from the obtained after 10 rounds of selection aptamer pool aptamer SEQ ID NO: HS02 (SEQ ID NO: 58): 0.12 ± 0.02 nM HS03 (SEQ ID NO: 70): 0.19 ± 0.03 nM HS04 (SEQ ID NO: 49): 0.21 ± 0.02 nM HS08 (SEQ ID NO: 83): 0.30 ± 0.09 nM Test Series 2: Testing of aptamer variants based on (SEQ ID NO: 58) aptamer SEQ ID NO: HS02-88 (SEQ ID NO: 58): 0.43 ± 0.08 nM HS02-62 (SEQ ID NO: 88): 0.56 ± 0.13 nM HS02-52 (SEQ ID NO: 89): 0.35 ± 0.09 nM HS02-52G (SEQ ID NO: 90): 0.47 ± 0.11 nM HS02-48G (SEQ ID NO: 91): 0.40 ± 0.13 nM HS02-44G (SEQ ID NO: 92): 0.17 ± 0.06 nM

Es zeigte sich, dass die an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere sehr gute Dissoziationskonstanten für die Bindung an aktiviertes Protein C aufwiesen.It was shown that the activated protein C binding aptamers had very good dissociation constants for binding to activated protein C.

Beispiel 4Example 4

Bestimmung der Spezifität einzelner an aktiviertes Protein C bindender AptamereDetermination of specificity of individual activated protein C binding aptamers

Die Ermittlung der APC-Spezifität der Varianten SEQ ID NO: 58 und 88 bis 92 erfolgte durch die Inkubation unterschiedlicher Konzentrationen von nativem APC (aus Plasma gereinigtes PC [Ceprotin®, Baxter], welches mit humanem alpha-Thrombin [Cellsystems, St. Katharinen, Deutschland] aktiviert wurde), PC (Ceprotin®), alpha-Thrombin (Cellsystems), Faktor VIIa (NovoSeven®, Novo Nordisk), Faktor Xa (Cellsystems) und FIXa (Cellsystems) mit radioaktiv-markierten Aptameren der Sequenzen SEQ ID NO: 58, 88 bis 92 und anschließendem Filterbindungsexperiment wie unter Beispiel 3 beschrieben. Hierbei wurde das native APC in einer halblogarithmischen Verdünnungsreihe startend von 100 nM und das Zymogen PC ebenfalls in einer halblogarithmischen Verdünnungsreihe allerdings startend von 1000 nM eingesetzt. Alpha-Thrombin, Faktor VIIa, Faktor Xa und FIXa wurden jeweils in Konzentrationen von 320 nM, 32 nM und 3,2 nM getestet.The determination of the APC specificity of the variants SEQ ID NO: 58 and 88 to 92 was carried out by incubation of different concentrations of native APC (plasma purified PC [Ceprotin ® , Baxter], which with human alpha-thrombin [Cellsystems, St. Katharinen , Germany] was activated), PC (Ceprotin ®), alpha-thrombin (Cell Systems), factor VIIa (NovoSeven ®, Novo Nordisk), factor Xa (Cell Systems) and FIXa (Cell Systems) with radioactively-labeled aptamers of the sequences SEQ ID NO : 58, 88 to 92 and subsequent filter binding experiment as described in Example 3. Here, the native APC was used in a semilogarithmic dilution series starting from 100 nM and the zymogen PC also in a semilogarithmic dilution series starting from 1000 nM. Alpha-thrombin, Factor VIIa, Factor Xa and FIXa were each tested at concentrations of 320 nM, 32 nM and 3.2 nM.

Bis zu einer Konzentration von 320 nM konnte bezüglich Alpha-Thrombin, Faktor VIIa, Faktor Xa und FIXa keinerlei Bindung der Aptamere beobachtet werden. Zwar wurde eine Bindung aller Aptamere an PC beobachtet, die KDs waren jedoch nicht quantitativ bestimmbar, lagen aber in allen Fällen bei > 320 nM. Untersuchungen mit einem fluorogenen Peptidsubstrat lassen darauf schließen, dass ein zumindest ein Teil der beobachteten Bindung der Aptamere auf eine Verunreinigung des verwendeten PC (Ceprotin®) mit APC zurückzuführen ist.Up to a concentration of 320 nM, no binding of the aptamers was observed with respect to alpha-thrombin, factor VIIa, factor Xa and FIXa. Although binding of all aptamers to PC was observed, the K D s were not quantifiable, but were> 320 nM in all cases. Studies using a fluorogenic peptide substrate suggest that at least part of the observed binding of aptamers to a contamination of the PC used (Ceprotin ®) is due to APC.

Neben der Bindung an Xigris® konnte für die mit hoher Affinität bindenden HS02-Varianten SEQ ID NO: 58 und 88 bis 92 auch eine effektive Bindung an natives APC (aktiviertes Ceprotin®) bestätigt werden. Die ermittelten KDs lagen hierbei bei: Aptamer SEQ ID NO: HS02-88 (SEQ ID NO: 58): 0,47 ± 0,06 nM HS02-62 (SEQ ID NO: 88): 1,06 ± 0,23 nM HS02-52 (SEQ ID NO: 89): 0,97 ± 0,18 nM HS02-52G (SEQ ID NO: 90): 0,74 ± 0,26 nM HS02-48G (SEQ ID NO: 91): 0,85 ± 0,06 nM HS02-44G: (SEQ ID NO: 92): 0,76 ± 0,10 nM 58 and 88 to 92 also effective binding to native APC (activated Ceprotin ®) be confirmed: In addition to binding to Xigris ® was for the high-affinity binding HS02 variants SEQ ID NO. The determined K D s were included in this case: aptamer SEQ ID NO: HS02-88 (SEQ ID NO: 58): 0.47 ± 0.06 nM HS02-62 (SEQ ID NO: 88): 1.06 ± 0.23 nM HS02-52 (SEQ ID NO: 89): 0.97 ± 0.18 nM HS02-52G (SEQ ID NO: 90): 0.74 ± 0.26 nM HS02-48G (SEQ ID NO: 91): 0.85 ± 0.06 nM HS02-44G: (SEQ ID NO: 92): 0.76 ± 0.10 nM

Es zeigte sich, dass die an aktiviertes Protein C bindenden Aptamere sehr gute Dissoziationskonstanten für die Bindung an natives aktiviertes Protein C aufwiesen.It was found that the activated protein C binding aptamers had very good dissociation constants for binding to native activated protein C.

Beispiel 5Example 5

Versuche zur Inhibierung der APC-vermittelten Faktor Va-InaktivierungAttempts to Inhibit APC-mediated Factor Va Inactivation

Zur Überprüfung der Inhibition der antikoagulatorischen APC-Aktivität durch die verschiedenen HS02-Varianten SEQ ID NO: 58 und 88 bis 92 wurden diese jeweils in aufsteigenden Konzentrationen in ein gereinigtes System zur Bestimmung der APC-vermittelten Inhibierung der FVa-Kofaktoraktivität eingesetzt. Hierbei wurde 625 pM FVa (Cellsystems) mit 18,3 pM APC (Xigris®) in Assay-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,1% BSA, 137 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 10 μg/ml Phospholipide) in Anwesenheit unterschiedlicher Aptamer-Konzentrationen (halblogarithmische Verdünnungsreihe startend von 180 nM) in einem Gesamtvolumen von 50 μl für 20 min bei RT inkubiert. Die Bestimmung der verbleibenden FVa-Kofaktor-Aktivität wurde unter Zuhilfenahme eines Plattenfluorometers (Ascent Fluoroscan, Thermo Fisher Scientific) durchgeführt. Hierbei wurden jeweils 75 μl einer Lösung mit 42 pM humanem FXa (Cellsystems) and 667 μM eines fluorogenen Peptidsubstarts (Z-Gly-Gly-Arg-AMC, Bachem, Weil am Rhein, Deutschland) in die Vertiefungen von weißen C8 Fluoronunc-Modulen (Nunc, Thermo Fisher Scientific) vorgelegt und 25 μl des oben beschriebenen Testansatzes zugegeben. Unmittelbar vor Beginn der kinetischen Messung des Substratumsatzes (eine Messung pro Minute für 20 Minuten) erfolgte die Zugabe von 50 μl einer 25 nM Prothrombinlösung in Assay-Puffer (Cellsystems).To test the inhibition of anticoagulant APC activity by the various HS02 variants SEQ ID NOs: 58 and 88 to 92, these were each used in ascending concentrations in a purified system for the determination of APC-mediated inhibition of FVa cofactor activity. Here, (Xigris ®) was 625 pM FVa (Cell Systems) at 18.3 pM APC in assay buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.1% BSA, 137 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 10 ug / ml phospholipids) in the presence of different aptamer concentrations (semilogarithmic dilution series starting from 180 nM) in a total volume of 50 .mu.l incubated for 20 min at RT. Determination of residual FVa cofactor activity was performed using a plate fluorometer (Ascent Fluoroscan, Thermo Fisher Scientific). In each case, 75 μl of a solution containing 42 pM of human FXa (Cellsystems) and 667 μM of a fluorogenic peptide sub-start (Z-Gly-Gly-Arg-AMC, Bachem, Weil am Rhein, Germany) were introduced into the wells of C8 fluoronuc white modules ( Nunc, Thermo Fisher Scientific) and 25 μl of the assay described above. Immediately before the beginning of the kinetic measurement of substrate conversion (one measurement per minute for 20 minutes), 50 μl of a 25 nM prothrombin solution were added to assay buffer (Cellsystems).

Durch nicht-lineare Regression der erhaltenen Datenpunkte (Cofaktor-Restaktivität über Aptamerkonzentration) wurden die nachfolgend dargestellten IC50-Werte erhalten: Aptamer SEQ ID NO: HS02-88 (SEQ ID NO: 58): 0,58 ± 0,04 nM HS02-62 (SEQ ID NO: 88): 1,20 ± 0,09 nM HS02-52 (SEQ ID NO: 89): 0,70 ± 0,17 nM HS02-52G (SEQ ID NO: 90): 0,42 ± 0,16 nM HS02-48G (SEQ ID NO: 91): 0,36 ± 0,17 nM HS02-44G (SEQ ID NO: 92): 0,28 ± 0,11 nM By nonlinear regression of the data points obtained (cofactor residual activity via aptamer concentration), the following IC 50 values were obtained: aptamer SEQ ID NO: HS02-88 (SEQ ID NO: 58): 0.58 ± 0.04 nM HS02-62 (SEQ ID NO: 88): 1.20 ± 0.09 nM HS02-52 (SEQ ID NO: 89): 0.70 ± 0.17 nM HS02-52G (SEQ ID NO: 90): 0.42 ± 0.16 nM HS02-48G (SEQ ID NO: 91): 0.36 ± 0.17 nM HS02-44G (SEQ ID NO: 92): 0.28 ± 0.11 nM

In den vorstehend beschriebenen Versuchen konnte gezeigt werden, dass die untersuchten Aptamere die funktionelle Aktivität von APC bezüglich der Inaktivierung von FVa mit niedrigen IC50-Werten zu inhibieren vermögen.In the experiments described above it was possible to show that the investigated aptamers were able to inhibit the functional activity of APC with respect to the inactivation of FVa with low IC 50 values.

Beispiel 6Example 6

Versuche zur Inhibierung der APC-vermittelten Faktor VIIIa-InaktivierungAttempts to Inhibit APC-mediated Factor VIIIa Inactivation

Zur weiteren Überprüfung der Inhibition der antikoagulatorischen APC-Aktivität durch die verschiedenen HS02-Varianten SEQ ID NO: 58 und 88 bis 92 wurden diese ebenfalls jeweils in aufsteigenden Konzentrationen in ein gereinigtes System zur Bestimmung der APC-vermittelten Inhibierung der FVIIIa-Kofaktoraktivität eingesetzt. Hierzu wurde 1 U rekombinanter FVIII (Recombinate®, Baxter) durch Inkubation mit 0,025 NIH-units humanem alpha-Thrombin (Cellsystems) für 2 min in PBS-Puffer (0,1% BSA) in einem Gesamtvolumen von 100 μl aktiviert. Zum Stoppen der Aktivierungsreaktion wurden dem Ansatz 5 μl einer 1,4 nM Hirudinlösung (Refludan®, Bayer Healthcare) zugegeben. Anschließend wurde der so aktivierte FVIII (FVIIIa) in einer finalen Konzentration von 0,16 U/ml mit 1,8 nM APC (Xigris®) in Assay-Puffer in Anwesenheit unterschiedlicher Aptamer-Konzentrationen (halblogarithmische Verdünnungsreihe startend von 180 nM) in einem Gesamtvolumen von 50 μl für 20 min bei RT inkubiert. Die Bestimmung der verbleibenden FVIIIa-Kofaktor-Aktivität wurde ebenfalls unter Zuhilfenahme eines Plattenfluorometers (FLx-800, Bio-Tek) durchgeführt. Hierbei wurden jeweils 75 μl einer Lösung von 3 nM humanem FIXa (Cellsystems) und 333 μM eines fluorogenen Peptidsubstarts (Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-AMC, Bachem) in die Vertiefungen von schwarzen F16 Fluoronunc-Modulen (Nunc, Thermo Fisher Scientific) vorgelegt und 25 μl des oben beschriebenen Testansatzes zugegeben. Unmittelbar vor Beginn der kinetischen Messung des Substratumsatzes (eine Messung pro Minute für 20 Minuten) erfolgte die Zugabe von 50 μl einer 25 nM FXa-Lösung in Assay-Puffer (Cellsystems).To further test the inhibition of anticoagulant APC activity by the various HS02 variants SEQ ID NO: 58 and 88 to 92, these were also each used in ascending concentrations in a purified system for the determination of APC-mediated inhibition of FVIIIa cofactor activity. For this purpose, 1 U recombinant FVIII (Recombinate ®, Baxter) by incubation with 0.025 NIH units of human alpha-thrombin (Cell Systems) for 2 (0.1% BSA) activated min in a total volume of 100 ul in PBS buffer. To stop the activation reaction the batch 5 ul of a 1.4 nM hirudin (Refludan ®, Bayer Healthcare) was added. Subsequently, the thus activated FVIII (FVIIIa) was in a final Incubated concentration of 0.16 U / ml with 1.8 nM APC (Xigris ®) in assay buffer, in the presence of different aptamer concentrations (half-log dilution series starting from 180 nM) in a total volume of 50 ul for 20 min at RT. Determination of residual FVIIIa cofactor activity was also performed using a plate fluorometer (FLx-800, Bio-Tek). In each case 75 μl of a solution of 3 nM human FIXa (Cellsystems) and 333 μM of a fluorogenic peptide sub-start (Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-AMC, Bachem) were introduced into the wells of black F16 Fluoronunc modules (Nunc, Thermo Fisher Scientific) and added 25 .mu.l of the test mixture described above. Immediately prior to initiating the kinetic measurement of substrate turnover (one measurement per minute for 20 minutes), 50 μl of a 25 nM FXa solution was added to assay buffer (Cellsystems).

Durch nicht-lineare Regression der erhaltenen Datenpunkte (Cofaktor-Restaktivität über Aptamerkonzentration) wurden die nachfolgend dargestellten IC50-Werte erhalten: Aptamer SEQ ID NO: HS02-88 (SEQ ID NO: 58): 1,27 ± 0,41 nM HS02-62 (SEQ ID NO: 88): 0,88 ± 0,46 nM HS02-52 (SEQ ID NO: 89): 2,46 ± 0,08 nM HS02-52G (SEQ ID NO: 90): 0,22 ± 0,15 nM HS02-48G (SEQ ID NO: 91): 1,06 ± 0,43 nM HS02-44G (SEQ ID NO: 92): 0,88 ± 0,11 nM By nonlinear regression of the data points obtained (cofactor residual activity via aptamer concentration), the following IC 50 values were obtained: aptamer SEQ ID NO: HS02-88 (SEQ ID NO: 58): 1.27 ± 0.41 nM HS02-62 (SEQ ID NO: 88): 0.88 ± 0.46 nM HS02-52 (SEQ ID NO: 89): 2.46 ± 0.08 nM HS02-52G (SEQ ID NO: 90): 0.22 ± 0.15 nM HS02-48G (SEQ ID NO: 91): 1.06 ± 0.43 nM HS02-44G (SEQ ID NO: 92): 0.88 ± 0.11 nM

In den vorstehend beschriebenen Versuchen konnte gezeigt werden, dass die untersuchten Aptamere die funktionelle Aktivität von APC bezüglich der Inaktivierung von FVIIIa mit niedrigen IC50-Werten zu inhibieren vermögen.In the experiments described above it was possible to show that the investigated aptamers are able to inhibit the functional activity of APC with respect to the inactivation of FVIIIa with low IC 50 values.

Beispiel 7Example 7

Versuche zur Bestimmung des Einflusses der APC-Aptamere auf die Inhibierung von APC durch den Protein-C-Inhibitor (PCI)Attempts to Determine the Influence of APC Aptamers on the Inhibition of APC by the Protein C Inhibitor (PCI)

Zur Untersuchung des Einflusses der APC-Aptamere auf die Kinetik der Inhibierung von APC durch PCI wurde ein Testsystem im Mikrotiterplatten-Format eingesetzt. Hierbei wurden die Vertiefungen von weißen C8 Fluoronunc-Modulen (Nunc, Thermo Fisher Scientific) mit einem polyklonalen rabbit-anti human PC-Antikörper (Dako) in Beschichtungspuffer (30 mM Na2CO2, 200 mM NaHCO3, pH 9.0) bei 4°C über Nacht beschichtet (100 μl/Vertiefung). Anschließend wurden die Vertiefungen 3× mit Waschpuffer (1 × PBS, pH 7.4, 0.05% Tween 20) gewaschen (dies ist die in diesem Testverfahren standardmäßig eingesetzte Waschsequenz, durchgeführt mit einem automatischen Mikrotiterplatten-Washer [SLT, Tecan, Germany]) und freie Bindungsstellen mit Blockpuffer (1 × PBS, pH 7.4, 2% BSA, 0.05% Tween 20) für 2 h bei RT blockiert. Nach Waschen der Vertiefungen erfolgte die Zugabe von 100 μl/Vertiefung einer 360 pM APC (Xigris®)-Lösung in Verdünnungspuffer (1 × PBS, pH 7.4, 0,1% BSA, 0.05% Tween 20), welche für 1 h bei RT inkubiert und anschließend durch Waschen entfernt wurde. Zu dem nun in den Vertiefungen der Module immobilisierten APC erfolgte dann die Zugabe von 100 μl/Vertiefung Citrat-Poolplasma, welchem im Vorfeld jeweils die zu testenden Aptamere in einer Konzentration von final 100 nM zugegeben wurden. Es wurde ebenfalls ein Leerwert ohne Aptamere mitgeführt. Um die Bindung des im Poolplasma enthaltenen PCI an das in den Vertiefungen immobilisierte APC zu definierten Zeitpunkten zu stoppen, wurden die entsprechenden Vertiefungen nach verschiedenen Inkubationszeiten (5, 10, 20 und 30 min) standardmäßig gewaschen und mit 100 μl/Vertiefung Verdünnungspuffer befüllt. Nach Abschluss der Versuchsserie wurden alle Vertiefungen erneut gewaschen. Zur Bestimmung der in den Vertiefungen verbliebenden amidolytischen APC-Aktivität wurde anschließend ein fluorogenes Peptidsubstrat für APC (Pefa 3342, Pentapharm) in einer Konzentration von 200 μM in Verdünnungspuffer zugegeben (100 μl/Vertiefung) und die Kinetik der Substarthydrolyse mittels eines Plattenfluorometers (Ascent Fluoroscan, Thermo Fisher Scientific) erfasst. Die scheinbaren Inhibitionskonstanten (kapp) als Maß für die Geschwindigeit der Inhibierung des immoblisierten APC wurden aus den sich ergebenden Datensätzen mittels exponentieller Interpolation berechnet. Um die PCI-Spezifität des gefundenen Effekts nachzuweisen, wurden die Vertiefungen nach Aufnahme der Inhibitionskinetiken erneut gewaschen und anschließend 100 ul/Vertiefung eines POD-markierten polyklonalen anti-PCI-Antikörpers (Affinity Biologicals) in einer 1:2000 Verdünnung in Verdünnungspuffer zugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 1 h wurden die Vertiefung erneut gewaschen und 100 μl/Vertiefung eines Chemilumineszenz-Substrats (Roche) zugegeben. Die Intensität der freigesetzten Chemilumineszenz wurde nach einer Inkubationszeit von 3 min mit dem Ascent Fluoroscan bestimmt.To test the influence of APC aptamers on the kinetics of inhibition of APC by PCI, a test system in microtiter plate format was used. The wells of white C8 Fluoronunc modules (Nunc, Thermo Fisher Scientific) were incubated with a polyclonal rabbit anti human PC antibody (Dako) in coating buffer (30 mM Na 2 CO 2 , 200 mM NaHCO 3 , pH 9.0) at 4 ° C overnight (100 μl / well). Subsequently, the wells were washed 3x with wash buffer (1 x PBS, pH 7.4, 0.05% Tween 20) (this is the standard washing sequence used in this test procedure, performed with an automatic microtiter plate washer [SLT, Tecan, Germany]) and free Binding sites blocked with blocking buffer (1 × PBS, pH 7.4, 2% BSA, 0.05% Tween 20) for 2 h at RT. After washing the wells, the addition was made of 100 ul / well of a 360 pM APC (Xigris ®) solution in dilution buffer (1 x PBS, pH 7.4, 0.1% BSA, 0.05% Tween 20) for 1 h at RT was incubated and then removed by washing. The APC, which was now immobilized in the wells of the modules, was then followed by the addition of 100 μl / well of citrated pool plasma to which the aptamers to be tested had been added in advance in a final concentration of 100 nM. There was also a blank without aptamers carried. In order to stop binding of the PCI contained in the pool plasma to the APC immobilized in the wells at defined times, the corresponding wells were washed by default after different incubation times (5, 10, 20 and 30 min) and filled with 100 μl / well of dilution buffer. After completion of the series of experiments, all wells were washed again. To determine the amidolytic APC activity remaining in the wells, a fluorogenic peptide substrate for APC (Pefa 3342, Pentapharm) in a concentration of 200 μM in dilution buffer was then added (100 μl / well) and the kinetics of the substrate hydrolysis using a plate fluorometer (Ascent Fluoroscan , Thermo Fisher Scientific). The apparent inhibition constants (kapp) as a measure of the rate of inhibition of the immobilized APC were calculated from the resulting data sets by exponential interpolation. To detect the PCI specificity of the effect found, the wells were rinsed after inhibition kinetics were recorded and then 100 μl / well of a POD-labeled polyclonal anti-PCI antibody (Affinity Biologicals) in a 1: 2000 dilution in dilution buffer was added. After an incubation period of 1 h, the well was washed again and 100 μl / well of a chemiluminescent substrate (Roche) added. The intensity of chemiluminescence released was determined after 3 minutes incubation with the Ascent Fluoroscan.

Nachfolgend sind die über den vorstehend dargestellen Immunoassay ermittelten, scheinbaren Inhibitionskonstanten (kapp) von immobilisiertem APC bei Anwesenheit der verschiedenen Aptamere der Sequenzen SEQ ID NO: 58 und 88 bis 92 (100 nM) in der Plasmamatrix dargestellt: Aptamer SEQ ID NO: HS02-88 (SEQ ID NO: 58): 0,143 ± 0,012 HS02-62 (SEQ ID NO: 88): 0,095 ± 0,002 HS02-52 (SEQ ID NO: 89): 0,085 ± 0,006 HS02-52G (SEQ ID NO: 90): 0,080 ± 0,002 HS02-48G (SEQ ID NO: 91): 0,053 ± 0,000 HS02-44G (SEQ ID NO: 92): 0,047 ± 0,000 ohne Aptamer: 0,031 ± 0,000 The apparent inhibition constants (k app ) of immobilized APC determined in the above-described immunoassay in the presence of the various aptamers of the sequences SEQ ID NO: 58 and 88 to 92 (100 nM) in the plasma matrix are shown below: aptamer SEQ ID NO: HS02-88 (SEQ ID NO: 58): 0.143 ± 0.012 HS02-62 (SEQ ID NO: 88): 0.095 ± 0.002 HS02-52 (SEQ ID NO: 89): 0.085 ± 0.006 HS02-52G (SEQ ID NO: 90): 0.080 ± 0.002 HS02-48G (SEQ ID NO: 91): 0.053 ± 0.000 HS02-44G (SEQ ID NO: 92): 0.047 ± 0.000 without aptamer: 0.031 ± 0.000

In den Versuchsansätzen konnte die Bildung von APC/PCI-Komplexen als Ursache für die Inhibierung des APC nachgewiesen werden. Hierbei war die ermittelte Anzahl der gebildeten Komplexe proportional zu den gefundenen Inhibitionskonstanten.In the experimental approaches, the formation of APC / PCI complexes as the cause of the inhibition of APC could be detected. Here, the determined number of complexes formed was proportional to the found inhibition constants.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.This is followed by a sequence protocol according to WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.This can be downloaded from the official publication platform of the DPMA.

Claims (16)

Aptamer, das an ein an der Hämostase beteiligtes Zielmolekül bindet, wobei das Aptamer ein Aptamer ist, das an aktiviertes Protein C bindet, wobei das Aptamer mit einer Dissoziationskonstante KD im Bereich von ≥ 0,001 nM bis ≤ 80 nM an aktiviertes Protein C bindet, und wobei das Aptamer eine Länge im Bereich von ≥ 20 Nukleotide bis ≤ 160 Nukleotide aufweist, und wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer ein Sequenzmotiv aufweist ausgewählt aus der Gruppe umfassend: 5'-TATCCCGN1ATGGG-3' (SEQ ID NO: 1) worin: N1 ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanin, Cytosin, Adenin, Thymin, Uracil, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifiziertes Nukleotid, oder eine Deletion; und/oder 5'-TATCACGTATGGG-3' (SEQ ID NO: 3).An aptamer that binds to a target molecule involved in hemostasis, the aptamer being an aptamer that binds to activated protein C, the aptamer binding to activated protein C with a dissociation constant K D in the range of ≥ 0.001 nM to ≤ 80 nM, and wherein the aptamer has a length in the range of ≥ 20 nucleotides to ≤ 160 nucleotides, and wherein the activated protein C binding aptamer comprises a sequence motif selected from the group comprising: 5'-TATCCCGN 1 ATGGG-3 '(SEQ ID NO: 1) wherein: N 1 is selected from the group comprising guanine, cytosine, adenine, thymine, uracil, 2'-fluoro, 2'-methoxy and / or 2'-amino-modified nucleotide, or a deletion; and / or 5'-TATCACGTATGGG-3 '(SEQ ID NO: 3). Aptamer, das an aktiviertes Protein C bindet, nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer mit einer Dissoziationskonstante KD im Bereich von ≥ 0,002 nM bis ≤ 8 nM, vorzugsweise im Bereich von ≥ 0,005 nM bis ≤ 5 nM, bevorzugt im Bereich von ≥ 0,01 nM bis ≤ 2 nM, besonders bevorzugt im Bereich von ≥ 0,05 nM bis ≤ 1,5 nM, ganz besonders bevorzugt im Bereich von ≥ 0,1 nM bis ≤ 1,3 nM, an aktiviertes Protein C bindet.Aptamer which binds to activated protein C according to claim 1, characterized in that the activated protein C binding aptamer having a dissociation constant K D in the range of ≥ 0.002 nM to ≤ 8 nM, preferably in the range of ≥ 0.005 nM to ≤ 5 nM, preferably in the range of ≥ 0.01 nM to ≤ 2 nM, particularly preferably in the range of ≥ 0.05 nM to ≤ 1.5 nM, very particularly preferably in the range of ≥ 0.1 nM to ≤ 1.3 nM , binds to activated protein C. Aptamer, das an aktiviertes Protein C bindet, nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Anzahl an Nukleotiden im Bereich von ≥ 20 Nukleotide bis ≤ 120 Nukleotide, vorzugsweise im Bereich von ≥ 40 Nukleotide bis ≤ 88 Nukleotide, aufweist.Aptamer which binds to activated protein C according to claim 1 or 2, characterized in that the activated protein C binding aptamer a number of nucleotides in the range of ≥ 20 nucleotides to ≤ 120 nucleotides, preferably in the range of ≥ 40 nucleotides to ≤ 88 nucleotides. Aptamer, das an aktiviertes Protein C bindet, nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer wenigstens eine erste Haarnadel-Struktur umfassend einen Stamm und eine Schleife aufweist.Aptamer which binds to activated protein C according to any one of the preceding claims, characterized in that the activated protein C-binding aptamer has at least one first hairpin structure comprising a stem and a loop. Aptamer, das an aktiviertes Protein C bindet, nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine zweite Haarnadel-Struktur umfassend einen Stamm und eine Schleife aufweist, wobei die zweite Haarnadel-Struktur in der Schleife der ersten Haarnadel-Struktur angeordnet ist.Aptamer which binds to activated protein C according to any one of the preceding claims, characterized in that the activated protein C binding aptamer has a second hairpin structure comprising a stem and a loop, wherein the second hairpin structure in the loop of the first Hairpin structure is arranged. Aptamer, das an aktiviertes Protein C bindet, nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz SEQ ID NO: 1 die zweite Haarnadel-Struktur umfasst. Aptamer which binds to activated protein C according to any one of the preceding claims, characterized in that the sequence SEQ ID NO: 1 comprises the second hairpin structure. Aptamer, das an aktiviertes Protein C bindet, nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm der ersten Haarnadel-Struktur eine Nukleotidabfolge Cytidin-Thymidin aufweist, die eine Ausbuchtung ausbildet.Aptamer which binds to activated protein C according to any one of the preceding claims, characterized in that the stem of the first hairpin structure has a nucleotide sequence cytidine-thymidine which forms a bulge. Aptamer, das an aktiviertes Protein C bindet, nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm der ersten Haarnadel-Struktur im Bereich von ≥ 4 Basenpaare bis ≤ 15 Basenpaare, vorzugsweise im Bereich von ≥ 9 Basenpaare bis ≤ 13 Basenpaare, bevorzugt im Bereich von ≥ 11 Basenpaare bis ≤ 12 Basenpaare aufweist.Aptamer which binds to activated protein C according to one of the preceding claims, characterized in that the strain of the first hairpin structure in the range of ≥ 4 base pairs to ≤ 15 base pairs, preferably in the range of ≥ 9 base pairs to ≤ 13 base pairs, preferred in the range of ≥ 11 base pairs to ≤ 12 base pairs. Aptamer, das an aktiviertes Protein C bindet, nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Schleife der ersten Haarnadel-Struktur im Bereich von ≥ 5 Nukleotide bis ≤ 30 Nukleotide, vorzugsweise im Bereich von ≥ 6 Nukleotide bis ≤ 18 Nukleotide, aufweist.Aptamer which binds to activated protein C according to any one of the preceding claims, characterized in that the loop of the first hairpin structure in the range of ≥ 5 nucleotides to ≤ 30 nucleotides, preferably in the range of ≥ 6 nucleotides to ≤ 18 nucleotides , Aptamer, das an aktiviertes Protein C bindet, nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer eine Sequenz aufweist ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
Figure DE102007063902B3_0030
Figure DE102007063902B3_0031
wobei das an aktiviertes Protein C bindende Aptamer Modifikationen aufweisen kann, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder das Aptamer modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen kann.Aptamer which binds to activated protein C according to any one of the preceding claims, characterized in that the activated protein C binding aptamer has a sequence selected from the group comprising:
Figure DE102007063902B3_0030
Figure DE102007063902B3_0031
wherein the activated protein C-binding aptamer may have modifications, preferably selected from the group comprising 5'-PEG and / or 3'-CAP modifications, and / or the aptamer-modified nucleotides, preferably selected from the group comprising Locked nucleic acids , 2'-fluoro, 2'-methoxy and / or 2'-amino-modified nucleotides may have. Verfahren zur Bestimmung von aktiviertem Protein C in biologischen Proben, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein an aktiviertes Protein C bindendes Aptamer nach einem der vorherigen Ansprüche mit der biologischen Probe, vorzugsweise einer biologischen Flüssigkeit, inkubiert wird und ein Bindungsereignis zwischen dem Aptamer und aktiviertem Protein C nachgewiesen wird.Method for the determination of activated protein C in biological samples, characterized in that at least one activated protein C-binding aptamer according to one of the preceding claims is incubated with the biological sample, preferably a biological fluid, and a binding event between the aptamer and activated protein C is detected. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Flüssigkeit eine Körperflüssigkeit ist, vorzugsweise Blut oder Blutprodukte, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Blutplasma, Serum und/oder Vollblut. A method according to claim 11, characterized in that the biological fluid is a body fluid, preferably blood or blood products, preferably selected from the group comprising blood plasma, serum and / or whole blood. Kit umfassend wenigstens ein an aktiviertes Protein C bindendes Aptamer nach einem der vorherigen Ansprüche.Kit comprising at least one activated protein C binding aptamer according to any one of the preceding claims. Verwendung eines an aktiviertes Protein C bindenden Aptamers nach einem der vorherigen Ansprüche, dessen pharmakologisch akzeptablen Salzen, Derivaten und/oder Konjugaten, zur Herstellung eines Arzneimittels.Use of an activated protein C-binding aptamer according to any preceding claim, its pharmacologically acceptable salts, derivatives and / or conjugates, for the manufacture of a medicament. Verwendung eines an aktiviertes Protein C bindenden Aptamers nach einem der vorherigen Ansprüche, dessen pharmakologisch akzeptablen Salzen, Derivaten und/oder Konjugaten, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Diagnose, therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Blutgerinnung in Zusammenhang stehen, Blutungserkrankungen, vorzugsweise hämorrhagischen Diathesen bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Hämophilie, insbesondere Hämophilie A, und/oder von Willebrand-Syndrom, und/oder Blutungskomplikationen, die durch eine erhöhte Konzentration an aktiviertem Protein C ausgelöst werden.Use of an activated protein C-binding aptamer according to one of the preceding claims, its pharmacologically acceptable salts, derivatives and / or conjugates, for the manufacture of a medicament for the diagnosis, therapeutic and / or prophylactic treatment of disorders associated with impaired blood clotting, Bleeding disorders, preferably hemorrhagic diatheses, preferably selected from the group comprising hemophilia, in particular hemophilia A, and / or von Willebrand syndrome, and / or bleeding complications, which are triggered by an increased concentration of activated protein C. Arzneimittel umfassend an aktiviertes Protein C bindende Aptamere nach einem der vorherigen Ansprüche.Medicaments comprising activated protein C-binding aptamers according to one of the preceding claims.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992014843A1 (en) * 1991-02-21 1992-09-03 Gilead Sciences, Inc. Aptamer specific for biomolecules and method of making
US5650275A (en) * 1990-06-11 1997-07-22 Nexstar Pharmacueticals Inc Target detection method using spectroscopically detectable nucleic acid ligands
US20060110739A1 (en) * 2003-12-12 2006-05-25 Saint Louis University Biosensors for detecting macromolecules and other analytes

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5650275A (en) * 1990-06-11 1997-07-22 Nexstar Pharmacueticals Inc Target detection method using spectroscopically detectable nucleic acid ligands
WO1992014843A1 (en) * 1991-02-21 1992-09-03 Gilead Sciences, Inc. Aptamer specific for biomolecules and method of making
US20060110739A1 (en) * 2003-12-12 2006-05-25 Saint Louis University Biosensors for detecting macromolecules and other analytes

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLANK M u.a. Aptamers as tools for target validation, 2005, Curr. Opin. Chem. Biol., vo. 9, Bd. 4, S. 336-342. *
GAL SW u.a. Selection of a RNA aptamer that binds to human activated protein C and inhibits its protease function, 1998, Eur. J. Biochem., Vol. 252, Bd. 3, S. 553-562 *
HOWARD EL u.a. Factor IXa inhibitors as novel anticoagulants, 2007, Arterioscler. Thromb. Vas. Biol., Vol 27, Bd. 4, s. 722-727 *
RUSCONI CO u.a. RNA aptamers as reversible antagonists of coagulation factor IXa, 2002, Nature, Vol. 419, Bd. 6902, S. 9094 *

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