DE102007041476B4 - Aptamers that bind to a target molecule involved in hemostasis - Google Patents
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Abstract
Aptamer, das an ein an der Hämostase beteiligtes Zielmolekül bindet, wobei das Aptamer ein Thrombin-bindendes Fusions-Aptamer ist, umfassend wenigstens zwei an Thrombin bindende Aptamere und wenigstens einen Linker, wobei der wenigstens eine Linker die wenigstens zwei an Thrombin bindenden Aptamere verbindet, wobei das Thrombin-bindende Fusions-Aptamer eine Sequenz aufweist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:An aptamer that binds to a target molecule involved in hemostasis, the aptamer being a thrombin-binding fusion aptamer comprising at least two thrombin-binding aptamers and at least one linker, the at least one linker linking the at least two aptamers binding to thrombin, wherein the thrombin-binding fusion aptamer has a sequence selected from the group consisting of:
Description
Die Erfindung betrifft Aptamere, die an ein an der Hämostase beteiligtes Zielmolekül binden, wobei das Aptamer ein Thrombin-bindendes Fusions-Aptamer ist.The invention relates to aptamers which bind to a target molecule involved in hemostasis, the aptamer being a thrombin-binding fusion aptamer.
Die Schrift
Eine Aufgabe der Erfindung war es, Thrombin-inhibierende Aptamere zur Verfügung zu stellen.An object of the invention was to provide thrombin-inhibiting aptamers.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Aptamer, das an ein an der Hämostase beteiligtes Zielmolekül bindet, wobei das Aptamerein Thrombin-bindendes Fusions-Aptamer ist, umfassend wenigstens zwei an Thrombin bindende Aptamere und wenigstens einen Linker, wobei der wenigstens eine Linker die wenigstens zwei an Thrombin bindenden Aptamere verbindet, wobei das Thrombin-bindende Fusions-Aptamer eine Sequenz aufweist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: 
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.Further advantageous embodiments of the invention will become apparent from the dependent claims.
Unter dem Begriff ”Aptamer” sind im Sinne dieser Erfindung Oligonukleotide zu verstehen, die spezifisch und mit hoher Affinität an ein Zielmolekül, insbesondere an ein an der Hämostase beteiligtes Zielprotein wie aktiviertes Protein C oder Thrombin, binden.For the purposes of this invention, the term "aptamer" is to be understood as meaning oligonucleotides which bind specifically and with high affinity to a target molecule, in particular to a target protein involved in the hemostasis, such as activated protein C or thrombin.
Unter dem Begriff ”Fusions-Aptamer” sind im Sinne dieser Erfindung Aptamerkonstrukte zu verstehen, die wenigstens zwei gleiche oder unterschiedliche Aptamersequenzen und wenigstens einen die Aptamersequenzen verbindenden Linker oder Spacerregion aufweisen.For the purposes of this invention, the term "fusion aptamer" means aptamer constructs which have at least two identical or different aptamer sequences and at least one linker or spacer region connecting the aptamer sequences.
Überraschender Weise konnte festgestellt werden, dass die erfindungsgemäßen Thrombin-bindenden Fusions-Aptamere eine unerwartet starke Inhibtion von Thrombin zeigen können. Insbesondere konnte festgestellt werden, dass die erfindungsgemäßen Thrombin-bindenden Fusions-Aptamere eine unerwartet hohe inhibierende Wirkung auf die durch Thrombin vermittelte Blutgerinnung aufweisen.Surprisingly, it has been found that the thrombin-binding fusion aptamers according to the invention can show an unexpectedly strong inhibition of thrombin. In particular, it has been found that the thrombin-binding fusion aptamers of the invention have an unexpectedly high inhibitory effect on thrombin-mediated blood coagulation.
Beispielsweise konnte zur Thrombin-inhibierenden Wirkung der erfindungsgemäßen Thrombin-bindenden Fusions-Aptamere festgestellt werden, dass eine Blutgerinnung bei einer Verwendung erfindungsgemäßer Thrombin-bindender Fusions-Aptamere bereits bei einer 30-fach geringeren Konzentrationen gegenüber einzelnen Aptameren gehemmt werden konnte.For example, it was possible to determine, for the thrombin-inhibiting action of the thrombin-binding fusion aptamers according to the invention, that blood clotting could be inhibited even with a 30-fold lower concentration compared to individual aptamers when using thrombin-binding fusion aptamers according to the invention.
Erfindungsgemäße Thrombin-bindende Fusions-Aptamere können eine DNA- oder eine RNA-Sequenz aufweisen. Vorzugsweise weisen Thrombin-bindende Fusions-Aptamere eine DNA-Sequenz auf. Aptamere auf DNA-Basis besitzen in vorteilhafter Weise eine erhöhte Stabilität.Thrombin-binding fusion aptamers according to the invention may have a DNA or an RNA sequence. Preferably, thrombin-binding fusion aptamers have a DNA sequence. DNA-based aptamers advantageously have increased stability.
Weiterhin geeignet sind Aptamere, die eine Sequenz umfassend 2'-modifizierte Nukleotide, beispielsweise 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide, aufweisen. Auch geeignet sind Aptamere, die 2'-modifizierte Ribonukleotide, beispielsweise 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Ribonukleotide, aufweisen. Weiterhin können Aptamere Desoxyribonukleotide und 2'-modifizierte Ribonukleotide, beispielsweise 2'-Fluor-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Ribonukleotide aufweisen.Also suitable are aptamers which have a sequence comprising 2'-modified nucleotides, for example 2'-fluoro, 2'-methoxy and / or 2'-amino-modified nucleotides. Also suitable are aptamers which have 2'-modified ribonucleotides, for example 2'-fluoro, 2'-methoxy and / or 2'-amino-modified ribonucleotides. Furthermore, aptamers may have deoxyribonucleotides and 2'-modified ribonucleotides, for example 2'-fluoro, 2'-methoxy and / or 2'-amino-modified ribonucleotides.
In bevorzugten Ausführungsformen des Thrombin-bindendes Fusions-Aptamers umfasst das Fusions-Aptamer:
- – zwei an Thrombin bindende Aptamere; und
- – ein Linker, wobei der Linker jeweils zwei an Thrombin bindende Aptamere verbindet.
- Two thrombin-binding aptamers; and
- A linker, wherein the linker connects two thrombin-binding aptamers.
Vorzugsweise weisen die an Thrombin bindenden Aptamere eine Sequenz auf ausgewählt aus der Gruppe umfassend: 
Bevorzugt verwendbare an Thrombin bindende Aptamere binden an die Exosites 1 und 2 von Thrombin.Preferably, thrombin-binding aptamers bind to exosites 1 and 2 of thrombin.
Besonders bevorzugte Linker sind so genannte Poly A-Linker.Particularly preferred linkers are so-called poly A linkers.
Es konnte überraschend festgestellt werden, dass die erfindungsgemäßen Thrombin-bindenden Fusions-Aptamere eine besonders gute Affinität zu Thrombin aufweisen können, deren Linker überwiegend das Nukleotid Adenosin enthalten oder aus dem Nukleotid Adenosin ausgebildet sind.It has surprisingly been found that the thrombin-binding fusion aptamers according to the invention can have a particularly good affinity for thrombin, whose linkers predominantly contain the nucleotide adenosine or are formed from the nucleotide adenosine.
Die an Thrombin bindenden Aptamere können Modifikationen aufweisen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 5'-PEG- und/oder 3'-CAP-Modifikationen, und/oder die Aptamere modifizierte Nukleotide, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Locked-Nukleinsäuren, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen können.The thrombin-binding aptamers may have modifications, preferably selected from the group comprising 5'-PEG and / or 3'-CAP modifications, and / or the aptamers modified nucleotides, preferably selected from the group comprising Locked nucleic acids, 2 ' Fluoro, 2'-methoxy and / or 2'-amino-modified nucleotides.
Eine weitere bevorzugte chemische Modifikation ist beispielsweise die Anfügung einer so genannten ”3'-CAP”- oder ”5'-CAP”-Struktur, eines modifizierten Guanosin-Nukleotids (7-Methyl-guanosin) an das 3'-Ende oder 5'-Ende. Die Modifikation des 3'-Endes oder 5'-Endes kann das Fusions-Aptamer in vorteilhafter Weise vor einem schnellen Abbau durch Nukleasen, insbesondere in einem Organismus oder einer biologischen Probe schützen.Another preferred chemical modification is, for example, the addition of a so-called "3'-CAP" or "5'-CAP" structure, a modified guanosine nucleotide (7-methyl-guanosine) to the 3'-end or 5 ' -The End. Modification of the 3'-end or 5'-end may advantageously protect the fusion aptamer from rapid degradation by nucleases, particularly in an organism or biological sample.
In anderen Ausführungsformen kann insbesondere das 5'-Ende des Fusions-Aptamers pegyliert sein. Eine 5'-PEG-Modifikationen kann beispielsweise wenigstens eine Polyethylenglykol-Einheit umfassen, bevorzugt im Bereich von 1 bis 900 Polyethylenglykol-Einheiten, vorzugsweise im Bereich von 1 bis 450 Polyethylenglykol-Einheiten auf. Bevorzugt verwendbar sind lineare Polyethylenglykol(PEG)-Einheiten HO-(CH2CH2O)n-H, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 900, bevorzugt im Bereich von 1 bis 450 ist.In other embodiments, in particular, the 5 'end of the fusion aptamer may be pegylated. For example, a 5'-PEG modification may comprise at least one polyethylene glycol unit, preferably in the range of 1 to 900 polyethylene glycol units, preferably in the range of 1 to 450 polyethylene glycol units. Preference is given to using linear polyethylene glycol (PEG) units HO- (CH 2 CH 2 O) n -H, where n is an integer in the range from 1 to 900, preferably in the range from 1 to 450.
Eine Verabreichung der erfindungsgemäßen Thrombin-bindenden Fusions-Aptamere, deren pharmakologisch akzeptablen Salzen, Derivaten und/oder Konjugaten ermöglicht in vorteilhafter Weise eine therapeutische Beeinflussung der Aktivität von Thrombin.Administration of the thrombin-binding fusion aptamers according to the invention, their pharmacologically acceptable salts, derivatives and / or conjugates advantageously makes it possible to therapeutically influence the activity of thrombin.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Thrombin-bindenden Fusions-Aptamere zur Diagnose, therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Blutgerinnung in Zusammenhang stehen oder deren Therapie eine Beeinflussung des Blutgerinnungssystems erfordert.Another object of the invention relates to the use of the thrombin-binding fusion aptamers according to the invention for the diagnosis, therapeutic and / or prophylactic treatment of diseases that are associated with a disturbed blood coagulation or whose therapy requires an influence on the blood coagulation system.
Insbesondere sind die erfindungsgemäßen Thrombin-bindenden Fusions-Aptamere verwendbar als Blutgerinnungshemmer oder Antikoagulantien.In particular, the thrombin-binding fusion aptamers of the invention are useful as anticoagulants or anticoagulants.
Überraschend konnte festgestellt werden, dass die erfindungsgemäßen Thrombin-bindenden Fusions-Aptamere sehr wirksame Blutgerinnungshemmer sind. Insbesondere konnte festgestellt werden, dass die erfindungsgemäßen Thrombin-bindenden Fusions-Aptamer SEQ ID NO: 98 eine deutlich höhere Wirkung auf die durch Thrombin vermittelte Blutgerinnung aufweisen, als eine Kombination der Einzelaptamere SEQ ID NO: 95 und SEQ ID NO: 97.Surprisingly, it has been found that the thrombin-binding fusion aptamers according to the invention are very effective anticoagulants. In particular, it has been found that the thrombin-binding fusion aptamer SEQ ID NO: 98 according to the invention has a significantly higher activity have thrombin-mediated blood coagulation as a combination of the single aptamer SEQ ID NO: 95 and SEQ ID NO: 97.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines erfindungsgemäßen Thrombin-bindendes Fusions-Aptamers, dessen pharmakologisch akzeptablen Salzen, Derivaten und/oder Konjugaten, zur Herstellung eines Arzneimittels.The invention further relates to the use of a thrombin-binding fusion aptamer according to the invention, its pharmacologically acceptable salts, derivatives and / or conjugates, for the preparation of a medicament.
Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung von erfindungsgemäßen Thrombin-bindendes Fusions-Aptameren, deren pharmakologisch akzeptablen Salzen, Derivaten und/oder Konjugaten, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Diagnose, therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Blutgerinnung in Zusammenhang stehen oder deren Therapie eine Beeinflussung des Blutgerinnungssystems erfordert, insbesondere als Blutgerinnungshemmer.More particularly, the invention relates to the use of thrombin-binding fusion aptamers of the invention, their pharmacologically acceptable salts, derivatives and / or conjugates, for the manufacture of a medicament for the diagnosis, therapeutic and / or prophylactic treatment of disorders associated with impaired blood coagulation or whose therapy requires an influence on the blood coagulation system, in particular as a blood coagulation inhibitor.
Erkrankungen, die mit einer gestörten Blutgerinnung in Zusammenhang stehen oder deren Therapie eine Beeinflussung des Blutgerinnungssystems erfordert sind insbesondere ausgewählt aus der Gruppe umfassend arterielle oder venöse Thrombosen, insbesondere akuter Myokard- und Hirninfarkt oder Lungenembolien, und/oder thromboembolischen Komplikationen.Diseases associated with impaired blood coagulation or whose therapy requires interference with the blood coagulation system are, in particular, selected from the group comprising arterial or venous thromboses, in particular acute myocardial and cerebral infarcts or pulmonary embolisms, and / or thromboembolic complications.
Erfindungsgemäße Thrombin-bindendes Fusions-Aptamere sind insbesondere geeignet zur Therapie von arteriellen Thrombosen, insbesondere des akuten Myokard- und Hirninfarkts und Sekundärprophylaxe von thromboembolischen Komplikationen nach gefäßrekonstruktiven Eingriffen. Erfindungsgemäße Thrombin-bindendes Fusions-Aptamere sind weiterhin geeignet zur systemischen Antikoagulation zur Verwendung bei extrakorporalen Therapieverfahren, insbesondere Herz-Lungen-Maschine, Hämodialyse und Hämofiltrationsverfahren. Erfindungsgemäße Thrombin-bindendes Fusions-Aptamere sind auch geeignet zur Verwendung in der Akuttherapie von venösen Thrombosen, insbesondere akuten Lungenembolien.Thrombin-binding fusion aptamers according to the invention are particularly suitable for the therapy of arterial thromboses, in particular acute myocardial and cerebral infarction and secondary prophylaxis of thromboembolic complications after vascular reconstruction procedures. Thrombin-binding fusion aptamers according to the invention are furthermore suitable for systemic anticoagulation for use in extracorporeal therapeutic methods, in particular heart-lung machines, hemodialysis and hemofiltration methods. Thrombin-binding fusion aptamers of the invention are also suitable for use in the acute therapy of venous thrombosis, especially acute pulmonary embolism.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Arzneimittel umfassend wenigstens ein erfindungsgemäßes Thrombin-bindendes Fusions-Aptamer. Das Arzneimittel umfasst erfindungsgemäße Thrombin-bindendes Fusions-Aptamere vorzugsweise als pharmakologisch akzeptables Salz, bevorzugt als Salze anorganischer Säuren, beispielsweise Phosphorsäure, oder als Salze organischer Säuren beispielsweise Salzsäure oder Schwefelsäure. Das Arzneimittel kann weiterhin pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffen und/oder Träger umfassen.A further subject of the invention are medicaments comprising at least one thrombin-binding fusion aptamer according to the invention. The medicament comprises thrombin-binding fusion aptamers according to the invention preferably as a pharmacologically acceptable salt, preferably as salts of inorganic acids, for example phosphoric acid, or as salts of organic acids, for example hydrochloric acid or sulfuric acid. The medicament may further comprise pharmaceutically acceptable excipients and / or carriers.
In vorteilhafter Weise ist das Arzneimittel zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Blutgerinnung in Zusammenhang stehen oder deren Therapie eine Beeinflussung des Blutgerinnungssystems erfordert, insbesondere als Blutgerinnungshemmer, geeignet.Advantageously, the medicament is suitable for the prophylactic or therapeutic treatment of diseases associated with impaired blood coagulation or whose therapy requires an influence on the blood coagulation system, in particular as a blood coagulation inhibitor.
Das Arzneimittel ist oral, transmucosal, rektal, pulmonal, enteral und/oder parenteral verabreichbar. Bevorzugt ist eine Verabreichung durch Injektion.The drug is orally, transmucosally, rectally, pulmonarily, enterally and / or parenterally administrable. Preference is given to administration by injection.
Wenn nicht anders ausgeführt, weisen die verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke die Bedeutung auf, wie sie gemeinhin von einem Durchschnittsfachmann in dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden wird.Unless otherwise stated, the technical and scientific terms used are as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs.
Alle Veröffentlichungen, Patentanmeldungen, Patente und weiteren hier angegebenen Literaturangaben sind voll inhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen.All publications, patent applications, patents, and other references cited herein are incorporated by reference in their entirety.
Beispiele, die der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung dienen, sind nachstehend angegeben.Examples which serve to illustrate the present invention are given below.
Beispiel 1example 1
Versuche zur Blutgerinnungshemmung durch das Thrombin-bindende Fusions-Aptamer der Sequenz SEQ ID NO: 98Experiments for anticoagulant by the thrombin-binding fusion aptamer of the sequence SEQ ID NO: 98
Die Thrombin-inhibierende Wirkung des Thrombin-bindenden Fusions-Aptamers der Sequenz 5'-GGTTGGTGTGGTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3' (SEQ ID NO: 98) wurde in einem einschrittigen Thrombin-basierten Gerinnungstest unter Verwendung eines Amelung-Coagulometer AMAX CS 190 (Amelung, Lemgo) bestimmt.The thrombin-inhibiting activity of the thrombin-binding fusion aptamer of the sequence 5'-GGTTGGTGTGGTTGGAAAAAAAAAAAAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3 '(SEQ ID NO: 98) was determined in a one-step thrombin-based coagulation assay using an Amelung Coagulometer AMAX CS 190 (Amelung, Lemgo). certainly.
Hierzu wurde humanes α-Thrombin (CellSystems, St. Katharinen) in PBS (pH 7,4; 3 mM MgCl2, 0,1% BSA) auf eine Konzentration von 2,5 NIH Einheiten/ml (NIH = National Institute of Health, USA; definiert biologische Einheiten) verdünnt und mit unterschiedlichen Konzentrationen des Thrombin-bindenden Fusions-Aptamers der Sequenz SEQ ID NO: 98 sowie den Aptameren der Sequenzen SEQ ID NO: 95 und SEQ ID NO: 97 versetzt, wobei eine halblogarithmische Verdünnungsserie startend von 1500 nM verwendet wurde.For this purpose, human α-thrombin (CellSystems, St. Katharinen) in PBS (pH 7.4, 3 mM MgCl 2 , 0.1% BSA) to a concentration of 2.5 NIH units / ml (NIH = National Institute of Health , Defined biological units) diluted and mixed with different concentrations of the thrombin-binding fusion aptamer of the sequence SEQ ID NO: 98 and the aptamers of the sequences SEQ ID NO: 95 and SEQ ID NO: 97, starting a semilogarithmic dilution series starting from 1500 nM was used.
Nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten bei at 37°C wurden 25 μl der Reaktionsmischung zu 50 μl humanem Citrat-Poolplasma (eigene Herstellung) gegeben und die Zeit bis zur Gerinnung der Testansätze bestimmt.After an incubation period of 10 minutes at 37 ° C., 25 μl of the reaction mixture were added to 50 μl of human citrated pool plasma (own preparation) and the time until coagulation of the test mixtures was determined.
Es konnte festgestellt werden, dass die Gerinnung bei Zugabe des Thrombin-bindenden Fusions-Aptamers der Sequenz SEQ ID NO: 98 bereits bei einer 30-fach geringeren Konzentrationen gegenüber dem Aptamer der Sequenz SEQ ID NO: 95 gehemmt wurde.It was found that the coagulation was inhibited with the addition of the thrombin-binding fusion aptamer of the sequence SEQ ID NO: 98 even at a 30-fold lower concentrations compared to the aptamer of the sequence SEQ ID NO: 95.
Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.This is followed by a sequence protocol according to WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.This can be downloaded from the official publication platform of the DPMA.
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