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Patents

  1. Advanced Patent Search
Publication numberDE102005034443 A1
Publication typeApplication
Application numberDE200510034443
Publication date22 Feb 2007
Filing date22 Jul 2005
Priority date22 Jul 2005
Publication number0510034443, 200510034443, DE 102005034443 A1, DE 102005034443A1, DE 2005/10034443 A1, DE-A1-102005034443, DE0510034443, DE102005034443 A1, DE102005034443A1, DE2005/10034443A1, DE200510034443
InventorsMichael Dr. Kempe, Ralf Dipl.-Phys. Wolleschensky
ApplicantCarl Zeiss Jena Gmbh
Export CitationBiBTeX, EndNote, RefMan
External Links: DPMA, Espacenet
Sample e.g. cell particle, luminescence microscopy method, involves prevailing one of sample regions for image of sample, so that image has local resolution which is enhanced in relation to excitation radiation distribution
DE 102005034443 A1
Abstract
The method involves displacing two partial regions of a sample in two states, respectively, while irradiation of excitation radiation (A) takes place with an excitation radiation distribution. An image of a luminescent sample has two sample regions in the states, respectively. One of the sample regions prevails for the image of the sample, so that the image has a local resolution which is enhanced in relation to the distribution. An independent claim is also included for a microscope for resolution enhanced luminescence microscopy of a sample.
Claims(30)  translated from German
  1. Auflösungsgesteigertes Lumineszenz-Mikroskopieverfahren, bei dem – eine Probe (P, Increased resolution luminescence microscopy method - in which a sample (P, 24 24 ) durch Einstrahlung von Anregungsstrahlung (A) zur Emission von bestimmter Lumineszenzstrahlung (F) angeregt wird und ein Bild der lumineszierenden Probe (P, ) Is excited by irradiation of excitation radiation (A) to issue certain luminescence (F) and an image of the luminescent sample (P, 24 24 ) gewonnen wird, wobei – die lumineszierende Probe (P, ) Is obtained, wherein - the luminescent sample (P, 24 24 ) aus einem ersten Lumineszenz-Zustand ( ) Of a first luminescence state ( 5 5 ), in dem die Anregbarkeit zur Emission der bestimmten Lumineszenzstrahlung (F) mit steigender Anregungsstrahlungsleistung bis zu einem Maximalwert ( ), In which the excitability for emission of certain luminescence (F) with increasing excitation radiation power up to a maximum value ( 18 18 ), welcher einem Anregungsstrahlungsleistungs-Schwellwert ( ), Which is an excitation radiation performance threshold ( 19 19 ) zugeordnet ist, steigt, in einen zweiten Lumineszenz-Zustand ( Is assigned), rising, in a second luminescence state ( 6 6 ) überführbar ist, in dem die Probe (P, ) Can be transferred, in which the sample (P, 24 24 ) gegenüber dem ersten Zustand ( ) Compared to the first state ( 5 5 ) verminderte Anregbarkeit zur Emission der bestimmten Lumineszenzstrahlung (F) aufweist, wobei die Probe (P, ) Reduced excitability for emission of the determined luminescence radiation (F), wherein the sample (P, 24 24 ) durch Einstrahlung von Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes ( ) By irradiation of exciting radiation power above the threshold value ( 19 19 ) in den zweiten Zustand ( ) In the second state ( 6 6 ) bringbar ist, – die Probe (P, ) Is engageable, - the sample (P, 24 24 ) in Teil-Bereichen (B1) in den ersten Zustand ( ) In partial areas (B1) in the first state ( 5 5 ) und in angrenzenden Teil-Bereichen (B2) in den zweiten Zustand ( ) And in the adjoining partial areas (B2) in the second state ( 6 6 ) versetzt wird, indem die Einstrahlung von Anregungsstrahlung (A) mit einer Anregungsstrahlungsverteilung erfolgt, die zumindest ein örtliches Leistungsmaximum über dem Schwellwert ( ) Is treated by the irradiation of excitation radiation (A) is carried out with an excitation radiation distribution which has at least a local power maximum above the threshold value ( 19 19 ) und zumindest ein örtliches, lokales Leistungsminimum ( ) And at least one local, local power minimum ( 45 45 ) unter dem Schwellwert aufweist, – das Bild der lumineszierenden Probe (P, ) Below the threshold value, - the image of the luminescent sample (P, 24 24 ) Proben-Bereiche (B1) im ersten Zustand ( ) Sample areas (B1) in the first state ( 5 5 ) und Proben-Bereiche (B2) im zweiten Zustand ( ) And sample areas (B2) in the second state ( 6 6 ) umfaßt, wobei zum Bild der lumineszierenden Probe (P, ), Wherein the image of the luminescent sample (P, 24 24 ) überwiegend Proben-Bereiche (B1) im ersten Zustand ( ) Mainly sample areas (B1) in the first state ( 5 5 ) beitragen und dadurch das Bild eine gegenüber der Anregungsstrahlungsverteilung gesteigerte Ortsauflösung hat. ) And contribute to make the image has a relation to the exciting radiation distribution increased spatial resolution.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem eine Probe (P, A method according to claim 1, in which a sample (P, 24 24 ) verwendet wird, die nach Überführung in den zweiten Zustand ( ) Is used, after conversion to the second state ( 6 6 ) wieder in den ersten Zustand ( ) Back to the first state ( 5 5 ) zurückkehrt, entweder durch aktive Einwirkung oder spontan. ) Returns, either by action or spontaneously active.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem eine Rücksetzstrahlung (R) eingestrahlt wird, die die Probe (P, The method of claim 2, wherein a reset radiation (R) is irradiated which the sample (P, 24 24 ) aus dem zweiten Zustand ( ) From the second state ( 6 6 ) in den ersten Zustand ( ) In the first state ( 5 5 ) zurücksetzt und die von der Anregungsstrahlung (A) verschiedene optische Eigenschaften hat. ) Resets and of the excitation radiation (A) having different optical properties.
  4. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem das Bild durch Abscannen der Probe (P, Method according to one of the above claims, wherein the image by scanning the sample (P, 24 24 ) mit einem Spot-, Zeilen- oder Multispotmuster ( ) With a spot, line or multi-spot pattern ( 58 58 ) gewonnen wird und insbesondere zwischen zwei Scanschritten Rücksetzstrahlung (R) eingestellt wird. ) Is obtained and in particular between two scan steps reset radiation (R) is set.
  5. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem eine Probe (P, Method according to one of the above claims, in which a sample (P, 24 24 ) verwendet wird, die bei einer Anregungsstrahlungsleistung über dem Schwellwert ( ) Is used, the excitation radiation at a power above the threshold value ( 19 19 ) nicht luminesziert, Lumineszenzstrahlung mit anderen Eigenschaften als die bestimmte Lumineszenzstrahlung (F) abstrahlt und/oder geänderte, zu verminderter Lumineszenz führende Eigenschaften aufweist. ) Does not luminesce, with luminescence properties other than the specific luminescence (F) emits and / or has changed, leading to reduced luminescence properties.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die Anregungsstrahlungsverteilung beugungsbegrenzt ist. Method according to one of claims 1 to 5, wherein the excitation radiation distribution is diffraction limited.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem eine torusförmig verteilte Anregungsstrahlung (A) verwendet wird und vorzugsweise zusätzlich bei der Detektion der Lumineszenzstrahlung (F) außerhalb des Torus liegende Proben-Bereiche ausgeblendet werden. The method of claim 6, wherein a toroidal distributed excitation radiation is used (A) and preferably additionally be hidden in the detection of luminescence radiation (F) lying outside the torus sample areas.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die Anregungsstrahlungsverteilung (A) eine linienförmige oder flächige strukturierte Probenbeleuchtung, insbesondere gemäß eines Streifen- oder Kreuzgitters, aufweist sowie bei dem eine ortsaufgelöste Detektion zur Bildgewinnung verwendet wird. Method according to one of claims 1 to 5, wherein the excitation radiation distribution (A) a linear or two-dimensional structured sample illumination, in particular according to a strip or cross grid has, and wherein the spatially resolved detection is used for image recovery.
  9. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem eine konfokale Detektion (D) von im ersten Zustand ( Method according to one of the above claims, in which a confocal detection (D) of the first state ( 5 5 ) befindlichen Proben-Bereichen (B1) durchgeführt wird. ) Located sample areas (B1) is carried out.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem eine Tiefenauflösungssteigerung entlang der optischen Achse (OA) erfolgt, indem das Leistungsminimum ( Method according to one of claims 1 to 9, wherein a depth resolution enhancement along the optical axis (OA) is effected by the power minimum ( 45 45 ) unter dem Schwellwert ( ) Is below the threshold ( 19 19 ) und das Leistungsmaximum über dem Schwellwert ( ) And the maximum power above the threshold value ( 19 19 ) entlang der optischen Achse (OA) benachbart sind. ) Are adjacent along the optical axis (OA).
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem eine Tiefenauflösungssteigerung entlang der optischen Achse erfolgt, indem zuerst in einem die Fokusebene enthaltenden Tiefenbereich Anregungsstrahlung (A) mit einer Leistung über dem Schwellwert eingestrahlt wird, in die Fokusebene Rücksetzstrahlung (R) eingestrahlt wird und anschließend die Anregungsstrahlung (A) mit der Anregungsstrahlungsverteilung eingestrahlt wird, wobei das Leistungsminimum ( Method according to one of claims 1 to 9, wherein a depth resolution enhancement along the optical axis is carried out by first, in a focal plane containing depth range excitation radiation (A) with a power irradiated above the threshold value, in the focal plane reset radiation (R) is irradiated and Subsequently, the excitation radiation (A) is irradiated with the excitation radiation distribution, wherein the power minimum ( 45 45 ) im Fokusbereich liegt. ) Is in the focus area.
  12. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem entweder in Proben-Bereichen (B1), die den ersten Zustand ( Method according to one of the above claims, wherein either in sample areas (B1) corresponding to the first state ( 5 5 ), oder in Proben-Bereichen (B2), die den zweiten Zustand ( ), Or in sample areas (B2), which the second state ( 6 6 ) aufweisen, die Anregungsstrahlungsleistung gemäß einer Referenzfrequenz moduliert wird, und diese Referenzfrequenz bei der Detektion der Lumineszenzstrahlung im Wege der Lock-In-Technik verwendet wird. ) Which the excitation radiation power is modulated according to a reference frequency, and this reference frequency is used in the detection of the luminescent radiation in the way of the lock-in technique.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem zusätzliche aus einem Gleichsignalanteil (S) ein niedrig aufgelöstes Bild gewonnen wird. The method of claim 12, wherein the additional of a direct signal component (S) is a low resolution image is recovered.
  14. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem eine fluoreszierende Probe (P, Method according to one of the above claims, wherein a fluorescent sample (P, 24 24 ) verwendet wird, insbesondere eine mit mindestens einem Fluorophor versehene Probe (P, ) Is used, in particular one provided with at least one fluorophore sample (P, 24 24 ). ).
  15. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem zusätzlich ein Bild mit Anregungsstrahlungsverteilung ohne Leistungsminimum ( Method according to one of the above claims, wherein in addition an image with excitation radiation distribution without power minimum ( 45 45 ) unter dem Schwellwert aufgenommen und zur Differenzbildung verwendet wird. ) Is incorporated under the threshold and used for subtraction.
  16. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem eine Lumineszenzkennlinie ( Method according to one of the above claims, wherein a Lumineszenzkennlinie ( 17 17 ), die emittierte Lumineszenzleistung als Funktion der Anregungsstrahlungsleistung angibt, ausgewertet, daraus der Schwellwert ( ) Indicating emitted luminescence as a function of excitation radiation power, evaluated from the threshold value ( 19 19 ) ermittelt und/oder die Anregungsstrahlungsverteilung kennlinienabhängig gewählt wird. ) Is determined and / or the excitation radiation distribution is chosen depending on characteristic curve.
  17. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem die Anregungsstrahlungsverteilung iterativ unter Auswertung der Bildauflösung optimiert wird. Method according to one of the above claims, wherein the excitation radiation distribution is optimized iteratively while evaluating the image resolution.
  18. Mikroskop zur auflösungsgesteigerten Lumineszenz-Mikroskopie, das aufweist: – Mittel ( Microscope for resolution-enhanced luminescence microscopy, comprising: - means ( 21 21 , . 22 22 ) zur Anregung von Lumineszenz, die Anregungsstrahlung (A) auf die Probe (P, ) For excitation of luminescence, the excitation radiation (A) on the sample (P, 24 24 ) einstrahlen und damit die Emission bestimmter Lumineszenzstrahlung (F) in der Probe (P, ) Irradiating and thereby the emission of certain luminescence radiation (F) in the sample (P, 24 24 ) anregen, – Mittel ( ) Encourage - Medium ( 22 22 , . 23 23 ) zur Gewinnung eines Bildes der lumineszierenden Probe (P, ) For obtaining an image of the luminescent sample (P, 24 24 ), – wobei die Mittel zur Anregung die Anregungsstrahlung (A) mit einer bestimmten Anregungsstrahlungsverteilung einstrahlen, die zumindest ein örtliches Leistungsmaximum aufweist, das über einem Schwellwert ( ), - Wherein the means for exciting the excitation radiation (A) with a particular excitation radiation distribution irradiation, which has at least a local power maximum which exceeds a threshold value ( 19 19 ) liegt, und zumindest ein örtliches, lokales Leistungsminimum ( ), And at least a local, local power minimum ( 45 45 ) aufweist, das unter dem Schwellwert ( ) Which is below the threshold value ( 19 19 ) liegt, – wobei der Schwellwert ( ) Is situated, - wherein the threshold value ( 19 19 ) zwei Lumineszenz-Regionen ( ) Two luminescent regions ( 5 5 , . 6 6 ) der Probe (P, ) Of the sample (P, 24 24 ) trennt, eine erste, bei Anregungsstrahlungsleistungen unterhalb des Schwellwertes ( ) Separates a first, upon excitation radiation powers below the threshold ( 19 19 ) vorliegende Zustands-Region ( ) Present state region ( 5 5 ), in der die Anregbarkeit zur Emission der bestimmten Lumineszenzstrahlung (F) mit steigender Anregungsstrahlungsleistung bis zu einem Maximalwert ( ) In the excitability of certain luminescence emission (F) with increasing excitation radiation power up to a maximum value ( 18 18 ), welcher am Schwellwert ( ), Which at the threshold value ( 19 19 ) erreicht wird, steigt, und einer zweiten bei und/oder nach Anregungsstrahlungsleistungen oberhalb des Schwellwertes ( ) Is achieved, increases, and at a second and / or after excitation radiation powers above the threshold value ( 19 19 ) vorliegende Zustands-Region ( ) Present state region ( 6 6 ), in der die Probe (P, ), In which the sample (P, 24 24 ) eine gegenüber der ersten Region ( ) One opposite the first region ( 5 5 ) verminderte Anregbarkeit zur Emission der bestimmten Lumineszenzstrahlung (F) aufweist, und – wobei die Mittel zur Bildgewinnung Proben-Bereiche (B1) in der ersten Region ( ) Decreased excitability for emission of certain luminescence (F), and - the means for imaging sample areas (B1) in the first region ( 5 5 ), die mit Anregungsstrahlungsleistung unterhalb des Schwellwertes ( ), With the excitation radiation power is below the threshold value ( 19 19 ) bestrahlt wurden, und Proben-Bereiche (B2) in der zweiten Region ( ) Were irradiated, and sample areas (B2) in the second region ( 6 6 ), die mit Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes ( ), With the excitation radiation power above the threshold value ( 19 19 ) bestrahlt wurden, erfassen, wobei zum Bild der Probe überwiegend Proben-Bereiche (B1) in der ersten Region ( ) Were irradiated, capture, wherein the image of the sample predominantly sample areas (B1) in the first region ( 5 5 ) beitragen und dadurch das Bild eine gegenüber der Anregungsstrahlungsverteilung gesteigerte Ortsauflösung hat. ) And contribute to make the image has a relation to the exciting radiation distribution increased spatial resolution.
  19. Mikroskop nach Anspruch 18, mit einer Anregungsstrahlungsquelle ( Microscope according to claim 18, comprising an excitation radiation source ( 30 30 ), welche die Anregungsstrahlung (A) abgibt, und einer der Anregungsstrahlungsquelle nachgeordneten Einrichtung ( ), Which emits the excitation radiation (A), and one of the excitation radiation source means downstream ( 36 36 - 40 40 ), welche einen Anregungsstrahl abgibt, der ein Strahlprofil mit dem Leistungsminimum ( ), Which emits an excitation beam, a beam profile with the power minimum ( 45 45 ) hat, das eine unter dem Schwellwert ( ) Has one less than the threshold ( 19 19 ) liegende Anregungsstrahlungsleistung hat. ) Exciting radiation power has lying.
  20. Mikroskop nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß eine Scannereinrichtung ( Microscope according to claim 18 or 19, characterized in that a scanner device ( 28 28 ) die Probe (P, ), The sample (P, 24 24 ) mit Anregungsstrahlung (A) abrastert. ) With excitation radiation (A) scans.
  21. Mikroskop nach Anspruch 20, wobei die Anregungsstrahlungsverteilung mindestens ein beugungsbegrenztes Punktbild aufweist. Microscope according to claim 20, wherein the excitation radiation distribution comprises at least one diffraction limited spot image.
  22. Mikroskop nach Anspruch 21, wobei die Anregungsstrahlungsverteilung mindestens einen linienförmigen oder streifen- oder gitterförmigen Proben-Bereich mit Anregungsstrahlung (A) beleuchtet, wobei die Anregungsstrahlungsleistung in Teilen des Streifens bzw. Gitters über dem Schwellwert ( Microscope according to claim 21, wherein the excitation radiation distribution of at least one line-shaped or strip-like or lattice-like sample area with excitation radiation (A) illuminated, wherein the excitation radiation power in parts of the strip or grating above the threshold value ( 19 19 ) und in Teilen des Streifen bzw. Gitters unter dem Schwellwert ( ) And in parts of the strip or grid below the threshold ( 19 19 ) liegt. ) Is located.
  23. Mikroskop nach einem der Ansprüche 18 bis 22, wobei die Anregungsstrahlungsverteilung das örtliche Leistungsminimum ( Microscope according to one of claims 18 to 22, wherein the excitation radiation distribution, the local power minimum ( 45 45 ) und das örtliche Leistungsminimum entlang der optischen Achse (OA) benachbart sind. ) And the local power minimum along the optical axis (OA) are adjacent.
  24. Mikroskop nach einem der Ansprüche 18 bis 23, gekennzeichnet durch Mittel ( Microscope according to one of claims 18 to 23, characterized by means ( 41 41 , . 42 42 ) zum Rücksetzen der Probe ( ) To reset the sample ( 24 24 ) aus der zweiten ( ) From the second ( 6 6 ) in die erste Zustands-Region ( ) In the first state region ( 5 5 ), die eine Strahlquelle ( ) Comprising a beam source ( 41 41 ), welche Rücksetzstrahlung (R) mit von der Anregungsstrahlung (A) verschiedenen optischen Eigenschaften aussendet, und eine Optik ( ), Which reset radiation (R) from the excitation radiation (A) emits different optical properties, and an optical system ( 42 42 ) zum Einkoppeln der Rücksetzstrahlung (R) aufweisen. ) For coupling in the reset radiation (R).
  25. Mikroskop nach einem der Ansprüche 18 bis 24, gekennzeichnet durch einen Intensitätsmodulator ( Microscope according to one of claims 18 to 24, characterized by an intensity modulator ( 37 37 , . 38 38 , . 49 49 , . 35 35 ), der die Verteilung der Anregungsstrahlung (A) mit einer Referenzfrequenz moduliert, und einen in den Mitteln zur Bildgewinnung vorgesehenen oder damit verbundenen Lock-In-Verstärker ( ), Which modulates the distribution of the excitation radiation (A) with a reference frequency, and a slot provided in the means for imaging or associated lock-in amplifier ( 48 48 ), der die Referenzfrequenz auswertet und Hintergrundstrahlung (S) reduziert. ), Which evaluates the reference frequency and background radiation (S) is reduced.
  26. Mikroskop nach Anspruch 25, mit einem Gleichsignalsausgang zur Gewinnung eines zusätzlichen niedrig aufgelösten Bildes. Microscope according to claim 25, with a DC signal output for obtaining an additional low resolution image.
  27. Mikroskop nach einem der Ansprüche 18 bis 26 mit einem Steuergerät ( Microscope according to one of claims 18 to 26 with a control unit ( 35 35 ), das das Mikroskop zur Ausführung eines der Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 ansteuert. ), Which drives the microscope for performing one of the methods according to any one of claims 1 to 17.
  28. Mikroskop nach einem der Ansprüche 18 bis 27, mit einem Steuergerät ( Microscope according to one of claims 18 to 27, with a control device ( 35 35 ), das die Mittel zur Anregung und die Mittel zur Bildgewinnung ansteuert bzw. ausliest und die Anregungsstrahlungsverteilung zur Optimierung der Bildauflösung einstellt. ), Which controls the means of excitation and the means for image acquisition, or reading and the exciting radiation distribution is adjusted to optimize the image.
  29. Mikroskop nach Anspruch 28, bei dem das Steuergerät ( Microscope according to claim 28, wherein the control device ( 35 35 ) eine Speicher- oder Dateneingabeeinrichtung aufweist, über die dem Steuergerät eine Lumineszenzkennlinie ( ) Comprises a storage or data input device via which the control device a Lumineszenzkennlinie ( 17 17 ) verfügbar ist, wobei die Lumineszenzkennlinie ( Is) available, the Lumineszenzkennlinie ( 17 17 ) die emittierte Lumineszenzleistung als Funktion der Anregungsstrahlungsleistung wiedergibt und wobei das Steuergerät ( ) Represents the emitted luminescence as a function of excitation radiation power and wherein the controller ( 35 35 ) aus der Lumineszenzkennlinie ( ) From the Lumineszenzkennlinie ( 17 17 ) den Schwellwert ( ) The threshold value ( 19 19 ) ermittelt und/oder die Anregungsstrahlungsverteilung kennlinienabhängig einstellt. ) Is determined and / or adjusting the excitation radiation distribution depending on characteristic curve.
  30. Mikroskop nach Anspruch 28, bei dem das Steuergerät ( Microscope according to claim 28, wherein the control device ( 35 35 ) aus dem Bild der Probe (P, ) From the image of the sample (P, 24 24 ) die Auflösung ermittelt und die Anregungsstrahlungsverteilung iterativ zur Optimierung der Bildauflösung einstellt. ) Determines the resolution and the exciting radiation distribution is adjusted iteratively to optimize the image.
Description  translated from German
  • [0001] [0001]
    Die Erfindung bezieht sich auf die auflösungsgesteigerte Lumineszenzmikroskopie und insbesondere auf ein Verfahren, bei dem eine zu untersuchende lumineszierende Probe mit Anregungsstrahlung beleuchtet wird und ein Bild der zur Lumineszenz angeregten Probe gewonnen wird. The invention relates to the resolution increased luminescence and more particularly to a method in which an under investigation luminescent sample is illuminated with excitation radiation and a picture of the excited luminescence sample is obtained. Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein Mikroskop zur auflösungsgesteigerten Lumineszenzmikroskopie einer Probe, das Mittel zur Anregung von Lumineszenz, die in der Probe Anregungsstrahlung einstrahlen und Mittel zur Gewinnung eines Bildes der angeregten Probe aufweist. The invention further relates to a microscope for resolution-enhanced luminescence of a sample, the means for excitation of luminescence, which radiate in the sample excitation radiation and means for obtaining an image of the excited sample.
  • [0002] [0002]
    Ein klassisches Anwendungsgebiet der Lichtmikroskopie zur Untersuchung von biologischen Präparaten ist die Lumineszenzmikroskopie. A classic application field of light microscopy for the study of biological specimens is the luminescence. Hierbei werden bestimmte Farbstoffe (sogenannte Phosphore oder Fluorophore) zur spezifischen Markierung von Proben, zB von Zellteilen, verwendet. In this case, certain dyes (so-called phosphors or fluorophores), used for specific labeling of samples, eg of cell parts. Die Probe wird, wie erwähnt, mit Anregungsstrahlung beleuchtet und das dadurch angeregte Lumineszenzlicht mit geeigneten Detektoren erfaßt. The sample is, as mentioned, is illuminated with excitation radiation and the excited luminescence detected thereby with suitable detectors. Üblicherweise ist dazu im Lichtmikroskop ein dichroitischer Strahlteiler in Kombination mit Blockfiltern vorgesehen, die die Fluoreszenzstrahlung von der Anregungsstrahlung abspalten und eine getrennte Beobachtung ermöglichen. Usually, a dichroic beam splitter in combination with blocking filters is provided for this purpose in the light microscope, which eliminate the fluorescence radiation from the excitation radiation and enable separate observation. Durch dieses Vorgehen ist die Darstellung einzelner, verschieden gefärbter Zellteile im Lichtmikroskop möglich. Through this approach, the representation of individual, differently colored cell parts in the light microscope is possible. Natürlich können auch mehrere Teile eines Präparates gleichzeitig mit verschiedenen, sich spezifisch an unterschiedliche Strukturen des Präparates anlagernden Farbstoffen eingefärbt werden. Of course, several parts of a preparation can be dyed simultaneously with different bind in a specific to different structures of the specimen dyes. Dieses Verfahren bezeichnet man als Mehrfachlumineszenz. This method is referred to as multiple luminescence. Auch kann man Proben vermessen, die per se, also ohne Farbstoffzugabe lumineszieren. One can also measure sample which luminesce per se without dye addition.
  • [0003] [0003]
    Lumineszenz wird hier, wie allgemein üblich, als Oberbegriff für Phosphoreszenz und Fluoreszenz verstanden, erfaßt also beide Prozesse. Luminescence is here, as is usually understood as a generic term for phosphorescence and fluorescence, ie detects both processes.
  • [0004] [0004]
    Weiter ist es zur Probenuntersuchung bekannt, Laser-Scanning-Mikroskope (auch LSM abgekürzt) zu verwenden, die aus einem dreidimensional ausgeleuchteten Bild mittels einer konfokalen Detektionsanordnung (dann spricht man von einem konfokalen LSM) oder einer nichtlinearen Probenwechselwirkung (sogenannte Multiphotonenmikroskopie) nur diejenige Ebene wiedergeben, die sich in der Fokusebene des Objektives befindet. Further, it is for sample analysis known laser scanning microscope (also abbreviated LSM) to use, consisting of a three-dimensionally illuminated image using a confocal detection arrangement (we speak of a confocal LSM) or a non-linear sample interaction (called multiphoton microscopy) only that level play, which is located in the focal plane of the objective. Es wird ein optischer Schnitt gewonnen, und die Aufzeichnung mehrerer optischer Schnitte in verschiedenen Tiefen der Probe erlaubt es anschließend, mit Hilfe eines geeigneten Datenverarbeitungsgerätes ein dreidimensionales Bild der Probe zu generieren, das aus den verschiedenen optischen Schnitten zusammengesetzt ist. There is obtained an optical section, and recording a plurality of optical sections at different depths of the sample is then allowed to generate by means of a suitable data processing device, a three-dimensional image of the sample, which is composed of the various optical sections. Die Laser-Scanning-Mikroskopie ist somit zur Untersuchung von dicken Präparaten geeignet. The laser scanning microscopy is suitable for examination of thick preparations.
  • [0005] [0005]
    Natürlich wird auch eine Kombination von Lumineszenzmikroskopie und Laser-Scanning-Mikroskopie verwendet, bei der eine lumineszierende Probe in verschiedenen Tiefenebenen mit Hilfe eines LSM abgebildet wird. Of course, a combination of luminescence microscopy and laser scanning microscopy is used in a luminescent sample is imaged at different depth levels using an LSM.
  • [0006] [0006]
    Prinzipiell ist die optische Auflösung eines Lichtmikroskopes, auch eines LSM, durch die physikalischen Gesetze beugungsbegrenzt. In principle, the optical resolution of a light microscope, and an LSM, diffraction-limited by the laws of physics. Zur optimalen Auflösung innerhalb dieser Grenzen sind spezielle Beleuchtungskonfigurationen bekannt, wie beispielsweise 4Pi-Anordnung oder Anordnungen mit Stehwellenfeldern. For optimal resolution within those limits, special lighting configurations known, such as 4Pi arrangement or arrangements with standing wave fields. Damit kann die Auflösung, insbesondere in axialer Richtung gegenüber einem klassischen LSM deutlich verbessert werden. In order for the resolution, especially in the axial direction with respect to a classic LSM can be significantly improved. Mit Hilfe nicht-linearer Entvölkerungsprozesse kann weiter die Auflösung auf einen Faktor von bis zu 10 gegenüber einem beugungsbegrenzten konfokalen LSM angehoben werden. Using non-linear depopulation can be further increased to a factor of up to 10 compared to a diffraction limited confocal LSM the resolution.
  • [0007] [0007]
    Die The 1a 1a /b zeigen ein solches Verfahren, wie es zB in / B show such a process, as described for example in US 5866911 US 5866911 beschrieben ist. is described. Dabei wird zur Auflösungssteigerung mit einer zwei Wellenlängen aufweisenden Lichtstrahlung gearbeitet. In this case, having light radiation is increasing the resolution with a dual wavelength worked. Die Lichtstrahlung der einen Wellenlänge wird als Anregungslichtstrahl The light radiation of a wavelength than the excitation light beam 1 1 auf die zu messende Probe mittels eines Objektives fokussiert und regt dort Lumineszenz, hier Fluoreszenz, an. focused on the sample to be measured by means of a lens and excites luminescence, here fluorescence, to. Die Darstellung in den The illustrations in the 1a 1a /b zeigt zur Vereinfachung nur den eindimensionalen Fall. / B is designed to display only the one-dimensional case. Die Erhöhung der Ortsauflösung erfolgt nun dadurch, daß ein Lichtstrahl The increase of the spatial resolution is now characterized in that a light beam 2 2 mit der anderen Wellenlänge in Teilbereichen den durch den Anregungslichtstrahl angeregten fluoreszierenden Zustand entvölkert. depopulated with the other wavelength in some areas excited by the excitation light beam fluorescent state. Man bezeichnet diesen Lichtstrahl deshalb auch als „Entvölkerungs-Strahlung". Nun erfolgt die Einstrahlung zB so, daß sich das Hauptmaximum des Entvölkerungs-Lichtstrahls We call this light therefore known as "depopulation radiation". Now the irradiation is carried out, for example, so that the main maximum of the depopulation light beam 2 2 und das Hauptmaximum des Anregungslichtstrahls and the main maximum of the excitation light beam 1 1 teilweise überdecken, wie es in partially overlap, as in 1a 1a gut zu erkennen ist. is clearly visible. Durch diese „Abregung" der Probe an den Rändern des mit Anregungsstrahlung This "de-excitation" of the sample at the edges of the excitation radiation with 1 1 beleuchteten Bereiches, sendet nur noch ein reduziertes Volumen illuminated area, sends only a reduced volume 3 3 Fluoreszenz aus, wie in Fluorescence from, as in 1b 1b gut zu sehen ist. is good to see. Die Auflösung ist durch diese Volumenreduktion folglich gesteigert. The resolution is therefore increased by this volume reduction.
  • [0008] [0008]
    2a 2a –c zeigen drei mögliche Mechanismen, mit denen eine solche Entvölkerung erfolgen kann. -c show three possible mechanisms by which such a depopulation can occur. In In 2a 2a ist der Prozeß der Abregung durch stimulierte Emission (STED) dargestellt. is shown, the process of de-excitation by stimulated emission (STED). Die Anregungsstrahlung liegt im Fluorophor des Niveaus S1 an (Pfeil A). The excitation radiation is in the fluorophore of the levels S1 (arrow A). Die Entvölkerung des derart angeregten Niveaus S1 wird in Richtung des Grundniveaus S0 durch Lichtstrahlung mit einer Wellenlänge im Bereich der Fluoreszenzwellenlänge bewerkstelligt. The depopulation of the excited state S1 is done in such a way in the direction of the ground level S0 by light radiation with a wavelength in the range of the fluorescence wavelength. Pfeil SE zeigt diese stimulierte Emission, deren Wellenlänge der der Lumineszenz (Pfeil F) fast identisch entspricht. SE arrow shows this stimulated emission whose wavelength of luminescence (arrow F) is almost identical. Somit ist die Anregungswellenlänge um den Betrag des Stokesshiftes kurzwelliger als die der Entvölkerungs-Strahlung. Thus, the excitation wavelength by the amount of the Stokes shift with a wavelength shorter than that of the depopulation radiation. Die Auflösungssteigerung gemäß dieses Ansatzes benötigt also zwei unterschiedliche Lichtquellen, wie auch der Stand der Technik in Form der The increase in resolution in accordance with this approach thus requires two different light sources, as well as the state of the art in the form of DE 4416558 C2 DE 4416558 C2 belegt. occupied.
  • [0009] [0009]
    2b 2b veranschaulicht einen weiteren möglichen Prozeß der Entvölkerung für das angeregte Niveau S1 (Pfeil A), indem eine Anregung in ein noch höheres Niveau S2 (Pfeil A+) erfolgt, das keine Lumineszenz mehr aussenden kann. illustrates another possible process of depopulation of the excited level S1 (arrow A) by an excitation takes place in an even higher level S2 (arrow A +), which can no longer emit luminescence. Dieses Anheben wird im Englischen als Excited State Absorption bezeichnet, weshalb dieses Vorgehen auch mit dem Kürzel ESA belegt ist. This lifting is referred to in English as Excited State Absorption why this approach is also assigned the symbol ESA. Eine entsprechende Schilderung dieses Prozesses findet sich beispielsweise in der A similar account of this process can be found for example in the US 6633432 US 6633432 . , Da der Abstand der Energieniveaus in einer Probe bzw. einem Farbstoff zu höheren Niveaus hin abnimmt, verwendet man zur Entvölkerung bei dem ESA-Prozeß eine Lichtquelle mit einer geringeren Energie und damit längeren Wellenlänge, als zur Anregung. Since the distance of the energy levels in a sample or a dye decreases to higher levels out is used for the depopulation wherein the ESA process, a light source with a lower energy and hence longer wavelength, as for excitation. Man braucht also wiederum zwei verschiedene Lichtquellen. So you need turn two different light sources.
  • [0010] [0010]
    Ein weiteres Verfahren zur Entvölkerung stellt für die Fluoreszenz die sogenannte Reversible Saturable Optical Fluorescence Transition dar, die zB in Another method for depopulation represents for Saturable Optical fluorescence, the so-called reversible transition Fluorescence, for example, in DE 10325460 A1 DE 10325460 A1 beschrieben und in and described in 2c 2c veranschaulicht ist. is illustrated. Dieser Ansatz verwendet zum räumlich hochauflösenden Abbilden einen Farbstoff, der mit Hilfe eines Umschaltstrahls This approach uses the high spatial resolution imaging of a dye using a Umschaltstrahls 4 4 wiederholt aus einem ersten Zustand repeated from a first state 5 5 , in dem Fluoreszenz stattfindet, in einen zweiten Zustand In which fluorescence takes place in a second state 6 6 , in dem der Farbstoff nicht fluoresziert, überführbar ist, wobei der Farbstoff aus dem zweiten Zustand In which the dye does not fluoresce, is transferable, the dye from the second state 6 6 in den ersten Zustand in the first state 5 5 zurückkehren kann, wie can return, as 2c 2c veranschaulicht. illustrated. Die Probe mit dem Farbstoff wird in Teilbereichen mit dem Umschaltstrahl The sample with the dye is in some areas with the Umschaltstrahl 4 4 in den zweiten Zustand in the second state 6 6 überführt, wobei ein definierter Bereich der Probe ausgelassen wird. transferred, with a defined area of the sample is omitted. Mit einem Anregungsstrahl With an excitation beam 1 1 wird dann Fluoreszenzlicht is then fluorescent light 7 7 angeregt und anschließend registriert. stimulated and subsequently registered. Das Fluoreszenzlicht The fluorescent light 7 7 stammt dann nur aus Probenvolumina, die zuvor nicht mit dem Umschaltstrahl then only comes from sample volumes that were not previously with the Umschaltstrahl 7 7 beaufschlagt wurden. were applied. Durch geeignete Überlappung von Anregungsstrahl By a suitable overlap of the excitation beam 1 1 und Umschaltstrahl and Umschaltstrahl 4 4 ist das Volumen, aus dem Fluoreszenzlicht is the volume from which fluorescent light 7 7 emittiert wird, kleiner, als es die Auflösung des Anregungsstrahls is emitted less than the resolution of the excitation beam 1 1 und die Schärfe der Nullstelle des Umschaltstrahls and the sharpness of the zero of the Umschaltstrahls 4a 4a priori erlaubten. priori allowed.
  • [0011] [0011]
    In allen drei genannten Verfahren gemäß According to all three of these methods 2a 2a bis to 2c 2c erfolgt also die Verhinderung von Fluoreszenz durch den Einsatz von Lichtstrahlung mit einer Wellenlänge, die ungleich der Wellenlänge zur Anregung ist. Thus, the prevention of fluorescence takes place through the use of light radiation with a wavelength that is not equal to the wavelength for excitation. Zugleich muß diese Lichtstrahlung mindestens eine schart begrenzte örtliche Nullstelle der Strahlungsleistung aufweisen, die die endgültige Auflösung der detektierten Fluoreszenzstrahlung bestimmt. At the same time, these light rays must have at least a sharply limited local zero of the radiation power, which determines the final resolution of the detected fluorescence radiation. Sobald die Nullstelle nur mehr als Minimum ausgebildet ist und nicht völlig auf Null zurückgeht, verringert sich weiter die Fluoreszenzleistung und damit die Effizienz des Verfahrens. Once the root is only designed as a minimum and not fully return to zero, further reduced the fluorescence power and thus the efficiency of the process. Dies liegt zB bei Aberrationen der optischen Anordnung bzw. im Präparat vor. This is for example in aberrations of the optical arrangement or in preparation.
  • [0012] [0012]
    3 3 zeigt eine bekannte Vorrichtung, die eines der drei genannten Verfahren zur Auflösungssteigerung verwendet, im Beispiel der shows a prior art device using one of the three aforementioned methods for resolution enhancement, in the example of 3 3 den STED-Prozeß. the STED process. Eine Anregungsstrahlquelle An excitation beam source 8 8 erzeugt eine Airy-Verteilung in der Probe generates an Airy distribution in the sample 10 10 , mit der die Probe aus dem Grundniveau S0 in den angeregten Zustand S1 überführt wird. With which the sample is transferred from the ground level to the excited state S0 S1. Die Entvölkerung des Zustands S1 erfolgt mittels einer Entvölkerungslichtquelle The depopulation of the state S1 by means of a Entvölkerungslichtquelle 11 11 , die unter die Verwendung einer Phasenplatte Covered by the use of a phase plate 12 12 eine donut- oder torus-förmigen Strahlverteilung a donut or torus-shaped beam distribution 13 13 in der Probe in the sample 10 10 hat. has. Die Lumineszenzstrahlung der nicht-entvölkerten dh nicht-abgeregten Farbstoffmoleküle wird mit Hilfe eines Detektors The luminescence radiation of the non-depopulated ie non--excited dye molecules, with the aid of a detector 14 14 erfaßt. detected. Durch die Entvölkerung wird die Auflösung des Mikroskops über die Beugungsbegrenzung, die sich aus der Airy-Verteilung ergibt, hinaus gesteigert. Due to the depopulation of the resolution of the microscope over the diffraction limit, which results from the Airy distribution, also increased. Dies kommt durch eine verkleinerte Punktverwaschungsverteilung This is due to a reduced point-spread 15 15 des hochauflösenden Mikroskops im Vergleich zum konventionellen Mikroskop The high-resolution microscope compared to a conventional microscope 16 16 zum Ausdruck. expressed.
  • [0013] [0013]
    Ein weiteres Verfahren zur Auflösungssteigerung wird in der Another method for increasing the resolution is in the EP 1157297 B1 EP 1157297 B1 angesprochen. addressed. Dabei sollen mittels strukturierter Beleuchtung nichtlineare Prozesse ausgenützt werden. It should be exploited using structured illumination nonlinear processes. Als Nichtlinearität erwähnt die Druckschrift dabei die Sättigung der Fluoreszenz. As a non-linearity, the document mentioned here the saturation of the fluorescence. Das geschilderte Verfahren nimmt in Anspruch, durch eine strukturierte Beleuchtung eine Verschiebung des Objektraumspektrums relativ zur Übertragungsfunktion des optischen Systems zu realisieren. The described method takes, be realized by a structured illumination, a displacement of the object space spectrum relative to the transfer function of the optical system. Konkret bedeutet die Verschiebung des Spektrums, daß Objektraumfrequenzen V0 bei einer Raumfrequenz V0–Vm, wobei Vm die Frequenz der strukturierten Beleuchtung ist, übertragen werden. In practice, the shift of the spectrum that object space frequencies V0 are at a spatial frequency V0-Vm, where Vm is the frequency of the structured illumination. Bei gegebener durch das System maximal übertragbarer Raumfrequenz ermöglicht dies den Transfer von um die Verschiebefrequenz Vm über der maximalen Frequenz der Übertragungsfunktion liegender Raumfrequenzen des Objektes. For a given maximum transmitted by the system frequency space, this enables the transfer of the displacement frequency Vm lying above the maximum frequency of the transfer function of the spatial frequencies of the object. Dieser Ansatz erfordert einen Rekonstruktionsalgorithmus zur Bilderzeugung und die Verwertung mehrerer Aufnahmen für ein Bild. This approach requires a reconstruction algorithm for image generation and utilization of several recordings for a picture.
  • [0014] [0014]
    Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Lumineszenzmikroskopieverfahren bzw. ein Lumineszenzmikroskop anzugeben, das eine Auflösungssteigerung ohne Rückgriff auf mehrere Wellenlängen bzw. ohne aufwendige Bildrekonstruktionsalgorithmen erreicht. The invention is therefore an object of the invention to provide a Lumineszenzmikroskopieverfahren or a luminescence that achieves a resolution enhancement without resorting to multiple wavelengths or without complex image reconstruction algorithms.
  • [0015] [0015]
    Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst mit einem auflösungsgesteigerten Lumineszenz-Mikroskopieverfahren, bei dem eine Probe durch Einstrahlung von Anregungsstrahlung zur Emission von bestimmter Lumineszenzstrahlung angeregt wird und ein Bild der lumineszierenden Probe gewonnen wird, wobei die lumineszierende Probe aus einem ersten Lumineszenz-Zustand, in dem die Anregbarkeit zur Emission der bestimmten Lumineszenzstrahlung mit steigender Anregungsstrahlungsleistung bis zu einem Maximalwert, welcher einem Anregungsstrahlungsleistungs-Schwellwert zugeordnet ist, steigt, in einen zweiten Lumineszenz-Zustand überführbar ist, in dem die Probe gegenüber dem ersten Zustand verminderte Anregbarkeit zur Emission der bestimmten Lumineszenzstrahlung aufweist, wobei die Probe durch Einstrahlung von Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes in den zweiten Zustand bringbar ist, die Probe in Teil-Bereichen in den ersten Zustand und in angrenzenden Teil-Bereichen in den zweiten Zustand versetzt wird, indem die Einstrahlung von Anregungsstrahlung mit einer Anregungsstrahlungsverteilung erfolgt, die zumindest ein örtliches Leistungsmaximum über dem Schwellwert und zumindest ein örtliches, lokales Leistungsminimum unter dem Schwellwert aufweist, das Bild der lumineszierenden Probe Proben-Bereiche im ersten Zustand und Proben-Bereiche im zweiten Zustand umfaßt, wobei zum Bild der lumineszierenden Probe überwiegend Proben-Bereiche im ersten Zustand beitragen und dadurch das Bild eine gegenüber der Anregungsstrahlungs-verteilung gesteigerte Ortsauflösung hat. This object is achieved with a resolution-enhanced luminescence microscopy method, in which a sample by irradiation of excitation radiation to emit certain luminescence is excited and an image of the luminescent sample is obtained, wherein the luminescent sample from a first luminescent state in which the excitability for emission of the determined luminescence with increasing excitation radiation power to a maximum value which is assigned to an excitation radiation power threshold, increasing, in a second luminescence condition can be transferred, in which the sample compared to the first state having reduced excitability for emission of the determined luminescence radiation, wherein the sample by irradiation with excitation radiation power is above the threshold value in the second state can be brought, the sample is treated in part-regions in the first state and in the adjacent partial areas in the second state by the irradiation of excitation radiation is effected with an excitation radiation distribution, having at least a local power maximum is above the threshold and at least a local, local power minimum below the threshold, the image of the luminescent sample sample areas in the first state and sample areas comprising the second state, wherein the image of the luminescent sample predominantly sample areas contribute in the first state and a new image that has a relation to the excitation radiation distribution increased spatial resolution.
  • [0016] [0016]
    Die Aufgabe wird weiter gelöst mit einem Mikroskop zur auflösungsgesteigerten Lumineszenz-Mikroskopie, das Mittel aufweist zur Anregung von Lumineszenz, die Anregungsstrahlung auf die Probe einstrahlen und damit die Emission bestimmter Lumineszenzstrahlung in der Probe anregen, Mittel zur Gewinnung eines Bildes der lumineszierenden Probe, wobei die Mittel zur Anregung die Anregungsstrahlung mit einer bestimmten Anregungsstrahlungsverteilung einstrahlen, die zumindest ein örtliches Leistungsmaximum aufweist, das über einem Schwellwert liegt, und zumindest ein örtliches, lokales Leistungsminimum aufweist, das unter dem Schwellwert liegt, wobei der Schwellwert zwei Lumineszenz-Regionen der Probe trennt, eine erste, bei Anregungsstrahlungsleistungen unterhalb des Schwellwertes vorliegende Zustands-Region, in der die Anregbarkeit zur Emission der bestimmten Lumineszenzstrahlung mit steigender Anregungsstrahlungsleistung bis zu einem Maximalwert, welcher am Schwellwert erreicht wird, steigt, und einer zweiten bei und/oder nach Anregungsstrahlungsleistungen oberhalb des Schwellwertes vorliegende Zustands-Region, in der die Probe eine gegenüber der ersten Region verminderte Anregbarkeit zur Emission der bestimmten Lumineszenzstrahlung aufweist, und wobei die Mittel zur Bildgewinnung Proben-Bereiche in der ersten Region, die mit Anregungsstrahlungsleistung unterhalb des Schwellwertes bestrahlt wurden, und Proben-Bereiche in der zweiten Region, die mit Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes bestrahlt wurden, erfassen, wobei zum Bild der Probe überwiegend Proben-Bereiche in der ersten Region beitragen und dadurch das Bild eine gegenüber der Anregungsstrahlungsverteilung gesteigerte Ortsauflösung hat. The object is also achieved with a microscope for resolution-enhanced luminescence microscopy, comprising means for excitation of luminescence irradiate the excitation radiation to the sample and thus the emission of certain luminescence stimulate in the sample means for obtaining an image of the luminescent sample, the means for exciting the excitation radiation irradiating with a certain excitation radiation distribution which has at least a local power maximum which is above a threshold value, and having at least a local, local power minimum which is below the threshold, wherein the threshold separates two luminescence regions of the sample, first, present at excitation radiation powers below the threshold state region in which the excitability for emission of certain luminescence with increasing excitation radiation power up to a maximum value which is reached at the threshold increases, and a second during and / or after excitation radiation powers above the threshold present-state region where the sample has a relation to the first region of reduced excitability for emission of the determined luminescence radiation, and wherein the means for imaging sample areas in the first region which have been irradiated with exciting radiation power below the threshold value, and sample areas in the second region, which were irradiated with exciting radiation power above the threshold value, capture, with predominantly contribute to the image of the specimen sample areas in the first region and a new image that has a relation to the exciting radiation distribution increased spatial resolution.
  • [0017] [0017]
    Es wird also eine Probe verwendet bzw. das Mikroskop ist für eine entsprechende Probe ausgelegt, deren lumineszierendes Material sich im wesentlichen in zwei Zuständen befinden kann. Thus, a sample used or the microscope is designed for a respective sample, the luminescent material may be located substantially in two states. In einem ersten Zustand, der sich bei der Einstrahlung von Anregungsstrahlungsleistung unterhalb des Schwellwertes einstellt und der mittels der Mittel zur Anregung erreicht wird, strahlt das Material Lumineszenzstrahlung ab, deren Leistung in der Regel mit der Anregungsstrahlungsleistung zunimmt. In a first state which is established at the irradiation of excitation radiation power below the threshold value and which is achieved by means of the means for exciting the material emits luminescent radiation whose power increases generally with the excitation radiation power. In einem zweiten Zustand, der bei Einstrahlung von Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes vorliegt, erfolgt entweder gar keine oder verminderte Lumineszenz. In a second state, which is present upon irradiation with excitation radiation power above the threshold value, there is either no or reduced luminescence. Auch können gegenüber dem ersten Zustand geänderte Absorptionseigenschaften und/oder Lumineszenzstrahlungsemission mit anderen optischen Eigenschaften als im ersten Zustand, beispielsweise mit anderer spektraler Zusammensetzung, Polarisation oder Lebensdauer, erfolgen. Also can be made with other optical properties than in the first state, for example having different spectral composition, polarization or lifetime, compared to the first state modified absorption properties and / or Lumineszenzstrahlungsemission. Bezogen auf die Probe, die sich natürlich aus einer Vielzahl von fluoreszierenden oder auto-fluoreszierenden Molekülen zusammensetzt, ergeben sich zwei Zustandsregionen. Based on the sample, the course is composed of a variety of fluorescent or auto-fluorescent molecules, there are two state regions. In einer ersten Zustandsregion ist die Mehrzahl der Moleküle im ersten Zustand, in einer zweiten Zustandsregion ist die Mehrzahl im zweiten Zustand. In a first condition region is the majority of the molecules in the first state, second state in a region, the plurality is in the second state. Erfindungsgemäß werden nun Proben-Bereiche in die erste Zustandsregion (oder kurz Zustand) und andere Proben-Bereiche in die zweite Zustandsregion (oder kurz Zustand) verbracht. According to sample areas are now in the first state region (or short condition) and other sample areas in the second state region (or short condition) spent. Die örtliche Nähe der Bereiche, die in den ersten Zustand gebracht wurden, also auf die Anregungsstrahlungsleistung unterhalb des Schwellwertes fällt, und Bereichen im zweiten Zustand, dh Bereiche, die mit Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes bestrahlt werden, erlaubt eine signifikante Steigerung der Auflösung gegenüber der Anregungsstrahlungsverteilung. The physical proximity of the areas that have been placed in the first state, that is incident on the excitation radiation power is below the threshold value, and regions in the second state, that is, areas which are irradiated with excitation radiation power above the threshold value, allows a significant increase in resolution compared to the excitation radiation distribution ,
  • [0018] [0018]
    Die erfindungsgemäße Lösung erreicht also die Auflösungssteigerung durch eine nichtlineare Lumineszenzkennlinie, die die emittierte Lumineszenzleistung als Funktion der Anregungsstrahlungsleistung beschreibt und ein lokales Maximum hat. Thus, the inventive solution achieves the increase in resolution by a nonlinear Lumineszenzkennlinie that describes the emitted luminescence as a function of excitation radiation power and has a local maximum. Es ist dabei vorteilhaft, aber nicht zwingend erforderlich, wenn die Kennlinie beiderseits dieses Maximums relativ steile Flanken aufweist. It is advantageous, but not essential, if the curve on either side of this maximum has relatively steep slopes. Auch kann zur Anregung ein Multiphotonenprozeß zum Einsatz kommen. Also can be used to excite a multi-photon process.
  • [0019] [0019]
    Da beim erfindungsgemäßen Ansatz möglichst ausschließlich Proben-Bereiche im ersten Zustand zum Bild Lumineszenzstrahlung beitragen und Proben-Bereiche im zweiten Zustand zumindest in einem geringeren Maße lumineszieren, ist eine Auflösungssteigerung erreicht, da das Probenbild eine über die Anregungsstrahlungsverteilung hinausgehende Struktur zeigt. Since contribute in the novel approach eliminates possible sample areas in the first state to image luminescence and luminescence sample areas in the second state, at least to a lesser extent, an increase in resolution is achieved because the sample image shows about the exciting radiation distribution beyond structure. Diese Intensitätsstruktur ist um so ausgeprägter, je deutlicher die Emissionsleistung sich zwischen erstem und zweitem Zustand unterscheidet. This intensity structure is more pronounced, the emission performance differs more clearly between first and second state.
  • [0020] [0020]
    Durch Einstrahlung der Anregungsleistung oberhalb des Schwellwertes, der dem Maximum der Fluoreszenzkennlinie entspricht, wird weniger Fluoreszenz angeregt als im ersten Zustand. By irradiation of the excitation power above the threshold value corresponding to the maximum of the fluorescence characteristic, less fluorescence is excited than in the first state. Im Mikroskop ist dazu die Anregungsstrahlungsverteilung mit Leistungen über dem Schwellwert versehen. Under the microscope, the exciting radiation distribution is provided for this purpose with services above the threshold. Strahlung anderer Wellenlänge, wie sie im Stand der Technik bislang erforderlich war, ist nicht mehr nötig. Radiation of a different wavelength, as has so far been necessary in the prior art is no longer necessary. Das erfindungsgemäße Mikroskop bzw. eine Vorrichtung zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind deshalb sehr viel einfacher, benötigen insbesondere nur eine einzige Lichtquelle, deren Auflösung sich auf die Bildqualität auswirkt. The microscope according to the invention and an apparatus for performing the method according to the invention are therefore much easier, particularly require only a single light source whose resolution affects the image quality. Auch sind die chromatischen Anforderungen hinsichtlich der Einkopplung der Anregungsstrahlung gegenüber dem Stand der Technik deutlich vereinfacht, da nicht mehr ein relativ breiter Wellenlängenbereich abgedeckt werden muß. Also, the chromatic requirements regarding the feeding in the excitation radiation are compared to the prior art, much simpler since there is not a relatively large wavelength range must be covered.
  • [0021] [0021]
    Das Mikroskop ist auf die Probe abgestimmt, da die eingestrahlte Anregungsstrahlungsverteilung den Schwellwert für die Leitung berücksichtigt. The microscope is matched to the sample since the irradiated excitation radiation distribution takes into account the threshold value for the line.
  • [0022] [0022]
    Für den erfindungsgemäßen Ansatz ist es darüber hinaus nicht zwingend erforderlich, daß die Probenbereiche, die mit Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes beleuchtet werden, zuvor „normal" angeregt wurden (wie dies beispielsweise beim STED- oder beim ESA-Ansatz erforderlich ist), wenn eine Probe verwendet wird, die nach Bestrahlung mit über dem Schwellwert liegender Anregungsstrahlungsleistung dauerhaft oder zumindest für eine gewisse Zeitdauer eine deutlich herabgesetzte oder gar verschwindende Anregbarkeit zeigt. For the inventive approach, moreover, it is not essential that the sample areas that are illuminated with exciting radiation power above the threshold value, previously "normal" excited (as required for example in the STED or the ESA approach) when a sample is used, permanently or at least for a certain period of time shows a significantly reduced or even disappearing excitability after irradiation with excitation radiation lying above the threshold power.
  • [0023] [0023]
    Es ist bevorzugt, daß eine Probe bzw. ein Farbstoff verwendet wird, die/der bei einer Anregungsstrahlungsleistung über dem Schwellwert nicht luminesziert, Lumineszenzstrahlung mit anderen Eigenschaften als die bestimmte Lumineszenzstrahlung abstrahlt und/oder geänderte, zu verminderter Lumineszenz führende Absorptionseigenschaften für Anregungsstrahlung aufweist. It is preferred that a sample or a dye is used which / has not luminesces at an excitation radiation power above the threshold value, emits luminescent radiation having different characteristics than the specific luminescence and / or altered, leading to reduced luminescence absorption characteristics for the excitation radiation.
  • [0024] [0024]
    Die Auflösungssteigerung wird also erfindungsgemäß dadurch erreicht, daß aus Proben-Bereichen, die mit über dem Schwellwert liegender Anregungsstrahlungsintensität beleuchtet werden, keine oder nur mehr wenig Lumineszenzstrahlung zur Bilderzeugung beiträgt. The increase in resolution is thus achieved according to the invention that no or only little luminescence contributes from sample areas that are illuminated with excitation radiation lying above the threshold intensity for imaging. Je nach Lumineszenzeigenschaft, die die Probe im zweiten Zustand, dh bei und/oder nach oberhalb dem Schwellwert liegender Anregungsstrahlungsleistung zeigt, erfolgt dieser verminderte Beitrag zum Bild auf unterschiedliche Weise. Depending on the luminescence showing the sample in the second state, ie with and / or after excitation radiation lying above the threshold power, this takes place reduced contribution to the image in different ways. Zeigt die Probe überhaupt keine Lumineszenz mehr, wird aus Proben-Bereichen, die im zweiten Zustand sind, auch keine Lumineszenzstrahlung mehr detektiert. Shows the sample no longer luminescence, no luminescence radiation is from sample areas that are in the second state, longer detected. Zeigt die Probe im zweiten Zustand hingegen Lumineszenzstrahlung mit geänderten optischen Eigenschaften, wird man eine entsprechend optische Filterung, beispielsweise hinsichtlich spektraler Zusammensetzung oder Polarisation zum Ausblenden vornehmen. Displays the sample in the second state, however luminescence with modified optical properties, you will make a corresponding optical filtering, for example in terms of spectral composition or polarization to hide. Zeigen sich veränderte Lebensdauern der angeregten Lumineszenzzustände, erreicht eine zeitliche Filterung eine Ausblendung. Show changed lifetimes of the excited Lumineszenzzustände, reaches a temporal filtering a suppression.
  • [0025] [0025]
    Um die Proben-Bereichen im ersten Zustand weiter einzugrenzen bzw. einige dieser Proben-Bereiche auszuwählen, ist es bevorzugt eine konfokale Detektion vorzunehmen. To the sample areas in the first state further narrow or select some of these sample regions, it is preferable to carry out a confocal detection. Durch die erfindungsgemäße Reduktion des zur Lumineszenz angeregten Volumens unterhalb der Beugungsgrenze wird dabei eine Ortsauflösung erreicht, die diejenige bei normaler konfokaler Detektion übertrifft. The inventive reduction of the excited luminescence volume below the diffraction limit spatial resolution is achieved, which exceeds that of normal confocal detection.
  • [0026] [0026]
    Wesentlich ist, daß nicht alle mit Anregungsstrahlung beleuchteten Bereiche zum Lumineszenzbild beitragen, sondern daß mit über dem Schwellwert liegender Anregungsstrahlungsleistung beleuchtete Proben-Bereiche im Bild nicht oder nur vermindert enthalten sind, wodurch sich automatisch die Auflösungssteigerung gegenüber der Einstrahlung der Anregungsstrahlung ergibt, da eine räumliche Reduktion des lumineszierenden Probenvolumens gegenüber dem angeregten Probenvolumen erreicht ist. It is essential that do not contribute all illuminated with excitation radiation areas for luminescence, but that with above threshold lying excitation radiation power illuminated sample areas in the image are either greatly reduced or contained, thus automatically determines the resolution increase over the irradiation of the exciting radiation, as a spatial reduction of the luminescent sample volume compared to the excited sample volume is reached. Es finden sich im Bild optische Strukturen, die in der Anregungsstrahlungsverteilung nicht vorhanden waren. It can be found in the image optical structures that were not present in the exciting radiation distribution. Die Auflösung des Bildes ist also über die Auflösung der Anregungsstrahlungseinkopplung hinaus gesteigert. The resolution of the image is thus increased the dissolution of the Anregungsstrahlungseinkopplung out.
  • [0027] [0027]
    In besonders vorteilhafter Weise verwendet man eine Probe bzw. Farbstoffe bzw. stimmt das erfindungsgemäße Mikroskop darauf ab, die vom zweiten Zustand durch Einstrahlung einer Rücksetzstrahlung, die andere optische Eigenschaften als die Anregungsstrahlung hat, wieder in den (ursprünglichen) ersten Zustand zurückgesetzt werden können. In a particularly advantageous manner using a sample or dyes or authorizes microscope according to the invention it from, the, back to the second state by irradiation of a resetting radiation having different optical properties from the excitation radiation will be reset to the (original) first state. Das Mikroskop weist dazu geeignete Mittel auf. The microscope has for this purpose suitable means. Dies bedeutet, daß der zweite Zustand ein zumindest weitgehend reversibler Zustand ist. This means that the second state is an at least largely reversible state. Durch Einstrahlung von Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes aus dem Lumineszenzbild ausgeblendete Bereiche können dann nach Einstrahlung der Rücksetzstrahlung wieder zur normalen Lumineszenz im ersten Zustand angeregt werden. The resetting radiation can be re-stimulated luminescence to normal in the first state by irradiation of exciting radiation power above the threshold value of the luminescence hidden sections then after irradiation. Ein derart weitergebildetes Verfahren bzw. ein derart ausgestaltetes Mikroskop eignet sich dann für Anwendungen, bei denen verschiedene Bereiche einer Probe mehrfach abgebildet werden sollen. Such further formed method or a microscope then such configuration is suitable for applications where different regions of a sample to be imaged multiple times. Es wird für solche Anwendungen deshalb bevorzugt, daß eine Probe bzw. ein Farbstoff verwendet wird, die bzw. der im zweiten Zustand, also nach Beleuchtung mit Anregungsstrahlung über dem Schwellwert, verminderte Empfindlichkeit für Anregungsstrahlung zeigt, wobei durch Einstrahlung einer Rücksetzstrahlung, die andere optische Eigenschaften als die Anregungsstrahlung hat, die Empfindlichkeitsverminderung zumindest teilweise reversiert wird (und der erste Zustand wiederhergestellt wird). It is for such applications, therefore, preferred that a sample or a dye is used, the or in the second state, ie, after illumination with excitation radiation above the threshold value, exhibits reduced sensitivity to excitation radiation, said optical radiation of a reset radiation, the other properties than the excitation radiation sensitivity reduction is at least partially reversed (and the first state restored). Zumindest die mit über dem Schwellwert liegender Anregungsstrahlungsleistung beleuchteten Proben-Bereiche werden mit Rücksetzstrahlung bestrahlt. At least the illuminated with lying above the threshold excitation radiation output sample areas are irradiated with resetting radiation. Es ist dabei bedeutsam, daß die Rücksetzstrahlung, die die Probe wieder in den ersten Zustand überführt, zur Bewerkstellung der Auflösungssteigerung nichts beiträgt, also auch nur sehr grob oder überhaupt nicht strukturiert in die Probe eingekoppelt werden kann. It is significant that the resetting radiation, which transfers the sample back to the first state, to the resolution enhancement Bewerkstellung contributes nothing, so even very coarse or not structured to be coupled into the sample.
  • [0028] [0028]
    In einer besonders vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung erlaubt die hinsichtlich ihrer Lumineszenzeigenschaften wieder in den ersten Zustand rückführbare Probe eine Bilderzeugung durch Abscannen. In a particularly advantageous embodiment of the invention, the traceable back to the first state in terms of their luminescence sample allows imaging by scanning. Dabei kann die Probe beispielsweise mit einem Spot-, Zeilen- oder Multispotbereich abgerastert werden, zB durch eine Scannereinrichtung. The sample can be scanned for example, using a spot, line or multi-spot area, eg by a scanner device. Zwischen zwei Scanschritten wird dann jeweils Rücksetzstrahlung eingestrahlt, um beim neuen Scanschritt jeweils erneut Anregungsstrahlung unter und über dem Schwellwert einstrahlen zu können. Between two scanning steps in each case reset radiation is then irradiated to irradiate the new scan again step each excitation radiation above and below the threshold value can. Dadurch wird in jedem Scanschritt eine gesteigerte Auflösung erzielt, was insgesamt ein deutlich auflösungsverbessertes Bild liefert. As a result, an increased resolution is achieved in each scanning step, totaling a noticeably auflösungsverbessertes image.
  • [0029] [0029]
    Die Einstrahlung der Anregungsstrahlungsverteilung erzeugt also eine örtliche Struktur der Fluoreszenzstrahlung. The irradiation of the exciting radiation distribution thus creates a local structure of the fluorescence radiation. Diese ist meist symmetrisch bezüglich der Anregungsstrahlungsverteilung. This is usually symmetrical with respect to the exciting radiation distribution. Möchte man eine bestimmte fluoreszierende Flächenform, zB einen Punkt, so werden vorteilhafterweise Teile der fluoreszierenden Probe ausgeblendet. If you want a specific fluorescent surface shape, such as a point, advantageously parts of the fluorescent sample are hidden. Dies ist ohne Auswirkung auf die Auflösung der erwünschten Flächenform möglich, da man für ausreichende Abstände zwischen benachbarten fluoreszierenden Bereichen sorgen kann. This is possible without affecting the resolution of the desired surface shape, as you can provide adequate distances between adjacent fluorescent areas.
  • [0030] [0030]
    Für die Anregung der Probe über bzw. unter dem Schwellwert sind prinzipiell zwei Varianten möglich. For the excitation of the sample above or below the threshold value, two variants are possible in principle. In einer ersten Variante erfolgt eine prinzipiell beugungsbegrenzte Beleuchtung, wobei diese punktförmig sein kann, radial symmetrisch sein kann oder ein zentrales Maximum, wie die bekannte Airy-Funktion aufweisen kann, jedoch nicht muß. In a first variant of a principle diffraction-limited illumination, which can be point-like, can be radially symmetrical or may have a central maximum, as the known Airy function is performed, but need not. In dieser Form der Anregungsverteilung ist es bevorzugt, daß die Anregungsstrahlungsverteilung beugungsbegrenzt ist. In this form of the excitation distribution, it is preferred that the excitation radiation distribution is diffraction limited.
  • [0031] [0031]
    Bei der beugungsbegrenzten Anregungsstrahlungsverteilung kann man besonders vorteilhaft eine torusförmige Verteilung verwenden, die im Kernbereich der torusförmigen Verteilung eine Anregungsstrahlungsleistung über dem Schwellwert, in Randbereichen unter dem Schwellwert hat. In the diffraction-limited excitation radiation distribution can be particularly advantageous to use a toroidal distribution in the core region of the toroidal distribution has an excitation radiation power above the threshold value, in the edge regions below the threshold. Im vom Torus umschriebenen Zentrum erhält man dann eine punktförmige Lumineszenzverteilung, die deutlich kleiner ist, als es ein beugungsbegrenztes Airy-Scheibchen wäre. In the circumscribed by the torus center is then obtained a punctiform luminescence, which is significantly smaller than would be a diffraction-limited Airy disk. Da natürlich aus den erwähnten Symmetriegründen auch am Außenrand des Torus liegende Proben-Bereiche mit unter dem Schwellwert liegender Anregungsstrahlungsleistung beleuchtet werden, wird auch dort Lumineszenzstrahlung angeregt. Because, of course, lies on the outer edge of the torus sample areas with rates below the threshold excitation radiation power are illuminated from the mentioned symmetry, luminescence is excited there. Um ein punktförmiges Fluoreszenzbild zu erzeugen, ist es zweckmäßig, diese Bereiche auszublenden, beispielsweise mit Hilfe einer konfokalen Detektion, die lediglich im vom Torus umschriebenen Zentrum entstehende Lumineszenzstrahlung passieren läßt. To create a point-like fluorescence image, it is convenient to hide these areas, for example, using a confocal detection, can pass the resulting only in circumscribed by the torus center luminescence. Das lumineszierende Zentrum ist dabei dennoch kleiner, als es die (beugungsbegrenzte) Auflösung der konfokalen Detektion per se erlaubt. The luminescent center is still smaller than it allows (diffraction limited) resolution of confocal detection per se. Das Ausblenden kann natürlich auch anders bewerkstelligt werden. Hiding can of course also be accomplished otherwise. ZB können die Außenbereiche bezüglich der Lumineszenzanregbarkeit gezielt ausgeschaltet bzw. das umschriebene Zentrum gezielt eingeschaltet werden. For example, the outer regions with respect to the Lumineszenzanregbarkeit can explicitly deactivated or the circumscribed center are targeted on. Das erfindungsgemäße Verfahren bzw. Mikroskop erlaubt damit eine Auflösung über die physikalische Beugungsgrenze hinaus bei gleichzeitiger Beeinflussung der fluoreszierenden Bereichsform. The method or microscope according to the invention thus allows a resolution of the physical diffraction limit, while influencing the fluorescent area shape.
  • [0032] [0032]
    In einer zweiten Variante wird eine flächige, strukturierte Beleuchtung eingesetzt, wobei die Fläche auch als eine oder mehrere, in einer Richtung beugungsbegrenzte Linie(n) ausgebildet werden kann. In a second variant of a two-dimensional structured illumination is used, wherein the area as one or more diffraction-limited in a direction line (s) can be formed. Teilbereiche der beleuchteten Fläche weisen eine Anregungsstrahlungsleistung über und andere Teilbereiche eine Anregungsstrahlungsleistung unter dem Schwellwert auf. Portions of the illuminated area have an excitation radiation power above other sections excitation radiation power below the threshold value on. Eine solche flächige Beleuchtung erlaubt es, eine größere Probe besonders schnell abzurastern. One such area illumination allows abzurastern a larger sample very quickly. Gleiches gilt natürlich auch für eine Multispot-Anordnung, bei der mehrere beugungsbegrenzte Beleuchtungsspots auf die Probe fallen, die so weit voneinander räumlich getrennt sind, daß sie eindeutig voneinander getrennt detektiert werden können. The same is true for a multi-spot arrangement in which multiple diffraction-limited spot lights falling on the sample that are so widely separated spatially, that they can be detected clearly separated from each other. Als flächige strukturierte Probenbeleuchtung kommt insbesondere ein Streifen- oder Kreuzgitter in Frage. As flat structured sample illumination is especially a strip or cross grating in question.
  • [0033] [0033]
    Je nach Probe können Proben-Bereiche im zweiten Zustand noch eine gewisse Restlumineszenz zeigen. Depending on the sample can sample areas in the second state still show some residual luminescence. Dies kann entweder durch die Probe selbst bedingt sein, oder durch Wanderungen von lumineszierendem Material zwischen den unterschiedlich beleuchteten Proben-Bereichen, beispielsweise durch Diffusion. This can either be caused by the sample itself, or by migration of luminescent material between the differently illuminated sample areas, for example by diffusion. Die Probe selbst kann zB störend autofluoreszieren oder andere Farbstoffe enthalten, die nicht in einen zweiten, reversiblen Zustand überführbar sind. The sample itself may eg autofluoresce disturbing or contain other dyes that are not transferable into a second, reversible state. Im Ergebnis hat man eine Restlumineszenzstrahlung in Bereichen, die mit über dem Schwellwert liegender Anregungsstrahlungsleistung beleuchtet wurden. As a result, one has a Restlumineszenzstrahlung in areas that have been illuminated with excitation radiation lying above the threshold power. Prinzipiell kann diese Restlumineszenz durch einen geeigneten Schwellwert bei der Detektion unterdrückt werden. In principle, this residual luminescence can be suppressed by a suitable threshold value in the detection.
  • [0034] [0034]
    Die Verwendung einer an und für sich bekannten Lock-In-Technik unterdrückt diese Hintergrundstrahlung bei verbessertem Bildsignal. The use of a per se known lock-in technique suppresses this background radiation with improved image signal. Dazu wird man entweder in Proben-Bereiche, die in den zweiten Zustand versetzt werden oder in Proben-Bereiche, die im ersten Zustand verbleiben, die Anregungsstrahlung gemäß einer Referenzfrequenz intensitätsmodulieren und diese Referenzfrequenz bei der Detektion der Lumineszenzstrahlung im Wege der Lock-In-Technik verwerten. For this purpose, either in sample areas that are placed in said second state or in the sample areas, which remain in the first state, intensity-modulating the excitation radiation in accordance with a reference frequency and said reference frequency in the detection of the luminescent radiation in the way of lock-in technique exploit. Das Mikroskop weist dazu einen Modulator und einen dem Lumineszenzdetektor nachgeschalteten Lock-In-Verstärker auf. The microscope has for this purpose a modulator and a luminescence the downstream lock-in amplifier. Dieser separiert dann die modulierten Signale und unterdrückt die unmodulierten Signale, was eine hochaufgelöste Detektion auch bei der genannten Restlumineszenz ermöglicht, ohne daß der Spitzenpegel des Nutzsignals sinkt. This then separates the modulated signals and suppresses the non-modulated signals, which enables a high-resolution detection even when the above residual luminescence without the peak level of the useful signal decreases. Dadurch tragen die modulierten Signale voll zum hochaufgelösten Bild bei. As a result, the modulated signals take full at the high resolution image.
  • [0035] [0035]
    Eine alternative Möglichkeit zur Unterdrückung einer Restlumineszenz ist ein Differenzverfahren, bei dem zwei Bilder voneinander substrahiert werden. An alternative possibility for suppressing a residual luminescence is a difference method, in which two images are subtracted from each other. Ein erstes Bild wird mit Anregungsstrahlungsleistung unter dem Schwellwert, ein zweites Bild mit Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes aufgezeichnet. A first image is recorded with excitation radiation power below the threshold value, a second image with exciting radiation power above the threshold. Die Differenz zwischen den beiden Bildern bewirkt die Abseparierung der Restlumineszenz. The difference between the two images causes the Abseparierung the residual luminescence. Andere mögliche Ansätze zur Unterdrückung der Restlumineszenz nutzen weitere Eigenschaften von in Varianten der Erfindung verwendeten Proben bzw. Farbstoffen, beispielsweise die Auswertung unterschiedlicher Lumineszenzlebensdauern im ersten bzw. zweiten Zustand, die Nutzung unterschiedlicher optischer Eigenschaften der Lumineszenzstrahlung im ersten oder zweiten Zustand o.ä. Other possible approaches to the suppression of residual luminescence use other properties of samples, or dyes, for example, the evaluation of different luminescence lifetimes in the first or second state, the use of different optical properties of the luminescent radiation in the first or second state used in variants of the invention, etc.
  • [0036] [0036]
    Weiter werden in vorteilhaften Ausgestaltungen Probenteile, die außerhalb der zu detektierenden Fokusebene liegen, ausgeblendet, um die Tiefenschärfe zu steigern. Further, in advantageous embodiments, sample parts that are outside of the detected focal plane, hidden in order to increase the depth of field. Dadurch wird gleichzeitig die axiale von der lateralen Auflösung entkoppelt. This decouples the same time, the axial of the lateral resolution. Dazu wird zuerst die Probe unstrukturiert in den zweiten Zustand überführt und dann nur in der Fokusebene rückgesetzt. For this, the sample is first brushed transferred into the second state and then reset only in the focal plane. Gleiches erreicht eine entsprechende Tiefenstrukturierung der Anregungsstrahlungsintensität, mit einem Minimum in der Fokusebene. The same reaches a corresponding depth structuring of the excitation radiation intensity, with a minimum in the focal plane. Hierzu kann man eine Anordnung gemäß den Prinzipien der This can be done, an arrangement according to the principles of the DE 102 57 423 A1 DE 102 57 423 A1 geeignet abwandeln. Suitable modify.
  • [0037] [0037]
    Das eingangs genannte erfindungsgemäße Mikroskop verwirklicht in vorteilhaften Ausgestaltungen eine oder mehrere der oben genannten Weiterbildungen. The inventive microscope aforementioned realized in advantageous embodiments, one or more of the above developments. Da die Anregungsstrahlung sowohl zur Anregung der Lumineszenz als auch zur Verhinderung bzw. Minderung von Lumineszenz verwendet wird, ist es vorteilhafterweise möglich, eine einzige Anregungsstrahlungsquelle vorzusehen, welche die Anregungsstrahlung abgibt und der eine Einrichtung nachgeordnet ist, welche dem Strahlprofil ein Minimum, vorzugsweise mit variabler Tiefe, aufprägt, wobei im Minimum die Leistung unter dem Schwellwert liegt. Because the excitation radiation is used both for excitation of luminescence, as well as for the prevention or reduction of luminescence, it is advantageously possible to provide a single excitation radiation source which emits the excitation radiation and which is arranged downstream of a device which the beam profile of a minimum, preferably variable- depth, imparts, wherein the minimum is the power under the threshold value.
  • [0038] [0038]
    Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beispielhalber noch näher erläutert. The invention will be explained in more detail by way of example with reference to the drawings. In den Zeichnungen zeigt: In the drawings:
  • [0039] [0039]
    1a 1a und and 1b 1b ortsabhängige Leistungsverteilungen für Verfahren des Standes der Technik, location-dependent power distributions for processes of the prior art,
  • [0040] [0040]
    2a 2a - 2c 2c Schemazeichnungen für verschiedene Verfahren zur Auflösungssteigerung gemäß dem Stand der Technik, Schematic diagrams for various methods for increasing the resolution in accordance with the prior art,
  • [0041] [0041]
    3 3 ein auflösungsgesteigertes Fluoreszenzmikroskop nach dem Stand der Technik, a resolution-enhanced fluorescence microscope according to the prior art,
  • [0042] [0042]
    4 4 eine Fluoreszenzkennlinie einer Probe, a fluorescence characteristic of a sample,
  • [0043] [0043]
    5 5 eine Schemazeichnung zur erfindungsgemäßen Auflösungssteigerung, a schematic drawing for increasing the resolution of the present invention,
  • [0044] [0044]
    6a 6a /b ein- bzw. zweidimensionale Leistungsverteilungen, wie sie bei der Auflösungssteigerung nach einer ersten und zweiten Verfahrensform anfallen, / B show or two-dimensional power distributions, as obtained in the resolution enhancement after a first and second methods form
  • [0045] [0045]
    7 7 eine Darstellung ähnlich der a view similar to 6a 6a /b für eine dritte Verfahrensform, / B for a third form of method,
  • [0046] [0046]
    8a 8a /b Darstellungen ähnlich der / B representations similar to the 6a 6a /b für eine vierte und fünfte Verfahrensform, / B for a fourth and fifth method form,
  • [0047] [0047]
    9a 9a /b eine Schemazeichnung für ein erstes auflösungsgesteigertes Mikroskop, / B is a schematic diagram of a first resolution-enhanced microscope,
  • [0048] [0048]
    10 10 eine Leistungsverteilung ähnlich der a power distribution similar to the 6a 6a zur Verdeutlichung der Wirkungsweise des Mikroskops der to illustrate the operation of the microscope of the 9 9 , .
  • [0049] [0049]
    11a 11a /b eine Kennlinie ähnlich der / B is a characteristic similar to the 4 4 sowie eine Leistungsverteilung zur Verdeutlichung eines zweiten auflösungsgesteigerten Mikroskops, and a power distribution illustrating a second resolution-enhanced microscope,
  • [0050] [0050]
    12 12 eine Schemadarstellung des zweiten Mikroskops, a schematic representation of the second microscope,
  • [0051] [0051]
    13 13 eine Schemadarstellung eines dritten auflösungsgesteigerten Mikroskops, a schematic of a third resolution-enhanced microscope,
  • [0052] [0052]
    14 14 eine Schemadarstellung zur Funktionsweise des dritten Mikroskops, a schematic representation of the functioning of the third microscope,
  • [0053] [0053]
    15a 15a /b Schemadarstellungen von Teilen eines vierten Mikroskops, / B schematic representations of parts of a fourth microscope,
  • [0054] [0054]
    16a 16a eine Verteilung der Anregungs- bzw. Rücksetzstrahlung in einer Pupille des vierten Mikroskops, a distribution of excitation or resetting radiation in a pupil of the fourth microscope,
  • [0055] [0055]
    16b 16b eine mit dem vierten Mikroskop realisierte Multispotverteilung, a realized with the fourth microscope Multispot distribution,
  • [0056] [0056]
    17 17 eine Fluoreszenzverteilung beim vierten Mikroskop und a fluorescence microscope and distribution in the fourth
  • [0057] [0057]
    18 18 eine Verteilung der Anregungs- bzw. Rücksetzstrahlung in einer Pupille einer Variante des vierten Mikroskops. a distribution of excitation or resetting radiation in a pupil of a variant of the fourth microscope.
  • [0058] [0058]
    Nachfolgend werden in verfahrenstechnischer Erläuterung sowie in Mikroskopbeschreibungen verschiedene Ausführungsformen zur auflösungsgesteigerten Lumineszenzmikroskopie dargestellt. Subsequently, various embodiments for resolution-enhanced luminescence microscopy are shown in procedural explanation as well as descriptions microscope. Dies geschieht rein exemplarisch anhand verschiedener Fluoreszenzmikroskope bzw. Fluoreszenzmikroskopieverfahren. This is done by way of example with reference to different fluorescent microscopes and fluorescence microscopy methods. Natürlich sind die nachfolgend geschilderten Ausführungsbeispiele, dh Verfahrensformen und Mikroskope, auch für andersartig lumineszierende Substanzen einsetzbar, beispielsweise für phosphorisierende Proben oder Farbstoffe. Of course, the below-described embodiments, ie, methods and forms microscopes, also for differently luminescent substances are used, for example, phosphorescent samples or dyes. Soweit nachfolgend von einem Farbstoff gesprochen wird, so ist auch dies nur beispielshalber aufzufassen. Insofar as mentioned hereinafter a dye, so this is also regarded only by way of example. Anstelle eines Farbstoffes, der zur Präparation einer Probe eingesetzt werden kann, kann natürlich auch eine direkt fluoreszierende (oder phosphorisierende) Substanz als Probe treten, wodurch eine Farbstoffzugabe entbehrlich ist. Instead of a dye which can be used for the preparation of a sample can of course occur as a sample and a direct fluorescent (or phosphorescent) substance, whereby a dye addition is unnecessary. Auch können zusätzliche Farbstoffe verwendet werden, die andere Eigenschaften zeigen und nicht in einen zweiten Zustand bringbar sind. Also, additional dyes can be used, which exhibit different properties and not be brought into a second state. Weiter können für einzelne Verfahrensformen oder Mikroskope geschilderte Merkmale auch für andere beschriebene Verfahrensformen oder Mikroskope eingesetzt werden, so daß auch hier nicht geschilderte Kombinationen möglich sind. Next described for individual procedures or forms microscopes characteristics to other methods described forms or microscopes can be used, so that not described here combinations are possible.
  • [0059] [0059]
    4 4 zeigt beispielshalber eine Fluoreszenz-Kennlinie by way of example shows a fluorescence characteristic 17 17 für einen Farbstoff, der erfindungsgemäß verwendet wird. for a dye that is used according to the invention. Diese Fluoreszenz-Kennlinie This fluorescence characteristic 17 17 gibt die Leistung L der abgegebenen Fluoreszenzstrahlung F als Funktion der Leistung L der Anregungsstrahlung A wieder. L is the power of the votes fluorescence radiation F as a function of the excitation radiation power L A again. Wie zu sehen ist, steigt die Kennlinie As can be seen, the curve rises 17 17 weitgehend linear, jedenfalls monoton, bis zu einem Maximum essentially linear, at least monotonously up to a maximum 18 18 und fällt dann oberhalb eines Schwellwerts and then falls above a threshold 19 19 für die Anregungsstrahlungsleistung wieder ab. for the excitation radiation power again. Erkennbar sind zwei Zustands-Regionen, die jeweils links und rechts vom Schwellwert Visible are two state-regions, each left and right of the threshold 19 19 bzw. dem Maximum or the maximum 18 18 liegen. are. Wird eine Anregungsstrahlungsleistung unterhalb des Schwellwerts If an exciting radiation power below the threshold 19 19 eingestrahlt, befindet sich der Farbstoff vorrangig in einem ersten Zustand irradiated, the dye is mainly in a first state 5 5 . , In diesem kann er Fluoreszenzstrahlung abstrahlen. In this he can radiate fluorescence radiation. Wird die Anregungsstrahlungsleistung über den Schwellwert If the exciting radiation power above the threshold 19 19 erhöht, findet eine Umschichtung der Farbstoffmoleküle in einen zweiten Zustand increased, is a shift of the dye molecules in a second state 6 6 statt. instead of. Farbstoffmoleküle im zweiten Zustand Dye molecules in the second state 6 6 können entweder nicht fluoreszieren, strahlen eine Fluoreszenzstrahlung mit geänderten optischen Eigenschaften ab und/oder besitzen eine gegenüber dem ersten Zustand either can not fluoresce, emit a fluorescence radiation with modified optical properties from and / or have a relation to the first state 5 5 geänderte Absorptionseigenschaft. altered absorption property. Die geänderten optischen Eigenschaften für Fluoreszenzemission oder Absorption können die spektrale Zusammensetzung, die Polarisation und/oder die Lebensdauer der Fluoreszenzstrahlung betreffen. The modified optical properties for fluorescence emission or absorption may affect the spectral composition, the polarization and / or lifetime of the fluorescence radiation. Im Ergebnis fällt in der zweiten Zustands-Region die Leistung der Fluoreszenzstrahlung F, wenn man sich auf die Art der Fluoreszenzstrahlung, die im ersten Zustand As a result, drops in the second-state region the performance of the fluorescence radiation F, if you look at the type of fluorescence radiation, which in the first state 5 5 abgeben wird, bezieht, wieder ab. will issue relates, again.
  • [0060] [0060]
    Die Erfindung setzt nun die Kennlinie The invention now sets the characteristic 17 17 dahingehend ein, daß die Einstrahlung der Anregungsstrahlung A nur einen Teil der Probe in die erste Zustands-Region (oder kurz ersten Zustand) one to the effect that the radiation of the excitation radiation only a part of the sample A in the first state region (or shortly first state) 5 5 , einen anderen Teil der Probe jedoch in die zweite Zustands-Region (oder kurz zweiten Zustand) , Another portion of the sample, however, in the second state region (or shortly second state) 6 6 bringt. brings. Bereiche, die mit Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes Areas with excitation radiation power above the threshold value 19 19 beleuchtet wurden/werden, emittieren somit die bestimmte Fluoreszenzstrahlung nur vermindert. were lit / are, thus, the specific fluorescence radiation emitted only reduced. Dabei ist es vorteilhaft, wenn der zweite Zustand It is advantageous if the second state 6 6 ein reversibler Zustand ist. a reversible state. Dies bedeutet, daß zumindest nach einer gewissen Zeit oder nach aktiver Einwirkung ein einmal mit Anregungsstrahlungsleistung oberhalb des Schwellwertes This means that, at least after a certain time or after exposure to an active once with exciting radiation power above the threshold value 19 19 bestrahlter Farbstoff wieder die Eigenschaften des ersten Zustandes irradiated dye displays the properties of the first state 5 5 zeigt. shows. Ein Beispiel für einen Farbstoff, für den die Erfinder eine Kennlinie gemäß der An example of a dye for which the inventor a characteristic according to the 4 4 erkannten, ist die als Dronpa bezeichnete Substanz, die in der Veröffentlichung R. Ando et al., „Regulated fast nucleocytoplasmic shuttling observed by reversible protein highlighting", Science, 19. November 2004, Vol. 306, S. 1370-1373, beschrieben ist. Der Farbstoff ist von der Firma Amalgaam, Woburn, Massachusetts, USA, unter der Bezeichnung Dronpa-Green, Code-Nr. AM-V0071, verfügbar und bislang im Zusammenhang mit der Fluoreszenzmarkierung von Molekülen, deren Transporteigenschaften durch Zellmembranen untersucht werden sollen, bekannt. Der Farbstoff Dronpa kann bei einer Wellenlänge von 488 nm angeregt werden, und nach Anregung in den zweiten Zustand recognized, is designated as Dronpa substance "fast nucleocytoplasmic shuttling-observed by reversible protein highlighting Regulated", Science, 19. November 2004 Vol. 306, pp 1370-1373 disclosed in R. Ando et al., is. The dye is of the company Amalgaam, Woburn, Massachusetts, USA, under the designation Dronpa Green, code no. AM-V0071, available and previously in connection with the fluorescent labeling of molecules whose transport properties are to be examined by cell membranes, known. The dye Dronpa can be excited at a wavelength of 488 nm, and according to excitation to the second state 6 6 durch Strahlung bei einer Wellenlänge von 405 nm wieder in den ersten Zustand again by radiation at a wavelength of 405 nm in the first state 5 5 zurückgeführt werden. be recycled.
  • [0061] [0061]
    In Kombination mit einer geeigneten Anregungsstrahlungsverteilung beim Beleuchten der Probe führt die Verwendung des Farbstoffes mit der Kennlinie der In combination with an appropriate excitation radiation distribution when illuminating the sample, the use of the dye with the characteristic of the 4 4 oder einer entsprechenden Kennlinie zu einer deutlichen Steigerung der Auflösung. or an appropriate characteristic to a significant increase of the resolution. Dabei wird im Gegensatz zum Stand der Technik nur Strahlung mit einer Wellenlänge eingestrahlt, und nur diese Strahlung trägt zur Auflösung bei. In this case, in contrast to the prior art, only radiation is irradiated at a wavelength and only those radiation contributes to the resolution in. Das Rückschalten kann den Ausführungsformen, bei denen der Farbstoff nicht spontan in den ersten Zustand The downshift can the embodiments in which the dye does not spontaneously in the first state 5 5 zurückkehrt, durch Einstrahlung einer Rücksetzstrahlung R erreicht werden, die jedoch zur Auflösungssteigerung unbeachtlich ist. returns are achieved by irradiation of a resetting radiation R, which however, is irrelevant to the resolution enhancement.
  • [0062] [0062]
    Mit der Anregungsstrahlung A wird neben der Anregung der Farbstoffmoleküle aus dem Grundniveau heraus in das erste angeregte Niveau (erster Zustand With the exciting radiation A is adjacent to the excitation of the dye molecules from the ground level out in the first excited level (first state 5 5 ) auch die Verhinderung von Fluoreszenz oder auch eine Entvölkerung (zweiter Zustand ) And the prevention of fluorescence or even depopulation (second state 6 6 ) bewerkstelligt. ) Accomplished. Bei der Entvölkerung erfolgt eine Umlagerung der Farbstoffmoleküle aus dem ersten Zustand in den zweiten Zustand. In the depopulation of a rearrangement of the dye molecules from the first state to the second state occurs. Die beiden Zustände haben voneinander verschiedene optische Fluoreszenzeigenschaften. The two states have mutually different optical fluorescence properties. Nach der Anregung mit der Anregungsstrahlung A kann sofort das hochaufgelöste Fluoreszenzbild gewonnen werden, wobei hochaufgelöst sich auf die optische Auflösung der Anregungsstrahlung A bezieht. After excitation with the exciting radiation A can be immediately obtained a high-resolution fluorescence image with high resolution refers to the optical resolution of the exciting radiation A. Falls der Farbstoff aus dem zweiten Zustand nicht spontan in den ersten Zustand zurückkehrt, wird aktiv eine Rücksetzung, beispielsweise mittels einer Rücksetzstrahlung R, die von der Anregungsstrahlung A verschiedene optische Eigenschaften aufweist, bewerkstelligt. If the dye does not return from the second state to the first state spontaneously active, a reset, for example by means of a resetting radiation R, which has several of the exciting radiation A optical properties accomplished. Das entsprechende Schema zeigt The corresponding scheme shows 5 5 . ,
  • [0063] [0063]
    Ursprünglich befindet sich zB die zu untersuchende Probe P im ersten Zustand Originally the investigated sample P is, for example, in the first state 5 5 , in dem die Leistung der Fluoreszenzstrahlung F mit der Leistung der Anregungsstrahlung A steigt. In which the power of the fluorescence radiation F increases with the power of the excitation radiation A. Die Einstrahlung der Anregungsstrahlung A erfolgt nun so, daß in einzelnen Proben-Bereichen B2 die Anregungsstrahlungsleistung über dem Schwellwert The irradiation of the exciting radiation A is computed such that B2 in each sample areas the exciting radiation power above the threshold 19 19 liegt. is located. In anderen Bereichen B1 liegt sie darunter. In other areas B1 it is below. Somit sind einige Probenbereiche im ersten Zustand Thus, some sample areas are in the first state 5 5 , andere im zweiten Zustand And others in the second state 6 6 , je nach dem ob die Leistung der Anregungsstrahlung über oder unter dem Schwellwert , Depending on whether the power of the excitation radiation above or below the threshold value 19 19 liegt. is located. 5 5 zeigt schematisch die Überführung der Probe durch Einstrahlung von Anregungsstrahlung A in Probenbereiche B1 im ersten Zustand schematically shows the transfer of the sample by irradiation with excitation radiation in A sample zones B1 in the first state 5 5 (rechter Teil der unteren Hälfte der (Right part of the lower half of the 5 5 ) sowie Probenbereiche B2 im zweiten Zustand ) As well as sample areas B2 in the second state 6 6 (linker Teil). (Left panel). Probenbereiche B2 im zweiten Zustand Sample zones B2 in the second state 6 6 können nicht mehr effizient fluoreszieren, vor allem wenn eine Anregungsstrahlungsleistung deutlich über dem Schwellwert can no longer fluoresce efficiently, especially when an excitation radiation power significantly above the threshold 19 19 verwendet wurde. was used. Der Begriff „fluoreszieren" bezieht sich dabei auf Fluoreszenzstrahlung mit bestimmten Eigenschaften. Es ist also durchaus möglich, daß auch im zweiten Zustand The term "fluorescence" refers to fluorescence radiation with specific properties. It is therefore quite possible that in the second state 6 6 Fluoreszenzstrahlung abgegeben wird, jedoch mit anderen Eigenschaften als im ersten Zustand Fluorescence radiation is emitted, but with different properties than in the first state 5 5 . , Entweder ändern sich im zweiten Zustand also die Absorptionseigenschaften oder/und die Fluoreszenzeigenschaften der Probe. So either change in the second state, the absorption properties and / or the fluorescence characteristics of the sample.
  • [0064] [0064]
    Bereiche B1 der Probe, die im ersten Zustand Areas B1 of the sample in the first state 5 5 bleiben, emittieren nach Einstrahlung von Anregungsstrahlung A weiterhin dieselbe Fluoreszenzstrahlung F. Einstrahlung von Rücksetzstrahlung R (in Stay emit after irradiation of exciting radiation A still the same fluorescence radiation F. irradiation of resetting radiation R (in 5 5 ist dieser Vorgang durch einen entsprechenden Pfeil veranschaulicht) bringt die gesamte Probe P wieder in den ersten Zustand this process is by a corresponding arrow illustrated) brings the entire sample P again to the first state 5 5 , reversiert also die Aufteilung in zwei verschieden fluoreszierende Probenbereiche B1 und B2. So reverses the division into two different fluorescent sample areas B1 and B2.
  • [0065] [0065]
    Die Aufteilung der Probe in Probenbereiche B1, die sich im ersten Zustand The distribution of the sample in sample areas B1, which is in the first state 5 5 befinden, und Probenbereiche B2, die sich im zweiten Zustand are, and sample areas B2 in the second condition 6 6 befinden, ermöglicht es nun, die Emission von Fluoreszenzstrahlung F auf ein Volumen der Probe P zu beschränken, das kleiner ist, als das ursprüngliche mit Anregungsstrahlung A beleuchtete Volumen. are, now makes it possible to limit the emission of fluorescence radiation F on a volume of the sample P, which is smaller than the original illuminated with excitation radiation A volume. Es läßt sich somit also eine Struktur im fluoreszierenden Bild erreichen, die ursprünglich in der Anregungsstrahlungsverteilung nicht vorhanden war. It is thus possible to achieve a structure so the fluorescent image, which was not present originally in the exciting radiation distribution. Ursache dafür ist die geschickt eingesetzte Nichtlinearität der Kennlinie This is due to the nonlinearity of the clever use of the characteristic 17 17 . ,
  • [0066] [0066]
    Die The 6a 6a und and 6b 6b zeigen zwei Verfahrensformen, wie die Anregungsstrahlungsverteilung zur Auflösungssteigerung aussehen kann. show two forms of methods, such as the excitation radiation distribution can look for increasing resolution. Beide Figuren zeigen links einen eindimensionalen Schnitt durch die Anregungsstrahlungsverteilung bzw. Fluoreszenzstrahlungsverteilung. Both figures show left a one-dimensional section through the exciting radiation distribution and fluorescence radiation distribution. Jeweils rechts ist das zweidimensionale Bild der Fluoreszenzstrahlungsverteilung in Draufsicht zu sehen. To the right is seen in plan view, the two-dimensional image of the fluorescence radiation distribution.
  • [0067] [0067]
    In In 6a 6a wird eine punkförmige verteilte Anregungsstrahlung A eingestrahlt. is irradiated a punk-like distributed excitation radiation A. Die Verteilung ist hier eine beugungsbegrenzte Airy-Verteilung. The distribution is a diffraction-limited Airy distribution here. Hierdurch wird im Farbstoff Fluoreszenzstrahlung F mit einer ellipsoidförmigen Donut-Verteilung angeregt, die sich im zweidimensionalen Bild als lateral fluoreszierender, kreisförmiger Ring darstellt. As a result, F is excited with an ellipsoidal donut distribution in dye fluorescence radiation, which is located in the two-dimensional image as a laterally fluorescent, circular ring. Es fluoreszieren nur die Proben-Bereiche B1. It fluoresce only the sample areas B1. Axial liegt ein fluoreszierender ellipsenförmiger Ring dar. Dieser Probenbereich B1 ist kleiner als die Beugungsgrenze der Anregungsstrahlung erlaubt. Axially located represent a fluorescent elliptical ring. This sample area B1 is smaller than the diffraction limit allows the excitation radiation.
  • [0068] [0068]
    Strahlt man dagegen, wie in Beam one hand, as in 6b 6b gezeigt, eine ebenfalls beugungsbegrenzte Donut-förmige Verteilung der Anregungsstrahlung A ein, ergibt sich ein abstrahlender Proben-Bereich B1, der einer verkleinerten Airy-Verteilung entspricht, welche von einem ringförmigen fluoreszierenden Bereich umgeben ist. shown, also a diffraction-limited donut-shaped distribution of the exciting radiation A a, there is a radiating sample area B1, which corresponds to a scaled Airy distribution, which is surrounded by a circular fluorescent area. In der Schnittdarstellung zeigen sich in der Verteilung der Fluoreszenzstrahlung F deshalb drei Peaks als Proben-Bereiche B1. In the sectional view, therefore, are reflected in the distribution of the fluorescence radiation F three peaks as a sample areas B1. Auch hier ist die Punktverwaschungsverteilung Again, the point-spread 16 16 kleiner als die Beugungsgrenze zuläßt. smaller than the diffraction limit allows. Die Verbesserung der Auflösung über die normale Punktverwaschungsverteilung hängt wesentlich von der Kombination aus Kennlinie The improvement in resolution over the normal point-spread largely depends on the combination of characteristic 17 17 und Leistungsverteilung der Anregungsstrahlung A ab. and power distribution from the exciting radiation A.
  • [0069] [0069]
    Zur Ausblendung des ringförmigen Außenbereichs ist es zusätzlich möglich, eine konfokale Detektion durchzuführen, die den mittleren Peak durch geeignete Einstellung eines konfokalen Detektionsvolumens D auswählt. For suppression of the annular outer region, it is also possible to carry out a confocal detection, which selects the mean peak by suitable adjustment of a confocal detection volume D. Dies ist schematisch als dritte Verfahrensform in This is shown schematically as a third method in the form of 7 7 dargestellt. shown. Der nun noch detektierte fluoreszierende Proben-Bereich B1 besteht dann aus dem mittleren Peak. The now still detected fluorescent sample area B1 then consists of the mean peak. Insgesamt ist zB ein bildgebendes Volumen B (punktierte Linie in der rechten Darstellung der Overall, for example, is an imaging volume B (dotted line in the right representation of the 7 7 ) erreicht, das zweieinhalb mal schmäler ist, als die konventionelle Punktverwaschungsverteilung, und sogar 1,7-mal schmäler, als eine konfokale Punktverwaschungsverteilung. ) Is achieved, which is two and a half times narrower than the conventional point-spread, and even 1.7 times narrower than a confocal point-spread distribution. Bei einer Donut-förmigen Anregungsverteilung, wie sie die durchgezogene Kurve in der rechten Darstellung der In a donut-shaped excitation distribution as the solid curve in the right illustration 6b 6b bzw. and 7 7 zeigt, ist die resultierende Verteilung des bildgebenden Volumens B bzw. der mittlere Peak der Punktverwaschungsverteilung der shows the resulting distribution of the imaging volume B and the middle peak of the point-spread distribution of 6b 6b radialsymmetrisch. radially symmetrical. Verwendet man zwei Beleuchtungsspots, erreicht man eine maximale Auflösungssteigerung entlang der Verbindungslinie der Spotmaxima. Using two light spots, one achieves a maximum resolution enhancement along the line connecting the spot maxima.
  • [0070] [0070]
    Alternativ wird der äußere fluoreszierende Ring in Alternatively, the outer ring is fluorescent in 6b 6b durch ein gezieltes Rückschalten des Farbstoffs aus dem zweiten Zustand by selective switching back of the dye from the second state 6 6 in den ersten Zustand in the first state 5 5 im Bereich des konfokalen Detektionsvolumens D ausgeblendet. hidden in the area of the confocal detection volume D. Das Vorgehen/Prinzip ist dann wie folgt: Zuerst wird mit Anregungsstrahlung so angeregt, daß der zu untersuchende Probenabschnitt vollständig in den zweiten Zustand gelangt. The approach / principle is then as follows: First, is excited with excitation radiation so that the sample under investigation section completely enters the second state. Anschließend wird Rücksetzstrahlung R mit einer Verteilung entsprechend dem konfokalen Detektionsvolumen D eingestrahlt und damit ein Teil der Probe zurückgeschaltet. Then resetting radiation R is radiated with a distribution corresponding to the confocal detection volume D, and thus returns a portion of the sample. Bei nochmaliger Anregung mit der Anregungsstrahlungsverteilung A gemäß With repeated excitation with the exciting radiation distribution A according to 7 7 gelangt dann nur der in diesem Probenteil liegende bildgebende Bereich B in den ersten Zustand und emittiert Fluoreszenzstrahlung F in Form des mittleren Peaks, wie er auch in der Variante der then passes only the sample part located in this imaging region B in the first state and emits fluorescence radiation F in the form of the central peak, as also in the variant of 7 7 verbleibt. remains. Der ringförmige Außenbereich verbleibt im zweiten Zustand und fluoresziert nicht. The annular outer region remains in the second state, and does not fluoresce.
  • [0071] [0071]
    In einer vierten Verfahrensform erfolgt eine strukturierte flächige Beleuchtung, wie sie beispielsweise in In a fourth method form a textured surface illumination is carried out as described for example in 8a 8a gezeigt ist. is shown. Eine in x-Richtung sinusförmig verteilte Anregungsstrahlung A führt in den Tälern der sinusförmigen Leistungsverteilung zu Fluoreszenzstrahlung F. Die fluoreszierenden Proben-Bereiche B1 sind streifenförmig. A in the x-direction sinusoidally distributed excitation radiation A into the valleys of the sinusoidal power distribution to fluorescent radiation F. The fluorescent sample areas B1 strips. Die Streifen sind jedoch deutlich schmaler als die Streifen der sinusförmigen Verteilung der Anregungsstrahlung A. Vorteilhaft ist hierbei, daß die sinusförmige Verteilung der Anregungsstrahlung A als Minima keine Nullstellen aufweist bzw. aufweisen muß. However, the strip are considerably narrower than the strips of the sinusoidal distribution of the excitation radiation A. It is advantageous here that the sinusoidal distribution of the excitation radiation having A as minima no zeros or must have. Die resultierende Verteilung der Fluoreszenzstrahlung F hängt zwar in ihrer Höhe, nicht jedoch in der Breite von der Leistung der Anregungsminima ab. Although the resulting distribution of the fluorescence radiation F is stuck at its height, but not in the width of the power from the Anregungsminima. Die Tiefe der Minima der sinusförmigen Anregungsstrahlungsverteilung ist also unkritisch für die Breite der Streifen und somit für die Auflösung. The depth of the minima of the sinusoidal excitation radiation distribution is therefore critical to the width of the strip and thus for the resolution. Im Beispielfall ist die Periode der sinusförmigen Streifenverteilung der Anregungsstrahlung A an der Grenzfrequenz der Auflösung eingestellt. In the example case, the period of the sinusoidal excitation radiation distribution of the strip A is set at the boundary frequency of the resolution. Als Detektor wird zB ein Matrixdetektor verwendet. As a detector, for example a matrix detector is used. Die Streifenbreite und mithin die Auflösung ist um Faktor 6 gegenüber der Grenzfrequenz der Auflösung verbessert. The strip width and hence the resolution is improved by a factor of 6 compared to the cutoff frequency of the resolution. Ein hochaufgelöstes Bild wird nun durch Verschiebung des Streifenmusters gewonnen. A high-resolution image is now obtained by shifting the fringe pattern.
  • [0072] [0072]
    Alternativ kann statt einer streifenförmigen Weitfeldbeleuchtung auch eine brennlinienförmige Beleuchtung verwendet werden, wobei die Linie entlang ihrer Längsachse (zB sinusförmig) moduliert ist, so daß die Leistung in Linienabschnitten über dem Schwellwert und in Linienabschnitten unter dem Schwellwert liegt. Alternatively can be used instead of a strip-shaped wide-field illumination and a focal line-shaped illumination, the line along its longitudinal axis (eg, sinusoidal) is modulated so that the power is in line segments above the threshold and line portions below the threshold. Die Scanbewegung erfolgt senkrecht zur Linie und entlang der Linie. The scan movement takes place perpendicular to the line and along the line. Der Detektor ist ein geeignet hochauflösender Zeilendetektor. The detector is a suitable high resolution line detector.
  • [0073] [0073]
    8b 8b zeigt eine Weiterbildung der vierten Verfahrensform der shows a development of the fourth form of the process 8a 8a . , In dieser fünften Verfahrensform erfolgt die Strukturierung der Verteilung der Auflösungsstrahlung A in beiden lateralen Achsen, dh in der Probenebene, so daß eine matrixförmige Beleuchtungsspotverteilung gegeben ist. In this fifth method, the form of the structuring of the radiation distribution of the resolution A in both lateral axes is carried out, ie so that a matrix-shaped light distribution is given spot in the sample plane. Dies ist in der Schnittdarstellung der linken Hälfte der This is shown in the sectional view of the left half of the 8b 8b eindimensional dargestellt. represented one-dimensional. Senkrecht zur optischen Achse ist eine Matrix aus hellen Anregungsspots auf die Probe abgebildet. Perpendicular to the optical axis of a matrix of light excitation spots is imaged onto the sample. Jedem Beleuchtungsspot wird nun ein Detektor zugeordnet. Each lighting spot a detector is now assigned. Eine Verschiebung des Spotmusters relativ zur Probe erlaubt es, die Zwischenräume zwischen den Punkten ebenfalls zu vermessen. A displacement pattern of the spot relative to the sample makes it possible to measure the spaces between the dots as well. Der Bereich in dem die Verschiebung des matrixförmigen Musters zu erfolgen hat, ist in The area has to be made in the displacement of the matrix-like pattern is in 8b 8b als Gebiet G1 dargestellt. represented as a region G1. Durch eine Abrasterung der Spotmatrix, beispielsweise wie mit einem konventionellen Laserscanningmikroskop bekannt, wird insgesamt das gesamte Gebiet G2 aus Einzelgebieten G1 zusammengesetzt. Known by a scanning it, the spot matrix, for example, as with a conventional laser scanning microscope, the entire territory of G2 as a whole composed of individual regions G1. Durch diese Parallelisierung ist eine sehr hohe Scangeschwindigkeit erreicht. By parallelizing a very high scan speed is reached. Zugleich ist die Auflösung, wie die schmalen Peaks der Fluoreszenzstrahlung F in der Schnittdarstellung zeigen, über die Auflösung der Anregungsstrahlungsverteilung hinaus gesteigert. At the same time resolution as the narrow peak of the fluorescence radiation F show in the sectional view is increased beyond the resolution of the exciting radiation distribution beyond.
  • [0074] [0074]
    Obwohl bislang nur die laterale Auflösung erwähnt wurde, ist auch die axiale Auflösung für die Ausführungsformen verbessert. Although so far only the lateral resolution was mentioned, the axial resolution of the embodiments is improved.
  • [0075] [0075]
    9a 9a zeigt ein Laserscanningmikroskop, das jede der erläuterten Verfahrensformen realisieren kann. shows a laser scanning microscope that can implement any of the methods explained forms. Für die Verfahrensformen For the method forms 1 1 bis to 3 3 ist das Laserscanningmikroskop is the laser scanning microscope 20 20 z. B. als einzelpunktscannendes Mikroskop ausgebildet. z. B. configured as a single-point-scanning microscope. Es weist ein Anregungsmodul It has an excitation module 21 21 , ein Mikroskopmodul A microscope module 22 22 sowie ein Detektormodul and a detector module 23 23 auf. on. Im Mikroskopmodul The microscope module 22 22 befindet sich eine Probe There is a sample 24 24 im Fokus eines Objektivs the focus of a lens 25 25 , dem in Beleuchtungsrichtung eine Tubuslinse , The illumination direction in a tube lens 26 26 vorgeschaltet ist. is connected upstream. Vor dieser Optik liegt eine Scanoptik Prior to this look is scanning optics 27 27 , die zusammen mit einem Scanner Which, together with a scanner 28 28 ein Abscannen der Probe a scanning of the sample 24 24 durch Verschieben des Fokuspunktes auf der Probe ermöglicht. possible by shifting the focus point on the sample. Ein Hauptfarbteiler A main beam splitter 29 29 koppelt die Strahlung aus dem Anregungsstrahlungsmodul couples the radiation from the excitation radiation module 21 21 in das Mikroskopmodul in the microscope module 22 22 ein und trennt aus dem Mikroskopmodul and separated from the microscope module 22 22 von der Probe of the sample 24 24 aufgenommene Strahlung zum Detektormodul absorbed radiation to the detector module 23 23 ab. from.
  • [0076] [0076]
    Das Anregungsmodul The excitation module 21 21 verfügt über eine Lichtquelle has a light source 30 30 , deren Strahlung über den Hauptfarbteiler Whose radiation through the main color splitter 29 29 zum Fokuspunkt in der Probe to the focal point in the sample 24 24 gebündelt wird. is bundled. Die im Fokuspunkt der Probe The focus point of the sample 24 24 angeregte Fluoreszenzstrahlung F wird vom Objektiv excited fluorescence radiation F is the lens 25 25 gesammelt und am Hauptfarbteiler collected and the main beam splitter 29 29 aufgrund der im Vergleich zur Anregungsstrahlung A geänderten Spektraleigenschaften zu einer Pinholeoptik due to the changed compared to the excitation radiation A spectral properties to a pinhole 31 31 ausgekoppelt, der ein Pinhole decoupled, the pinhole a 32 32 sowie ein (optionaler) Blockfilter and an (optional) block filter 33 33 nachgeschaltet sind. downstream. Ein Punkt-Detektor A point detector 34 34 erfaßt die Leistung der Fluoreszenzstrahlung F am Fokuspunkt. detects the power of the fluorescent radiation at the focal point F. Die Erfassung kann zusätzlich spektral aufgelöst, polarisationsaufgelöst und/oder zeitaufgelöst erfolgen. The acquisition can also spectrally resolved, polarization-resolved and / or time-resolved. Die Signale des Detektors The signals of the detector 34 34 werden von einem Steuergerät be from a control unit 35 35 ausgelesen, das insgesamt den Betrieb des Laserscanningmikroskops read the whole operation of the laser scanning microscope 20 20 steuert. controls.
  • [0077] [0077]
    Zur Auflösungssteigerung erfolgt die Einstrahlung der Anregungsstrahlung A in den Fokuspunkt For increasing the resolution, the irradiation of the excitation radiation is A in the focal point 24 24 mit einer bestimmten Leistungsverteilung. with a specific power distribution. Um diese vorzugeben und einzustellen, ist ein geeigneter Aufbau im Anregungsmodul In order to define and set this, a suitable structure in the excitation module 21 21 vorgesehen. provided. Die Bauweise der The construction of the 9a 9a weist einen Strahlteiler has a beam splitter 36 36 auf, der 50% der Strahlleistung der Lichtquelle to which 50% of the beam power of the light source 30 30 auskoppelt. decouples. In der Ausführungsform handelt es sich bei dem Strahlteiler In the embodiment, wherein the beam splitter 36 36 um einen Polarisationsstrahlteiler. a polarization beam splitter. Die derart aufgespaltenen Teilstrahlen werden nachher über einen weiteren Strahlteiler The thus split partial beams are subsequently through another beam splitter 40 40 wieder zu einem gemeinsamen Strahl überlagert, wobei die Intensitäten und Phasen der Teilstrahlen zuvor geeignet eingestellt werden. again superimposed to form a common beam, wherein the intensities and phases of the sub-beams are previously suitably adjusted. Zusätzlich ist in einem Teilstrahl ein Phasenelement Additionally, in a partial beam is a phase element 39 39 gestellt, das entweder als festes Phasenelement oder als variabel einstellbares Phasenelement ausgebildet werden kann. provided that can be configured either as a solid phase member or as a variably adjustable phase element. Das Phasenelement The phase element 39 39 hat z. B. einen phasenverändernden Bereich z. B. has a phase-changing field 44 44 sowie einen phasenneutralen Bereich and a phase-neutral range 49 49 , so daß eine donutförmige Leistungsverteilung im Strahl erzeugt wird. So that a donut-shaped power distribution in the beam. Nach Überlagerung der beiden Teilstrahlen nach dem Strahlteiler After superposition of the two partial beams by the beam splitter 40 40 erhält man Anregungsstrahlung A gemäß obtained excitation radiation A according to 10 10 . , Der Aufbau des Phasenelementes The structure of the phase element 39 39 ist exemplarisch in is exemplified in 9b 9b gezeigt. shown. Zur Einstellung der Leistungsanteile der beiden Teilstrahlen vor der Überlagerung sind in jeden Teilstrahl noch variable Abschwächer To adjust the power balance between the two partial beams prior to superposition are in each partial beam still variable attenuator 37 37 bzw. and 38 38 gestellt. provided.
  • [0078] [0078]
    Im Ergebnis erhält man eine Verteilung der Leistung der Anregungsstrahlung A, wie sie in As a result, one obtains a distribution of the power of the excitation radiation A, such as in 10 10 als Schnittdarstellung entlang einer senkrecht zur optischen Achse verlaufende x-Achse gezeigt ist. is shown as a sectional view taken along a plane perpendicular to the optical axis extending x axis. Die Verteilung weist ein Minimum The distribution has a minimum 45 45 auf, dessen Tiefe durch Einstellung der Abschwächer on whose depth by adjusting the attenuator 38 38 bzw. and 37 37 , dh durch Änderung der relativen Leistung der beiden Teilstrahlen variabel einstellbar ist, z. B. durch das Steuergerät , That is variably adjustable by changing the relative power of the two sub-beams, for. Example, by the controller 35 35 . , Die Anpassung des Minimums The adjustment of the minimum 45 45 erlaubt es, die Intensität der ebenfalls in allows the intensity of the also in 10 10 eingezeichneten Fluoreszenzstrahlung F optimal einzustellen. marked fluorescence radiation F set optimally.
  • [0079] [0079]
    Das hinsichtlich der Tiefe einstellbare Minimum The adjustable in depth minimum 45 45 kann auch durch den Einsatz eines variabel einstellbaren Phasenelementes ohne Bildung von Teilstrahlen erzeugt werden. can also be generated by the use of a variably adjustable phase element without the formation of sub-beams. Für ein solches Phasenelement kommt eine Matrix aus Flüssigkristallen in Frage, bei der die Phase jedes einzelnen Pixels einstellbar ist. For such a matrix of liquid crystal phase element is concerned, in which the phase of each individual pixel can be adjusted. Natürlich sind noch andere Einrichtungen zur Erzeugung einer donatförmigen Strahlverteilung mit einstellbarem Minimum Of course, other means for generating a donat shaped beam distribution with adjustable minimum 45 45 möglich. possible.
  • [0080] [0080]
    Für ein optionales Rückschalten der Proben-Bereiche B2 vom zweiten Zustand For an optional switching back the sample areas B2 from the second state 6 6 in den ersten Zustand in the first state 5 5 kann eine Rücksetzstrahlungsquelle can a resetting radiation source 41 41 vorgesehen werden, die über einen dritten Teiler are provided, which via a third divider 42 42 in den Anregungsstrahlengang des Anregungsmoduls in the excitation beam path of the excitation module 21 21 eingebunden ist. is involved. Diese Bauweise ist jedoch optional, weshalb die Darstellung der This construction is, however, optional, and therefore the representation of the 9a 9a auch eine gestrichelte Darstellung für diese Elemente zeigt. a dashed line for these elements shows. Die Rücksetzstrahlungsquelle The resetting radiation source 41 41 ist nur dann erforderlich, wenn der Farbstoff der Probe It is only necessary when the dye of the sample 24 24 nicht spontan wieder in den ersten Zustand zurückkehrt, sondern eines aktiven Rücksetzens durch optische Rücksetzstrahlung R bedarf. not spontaneously returns to the first state, but will require an active reset by optical resetting radiation R. Rücksetzstrahlung kann jedoch auch anderweitig auf die Probe However, resetting radiation may also elsewhere on the sample 24 24 aufgebracht werden, beispielsweise durch eine Einstrahlung schräg zur optischen Achse des Objektivs be applied, for example, by irradiation oblique to the optical axis of the lens 25 25 mit Hilfe einer seitlich vom Laserscanningmikroskop angebrachten Rücksetzstrahlquelle. with the aid of a laterally affixed by the laser scanning microscope reset ray source.
  • [0081] [0081]
    Das Mikroskop der The Microscope 9a 9a kann die eingangs geschilderten Verfahrensformen ausführen. can perform the procedure initially described forms. Die dritte Verfahrensform erfordert dabei die Verwendung des Pinholes The third method form it requires the use of the pinhole 32 32 und der Pinholeoptik and the pinhole 31 31 im Detektormodul in the detector module 23 23 . , Immer dann, wenn man keine konfokale Detektion benötigt, können die dafür nötigen Bauteile ( Whenever you do not need confocal detection, making the necessary components to ( 31 31 , . 32 32 ) entfallen. ) Account.
  • [0082] [0082]
    11a 11a zeigt eine weitere Verbesserungsmöglichkeit des erfindungsgemäßen Vorgehens auf. shows a further possibility of improvement of the procedure according to the invention. Der Übergang der Probe im Teil-Bereich B2 aus dem ersten Zustand in den zweiten Zustand The transition of the sample in the sub-range B2 from the first state to the second state 6 6 kann unvollständig stattfinden. can take place incomplete. Dies ist beispielsweise dann der Fall, wenn die Fluoreszenzkennlinie This is for example the case when the fluorescent characteristic 17 17 nach dem Maximalwert according to the maximum value 18 18 , dh für Leistungen der Anregungsstrahlung A oberhalb des Schwellwertes , Ie for services of excitation radiation A above the threshold 19 19 , nicht steil genug abfällt. Not steeply enough. Im Beispiel der In the example of 11a 11a geht die Kennlinie is the characteristic 17 17 auch bei hohen Anregungsstrahlungsleistungen nicht auf Null zurück. even at high excitation radiation powers not to zero. Dies führt zu einer Restfluoreszenz This results in a residual fluorescence 47 47 in den Proben-Bereichen B2, die im zweiten Zustand in the sample areas B2 in the second state 6 6 sind, da der geminderte Anteil , since the proportion of impaired 46 46 nicht dem Maximalwert not the maximum value 18 18 entspricht. corresponds. Würde man die Fluoreszenzstrahlung F dann mit dem Mikroskop gemäß If you were the fluorescence radiation F then according to the microscope 9a 9a beispielsweise in Realisierung der dritten Verfahrensform vermessen, so würde sich das bildgebende Volumen B aus einem niedrig aufgelösten Sockel S und einer hochaufgelösten Verteilung V zusammensetzen. measured for example in the implementation of the third process form, then the imaging volume B would consist of a low-resolution base S and a high-resolution distribution V. Dies ist in This is in 11b 11b schematisch dargestellt, die den Sockel S schraffiert und die hochaufgelöste Verteilung V schwarz zeigt. schematically shown that shades the base S and the high resolution distribution V is black.
  • [0083] [0083]
    Der gleiche Effekt kann auftreten, wenn in der Probe eine starke Diffusion des fluoreszierenden Materials, beispielsweise der Farbstoffmoleküle, herrscht. The same effect can occur when a strong diffusion in the sample of the fluorescent material, for example, of the dye molecules prevails. Auch dann ergibt sich eine Restfluoreszenz Even then, there is a residual fluorescence 47 47 in den Proben-Bereichen B2, jedoch nicht aufgrund einer vergleichsweise schwach abfallenden Kennlinie in the sample areas B2, but not due to a comparatively weak sloping curve 17 17 , sondern durch Diffusion des fluoreszierenden Materials. But by diffusion of the fluorescent material.
  • [0084] [0084]
    Der Sockel S läßt sich durch geeignete Bildaufnahme unterdrücken. The base S can be suppressed by suitable image acquisition. Eine dies realisierende zweite Ausführungsform eines Laserscanningmikroskops A realized this second embodiment of a laser scanning microscope 20 20 ist exemplarisch in is exemplified in 12 12 dargestellt. shown. Mit der Bauweise gemäß With the construction according to 9a 9a übereinstimmende Komponenten sind mit denselben Bezugszeichen versehen, so daß auf ihre nochmalige Erläuterung verzichtet werden kann. matching components are denoted by the same reference numerals, and so can be dispensed with their repeated explanation.
  • [0085] [0085]
    Im Unterschied der Bauweise der In contrast the construction of the 9a 9a ist nun der Detektor is now the detector 34 34 mit einem Lock-In-Verstärker with a lock-in amplifier 48 48 verbunden, wobei diese Verbindung in connected, said compound in 12 12 lediglich exemplarisch über das Steuergerät exemplary only via the control unit 35 35 realisiert ist. is realized. Natürlich ist auch eine direkte Verbindung möglich. Of course, a direct connection is possible. Auch kann der Lock-In-Verstärker Also, the lock-in amplifier can 48 48 in das Steuergerät in the controller 35 35 integriert werden. be integrated. Der Lock-In-Verstärker The lock-in amplifier 48 48 ist mit einem Frequenzgenerator is provided with a frequency generator 49 49 verbunden, der das Minimum connected, the minimum, the 45 45 in seiner Amplitude moduliert. modulated in amplitude. Hierzu wird die Leistung einer der beiden Teilstrahlen im Anregungsmodul To this end, the performance of the two partial beams in the excitation module 21 21 geeignet moduliert, was z. B. durch eine Ansteuerung einer der beiden Abschwächer appropriately modulated what z. B. by driving one of the two attenuators 37 37 oder or 38 38 geschieht. happens. In der Darstellung der In the illustration of 12 12 ist die Ansteuerleitung für den Abschwächer is the control line for the attenuator 38 38 gestrichelt dargestellt, um diese Option anzudeuten. shown in dashed lines to indicate this option. Natürlich kann die Ansteuerung der Abschwächer auch durch das Steuergerät Of course, the control of the attenuator can also by the control unit 35 35 erfolgen, das das Signal des Frequenzgenerators take place that the signal of the frequency generator 49 49 entsprechend auswertet. evaluates accordingly. Wie bereits erwähnt, können der Lock-In-Verstärker As mentioned above, the lock-in amplifier can 48 48 und/oder der Frequenzgenerator and / or the frequency generator 49 49 Bestandteile des Steuergerätes Components of the control unit 35 35 sein. be.
  • [0086] [0086]
    Die vom Frequenzgenerator The frequency of the generator 49 49 zur Modulation des Minimums bereitgestellten Frequenz wird auch dem Lock-In-Verstärker for modulation of the minimum frequency is also provided to the lock-in amplifier 48 48 zugeführt. supplied. Durch die Modulation des Minimums By the modulation of the minimum 45 45 verändert sich das Signal aus den Proben-Bereichen im ersten Zustand the signal from the sample areas changed in the first state 5 5 , wohingegen Signale aus dem Sockel S konstant bleiben. Whereas signals from the base S remain constant. Der Lock-In-Verstärker The lock-in amplifier 48 48 separiert die modulierten Signale heraus und unterdrückt Signale aus dem Sockel S. Im Ergebnis erfolgt eine Trennung der Verteilung V vom Sockel S, und die hochaufgelöste Detektion ist auch bei einem unvollständigem Übergang in den zweiten Zustand the modulated signals separated out and suppressed signals out of the socket S. As a result, a separation of the distribution V from the base S, and the high-resolution detection is also in an incomplete transition to the second state 6 6 erreicht. reached.
  • [0087] [0087]
    Verwertet man gezielt den Gleichanteil des Signals, erreicht man eine zusätzliche Bildinformation, die nicht hochaufgelöst ist. Utilized to target the DC component of the signal to reach an additional image information that is not in high resolution. Diese Bildinformation kann sich zB auf andersartig fluoreszierende Proben-Bereiche/-Eigenschaften beziehen. This image information may relate to differently fluorescing sample areas / properties for example. Die hoch und niedrig aufgelösten können beliebig codiert (zB farbcodiert) überlagert dargestellt werden. The high and low resolution can arbitrarily coded (eg, color coded) are shown superimposed.
  • [0088] [0088]
    Alternativ oder zusätzlich zu dieser Lock-In-Detektion können auch zwei Bilder aufgezeichnet werden. Alternatively, or in addition to lock-in detection, two images can be recorded. Ein erstes Bild wird mit Anregungsstrahlungsverteilung mit Minimum The first photo is with excitation radiation distribution with minimum 45 45 , das zweite ohne Minimum , The second minimum without 45 45 aufgezeichnet. recorded. Zur Separierung der hochaufgelösten Verteilung V vom Sockel S werden dann nur noch die Bilder voneinander subtrahiert (erstes Bild minus zweites Bild). In order to separate the high-resolution distribution V from the south then only be subtracted images (first image minus second picture). Das Ergebnisbild enthält nur noch die Informationen mit der hochaufgelösten Verteilung V. Weitere Möglichkeiten zur Unterdrückung eines niedrig aufgelösten Sockels können die Nutzung der unterschiedlichen optischen Eigenschaften des ersten Zustands The resulting image contains only the information with the high-resolution distribution V. Other ways to suppress a low-resolution base, the use of different optical properties of the first state 5 5 und des zweiten Zustands and the second state 6 6 sein, beispielsweise wenn sich die Lebensdauer der beiden Zustände unterscheiden. be, for example, if they are different the life of the two states. Auch kann man eine unterschiedliche Charakteristik des Emissionsspektrums verwenden, bzw. eine unterschiedliche Charakteristik des Absorptionsspektrums zwischen erstem Zustand Also, one can use a different characteristic of the emission spectrum, or a different characteristic of the absorption spectrum between the first state 5 5 und zweiten Zustand and second state 6 6 . ,
  • [0089] [0089]
    13 13 zeigt eine nochmalige Abwandlung des Laserscanningmikroskops shows a further modification of the laser scanning microscope 20 20 der the 9a 9a zur Realisierung einer der Verfahrensformen mit linienförmiger Beleuchtung. for realizing the method forms with line-shaped illumination. Auch hier sind mit der Again, with the 9a 9a übereinstimmende Elemente mit denselben Bezugszeichen gekennzeichnet, so daß auf deren Beschreibung wiederum verzichtet werden kann. matching elements with the same reference numerals so that the description thereof in turn can be dispensed with. Weiter sind nur die Mittelstrahlen eingezeichnet. Further, only the central rays are shown.
  • [0090] [0090]
    Die nun kohärente Lichtquelle The now coherent light source 30 30 strahlt ihre Strahlung durch ein Gitter emits its radiation through a grating 50 50 , das zwei 1. Beugungsordnungen, o+ und o-, sowie eine 0.-Beugungsordnung erzeugt. That makes two 1st diffraction orders, o + and o-, and a 0-order diffraction. Dem Gitter ist eine Zylinderlinse The grid is a cylindrical lens 50a 50a nachgeordnet, die hier ein Beispiel für ein anamorphotisches Element ist. downstream of which is an example of an anamorphic element here. Auf die Probe wird eine senkrecht zur optischen Achse liegende Linie fokussiert. To the test a plane perpendicular to the optical axis line is focused.
  • [0091] [0091]
    Die Beugungsordnungen fallen beim Fokussieren streifend zueinander ein und gelangen so in der Probe zur Interferenz. The diffraction orders fall when focusing grazing each other and thus reach the sample to interference. Durch den Talbot-Effekt entsteht ein sogenanntes Talbotgitter entlang der optischen Achse OA. By the Talbot effect is produced a so-called Talbotgitter along the optical axis OA. Dies ist schematisch in der oberen Hälfte der This is schematically illustrated in the upper half of 14 14 gezeigt. shown. Die +1., die 0. sowie die –1. The +1., 0. and -1. Ordnung fallen in der Probe Order to fall in the sample 24 24 unter verschiedenen Winkeln ein und die Interferenzen erzeugen die dem Fachmann bekannte Talbotstruktur. a at different angles and the interference produce known to those skilled Talbotstruktur.
  • [0092] [0092]
    Die Wirkung innerhalb der Probe zeigt sich in der unteren Hälfte The effect within the sample is shown in the lower half 14 14 , die einen Tiefenschnitt (x,z-Ebene) durch die Probe zeigt. Showing a depth slice (x, z-plane) by the sample. An den Stellen hoher Intensität (schwarze Bereiche B2) gelangt die Probe in den zweiten Zustand At the points of high intensity (black areas B2), the sample enters the second state 6 6 , dh es wird eine Entvölkerung der angeregten Zustände durch Umschalten der Farbstoffmoleküle erreicht. , That is, reaches a depopulation of the excited states by switching the dye molecules. In den Bereichen B1 geringer Intensität verbleibt die Probe im ersten Zustand In the areas of low intensity B1 and the sample remains in the first state 5 5 (schraffierte und weiße Bereiche). (Shaded and white areas).
  • [0093] [0093]
    Die Detektion erfolgt mit einem Zeilendetektor Detection is carried out with a line detector 34 34 , der in der Bauweise der That in the construction of the 13 13 exemplarisch als mit dem Steuergerät of example as to the control unit 35 35 vereinigt dargestellt ist. is shown combined. Dem Zeilendetektor The linear detector array 34 34 ist wieder (optional) ein Blockfilter is back (optional) a block filter 33 33 vorgestellt. presented. Weiter ist dem Zeilendetekor Next is the Zeilendetekor 34 34 eine (in a (in 13 13 nicht dargestellte, da direkt auf den Zeilendetektor not shown, as it is directly on the line detector 34 34 aufgebrachte) entlang der x-Achse liegende Schlitzblende vorgeordnet, um die erforderliche konfokale Selektion einer Tiefenebene zu bewirken und dadurch nur die schraffierten Bereiche zu detektieren. applied) arranged upstream along the x-axis lying slit diaphragm in order to provide the required selection of a confocal depth level and thereby detect only the hatched areas.
  • [0094] [0094]
    Der Scanner The scanner 28 28 ermöglicht die Bewegung der Anregungsstrahlungsverteilung über die Probe allowing the movement of the excitation radiation distribution over the sample 24 24 senkrecht zur optischen Achse, also entlang der x- und y-Achse. perpendicular to the optical axis, ie along the x and y axis. Optional kann mit der Rücksetzstrahlungsquelle Optionally, the resetting radiation source 41 41 beispielsweise eine homogene Line entlang der x-Achse in der Probe For example, a homogeneous line along the x-axis in the sample 24 24 erzeugt werden, die ein Umschalten der Farbstoffe aus dem zweiten Zustand are generated, the switching of the dye from the second state 6 6 in den ersten Zustand in the first state 5 5 ermöglicht, wie dies enables, as 5 5 veranschaulicht. illustrated. Diese Linie kann auch ein Beleuchtungsmuster aufweisen, daß passend zu den Proben-Bereichen B2 im zweiten Zustand This line may also include an illumination pattern that match the sample areas B2 in the second state 6 6 liegt, da nur diese Bereiche zurückgesetzt werden müssen. is because only these areas need to be reset.
  • [0095] [0095]
    Das Laserscanningmikroskop gemäß The laser scanning microscope according to 13 13 realisiert also die Verfahrensform gemäß So implements the method according to the form 8a 8a . , Die Tiefe der Minima The depth of the minima 45 45 kann durch die Güte des Gitters bzw. die individuelle Abschwächung der einzelnen Ordnungen erfolgen. can be carried out by the quality of the grid or the individual attenuation of the individual orders.
  • [0096] [0096]
    15a 15a zeigt eine Anordnung zur Realisierung der Verfahrensform gemäß shows an arrangement for realizing the method according to the form 8b 8b , wobei vom Laserscanningmikroskop Wherein the laser scanning microscope 20 20 hier nur das Anregungsmodul only the excitation module 21 21 gezeigt ist, da das Mikroskopmodul is shown as the microscope module 22 22 ansonsten den bereits geschilderten Aufbau hat. otherwise has the structure described already. Aus der Lichtquelle From light source 30 30 werden mittels eines ersten Strahlteilers by means of a first beam splitter 53 53 zwei Teilstrahlen erzeugt, hier senkrecht zur Zeichenebene beabstandet. two partial beams produced here spaced perpendicular to the plane. Ein zweiter Strahlteiler A second beam splitter 52 52 erzeugt insgesamt vier parallel laufende Teilstrahlen. produced a total of four parallel sub-beams. 15b 15b zeigt die Anordnung in einem um 90° Grad gedrehten Schnitt. shows the arrangement in a rotated by 90 ° section. Insgesamt liegen vier Teilstrahlen In total there are four sub-beams 54 54 , . 55 55 gleicher Intensität (gezeichnet sind die Mittelstrahlen) vor. the same intensity (shown are the mean radiation) ago. In der Zeichnung nehmen jeweils zwei Teilstrahlen den gleichen Weg, so daß sie verdeckt sind. In the drawing, two partial beams follow the same path, so that they are hidden.
  • [0097] [0097]
    Die Teilstrahlen werden durch Linsen in eine Pupille des Mikroskopmoduls The partial beams by lenses in a pupil of the microscope module 22 22 fokussiert, so daß sich innerhalb einer Berandung focused, so that within a boundary 56 56 der Pupille die in the pupil in the 16a 16a dargestellte Punktverteilung ergibt. point distribution shown results. Die vier Teilstrahlen The four sub-beams 55 55 , . 54 54 nehmen die Ecken eines Quadrates ein. occupy the corners of a square. In der Probe In the sample 24 24 gelangen die Teilstrahlen zur Interferenz, wodurch senkrecht zur optischen Achse ein Multispotmuster enter the sub-beams to interfere, thus perpendicular to the optical axis of a multi-spot pattern 58 58 gemäß according to 16b 16b auf der Probe on the sample 24 24 entsteht. arises. Die Tiefe der Nullstellen dieses Multispotmusters The depth of the zeros of this multi-spot pattern 58 58 kann beispielsweise durch die Änderung der Intensitäten der jeweils diagonal gegenüberliegenden Strahlen for example, by changing the intensities of each diagonally opposite rays 54 54 , . 55 55 variiert werden. be varied. Hierzu sind geeignete einstellbare Abschwächer (nicht gezeigt) für die Teilstrahlen vorgesehen. Suitable for this purpose adjustable attenuator (not shown) for the partial beams.
  • [0098] [0098]
    An den Stellen hoher Intensität (helle Bereiche B2) im Multispotmuster At the points of high intensity (bright areas B2) in the multi-spot pattern 58 58 der the 16b 16b gelangt die Probe passes the test 24 24 in den zweiten Zustand in the second state 6 6 . , Fluoreszenzstrahlung F entsteht in den Bereichen B1 geringer Intensität (dunkle Bereiche). Fluorescence radiation F is formed in the areas B1 of low intensity (dark areas). Die Fluoreszenzstrahlung F wird dann wie üblich am Hauptfarbteiler The fluorescence radiation F is then, as usual, the main color splitter 29 29 abgeteilt. partitioned. Der Detektor The detector 54 54 ist ein auf das Spotmuster angepaßter Matrixdetektor, optional mit vorgeschalteter Pinholemaske. is adapted to the spot pattern array detector, optionally with upstream Pinholemaske. Die Detektorelemente sind auf die Bereiche B1 ausgerichtet. The detector elements are aligned with the areas B1. Der Scanner The scanner 28 28 ermöglicht wiederum die Verschiebung der Anregungsstrahlungsverteilung über die Probe in turn, enables the shifting of the excitation radiation distribution over the sample 24 24 in x- und/oder y-Richtung. in the x and / or y-direction. 17 17 zeigt im unteren Bild das Multispotmuster shows in the picture below the multi-spot pattern 58 58 und darüber das damit angeregte Fluoreszenzmuster and about the so excited fluorescence pattern 59 59 . ,
  • [0099] [0099]
    Von der Rücksetzlichtquelle From the reset light source 41 41 kann ein weiterer Strahl , another beam 57 57 in die Pupille fokussiert werden, der damit eine homogene Fläche in der Probe be focused into the pupil, the order that a homogeneous surface in the sample 24 24 ausleuchtet. illuminates. Dadurch erfolgt ein Rückschalten der Fluoreszenzmoleküle aus dem zweiten Zustand This results in a downshift of the fluorescent molecules from the second state 6 6 in den ersten Zustand in the first state 5 5 , wie bereits erläutert zwischen zwei Scanschritten und gegebenenfalls auch innerhalb eines Schanschrittes. As already explained between two scan steps, and possibly also within a scraping step.
  • [0100] [0100]
    Der Rücksetzstrahl The reset beam 47 47 kann aber auch ein Beleuchtungsmuster aufweisen, das den Bereichen B2 entspricht, da nur diese rückgesetzt werden müssen. but may also include an illumination pattern corresponding to the areas B2, as only these need to be reset. Hierzu wird der Strahl To this end, the beam 47 47 analog zu den Teilstrahlen analogous to the partial beams 54 54 , . 55 55 ebenfalls in vier Teilstrahlen zerlegt und in die Pupille abgebildet, so daß sich innerhalb der Berandung also divided into four sub-beams and displayed in the pupil, so that within the boundary 56 56 der Pupille beispielsweise die in the pupil, for example, in 18 18 gezeigte Verteilung ergibt. distribution shown results. Zusätzlich ist die optische Achse der Teilstrahlen In addition, the optical axis of the partial beams 57 57 der Rücksetzstrahlung R gegenüber der optischen Achse der Anregungsstrahlung A derart verkippt, daß die in der Probe entstehenden Minima des Multispotmuster the resetting radiation R relative to the optical axis of the excitation radiation A tilted such that the resulting sample in the minima of the multi-spot pattern 58 58 der Anregungsstrahlung A mit den Maxima des Multispotrücksetzmusters zusammenfallen Die Ausführungsform gemäß the excitation radiation A with the maxima of the multi-spot reset pattern coincide The embodiment of 15a 15a in der Variante von in the variant of 18 18 ist ein exemplarisches Beispiel dafür, daß durch geeignete Strukturierung der Rücksetzstrahlung eine proben- bzw. farbstoffschonende Rücksetzung nur in den Bereichen B2 erfolgt. is a typical example of that by appropriate structuring of the resetting radiation a sample- or dye gentle reset occurs only in the areas B2.
  • [0101] [0101]
    Es kommt darauf an, daß die Probe durch geeignete Einstrahlung von Anregungsstrahlung A in Bereiche B1 im ersten Zustand und in Bereiche B2 im zweiten Zustand aufgeteilt wird. It is important that the sample is divided by appropriate irradiation of the excitation radiation in areas A and B1 in the first state in the regions B2 in the second state. Die Überführung von Proben-Bereichen in den zweiten Zustand kann deshalb auch durch zur Auswahl einer Tiefenebene der Probe (vgl. The placing of sample areas in the second state can therefore also to select a depth level of the sample (see FIG. 14 14 ) eingesetzt werden, so daß Proben-Bereiche B1 nicht zu einem Übersprechen benachbarter Detektorelemente/-regionen beitragen können. ) Are used, so that sample areas B1 can not contribute to crosstalk of adjacent detector elements / regions.
  • [0102] [0102]
    Für das vorstehend in verschiedenen Varianten geschilderte Verfahren bzw. Mikroskop ist die Einstellung der Leistung der Anregungsstrahlung A abhängig von der Fluoreszenzcharakteristik der Probe unter besonderer Berücksichtigung der örtlichen Verteilung der Anregungsstrahlung A von Bedeutung. For the above-described method in different variants microscope or the setting of the power of the excitation radiation A is dependent on the fluorescence characteristics of the sample under special consideration of the spatial distribution of the exciting radiation A significant. Insbesondere bestimmt die Tiefe eines oder mehrer Minima In particular, the depth of one or more minima determined 45 45 und die Höhe der entsprechenden Maxima der Anregungsstrahlung der Verteilung die erreichbare Auflösungssteigerung. and the height of the corresponding maxima of the excitation radiation distribution, the achievable resolution enhancement. Ein Optimierung der Einstellung der örtlichen Leistungsverteilung der Anregungsstrahlung A kann auf zwei Wegen realisiert werden: Bei Kenntnis der Kennlinie An optimization of the attitude of the local power distribution of the exciting radiation A can be realized in two ways: With knowledge of the characteristic 17 17 , die dazu beispielsweise dem Steuergerät That this example, the controller 35 35 entsprechend zur Verfügung gestellt ist/wird, wird für eine gegebene örtliche Anregungsverteilung der optimale Leistungspegel errechnet und entsprechend eingestellt, beispielsweise durch Ausgabe eines Sollwertes oder sogar direkte Ansteuerung des Anregungsmoduls is provided accordingly / is calculated for a given local excitation distribution, the optimal power level and set accordingly, for example, by issuing a setpoint or even direct control of the excitation module 21 21 . ,
  • [0103] [0103]
    Alternativ oder zusätzlich kann an einem Testpräparat oder einer Referenzstelle der zu untersuchenden Probe die tatsächliche Auflösung ermittelt und der optimale Leistungspegel bei gebender Anregungsverteilung in einem interativen Prozeß ermittelt und dann zur Abbildung der Probe Alternatively or additionally, determined on a test product or a reference point of the test sample, the actual resolution and determines the optimal power level for imaging excitation distribution in an iterative process, and then the image of the sample 24 24 verwendet werden. be used.
  • [0104] [0104]
    Anstelle einer reinen Leistungsskalierung kann natürlich auch die Verteilung verändert werden, beispielsweise durch entsprechende Einstellung des Phasenelements Instead of a pure power scaling can of course also the distribution to be changed, for example, by setting the phase element 39 39 . ,
  • [0105] [0105]
    Die Fluoreszenzcharakteristik der Probe The fluorescence characteristics of the sample 24 24 , beispielsweise die Fluoreszenzcharakteristik eines Farbstoffs, kann durch Untersuchung an einem Testpräparat oder einer Referenzstelle der Probe bereits unter späteren Bildgewinnungsbedingungen ermittelt werden. Such as the fluorescence characteristic of a dye can be determined by examination of a test product or a reference point of the sample already under subsequent image acquisition conditions. Dazu wird die Leistung der detektierten Fluoreszenzstrahlung F als Funktion der Leistung der Anregungsstrahlung A an einen Punkt oder einem Gebiet der Probe ermittelt. For this purpose, the power of the detected fluorescence radiation F is determined as a function of the power of the excitation radiation A to a point or an area of the sample. Für eine besonders gute Einstellung ist es günstig, wenn die Fluoreszenzcharakteristik, dh die Kennlinie For a particularly good setting, it is advantageous if the fluorescence characteristic, ie the graph 17 17 nicht von der Konzentration des fluoreszierenden Materials, beispielsweise des Farbstoffs abhängt (im Gegensatz zur emittierten Leistung der Fluoreszenzstrahlung F). does not depend on the concentration of the fluorescent material, for example, of the dye (in contrast to the performance of the emitted fluorescence radiation F). Das Steuergerät The control unit 35 35 des Scanningmikroskops the scanning microscope 20 20 kann dazu aus der ermittelten Kurve may to from the determined curve 17 17 oder einer zugeführten bzw. in einem Speicher abgelegten Kurve or a supplied or stored in a memory curve 17 17 automatisch die optimale Leistung ermitteln und entsprechend einstellen. automatically determine the optimum performance and adjust accordingly.
  • [0106] [0106]
    Die iterative Bestimmung ist immer dann vorteilhaft, wenn die Fluoreszenzeigenschaften stark probenabhängig sind und eine Referenzstelle an der Probe für die Ermittlung der Fluoreszenzcharakteristik vorhanden ist oder nicht gefunden werden kann. The iterative determination is always advantageous if the fluorescence properties are strongly depending on the sample and a reference point on the sample for the determination of the fluorescence characteristic is present or can not be found. In diesem Fall kann man entweder an einem begrenzten Gebiet innerhalb oder außerhalb des interessierenden Probenfeldes oder anhand einer Bildgebung im gesamten abzubildenden Probenfeld eine Leistungsoptimierung vornehmen bzw. durch das Steuergerät In this case one can either on a limited area within or outside the field or sample of interest with reference to a sample to be imaged in the entire imaging field to make a performance optimization or by the controller 35 35 ausführen lassen. execute it. Anhand eines Gütekriteriums der Auflösung (z. B. der Kontrast in einer ausgewählten Stelle oder die Ausdehnung des im Bild übertragenen Frequenzbereichs im Fourierraum) wird die Anregungsleistung optimiert. On the basis of a quality criterion of resolution (z. B. the contrast in a selected location or the extent of the transmitted image in the frequency range in Fourier space) the excitation power is optimized. Dabei ist es im allgemeinen ausreichend, die Leistung im Minimum der Anregungsverteilung bzw. eine räumlich breit verteilte Untergrundleistung anzupassen. It is generally sufficient to adapt the power in the minimum of the excitation distribution or a broad spatially distributed subsurface performance.
  • [0107] [0107]
    Die Anregungsstrahlung A und die Rücksetzungsstrahlung R können aus einer einzigen Strahlungsquelle erzeugt werden. The excitation radiation A and the reset radiation R can be generated from a single radiation source. Die Strahlungsquelle kann entweder direkt umschaltbar oder mit einer nachgeordneten Selektionsanordnung versehen sein. The radiation source may be provided either directly or reversible with a subsequent selection device.
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