DE102004008241A1

DE102004008241A1 - Enzyme-based nanolithography

Info

Publication number: DE102004008241A1
Application number: DE102004008241A
Authority: DE
Inventors: Manfred Radmacher; Leif Riemenschneider
Original assignee: Universitaet Bremen
Current assignee: Universitaet Bremen
Priority date: 2004-02-19
Filing date: 2004-02-19
Publication date: 2005-11-24
Anticipated expiration: 2024-02-20
Also published as: WO2005080255A1; DE102004008241B4

Abstract

Bereitgestellt wird ein enzymgestützes Verfahren zur Nanolithografie und Vorrichtungen zur Durchführung solcher Verfahren. Ferner werden Träger mit Oberflächen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich sind, beschrieben sowie Vorrichtungen, die solche Träger enthalten, beispielsweise Chips, Microarrays und Biosensoren. Des Weiteren werden Verfahren zur gezielten Beschichtung einer Sonde mit Enzym oder Effektormolekülen bereitgestellt, die insbesondere zur Verwendung in der Rastersondenmikroskopie dienen können. Die beschriebenen Verfahren, Oberflächen, Träger, Vorrichtungen, Sonden und Rastersondenmikroskope können zur Speicherung und/oder Analyse von Daten, in der Zellbiologie oder zur Durchführung von Mess- und Untersuchungsverfahren wie beispielsweise in der Forensik, der Umwelt- oder chemischen Analytik, der Molekularbiologie oder der pharmazeutischen Diagnostik verwendet werden.Provided is an enzyme-supported method for nanolithography and devices for carrying out such methods. Furthermore, carriers with surfaces which can be obtained by the method according to the invention are described, as well as devices which contain such carriers, for example chips, microarrays and biosensors. Furthermore, methods are provided for the targeted coating of a probe with enzyme or effector molecules, which in particular can be used for scanning probe microscopy. The described methods, surfaces, supports, devices, probes and scanning probe microscopes can be used for the storage and / or analysis of data, in cell biology or for performing measurement and investigation methods such as in forensics, environmental or chemical analysis, molecular biology or used in pharmaceutical diagnostics.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ganz allgemein ein enzymgestütztes Verfahren zur Nanolithografie und Vorrichtungen zur Durchführung solcher Verfahren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein lithografisches Verfahren zur Strukturierung einer Oberfläche eines Trägers, wobei durch eine lokal begrenzte enzymatische Aktivität in unmittelbarer Nähe der Oberfläche diese chemisch oder physikalisch modifiziert wird, vorzugsweise durch Positionierung eines an einer Sonde immobilisierten Enzyms oder Effektormoleküls in die unmittelbare Nähe der Oberfläche. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Träger mit Oberflächen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich sind sowie Vorrichtungen, die solche Träger enthalten, wie Chips, Microarrays und Biosensoren, insbesondere DNA- und Protein-Chips. Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur gezielten Beschichtung einer Sonde mit Enzym oder Effektormolekülen, so dass die Sonde Enzyme bzw. Effektormoleküle vorzugsweise in einem Bereich von weniger als 100 nm, vorzugsweise weniger als 50 nm und besonders bevorzugt in einem Bereich von 10 nm oder weniger aufweist. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Sonden, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind, sowie insbesondere Rastersondenmikroskope, die erfindungsgemäße Sonden enthalten. Die erfindungsgemäßen Verfahren, Oberflächen, Träger, Vorrichtungen, Sonden und Rastersondenmikroskope können zur Herstellung von beispielsweise Nanochips und Microarrays sowie zur Speicherung und/oder Analyse von Daten, zum Einsatz in der Zellbiologie oder zur Durchführung von Mess- und Untersuchungsverfahren wie beispielsweise in der Forensik sowie der chemischen oder biologischen Analytik verwendet werden.The The present invention relates generally to an enzyme-assisted method for nanolithography and apparatus for carrying out such methods. Especially The present invention relates to a lithographic process for structuring a surface a carrier, being characterized by a localized enzymatic activity in the immediate Near the surface this is chemically or physically modified, preferably by positioning an enzyme immobilized on a probe or effector molecule in the immediate vicinity of Surface. Furthermore, the present invention relates to carriers with surfaces, the by the method according to the invention available and devices containing such carriers, such as chips, microarrays and biosensors, especially DNA and protein chips. Furthermore, the present invention relates Invention Process for the targeted coating of a probe with enzyme or effector molecules, so that the probe preferably enzymes or effector molecules in a range less than 100 nm, preferably less than 50 nm, and more preferably in a range of 10 nm or less. The present The invention further relates to probes which are obtained by the method according to the invention available are, and in particular scanning probe microscopes, the probes according to the invention contain. The methods according to the invention, Surfaces, Carrier, Devices, probes and scanning probe microscopes can be used for Production of, for example, nanochips and microarrays and for storage and / or analysis of data for use in cell biology or to carry out of measurement and investigation methods such as in forensics and chemical or biological analysis.

In der vorliegenden Anmeldung wird innerhalb des Textes auf verschiedene Publikationen unter Angabe von Autor und Datum Bezug genommen. Vollständige Literaturangaben zu diesen Publikationen können auch am Ende der Beschreibung unmittelbar vor den Ansprüchen gefunden werden. Die Offenbarungen dieser Publikationen werden hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit in diese Anmeldung einbezogen, um vollständiger den Stand der Technik zu beschreiben, der den Fachleuten zum Zeitpunkt der hier beschriebenen und beanspruchten Erfindung bekannt war.In The present application is within the text to various Publications with indication of author and date reference. Complete references to these publications also found at the end of the description immediately before the claims become. The disclosures of these publications are hereby incorporated by Reference in its entirety to this application complete to describe the state of the art to the professionals at the time the invention described and claimed herein was known.

Hintergrund der ErfindungBackground of the invention

Herkömmliche Lithografieverfahren, so wie die Fotolithografie, werden verwendet, um Strukturen von einer Größe von einigen hundert Nanometern herzustellen, sogar unter solchen Bedingungen, wie sie in den Fertigungsstrassen der Halbleiterindustrie vorherrschen. Es gibt einen konstanten Bedarf für eine Erhöhung der Auflösung bei solchen Verfahren. Mögliche Lösungswege sind die Verwendung von kürzeren Wellenlängen (UV-Licht) oder anderen Medien, wie in der Elektronenlithografie; siehe auch die Karte für Internationale Halbleitertechnologie auf http://public.itrs.net/. Es ist jedoch nicht klar, wie Strukturgrößen von mehreren zehn Nanometern oder auch nur von einigen Nanometern durch eine bloße Verbesserung der gegenwärtig gebräuchlichen Technologien routinemäßig hergestellt werden können. Eine mögliche alternative Technik, die sich unter Laborbedingungen als erfolgreich erwiesen hat, ist die Oberflächenmodifikation durch Rastersondentechniken. Beispielsweise können weiche Polymerfilme durch mechanische Interaktion einer Rasterkraftmikroskopspitze modifiziert werden (Wendel, Lorenz et al. 1995). Auch die Dip-Pen-Technologie (Piner, Zhu et al. 1999), bei der eine geeignete Tinte auf einer AFM-Spitze adsorbiert und dann lokal auf eine Probe aufgebracht wird, hat großes Interesse auf sich gezogen.conventional Lithography techniques, such as photolithography, are used around structures of a size of a few hundred nanometers, even under such conditions, as they prevail in the production lines of the semiconductor industry. There is a constant need for increasing the resolution at such procedures. Possible solutions are the use of shorter ones wavelength (UV light) or other media, such as in electron lithography; see also the map for International Semiconductor Technology at http://public.itrs.net/. However, it is not clear how feature sizes of tens of nanometers or more even by a few nanometers, by merely improving the technologies currently in use routinely made can be. A possible alternative technique that is successful under laboratory conditions has proved, is the surface modification through grid-end techniques. For example, soft polymer films may pass through modified mechanical interaction of an atomic force microscope tip (Wendel, Lorenz et al., 1995). Also the dip pen technology (Piner, Zhu et al., 1999) using a suitable ink on a AFM tip adsorbed and then applied locally to a sample will have great Interest attracted.

In Zukunft wird nicht nur ein Bedarf für die Oberflächenstrukturierung in sehr kleinem (Nanometer-) Maßstab, wie von der Halbleiterindustrie vorgebracht, bestehen, sondern auch für die chemische Oberflächenmodifikation z.B. in biotechnologischen Anwendungen. Die Miniaturisierung von Assays wie DNA-Chips oder Protein-Chips wird kleinere, chemisch exakt definierte Strukturen erfordern. Eine Übersicht über die bekanntesten Biochip-Systeme wird von Bowtell in Nature Genetics Supplement 21 (1999), 25-32, gegeben.In The future will not only be a need for surface structuring in very small (nanometer) scale, as put forward by the semiconductor industry, but also for the chemical surface modification e.g. in biotechnological applications. The miniaturization of Assays such as DNA chips or protein chips become smaller, chemical require exactly defined structures. An overview of the most popular biochip systems will be available by Bowtell in Nature Genetics Supplement 21 (1999), 25-32.

Es gibt auch einen starken Bedarf nach der Miniaturisierung von diagnostischen Geräten, von Biosensoren oder der Herstellung von chemischen „Nanoreaktoren" (lokale Bereiche, die gewisse chemische Aufgaben erfüllen können). Wenn es auch vorstellbar ist, dass konventionelle Techniken wie die UV-Lithografie Auflösungen im Zehner-Nanometerbereich erreichen wird, so ist doch nicht klar, wie der Bedarf nach chemischen Modifikationen gedeckt werden soll.It There is also a strong need for miniaturization of diagnostic Devices, of biosensors or the production of chemical "nanoreactors" (local areas, that can perform certain chemical tasks). If so, too is that conventional techniques such as UV lithography resolutions in the Tens of nanometers, it is not clear how to meet the need for chemical modifications.

Enzyme wurden ebenfalls zur chemischen Oberflächenmodifikation beschrieben, z.B. durch Aufgingen mit einem Nanofountain Pen auf eine geeignete Oberfläche, wo ein Substrat, das von dem Enzym verdaut werden kann, fixiert wurde (Ionescu, Marks et al., 2003). Hier wurden allerdings bereits durch die Verfahrensbedingungen Oberflächenveränderungen durch selbstständige Veränderung des Substrats beobachtet. Ferner wurde das Enzym eher im Sinne eines „Etching" verwendet, d.h. des klassischen Ätzens der Oberfläche, während die enzymatische Aktivität eine untergeordnete Rolle spielte. In einer anderen Anwendung wurde im Medium präsente Phospholipase verwendet, um einen Lipidfilm zu modifizieren. Hier wurden lokale Störungen in der Ordnung des Lipidfilms, die von der mechanischen Interaktion einer Rastersondemikroskopspitze verursacht wurden, dazu verwendet, die Probe lokal zu verändern (Grandbois, Clausen-Schaumann et al. 1998). Verfahren zur gezielten enzymgestützten Strukturierung einer Oberfläche, die den Ansprüchen beispielsweise der Chip-Industrie und Nanobiotechnologie genügen, stehen bisher allerdings nicht zur Verfügung.Enzymes have also been described for chemical surface modification, for example, by contacting with a nanofountain pen on a suitable surface where a substrate which can be digested by the enzyme has been fixed (Ionescu, Marks et al., 2003). Here, however, already by the process conditions surface changes were observed by independent change of the substrate. Furthermore, the enzyme was used rather in the sense of an "etching", ie the classical etching of the surface, while the enzymatic activity played a minor role, in another application it was present in the medium used phospholipase to modify a lipid film. Here, local disturbances in the order of the lipid film caused by the mechanical interaction of a scanning probe microscope tip were used to locally alter the sample (Grandbois, Clausen-Schaumann et al., 1998). However, methods for the targeted enzyme-based structuring of a surface, which satisfy the requirements of, for example, the chip industry and nanobiotechnology, are not yet available.

Der vorliegenden Erfindung liegt das technische Problem zugrunde Oberflächen und Verfahren zu deren Herstellung bereitzustellen, die den vorgenannten Anforderungen gerecht werden.Of the The present invention is based on the technical problem of surfaces and To provide processes for their preparation, which are the aforementioned To fit in requirements.

Dieses technische Problem wird mit den in den Ansprüchen gekennzeichneten sowie in der nachfolgenden Beschreibung erläuterten erfindungsgemäßen Ausführungsformen gelöst.This technical problem is marked with those in the claims as well in the following description explained embodiments of the invention solved.

Die vorliegende ErfindungThe present invention

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Strukturierung einer Oberfläche eines Trägers, wobei durch eine lokal begrenzte enzymatische Aktivität in unmittelbarer Nähe der Oberfläche, diese chemisch oder physikalisch modifiziert wird. Erfindungsgemäß kann das wesentliche Merkmal der lokalen enzymatischen Aktivität an der zu strukturierenden Oberfläche durch das gezielte An- und Abschalten der Enzymaktivität in unmittelbarer Nähe der Oberfläche und/oder durch die kontrollierte Beschichtung einer Sonde mit wenigen oder gar nur einem Enzym oder Effektormolekül erreicht werden.The The present invention relates to a method of structuring a surface a carrier, being characterized by a localized enzymatic activity in the immediate Near the Surface, this is chemically or physically modified. According to the invention that essential feature of local enzymatic activity at the surface to be structured by the targeted switching on and off of the enzyme activity in the immediate Near the surface and / or by the controlled coating of a probe with few or even just an enzyme or effector molecule can be achieved.

Die Erfindung basiert auf den überraschenden Befund, dass sich unter Zuhilfenahme biologischer oder biologisch abgeleiteter Enzyme ein Verfahren zur gezielten lokalen, chemischen oder physikalischen Modifikation einer geeigneten Oberfläche erhalten lässt. Das Enzym kann vorzugsweise auf der Spitze eines Rastersondenmikroskops fixiert werden, wodurch die chemische oder physikalische Modifikation mit sehr hoher Auflösung durchgeführt werden kann, letztendlich auf der Basis einzelner Moleküle.The Invention is based on the surprising Findings that, with the help of biological or biological derived enzymes a method of targeted local, chemical or physical modification of a suitable surface leaves. The enzyme may preferably be on the tip of a scanning probe microscope be fixed, causing the chemical or physical modification with very high resolution be performed can, ultimately based on individual molecules.

Das hierin beschriebene Verfahren kann auf ein breites Spektrum von Enzymmolekülen angewendet werden und ermöglicht daher eine Technologieplattform, die für verschiedene Anwendungen genutzt werden kann. Enzyme sind gebräuchliche Hilfsmittel in der Diagnostik und der Biotechnologie. Die wohl bekanntesten Anwendungen sind PCRs (Polymerase-Kettenreaktionen) oder ELISAs (enzyme linked immunosorbent assays). Sie haben sogar in Produkten des täglichen Hausgebrauchs Verwendung gefunden, z.B. als Waschmittelzusätze. Erfindungsgemäß kann in zukünftigen Anwendungen das riesige Wissen über Enzyme aus diesen Gebieten genutzt und auf verfügbare Enzyme und geeignete Substrate zurückgegriffen werden.The The method described herein can be applied to a wide range of enzyme molecules be applied and enabled therefore a technology platform suitable for various applications can be used. Enzymes are common tools in the Diagnostics and biotechnology. The most famous applications are PCRs (polymerase chain reactions) or ELISAs (enzyme linked immunosorbent assays). They even have in everyday products Home use, e.g. as detergent additives. According to the invention, in future Applications the huge knowledge about Used enzymes from these areas and available enzymes and appropriate Substrate used become.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Träger mit Oberflächen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich sind sowie Vorrichtungen, die solche Träger enthalten, wie Chips, Microarrays und Biosensoren, insbesondere DNA- und Protein-Chips.Further The present invention relates to supports having surfaces which by the method according to the invention available and devices containing such carriers, such as chips, microarrays and biosensors, especially DNA and protein chips.

Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur gezielten Beschichtung einer Sonde mit Enzym oder Effektormolekülen, umfassend das Inkontaktbringen der Sonde mit einem flachen Träger, auf dem Enzyme oder Effektormoleküle mittels eines polyvalenten Bindungspartners A wie Streptavidin an einen Bindungspartner B wie Biotin, der auf dem Träger gebunden ist, und zumindest ein Teil der Sonde im Wesentlichen die gleichen Bindungspartner B, in diesem Falle Biotin, aufweist.Of Furthermore, the present invention relates to methods for targeted Coating a probe with enzyme or effector molecules comprising contacting the probe with a flat support the enzymes or effector molecules by means of a polyvalent binding partner A such as streptavidin to a Binding partner B such as biotin, which is bound to the carrier, and at least a part of the probe is essentially the same binding partner B, in this case biotin.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Sonden, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind, sowie insbesondere Rastersondenmikroskope, die erfindungsgemäße Sonden enthalten.The The present invention further relates to probes which are obtained by the method according to the invention available are, and in particular scanning probe microscopes, the probes according to the invention contain.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung Verwendungen der hier beschriebenen Verfahren, Oberflächen, Träger, Vorrichtungen, Sonden und Rastersondenmikroskope zur Herstellung von beispielsweise Nanochips und Microarrays sowie zur Speicherung und/oder Analyse von Daten, zum Einsatz in der Zellbiologie oder zur Durchführung von Mess- und Untersuchungsverfahren wie beispielsweise in der Forensik sowie in der chemischen oder biologischen Analytik.Finally, concerns the present invention uses the methods, surfaces, supports, devices described herein, Probes and scanning probe microscopes for the production of, for example Nanochips and microarrays as well as for storage and / or analysis data, for use in cell biology or for performing measurement and investigation procedures such as in forensics as well in chemical or biological analysis.

Die Abbildungen zeigen:The Pictures show:

1:

A. Eine Rasterkraftmikroskopspitze (Rasterelektronenmikrograph, Breite der pyramidenförmigen Spitze etwa 4 μm) wird an ihrem vordersten Ende mit einem Enzymmolekül (gelb bzw. hellgrau) beschichtet durch Interaktion der am Enzym gebundenen Gruppen (grün bzw. mittelhellgrau, in diesem Fall Streptavidin, als Steckknopf dargestellt) mit den an der Spitzenoberfläche gebundenen Gruppen (rot bzw. dunkelgrau, in diesem Fall Biotin, doppelt konkav dargestellt).
B. Das Protein, d.h. Enzym ist mit einem Streptavidinmolekül verbunden (doppelt konkav dargestellter Komplex), der vier Bindungsstellen (grün bzw. Kanten) für den Liganden Biotin (als Steckknopf dargestellt) aufweist. Die Enzyme werden auf einem biotinilierten Träger fixiert. Die ebenfalls biotinilierte Rasterkraftmikroskopspitze wird mit der enzymbeschichteten Probe in Kontakt gebracht. Enzymmoleküle werden dann an die Spitze und an den Träger gebunden. Nach der Trennung der Spitze vom Träger werden etwa 50% der doppelt gebundenen Enzym-Moleküle an der Spitze verbleiben. Diese Vorgehensweise ermöglicht es, dass nur das vorderste Ende der Rasterkraftmikroskopspitze beschichtet wird.

1 :

A. An atomic force microscope tip (scanning electron micrograph, width of the pyramidal tip about 4 microns) is coated at its foremost end with an enzyme molecule (yellow or light gray) by interaction of the enzyme-bound groups (green or medium light gray, in this case streptavidin, as a plug shown) with the groups bound to the tip surface (red or dark gray, in this case biotin, shown as double concave).
B. The protein, ie enzyme is connected to a streptavidin molecule (double concave complex), the four binding sites (green and edges) for the ligand biotin (shown as a button). The enzymes will be fixed on a biotinylated carrier. The biotinylated atomic force microscope tip is also brought into contact with the enzyme-coated sample. Enzyme molecules are then bound to the tip and to the carrier. After separation of the tip from the support, approximately 50% of the double-bound enzyme molecules will remain at the tip. This approach allows only the foremost end of the atomic force microscope tip to be coated.

2: Mögliche Reaktionsschemata. Die Abbildungen geben beispielhaft einige Reaktionsschemata wieder. Durch Einschalten zusätzlicher Effektormoleküle wie Co-Enzyme oder anderer Moleküle können natürlich beliebig komplizierte Reaktionsschemata erhalten werden.

A. Das Substrat (S) wird auf der Oberfläche fixiert und wird durch die enzymatische Aktivität löslich. S wird auf der Probe fixiert und das Enzym spaltet S, so dass Produkt P löslich wird und die Reste von S, die immer noch auf der Probenoberfläche sind, andere (chemische oder physikalische) Eigenschaften aufweisen als S.
B. Das Substrat (S) ist im Medium präsent und wird durch die Aktivität des Enzyms unlöslich. S wird im Medium aufgelöst und das Produkt P immobilisiert auf der Oberfläche durch chemische oder physikalische Interaktion.
C. Das Substrat ist im Medium präsent. Das lösliche Produkt P modifziert dann chemisch die auf der Oberfläche vorhandenen Moleküle
D. Das Substrat ist im Medium präsent. Das lösliche Produkt P reagiert mit einem Cofaktor B, so dass ein Komplex PB entsteht. Der Komplex PB kann nun die Oberfläche physikalisch modifizieren, etwa indem er sich auf der Oberfläche anlagert (analog Schema A).
E. Das Substrat ist im Medium präsent. Das lösliche Produkt P reagiert mit einem Cofaktor B, so dass ein Komplex PB entsteht. Der Komplex PB kann nun die Oberfläche chemisch (analog Schema A) modifizieren.
F. Das Substrat ist im Medium präsent. Das lösliche Produkt P reagiert mit einem Cofaktor B, so dass eine Modifikation des Cofaktors zu B* erfolgt. Der modifizierte Kofaktor B* kann nun chemisch oder physikalisch die Oberfläche modifizieren.

2 : Possible reaction schemes. The figures exemplify some reaction schemes. By switching on additional effector molecules, such as coenzymes or other molecules, it is, of course, possible to obtain arbitrarily complicated reaction schemes.

A. The substrate (S) is fixed on the surface and becomes soluble by the enzymatic activity. S is fixed on the sample and the enzyme cleaves S, so that product P becomes soluble and the residues of S that are still on the sample surface have different (chemical or physical) properties than S.
B. The substrate (S) is present in the medium and becomes insoluble by the activity of the enzyme. S is dissolved in the medium and the product P immobilized on the surface by chemical or physical interaction.
C. The substrate is present in the medium. The soluble product P then chemically modifies the molecules present on the surface
D. The substrate is present in the medium. The soluble product P reacts with a cofactor B to form a complex PB. The complex PB can now physically modify the surface, for example by attaching itself to the surface (analogous to Scheme A).
E. The substrate is present in the medium. The soluble product P reacts with a cofactor B to form a complex PB. The complex PB can now modify the surface chemically (analogous to Scheme A).
F. The substrate is present in the medium. The soluble product P reacts with a cofactor B, so that a modification of the cofactor to B * occurs. The modified cofactor B * can now chemically or physically modify the surface.

3: Das Enzym alkalische Phosphatase wurde an einer Rasterkraftmikroskopspitze fixiert. Das Substrat BCIP war präsent im umgebenden Medium.

A. Das Produkt der enzymatischen Reaktion bildet zusammen mit NBT einen nichtwasserlöslichen Komplex, der auf der Oberfläche ausfällt.
B. Durch langsames Annähern der Rasterkraftmikroskopspitze bis zum direkten Kontakt mit der Oberflächen können beliebige Merkmale auf der Oberfläche erzeugt werden.

3 : The enzyme alkaline phosphatase was fixed to an atomic force microscope tip. The substrate BCIP was present in the surrounding medium.

A. The product of the enzymatic reaction together with NBT forms a non-water-soluble complex which precipitates on the surface.
B. By slowly approaching the atomic force microscope tip to direct contact with the surface, any features can be created on the surface.

Detaillierte Beschreibung der ErfindungDetailed description the invention

Die vorliegende Erfindung betrifft ein lithografisches Verfahren zur Strukturierung einer Oberfläche eines Trägers, wobei durch eine lokal begrenzte enzymatische Aktivität in unmittelbarer Nähe der Oberfläche, diese chemisch oder physikalisch modifiziert wird.The The present invention relates to a lithographic process for Structuring a surface a carrier, being characterized by a localized enzymatic activity in the immediate Near the surface, this is chemically or physically modified.

Wie vorstehend erwähnt und in den Beispielen erläutert, wird ein Verfahren zur Modifikation einer geeigneten Oberfläche mit Hilfe von biologischen oder biologisch abgeleiteten Enzymmolekülen bereitgestellt. Die Enzymmoleküle werden in die unmittelbare Nähe der Probe gebracht und modifizieren diese durch Materialablagerung, Materialentfernung oder Modifikation von Probenmolekülen. Die wesentlichen Merkmale der Erfindung bestehen darin, dass

– eine geeignete Oberfläche direkt oder indirekt durch die chemische Aktivität eines Enzyms modifiziert wird; und
– das Enzym relativ zur Probe so positioniert wird, dass die Modifikation nur lokal stattfindet; siehe beispielsweise 3.

As mentioned above and illustrated in the examples, a method of modifying a suitable surface by means of biological or biologically derived enzyme molecules is provided. The enzyme molecules are brought into close proximity to the sample and modify it by material deposition, material removal or modification of sample molecules. The essential features of the invention are that

A suitable surface is modified directly or indirectly by the chemical activity of an enzyme; and
- The enzyme is positioned relative to the sample so that the modification takes place only locally; see for example 3 ,

Der hauptsächliche Vorteil dieser Idee liegt in der Nutzung der chemischen Aktivität eines Enzyms aus der Vielzahl verfügbarer Enzyme, deren Eigenschaften sich das erfindungsgemäße Verfahren zunutze macht. Dies erlaubt die Schaffung einer Technologieplattform für viele verschiedene Anwendungen.Of the primary Advantage of this idea lies in the use of the chemical activity of a Enzyme of the variety available Enzymes whose properties are the inventive method makes use of. This allows the creation of a technology platform for many different applications.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich vorzugsweise dadurch aus, dass eine Auflösung von kleiner etwa 200 nm, vorzugsweise kleiner 100 nm, mehr noch bevorzugt kleiner 50 nm und insbesondere bevorzugt kleiner etwa 10 nm erhalten lassen.The inventive method is preferably characterized in that a resolution of less than about 200 nm, preferably less than 100 nm, more preferably less than 50 nm, and more preferably less than about 10 nm to let.

Als Träger und Oberflächen kommen die in der Array- und Chip-Technologie üblichen Materialien in Betracht wie Glas, Gold sowie Kunststoffmembranen, die auch die Oberfläche selbst darstellen können. Geeignet sind insbesondere Metalle, z. B. Kupfer, Titan, Chrom, Gold und vor allem Platin. Üblicherweise ist die Trägeroberfläche derivatisiert. Glasoberflächen beispielsweise können mit Silanreagenzien behandelt werden wie Aminopropyltriethoxysilan (APTES), 3-Mercaptopropyltrimethoxysilan (MPTS), Glycidoxypropyltrimethoxysilan (GPTS), Bis(hydroxyethyl)aminopropyltriethoxysilan (HE-APTS), Hydroxybutyramid-propyltriethoxysilan (HBPTES) und (Perfluorooctyloxy)propyltriethoxysilan (POPTS). Vorzugweise werden Gold, Ni-NTA, Avidin oder Biotin-beschichtete Träger aus Glas, Silizium, Siliziumoxid oder Siliziumnitrid verwendet.When carrier and surfaces come into consideration the materials commonly used in array and chip technology like glass, gold as well as plastic membranes, which are also the surface itself can represent. Particularly suitable metals, for. As copper, titanium, chromium, Gold and especially platinum. Usually the support surface is derivatized. glass surfaces for example be treated with silane reagents such as aminopropyltriethoxysilane (APTES), 3-mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTS), glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTS), bis (hydroxyethyl) aminopropyltriethoxysilane (HE-APTS), hydroxybutyramide-propyltriethoxysilane (HBPTES) and (perfluorooctyloxy) propyltriethoxysilane (POPTS). preferably, are gold, Ni-NTA, avidin or biotin-coated carrier Glass, silicon, silicon oxide or silicon nitride used.

Besonders bevorzugt sind mit Gold beschichtete Glasträger. Die Goldoberfläche kann beispielsweise durch verschieden funktionalisierte Alkanthiol-Monoschichten (SAMs = self assembled monolayers) wie Biotin, N-oxysuccinimidester, Epoxygruppen, Maleimidgruppen, Aminogruppen, und Oligo(ethylenglycol) beschichtet werden.Especially preferred are gold coated glass slides. The gold surface can for example, by differently functionalized alkanethiol monolayers (SAMs = self assembled monolayers) such as biotin, N-oxysuccinimide ester, Epoxy groups, maleimide groups, amino groups, and oligo (ethylene glycol) be coated.

Für die Herstellung bzw. Modifizierung von Proteinchips können insbesondere weiche Träger wie PVDF, Nitrocellulose und Polystyrol verwendet werden.For the production or modification of protein chips, in particular soft carriers such as PVDF, nitrocellulose and polystyrene are used.

Da auf Glasoberflächen eine Vielfalt von verschiedenen Molekültypen fixiert werden können, wird Glas in den erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt verwendet.There on glass surfaces A variety of different types of molecules can be fixed, glass becomes in the inventive method preferably used.

Als Oberflächen kommen insbesondere auch bereits mit Biomolekülen beladene Oberflächen in Betracht wie DNA-Chip-Formate, die auch kommerziell erhältlich sind, beispielsweise von der von Firma Affymetrix, die DNA-Mikroarrays anbietet. Die Herstellung von Arrays immobilisierter Biomoleküle, die ebenfalls im Sinne der vorliegenden Erfindung modifiziert werden können, sind beispieleweise in der deutschen Patentanmeldung DE 100 41 809 A1 beschrieben.Suitable surfaces are, in particular, also surfaces already loaded with biomolecules, such as DNA chip formats, which are also commercially available, for example from the company Affymetrix, which offers DNA microarrays. The production of arrays of immobilized biomolecules, which can also be modified in the sense of the present invention, are for example in the German patent application DE 100 41 809 A1 described.

Aus der vorstehenden Erläuterung ergibt sich, dass ein Träger gleichzeitig auch die Oberfläche darstellen kann. Dementsprechend werden die Begriffe Träger und Oberfläche ggf. synonym verwendet.Out the above explanation it turns out that a carrier at the same time also represent the surface can. Accordingly, the terms carrier and surface possibly used synonymously.

Träger im erfindungsgemäßen Sinn sind in der Regel Materialien mit starrer oder halbstarrer Oberfläche und in diesem Sinne als fest zu bezeichnen. Üblich sind planare Oberflächen. Die Form eines Trägers kann mannigfaltig sein und kann sich nach der Art der Verwendung richten. Es kann sich beispielsweise um Objektträger, Chips, Dipsticks, Stempel, Caps, Partikel, sphärische Körper, wie Kugeln oder Kügelchen, Membranen, Blätter, Scheiben, Folien oder Platten handeln. Auch Wafer-Formate können als Träger dienen, die gewünschtenfalls vereinzelbar sind. Die Träger können ferner mit weiteren zweckmässigen Bauteilen versehen sein, beispielsweise kann man Chips einkapseln.Carrier in the sense of the invention are usually materials with a rigid or semi-rigid surface and in this sense as firm to call. Common are planar surfaces. The Shape of a carrier can be varied and may vary according to the type of use judge. These may be, for example, slides, chips, dipsticks, stamps, Caps, particles, spherical Body, like spheres or globules, Membranes, leaves, Disc, foil or plate act. Even wafer formats can as carrier serve, if desired are singular. The carriers can further with further expedient Be provided components, for example, you can encapsulate chips.

Erfindungsgemäß beinhaltet der Begriff „Modifikation" insbesondere die hier beschriebenen Ausführungsformen wie Ablagerung, Entfernung oder tatsächliche Modifikation des Substrats. Die Modifikation der Oberfläche kann mit sehr hoher Auflösung durchgeführt werden, wobei letztendlich ein Enzymmolekül immer nur eine molekulare Modifikation an einer einzelnen Stelle durchführt. Die Modifikation der Oberfläche kann direkt durch die Aktivität des Enzyms erfolgen oder indirekt, so dass die enzymatischen Produkte selbst die Oberfläche modifizieren.Included in the invention the term "modification" in particular the Embodiments described herein such as deposition, removal or actual modification of the substrate. The modification of the surface can be done with very high resolution, where ultimately an enzyme molecule is always only one molecular Carrying out modification at a single point. The modification of the surface can directly through the activity of the enzyme, or indirectly, so that the enzymatic products even the surface modify.

Wenn nicht anders angegeben, wird der Begriff Enzym im herkömmliche Sinne verwendet. Unter einem Enzym wird u.a. ein chemisch aktives Molekül verstanden, das ein Substratmolekül modifiziert und dabei eines oder mehrere Produktmoleküle produziert. Ein Enzym kann das Substratmolekül chemisch modifizieren, kann es in mehrere Untermoleküle aufspalten oder eine Kombination aus beidem ausführen. Die chemische Modifikation des Substratmoleküls wird direkt oder indirekt zu einer chemischen oder physikalischen Modifikation der Probe führen. Da diese Modifikation nur lokal stattfindet, wird dieser Vorgang erfindungsgemäß enzymgestützte Nanolithografie genannt.If Unless otherwise stated, the term enzyme is used in the conventional Senses used. Under an enzyme, i.a. a chemically active Molecule understood, that is a substrate molecule modified and thereby produces one or more product molecules. An enzyme can be the substrate molecule can chemically modify it into several sub-molecules or a combination of both. The chemical modification of the substrate molecule becomes directly or indirectly a chemical or physical Modification of the sample lead. There this modification takes place only locally, this process according to the invention is enzyme-based nanolithography called.

Unter Effektormolekülen werden üblicherweise Stoffe verstanden, die sowohl die Enzymreaktion anregen oder hemmen können. Effektoren sind normalerweise nicht an der Reaktion selbst beteiligt, können diese nach dem Verständnis für die vorliegende Erfindung aber auslösen. Sie können je nach ihrer Wirkung auch als Aktivator oder Inhibitor bezeichnet werden. Erfindungsgemäß werden unter dem Begriff „Effektormolekül" auch Cofaktoren wie NADPH verstanden, sowie allgemein Moleküle, die eine enzymatische Reaktion auslösen können, beispielsweise durch Bindung an das Enzym, wodurch dieses eine Aktivierung erfährt, d.h. enzymatisch aktiv wird. Dementsprechend kann das Effektormolekül ein Cofaktor, ein Sub strat, ein Katalysator oder ebenfalls ein Enzym sein. Cofaktoren werden auch als Coenzyme bezeichnet.Under effector become common Understood substances that stimulate or inhibit both the enzyme reaction can. Effectors are usually not involved in the reaction itself, they can after understanding for the but trigger the present invention. You can also referred to as activator or inhibitor depending on their effect become. According to the invention under the term "effector molecule" also cofactors like NADPH, as well as in general molecules that have an enzymatic reaction trigger can, for example, by binding to the enzyme, whereby this activation learns i.e. becomes enzymatically active. Accordingly, the effector molecule can be a cofactor, a sub strate, a catalyst or also an enzyme. cofactors are also called coenzymes.

In diesem Zusammenhang kommen als Effektormoleküle auch Vitamine als Bestandteile von Coenzymen in Betracht, beispielsweise Thiamin (Vitamin B1) bzw. Thiamindiphosphat als Coenzym der oxidativen Decarboxylierung, Riboflavin (Vitamin B2), das mit Nicotinsäure, Nicotinamid, Folsäure und Pantothensäure den B2-Komplex bildet, Pyridoxin (Vitamin B6), das bei Transaminierungen und Decarboxylierungen benötigt wird, Cobalamin (Vitamin B12), das bei Isomerasen eine Rolle spielt, Ascorbinsäure (Vitamin C) als H-Donor bei Oxidoreduktasen, und Biotin (Vitamin H) als CO-Gruppenüberträger.In In this context come as effector molecules and vitamins as ingredients of coenzymes, for example thiamine (vitamin B1) or Thiamine diphosphate as a coenzyme of oxidative decarboxylation, riboflavin (Vitamin B2) with nicotinic acid, Nicotinamide, folic acid and pantothenic acid forms the B2 complex, pyridoxine (vitamin B6), which in transaminations and decarboxylations needed cobalamin (vitamin B12), which plays a role in isomerases, ascorbic acid (Vitamin C) as H-donor in oxidoreductases, and biotin (Vitamin H) as a CO group carrier.

Im Falle der Verwendung von an einer Sonde immobilisierten Effektormolekülen werden im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt allosterische Enzyme, beispielsweise im Medium auf der Oberfläche, verwendet, die zusätzlich zu ihrem katalytischen Zentrum noch Bindungsstellen besitzen, an denen das Effektormolekül reversibel binden kann.in the Case of using immobilized on a probe effector molecules in the process according to the invention preferably allosteric enzymes, for example in the medium on the Surface, used that in addition to their catalytic center still have binding sites on which the effector molecule can bind reversibly.

Einige Punkte sind wesentlich für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Beispielsweise müssen Enzym und Substrat in unmittelbare Nähe der Oberfläche gebracht (Abstand im Bereich von nm oder Zehntel-nm) und relativ zueinander positioniert werden. Dies kann dadurch erreicht werden, dass das Enzym oder ein Effektormolekül an eine Sonde immobilisiert wird.Some points are essential for carrying out the method according to the invention. For example, enzyme and substrate must be brought into close proximity to the surface (distance in Be rich of nm or tenth-nm) and relative to each other. This can be achieved by immobilizing the enzyme or an effector molecule to a probe.

Das Enzym oder Effektormolekül kann chemisch auf einem Kügelchen (Glas, Latex oder andere Materialien) oder an der Spitze eines Rastersondenmikroskops (Rastertunnelmikroskop, Rasterkraftmikroskop, SNOM oder andere) fixiert werden. Das Kügelchen oder die Spitze kann durch externe Kräfte positioniert werden, z.B. elektrische, magnetische, optische Steuerungskräfte (magnetic or optical traps) oder andere, oder durch ein Mikropositionierungsgerät (Piezo-Konverter, mikrotechnologisch hergestellte elektromechanische Wandler und so weiter) relativ zur Probe. Immobilisierung des Enzyms oder Effektormoleküls kann durch kovalente Bindung, durch chemische Bindung oder durch physikalische Adsorption erfolgen.The Enzyme or effector molecule can chemically on a bead (Glass, latex or other materials) or at the top of a scanning probe microscope (Scanning Tunneling Microscope, Atomic Force Microscope, SNOM or others) be fixed. The bead or the tip can be positioned by external forces, e.g. electrical, magnetic, optical control forces (magnetic or optical traps) or others, or by a micropositioning device (piezo converter, microtechnological manufactured electromechanical transducers and so on) relative to Sample. Immobilization of the enzyme or effector molecule can by covalent bonding, by chemical bonding or by physical Adsorption done.

Kovalente Bindungen können beispielsweise erreicht werden mit Silan- oder Thiolchemie, chemische Bindungen könnten spezifische biologische Interaktionen wie die Ligand-Rezeptor-Interaktionen zum Einsatz bringen (z.B. Biotin-Streptavidin, Antikörper-Antigen und der gleichen). Physikalische Fixierung kann sich elektrostatischer Kräfte, Van-der-Waals-Kräfte, hydrophober Kräfte und dergleichen bedienen. Fixierung kann auch durch Kombination der oben beschriebenen Verfahren erreicht werden.covalent Bindings can For example, be achieved with silane or thiol chemistry, chemical Bindings could specific biological interactions such as ligand-receptor interactions for Use (e.g., biotin-streptavidin, antibody-antigen and the like). Physical fixation can be electrostatic forces, van der Waals forces, hydrophobic personnel and the like. Fixation can also be through combination the method described above can be achieved.

Demnach ist in einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die Sonde ein Mikro- oder Nanopartikel und umfasst vorzugsweise Latex-, Glas-, Polystyrol- oder Silika-Kügelchen. Solche Kügelchen können beispielsweise mit Biotin oder Streptavidin beschichtet werden. Diese Kügelchen können mit einer sogenannten optischen Pinzette lokal positioniert werden. Diese Technik beruht auf sogenannten optische Fallen; siehe beispielsweise Ashkin 1970, 1997. Ein neuerer Typ einer dreidimensionalen Falle (single-beam gradient force trap) wurde in Ashkin, 1986, beschrieben.Therefore is in one embodiment the method according to the invention the probe is a micro or nanoparticle and preferably comprises Latex, glass, polystyrene or silica beads. Such beads can For example, be coated with biotin or streptavidin. These beads can with a so-called optical tweezers are positioned locally. This technique is based on so-called optical traps; see for example Ashkin 1970, 1997. A newer type of three-dimensional trap (single-beam gradient force trap) has been described in Ashkin, 1986.

Eine optische Pinzette beruht auf der Tatsache, dass kleine transparente dielektrische Objekte (mit n_Objekt> n_Umgebung) durch eine Kraft in den Fokus eines fokussierten Laserstrahls befördert werden; siehe beispielsweise Hegner, 2002. Als dielektrische Objekte kommen wie oben erwähnt Mikropartikel aus Polystyrol, Glas- oder Silikakügelchen in Betracht, die ihrerseits Träger für Biomoleküle, d.h. erfindungsgemäß Enzyme oder Effektormoleküle sein können. Der Aufbau einer optischen Einzelstrahl-Pinzette sowie von mechanischem Zubehör wie einer Flüssigkeitszelle und eines mechanischen Verstelltisches sind dem Fachmann bekannt. Dies gilt auch für Steuerungsprogramme, beispielsweise in LabView, um den Piezotisch relativ zur optischen Falle bewegen zu können und um die optische Falle zu kalibrieren; siehe beispielsweise die Diplomarbeit „Aufbau einer optischen Pinzette" von Andy Sischka, Fakultät für Physik, Universität Bielefeld (Juni 2002).Optical tweezers are based on the fact that small transparent dielectric objects (with n _object > n _environment ) are conveyed by a force into the focus of a focused laser beam; see, for example, Hegner, 2002. As dielectric objects, as mentioned above, microparticles of polystyrene, glass or silica beads are suitable, which in turn can be carriers for biomolecules, ie enzymes or effector molecules according to the invention. The structure of a single-jet optical tweezers and of mechanical accessories such as a liquid cell and a mechanical adjustment table are known in the art. This also applies to control programs, for example in LabView, to move the piezoelectric table relative to the optical trap and to calibrate the optical trap; see, for example, the diploma thesis "Construction of Optical Tweezers" by Andy Sischka, Faculty of Physics, Bielefeld University (June 2002).

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Sonde die Spitze eines Rastersondenmikroskops.In another preferred embodiment the method according to the invention the probe is the tip of a scanning probe microscope.

Allen Rastersondenmikroskopen gemeinsam ist die Notwendigkeit der präzisen Steuerung des Abstandes zwischen Sonde und Probenoberfläche und der lateralen Rasterbewegung mit einer Auflösung im Nanometerbereich und deutlich besser. Diese Bewegungspräzision lässt sich durch Piezoelemente realisieren. Diese bestehen aus Piezokeramik, die die Eigenschaft hat, dass sie sich bei angelegter Spannung kontrahiert oder elongiert.all Scanning probe microscopes in common is the need for precise control of the Distance between probe and sample surface and the lateral grid movement with a resolution in the nanometer range and much better. This movement precision can be realized by piezo elements. These consist of piezoceramics, which has the property that it contracts when voltage is applied or elongated.

Rastersondenmikroskope werden in vielen Fällen zur lokalen Oberflächenmodifikation verwendet. Die wohl bekanntesten Fälle sind das Kratzen oder Hämmern von Löchern in einen weichen Polymerfilm durch Rasterkraftmikroskopie (Wendel, Lorenz et al., 1995), die Dip- Pen-Technologie (Piner, Zhu et al., 1999), bei der eine an eine Spitze adsorbierte Tinte langsam auf eine Probe aufgebracht wird, oder die lokale Elektrooxidation einer leitenden Probe durch den Elektronenstrom in einem Rastertunnelmikroskop.Scanning probe microscopes be in many cases for local surface modification used. The most well-known cases are the scratching or hammering of holes into a soft polymer film by atomic force microscopy (helix, Lorenz et al., 1995), the dip-pen technology (Piner, Zhu et al., 1999), in which one adsorbed to a tip Ink is slowly applied to a sample, or local electro-oxidation a conductive sample through the electron stream in a scanning tunneling microscope.

In einer neueren Veröffentlichung wurden Experimente beschreiben, bei denen ein an einer Rasterkraftmikroskopspitze fixiertes Enzym zur Modifikation einer geeigneten Oberfläche verwendet wurde. Hier wurde die spezifische Bindung des Substratmoleküls an das Enzymmolekül dazu benutzt, das Substrat aus der Probe zu entfernen (Takeda, Nakamura et al., 2003). Im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung wurde in diesen Experimenten allerdings nur die spezifische Enzym-Substrat-Bindung ausgenutzt und sozusagen das Substrat (Peptid) von der Oberfläche runter gebürstet. Im Gegensatz dazu beruht das erfindungsgemäße Verfahren auf der Nutzung der chemischen, d.h. enzymatischen Aktivität des Enzyms. Mit anderen Worten, das Produkt der chemischen Reaktion, die das Enzym beschleunigt, wird genutzt um die Zieloberfläche zu modifizieren.In a recent publication were described experiments in which one at a atomic force microscope tip fixed enzyme was used to modify a suitable surface. Here, the specific binding of the substrate molecule to the enzyme molecule used to remove the substrate from the sample (Takeda, Nakamura et al., 2003). In contrast to the present invention was in These experiments, however, exploited only the specific enzyme-substrate binding and, so to speak, the substrate (peptide) from the surface down brushed. In contrast, the inventive method based on the use the chemical, i. enzymatic activity of the enzyme. In other words, the product of the chemical reaction that accelerates the enzyme becomes used around the target surface to modify.

Ein weiterer gravierender Unterschied gegenüber der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass bei dem von Takeda et al. verwendeten Kraftmikroskop keine gezielte Beschichtung der Spitzenoberfläche mit Enzym erfolgte und durch die Vielzahl von gebundenen Enzymmolekülen keine ausreichende lokale Begrenzung der Enzymaktivität erreicht wurde. Ferner wurde von den Autoren auch nicht auf die Notwendigkeit einer lokalen Begrenzung der Enzymaktivität hingewiesen, geschweige denn Maßnahmen empfohlen, wie die zu erreichen sei.Another major difference with respect to the present invention is that in the Takeda et al. used force microscope, no targeted coating of the tip surface was carried out with enzyme and due to the large number of bound enzyme molecules, no sufficient local limitation of the enzyme activity was achieved. Furthermore, the authors did not point out the need for local limitation of enzyme activity, let alone measurement recommended how to achieve that.

Rastersondenmikroskope, die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden können, umfassen das Rastertunnelmikroskop (STM), Scanning Near – field Optical Mikroskop (SNOM), und besonders bevorzugt das Rasterkraftmikroskop (AFM), das für die in den Beispielen beschriebenen Experimente verwendet wurde.Scanning probe microscopes, the for the inventive method can be used Scanning Tunneling Microscope (STM), Scanning Near - field Optical Microscope (SNOM), and most preferably the atomic force microscope (AFM) used for the in The experiments described in the examples were used.

Beim AFM tastet eine Sonde die atomare Hügellandschaft des zu untersuchenden Probeobjektes ab. Die Sonde besteht aus einer Spitze, die aus wenigen Atomen gebildet wird iIm Idealfall sitzt an der Spitze der Spitze ein einziges Atom), die an einem beweglichen dünnen "Balken" montiert ist.At the AFM probes a probe the atomic hilly landscape of the examined Sample object. The probe consists of a tip, which consists of few Atoms ideally is sitting at the top of the top a single atom), which is mounted on a movable thin "beam".

Fährt man mit dieser feinen Spitze an die Oberfläche heran, so wirkt in erster Näherung ein Lennard-Jones-Potenzial zwischen dem vordersten Atom der Spitze und dem Oberflächenatom, d.h., abstandsabhängig wirkt auf die Spitze in einem größeren Abstand zuerst eine anziehende und dann eine abstoßende Kraft. Beim Abtasten der Oberfläche wird die Kraft der Spitze konstant gehalten. Die dadurch veränderte Biegung des "Balkens" wird mit einem Sensor registriert. Als Sensor kann ein Rasterkraftmikroskop, üblicherweise jedoch ein abgelenkter Laserstrahl verwendet werden. Rastersondenmikroskope sind dem Fachmann bekannt. Neuere Entwicklungen dazu sind beispielsweise in der europäischen Patentanmeldung EP 0 896 201 A1 beschrieben.If one approaches the surface with this fine tip, a Lennard-Jones potential between the foremost atom of the tip and the surface atom acts in a first approximation, ie, depending on the distance, an attracting and then a repulsive effect acts on the tip at a greater distance first Force. When scanning the surface, the force of the tip is kept constant. The thus changed bending of the "beam" is registered with a sensor. As a sensor, an atomic force microscope, but usually a deflected laser beam can be used. Scanning probe microscopes are known in the art. Recent developments are, for example, in the European patent application EP 0 896 201 A1 described.

Wie in den Abbildungen der 2 gezeigt, kann das Substratmolekül, das vom Enzym chemisch modifiziert wird, an der Oberfläche oder im umgebenden Medium präsent sein. In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Substrat des Enzyms auf der Oberfläche immobilisiert. In einer alternativen Ausführungsform liegt das Substrat in einem Medium auf der Oberfläche vor. Es ist aber auch möglich, beide Ausführungsformen ggf. mit unterschiedlicher Gewichtung zu kombinieren.As in the pictures of 2 As shown, the substrate molecule that is chemically modified by the enzyme can be present on the surface or in the surrounding medium. In one embodiment of the method according to the invention, the substrate of the enzyme is immobilized on the surface. In an alternative embodiment, the substrate is in a medium on the surface. But it is also possible to combine both embodiments, if necessary, with different weighting.

Üblicher Weise ist das Substratmolekül im umgebenden Medium präsent, um eine konstante Menge an verfügbarem Substrat zu gewährleisten. Zur Entfernung von Material aus der Oberfläche wird vorzugsweise das Substrat auf der Probe präsentiert, und das Enzym kann Teile des Substratmoleküls abspalten (z.B. Lysozym kann Teil eines fixierten Polysaccharids abspalten). Andere Ausführungsformen sind allerdings auch akzeptabel. Zum Beispiel kann Glukoseoxidase lokal Wasserstoffperoxid produzieren, welches dann eine geeignete Oberfläche chemisch modifiziert.usual Way is the substrate molecule present in the surrounding medium, a constant amount of available To ensure substrate. to Removal of material from the surface will preferably be the substrate presented on the sample, and the enzyme can cleave off portions of the substrate molecule (e.g., lysozyme can split off part of a fixed polysaccharide). Other embodiments are but also acceptable. For example, glucose oxidase can be local Produce hydrogen peroxide, which then chemically a suitable surface modified.

Wie vorstehend erwähnt, kann das Enzym im erfindungsgemäßen Verfahren in einem Medium auf der Oberfläche vorliegen, insbesondere dann, wenn das Effektormolekül auf der Sonde gebunden ist.As mentioned above, may be the enzyme in the process of the invention in a medium on the surface be present, especially when the effector molecule on the Probe is bound.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Enzym auf dem Apex der Spitze gebunden; siehe auch die Beispiele.In a preferred embodiment the method according to the invention the enzyme is bound to the apex of the tip; see also the examples.

Wie bereits vorstehend erwähnt, ist es wichtig, dass die enzymatische Aktivität lokal und ggf. zeitlich begrenzt wird. Beispielsweise kann die Aktivität des Enzymmoleküls über eine externe Steuerung an- und ausgeschaltet werden. In dieser Ausführungsform kann, wenn auch weniger bevorzugt, die gesamte Sonde, beispielsweise die gesamte Rasterkraftmikroskopspitze mit Enzym oder Effektormolekülen beschichtet sein, wobei die Aktivität des Enzyms an der Oberfläche durch ein externes Signal gesteuert wird. Ein geeignetes externes Signal kann beispielsweise durch ein elektrisches oder magnetisches Feld, Oberflächenladung, pH-Änderung, Ionengradienten oder optisches Signal vermittelt werden; siehe auch die vorstehenden Ausführungen zur optischen Pinzette oben.As already mentioned above, It is important that the enzymatic activity is local and possibly limited in time becomes. For example, the activity of the enzyme molecule via a external control on and off. In this embodiment may, although less preferably, the entire probe, for example the entire atomic force microscope tip is coated with enzyme or effector molecules be the activity of the enzyme on the surface controlled by an external signal. A suitable external Signal, for example, by an electric or magnetic Field, surface charge, pH change, Ion gradients or optical signal are mediated; see also the above statements to the optical tweezers above.

Somit ist jedes Signal geeignet, mit dem erreicht werden kann, dass nur Enzymmoleküle in der unmittelbaren Nähe der zu modifizierenden Probe aktiv sind. Eine mögliche Vorgehensweise ist, diese aktivierenden Bedingungen nur in der Nähe der Oberfläche zu schaffen. Beispielsweise kann ein photoaktivierbares Enzymmolekül durch das evaneszente Feld einer totalen internen Lichtreflexion an der Probe/Medium-Grenzlinie aktiviert werden. In einer anderen Ausführungsform kann durch lokale Oberflächenladungen (oder Oberflächenpotenzial) ein Oberflächen-pH-Wert geschaffen werden, der sich vom pH-Wert im Medium unterscheidet. Da die meisten Enzyme eine pH-abhängige Aktivität aufweisen, kann dieses Verfahren derart angepasst werden, dass das Enzym nur in der Nähe der Probenoberfläche aktiv ist. Ein einfacher Weg zur An- und Ausschaltung der Aktivität des Enzyms liegt beispielsweise in einer Verfügbarkeit oder Nicht-Verfügbarkeit des Substrats. Dies kann einfach durch ein im Medium gelöstes Substrat, das durch ein Medium ohne Substrat ersetzt werden kann, erreicht werden. Allerdings kann die Aktivität des Enzyms auch durch externe Reize modifiziert werden (elektrische oder magnetische Felder, Bestrahlung mit Licht oder elektromagnetischen Wellen, Temperatur, pH-Wert). Dasselbe gilt für die Aktivität des Substrats oder für molekulare Gruppen, die auf der Oberfläche modifiziert werden sollen. Eine standardisierte Vorgehensweise, um das Substrat nach einem externen Reiz verfügbar zu machen, ist die Verwendung von vorübergehend inaktiven Verbindungen, die durch die Bestrahlung mit Licht aktiviert werden (beispielsweise "caged compounds" wie caged-ATP, caged-CA, etc.).Consequently Any signal that can be achieved is only suitable enzyme molecules in the immediate vicinity the sample to be modified are active. One possible approach is to create these activating conditions only near the surface. For example, a photoactivatable enzyme molecule may be the evanescent field of total internal light reflection at the sample / medium boundary to be activated. In another embodiment, by local surface charges (or surface potential) a surface pH be created, which differs from the pH in the medium. Since most enzymes have a pH-dependent activity, can this procedure be adapted so that the enzyme only in nearby the sample surface is active. A simple way to turn on and off the activity of the enzyme is for example in an availability or non-availability of the Substrate. This can be achieved simply by a substrate dissolved in the medium, which can be replaced by a medium without a substrate achieved become. However, the activity of the enzyme can also be caused by external Stimuli are modified (electric or magnetic fields, irradiation with light or electromagnetic waves, temperature, pH). The same applies to the activity of the substrate or for molecular groups to be modified on the surface. A standardized approach to the substrate after a external irritant available too make use of temporarily inactive connections, which are activated by the irradiation with light (for example "caged compounds" such as caged-ATP, caged-CA, Etc.).

Alternativ, oder zusätzlich, kann die lokale Aktivität des Enzyms in der Nähe der Oberfläche dadurch erreicht werden, dass die Sonde nur einer bestimmten Stelle, im Falle der Rasterkraftmikroskopspitze nur am vordersten Ende, mit aktiven Enzym- oder Effektormolekülen beschichtet; siehe beispielsweise 1. Dementsprechend ist bevorzugt, dass lediglich das äußerste Ende des Apex der Sondenspitze mit Enzym oder Effektormolekülen versehen ist. Besonders bevorzugt trägt der Apex der Sondenspitze lediglich ein Enzym oder Effektormolekül.Alternatively, or additionally, the local activity of the enzyme near the surface can be achieved by coating the probe only with a specific site, in the case of the AFM tip only at the foremost end, with active enzyme or effector molecules; see for example 1 , Accordingly, it is preferred that only the extreme end of the apex of the probe tip is provided with enzyme or effector molecules. Most preferably, the apex of the probe tip carries only one enzyme or effector molecule.

Wie vorstehend bereits erwähnt, beruht die erfindungsgemäße Strukturierung, d.h. Modifikation einer Oberfläche auf der enzymatischen Aktivität eines Enzyms, d.h. ein Enzymmolekül transformiert ein Substratmolekül S in ein Produktmolekül P. Um diese chemische Reaktion zur Oberflächenmodifikation nutzbar zu machen, sind mehrere Konzepte vorstellbar; siehe beispielhaft die Abbildungen in 2.As already mentioned above, structuring according to the invention, ie modification of a surface, is based on the enzymatic activity of an enzyme, ie an enzyme molecule transforms a substrate molecule S into a product molecule P. In order to make use of this chemical reaction for surface modification, several concepts are conceivable; see for example the figures in 2 ,

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens resultiert die Modifikation der Oberfläche aus der Präzipitation eines Produkts der enzymatischen Reaktion, während in einer anderen Ausführungsform die Modifikation der Oberfläche aus der Modifikation des Substrats auf oder innerhalb der Oberfläche resultiert.In an embodiment the method according to the invention the modification of the surface results from the precipitation a product of the enzymatic reaction, while in another embodiment the modification of the surface the modification of the substrate on or within the surface results.

Es ist offensichtlich, dass weitere Reaktionsschemata erfindungsgemäß verwendet werden können. Der gemeinsame Grundgedanke ist, dass eine lokale enzymatische Reaktion in ihrer Nähe eine Probenoberfläche durch Hinzufügen von Molekülen oder durch Entfernen oder Modifikation von Molekülen auf der Probenoberfläche modifiziert. Dies kann direkt vom Enzym durchgeführt werden oder indirekt vom Produkt der enzymatischen Reaktion. Das Enzym oder das aktive Produkt können zusätzliche Coenzyme oder Helfermoleküle zur Erfüllung dieser Aufgabe benötigen.It it is obvious that further reaction schemes are used according to the invention can be. The common basic idea is that a local enzymatic reaction in their vicinity a sample surface by adding of molecules or modified by removal or modification of molecules on the sample surface. This can be done directly by the enzyme or indirectly from the product the enzymatic reaction. The enzyme or active product may be additional Coenzymes or helper molecules to fulfillment need this task.

Für das erfindungsgemäße Verfahren sind grundsätzlich alle Arten von Enzymen verwendbar, wie Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen. In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Oxidoreductasen, Glucoseoxidasen, Transferasen, Kinasen, Hydrolasen, Carbonsäureesterhydrolasen, Lipasen, Ribonucleasen, Hyaluronidasen, Invertasen, Amylasen, beta-Galactosidasen, Proteinasen und Polymerasen. Besonders bevorzugt werden das Enzym alkalische Phosphatase, Glucoseoxidase, DNA oder RNA-Polymerase, oder ein katalytischer Antikörper verwendet.For the inventive method are basically all types of enzymes usable, such as oxidoreductases, transferases, Hydrolases, lyases, isomerases and ligases. In one embodiment the method according to the invention the enzyme is selected from the group consisting of oxidoreductases, glucose oxidases, transferases, Kinases, hydrolases, carboxylic ester hydrolases, Lipases, ribonucleases, hyaluronidases, invertases, amylases, beta-galactosidases, Proteinases and polymerases. Particularly preferred are the enzyme alkaline phosphatase, glucose oxidase, DNA or RNA polymerase, or a catalytic antibody used.

Die Substrate und ggf. notwendigen Cofaktoren von Enzymen sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise Nukleotide, Aminosäuren, oder Vorstufen zu Farbstoffen, insbesondere dann, wenn es sich um metabolisierende Enzyme, d.h. Produkt „ausbauende" Enzyme handelt. Im Falle von anabolischen Reaktionen kann das Substrat beispielsweise Nukleinsäuren, (Poly)Peptide, Zucker, oder Farbstoffe umfassen.The Substrates and possibly necessary cofactors of enzymes are those skilled in the art known and include, for example, nucleotides, amino acids, or Precursors to dyes, especially when it is metabolizing Enzymes, i. Product "degrading" enzymes. For example, in the case of anabolic reactions, the substrate may nucleic acids, (Poly) include peptides, sugars, or dyes.

Beispielhaft seien folgende enzymatische Reaktionen genannt: Die Oberfläche ist mit Phospholipid beschichtet. Das Enzym Phospholipase spaltet das Phospholipid in zwei separate Moleküle, die löslich werden und von der Oberfläche entfernt werden.exemplary The following enzymatic reactions may be mentioned: The surface is coated with phospholipid. The enzyme phospholipase cleaves the Phospholipid into two separate molecules that become soluble and removed from the surface become.

Das Enzym alkalische Phosphatase dephosphoryliert p-Nitrophenylphosphate, und das Produkt bindet auf Grund von elektrostatischen Interaktionen an eine geladene Oberfläche. Das Enzym Glukoseoxidase oxidiert Glukose und produziert Wasserstoffperoxid. Das Wasserstoffperoxid oxidiert geeignete Moleküle auf der Oberfläche.The Enzyme alkaline phosphatase dephosphorylates p-nitrophenyl phosphates, and the product binds due to electrostatic interactions a charged surface. The enzyme glucose oxidase oxidizes glucose and produces hydrogen peroxide. The hydrogen peroxide oxidizes suitable molecules on the surface.

Das Enzym alkalische Phosphatase dephosphoryliert das Substrat BCIP/NBT, das Produkt wird unlöslich und fällt auf einer geeigneten Oberfläche aus; siehe auch die Beispiele. Wie vorstehend beschrieben, kann das Enzymmolekül durch die in der Biotechnologie verfügbaren Toolkits chemisch gebunden werden. Im nachfolgenden Beispiel wurde beispielsweise ein Phosphatasemolekül verwendet, an das ein Streptavidinmolekül kovalent gebunden war. Streptavidin weist vier Bindungsgruppen für Biotin auf. Die Rasterkraftmikroskopspitze wurde kovalent mit einem biotinilierten Silan beschichtet. Nach einem erfindungsgemäßen Verfahren führte das Eintauchen der Rasterkraftmikroskopspitze in eine Streptavidin-Enzym-Komplex-Lösung dazu, dass die Rasterkraftmikroskopspitze ausschließlich am vordersten Ende der Spitze mit Enzymmolekülen beschichtet war; siehe Beispiel 1 und 1.The enzyme alkaline phosphatase dephosphorylates the substrate BCIP / NBT, the product becomes insoluble and precipitates on a suitable surface; see also the examples. As described above, the enzyme molecule can be chemically bound by the toolkits available in biotechnology. In the following example, for example, a phosphatase molecule was used, to which a streptavidin molecule was covalently bound. Streptavidin has four binding groups for biotin. The atomic force microscope tip was covalently coated with a biotinylated silane. According to a method of the invention, dipping the atomic force microscope tip into a streptavidin-enzyme complex solution resulted in the atomic force microscope tip being coated with enzyme molecules only at the foremost end of the tip; see Example 1 and 1 ,

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Träger, die gemäß einem der vorstehend beschriebenen Verfahren erhältlich sind. Wie vorstehend beschrieben und in den Beispielen gezeigt, lassen sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erstmals Träger bzw. Oberflächen herstellen, die im Nanometerbereich genau strukturiert sind.The The present invention also relates to supports which are according to a obtainable by the methods described above. As above described and shown in the examples, can be with the inventive method first carrier or surfaces which are precisely structured in the nanometer range.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Vorrichtungen, die die erfindungsgemäßen Träger enthalten. Entsprechende Vorrichtungen umfassen Chips, Microarrays, diagnostische Vorrichtungen, Biosensoren oder Nanoreaktoren. Die erfindungsgemäßen Träger bzw. deren Oberflächen können natürlich je nach beabsichtigter Anwendung weiter modifiziert werden, beispielsweise in Gehäuse eingebaut werden und/oder mit konventionellen Verfahren mit Molekülen, beispielsweise Biomolekülen, beladen werden.Further The present invention relates to devices containing the carriers according to the invention. Corresponding devices include chips, microarrays, diagnostic Devices, biosensors or nanoreactors. The carrier or their surfaces can Naturally be further modified depending on the intended application, for example in housing be incorporated and / or with conventional methods with molecules, for example biomolecules be loaded.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Vorrichtung einen DNA- oder Protein-Chip. Sogenannte Genchips können beispielsweise für forensische Anwendungen genutzt werden. Ferner ist es beispielsweise mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich sogenannte PISA (Protein in situ Arrays) herzustellen, die heutzutage lediglich in der konventionellen Multiwell-Größenordnung verwendet werden können.In a preferred embodiment The device comprises a DNA or protein chip. So-called gene chips, for example, can forensic Applications are used. Furthermore, it is for example with the inventive method possible produce so-called PISA (protein in situ arrays), nowadays only be used in the conventional multi-well order can.

Wie bereits vorstehend beschrieben, wird in einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Sonde verwendet, bei der nur eine kleine kontrollierte Fläche, beispielsweise nur der vorderste Teil einer Rasterkraftmikroskopspitze oder der Tangentialbereich eines Kügelchens mit Enzym- oder Effektormolekülen beschichtet ist, um eine Auflösung im Nanometerbereich zu erreichen. Dies kann nicht mit Standardtechniken wie Pipettieren oder Maskierung und dergleichen erreicht werden.As already described above, is in a particularly preferred embodiment the method according to the invention used a probe in which only a small controlled area, for example only the foremost part of an atomic force microscope tip or the tangential region a bead with enzyme or effector molecules is coated to a resolution to reach in the nanometer range. This can not be done with standard techniques such as pipetting or masking and the like can be achieved.

Erfindungsgemäß wurde ein neues Verfahren gefunden, wie man Enzyme oder Effektormoleküle von einem flachen Träger sammeln kann durch Inkontaktbringen der Sonde mit diesem Träger; siehe auch Beispiel 1. In einem zweiten Schritt wird die Sonde dann zu der zu modifizierenden Probenoberfläche bewegt.According to the invention was found a new method of how to make enzymes or effector molecules of one flat carrier can collect by contacting the probe with this carrier; see also Example 1. In a second step, the probe is then added to the to be modified sample surface emotional.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung daher ein Verfahren zur gezielten Beschichtung einer Sonde mit Enzym oder Effektormolekülen, umfassend das Inkontaktbringen der Sonde mit einem flachen Träger, auf dem Enzyme oder Effektormoleküle mittels eines polyvalenten Bindungspartners A an einen Bindungspartner B auf dem Träger gebunden sind und zumindest ein Teil der Sonde im Wesentlichen die gleichen Bindungspartner B aufweist.In In a further aspect, the present invention therefore relates to a Method for the targeted coating of a probe with enzyme or effector comprising contacting the probe with a flat support the enzymes or effector molecules by means of a polyvalent binding partner A to a binding partner B on the carrier are bound and at least a portion of the probe substantially the has the same binding partner B.

Grundsätzlich kann jedwede Sonde wie bereits vorstehend beschrieben verwendet werden. Besonders bevorzugt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist, dass lediglich das distale Ende des Apex der Sondenspitze beschichtet wird. Dabei ist natürlich ganz besonders bevorzugt, dass die Sonde mit lediglich einem Enzym oder Effektormolekül belegt wird.Basically any probe as already described above may be used. Particularly preferred in the method according to the invention is that only the distal end of the apex of the probe tip is coated. there is natural very particularly preferred that the probe with only one enzyme or effector molecule is occupied.

Üblicherweise werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren Bindungspartner A mit jeweils mindestens zwei freien Bindungsstellen für Bindungspartner B verwendet. Typische Bindungspartner sind dabei Streptavidin und Biotin oder Antikörper bzw. Antikörperfragmente sowie entsprechende Antigene.Usually be in the process of the invention Binding partner A, each with at least two free binding sites for binding partners B used. Typical binding partners are streptavidin and Biotin or antibodies or antibody fragments as well as appropriate antigens.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Sonden, die gemäß einem der vorstehend beschriebenen Verfahren erhältlich sind, bevorzugt dabei Sonden von Rastersondenmikroskopen. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung auch Rastersondenmikroskope, die eine erfindungsgemäße Sonde enthalten. Erfindungsgemäße Sonden, insbesondere solche, die nur ein Enzym oder Effektormoleküle aufweisen, können beispielsweise auch in der Zellbiologie eingesetzt werden, z.B. zur Untersuchung der Aktivität von Enzymen oder anderen Molekülen auf der Membran von Zellen.The The present invention also relates to probes according to a The above-described methods are available, preferably thereby Probes from scanning probe microscopes. Accordingly, the concerns The present invention also relates to scanning probe microscopes comprising a probe according to the invention contain. Inventive probes, in particular those which have only one enzyme or effector molecules, can for example, in cell biology, e.g. to study the activity of enzymes or other molecules on the membrane of cells.

Wie bereits aus dem Stand der Technik ersichtlich, ergeben sich für die erfindungsgemäßen Verfahren, Träger bzw. Oberflächen, Vorrichtungen, Sonden und Rastersondenmikroskope eine Fülle von Einsatzmöglichkeiten und Verwendungen, beispielsweise zur Herstellung von Nanochips oder Microarrays, um nur zwei zu nennen. Weiterhin seien beispielhaft folgende Anwendungen genannt:
Diagnostik, Therapiewahl und Therapiekontrolle von Tumor- und Stoffwechselerkrankungen; Untersuchung der genetischen Prädisposition (SNPs), insbesondere die Detektion von Mutationen, auch im forensischen Bereich; Genexpressionskontrolle; Sequenzierung, insbesondere Sequenzierung durch Hybridisierung; mikrobiologische Anwendungen wie in Bakteriologie und Virologie, beispielsweise zur Differenzierung verschiedener Stämme; ELISA-Anwendungen mit immobilisierten Antikörpern, Antigenen, Rezeptoren und Liganden in der klinischen Chemie bis hin zur Lebensmittelchemie und Umweltanalytik; Allergiediagnostik mit immobilisierten Allergene; High Throughput Screening von Substanzbibliotheken; Informations- und Kommunikationstechnik; und dergleichen mehr.As can already be seen from the prior art, the methods, carriers or surfaces, devices, probes and scanning probe microscopes according to the invention provide a wealth of possible uses and uses, for example for the production of nanochips or microarrays, to name only two. Furthermore, the following applications are mentioned by way of example:
Diagnosis, treatment choice and therapy control of tumor and metabolic diseases; Investigation of genetic predisposition (SNPs), in particular the detection of mutations, also in the forensic field; Gene expression control; Sequencing, in particular sequencing by hybridization; microbiological applications such as in bacteriology and virology, for example for the differentiation of different strains; ELISA applications with immobilized antibodies, antigens, receptors and ligands in clinical chemistry to food chemistry and environmental analysis; Allergy diagnostics with immobilized allergens; High throughput screening of compound libraries; Information and communication technology; and more.

Die erfindungsgemäßen Verfahren, Träger bzw. Oberflächen, Vorrichtungen, Sonden und Rastersondenmikroskope können insbesondere zur Speicherung und/oder Analyse von Daten, Zellmanipulation, oder zur Durchführung von Mess- oder Untersuchungsverfahren verwendet werden. Ferner kommen der Einsatz in jüngster Techniken wie bioMEMS (siehe dazu beispielsweise „Fundamentals of Microfabrication: The Science of Miniaturization", Second Edition, Marc J Madou, University of California, Irvine, California, USA, (2002) ISBN: 0849308267), μTAS (siehe dazu beispielsweise das „μTAS Virtual Journal", das ausschließlich in elektronischem Format verfügbar ist und Mikro-Total-Analyse Systeme (μTAS) zum Gegenstand hat, und über die Internetseite des Verlags ELSEVIER einsehbar ist).The inventive method, Carrier or Surfaces, Devices, probes and scanning probe microscopes can in particular for storage and / or analysis of data, cell manipulation, or to carry out be used by measuring or inspection procedures. Further come the use in recent Techniques like bioMEMS (see for example "Fundamentals of Microfabrication: The Science of Miniaturization, Second Edition, Marc J Madou, University of California, Irvine, California, USA, (2002) ISBN: 0849308267), μTAS (See for example the "μTAS Virtual Journal", which is only available in electronic format available is and micro-total-analysis systems (μTAS) has the subject, and about the Website of the publisher ELSEVIER is available).

Der Offenbarungsgehalt der vorstehend zitierten Dokumente aus dem Stand der Technik ist hiermit durch Bezugnahme in dieser Anmeldung enthalten, insbesondere betreffend die Quellen zu Rastersondenmikroskopie und Sensorsystemen. Diese und andere Ausführungsformen sind dem Fachmann offenbart und offensichtlich und umfasst durch die Beschreibung der vorliegenden Erfindung. Weiterführende Literatur zu einer der oben angeführten Werkstoffe und Vorrichtungen, die im Sinne der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können dem Stand der Technik entnommen werden, z.B. aus öffentlichen Bibliotheken unter z.B. der Benutzung elektronischer Hilfsmittel. Zudem bieten sich öffentliche Datenbanken an wie die „Medline", die über das Internet zur Verfügung stehen.The disclosure of the above-cited prior art documents is hereby incorporated by reference in this application, and in particular concerning the sources of scanning probe microscopy and sensor systems. These and other embodiments will be apparent to those skilled in the art and obvious and encompassed by the description of the present invention. Further Leading literature on any of the above materials and devices that can be used in the present invention can be found in the art, eg, from public libraries using, for example, the use of electronic aids. In addition, public databases are available, such as the "Medline", which are available over the Internet.

Die vorliegende Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen erläutert. Die Beispiele und die Abbildungen sind dazu gedacht, bei dem Verständnis für die Erfindung zu helfen, sind jedoch nicht dazu gedacht und dürfen nicht so verstanden werden, die Erfindung, so wie sie in den nachfolgenden Ansprüchen wiedergegeben ist, auf irgendeine An und Weise einzuschränken.The The present invention will be illustrated in the following examples. The Examples and illustrations are intended to aid in the understanding of the invention but they are not meant to be and should not be understood the invention as recited in the following claims is to restrict in any way.

BEISPIELEEXAMPLES

Beispiel 1: Gezielte Beschichtung einer Sonde eines Rasterkraftmikroskops.Example 1: Targeted coating a probe of an atomic force microscope.

Zur ausschließlichen Beschichtung nur des vordersten Endes der Rasterkraftmikroskopspitze präparierten wir eine flache Probe, die ebenfalls mit biotiniliertem Silan beschichtet war. Zu dieser Probe fügten wir Enzym hinzu, so dass die Probe beschichtet war. Bei Inkontaktbringen der biotinilierten Rasterkraftmikroskopspitze mit dieser Probe können die Biotingruppen am vordersten Ende der Rasterkraftmikroskopspitze wegen der Polyvalenz von Streptavidin auch an Streptavidinmoleküle binden. Auf Grund geometrischer Beschränkungen ist es tatsächlich vorstellbar, dass Streptavidin an maximal zwei Biotingruppen an der Oberfläche bindet und folglich die beiden anderen Bindungsstellen der Rasterkraftmikroskopspitze zugewandt sein müssen.to exclusive Prepared coating only on the foremost end of the atomic force microscope tip a flat sample also coated with biotinylated silane was. Added to this sample We added enzyme so that the sample was coated. When brought in contact of the biotinized atomic force microscope tip with this sample may be the Biotin groups at the forefront of the atomic force microscope tip because of the versatility of streptavidin also bind to streptavidin molecules. Due to geometric restrictions it is indeed conceivable that streptavidin binds to a maximum of two biotin groups the surface binds and consequently the other two binding sites of the atomic force microscope tip must be facing.

Die Immobilisierung von streptavidinisierten Proteinen am Apex einer Rastersondenspitze und Vorbereitung einer geeigneten Oberfläche kann beispielsweise wie folgt vorgenommen werden:The Immobilization of streptavidinized proteins at the apex of a Scanning probe tip and preparing a suitable surface can For example, be made as follows:

Reinigungcleaning

1. Cleaning the surface of a piece of oxidized Silicon wafers (CrysTec 53012) in a mixture of conc. Sulfuric acid (Riedel de Haen - C8029) and 30 percent hydrogen peroxide solution (Merck 8.22287.1000) (ratio 3: 1) in the ultrasonic bath for 15 minutes.
2. Rinse of the wafer with deionized water (MilliPore quality).
3. Irradiate an AFM tip (Veeco Nanoprobe NP-STT) with UV light to break up organic dirt on the surface.

Silanisierungsilanization

4. Applying a mixture of: - 9 ml of methanol reagent grade (Riedel de Haen - 32213) - 80 μm (microliters) conc. acetic acid (Fluka 45731) - 370 μm deionized water 230 μm N-2-aminoethyl-3-aminopropyltrimethoxysilane (Merck 8.19172.0100)
5. Insert the wafer and AFM tip into this mixture for 30 minute
6. Remove and wash twice the wafer and AFM tip in methanol.
7. Dry the wafer and AFM tip with nitrogen gas.
8. Heat the wafer and AFM tip in an oven 120 ° C for 3 min.

Aufbringen des Biotin-LinkersApplying the biotin linker

9. Prepare a solution of - 4 ml of dimethyl Sulfoxide (DMSO) (Fluka 41640) - 1 μg (micrograms) of biotin-N-hydroxysuccinimide ester (NHS-biotin) (Sigma H1759)
10. Insert the wafer and AFM tip into this mixture for 2 h.
11. Remove and wash twice the wafer and AFM tip in ethanol (Riedel de Haen 32205).
12. Dry the wafer and AFM tip with nitrogen gas.

Immobilisierung streptavidinisierter alkaliner Phosphatasen auf der Wafer-OberflächeImmobilization streptavidinized alkaline phosphatases on the wafer surface

13. The biotinized wafer is placed in a 0.2 nM solution of alkaline phosphatase (Sigma 52890) for 10 min.
14. Rinse with deionized water.
15. Incubate in a 5 mM solution of p-nitrophenyl phosphate (pNNP) (Sigma N4665) in 40 mM TRIS buffer p.A. (Roth 4855.2) and 1 mM magnesium chloride (Sigma M2670) for 10 min on a stirred table.
16. Rinse with deionized water.

Immobilisierung streptavidinisierter alkaliner Phosphatasen auf der AFM-SpitzeImmobilization streptavidinized alkaline phosphatases on the AFM tip

17. Installation of biotinized AFM tip and of the prepared Wafers in an atomic force microscope.
18. Approach the AFM tip to the surface of the Wafer.
19. Slowly move the AFM tip over the surface (~100 nm / s) over one Range of ~50 μm. in this connection Individual streptavidinized alkaline phosphatases bind to each other the AFM tip.

Da dasselbe Streptavidinmolekül nun an den Träger und die Spitze gebunden ist, ist es bei Abziehen der Spitze zu 50% wahrscheinlich, dass Streptavidin an die Spitze gebunden bleiben wird. Da das Enzym kovalent and Streptavidin gebunden ist, werden wir folglich aktives Enzym an unserer Rasterkraftmikroskopspitze ansammeln. Wegen der Größe der Moleküle und der in dieses Konzept involvierten Zwischenräume ist es möglich, nur das vorderste Ende der Rasterkraftmikroskopspitze zu beschichten. Wir können abschätzen, dass maximal die vordersten 10 nm der Rasterkraftmikroskopspitze beschichtet sein dürften.Since the same streptavidin molecule is now attached to the Carrier and the tip is tied, it is likely when removing the tip to 50% that streptavidin will remain bound to the tip. Since the enzyme is covalently bound to streptavidin, we will therefore accumulate active enzyme at our atomic force microscope tip. Because of the size of the molecules and the spaces involved in this concept, it is possible to coat only the foremost end of the atomic force microscope tip. We can estimate that at most the foremost 10 nm of the atomic force microscope tip should be coated.

Beispiel 2: Strukturierung einer Oberfläche mit der Rasterkraftmikroskopspitze aus Beispiel 1.Example 2: structuring a surface with the atomic force microscope tip of Example 1.

Zur Erzeugung der in den 3B und 3C gezeigten Strukturen wurde die, nach der oben beschriebenen Prozedur, funktionalisierte AFM-Spitze in ein AFM eingebaut (Asylum Research MFP 3D). Als zu strukturierende Oberfläche kam Glimmer (Plano GmbH, Wetzlar) zum Einsatz.To produce in the 3B and 3C In the structures shown, the functionalized AFM tip was incorporated into an AFM according to the procedure described above (Asylum Research MFP 3D). Glimmer (Plano GmbH, Wetzlar) was used as the surface to be structured.

Als umgebenes Medium wurde 40 mM TRIS Puffer (Roth 4855.2) mit 1mM Magnesiumchlorid (Sigma M2670) genutzt, der im Verhältnis 1:1 mit dem Substrat BCIP/NBT (Sigma 6404) gemischt ist.When surrounding medium was added 40 mM TRIS buffer (Roth 4855.2) with 1 mM magnesium chloride (Sigma M2670) used in the ratio 1: 1 with the substrate BCIP / NBT (Sigma 6404) is mixed.

Die an der Spitze immobilisierte alkaline Phosphatase (Sigma 52890) setzt dabei das in Lösung befindliche Substrat so um, dass es unlöslich wird. Zum Erzeugen der Punktstruktur (3C) wurde die AFM-Spitze für jeden Punkt für 20 s mit der Glimmeroberfäche in Kontakt gebracht. Nach dem "Schreiben" wurde derselbe Bereich im Tapping-Modus abgebildet. Zum Erzeugen der zusammenhängenden L-förmigen Struktur (3B) wurde die AFM-Spitze in Kontakt gebracht und mit einer Geschwindigkeit von 10nm/s bewegt. Dieser Bereich wurde anschließend ebenfalls im Tapping-Modus abgebildet.The alkaline phosphatase immobilized at the tip (Sigma 52890) converts the substrate in solution to insolubility. To create the dot structure ( 3C ), the AFM tip was contacted with the mica surface for each 20 seconds for each point. After writing, the same area was mapped in tapping mode. To create the contiguous L-shaped structure ( 3B ), the AFM tip was brought into contact and moved at a speed of 10nm / s. This area was then also mapped in tapping mode.

Literaturliterature

Ashkin, A. Acceleration and trapping of particles by radiation pressure. Phys. Rev. Lett. 24, pages 156-159, (1970).
Ashkin, A. Trapping of atoms by resonance radiation pressure. Phys. Rev. Lett. 40, pages 729-732, (1978).
Ashkin, A. Ashkin, J.M. Dziedzic, J.E. Bjorkholm, S. Chu, Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Opt. Lett. 11, pages 288-290, (1986).
Ashkin, A. Forces of a single-beam gradient laser trap on a dielectric sphere in the ray optics regime. Biophys. J. 61, page 569-582, (1992).
Ashkin, A. Optical trapping and manipulating of neutral particles using lasers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, pages 4853-4860, (1997).
Grandbois, M., H. Clausen-Schaumann, et al. (1998). "Atomic force microscope imaging of phospholipid bilayer degradation by phospholipase A2. "Biophys. 2398 to 2404.
Hegner, M. Optics: the light fantastic. Nature (England), Sep 12 2002, 419 (6903) p125-7
Ionescu, R.E., R.S. Marks, et al. (2003). "Nanolithography using protease etching of protein surfaces. "Nanoletters 3 (12): 1639-1642.
Piner, R.D., J. Zhu, et al. (1999). "" Dip-Pen "Nanolithography." Science 283: 661-663.
Takeda, S., C. Nakamura, et al. (2003). "Lithographing of biomolecules on a substrate using an enzyme-immobilized AFM tip. "Nanoletters 3 (11): 1471-1474.
Wendel, M., H. Lorenz, et al. (1995). "Sharpened electron beam deposited tips for high resolution atomic force microscope lithography and imaging. "Appl. Phys. Lett. 67 (25): 3732-3734.

Claims

Lithographic process for structuring a surface a carrier, whereby, due to a localized enzymatic activity in the immediate vicinity of the surface, this is chemically or physically modified.

The method of claim 1, wherein one on a probe immobilized enzyme or effector molecule is positioned in the immediate vicinity of the surface.

The method of claim 2, wherein the probe is a microporous or nanoparticles.

The method of claim 3, wherein the micro or Nanoparticles include latex, glass or silica beads.

The method of claim 2, wherein the probe is the tip of a scanning probe microscope.

The method of claim 5, wherein the scanning probe microscope a Scanning Tunneling Microscope (STM) or Atomic Force Microscope (AFM) is.

Method according to one of claims 1 to 6, wherein the substrate of the enzyme immobilized on the surface is.

Method according to one of claims 1 to 6, wherein the substrate in a medium on the surface is present.

Method according to one of claims 1 to 8, wherein the enzyme in a medium on the surface is present.

A method according to any one of claims 1 to 8, wherein the enzyme is bound to the tip of the apex is.

Method according to one of claims 1 to 9, wherein the effector molecule is a cofactor, a substrate, an enzyme or a catalyst.

Method according to one of claims 1 to 11, wherein the activity of the enzyme through at the surface an external signal is controlled.

The method of claim 12, wherein the external signal by an electric or magnetic field, surface charge, pH change, Ion gradient, or optical signal is mediated.

Method according to one of claims 1 to 13, wherein only the very end of the apex of the tip is provided with enzyme or effector molecules.

The method of claim 14, wherein the apex is the apex carries only one enzyme or effector molecule.

Method according to one of claims 1 to 15, wherein the modification the surface from the precipitation a product of the enzymatic reaction results.

Method according to one of claims 1 to 15, wherein the modification the surface resulting from the modification of the substrate on or within the surface.

A method according to any one of claims 1 to 17, wherein the enzyme selected is from the group consisting of oxidoreductases, glucose oxidases, transferases, Kinases, hydrolases, carboxylic ester hydrolases, Lipases, ribonucleases, hyaluronidases, invertases, amylases, beta-galactosidases, Proteinases and polymerases is selected.

A method according to any one of claims 1 to 18, wherein the enzyme alkaline phosphatase, glucose oxidase, DNA or RNA polymerase, or a catalytic antibody is.

Method according to one of claims 1 to 19, wherein the substrate Nucleotides, amino acids, or Comprises precursors to dyes.

Method according to one of claims 1 to 19, wherein the substrate nucleic acids, (Poly) comprises peptides, sugars, or dyes.

Carrier, available according to a method of the claims 1 to 21.

Device comprising a carrier according to claim 22.

Device according to claim 23, comprising a chip, microarray, diagnostic device, biosensor or nanoreactor.

The chip of claim 24, which is a DNA or protein chip is.

Method for the targeted coating of a probe with enzyme or effector molecules, comprising contacting the probe with a flat support the enzymes or effector molecules by means of a polyvalent binding partner A to a binding partner B on the carrier are bound and at least a portion of the probe substantially the has the same binding partner B.

The method of claim 26, wherein the probe is a Probe as in any of the claims 3 to 6 is.

A method according to claim 26 or 27, wherein only the distal end of the apex of the probe tip is coated.

A method according to any one of claims 26 to 28, wherein binding partners A is at least two free binding sites for binding partners B has.

A method according to any one of claims 26 to 29, wherein the binding partner A streptavidin and binding partner B is biotin.

A method according to any one of claims 26 to 30, wherein the probe is occupied by only one enzyme or effector molecule.

Probe, available according to a method according to the claims 26 to 31.

Scanning probe microscope containing a probe after Claim 32.

Use of a method according to one of claims 1 to 21, a carrier according to claim 22, a device according to any one of claims 23 to 25, a probe according to claim 32 or a scanning probe microscope according to claim 33 for the production of nanochips or microarrays.

Use of a method according to one of claims 1 to 21, a carrier according to claim 22, a device according to any one of claims 23 to 25, a probe according to claim 32 or a scanning probe microscope according to claim 33 for the storage and / or analysis of data, cell manipulation, or to carry out of measuring or examination procedures.