DE10128508A1

DE10128508A1 - Verfahren und Nukleinsäuren für die Differenzierung von Prostata-Tumoren

Info

Publication number: DE10128508A1
Application number: DE10128508A
Authority: DE
Inventors: Juergen Distler; Fabian Model; Peter Adorjan
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2001-06-14
Filing date: 2001-06-14
Publication date: 2003-02-06
Also published as: CA2445731A1; EP1395686A2; US7381808B2; US20030113750A1; JP2004529661A; WO2002103042A2; WO2002103042A3

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft chemisch modifizierte genomische Sequenzen, Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes genomischer DNA sowie ein Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von Genen zur Anwendung bei der Charakterisierung, Klassifizierung, Differenzierung, Diagnose und Therapie von Prostataläsionen.

Description

Gebiet der Erfindung

Die durch die methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie untersuchten Beobachtungsebenen sind die Gene selbst, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung der Gene bzw. des Genoms korrelierbar. Insofern können sich pathogene Zustände in einem veränderten Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms äußern.
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, Oligonukleotide, PNA-Oligomere und eine Methode zur Charakterisierung, Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose von Prostataläsionen oder der Prädisposition für Prostatakrebs durch Untersuchung der genetischen und/oder epigenetischen Parameter genomischer DNA und insbesondere deren Cytosin-Methylierungszustand.

Stand der Technik

Mit einer Inzidenz von 180 : 100 000 in den USA in 1999 (Cancer J Clin 1999; 49: 8), stellt Prostatakrebs in den westlichen Ländern ein bedeutendes Problem im Gesundheitswesen dar. Zur Verbesserung der Früherkennung werden verschiedene Screening-Strategien wie die Bestimmung der Konzentrationen prostataspezifischer Antigene sowie die digitale rektale Untersuchung angewendet. Wird bei einem Patienten ein Prostatakarzinom vermutet, so wird durch histologische und zytologische Untersuchung von Biopsieproben auf mit maligner Transformation assoziierte Merkmale die Diagnose Krebs bestätigt oder ausgeschlossen. Insbesondere Frühstadien von Prostatakarzinomen sind durch eine routinemäßige histologische Untersuchung auch bei Entnahme einer geeigneten Biopsie oft schwer von benigner Hyperplasie der Prostata zu unterscheiden (McNeal JE et al., Hum Pathol 2001, 32: 441-6). Darüber hinaus wird die Routineuntersuchung aufgrund von kleinen oder sonst unzureichenden Biopsieproben manchmal verhindert.
Molekulare Marker bieten den Vorteil, dass selbst Proben von sehr geringer Größe sowie Proben, deren Gewebearchitektur nicht erhalten geblieben ist, recht gut untersucht werden können. Innerhalb des letzten Jahrzehnts wurde gezeigt, dass zahlreiche Gene zwischen benignen hyperplastischen Prostatatumoren und unterschiedlichen Graden von Prostatakrebs unterschiedlich exprimiert werden. Bislang wurde jedoch noch kein einziger, für die Unterscheidung zwischen den beiden Läsionen ausreichender Marker gefunden. In jüngster Zeit wurde gezeigt, dass hochdimensionale Ansätze auf der Grundlage von mRNA ein besseres Mittel zur Unterscheidung zwischen unterschiedlichen Tumorarten sowie benignen und malignen Läsionen liefern. Die Anwendung als routinemäßiges diagnostisches Werkzeug im klinischen Umfeld wird jedoch dadurch verhindert, dass mRNA extrem instabil ist, wobei die schnell auftretenden Expressionsänderungen auf bestimmte Auslöser folgen (z. B. Probenahme) sowie, was am entscheidendsten ist, durch die zur Untersuchung benötigte große Menge an mRNA (Lipshutz, R. J. et al., Nature Genetics 21: 20-24, 1999; Bowtell, D. D. L. Nature genetics suppl. 21: 25-32, 1999), die aus einer routinemäßigen Biopsie häufig nicht gewonnen werden kann.
Aberrante DNA-Methylierung innerhalb von CpG-Inseln ist in menschlichen Malignomen häufig anzutreffen und führt zur Abrogation oder Überexpression eines breiten Spektrums von Genen (Jones, P. A. Cancer Res 65: 2463-2467, 1996). Ebenso wurde bei bestimmten Tumoren ein Auftreten anormaler Methylierung in CpG-reichen regulatorischen Elementen in intronischen und kodierenden Teilen von Genen nachgewiesen (Chan, M. F., et al., Curr Top Microbiol Immunol 249: 75-86,2000). Hochcharakteristische DNA-Methylierungsmuster konnten ferner bei Zelllinien von Brustkrebs nachgewiesen werden (Huang, T. H.-M., et al., Hum Mol Genet 8: 459-470, 1999).
5-Methylcytosin ist die häufigste kovalente Basenmodifikation in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin- Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR-Amplifikation die vom 5-Methylcytosin getragene epigenetische Information vollständig verloren.
Eine relativ neue und die mittlerweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewandelt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden konnte, jetzt durch "normale" molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt werden kann. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur mit einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15; 24(24): 5064-6). Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode veranschaulicht. Allerdings werden gegenwärtig nur einzelne Regionen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausende von möglichen Methylierungsfällen ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren.
Eine Übersicht über die weiteren bekannten Verfahren zum Nachweis von 5-Methylcytosin kann dem folgenden Übersichtsartikel entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.
Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr; 5(2): 94-8) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 1997 Nov; 17(3): 275-6) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine "Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE) Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15; 25(12): 2529-31, WO-Patent 9500669) oder durch enzymatischen Verdau (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15; 25(12): 2532-4) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 99/28498).
Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei einzelnen Genen befassen, sind: Grigg G, Clark S. Sequencing 5- methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun; 16(6): 431-6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar; 6(3): 387-95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25; 22(4): 695-6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May 19; 157(1-2): 261-4; WO 97/46705, WO 95/15373 and WO 97/45560.
Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung lässt sich aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort zitierten Literatur entnehmen.
Für die Abtastung immobilisierter DNA-Arrays werden vielfach fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-OH der jeweiligen Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden kann beispielsweise über ein Konfokalmikroskop erfolgen. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen anderen, kommerziell erhältlich.
Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988 Oct 15; 60(20): 2299-301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Analytmolekül so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere.
MALDI-TOF Spektrometrie eignet sich ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse von Nukleinsäuren ist etwas schwieriger (Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations and Future Trends. 1995, 1; 147-57). Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit etwa 100 mal schlechter als für Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die ein vielfach negativ geladenes Rückgrat haben, ist der Ionisationsprozeß durch die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektrometrie spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrices gefunden worden, die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Mittlerweile gibt es einige ansprechende Matrices für DNA, der Empfindlichkeitsunterschied wurde jedoch nicht verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, dass sie einem Peptid ähnlicher wird. Phosphorothioatnukleinsäuren, bei denen die gewöhnlichen Phosphate des Rückgrats durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut IG, Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25; 23(8): 1367-73). Die Kopplung eines "charge tags" an diese modifizierte DNA resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit auf das gleiche Niveau, wie es für Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von "charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate stark erschweren.
Genomische DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von Zell-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen. Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.

Beschreibung

Die offenbarte Erfindung gibt eine Methode und Nukleinsäuren zur Differenzierung von Prostatatumoren an. Sie offenbart ein Mittel zur Unterscheidung benigner Prostatahyperplasie von Prostatakarzinomen. Dadurch wird ein Mittel zur Früherkennung und Behandlung von Prostatakrebs bereitgestellt. Darüber hinaus weist die offenbarte Erfindung dadurch Verbesserungen gegenüber dem Stand der Technik auf, dass gegenwärtige Verfahren zur Differentialdiagnose von Prostataläsionen die Bereitstellung einer Probe ausreichender Größe für die histologische und zytologische Untersuchung erfordern. Das erfindungsgemäße Verfahren ist anwendbar zur Klassifizierung winziger Proben.
Die Erfindung stellt die chemisch modifizierte DNA bereit sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zur Detektion von Cytosin-Methylierungen und ein Verfahren, welches sich zur Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose von Prostatatumoren bwz. der Prädisposition für Prostatakrebs besonders eignet. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass sich genetische und epigenetische Parameter und insbesondere die Cytosin- Methylierungsmuster genomischer DNA zur Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose von Prostatatumoren, insbesondere zur Anwendung bei der Differentialdiagnose von Prostatakrebs besonders eignen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Nukleinsäure, umfassend eine mindestens 18 Basen lange Sequenz der chemisch vorbehandelten DNA gemäß einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 112 gelöst.
Die chemisch modifizierte Nukleinsäure konnte bisher nicht in Zusammenhang mit der Ermittlung von krankheitsrelevanten genetischen und epigenetischen Parametern gebracht werden.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird weiterhin durch ein Oligonukleotid oder Oligomer zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter DNA, umfassend mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von mindestens 13 Nukleotiden gelöst, die an eine chemisch vorbehandelte DNA gemäß Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 112 hybridisiert. Die erfindungsgemäßen Oligomersonden stellen wichtige und effektive Werkzeuge dar, welche die Ermittlung bestimmter genetischer und epigenetischer Parameter von Karzinomen, insbesondere zur Anwendung bei der Differentialdiagnose von Prostatatumoren bzw. zur Diagnose der Prädisposition für Prostatakarzinome erst ermöglichen. Bevorzugterweise umfasst die Basensequenz der Oligomere mindestens ein CpG Dinukleotid. Die Sonden können auch in Form einer PNA (Peptide Nucleic Acid) vorliegen, die besonders bevorzugte Paarungseigenschaften aufweist. Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäße Oligonukleotide, bei denen das Cytosin des CpG Dinukleotids das 5.-9. Nukleotid vom 5'-Ende des 13 mers ist; im Falle von PNA-Oligomeren ist es bevorzugt, dass das Cytosin des CpG Dinukleotids das 4.-6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9 mers ist.
Die erfindungsgemäßen Oligomere werden normalerweise in sogenannten Sets eingesetzt, die für jedes der CpG Dinukleotide der Sequenzen der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 112 mindestens ein Oligomer umfassen. Bevorzugt ist ein Set, das für jedes der CpG Dinukleotide aus einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 112 mindestens ein Oligomer umfasst.
Weiterhin stellt die Erfindung ein Set von mindestens zwei Oligonukleotiden zur Verfügung, die als sogenannte Primeroligonukleotide zur Amplifikation von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 112 oder Abschnitten davon eingesetzt werden können.
Im Falle der erfindungsgemäßen Sets von Oligonukleotiden ist es bevorzugt, dass mindestens ein Oligonukleotid an eine Festphase gebunden ist. Darüber hinaus ist es bevorzugt, dass alle Oligonukleotide eines Sets an eine Festphase gebunden sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Satz von mindestens 10 n (Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren), die zur Detektion des Cytosin- Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomischer DNA (Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 112) dienen. Diese Sonden ermöglichen die Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose von genetischen und epigenetischen Parametern von Tumoren, welche sich zur Differentialdiagnose von Prostatakrebs besonders eignen. Darüber hinaus ermöglichen die Sonden die Diagnose der Prädisposition für Prostatakrebs. Das Set von Oligomeren kann auch zur Detektion von Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs) in chemisch vorbehandelter DNA gemäß einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 112 verwendet werden.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass eine von der Erfindung zur Verfügung gestellte Anordnung aus unterschiedlichen Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren (ein sogenanntes "Array") ebenfalls an eine Festphase gebunden vorliegt. Dieses Array von unterschiedlichen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen kann dadurch gekennzeichnet sein, dass es auf der Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet ist. Die Festphasenoberfläche besteht bevorzugt aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold. Möglich sind jedoch auch Nitrocellulose sowie Kunststoffe wie zum Beispiel Nylon, die in Form von Kugeln oder auch als Harz-Matrizes vorliegen können.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines auf einem Trägermaterial fixierten Arrays zur Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose von Prostatatumoren, insbesondere zur Differentialdiagnose von Prostatakrebs, bei dem mindestens ein Oligomer gemäß der vorliegenden Erfindung an eine feste Phase gekoppelt wird. Verfahren zur Herstellung von solchen Arrays sind zum Beispiel aus der US 5,744,305 mittels Festphasenchemie und photolabilen Schutzgruppen bekannt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft einen DNA-Chip zur Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose von Prostatatumoren, insbesondere zur Differentialdiagnose von Prostatakrebs. Darüber hinaus ermöglicht der DNA-Chip die Diagnose der Prädisposition für Prostatakarzinome. Der DNA-Chip umfasst mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure. DNA-Chips sind zum Beispiel aus der US 5,837,832 bekannt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist zudem ein Kit, das zum Beispiel aus einer Bisulfit enthaltenden Reagenz, einem Satz von Primeroligonukleotiden umfassend mindestens zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils mindestens einem 18 Basen langen Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen (Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 112) entsprechen oder zu ihnen komplementär sind, Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren sowie einer Anleitung zur Durchführung und Auswertung des beschriebenen Verfahrens bestehen kann.
Ein Kit im Sinne der Erfindung kann jedoch auch nur Teile der vorgenannten Bestandteile enthalten.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern genomischer DNA zu Verfügung. Das Verfahren ist vorgesehen zur Anwendung bei der Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose von Prostatatumoren, insbesondere zur Differentialdiagnose von Prostatakrebs sowie der Diagnose der Prädisposition für Prostatakrebs. Das Verfahren ermöglicht die Untersuchung von Cytosin-Methylierungen und Single Nucleotide Polymorphismen mit den folgenden Schritten:
Im ersten Verfahrensschritt, muss die genomische DNA-Probe von Gewebe bzw. Zellquellen isoliert werden. Derartige Quellen umfassen zum Beispiel Zelllinien, histologische Objektträger, Körperflüssigkeiten wie beispielsweise Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn- Rückenmarks-Flüssigkeit, Lymphflüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe; beispielsweise Prostata- oder lymphatisches Gewebe. Die Extraktion kann durch für den Fachmann übliche Mittel erfolgen wie die Verwendung von Detergens-Lysaten, Beschallung mit Ultraschall und Mischen mit Glasperlen. Sobald die Nukleinsäuren extrahiert worden sind, wird die genomische Doppelstrang-DNA bei der Untersuchung verwendet.
In einer bevorzugten Ausgestaltung kann die DNA vor der chemischen Behandlung zerteilt werden; dabei kann es sich um ein beliebiges, nach dem Stand der Technik übliches Mittel handeln, insbesondere mit Restriktionsendonukleasen.
Im zweiten Verfahrensschritt wird die genomische DNA-Probe derart chemisch behandelt, dass an der 5'-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base verwandelt werden. Dies wird im folgenden unter "chemischer Vorbehandlung" verstanden.
Die oben beschriebene Behandlung genomischer DNA erfolgt bevorzugt mit Bisulfit (Sulfit, Disulfit) und anschließender alkalischer Hydrolyse, was zu einer Umwandlung nicht methylierter Cytosin-Nukleobasen in Uracil oder eine andere vom Basenpaarungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base führt.
Aus dieser chemisch vorbehandelten genomischen DNA werden Fragmente unter Verwendung von Sätzen von erfindungsgemäßen Primeroligonukleotiden und einer bevorzugterweise hitzestabilen Polymerase amplifiziert. Aus statistischen und praktischen Erwägungen werden bevorzugterweise mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert, die 100-2000 Basenpaare lang sind. Die Amplifikation von mehreren DNA- Abschnitten kann simultan in ein und demselben Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Üblicherweise wird die Amplifikation mittels einer Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens umfasst der Satz von Primeroligonukleotiden mindestens zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils revers komplementär oder identisch zu einem mindestens 18 Basenpaare langen Abschnitt der im Anhang (Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 112) aufgelisteten Basensequenzen sind. Die Primeroligonukleotide sind vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass sie kein CpG Dinukleotid enthalten. In einer besonders bevorzugten Ausführung des Verfahrens ist die Sequenz der besagten Primeroligonukleotide so ausgebildet, dass nur ein gezieltes Annealing und Amplifikation der relevanten prostata-spezifischen DNA erfolgt und damit die Amplifikation von Background- bzw. nicht relevanter DNA minimiert wird. Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird unter Background-DNA genomische DNA verstanden, die kein relevantes, gewebe-spezifisches Methylierungsmuster aufweist, wobei es sich hier bei dem relevanten Gewebe um Prostata- bzw. Prostatakarzinom-Gewebe handelt. Beispiele derartiger, im Beispiel 2 verwendeter Primer enthält die Tabelle 1.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass bei der Amplifikation mindestens ein Primeroligonukleotid an eine Festphase gebunden ist. Die unterschiedlichen Oligonukleotid und/oder PNA-Oligomersequenzen können auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sein, wobei die Festphasenoberfläche bevorzugt aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht, wobei auch andere Materialien, wie Nitrocellulose oder Kunststoffe verwendet werden können.
Die mittels der Amplifikation erhaltenen Fragmente können eine direkt oder indirekt nachweisbare Markierung tragen. Bevorzugt sind Markierungen in Form von Fluoreszenzmarkierungen, Radionukliden oder ablösbaren Molekülfragmenten mit typischer Masse, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden können, wobei bevorzugt ist, dass die erzeugten Fragmente zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen. Der Nachweis kann mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchgeführt und visualisiert werden.
Die im zweiten Verfahrensschritt erhaltenen Amplifikate werden anschließend an ein Array bzw. einen Satz von Oligonukleotiden und/oder PNA-Sonden hybridisiert. Die Hybridisierung erfolgt dabei auf die unten angegebene Art und Weise. Der bei der Hybridisierung verwendete Satz von Sonden besteht bevorzugterweise aus mindestens 10 Oligonukleotiden oder PNA-Oligomeren. Die Amplifikate dienen dabei als Sonden, die an vorher an eine Festphase gebundene Oligonukleotide hybridisieren. Die nicht hybridisierten Fragmente werden anschließend entfernt. Die besagten Oligonukleotide umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von 13 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 5. bis 9. Nukleotid vom 5'-Ende des 13 mers. Für jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden. Die besagten PNA-Oligomere umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von 9 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 4. bis 6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9 mers aus gesehen. Bevorzugt ist für jedes CpG Dinukleotid ein Oligonukleotid vorhanden.
Im fünften Verfahrensschritt entfernt man die nicht hybridisierten Amplifikate.
Im letzten Verfahrensschritt werden die hybridisierten Amplifikate nachgewiesen. Dabei ist bevorzugt, dass an den Amplifikaten angebrachte Markierungen an jeder Position der Festphase, an der sich eine Oligonukleotidsequenz befindet, identifizierbar sind.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass die Markierungen der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen, Radionuklide oder ablösbare Molekülfragmente mit typischer Masse sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden können. Der Nachweis der Amplifikate, Fragmente der Amplifikate oder zu den Amplifikaten komplementären Sonden im Massenspektrometer ist bevorzugt, wobei man die Detektion mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführen und visualisieren kann. Zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer können die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen.
Bevorzugt wird das vorgenannte Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern genomischer DNA verwendet.
Die erfindungsgemäßen Oligomere oder Arrays derselben sowie ein erfindungsgemäßes Kit sollen zur Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose von Prostatatumoren eingesetzt werden. Besonders bevorzugt zur Differentialdiagnose von Prostatatumoren sowie zur Diagnose der Prädisposition für Prostatakrebs. Erfindungsgemäß dient das Verfahren bevorzugt der Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose wichtiger genetischer und/oder epigenetischer Parameter in genomischer DNA, insbesondere zur Anwendung bei der Differentialdiagnose von Prostatatumoren und der Prädisposition für Prostatakrebs.
Das erfindungsgemäße Verfahren findet beispielsweise Anwendung bei der Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose von Prostatatumoren.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 112 sind anwendbar bei der Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose von genetischen und/oder epigenetischen Parametern genomischer DNA, insbesondere zur Anwendung bei der Differentialdiagnose von Prostatatumoren.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums und/oder Therapeutikums zur Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose von Prostatatumoren und -krebs durch Analyse von Methylierungsmustern genomischer DNA. Besonders bevorzugt zur Anwendung bei der Differentialdiagnose von Prostatatumoren. Das Diagnostikum und/oder Therapeutikum ist dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure (Seq. ID 1 bis 112) zu seiner Herstellung verwendet wird, vorzugsweise zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Diagnostikum und/oder Therapeutikum für Prostatakrebs durch Analyse von Methylierungsmustern genomischer DNA; insbesondere zur Anwendung bei der Differentialdiagnose von Prostatatumoren oder der Diagnose der Prädisposition für Prostatakrebs, wobei das Diagnostikum und/oder Therapeutikum mindestens eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung (Seq. ID 1 bis 112), vorzugsweise zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei die mittels der Erfindung erhaltenen bedeutenden genetischen und/oder epigenetischen Parameter in genomischer DNA mit einem anderen Satz genetischer und/oder epigenetischer Parameter verglichen werden können, wobei die Unterschiede als Basis für eine Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen dienen.
Unter dem Begriff "Hybridisierung" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Bindung unter Ausbildung einer Duplex-Struktur eines Oligonukleotids an eine vollständig komplementäre Sequenz im Sinne der Watson-Crick Basenpaarungen in der Proben DNA zu verstehen.
Mit dem Begriff "funktionelle Varianten" sind alle DNA-Sequenzen bezeichnet, die komplementär zu einer DNA-Sequenz sind und unter stringenten Bedingungen mit der Referenzsequenz hybridisieren.
"Genetische Parameter" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Mutationen und Polymorphismen genomischer DNA und zu ihrer Regulation weiterhin erforderliche Sequenzen. Insbesondere sind als Mutationen Insertionen, Deletionen, Punktmutationen, Inversionen und Polymorphismen und besonders bevorzugt SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) zu bezeichnen.
"Epigenetische Parameter" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind insbesondere Cytosin- Methylierungen und weitere chemische Modifikationen von DNA-Basen genomischer DNA und zu deren Regulation weiterhin erforderliche Sequenzen. Weitere epigenetische Parameter sind beispielsweise die Acetylierung von Histonen, die mit dem beschriebenen Verfahren nicht direkt analysiert werden kann, sondern wiederum mit der DNA-Methylierung korreliert.
Die Erfindung soll nun im folgenden anhand der Sequenzen und Beispiele unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung weiter verdeutlicht werden, ohne dass die Erfindung hierauf eingeschränkt wird.

Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1

Fig. 1 zeigt die Trennung von benigner Prostatahyperplasie (1) und Prostatakarzinomen (2). Rot entspricht einer hohen Methylierungswahrscheinlichkeit, Schwarz steht für Unbestimmtheit und Grün bezeichnet eine geringe Wahrscheinlichkeit. Die Markierungen auf der linken Seite der graphischen Darstellung sind Gen- und CpG-Identifikatoren. Die Markierungen auf der rechten Seite geben die Signifikanz (p-Wert) der Differenz zwischen den Mittelwerten der beiden Gruppen wieder. Jede Reihe entspricht einem einzigen CpG und jede Spalte den Methylierungsgraden einer Probe. Die CpGs sind nach ihrem Beitrag zur Unterscheidung zur Differentialdiagnose der beiden Läsionen geordnet, wobei der Beitrag von oben nach unten ansteigt.

Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 112

Sequenzen mit ungeraden Sequenznummern (z. B. Seq. ID No. 1, 3, 5, . . .) zeigen jeweils Sequenzen der chemisch vorbehandelten genomischen DNAs. Sequenzen mit geraden Sequenznummern (z. B. Seq. ID No. 2, 4, 6, . . .) zeigen jeweils die zu den vorstehenden Sequenzen komplementären Sequenzen (z. B. ist die zu Seq. ID No. 1 komplementäre Sequenz Seq. ID No. 2, zu Seq. ID No. 3 ist die komplementäre Sequenz Seq. ID No. 4 usw.) der chemisch vorbehandelten genomischen DNAs.

Seq. ID No. 113 bis Seq. ID No. 116

Seq. ID No. 113 bis Seq. ID No. 116 zeigen Sequenzen von in Beispiel 1 verwendeten Oligonukleotiden.
Das folgende Beispiel bezieht sich auf ein Fragment eines Gens, hier TGF-alpha in dem eine bestimmte CG-Position auf ihren Methylierungsstatus hin untersucht wird.

Beispiel 1

Methylierungsanalyse des Gens TGF-alpha

Das folgende Beispiel bezieht sich auf ein Fragment des Gens TGF-alpha, in dem eine bestimmte CG-Position auf Methylierung zu untersuchen ist.
Im ersten Schritt wird eine genomische Sequenz unter Verwendung von Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) derart behandelt, dass alle nicht an der 5-Position der Base methylierten Cytosine so verändert werden, dass eine hinsichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedliche Base substituiert wird, während die an der 5- Position methylierten Cytosine unverändert bleiben.
Wird für die Reaktion Bisulfit-Lösung verwendet, so findet an den nicht methylierten Cytosinbasen eine Addition statt. Zudem müssen ein denaturierendes Reagenz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zugegen sein. Eine anschließende alkalische Hydrolyse führt dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin-Nukleobasen in Uracil. Mit der chemisch umgewandelten DNA werden dann methylierte Cytosine nachgewiesen. Im zweiten Verfahrensschritt verdünnt man die behandelte DNA-Probe mit Wasser oder einer wässrigen Lösung. Bevorzugt wird anschließend eine Desulfonierung der DNA durchgeführt. Im dritten Verfahrensschritt amplifiziert man die DNA-Probe in einer Polymerasekettenreaktion, bevorzugt mit einer hitzebeständigen DNA-Polymerase. Im vorliegenden Fall werden Cytosine des Gens TGF-alpha untersucht. Dazu wird mit den spezifischen Primeroligonukleotiden GGTTTGTTTGGGAGGTAAG (Seq. ID 113) und CCCCCTAAAAACACAAAA (Seq. ID No. 114) ein definiertes Fragment der Länge 531 bp amplifiziert. Dieses Amplifikat dient als Probe, die an ein vorher an eine Festphase gebundenes Oligonukleotid unter Ausbildung einer Duplexstruktur hybridisiert, beispielsweise GTTTTTTTCGTTTTAGAG (Seq. ID No. 115), wobei sich das nachzuweisende Cytosin an Position 188 des Amplifikats befindet. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts beruht auf Cy3 und Cy5 fluoreszenzmarkierten Primeroligonukleotiden, die für die Amplifikation verwendet wurden. Nur wenn in der mit Bisulfit behandelten DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt es zu einer Hybridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit dem Oligonukleotid. Somit wird der Methylierungsstatus des jeweiligen zu untersuchenden Cytosins vom Hybridisierungsprodukt abgeleitet.
Zur Überprüfung des Methylierungsstatusses der Position wird eine Probe des Amplifikats weiterhin an ein anderes, vorher an eine Festphase gebundenes Oligonukleotid hybridisiert. Mit Ausnahme der betrachteten Position ist das besagte Oligonukleotid mit dem zuvor zur Untersuchung des Methylierungsstatusses der Probe verwendeten Oligonukleotid identisch.
An der zu untersuchenden Position enthält das besagte Oligonukleotid im Gegensatz zu einer Cytosinbase eine Thyminbase, d. h. GTTTTTTTTGTTTTAGAG (Seq. ID No. 116). Daher findet die Hybridisierungsreaktion nur statt wenn an der zu untersuchenden Stelle ein unmethyliertes Cytosin vorgelegen hat.

Beispiel 2

Differenzierung von Prostatatumoren

Um einen Bezug der Methylierungsmuster zu einer spezifischen Tumorart durchzuführen, bedarf es zunächst der Untersuchung der DNA-Methylierungsmuster zweier Gruppen von Patienten mit alternativen Tumorformen, hier eine Gruppe mit benigner Prostatahyperplasie und eine Gruppe mit Prostatakarzinomen. Diese Untersuchungen wurden analog dem Beispiel 1 durchgeführt. Die so erhaltenen Ergebnisse werden in einer Datenbank abgespeichert und die CpG Dinukleotide identifiziert, die zwischen den beiden Gruppen unterschiedlich methyliert sind. Dies kann durch Bestimmung einzelner CpG Methylierungsraten erfolgen, wie dies z. B. durch Sequenzieren möglich ist, was ein relativ ungenaues Verfahren zur Quantifizierung der Methylierung an einer bestimmten CpG darstellt, oder aber sehr genau durch eine methylierungssensitive "Primer-Extension-Reaktion". In einer besonders bevorzugten Variante kann der Methylierungsstatus von Hunderten oder Tausenden von CpGs auf einem Oligomer-Array untersucht werden. Ebenso können die Muster können z. B. mittels Clustering-Analysen, die z. B. durch einen Rechner durchgeführt werden können, verglichen werden.
Alle klinischen Proben wurden während einer Operation gewonnen, d. h. in einer routinemäßigen klinischen Situation (Santourlidis, S., Prostate 39: 166-174, 1999, Florl, A. R., Br. J. Cancer 80: 1312-1321, 1999). Eine Auswahl an genomischen Fragmenten aus 56 verschiedenen (in Tabelle 1 aufgeführten) Genen wurde gemäß Beispiel 1 mit Bisulfit behandelt und mittels PCR amplifiziert. Die genomische DNA wurde mit den in Tabelle 1 aufgeführten Primerpaaren amplifiziert. Wie für den Fachmann offensichtlich ist, sind jedoch auch andere Primer verwendbar, welche die Genomische auf geeignete Weise amplifizieren und deren Aufbau für den Fachmann offensichtlich ist. Besonders bevorzugt sind jedoch die Primerpaare wie sie in Tabelle 1 aufgeführt sind. Optimale Ergebnisse wurden durch Verwendung von mindestens 8 CpG Dinukleotiden erzielt, wobei sich die aufschlussreichsten CpG Positionen für diese Unterscheidung innerhalb der Gene TGF-alpha und POMC befinden. Die meisten anderen CpGs dieser Auswahl zeigten auch unterschiedliche Methylierungsmuster zwischen den beiden Phänotypen. Die Ergebnis zeigen, dass Methylierungsfingerprints die Differentialdiagnose von soliden malignen Tumoren zur Verfügung stellen können und daher in einer großen Zahl klinischer Situationen angewendet werden könnten. Fig. 1 zeigt die Anwendung des beschriebenen Verfahrens zur Unterscheidung benigner Prostatahyperplasie von Prostatakarzinomen. Tabelle 1 Liste der Gene und Primeroligonukleotide gemäß Beispiel 2

Claims

1. Nukleinsäure, umfassend eine mindestens 18 Basen lange Sequenz eines Abschnitts der chemisch vorbehandelten genomischen DNA gemäß einer der Sequenzen aus der Gruppe der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 112 und zu deren komplementären Sequenzen.

2. Oligomer, insbesondere Oligonukleotid oder Peptide Nucleic Acid (PNA)-Oligomer, wobei das besagte Oligomer jeweils mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von 9 Nukleotiden umfasst, die an eine chemisch vorbehandelte genomische DNA gemäß einer der Seq. ID No 1 bis 112 gemäß Anspruch 1 hybridisiert oder mit dieser identisch ist.

3. Oligomer gemäß Anspruch 2, wobei die Basensequenz mindestens ein CpG Dinukleotid umfasst.

4. Oligomer gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass sich das Cytosin des CpG Dinukleotids in etwa im mittleren Drittel des Oligomers befindet.

5. Satz von Oligomeren, umfassend mindestens zwei Oligomere gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4.

6. Satz von Oligomeren gemäß Anspruch 5, umfassend Oligomere zur Detektion des Methylierungszustandes aller CpG Dinukleotide innerhalb einer der Sequenzen gemäß der Seq. ID No. 1 bis 112 gemäß Anspruch 1, und zu deren komplementären Sequenzen.

7. Satz von mindestens zwei Oligonukleotiden gemäß Anspruch 2, die als Primeroligonukleotide zur Amplifikation von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID 112 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Sequenzen einer chemisch vorbehandelten DNA von Genen gemäß Anspruch 2 und zu deren komplementären Sequenzen, oder Abschnitten davon eingesetzt werden können.

8. Satz von Oligonukleotiden gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Oligonukleotid an eine Festphase gebunden ist.

9. Verwendung eines Satzes von Oligomersonden, umfassend mindestens zehn der Oligomere gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 zur Detektion des Cytosin- Methylierungszustandes und/oder von Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs) in einer chemisch vorbehandelten genomischen DNA gemäß Anspruch 1.

10. Verfahren zur Herstellung einer auf einem Trägermaterial fixierten Anordnung von unterschiedlichen Oligomeren (Array) zur Analyse von in Zusammenhang mit dem Methylierungszustand der CpG Dinukleotide einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID 112 und zu deren komplementären Sequenzen stehenden Erkrankungen, bei dem mindestens ein Oligomer gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4 an eine feste Phase gekoppelt wird.

11. Anordnung von unterschiedlichen Oligomeren (Array) die gemäß Anspruch 10 erhalten werden kann.

12. Array von unterschiedlichen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass diese auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind.

13. Array gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphasenoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht.

14. DNA- und/oder PNA-Array zur Analyse von in Zusammenhang mit dem Methylierungszustand von Genen stehenden Erkrankungen, der mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der voranstehenden Ansprüche umfasst.

15. Verfahren zur Bestimmung genetischer und/oder epigenetischer Parameter zur Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose von Prostatatumoren oder der Prädisposition für Prostatakrebs durch Analyse von Cytosin-Methylierungen, dadurch gekennzeichnet, dass die folgenden Schritte durchgeführt werden:

a) es wird eine biologischen Probe gewonnen, die genomische DNA enthält

b) die genomischen DNA wird extrahiert

c) in der genomischen DNA-Probe werden durch chemische Behandlung an der 5- Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base umgewandelt; und

d) aus dieser chemisch vorbehandelten genomischen DNA werden Fragmente unter Verwendung von Sätzen von Primeroligonukleotiden gemäß Anspruch 8 oder 9 und einer Polymerase amplifiziert, wobei die Amplifikate eine nachweisbare Markierung tragen.

16. Verfahren zur Bestimmung genetischer und/oder epigenetischer Parameter zur Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose von Prostatatumoren oder der Prädisposition für Prostatakrebs durch Analyse von Cytosin-Methylierungen, dadurch gekennzeichnet, dass die folgenden Schritte durchgeführt werden:

a) es wird eine biologischen Probe gewonnen, die genomische DNA enthält

b) die genomischen DNA wird extrahiert

c) in der genomischen DNA-Probe werden durch chemische Behandlung an der 5- Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base umgewandelt;

d) aus dieser chemisch vorbehandelten genomischen DNA werden Fragmente unter Verwendung von Sätzen von Primeroligonukleotiden gemäß Anspruch 8 oder 9 und einer Polymerase amplifiziert, wobei die Amplifikate eine nachweisbare Markierung tragen;

e) der Methylierungsstatus einer oder mehrerer Cytosin-Positionen wird identifiziert; und

f) der Methylierungsstatus der Cytosin-Positionen wird analysiert durch Bezugnahme auf einen oder mehrere Datensätze.

17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass im Amplifikationsschritt bevorzugt DNA amplifiziert wird, die in Prostatazellen aufgrund des spezifischen genomischen Methylierungsstatusses von Prostatazellen von besonderem Interesse ist im Gegensatz zur Background-DNA.

18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass man die chemische Behandlung mittels einer Lösung eines Bisulfits, Hydrogensulfits oder Disulfits durchführt.

19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert werden, die 100-2000 Basenpaare lang sind.

20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten in einem Reaktionsgefäß durchgeführt wird.

21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerase eine hitzebeständige DNA-Polymerase ist.

22. Verfahren gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt wird.

23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen sind.

24. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen der Amplifikate Radionuklide sind.

25. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet dass die Markierungen der Amplifikate ablösbare Molekülfragmente mit typischer Masse sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden.

26. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikate oder Fragmente der Amplifikate im Massenspektrometer nachgewiesen werden.

27. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 25 und/oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen.

28. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass man die Detektion mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführt und visualisiert.

29. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass die genomische DNA aus Zellen oder Zellbestandteilen erhalten wird, welche DNA enthalten, wobei Quellen von DNA z. B. Zelllinien, histologische Objektträger, Biopsien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, Lymphflüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, beispielsweise Prostata- oder lymphatisches Gewebe und alle möglichen Kombinationen hiervon umfassen.

30. Kit, umfassend ein Bisulfit (= Disulfit, Hydrogensulfit) Reagenz sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4.

31. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, eines Oligonukleotids oder PNA- Oligomers gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, eines Kits gemäß Anspruch 30, eines Arrays gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14, eines Satzes von Oligonukleotiden gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 zur Klassifizierung, Differenzierung und/oder Diagnose von Prostataläsionen oder der Prädisposition für Prostatakarzinome.

32. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, eines Oligonukleotids oder PNA- Oligomers gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, eines Kits gemäß Anspruch 30, eines Arrays gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14, eines Satzes von Oligonukleotiden gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 zur Therapie von Prostatakarzinomen.

33. Kit, umfassend ein Bisulfit (= Disulfit, Hydrogensulfit) Reagenz sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4.