DE10111392A1 - Bioanalytisches Messverfahren unter Verwendung von Oxidasen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft biologische Bestimmungsverfahren unter Verwendung von Enzymen aus der Gruppe der Oxidasen und unter Verwendung von optischen Indikatoren aus der Gruppe Lanthanoiden-Liganden-Komplexe. Die durch Oxidasen bewirkte Freisetzung von Wasserstoffperoxid bewirkt eine Änderung in den optischen, insbesondere lumineszenz-optischen Eigenschaften der Indikatoren. Damit sind Enzyme, Enzymsubstrate, Enzymhemmer oder Enzymaktivatoren auf verbesserte Weise nachweisbar bzw. bestimmbar. Über die Verwendung von Oxidasen als Marker in immunologischen oder genetischen Nachweis-Verfahren sind auch Antigene und Nucleinsäure-Oligomere nachweisbar bzw. bestimmbar. Der Vorteil der erfindungsgemäßen Indikatoren liegt in deren großen Stokes-Verschiebung und deren Abklingzeiten, die im Mikrosekundenbereich liegen. Damit bietet sich die Möglichkeit, über eine zeitlich auflösende Messung eine störende Untergrundfluoreszenz zuerst abklingen zu lassen und die Fluoreszenz des Indikators erst danach zu bestimmen, was zu extrem niedrigen Nachweisgrenzen führt.

Description

2. Einleitung und Problemstellung

Enzymatische Methoden spielen eine bedeutende Rolle in der Bioanalytik. Zu den häufigsten Fragestellungen gehören zum einen der Nachweis der Anwesenheit eines bestimmten Enzyms, zum anderen die quantitative Bestimmung der Aktivität von Enzymen. Aber auch Substrate, die durch Enzyme umgesetzt werden, können auf diese Weise bestimmt werden. Zu den am häufigsten durchgeführten Verfahren gehören der Nachweis und die Bestimmung von Substraten wie z. B. Glucose, Alkohol, Cholesterin und Triglyceriden. Schließlich können auch Hermmer bzw. Aktivatoren von Enzymen bestimmt werden, indem man deren reaktionsverlangsamenden bzw. reaktionsbeschleunigenden Einfluss quantitativ erfasst. Eine Zusammenfassung findet sich im Buch Enzymatic Methods of Analysis von G. G. Guilbault, Pergamon Press, 1970.

Zwei Arten von Enzymen kommen besonders häufig zur Verwendung, nämlich (a), Dehydrogenasen und (b), Oxidasen. Dehydrogenasen bilden aus NAD⁺ das NADH, und dieses kann über seine charakteristische Absorption bei 345 nm bzw. über seine Fluoreszenz bei 455 nm nachgewiesen werden. Oxidasen hingegen verbrauchen Sauerstoff und bilden Wasserstoffperoxid (H₂O₂; im folgenden als WP bezeichnet). Somit kann die Aktivität einer Oxidase durch Messung des Verbrauches an Sauerstoff oder der Bildung von WP nachgewiesen werden.

Bekanntestes Beispiel für ein Enzym, das in einem Bestimmungsverfahren unter Verwendung von Oxidasen eingesetzt wird, ist die Glucoseoxidase (GOx). Sie setzt Glucose zu Gluconsäurelacton und einer gleich großen molaren Menge an WP um. Über die Bestimmung der WP ist somit eine Quantifizierung der Glucose (z. B. im Blut oder in Getränken) und anderer Substrate von Oxidasen möglich. Man kann Oxidasen auch als Marker in Enzymtests verwenden und weist eine eingetretene Bildung eines Antigen- Antikörper-Komplexes (der dann ebenfalls GOx enthält) über die vorhandene Enzymaktivität nach (z. B. in Immuntests vom Typ eines Sandwich-Assays). Ähnliches gilt für den Nachweis einer eingetretenen Hybridisierungsreaktion zwischen zwei Nucleinsäuresträngen.

Diesen Verfahren haftet aber der Nachteil an, dass sie (a) entweder photometrisch durchgeführt werden müssen, was in stark gefärbten Lösungen unmöglich ist, oder dass (b) die Untergrundfluoreszenz so stark ist, dass sie alle anderen Signale überlagert, oder dass (c) die Messung nur indirekt (nämlich über die Messung des Verbrauchs von Sauerstoff) erfolgt, was nachteilig ist, weil der Sauerstoff-Partialdruck oft nicht bekannt ist oder während der Messung (oder von Probe zu Probe) schwankt. In dieser Schrift wird nun ein Verfahren vorgestellt, das von diesen Nachteilen frei ist.

3. Stand der Technik 3.1. Elektrometrische Bestimmungsverfahren für Oxidasen und deren Substrate

Vadgama, Rosenberg und Christie beschreiben einen elektrochemischen Sensor zur Bestimmung der Reaktionsprodukte von Oxidasen. Er beruht auf der Verwendung eines Permeations-selektiven Mediums und auf dem elektrochemischen Nachweis des gebildeten WPs (Eur. Pat. Appl. 503.943, 1992). In der PCT Anmeldung WO 99.53301 (1999) wird ebenfalls ein elektrochemisch-enzymatisches Verfahren beschrieben, das aber auf der Verwendung von 2 Elektroden (mit unterschiedlichen Membranen) beruht. Amperometrische Glucosemessgeräte sind kommerziell verfügbar.

3.2. Absorptiometrische und reflektometrische Bestimmungsverfahren für Oxidasen und deren Substrate

In letzter Zeit haben optische Verfahren zur Bestimmung von Oxidasen und deren Substraten besonderes Interesse erweckt, da sie einfacher, vor allem aber spezifischer sein können. Sie beruhen meist auf einer irreversiblen chemischen Reaktion zwischen dem von Oxidasen gebildeten WP und einem farblosen Ausgangsstoff (z. B. Dianisidin), der zu einem stark gefärbten Produkt führt, dessen Farbintensität gemessen und mit der vorhandenen Menge an Enzym bzw. Substrat in Beziehung gesetzt werden kann.

Genovesi, Pedersen und Sigel berichten in Proc. SPIE-Int. Soc. Opt. Eng. 990 (1989) 22-28 über einen photometrischen Farbtest für Glucose. Auch aus der US-PS 5.281.395 ist ein Teststreifen bekannt. In der PCT-Anmeldung WO 9805424 (1998) mit dem Titel "Analytical system and method permitting wide variety of different substrates" werden von C. Chow Biosensoren beschrieben, die auf der Bestimmung von Enzymsubstraten über eine irreversible Farbreaktion beruhen.

Einige dieser Verfahren werden kommerziell in sogenannten Teststreifen verwertet, die Auswertung erfolgt reflektometrisch. Allerdings haben alle Verfahren den Nachteil, dass die entstehenden Farbstoffe nicht stabil sind und das Ergebnis dadurch verfälscht werden kann. Darüber berichten z. B. Genshaw & Gunter in einer Arbeit mit dem Titel "Optical bleaching in o-dianisidine glucose tests" in Clin. Chem. 19 (1973) 1227-8.

Matsubara, Yokoi, Nakamichi und Takamura berichten in ihrer Arbeit "Spectrophotometric determination of uric acid in serum using a titanium (IV)-porphyrin complex" in Yakugaki Zasshi - J. Pharmaceutical Soc. Jap. 114 (1994) 48-53, dass gewisse Oxo[5,10,15,20-tetra(4-pyridyl)porphyrinato]titan(IV)-Komplexe mit Harnsäure in Gegenwart des Enzyms Uricase einen gelben Komplex mit einem Absorptions-Maximum bei 432 nm bilden, der zur quantitativen photometrischen (nicht aber fluorimetrischen) Bestimmung der Harnsäure geeignet ist.

3.3. Chemilumineszente Bestimmungsverfahren für Oxidasen

In einem anderen optischen Verfahren wird der Umstand ausgenützt, dass das von Oxidasen gebildete WP mit Reagenzien wie z. B. Luminol (G. L. Kok, T. P. Holler, M. B. Lopez, H. A. Nachtrieb, M. Yuan, Environm. Sci. Technol. 1978, 12, 1072; T. M. Freeman, W. R. Seitz, Anal. Chem. 1978, 50, 1242) bzw. Peroxalaten (P. von Zoomen et al., Anal. Chim. Acta 1985, 167, 249) unter Aussendung einer grünen bzw. blauen Chemilumineszenz reagiert (M. A. DeLuca, W. D. McElroy (eds.) Bioluminescence & Chemiluminescence, Academic Press, New York, 1981).

Es ist des weiteren bekannt, dass 2-wertige Europium-Komplexe Chemilumineszenz aussenden, wenn sie mit Oxidationsmitteln behandelt werden: (a) Elbanowski M, Paetz M., Slawinski J, Ciesla L., "Chemiluminescence of the europium ions-adenine nucleotides system and its possible biological significance", Photochem. Photobiol. 47 (1988) 463-6; (b) Elbanowski M., Kaczmarek M., und Staninski K., "The influence of aminopolycarboxylic acids on the chemiluminescence of the Eu(II)/Eu(III)-H₂O₂ system", J. Alloys Compd. 275-­ 277 (1998) 225-229.

In beiden Fällen handelt es sich aber um Chemilumineszenz, d. h., der Effekt ist nur so lange beobachtbar, solange noch Reagens vorhanden ist. Somit haben alle Methoden auf der Grundlage der Messung von Chemilumineszenz den Vorteil, keine Lichtanregungsquelle zu benötigen, aber den Nachteil, dass die lichtemittierende Spezies (z. B. Luminol) durch eine chemische Reaktion mit der Zeit verbraucht wird.

3.4. Fluoreszente Bestimmungsverfahren für Oxidasen

Der Stand der fluoreszenz-analytischen Techniken wird beschrieben von McNichols & Cote in einem Artikel "Optical glucose sensing in biological fluids: an overview", in J. Biomed. Opt. 5 (2000) 5-16, bzw. von Collins, Munkholm & Slovacek, "Optical oxidative enzyme­ based fluorescent sensors", PCT-Anm. WO 0011205 (2000).

Weber und Stanley berichten in der PCT Anm. WO 0002048 (2000) über einen "Optical sensor for in-situ measurement of analytes" unter besonderer Betonung der Analytik der Glucose. Die PCT-Anm. WO 9855869 (1998) beschreibt ähnliche Glucose- Analyseverfahren: "Method and device for detecting or quantifying carbohydrate-containing compounds". Raskas beschreibt in der US-PS 6.157.442 eine mikro-faseroptische Anordnung für die fluoreszente enzymatische Bestimmung von Glucose durch Messung des Sauerstoffverbrauches.

Chua & Tan berichten über "Plasma glucose measurement with the Yellow Springs Glucose Analyzer", Clin. Chem. 24 (1978) 150-2. Tolosa, Malak, Raob & Lakowicz beschreiben einen "Optical assay for glucose based on the luminescence decay time of the long wavelength dye Cy5", in: Sens. Actuators, B B45 (1997) 93-99. In einem Artikel über "Sol-Gel Based Glucose Biosensors Employing Optical Oxygen Transducers, and a Method for Compensating for Variable Oxygen Background" in Biosensors & Bioelectron. 15 (2000) 69-76 beschreiben Wolfbeis et al. ein fluoreszentes Verfahren, ebenfalls unter Messung des Sauerstoffverbrauches durch das Enzym.

Andere fluoreszenz-optische Verfahren beruhen z. B. auf der irreversiblen Oxidation mancher Phenole zu fluoreszenten Dimeren in Gegenwart von Peroxidase (Y. Hayashi et al. Anal. Chim. Acta 1986, 186, 131) oder von Mangan-Salzen (J. Peinando et al., Talanta 1986, 33, 914). Die entstehenden Reaktionsprodukte müssen mit UV-Licht angeregt werden (was bei chemilumineszenten Verfahren nicht erforderlich ist) und emittieren dann eine hellblaue Fluoreszenz. Zhou, Diwu, Panchuk-Voloshina und Haugland beschreiben in ihrer Arbeit "A stable nonfluorescent derivative of resorufin for the fluorometric determination of trace hydrogen peroxide" (in Anal. Biochem. 253 (1997) 162-168) hingegen eine Reaktion mit einem Derivat des Farbstoffes Resorufin, das bei Einwirkung von WP ein grün fluoreszierendes Produkt ergibt.

Das in enzymatischen Reaktionen gebildete WP auch nachgewiesen werden kann, indem man es unter dem Einfluss von Peroxidase mit p-Hydroxyphenylcarbonsäuren (z. B. p- Hydroxybenzoesäure oder Homovanillinsäure) zur Reaktion bringt. Es bildet sich ein Dimer, das unter UV-Anregung bei 315 nm stark (mit einem Maximum bei ca. 415 nm) fluoresziert, wie von Wang, Schubert & Renneberg in Sensors & Actuators B28 (1995) 3-7 berichtet wird. Leider weisen alle biologischen Materialien unter Anregung bei 315 nm eine stark störende Eigenfluoreszenz auf. Somit leiden alle Tests, die auf der Bildung von fluoreszenten Produkten, die im UV angeregt werden, unter starken Störeffekten durch die Fluoreszenz biologischer Materialien.

Die Empfindlichkeit und Selektivität des Homovanillinsäure-Verfahrens kann gesteigert werden, wenn man das durch WP gebildete Dimer mit Eu(III)-Ionen zu einem besser nachweisbaren Chelat umsetzt, wie Zhen et al. in Analyst 122 (1997) 455 beschreiben. Die Selektivität dieses Verfahrens beruht darauf, dass man wegen der langsamen Abklingzeit der Fluoreszenz des Eu-Chelates den Messvorgang so steuern kann, dass man zuerst die schnell­ abklingende Untergrundfluoreszenz der Probe abklingen läßt und erst danach die spektral deutlich abgetrennte Fluoreszenz des Chelates misst, die somit sehr spezifisch ist. Meyer und Karst berichten in der DE-Offenl. 198 13 247.6 (1998) über ein Verfahren zur Bestimmung von Glucose unter Verwendung der Enzyme Meerrettich-Peroxidase und Glucose-Oxidase sowie der Reagenzien p-Hydroxyphenylpropionsäure und Tb(EDTA). Auch diese Fluoreszenz klingt deutlich langsamer ab als die Untergrundfluoreszenz vieler biologischer Proben.

Dieses Verfahren wurde in Analyst 125 (2000) 1537-1538 genauer beschrieben. Spezifisch wurden Oxidase-Substrate bestimmt, indem man zur Untersuchungslösung als erstes Reagenz die Oxidase zugibt, als zweites Reagenz die p-Hydroxyphenylpropionsäure (pHPPS) und als drittes Reagens das Enzym Peroxidase. Das von der Oxidase gebildete WP reagiert unter dem Einfluss der Peroxidase mit dem pHPPS zu einem Dimer, das dann mit dem 4. Reagens (einem Lanthaniden-Ion) einen lumineszenten Komplex bildet, dessen Fluoreszenz durch Zugabe des 5. Reagenzes (Cäsiumchlorid) verstärkt wird. Diese Verfahren ist sehr empfindlich, aber wegen des Bedarfes von 5 Reagenzien umständlich. Es ist ausserdem irreversibel. Das erfindungsgemäße Verfahren benötigt im Gegensatz dazu als Reagenzien nur die Oxidase und den Lanthanoiden-Komplex.

S. Akyama beschreibt in dem Buch Molecular Luminescence Spectroscopy, Part 3 (S. G. Schulman, ed.), Wiley, New York, 1993, auf S. 241 ff, dass man Xanthin enzymatisch bestimmen kann, indem man es mit dem Enzym Xanthinoxidase oxidiert und das dadurch gebildete WP über den Löscheffekt bestimmt, den es auf den Farbstoff Indocyaningrün ausübt. Piletsky et al. beschreiben in Fresenius J. Anal. Chem. 366 (2000) 807 ein Verfahren zur Bestimmung von Glucose, das darauf beruht, das das vom Enzym Glucoseoxidase bei der Reaktion mit Glucose gebildete WP in Gegenwart eines weiteren Enzyms (nämlich der Peroxidase; Enzym-Catalog Nr. 1.11.1.7.) mit Polyanilin reagiert, dessen Absorptionsspektrum bei <600 nm sich in Folge deutlich verändert. Auf diese Weise wird Glucose photometrisch erfassbar. Zhou et al. beschreiben in Analytical Biochemistry 253 (1997) 162 ein stabiles nicht-fluoreszierendes Derivat des Resorufins (Amplex Red), das durch das Enzym Peroxidase zu einem fluoreszenten Produkt umgesetzt werden kann und zur Bestimmung der Aktivität von Glucose-Oxidase bzw. Monoamin-Oxidase eingesetzt wurde.

3.5. Lanthanidenkomplexe als Marker in Immuntests

Lanthaniden-Liganden-Komplexe weisen als Besonderheit eine sogenannte Energieübertragung auf, die darin besteht, dass die vom Liganden aufgenommene photonische Energie auf das Lanthanoid-Ion übertragen wird und als typische Lanthanoid-Emission abgegeben wird. Diese Lumineszenz ist oft schmalbandig (wenn nicht sogar linienförmig), um bis zu 250 nm langwellig verschoben und hat eine Lebensdauer im Bereich von µs bis zu einigen Millisekunden. Gewisse dreiwertige Ionen der Lanthanoiden-Elemente können als Marker in Lumineszenz-Immuntests verwendet werden. In einem (DELFIA™ genannten) Verfahren wird der Antikörper mit einem nicht fluoreszierenden Lanthanoiden-Ion markiert und nach der Bildung des Immunkomplexes mit zwei Reagenzien (Chelator und Mizellarbildner) versetzt, was zu einem deutlichen Anstieg der Fluoreszenzintensität führt. Das Verfahren wurde von I. Hemmilä in einem Übersichtsartikel mit dem Titel Progress in Delayed Fluorescence Immunoassay beschrieben, der im Buch Fluorescence Spectroscopy: Methods & Applications (Woltbeis, O. S., Ed.; Springer Verlag, Heidelberg, 1993, S. 259-­ 265 erschienen ist. Diamandis und Christopoulos geben in Anal. Chem. 62 (1990) 1149A ebenfalls eine Übersicht.

In einem alternativen Immuntest wird der Lanthaniden-Ligand (z. B. die Phenanthrolin­ dicarbonsäure BCPDA) über eine Avidin-Biotin-Bindungsreaktion zugegeben, danach eine Lösung von Eu(III)-Nitrat. Nach Trocknen wird die Fluoreszenz ausgelesen, vorzugsweise mit Zeitverzögerungen von bis zu einigen 100 µs, um die störende Untergrundfluoreszenz des biologischen Materials zuerst abklingen zu lassen. Eine Übersieht wurde von Evangelista et al. in Clinical Biochemistry 21 (1988) 173 verfasst.

In all diesen Verfahren wird ein Lanthanoid eingesetzt, das als Marker angesehen werden kann und kovalent an ein Protein geknüpft werden muss. In der vorliegenden Schrift wird ein lumineszenz-optisches Verfahren vorgestellt, das keine kovalente Knüpfung des Lanthanoidenreagenzes erfordert. Es erlaubt vielmehr auf ganze einfache und neue Weise die Bestimmung der Aktivität von Oxidasen und der Konzentration von Biomolekülen durch einfache Zugabe eines Reagenzes. Auch das in anderen Fällen notwendige Enzym Peroxidase wird nicht benötigt, und es ist nur ein Reagens zuzugeben. Das Verfahren beruht auf der Bestimmung einer zeitlich konstanten Photolumineszenz und nicht auf der Bestimmung einer mit der Zeit abnehmenden Chemilumineszenz.

4. Die neue Gruppe von Indikatoren

Es wurde überraschenderweise gefunden, dass während der katalytischen Aktivität von Oxidasen sowohl die Absorption als auch die Lumineszenz bestimmter anwesender Lanthaniden-Komplexe verändert werden. Die derart beeinflussten Lanthanidenkomplexe besitzen die folgende chemische Struktur

Ln(III)_x - Lig_y

worin
Ln(III) für ein 3-wertiges Ion der Elemente Europium, Terbium, Samarium, Lanthan, Dysprosium oder Holmium steht,
Lig für für das Strukturelement

R¹-CO-C(R²)=C(X)-R³

steht, worin
maximal 2 der Reste R für H stehen können,
X für OH, NHR⁴, NR⁴ ₂, stehen kann,
R¹-R³ für H, (Cyclo)alkyl, (Cyclo)alkanoyl- oder Aroyl, CF₃, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest oder Akanoylrest, für OH, NH₂, Alkylamino oder Dialkylamino,
R⁴ für H, Alkyl oder Aryl stehen können, wobei
jeder der Reste R¹-R⁴ über einen (gegebenenfalls substituierten) carbocyclischen bzw. heterocyclischen Ring mit einem der anderen Reste R¹-R⁴ verbunden sein kann, und das Verhältnis x : y zwischen 10 : 1 und 1 : 3 liegen kann.

Bevorzugte Ionen sind jene des Europiums, Terbiums und Holmiums. Bevorzugte Liganden sind Benzoylaceton, Benzoyl-trifluoroaceton, Dibenzoylmethan, Thenoyl-trifluoroaceton, heterocyclische (ortho-Hydroxy-)Carbonsäuren, aromatische oder heterocyclische ortho- Hydroxyketone und deren Derivate, Hydroxychinone und teilweise hydrierte und substituierte Hydroxychinon-artige Verbindungen und annelierte Carbocyclen einschließlich des Tetracyclins und seiner Derivate.

Ein bevorzugtes Reagenz ist der Europium-Tetracyclin-Komplex (EuTc), auf den WP einen besonders starken Effekt ausübt. Dies ist in Fig. 1 dargestellt. Das EuTc zeigt die typischen spektralen Eigenschaften eines Europium-Liganden-Komplexes. Sein Absorptionsmaximum liegt bei 395-405 nm, seine Absorbanz (ε) steigt in Gegenwart von WP deutlich an und dies kann zur Bestimmung von Oxidase-katalysierten Reaktionen herangezogen werden.

Die Emission des EuTc zeigt im sichtbaren Spektralbereich die charakteristischen Linien um 615 nm. Die Lumineszenz kann am wirksamsten mit Licht der Wellenlängen zwischen 300 und 420 nm angeregt werden. Dies geschieht in den beanspruchten Verfahren vorzugsweise mittels einer Leuchtdiode. Sie wird durch WP stark verstärkt. Auch die Fluoreszenz anderer Lanthanoidenkomplexe wird durch WP beeinflusst, wie in den Fig. 2-4 für die Ionen Dysprosium, Holmium und Samarium gezeigt.

5. Die neuen Bestimmungsverfahren 5.1. Nachweis und Bestimmung von Oxidase-Aktivitäten

Die erfindungsgemäßen Indikatoren können sowohl zum Nachweis als auch zur Bestimmung der Aktivitäten von Oxidasen eingesetzt werden. Oxidasen sind Enzyme, die Sauerstoff als Zweitsubstrat oxidieren und WP produzieren. Im Enzymkatalog haben sie die Nr. 1.x.3, wobei die Zahl 1 anzeigt, dass es sich um ein Enzym aus der Gruppe der Oxidoreduktasen handelt, die Zahl n für die jeweilige Substratgruppe steht (meist 1-14), und die Zahl 3 anzeigt, das es sich um eine Oxidase handelt.

Zum erfindungsgemäßen Nachweis der Anwesenheit eines Enzymes wird zuerst ein erfindungsgemäßes Reagenz zugegeben, danach das entsprechende Enzym-Substrat. Danach wird die Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von vorzugsweise 330-415 nm angeregt und die Emissionsintensität bei ca. 600-630 nm detektiert. Fig. 5 zeigt den Nachweis der Aktivität zweier Enzyme (GOx bzw. GalOx) in Vertiefungen von Mikrotiterplatten durch Zugabe von Reagenz und Substrat und anschließender fluorimetrischer Vermessung der Mikrotiterplatte.

5.2. Bestimmung von Substraten für Enzyme aus der Gruppe der Oxidasen

Als Oxidasen bezeichnet man Enzyme aus der Gruppe der Oxidoreduktasen, die Sauerstoff als zweites Substrat akzeptieren. Sie oxidieren ihr Substrat unter Verbrauch von Sauerstoff und unter Bildung von WP. So wird zum Beispiel die Glucose ("Blutzucker") durch das Enzym Glucose-Oxidase (GOx) nach folgender Reaktionsgleichung oxidiert:

Pro umgesetztem Molekül Glucose wird ein Molekül WP gebildet. Über die Messung der gebildeten Menge an WP kann man somit Glucose bestimmen. Die Bestimmung erfolgt üblicherweise kinetisch, das heißt, man verfolgt die Kinetik der Bildung des WP über die Zeit, typischerweise 1-5 Minuten.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen erweisen sich als für die Bioanalytik von Substraten der Oxidasen geeignet. Fig. 6 zeigt die Änderung der Emission über die Zeit als Funktion der in der Probe herrschenden Glucosekonzentration. Aus der Auftragung der Änderung der Emission pro Zeiteinheit (ΔI/Δt) gegen die Glucosekonzentration ergibt sich, dass Glucose im Konzentrationsbereich zwischen 2 und 50 mMol/L quantitativ bestimmt werden kann (Fig. 7).

5.3. Bestimmung anderer Substrate

Auch Substrate, die nicht direkt durch Oxidasen umgesetzt werden, sind einer Bestimmung mittels der erfindungsgemäßen Indikatoren zugänglich, nämlich dann, wenn das Substrat zuerst durch eine Nicht-Oxidase zu einem Produkt abgebaut wird, das wiederum ein Substrat für eine Oxidase ist und von dieser unter Bildung von WP weiter abgebaut werden kann. Eine typische Enzymkaskade dieser Art ist im Folgenden für das klinisch signifikante Creatinin dargestellt:

Creatinin + Creatin-Amidohydrolase ⇒ Creatin
Creatin + Creatinase ⇒ Sarcosin + Harnstoff
Sarcosin + Sarcosin-Oxidase + O₂ ⇒ Glycin + Formaldehyd + H₂O₂ (WP)

Nach dem gegenwärtigen Stand der Technik erfolgt die Bestimmung des Creatinins in einer umständlichen Reaktionssequenz unter Verwendung eines weiteren Enzyms (Peroxidase) und Bildung eines Farbstoffes aus den Reagenzien Amino-Antipyrin und 2,4,6-Tribrom-3- hydroxybenzoesäure (Goren et al., Clinical Chemistry 32 (1986) S. 548-551). Mittels der erfindungsgemäßen Indikatoren wird das Verfahren deutlich einfacher nachweis- und quantifizierbar, da nur das Lanthanoiden-Reagens, aber keine Peroxidase zugegeben werden muss. Konkrete Beispiele werden im Abschnitt 6 gegeben.

5.4. Immunoassays

Glucoseoxidase (GOx), Galactoseoxidase (GalOx) und andere Oxidasen werden in optischen Immuntesten als Marker eingesetzt. In einem typischen Verfahren wird ein Antikörper mit einer Oxidase markiert (im Folgenden gekennzeichnet mit einem Stern). Findet der so markierte Antikörper (*Ak) nun ein entsprechendes Antigen (Ag), so kommt es zur Bildung eines *Ak/Ag-Komplexes, der aber auch die Oxidase enthält und über deren Aktivität nachgewiesen werden kann. Papkovsky, O'Riordan & Guilbault beschreiben z. B. in ihrer Arbeit mit dem Titel "An Immunosensor Based on the Glucose Oxidase Label and Optical Oxygen Detection", in Anal. Chem. 71 (1999) S. 1568-1573 einen derartigen Test. Zur Messung der Aktivität des Enzyms GOx wird ein Sauerstoff-Sensor eingesetzt und der durch die enzymatische Aktivität verursachte Sauerstoffverbrauch gemessen. Diese Methode gibt die Enzym-Aktivität aber nur dann eindeutig wieder, wenn der Sauerstoffgehalt von Probe und Standard gleich sind, was nicht immer gewährleistet ist.

Mit Hilfe der erfindungsgemässen Indikatoren für WP ist es nun erstmalig auch möglich, in Immuntesten vom Typ des ELISA die Bildung von WP direkt und bei variabler Sauerstoffsättigung nachzuweisen. Ein konkretes Beispiel wird weiter hinten gegeben.

5.5. Hybridisierungsassays

Hybridisierungsassays spielen eine wichtige Rolle beim Nachweis genetisch veränderter DNA, dies vor allem in der medizinischen Diagnose, in der Forensik und beim Nachweis gentechnisch veränderter Nahrungsmittel. Bei derartigen Assays ist die eintretende (oder ausbleibende) Bildung eines Doppelstranges aus zwei komplemetären (oder eben nicht- komplementären) Einzelsträngen nachzuweisen. Da eine derartige Hybridisierung in komplexen Proben schwer direkt photometrisch nachzuweisen ist, bedient man sich auch hier fluoreszenter Markierungsmethoden.

Durch Markierung einer DNA, oder eines Teilstranges einer DNA, mit einer Oxidase hat man, ähnlich wie beim Immuntest, die Möglichkeit des Nachweises einer eintretenden Hybridisierung, indem man über die enzymatische Aktivität das gebildete WP mittel der erfindungsgemäßen Indikatoren nachweist. In einem typischen Verfahren wird ein amino- modifiziertes Oligomer mit einer Oxidase markiert. Findet dieses erste, markierte Oligomer (Oli-1) nun sein entsprechendes Gegenstück (Oli-2), so kommt es zur Bildung eines Duplexes, der aber auch die Oxidase enthält und über deren Aktivität nachgewiesen werden kann.

5.6. Biosensoren

Das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren kann auch durchgeführt werden, wenn der Indikator (oder das Enzym, oder beide) nicht in Lösung, sondern immobilisiert vorliegen. Indikator und Oxidase können entweder in eine Polymermembran eingebettet vorliegen, oder oberflächlich immobilisiert vorliegen. Das Polymer muss allerdings (a) den Indikator (bzw. das Enzym) so zurückhalten können, dass sie nicht ausgewaschen werden, aber (b) die Eindiffusion des Enzymsubstrates zulassen, damit es im Inneren der Membran zu einer Bindung kommen kann.

Derartige dünne Schichten wurden schon bisher in irreversiblen Farbtests verwendet und als Teststreifen bezeichnet (Sonntag, Trockenchemie: Analytik mit träger-gebundenen Reagenzien, Thieme Verlag, Stuttgart, 1988). Sie besitzen den Vorteil, dass sie die Untersuchung optisch intransparenter Proben (z. B. Blut) ermöglichen, da die Eigenfarbe der Probe nicht mehr stört, was im Gegensatz zum Test in fluider Lösung steht, wo eine Untersuchung stark gefärbter Untersuchungsmaterialien wegen der Eigenabsorption des Probenmaterials nicht möglich ist.

Fig. 8 zeigt einen Querschnitt durch derartige Sensormembranen. In einer Ausführung befindet sich auf einer inerten, aber optisch transparenten Polyester-Schicht eine einzige Sensorschicht (bestehend z. B. aus einem Hydrogel mit darin enthaltenem EuTc und GOx). In einer anderen Ausführung besteht der Biosensor aus zwei Schichten, nämlich einer aus Hydrogel mit darin enthaltenem Lanthanoiden-Reagenz, und einer zweiten darüber, bestehend aus GOx, die auf einen Träger (z. B. ein Nylonnetz) immobilisiert worden war. Die Fluoreszenz des Eu-Tc wird von der Polyesterseite aus abgetastet, indem man bei der Anregungswellenlänge λ_ex von 405 nm einstrahlt und die Emission bei einer Wellenlänge λ_em von ca. 615 nm vermisst. Die Probe ("sample") befindet sich in Kontakt mit der Sensorschicht. Wenn Glucose in die Sensorschicht eindringt, bildet sich durch enzymatische Oxidation WP, und dieses wird durch durch einen erfindungsgemäßen Indikator angezeigt. Ein Beispiel für die Herstellung eines Sensors wird in Abschnitt 6. gegeben.

Das Ansprechverhalten einer Sensormembran nach Fig. 8 ist in Fig. 9 dargestellt. Dazu wurde eine 1%-ige Lösung von WP in Puffer von pH 6.9 über die Sensormembran gepumpt und das Fluoreszenzsignal über die Zeit aufgetragen. Der anfängliche Abfall resultiert aus einer eingedrungenen Luftblase.

Bestimmungsverfahren für andere Substrate werden erhalten, indem man entsprechende andere Enzyme einsetzt. Dazu gehören unter anderem die Oxidasen für Lactat, Ethanol, Bilirubin, Cholesterol, verschiedene Aminosäuren (z. B. Glutamat und Lysin) sowie Amine (einschl. Catecholamine), Hydroxy-Phenole (einschliesslich Tyrosin) und (Hypo)xanthin, Harnsäuren und deren chemische Verwandte.

Derartige Sensoren werden zur Zeit am häufigsten für nicht-invasive Bestimmungen eingesetzt. Zu den Probenmaterialien gehören Blut, Serum, Speichel, Urin, Milch, Fruchtsäfte, Most, Fleisch, Fisch und Bioreaktorflüssigkeiten, um nur die Wichtigsten zu nennen. In der Medizin will man aber Messungen auch in-vivo vornehmen können. Um dies zu ermöglichen, bringt man die obige polymere Reaktionsschicht (mit darin oder darauf enthaltener GOx) auf der Spitze eines faseroptischen Lichtleiters an. Auf diese Weise erhält man faseroptische Sensoren, wie sie in der Literatur für andere Systeme beschrieben sind (O. S. Wolfbeis, Fiber Optic Chemical Sensors and Biosensors, CRC Press, Boca Raton, Florida, 1991).

6. Beispiele 6.1. Herstellung eines typischen Lanthaniden-Reagenzes (Eu-Tc)

Zur Herstellung des Puffers löst man 1,48 g MOPS Na⁺-Salz (Fluka AG) in 490 mL destill. Wasser, bringt den pH-Wert der Lösung mit wenig 70%-iger Perchlorsäure auf pH 6,9 und füllt auf 500 mL Endvolumen auf. Die Reagenslösung erhält man, indem man 4,0 mg Tetracyclin-Hydrochlorid (Fluka AG) und 9,6 mg EuCl₃-Hexahydrat (Alfa) in 100 mL des obigen Puffers löst. Das Reagens kann in trockener Form erhalten werden, indem man das gelöste Reagens ohne Pufferzusatz herstellt und die Lösung danach gefriertrocknet. Andere Mengenverhältnisse zwischen Tetracyclin und Europium-Ion sind möglich.

6.2. Enzymatische Bestimmung von Glucose in Serum Glucose-Oxidase-Stammlösung

Man löst 2,0 mg GOx (50 000 units, von Sigma) in 10 mL MOPS-Buffer.

Bestimmungsverfahren

In eine Fluoreszenzküvette füllt man 1 mL des Reagenzes, 1 mL des hinsichtlich Glucose zu bestimmenden Serums (mit einem Gehalt von 3-50 mMol/L Glucose) und danach 1 mL der GOx-Stammlösung. Man verfolgt die Zunahme der Fluoreszenzintensität über die Zeit ab dem Zeitpunkt der Zugabe der GOx. Der Anstieg der Fluoreszenz nach einer definierten Zeit, z. B. nach 3 min. ist ein Maß für die im Serum vorhandene Konzentration an Glucose. Der genaue Wert kann anhand vorab mit Hilfe von Standardlösungen ermittelter Kalibrationskurven (Fig. 7) berechnet werden.

6.2.1. Bestimmung von Xanthin Prinzip

Xanthin (+ Xanthin-Oxidase) ⇒ Harnsäure + H₂

O₂

Die Menge an gebildetem WP ist von der Konzentration an Xanthin abhängig und kann mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Reagenzes nachgewiesen werden.

Bestimmungsverfahren

Man pipettiert in eine 5-mL-Küvette 1 mL der Reagenz-Lösung (siehe 6.1.) und 1 mL einer Lösung von 4,5 Enzym-Einheiten Xanthin-Oxidase (Sigma; E. C. Nr. 1.1.3.22.) in 10 mL eines 0.015 molaren Phosphat-Puffers. Danach fügt man 1 mL der auf Xanthin zu analysierenden Lösung (die ca. zwischen 0.5 und 5 mM an Xanthin enthalten soll) und misst unmittelbar danach den Anstieg der Fluoreszenz zwischen 600 und 640 nm unter Lichtanregung bei 400-410 nm. Der Anstieg der Fluoreszenz über die Zeit ist ein Maß für die Xanthin-Konzentration. Die Daten für die Aufstellung einer Kalibrationskurve werden erhalten, indem man anstelle der zu analysierenden Lösung verdünnte Lösungen von Xanthin im gleichen Puffer (mit einem Xanthingehalt zwischen 0.1 und 10 mM) einsetzt. Eine Kalibrationskurve erhält man durch Auftragung der Fluoreszenzänderung (ΔF) pro Zeit (2-5 min) gegen die Konzentration an Xanthin.

6.2.2. Bestimmung von Glucose in Serum mit Hilfe eines automatisierten Fließsystems unter Verwendung von immobilisierter Glucoseoxidase und eines WP-Sensors Prinzip

Glucose (+ GOx) ⇒ Gluconolacton + H₂

O₂

Bestimmungsverfahren

Es wurde ein Fließinjektionssystem der Fa. Eppendorf (Hamburg) eingesetzt. Als Fließlösung diente ein HEPES-Puffer von pH 6.9. Die Probenvorbereitung erfolgte dadurch, dass die zu untersuchenden Humansera mit HEPES-Puffer (pH 6.9) 1 : 1 verdünnt wurden. Die Glucoseoxidase (GOx) wurde auf folgende Weise auf Agarose immobilisiert: GOx wurde mit dem Reagens Biotin-amidocaproat-NHS-ester (Sigma, Prod. Nr. B 2643) nach Vorschrift umgesetzt und die so biotinylierte GOx (jetzt auch käuflich erhältlich; Sigma G 7779) an Agarosekörnchen ("beads"), die an der Oberfläche Avidingruppen tragen (Sigma; Produkt Nr. A 9207) immobilisiert. Die Bindung zwischen Avidin und Biotin ist sehr stark. Die resultierenden Körnchen wurden in ein kleines Plastikröhrchen gefüllt, dieses an beiden Enden mit Watte verschlossen, die so erhaltene Reaktionskammer danach an das Fließsystem angeschlossen und mit Puffer befüllt.

Die Herstellung des WP-Sensors erfolgte dadurch, dass man eine 5%ige Lösung des Hydrogels HN80 (von Kingston Technology Inc., Dayton, NJ, USA) in Dimethylsulfoxid (DMSO) bereitete. Diese viskose Flüssigkeit wurde in einer Dicke von 100 µm auf eine Polyesterfolie aufgestrichen und danach 4 h an feuchter Luft stehen gelassen. Die entstandene klare Membran wurde mit Wasser gewaschen und war etwa 6-8 µm dick. Die Membran wurde danach in 100 mL einer Lösung gegeben, die 0.1% Europiumchlorid und 0.1% Tetracyclin enthielt. Nach 24 h wurde sie herausgenommen, gespült und war danach einsatzbereit. Der so erhaltene Film wurde an der Wand einer kleinen Durchflusszelle befestigt, und diese danach an das Fließsystem angeschlossen.

Die eigentliche Bestimmung von Glucose erfolgte dadurch, dass 100 µL der mit Puffer verdünnten Serumproben in das Fließsystem injiziert wurden. Die injizierte Proben durchliefen die Reaktionskammer (mit immobilisierter GOx) und unmittelbar danach die Durchflusszelle mit dem darin enthaltenen WP-Sensor.

Das System wurde mit einer 5 mM Lösung von Glucose in einem HEPES-Puffer, der 2% Albumin enthielt, geeicht. Danach wurden jeweils 9 Proben analysiert, wobei nach jeder Probe wieder Puffer durch den Analysator gepumpt wurde, bis das Fluoreszenzsignal des Sensors wieder zum Ausgangswert zurückgekehrt war. Nach jeweils 9 untersuchten Proben wurde wieder eine Kalibration mit einem 5 mM Glucose-Standard vorgenommen.

Als analytisches Signal diente die von der in der Durchflusskammer enthaltenen Sensormembran emittierte Fluoreszenz. Die Anregung erfolgte bei 410 nm, die Fluoreszenzintensität wurde bei < 600 nm gemessen und über eine Zeit von 60 sec integriert, was der Zeit entspricht, die die Probe in der Durchflusskammer verweilt.

6.2.3. Bestimmung von Lactat in Serum in einer Mikrotiterplatte

Diese Bestimmung erfolgte durch Zugabe des Enzyms Lactat-Oxidase (Sigma L-0638; Konzentration 5 mg/200 µL) zu 100 µL einer mit Puffer pH 6.9 verdünnten Serumprobe in einer Mikrotiterplatte und Nachweis des gebildeten WP über die Fluoreszenz einer zugefügten Reagenslösung (50 µL), die unter 6.1. beschrieben worden war.

6.2.4. Multienzym-Assay für Creatinin

Creatinin im Serum ist bei renaler Malfunktion deutlich erhöht.

Prinzip

Creatinin (+ Creatininase) ⇒ Creatin
Creatin (+ Creatinase) ⇒ Sarcosin + Harnstoff
Sarcosin (+ Sarcosin-Oxidase) ⇒ Glycin + Formaldehyd + H₂

O₂

(WP)

Das gebildete WP wird mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Reagenzes nachgewiesen. Ebenfalls anwesendes Creatin kann in einem zweiten Ansatz bestimmt werden, in welchem die erste der 3 Reaktionen nicht durchgeführt wird.

Probenvorbereitung

Die Serumprobe wird mit Puffer von pH 7.3 im Verhältnis 1 : 1 verdünnt.

Bestimmungsverfahren (a) Creatinin + Creatin

Man legt 200 µL verdünntes Serum (mit einem Gehalt von 50-100 µM Creatinin) vor. Dazu gibt man zuerst 0.5 mL des Wasserstoffperoxid-Reagenzes und danach eine getrennt bereitete Lösung von 1 mg Creatininase (aus Pseudömonas; frei von Creatinase; mit einer Gesamtaktivität von 150-200 Einheiten), 10 mg Creatinase (aus Flavobacterium; Gesamtaktivität 100-200 Einheiten) und 10 mg Sarconsinoxidase (aus Arthrobacter, Gesamtaktivität 50-150 Einheiten) in 0.5 mL Phosphatpuffer, der 2% HSA enthält. Man verfolgt die Lumineszenz des Reagenzes ab der Zugabe der Enzymlösung. Die Änderung der Lumineszenz über die Zeit (3 min) ist ein Maß für die Creatininkonzentration.

(b) Nur Creatin

Um eventuell vorhandenes Creatin zu bestimmen, führt man die gleiche Reaktion durch, gibt aber dem System keine Creatininase zu. Dadurch wird nur das Creatin erfasst.

(c) Nur Creatinin

Der Wert ergibt sich aus der Differenz der beiden vorherigen Bestimmungen.

6.2.5. Weitere Beispiele für Multi-Enzym-Bestimmungsverfahren 6.2.5.1. Total-Cholesterol Prinzip

Cholesterolester (+ Cholesterolesterase) ⇒ Cholesterol + Fettsäuren
Cholesterol (+ Cholesteroloxidase) ⇒ Cholest-4-en-3-on + H₂

O₂

Die Menge an gebildetem WP ist proportional zu der im Serum vorhandenen Konzentration an Gesamt-Cholesterol und wird mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Reagenzes bestimmt.

6.2.5.2. Lactat Prinzip

Lactat + NAD (+ Lactatdehydrogenase) ⇒ Pyruvat + NADH
Pyruvat + Phosphat (+ Pyruvatoxidase) ⇒ Acetylphosphat + H₂

O₂

Das gebildete WP wird mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Reagenzes bestimmt.

6.2.5.3. Triglyceride

Tritt bei Hyperlipoproteinaemie auf und gilt als Risikofaktor für Herz- und Kreislauferkrankungen

Prinzip

Triglyceride werden zuerst mit Lipase verseift und das freiwerdende Glycerin danach in einer 2-Enzym-Reaktion kinetisch bestimmt.

Triglyceride (+ Lipase) ⇒ Glycerin + Fettsäuren
Glycerin + ATP (+ Glycerolkinase) ⇒ Glycerol-1-phosphat + ADP
Glycerol-1-phosphat (+ Oxidase) ⇒ Dihydroxyaceton-Phosphat + H₂O₂

Das gebildete WP wird mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Reagenzes bestimmt.

6.3. Bestimmung von Enzymaktivitäten 6.3.1. Bestimmung der Aktivität des Enzyms Alanin-Aminotransferase (ALT)

Dieses Enzym hat diagnostische Bedeutung, da es beim Auftreten verschiedener Lebererkrankungen (insbes. Hepatitis) in erhöhter Aktivität auftritt. Die Bestimmung erfolgt in einem Multi-Enzym-Verfahren über folgende Reaktionssequenz:

L-Alanin + 2-Ketoglutarat (+ ALT) ⇒ Pyruvat + Glutamat
Pyruvat + Phosphat (+ Pyruvat-Oxidase) ⇒ Acetylphosphat + H₂O₂

Die gebildete Menge an WP ist der Aktivität des Enzyms ALT proportional und wird mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Reagenzes bestimmt.

6.3.2. Weitere Beispiele für die Bestimmung von Enzymaktivitäten 6.3.2.1. Bestimmung der Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP)

Die Aktivität dieses Enzyms ist bei diversen Erkrankungen (auch Tumoren) der Leber und der Knochen stark erhöht.

Prinzip

Tyrosin-Phosphat (+ ALP) ⇒ Tyrosin
Tyrosin (+ Tyrosin-Decarboxylase) ⇒ Tyramin
Tyramin (+ Tyramin-Oxidase) ⇒ p-Hydroxyphenylacetaldehyd + H₂

O₂

Die gebildete Menge an WP ist der Aktiviät des Enzyms ALP proportional und wird mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Reagenzes bestimmt.

6.3.2.2. Bestimmung der Aktivität der Cholinesterase

Die Aktivität dieses Enzyms ist bei Vergiftungen mit Nervengiften deutlich erniedrigt.

Prinzip

Acetylcholin (+ Cholinesterase) ⇒ Acetat + Cholin
Cholin (+ Cholinoxidase) ⇒ Betain + H₂

O₂

Das gebildete WP wird mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Reagenzes bestimmt.

6.3.2.3. Bestimmung der Aktivität der Lactatdehydrogenase

Die Aktivität dieses Enzyms ist nach einem myocardialem Infarkt stark erhöht. Prinzip einer selbstverstärkenden Reaktionssequenz:

Pyruvat + NADH (+ Lactatdehydrogenase) ⇒ Lactat
Lactat (+ Lactatoxidase) ⇒ Pyruvat + H₂O₂

Die Menge an gebildetem WP ist von der Aktivität der LD abhängig und kann mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Reagenzes bestimmt werden.

6.4. Bestimmung von Enzymhemmern 6.4.1. Bestimmung von Hemmern der HIV-Proteinase

• 1. Hemmer dieses Enzyms sind potentielle HIV-Pharmaka.

Prinzip

Proteasen können aus Peptiden eine endständige Aminosäure (AS) abspalten. Hemmer verlangsamen die Aktivität der Protease deutlich, was sich in einer verminderten Bildung von WP äußert.

Peptid (+ HIV-Proteinase) ⇒ Aminsäure (z. B. Ala; Leu) + Rest-Peptid
Aminosäure (+ AS-Oxidase) ⇒
⇒ oxidierte Aminosäure (z. B. Pyruvat; α-Ketoisocaproat) + H₂O₂

Die Menge an gebildetem WP ist von der Aktivität der HIV-Proteinase abhängig und kann mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Reagenzes bestimmt werden. Die erste Reaktion wird durch Inhibitoren der HIV-Protease, z. B. durch Acetyl-Pepstatin, deutlich gehemmt: Richards et al., FEBS Letters 253 (1989) 214.

6.5. Bestimmung eines Antigens (HSA) über einen Immunoassay auf magnetischen Partikeln (a) Biotinylierung von anti-HSA

Polyclonales anti-HSA (Ziege; Sigma Prod. Nr. A-1151) wurde nach 10-facher Verdünnung mit Phosphat-Puffer mit dem Biotinylierungs-Reagens Biotin-amidocapronsäure-sulfo-NHS-ester (Sigma, B-1022) nach der Vorschrift von Psantano & Kuhr in Analytical Chemistry 65 (1993) 623 umgesetzt. Das so biotinylierte anti-HSA wurde danach an die Magnetpartikel gebunden (s. unter 6.c.).

(b) Markierung von anti-HSA mit GOx

Die Markierung erfolgte über die Biotin-Streptavidin- Bindungsreaktion. Polyclonales anti-HSA (Ziege; Sigma Prod. Nr. A-1151) wurde nach 10- facher Verdünnung mit Phosphat-Puffer zuerst mit Streptavidin-Maleinimid (Sigma, Prod. Nr. S-9415) nach der Vorschrift von Duncan et al. in Analytical Biochemistry 132 (1983) 68 markiert. Das so entstandene Streptavidin/anti-HSA-Konjugat wurde nach elektrophoretischer Aufreinigung mit dem GOx-Markierungs-Reagens Biotinamino-GOx (Sigma Nr. G-7779) versetzt und elektrophoretisch gereinigt.

(c) Immobilisierung von anti-HSA auf Magnetbeads

Die Immobilisierung erfolgte über die Biotin-Streptavidin-Bindungsreaktion. 1 mL einer Suspension von paramagnetischen Eisenoxidpartikeln mit oberflächlich gebundenem Streptavidin (d = 1 µm; Sigma; Prod. Nr. S- 2415; enthaltende etwa 1 mg immobilisiertes Streptavidin) wurden mit 1 mL einer Lösung von biotinyliertem anti-HSA (s. unter a) versetzt und 1 h bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Partikel wurden dann mit Hilfe eines Magnetseparators (Sigma, Prod. Nr. M- 1292) abgetrennt.

(d) Bestimmungsverfahren

Die nach (c) erhaltenen Magnetpartikel wurden in 2 mL Phosphatpuffer von pH 7.0 suspendiert und mit Lösungen versetzt, die zwischen 2 und 20 µg/mL HSA enthielten, was der im Urin oder bei Microalbuminurie vorkommenden HSA- Konzentration entspricht. Nach 10 min wurden die Partikel mittels Magnetseparator abgetrennt, in 2 mL PBS resuspendiert und mit einer Lösung von 1 mg/mL des GOx­ markierten polyclonalen anti-HSA (siehe b) versetzt. In einem derartigen Sandwich-Assay bindet das anti-HSA an das bereits am Partikel befindliche HSA. Nach nochmaliger magnetischer Trennung und Resuspension wurde eine 0.1%ige Lösung von Glucose in PBS und 1 mL einer Lösung zugegeben, die 0.1% Tetracyclin (Sigma, Prod. Nr. T-3258) und 0.1% Europiumchlorid (Fluka) enthielt. Die pro Zeiteinheit gebildete Menge an WP kann durch den Anstieg in der Fluoreszenz bei 610-620 nm (unter Anregung bei 405 nm) bestimmt werden und ist proportional der in der Probe enthaltenen Konzentration an HSA.

6.6. Nachweis einer spezifischen Oligomeren-Sequenz über einen Hybridisierungs-Assay Prinzip

Die Bindung eines GOx-markierten 16-mers an ein komplementäres 16-mer, das auf ein Agarose-Partikel immobilisiert worden war, wurde über die mittels der erfindungsgemäßen Reagenzien nachweisbare Aktivität der GOx nachgewiesen.

(a) Herstellung einer Streptavidin-markierten Galactose-Oxidase

Galactose-Oxidase (E. C. 1.1.3.9) wurde in an sich bekannter Weise mit dem Reagens Streptavidin-Maleinamid (Sigma S-9415) markiert und aufgereinigt.

(b) Herstellung eines mit Galactose-Oxidase markierten Oligomers

Die Immobilisierung erfolgte durch Konjugation eines biotinylierten 16-mers der Sequenz [Biotin-(CH₂)₆-ATTACCGGACTCTATA-3'] (Metabion GmbH, München) an das unter 5.2. beschriebene Streptavidin/GOx-Konjugat und nachfolgende elektrophoretische Aufreinigung.

(c) Herstellung eines partikelgebundenen Oligomers

Die amino-modifizierte Sequenz [3'- TAATGGCCTGAGATAT-(CH₂)₆-NH₂] wurde mit Hilfe des Kopplungsreagenzes EDAC (Sigma, E-1769) kovalent an die Carboxygruppe von in TRIS-Puffer (pH 7.5) suspendierten carboxy-modifizierten Latex-Partikeln (Bangs Labs. Inc.; d = 20 µm) konjugiert. Die Partikel wurde abzentrifugiert, gewaschen und in TRIS-Puffer resuspendiert.

(d) Hybridisierung und Nachweis der Aktivität der GOx

Die unter 5.4. beschriebene Partikelsuspension (1 mL) wurde mit 100 µL einer Lösung von GOx-markiertem Oligomer versetzt und bei 55°C hybridisiert. Die Partikel wurden nach 1 h abzentrifugiert, gewaschen und in Puffer resuspendiert. Nach Zugabe von 500 µL einer 0.1%igen Lösung von Galactose und 500 µL einer Lösung, die 0.1% Europiumnitrat und 0.1% Tetracyclin enthielt, wurde ein deutlicher Anstieg in der Fluoreszenz bei 610-620 nm (unter Anregung bei 405 nm) festgestellt. Dies ist Beweis für eine Hybridisierung des GOx­ markierten Stranges. Bei Verwendung anderer GOx-markierter Sequenzen als jener in 5.2. trat wegen der nicht eintretenden Hybridisierung (und damit der Abwesenheit von GOx in den Partikel) keine Bildung von WP auf.

6.7. Beispiel für ein zeitaufgelöste Messverfahren

Die Fluoreszenz der erfindungsgemäßen Lanthaniden-Reagenzien klingt vergleichsweise langsam ab. Dies ist in Fig. 10 dargestellt. Erfindungsgemäß geht man bei der Messung so vor, dass man den Lanthanoiden-Komplex mit einem kurzen (0.01-0.1 µs) Puls einer UV- Leuchtdiode (Nichia; λ_max bei 375 nm) anregt. Die Integration der emittierten Lichtintensität erfolgt dann nach einer Verzögerungszeit t₁, die sich an der Abklingzeit des Lanthanoiden- Komplexes orientiert, üblicherweise aber 10 µs nicht überschreitet. Man kann auch Abklingzeiten elegant bestimmen, wenn man das Verhältnis von 2 Flächen (A₁ und A₂) bestimmt, wie dies G. Liebsch et al. in Appl. Spectrosc. 54 (2000) 548-559 beschrieben worden war. Das entsprechende Abtastschema ist in Fig. 10 dargestellt.

Die analytische Information beim erfindungsgemäßen Verfahren besteht nicht nur in der Messung der Änderung der Lumineszenzintensität, sondern auch in der Messung der Änderung der Lumineszenz-Abklingzeit. Das Eu-Tc besitzt in Abwesenheit von WP eine Abklingzeit von 12,4 µs, nach Sättigung mit WP aber eine Abklingzeit von 9,0 µs. Vorzugweise regt man bei dieser Messmethode die Fluoreszenz mit einer violetten Leuchtdiode oder einer UV-LED (Nichia) an, und bestimmt die Abklingfunktion des emittierten Lichtes, das auf der Emissionsseite mit Hilfe eines OG 570 Langpass-Filters von violetten und blauen Lichtanteilen befreit worden war.

6.8. Herstellung eines Biosensormembran mit immobilisiertem Enzym und immobilisiertem Indikator

Man löst 2 g eines Hydrogels (Hypan; von Hymedix, Dayton, Ohio) in 20 g Dimethylsulfoxid (Merck) und zieht die Lösung auf eine 120 µm dicke transparente Polyesterfolie (Mylar™; von Goodfellow). Nach Verdunsten des Lösungsmittel über Wasser ist die verbliebene Schicht ca. 12 µm dick. Aus der beschichteten Folie wurden Spots (∅ 3-10 mm) ausgestanzt und für 5 h in eine EuTc-Reagenzlösung (siehe 6.1.) gelegt. Die Schicht färbte sich gelb. Die gelben Spots wurden 24 h in einem 5 mM MOPS-Puffer (ohne EuTc) liegen gelassen und waren danach gebrauchsfertig. Diese Sensormembran wird danach mit einer 2 µm dicken Schicht bedeckt, die aus 9 Gewichtsteilen p-HEMA (Poly-Hydroxyethylmethacrylate, Sigma P 3183) oder Polyacrylamid, und aus einem Gewichtsteil des GOx-PAA-Konjugates (Sigma, Produkt-Nr. G9255) besteht. Das Ansprechen einer derartigen Sensormembran auf eine Lösung von Glucose ist in Abb. 8 dargestellt.

6.9. Bestimmungsverfahren für einen Enzymhemmer (Schwermetall-Ion) unter Verwendung einer Biosensormembran am Boden des Napfes einer Mikrotiterplatte (a) Vorbehandlung der Mikrotiterplatte (MTP)

Eine Standard-MTP mit 96 Vertiefungen ("wells") wird am Boden mit Sensorspots beklebt, die durch Ausstanzen einer Biosensor- Fläche erhalten werden, wie sie unter 6.8 beschrieben ist, ausgenommen, dass die Nylon- Oberfläche nicht mit Glucose-Oxidase, sondern mit Glutamat-Oxidase (E. C. 1.4.3.11; Sigma Nr. G-0400) belegt wurde.

(b) Reaktionsfolge

Harnstoff (+ Urease) ⇒ Ammoniak + Bicarbonat
Ammoniak + 2-Oxoglutarat + NADPH (+ Glutamat-Dehydrogenase) ⇒
⇒ Glutamat + NADP
Glutamat (+ Glutamat-Oxidase) = Abbauprodukt + H₂

O₂

(c) Bestimmung

Man befüllt, vorzugsweise mit einem Pipettierautomaten, die mit Sensorspots versehenen Vertiefungen der MTP nacheinander mit folgenden Lösungen:
(*) 100 µL einer 10%igen Lösung von Harnstoff in Tris-Puffer von pH 8.0;
(*) 2 mg Glutamat-Dehydrogenase (E. C. 1.4.1.3) gelöst in 10 µL Tris-Puffer;
(*) 1 mg NADPH (Na-Salz; Sigma N-1630) gelöst in 10 µL Puffer;

(d) 100 µL einer Umweltprobe mit einem Schwermetallgehalt (Ag, Pb, Cu, Cd, im Bereich von 0.1-10 mg/L; (e) 10 mg einer Lösung von Urease (E. C. 3.5.1.5; Sigma Prod. Nr. U-1500) in 10 µL Puffer.

Man misst unmittelbar nach der Zugabe der Urease die Verlangsamung der Bildung von WP als Folge der Hemmung durch Schwermetalle. Die maximale Bildungsgeschwindigkeit für WP wird ermittelt, indem man eine Lösung vermisst, in der die 0.5 mL der Umweltprobe durch destilliertes Wasser ersetzt werden.

Die Menge an gebildetem WP ist vom Gehalt der Probelösung an Schwermetallionen abhängig, da die Aktivität der Urease schon von Spuren von Schwermetallen gehemmt wird, wie z. B. in der Arbeit "Disposable Cuvette Test with Integrated Sensor Layer for Enzymatic Determination of Heavy Metals", von C. Preininger & O. S. Wolfbeis, in Biosensors & Bioelectronics 11 (1996) 981-990 gezeigt wurde. Die zeitliche Zunahme der Konzentration an WP wird über die Lumineszenz der in den Wells befindlichen Sensorspots mit Hilfe eines von unten abtastenden Mikrotiterplattenlesers (Ascent Fluoroskan) bestimmt.

Ergänzungsblatt

Die beigelegten graphischen Darstellungen sollen die Erfindung erläutern.

Fig. 1 zeigt die Absorptions und Emissionsspektren des EuTc-Komplexes in Abwesenheit und in Anwesenheit von H₂O₂. Auf Zugabe von H₂O₂ fällt zwar die Absorption bei 400 nm schwach ab, aber die Emissionsintensität bei ca. 615 nm nimmt um das bis zu 15-fache zu.

Fig. 2 zeigt den Einfluss von Wasserstoffperoxid auf das Emissionsspektrum des Dysprosium(III)-Tetracyclin-Komplexes in Wasser von pH 6.9.

Fig. 3 zeigt den Einfluss von Wasserstoffperoxid auf das Emissionsspektrum des Holmium(III)-Tetracyclinkomplexes in Wasser von pH 6.9.

Fig. 4 zeigt den Einfluss von Wasserstoffperoxid auf das Emissionsspektrum des Samarium(III)-Tetracyclinkomplexes in Wasser von pH 6.9

Fig. 5 zeigt einen Ausschnitt aus einer Mikrotiterplatte, in deren Vertiefungen (Näpfe; "wells") verschiedene Enzyme (Lipasen, Dehydrogenasen, Glucoseoxidase) eingebracht worden war. Anschliessend wurden das entsprechende Enzymsubstrat (Glucose) und ein erfindungsgemäßes Reagenz (EuTc) zugegeben. Linker Teil: Dunkle Spots stehen für helle Fluoreszenz. Diese tritt an jenen Stellen auf, an denen sich Glucoseoxidase befindet. Stellen, an denen sich Dehydrogenasen bzw. Lipasen befanden, bleiben hell (keine Fluoreszenz). Auf diese Weise erhält man Muster, die für jedes Enzymmuster (z. B. von Bakterien) typisch sind. Rechter Teil: Humanserumalbumin wurde mit verschiedenen Enzymen (GOx, markiert und in die Wells platziert. Nach Zugabe von EuTc und Glucose findet man starke Fluoreszenz nur an den Stellen, wo sich GOx-markiertes HSA befindet. Hingegen bleiben Wells, in denen sich HSA befindet, die mit Nicht-Oxidasen (z. B. der Glucosedehydrogenase) markiert worden war, hell.

Fig. 6 zeigt die zeitliche Zunahme der Lumineszenzintensität des Reagenzes EuTc in Gegenwart von Glucoseoxidase und einem Serum, das Glucose in typischen physiologischen Konzentrationen enthält. Als analytische Information diente die Änderung der Lumineszenzintensität pro 200 sec.

Fig. 7 zeigt eine Kalibrationskurve für die Bestimmung von Glucose mit Hilfe von GOx und dem Reagenz EuTc in Wasser bei pH 6.9 durch Auftragung der Änderung der Fluoreszenzintensität pro Zeit [ΔF/Δt)] gegen die Konzentration an Glucose.

Fig. 8 zeigt einen Querschnitt durch eine Sensormembran für Glucose. Auf einer inerten, aber optisch transparenten Polyester-Schicht liegt eine untere Schicht bestehend aus einem Hydrogel-Polymer und dem darin enthaltenen erfindungsgemäßen Indikator (hier EuTc). Die darüberliegende Schicht besteht aus GOx, die auf einen Träger aus Nylonnetz immobilisiert worden war. Die Fluoreszenz des EuTc wird von der Polyesterseite abgetastet, indem man bei der Anregungswellenlänge λ_exc von 405 nm einstrahlt und die Emission bei einer Wellenlänge λ_em von ca. 615 nm vermisst. Die Probe ("sample") befindet sich in Kontakt mit der Sensorschicht. Wenn Glucose in die Sensorschicht eindringt, bildet sich durch enzymatische Oxidation Wasserstoffperoxid, und dieses wird durch einen Anstieg in der Fluoreszenzintensität (und in einer Abnahme der Abklingzeit) des Reagenzes angezeigt.

Fig. 9 zeigt das zeitliche Ansprechverhalten einer Polymer-Sensormembran (nach Fig. 8) mit einem darin enthaltenen Indikator (EuTc) gegenüber einer 1%-igen Lösung von Glucose in Puffer von pH 6.9. Die Sensormembran war ein eine Durchflusszelle eingespannt, die sich in einem Fluorometer befand. Glucoselösung wurde durch die Zelle gepumpt und die Änderung der Fluoreszenzintensität gegen die Zeit aufgetragen.

Fig. 10 gibt eine schematische Darstellung einer zeitaufgelösten Messung zur Unterdrückung der durch biologische Materialien bedingten Untergrundfluoreszenz. Man regt mit einem kurzen Lichtpuls an, wartet danach bis zum Zeitpunkt t₁, bis zu dem die Untergrundfluoreszenz praktisch vollständig abgeklungen ist (typischerweise nach 100-500 ns), und öffnet danach das Messfenster. Man kann nun entweder ein integrale Fluoreszenz­ intensität A₁ bestimmen, oder aber durch Bestimmung von A₁ und A₂ (und mit Hilfe der angegebenen Gleichung) die Abklingzeit des Systems bestimmen, die ebenfalls als analytische Messgröße dienen kann. Beide Methoden dienen der Unterdrückung der störenden Untergrundfluoreszenz.

Claims (60)

1. Qualitative optische Nachweisverfahren und quantitative optische Bestimmungsverfahren für Enzymaktivitäten, Enzymsubstrate, Enzymhemmer, Enzymaktivatoren, Antigene oder Nucleinsäure-Oligomere unter Verwendung mindestens eines Enzyms aus der Gruppe der Oxidasen, dadurch gekennzeichnet, dass man das von Oxidasen, von oxidase-markierten Antikörpern oder von oxidase-markierten Oligo-Nucleinsäuresträngen während ihrer enzymatischen Aktivität gebildete Wasserstoffperoxid mit Hilfe eines Reagenzes bestehend aus einem 3-wenigen Ion der Elemente Europium, Terbium, Holmium, Dysprosium, Erbium oder Samarium und einem organischen Liganden nachweist, wobei das Reagenz durch Wasserstoffperoxid eine messbaren Änderung der optischen Eigenschaften erleidet, deren Größe in einem bekannten oder vorab ermittelten Verhältnis zur Konzentration des zu bestimmenden Enzyms, Enzymsubstrates, Enzymhemmers, Antigens oder Oligomers steht.

2. Verfahren zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung der Aktivität von Oxidasen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein zugegebenes Substrat durch die Oxidase abgebaut wird, die dadurch verursachte Bildung von Wasserstoffperoxid mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Reagenzes bestimmt und zur Bestimmung der Aktivität der Oxidase herangezogen wird.

3. Verfahren zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung der Aktivität von Enzymen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein zugegebenes Substrat in mehreren Schritten durch Enzyme, von denen eines eine Oxidase ist, abgebaut wird, und dass die dadurch verursachte Bildung von Wasserstoffperoxid mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Reagenzes bestimmt und zur Bestimmung der Aktivität des ersten Enzyms in der Enzymkaskade herangezogen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis oder die Bestimmung der Aktivität von Enzymen in biologischem Gewebe, in mikrobiellen oder Viral-Kulturen, oder in Vertiefungen von Mikrotiterplatten erfolgt.

5. Verfahren zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von Enzymsubstraten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Oxidase eine Glucoseoxidase, Galactoseoxidase, Cholesterinoxidase, Sarcosinoxidase, Xanthinoxidase, Aminoxidase, Aminosäureoxidase, Alkoholoxidase, Lactatoxidase, Pyruvatoxidase, Uricase oder eine andere beliebige Oxidase ist, die ihr Substrat unter Bildung von Wasserstoffperoxid enzymatisch umsetzt.

6. Verfahren zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von Enzymsubstraten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Glucoseoxidase ist und das Verfahren zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von Glucose in Blut, Serum, Speichel, interstitieller Flüssigkeit, alkoholischen oder nicht-alkoholischen Getränken (oder deren Vorprodukten) oder in Bioreaktoren eingesetzt wird.

7. Verfahren zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von Enzymsubstraten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Lactatoxidase ist und das Verfahren zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von Lactat in Blut, Serum, interstitieller Flüssigkeit oder in Bioreaktoren eingesetzt wird.

8. Verfahren zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von Enzymsubstraten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Cholesterinoxidase bzw. eine Bilirubinoxidase ist und das Verfahren zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von Cholesterin bzw. Bilirubin in Blut oder Serum eingesetzt wird.

9. Verfahren zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von Enzymsubstraten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Alkoholoxidase ist und das Verfahren zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von Alkohol in Blut, Serum, Speichel, interstitieller Flüssigkeit, alkoholischen oder nicht-alkoholischen Getränken (oder deren Vorprodukten) oder in Bioreaktoren eingesetzt wird.

10. Verfahren zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von Enzymsubstraten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das zu bestimmende Substrat zuerst durch ein oder mehrere Enzyme umgesetzt wird, die nicht der Klasse der Oxidasen angehören, dass danach das letzte der Produkte dieser Enzymkaskade durch eine Oxidase umgesetzt wird und dass die dadurch gebildete Menge an Wasserstoffperoxid gemessen und zur Bestimmung der Konzentration des Enzymsubstrates herangezogen wird.

11. Verfahren zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von Enzymsubstraten nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Enzym die Creatinin- Amidohydrolase, das zweite Enzym die Creatinase und das dritte Enzym die Sarcosinoxidase ist, und dass das Verfahren zur Bestimmung von Creatinin in Körperflüssigkeiten herangezogen wird.

12. Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung von Enzymhemmern nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der reaktionsverlangsamende Einfluss eines Enzymhemmers auf den durch eine Oxidase bewirkten Abbau eines Enzymsubstrates unter Freisetzung des Wasserstoffperoxids mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Reagenzes qualitativ nachgewiesen oder quantitativ ausgewertet und zum Nachweis der Anwesenheit oder zur Bestimmung der Konzentration des Hemmers der Oxidase herangezogen wird.

13. Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung von Enzymhemmern nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der reaktionsverlangsamende Einfluss eines Enzymhemmers auf den durch mehrere Enzyme, von denen eines eine Oxidase ist, bewirkten Abbau eines Enzymsubstrates unter Freisetzung des Wasserstoffperoxids mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Reagenzes qualitativ nachgewiesen oder quantitativ ausgewertet und zum Nachweis der Anwesenheit oder zur Bestimmung der Konzentration des Hemmers des ersten Enzyms der Enzymkaskade herangezogen wird.

14. Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung von Enzymhemmern nach Ansprüchen 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, das es in Verfahren zum Screening auf die Wirksamkeit von potentiellen Pharmaka als Enzymhemmer eingesetzt wird.

15. Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung von Enzymhemmern nach Ansprüchen 12-14, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Enzym in der Enzymkaskade eine Protease oder Peptidase ist.

16. Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung von Enzymhemmern nach Anspruch 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Hemmer eine toxische Substanz ist und das Verfahren zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von toxischen Substanzen in biologischen Proben, in Nahrungsmitteln oder in Umweltproben eingesetzt wird.

17. Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung von Enzymaktivatoren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der reaktionsbeschleunigende Einfluss eines Aktivators auf den durch eine Oxidase bewirkten Abbau eines Enzymsubstrates unter Freisetzung des Wasserstoffperoxids mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Reagenzes qualitativ nachgewiesen oder quantitativ ausgewertet und zum Nachweis der Anwesenheit oder zur Bestimmung der Konzentration des Aktivators der Oxidase herangezogen wird.

18. Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung von Enzymaktivatoren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der reaktionsbeschleunigende Einfluss eines Enzymaktivators auf den durch mehrere Enzyme, von denen eines eine Oxidase ist, bewirkten Abbau eines Enzymsubstrates unter Freisetzung des Wasserstoffperoxids mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Reagenzes qualitativ nachgewiesen oder quantitativ ausgewertet und zum Nachweis der Anwesenheit oder zur Bestimmung der Konzentration des Aktivators des ersten Enzyms der Enzymkaskade herangezogen wird.

19. Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung von Enzymaktivatoren nach Ansprüchen 17 und 18, dadurch gekennzeichnet, das es in Verfahren zum Nachweis von ein- oder zweiwertigen Metall-Ionen eingesetzt wird.

20. Verfahren zum qualitativen Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von Antigenen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein oxidase-markierte Antikörper in einem immun-analytischem Verfahren eingesetzt wird und dass nach erfolgter ein- oder mehrmaliger Antigen-Antikörper-Bindung und Zugabe von Enzymsubstrat das durch die Oxidase gebildete Wasserstoffperoxid bestimmt und zur Bestimmung der Antigen- Konzentration herangezogen wird.

21. Verfahren zum qualitativen Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von Antigenen nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren ein Sandwich- Assay oder ein sog. "enzyme-linked immuno-sorbent assay" (ELISA) ist.

22. Verfahren zum qualitativen Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von Antigenen nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von Antigenen in Blut, Serum, Speichel, interstitieller Flüssigkeit, alkoholischen oder nicht-alkoholischen Getränken (oder deren Vorprodukte), in Umweltproben oder in Bioreaktoren eingesetzt wird.

22. Verfahren zum immunhistochemischen Nachweis von Antigenen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein mit einer Oxidase markierter Antikörper an ein in einem Gewebsschnitt befindliches Antigen bindet und dass der Ort der Bindung durch Zugabe eines Lanthaniden-Liganden-Komplexes und eines Enzymsubstrates optisch - vorzugsweise mit Hülfe eines Mikroskopes - sichtbar gemacht wird.

24. Verfahren zum qualitativen Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von Nucleinsäure-Oligomeren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Einzelstrang verwendet wird, der mit einer Oxidase markiert ist und deren Aktivität nach erfolgter Hybridisierung (bzw. Umhybridisierung) und nach Zugabe von Enzymsubstrat über das gebildete Wasserstoffperoxid optisch nachgewiesen und zum Nachweis der Anwesenheit oder zur quantitativen Bestimmung einer bestimmten Gensequenz herangezogen werden kann.

25. Verfahren zum qualitativen Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von Nucleinsäure-Oligomeren nach Ansprüchen 1 und 24, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Markierung verwendete Oxidase eine Glucose-Oxidase oder eine Galactose-Oxidase ist.

26. Verfahren zum qualitativen Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von Nucleinsäure-Oligomeren nach Ansprüchen 1, 24 und 25, dadurch gekennzeichnet, dass es zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Nucleinsäure-Oligomeren in Blut, Sperma, Speichel, Nahrungsmitteln, Pflanzen- oder Saatmaterial, Erbgut, Mikrobakterien, Viren oder in Bioreaktoren herangezogen wird.

27. Reagenzien der allgemeinen Struktur
Ln_x-Lig_y
in fester, gelöster oder immobilisierter Form und geeignet zum Nachweis von enzymatisch gebildetem WP, dadurch gekennzeichnet, dass für Ln ein 3-wertiges Ion aus der Gruppe der Elemente Europium, Terbium, Holmium, Dysprosium, Lanthan, Erbium oder Samarium steht, dass für Lig ein an das Ion bindender organischer Ligand steht, dass das jeweilige Reagenz durch enzymatisch gebildetes Wasserstoffperoxid eine messbare Änderung seiner Absorptions- bzw. Fluoreszenzeigenschaften erleidet und dass das Verhältnis x : y zwischen 10 : 1 und 1 : 3 liegt.

28. Reagenzien nach Anspruch 27 und geeignet zur Durchführung bioanalytischer Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der organische Ligand das Strukturelement
R¹-CO-C(R²)=C(X)-R³
aufweist, worin
maximal 2 der Reste R für H stehen können,
X für OH, NHR⁴, NR⁴ ₂, stehen kann und
R¹-R⁴ für H, (Cyclo)alkyl, (Cyclo)alkanoyl- oder Aroyl, CF₃, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest oder Alkanoylrest, für OH, NH₂, Alkylamino oder Dialkylamino stehen können, wobei
jeder der Reste R¹-R⁴ über einen (gegebenenfalls substituierten) carbocyclischen bzw. heterocyclischen Ring mit einem der anderen Reste R¹-R⁴ verbunden sein kann.

29. Reagenzien nach Anspruch 28 und geeignet zur Durchführung bioanalytischer Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der organische Ligand für Benzoylaceton, Benzoyl-trifluoroaceton, Dibenzoylmethan, Thenoyl-trifluoroaceton, heterocyclische (ortho-Hydroxy-)Carbonsäuren, aromatische oder heterocyclische ortho- Hydroxyketone und deren Derivate, Hydroxychinone und teilweise hydrierte und substituierte Hydroxychinon-artige Verbindungen einschließlich des Tetracyclins und seiner Derivate steht.

30. Reagenzien nach Ansprüchen 1, 28 und 29, dadurch gekennzeichnet, dass das molare Verhältnis zwischen Lanthaniden-Ion und organischem Liganden im eingesetzten Reagenz zwischen 10 : 1 und 1 : 3 liegt.

31. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Oxidase, der oxidase­ markierte Antikörper oder das oxidase-markierte Oligomer in der zu vermessenden Lösung in gelöster Form vorliegt.

32. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Oxidase, der oxidase­ markierte Antikörper oder das oxidase-markierte Oligomer in immobilisierter Form und in unmittelbarem Kontakt mit der zu vermessenden Lösung vorliegt.

33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomoleküle auf einem flächigen Element oder auf Partikeln immobilisiert sind.

34. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Lanthanoiden-Reagens in der zu untersuchenden Probe in gelöster Form vorliegt.

35. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Lanthanoiden-Reagens in (oder auf) einer Polymermatrix vorliegt, die mit der der zu untersuchenden Probe in Kontakt ist, dass die Polymermatrix für Wasserstoffperoxid durchlässig ist und dass letzteres auf (oder in) der Matrix eine messbare Änderung der optischen Eigenschaften des Reagenzes bewirkt.

36. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Oxidase, oder der oxidase-markierte Antikörper oder das oxidase-markierte Oligomer und das Reagens in immobilisierter Form in oder auf einer Polymermatrix, aber in unmittelbarem Kontakt mit der zu vermessenden Lösung vorliegen.

37. Verfahren nach Ansprüchen 35 und 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymermatrix mit den darin enthaltenen Reagenzien und Enzymen (oder enzym-markierten Biomolekülen) als 0.1-10 µm dicke Schicht ausgebildet vorliegt und als Biosensor in Einmaltests oder mehrmals nacheinander zur Verwendung kommt.

38. Verfahren nach Ansprüchen 35 bis 37, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymermatrix aus einem Hydrogel besteht und das Reagens physikalisch oder chemisch immobilisiert vorliegt.

39. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich Oxidase, oxidase­ markierter Antikörper oder oxidase-markiertes Oligomer zusammen mit dem Reagens und der zu untersuchenden Probe in den Wells einer Mikrotiterplatte gelöst befinden und die Änderungen der optischen Eigenschaften des Reagenzes mit Hilfe eines Mikrotiterplattenlesers oder mit Hilfe bildgebender fluoreszenter Verfahren bestimmt werden.

40. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich das Reagens in immobilisierter Form in einer Mikrotiterplatte befindet und die als Folge der enzymatischen Reaktion eintretenden Änderungen der optischen Eigenschaften des Reagenzes mit Hilfe eines Mikroplattenlesers oder mit Hilfe bildgebender fluoreszenter Verfahren bestimmt werden.

41. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Enzyme (oder das oxidase-markierte Biomolekül) und das Reagens in immobilisierter Form auf dem Boden einer Mikrotiterplatte befinden und die als Folge der enzymatischen Reaktion eintretenden Änderungen der optischen Eigenschaften des Reagenzes mit Hilfe eines Mikroplattenlesers oder mit Hilfe bildgebender fluoreszenter Verfahren bestimmt werden.

42. Verfahren nach Ansprüchen 32, 33, 35, 36, 40 und 41, dadurch gekennzeichnet, dass eines oder mehrere der verwendeten Biomoleküle über das System (Strept)avidin/Biotin immobilisiert werden.

43. Verfahren nach Ansprüchen 35-38 und 42, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomoleküle und das Reagens auf einem Lichtwellenleiter immobilisiert vorliegen.

44. Verfahren nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, dass der Lichtwellenleiter ein faseroptischer Lichtwellenleiter ist.

45. Verfahren nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, dass der faseroptische Lichtwellenleiter für in-vivo-Anwendungen eingesetzt wird.

46. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit Hilfe eines Fließsystem durchgeführt werden, das eine mechanische Zuführung von Probenmaterial, Lösungsmittel, Enzymen (oder enzym-markiertem Biomolekül) und Reagens vorsieht.

47. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit Hilfe eines Fließsystem durchgeführt werden, das in jedem Fall eine mechanische Zuführung von Probenmaterial und Lösungsmittel vorsieht, während die eingesetzten Biomoleküle oder das Reagens, oder beide, sowohl über das Fließsystem zugeführt werden als auch in immobilisierter Form vorliegen können.

48. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich Enzym (oder enzym­ markiertes Biomolekül) oder Reagens in (oder auf) einem gegebenenfalls fluoreszent markierten Partikel befinden.

49. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich Enzym (oder enzym­ markiertes Biomolekül) und Reagens in (oder auf) einem gegebenenfalls fluoreszent markierten Partikel befinden.

50. Verfahren nach Ansprüchen 48 und 49, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeten Partikel einen Durchmesser von 0.1 bis 20 µm haben.

51. Verfahren nach Anspruch 48 oder 49, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel in fließ-cytometrischen Nachweisverfahren eingesetzt werden.

52. Verfahren nach Anspruch 48 oder 49, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel in heterogenen Immuntests oder Gentests eingesetzt werden.

53. Verfahren nach Ansprüchen 48 und 49, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel einen magnetischen Kern haben.

54. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Ausmaß der enzymatischen Reaktion über die eingetretenen Änderungen in der Lichtabsorption des Reagenzes im Wellenlängenbereich zwischen 300 und 450 nm quantifiziert.

55. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Ausmaß der enzymatischen Reaktion über die eintretenden Änderungen in der Lumineszenz des Reagenzes quantifiziert, indem man das Reagens mit Licht der Wellenlängen zwischen 300 und 450 nm bestrahlt und die Änderung in der Intensität der Emission bei Wellenlängen von <500 nm ermittelt.

56. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die das Ausmaß der enzymatischen Reaktion über die eingetretenen Änderungen in der Lumineszenz des Reagenzes quantifiziert, indem man die das Reagens mit Licht der Wellenlängen zwischen 300 und 450 nm bestrahlt und die Änderung in der Abklingzeit der Emission bei <500 nm bestimmt.

57 Verfahren nach Anspruch 55 und 56, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Unterdrückung der Eigenfluoreszenz des Untersuchungsmaterials bzw. des Systems zuerst einen kurzen Anregungspuls vorsieht und die Lumineszenz des Reagenzes erst nach einer Verzögerungsphase von 0.1-10 µs, während der die Störfluoreszenz der Probe und des Systems abklingt, misst.

58. Verfahren nach Ansprüchen 54 bis 57, dadurch gekennzeichnet, dass man als Lichtquelle eine Xenonlampe, eine blaue, violette oder ultraviolette Leuchtdiode oder eine blaue, violette oder ultraviolette Laserdiode einsetzt.

59. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die durch die Oxidase bewirkte Bildung von Wasserstoffperoxid kinetisch verfolgt und aus der pro Zeiteinheit eintretenden Änderung der optischen Eigenschaften des Reagenzes auf die Anwesenheit des Analyten oder auf die Konzentration des Analyten schließt.

60. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die durch die Oxidase bewirkte Bildung von Wasserstoffperoxid am Ende der Reaktion bestimmt und aus der insgesamt eintretenden Änderung der optischen Eigenschaften des Reagenzes auf die Anwesenheit des Analyten oder auf die Konzentration des Analyten schließt.