DE10108968B4 - Device for performing electrophysiological measurements on cells - Google Patents
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Abstract
Vorrichtung zum Durchführen elektrophysiologischer Messungen an Zellen (16), mit mindestens einer Elektrode (30 –36), mit einer ersten Perfusatleitung, die als Perfusateinlaß (38) mit einer ersten Mündung (39) zum Zuführen von Perfusat zu den Zellen (16) ausgebildet ist, und mit einer zweiten Perfusatleitung, die als Perfusatauslaß (40) mit einer zweiten Mündung (41) zum Abführen von Perfusat von den Zellen (16) ausgebildet ist, wobei die zweite Mündung (41) oberhalb der ersten Mündung (39) angeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens eine Elektrode (30–36) zum Einstechen in die Zellen (16) ausgebildet und mit den Perfusatleitungen (38, 40) in einem gemeinsamen Träger (22) eines Meßkopfes (20) integriert ist, daß der Perfusateinlaß (38) sich im wesentlichen parallel zu der mindestens einen Elektrode (30–36) erstreckt, und daß die erste Mündung (39) oberhalb eines unteren Endes der mindestens einen Elektrode (30–36) angeordnet ist.contraption to perform electrophysiological measurements on cells (16), with at least one Electrode (30-36), with a first perfusate tube, which as a perfusate inlet (38) with a first estuary (39) for feeding from perfusate to the cells (16), and with a second one Perfusatleitung, the perfusate outlet (40) with a second mouth (41) for discharging Perfusate is formed by the cells (16), the second orifice (41) above the first estuary (39), characterized in that the at least one electrode (30-36) formed for insertion into the cells (16) and with the perfusate leads (38, 40) in a common carrier (22) of a measuring head (20) that the Perfusate inlet (38) substantially parallel to the at least one electrode (30-36), and that the first estuary (39) above a lower end of the at least one electrode (30-36) is arranged.
Description
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Durchführen elektrophysiologischer Messungen an Zellen, mit mindestens einer Elektrode, mit einer ersten Perfusatleitung, die als Perfusateinlaß mit einer ersten Mündung zum Zuführen von Perfusat zu den Zellen ausgebildet ist, und mit einer zweiten Perfusatleitung, die als Perfusatauslaß mit einer zweiten Mündung zum Abführen von Perfusat von den Zellen ausgebildet ist, wobei die zweite Mündung oberhalb der ersten Mündung angeordnet ist.The The invention relates to a device for performing electrophysiological Measurements on cells, with at least one electrode, with a first Perfusate tube used as a perfusion inlet with a first muzzle Respectively from perfusate to the cells is formed, and with a second Perfusatleitung, which as a perfusate outlet with a second mouth to lead away perfusate is formed by the cells, with the second orifice above the first estuary is arranged.
Eine
Vorrichtung der vorstehend genannten Art ist aus der
Die bekannte Vorrichtung dient zum Durchführen elektrophysiologischer Messungen an Oozyten, insbesondere Oozyten des Xenopus laevis, eines südafrikanischen Klauenfrosches. Diese Oozyten werden bevorzugt für elektrophysiologische Messungen als Expressionssystem eingesetzt.The known device is used to perform electrophysiological Measurements on oocytes, in particular oocytes of Xenopus laevis, one South African Claw frog. These oocytes are preferred for electrophysiological measurements used as expression system.
In diesem Zusammenhang ist es bekannt, die Oozyten in einer Aufnahme zu positionieren und zu fixieren. Die Aufnahme kann z.B. eine trichterartige Öffnung in einer Platte sein. Derartige Platten sind standardisiert und werden üblicherweise mit 8 × 12 = 96, 16 × 24 = 384 oder 32 × 48 = 1.536 derartigen Aufnahmen ("Wells") verwendet. Die Aufnahmen für die Oozyten können z.B. an ihrer Unterseite mit einer Öffnung versehen sein, über die die Oozyte mittels Unterdruck angesaugt und in der Aufnahme fixiert wird.In In this context, it is known the oocytes in a recording to position and fix. The recording may e.g. a funnel-like opening in to be a plate. Such plates are standardized and usually become with 8 × 12 = 96, 16 × 24 = 384 or 32 × 48 = 1,536 such images ("Wells") used. The Recordings for the Oocytes can e.g. be provided on its underside with an opening over the the oocyte is aspirated by means of negative pressure and fixed in the receptacle.
Zum Durchführen von elektrophysiologischen Messungen wird eine genetische Information, nämlich eine mRNA oder eine cDNA, in die Oozyte eingebracht. Es bilden sich dann an der Oberfläche und in der Oozyte charakteristische Ionenkanäle und/oder Rezeptoren aus, die durch Anlegen einer elektrischen Spannung bzw. Durchleiten eines elektrischen Stroms oder Applikation einer Substanz vermessen werden können.To the Carry out From electrophysiological measurements is a genetic information, namely a mRNA or a cDNA introduced into the oocyte. It then form on the surface and in the oocyte characteristic ion channels and / or receptors, by applying an electrical voltage or passing a electrical current or application of a substance can be measured can.
Es ist bekannt, auf diese Weise pharmakologische Messungen durchzuführen, weil die in der Membran der Oozyten ausgebildeten Rezeptoren oder Ionenkanäle in einer Art und Weise ausgebildet werden, die charakteristisch für bestimmte Eigenschaften der zu untersuchenden Substanzen ist.It is known to perform in this way pharmacological measurements, because the receptors or ion channels formed in the oocyte membrane in one Be fashioned, characteristic of certain Properties of the substances to be examined is.
Bei
der eingangs erwähnten
Bei
der vorerwähnten
Vorrichtung gemäß der
An die Aufnahme der Zelle ist eine Perfusionseinrichtung angeschlossen. Mit dieser Perfusionseinrichtung lassen sich in gesteuerter Weise unterschiedliche Substanzen, insbesondere Meßsubstanzen, in die Aufnahme einfüllen, die typischerweise ein Fassungsvermögen von 100 μl hat. Im abgeknickten Bereich des Röhrchens ist horizontal neben der Rückseite der Zelle ein freies Ende eines Schlauchs angeordnet, der als Perfusateinlaß dient. In einem schräg nach oben weisenden Bereich des abgeknickten Röhrchens befindet sich das freie Ende eines zweiten Schlauchs, der als Perfusatauslaß verwendet wird. In deren unmittelbarer Nähe befindet sich in dem abgeknickten Röhrchen noch eine Referenzelektrode.At the uptake of the cell is connected to a perfusion device. This perfusion device can be controlled different substances, in particular measuring substances, in the recording fill, which typically has a capacity of 100 μl. in the bent portion of the tube is horizontal next to the back the cell a free end of a tube arranged, which serves as a perfusate inlet. In a diagonal upwardly facing portion of the bent tube is the free End of a second tube used as a perfusate outlet becomes. In their immediate vicinity There is still a reference electrode in the bent tube.
Auch
für dieses
zweite Ausführungsbeispiel gemäß der
Allgemein ist somit bei bekannten Vorrichtungen der hier interessierenden Art ein erhebliches handwerkliches Geschick erforderlich, um die Perfusatleitung in den Bereich der Aufnahme für die Zelle zu bringen und dort zu fixieren. Vor allem aber ist auch die Anbringung der Elektroden an der Zelle, insbesondere das Einstechen der Elektroden in die Zelle, von der Geschicklichkeit der jeweiligen Untersuchungsperson abhängig, da dies offensichtlich von Hand geschieht. Sofern die Applikation der Elektrode bzw. der Elektroden an die Zelle mißlingt, insbesondere wenn die Elektroden abbrechen, muß der gesamte Meßaufbau neu eingerichtet und neu justiert werden. Schließlich ist mit der bekannten Vorrichtung nur jeweils eine Einzelmessung an einer Zelle möglich, wobei lediglich die Abfolge unterschiedlicher Testflüssigkeiten in der erwähnten Weise automatisch gesteuert werden kann.In general, therefore, in known devices of the type of interest here, considerable manual skill is required in order to bring the perfusate line into the region of the receptacle for the cell and to fix it there. Above all, however, the attachment of the electrodes to the cell, in particular the insertion of the electrodes into the cell, depends on the skill of the respective subject, since this obviously happens by hand. If the application of the electrode or of the electrodes to the cell fails, in particular if the electrodes break off, the entire measuring setup must be newly set up and readjusted. Finally, only one individual measurement on a cell is possible with the known device, wherein only the sequence of different Test liquids can be controlled automatically in the mentioned manner.
Aus
der
Diese bekannte Vorrichtung ist daher lediglich für spezielle Messungen geeignet, bei denen viele (beispielsweise 20) nebeneinander liegende Meßpunkte in neurologischem Gewebe vermessen werden sollen.These known device is therefore suitable only for special measurements, where many (for example 20) adjacent measuring points to be measured in neurological tissue.
Der Erfindung liegt demgegenüber die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung der eingangs genannten Art dahingehend weiterzubilden, daß die vorstehend erläuterten Nachteile vermieden werden.Of the Invention is in contrast the task is based, a device of the type mentioned develop further to the effect that the above explained Disadvantages are avoided.
Insbesondere soll es möglich sein, die Messung sowohl hinsichtlich der Applikation der Elektroden wie auch hinsichtlich der Applikation der Perfusatleitungen vollautomatisch durchzuführen, weiterhin soll die Vorrichtung nach dem "plug-and-play"-Prinzip mit wenigen Handgriffen einsetzbar und bei einer eventuellen Beschädigung wieder-einsetzbar gemacht werden können. Schließlich soll es möglich werden, eine Vielzahl von Messungen an vielen unterschiedlichen Zellen vollautomatisiert, d.h. ohne Aufsicht durchführen zu können, insbesondere über Nacht.Especially should it be possible be the measurement both in terms of application of the electrodes as well as with regard to the application of the perfusate lines fully automatically perform, Furthermore, the device according to the "plug-and-play" principle Can be used with little effort and re-used in case of damage can be made. Finally, should it possible be a variety of measurements on many different Cells fully automated, i. without supervision can, especially about Night.
Diese Aufgabe wird gemäß der eingangs genannten Vorrichtung erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die mindestens eine Elektrode zum Einstechen in die Zellen ausgebildet und mit den Perfusatleitungen in einem gemeinsamen Träger eines Meßkopfes integriert ist, daß der Perfusateinlaß sich im wesentlichen parallel zu der mindestens einen Elektrode erstreckt, und daß die erste Mündung oberhalb eines unteren Endes der mindestens einen Elektrode angeordnet ist.These Task is in accordance with the beginning mentioned device according to the invention achieved in that the at least formed an electrode for piercing into the cells and with the Perfusatleitungen in a common carrier of a measuring head is integrated that the Perfusate intake yourself extending substantially parallel to the at least one electrode, and that the first estuary arranged above a lower end of the at least one electrode is.
Die Erfindung hat den Vorteil, daß der Träger industriell vorgefertigt werden kann und lediglich in der Vorrichtung an eine entsprechende Halterung eingesteckt werden muß. Die Elektroden sind dabei fertig installiert, insbesondere hinsichtlich ihrer relativen Lage zueinander, so daß das bei herkömmlichen Vorrichtungen notwendige und sehr delikate Ausrichten der Elektroden zueinander nicht mehr erforderlich ist. Auf diese Weise wird erreicht, daß das Risiko einer Beschädigung der Elektroden beim Einrichten der Vorrichtung drastisch minimiert wird. Außerdem werden die Messungen deutlich reproduzierbar, weil die Elektroden sich in einer definierten Lage zueinander befinden. Schließlich gestattet die integrierte Anordnung der Elektroden in dem Träger, daß automatisierte Verfahreinrichtungen für den so gebildeten Meßkopf gebildet werden, so daß die gewünschten vollautomatisierten Messungen an einer Vielzahl von Zellen möglich werden, beispielsweise in Verbindung mit einer standardisierten Multi-Well-Platte.The Invention has the advantage that the Carrier industrial can be prefabricated and only in the device to a appropriate holder must be inserted. The electrodes are finished installed, in particular with regard to their relative position to one another, so that in conventional devices necessary and very delicate alignment of the electrodes to each other is no longer necessary. In this way it is achieved that the risk damage the electrodes drastically minimized when setting up the device becomes. In addition, will the measurements are clearly reproducible, because the electrodes themselves are in a defined position to each other. Finally allowed the integrated arrangement of the electrodes in the carrier that automated Moving devices for the measuring head thus formed be formed so that the desired fully automated Measurements on a variety of cells are possible, for example in conjunction with a standardized multi-well plate.
Die Maßnahme, auf dem Träger ferner mindestens eine Perfusatleitung anzuordnen, hat den Vorteil, daß die Perfusionseinrichtung hinsichtlich der Zuführung und der Abführung des Perfusats in den selben Meßkopf integriert ist, in dem sich bereits Elektroden befinden, so daß eine gemeinsame Handhabung möglich ist. Weiterhin ist von Vorteil, daß beim Integrieren auch der Perfusatleitungen in den Meßkopf die relative Positionierung der Perfusatleitungen zu den Elektroden optimiert werden kann und bereits herstellerseitig fixiert ist. Auch insoweit entfällt ein umständliches Handhaben der Vorrichtung beim Aufbau der Meßanordnung. Weiterhin ergibt sich der Vorteil, daß bei einer Beschädigung einer der Komponenten der gesamte Meßkopf mit wenigen Handgriffen ausgetauscht werden kann.The Measure, on the carrier Furthermore, to arrange at least one perfusate, has the advantage that the Perfusion device with regard to the supply and the discharge of the Perfusats in the same measuring head is integrated, in which there are already electrodes, so that a common handling possible is. A further advantage is that when integrating the Perfusatleitungen in the measuring head the relative positioning of the perfusate leads to the electrodes can be optimized and is already fixed by the manufacturer. Also in this respect deleted a complicated one Handling of the device in the construction of the measuring arrangement. Furthermore results the advantage that at damage one of the components of the entire measuring head with a few simple steps can be exchanged.
Da der Perfusateinlaß eine erste Mündung aufweist, der Perfusateinlaß ferner im wesentlichen parallel zu der mindestens einen Elektrode angeordnet ist und schließlich die erste Mündung oberhalb eines unteren Endes der mindestens einen Meßelektrode angeordnet ist, wird das Perfusat ganz gezielt an exakt die Stelle geleitet, an der sich der aktive Teil der Meßelektroden befindet.There the perfusate intake one has first mouth, the perfusate inlet further arranged substantially parallel to the at least one electrode is and finally the first estuary above a lower end of the at least one measuring electrode is arranged, the perfusate is quite targeted to exactly the place at which the active part of the measuring electrodes is located.
Das Vorsehen eine Perfusatauslasses mit einer zweiten Mündung hat den Vorteil, daß das nicht mehr benötigte Perfusat kontrolliert abgeführt und insbesondere ein Überlaufen der Aufnahme für die Zelle verhindert werden kann. Da die zweite Mündung oberhalb der ersten Mündung angeordnet ist, kann die Zelle über die Strecke zwischen den beiden Mündungen stets mit frischem Perfusat versorgt werden, d.h. entweder mit einer Testflüssigkeit oder zwischen den Meßvorgängen mit einer Spülflüssigkeit.The Providing a perfusate outlet having a second mouth the advantage that the no longer needed Perfusate controlled dissipated and in particular an overflow the recording for the cell can be prevented. Since the second estuary above the first estuary is arranged, the cell can over the stretch between the two mouths always with fresh Perfusat be supplied, i. either with a test fluid or between the measuring processes with a rinsing liquid.
Diese Maßnahme hat daher den weiteren Vorteil, daß auch außerhalb von eigentlichen Meßvorgängen ein gezieltes Zuführen von Perfusat möglich ist, um die gerade nicht vermessenen Zellen gegen Austrocknen zu schützen. Dann kann über den vertikalen Abstand der beiden Mündungen in genau definierter Weise ein vorgegebener Flüssigkeitsspiegel oberhalb der Zellen eingestellt werden.This measure therefore has the further advantage that a targeted feeding of perfusate is possible even outside of actual measuring processes, in order to protect the cells which are just not measured against dehydration. Then, about the vertical distance of the two mouths in exactly defined manner, a predetermined liquid level can be set above the cells.
Bei bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind die Elektroden in Aussparungen des Trägers eingesetzt, sie können aber auch im Träger vergossen sein.at preferred embodiments the device according to the invention The electrodes are used in recesses of the carrier, but they can also in the carrier to be shed.
Diese Maßnahmen haben den Vorteil, daß eine stabile und reproduzierbare Lage der Elektroden im Träger erreicht wird.These activities have the advantage that a achieves stable and reproducible position of the electrodes in the carrier becomes.
Bei weiteren Ausführungsformen der Erfindung bestehen die Elektroden aus gezogenen Glasröhrchen.at further embodiments invention, the electrodes consist of drawn glass tubes.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, daß derartige Glaselektroden in an sich bekannter Weise für den jeweiligen Anwendungszweck optimiert ausgebildet werden können. So ist es z.B. möglich, die Elektroden mit einem elektrischen Widerstand zwischen 5 MΩ und 100 MΩ auszubilden, und zwar als sogenannte "sharp electrodes". Alternativ können die Elektroden auch als sogenannte "patch electrodes" mit einem elektrischen Widerstand in der Größenordnung von 500 kΩ bis 5 MΩ ausgebildet werden.These measure has the advantage that such Glass electrodes in a conventional manner for the particular application can be optimized. So it is e.g. possible, the electrodes with an electrical resistance between 5 MΩ and 100 To train MΩ, and as so-called "sharp electrodes ". Alternatively can The electrodes are also called "patch electrodes" with an electrical resistance in of the order of magnitude from 500 kΩ to 5 MΩ trained become.
Alternativ ist erfindungsgemäß aber auch vorgesehen, Elektroden als Drahtelektroden auszubilden, vorzugsweise als Silberdrahtelektroden, die weiter vorzugsweise mit einer Chloridschicht umgeben sind. Daneben ist auch die Verwendung von Wolframdrähten und dergleichen möglich.alternative but is also provided according to the invention Form electrodes as wire electrodes, preferably as silver wire electrodes, which are further preferably surrounded by a chloride layer. Besides the use of tungsten wires and the like is also possible.
Bei bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist mindestens eine Elektrode einen geraden Abschnitt auf.at preferred embodiments the device according to the invention At least one electrode has a straight section.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, daß die Elektrode in besonders einfacher Weise im Träger befestigt werden kann.These measure has the advantage that the electrode can be fastened in a particularly simple manner in the carrier.
Wenn in weiter bevorzugter Ausbildung der Erfindung zwei Elektroden im wesentlichen symmetrisch zu einer Längsachse des Trägers angeordnet sind, so kann man den Abstand zwischen den freien Enden der Elektroden in einem Bereich zwischen etwa 50 μm und 800 μm, vorzugsweise zwischen 200 μm und 500 μm einstellen.If in a further preferred embodiment of the invention, two electrodes in are arranged substantially symmetrically to a longitudinal axis of the carrier, so you can see the distance between the free ends of the electrodes in a range between about 50 microns and 800 microns, preferably set between 200 microns and 500 microns.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, daß beim Einführen der Elektroden in die Zellen individuelle Einstechlöcher erzielt werden und nicht ein gemeinsames, großes Loch aufgerissen wird, das entstünde, wenn die freien Enden der Elektroden zu dicht beieinander angeordnet wären. Dies hätte nämlich den Nachteil, daß wichtige physiologische Funktionen der Zelle verlorengingen. Dies wird bei der erfindungsgemäßen Vorgehensweise vermieden.These measure has the advantage that when inserting the Electrodes into the cells individual puncture holes are achieved and not a common, big one Hole that would be torn open, when the free ends of the electrodes are arranged too close to each other would. This would have namely the Disadvantage that important physiological functions of the cell were lost. This will be included the procedure of the invention avoided.
In diesem Zusammenhang ist besonders bevorzugt, wenn ein gerader Abschnitt der Elektroden mit einer Längsachse des Trägers einen spitzen Winkel einschließt, der insbesondere zwischen 3° und 10°, vorzugsweise 5° betragen kann.In This relationship is particularly preferred when a straight section the electrodes with a longitudinal axis of the carrier includes an acute angle, in particular between 3 ° and 10 °, preferably 5 ° can.
Diese zueinander geneigte Anordnung der Elektroden hat den Vorteil, daß die unteren freien Enden der Elektroden in gut reproduzierbarer Weise positioniert werden können.These mutually inclined arrangement of the electrodes has the advantage that the lower positioned free ends of the electrodes in a well reproducible manner can be.
Bei einer bevorzugten Gruppe von Ausführungsbeispielen der Erfindung ist mindestens eine der Elektroden als Meßelektrode ausgebildet. Die Meßelektrode ist vorzugsweise an einen Meßverstärker angeschlossen, der weiter vorzugsweise einstellbar ist.at a preferred group of embodiments of the invention At least one of the electrodes is designed as a measuring electrode. The measuring electrode is preferably connected to a measuring amplifier, which is further preferably adjustable.
Auf diese Weise ist es möglich, automatisch gesteuerte Messungen von Spannungs- oder Stromsignalen durchzuführen.On this way it is possible automatically controlled measurements of voltage or current signals perform.
Dies gilt insbesondere dann, wenn die mindestens eine Meßelektrode an eine Stromquelle angeschlossen ist und diese wiederum vorzugsweise einstellbar ist.This applies in particular when the at least one measuring electrode is connected to a power source and this in turn preferably adjustable is.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, daß bei Einsatz zweier unterschiedlicher Elektroden eine Entkopplung zwischen der Stromeinleitung einerseits und der Spannungsmessung andererseits erreicht wird.These measure has the advantage that when used two different electrodes a decoupling between the Current introduction on the one hand and the voltage measurement on the other is reached.
Die hier zu messenden Ströme und Spannungen liegen im nA- bis μA-Bereich für die Strommessung, und im mV-Bereich für die Spannungsmessung.The currents to be measured here and voltages are in the nA to μA range for the Current measurement, and in the mV range for voltage measurement.
Diese Messungen können durch die gängigen elektrophysiologischen Meßmethoden wie "bridge-mode", "current-clamp", und "voltage-clamp" durchgeführt werden. Dabei ist es für diese Erfindung unerheblich, ob die voltage-clamp-Ableitung mit zwei Elektroden (two-electrode voltage clamp; TEVC) oder mit einer Elektrode (single-electrode voltage-clamp, SEVC) durchgeführt wird. Bei der SEVC-Methode wird im sogenannten "switched-mode" gemessen, also abwechselnd wird in einem bestimmten Intervall ein Meßstrom eingeleitet und die Meßspannung (bei abgeschalteter Strominjektion) gemessen.These Measurements can through the common ones electrophysiological measurement methods such as "bridge-mode", "current-clamp", and "voltage-clamp" are performed. It is for this invention irrelevant whether the voltage-clamp derivative with two electrodes (two-electrode voltage clamp, TEVC) or with a Electrode (single-electrode voltage-clamp, SEVC) is performed. In the SEVC method is measured in the so-called "switched-mode", that is alternately in a measuring current is introduced at a certain interval and the measuring voltage (with switched off current injection) measured.
Zu diesem Zweck ist bei weiteren Ausführungsbeispielen bevorzugt, wenn mindestens eine der Elektroden als Referenzelektrode ausgebildet ist. In diesem Fall ist vorzugsweise die Referenzelektrode an eine Masse angeschlossen.To this purpose is preferred in further embodiments, if at least one of the electrodes is formed as a reference electrode is. In this case, preferably, the reference electrode is connected to a Ground connected.
Zu dem erwähnten Zweck sind Konfigurationen besonders bevorzugt, bei denen zwei Meßelektroden und zwei Referenzelektroden vorgesehen sind.For the purpose mentioned configurations are particularly preferred in which two Meßelek electrodes and two reference electrodes are provided.
In diesem Falle ist besonders bevorzugt, wenn mindestens zwei Meßelektroden in einer ersten gemeinsamen Ebene und/oder mindestens zwei Referenzelektroden in einer zweiten gemeinsamen Ebene angeordnet sind und weiter vorzugsweise die erste und die zweite Ebene parallel zueinander verlaufen und einen möglichst geringen Abstand zueinander aufweisen.In In this case, it is particularly preferred if at least two measuring electrodes in a first common plane and / or at least two reference electrodes are arranged in a second common plane and more preferably the first and the second plane are parallel to each other and one possible have a small distance from each other.
Diese Maßnahmen haben den Vorteil, daß ein extrem kompakter und von der Meßtechnik her optimaler Aufbau entsteht, bei dem alle erforderlichen Komponenten auf engstem Raum vereinigt sind.These activities have the advantage that a extremely compact and of the measuring technique optimal structure is created in which all the required components are united in a confined space.
Dies gilt insbesondere dann, wenn der Perfusateinlaß bei der bereits weiter oben erwähnten symmetrischen Anordnung der Elektroden im wesentlichen auf der Symmetrieachse zwischen den Meßelektroden angeordnet ist.This especially applies if the perfusate intake at the already above mentioned symmetrical arrangement of the electrodes substantially on the axis of symmetry between the measuring electrodes is arranged.
Es ist weiterhin in diesem Zusammenhang bevorzugt, wenn der Perfusateinlaß an eine Förderpumpe angeschlossen und diese insbesondere einstellbar ist.It is further preferred in this context when the perfusate inlet to a feed pump connected and this particular is adjustable.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, daß das Perfusat in genau dosierter Weise zugeführt werden kann.These measure has the advantage that the perfusate fed in exactly metered manner can be.
Bei weiteren Varianten dieses Ausführungsbeispiels ist der Perfusateinlaß über ein steuerbares Ventilsystem an eine Mehrzahl von Vorratsbehältern anschließbar, die eine Testflüssigkeit oder eine Spülflüssigkeit enthalten können.at further variants of this embodiment is the perfusate intake over controllable valve system connected to a plurality of storage containers, the a test fluid or a rinsing liquid can contain.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, daß hinsichtlich der Perfusionseinrichtung vollautomatisierte Messungen mit den bereits erwähnten Vorteilen durchgeführt werden können.These measure has the advantage that in terms of the perfusion device fully automated measurements with the already mentioned Benefits carried out can be.
Besonders ist bevorzugt, wenn die Vorratsbehälter oberhalb des Perfusateinlasses angeordnet sind.Especially is preferred when the reservoir above the perfusate inlet are arranged.
Dann ist es nämlich möglich, auf die Förderpumpe zu verzichten, weil dann nach Öffnen des Ventils in der entsprechenden Verbindungsleitung die Test- oder Spülflüssigkeit von selbst unter Schwerkrafteinfluß zum Perfusateinlaß strömt.Then it is possible, on the pump to give up, because then after opening of the valve in the appropriate connection line the test or rinse flows by itself under the influence of gravity to the perfusate inlet.
Eine besonders gute Wirkung wird erzielt, wenn die Mündungen der Perfusatleitungen entgegengesetzt gerichtet sind.A particularly good effect is achieved when the mouths of the perfusate tubes are directed opposite.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, daß ein Kurzschluß zwischen dem Einlaß- und dem Auslaßsystem verhindert wird, wenn in entgegengesetzten Richtungen eingelassen bzw. abgesaugt wird.These measure has the advantage that a short circuit between the intake and the exhaust system is prevented when recessed in opposite directions or is sucked off.
Auch in diesem Falle ist sinngemäß bevorzugt, wenn der Perfusatauslaß an eine Saugpumpe angeschlossen und diese insbesondere einstellbar ist.Also in this case, it is preferred that when the perfusate outlet is on a suction pump connected and this is in particular adjustable.
Eine besonders gute Wirkung wird erzielt, wenn in Blickrichtung auf die erste Ebene der Perfusateinlaß vor der ersten Ebene und der Perfusatauslaß hinter der zweiten Ebene angeordnet ist.A particularly good effect is achieved when looking in the direction of first level of perfusion inlet the first level and the perfusate outlet behind the second level is arranged.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, daß ein extrem kompakter und sicherer Aufbau entsteht, bei dem alle für die Messung erforderlichen Komponenten in optimaler Weise zusammenarbeiten.These measure has the advantage that a Extremely compact and safe construction arises in which all for the measurement necessary components work together in an optimal way.
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung ist bevorzugt, wenn mindestens ein Meßkopf an einem Aktuator angeordnet ist und der Aktuator entlang eines Koordinatensystems oberhalb einer Aufnahme für die Zellen verfahrbar ist.at embodiments The invention is preferred if at least one measuring head an actuator is arranged and the actuator along a coordinate system above a receptacle for the cells can be moved.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, daß der Meßkopf in allen Richtungen des Koordinatensystems vollautomatisch verfahren werden kann, so daß alle notwendigen Bewegungen programmiert durchge führt werden können. Dies betrifft insbesondere das Anstechen der Zellen mittels der Meßelektroden, aber auch das Heranfahren des Meßkopfes an die Zellen, wenn lediglich eine Befeuchtung der Zellen mittels Perfusat gewünscht ist, wie dies vorstehend erläutert wurde.These measure has the advantage that the measuring head in move fully automatically in all directions of the coordinate system can be, so that all programmed movements can be programmed. This especially concerns the piercing of the cells by means of the measuring electrodes, but also the approach of the measuring head to the cells, if only humidification of the cells by means of Perfusate desired is as explained above has been.
In einer bevorzugten Weiterbildung dieses Ausführungsbeispiels kann der Aktuator eine Mehrzahl von Meßköpfen tragen.In a preferred embodiment of this embodiment, the actuator carry a plurality of measuring heads.
Diese Maßnahme hat insbesondere bei der Verwendung von sogenannten Multi-Well-Platten den Vorteil, daß mehrere Zellen entlang einer Reihe oder einer Spalte der Platte parallel und gleichzeitig gemessen werden können, so daß die in den Wells der Platte enthaltenen Zellen insgesamt in einem Bruchteil der ansonsten benötigten Zeit gemessen werden können. Dabei kann selbstverständlich innerhalb der verschiedenen Aufnahmen für die Zellen mit unterschiedlichen Perfusaten gearbeitet werden, d.h. mit unterschiedlichen Testflüssigkeiten oder mit Spülflüssigkeiten. Wenn unterschiedliche Testflüssigkeiten verwendet werden, kann dies bedeuten, daß an sich dieselbe Art Testflüssigkeit, jedoch in unterschiedlicher Konzentration, verwendet wird, oder aber es können Testflüssigkeiten ganz unterschiedlicher Art eingesetzt werden.These measure has particular in the use of so-called multi-well plates the Advantage that several Cells along a row or a column of the plate in parallel and at the same time can be measured so that in the wells of the plate contained cells in total in a fraction of the otherwise required time can be measured. It goes without saying within the different shots for the cells with different ones Perfusaten be worked, i. with different test liquids or with rinsing liquids. If different test fluids this may mean that the same kind of test liquid, however, used in different concentrations, or else it can test liquids be used very different way.
Zu diesem Zweck ist es zweckmäßig, wenn die Meßköpfe relativ zum Aktuator mindestens entlang der auf die Zelle gerichteten Achse individuell verfahrbar sind.For this purpose, it is expedient for the measuring heads to be individual relative to the actuator at least along the axis directed onto the cell are movable.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, daß die Bewegungsvorgänge an einer Zelle individuell eingestellt werden können, auch wenn in der geschilderten Weise mehrere Zellen parallel vermessen werden.These measure has the advantage that the movement processes at one Cell can be adjusted individually, even if in the manner described several cells are measured in parallel.
Bei einer besonders bevorzugten Ausbildung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist der Meßkopf steckbar oder schraubbar am Aktuator befestigt.at a particularly preferred embodiment of the device according to the invention is the measuring head pluggable or screwed to the actuator.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, daß ein schneller Austausch des Meßkopfs möglich ist, ohne daß der gesamte Versuchsaufbau verändert werden muß.These measure has the advantage of being a faster Replacement of the measuring head possible is without the changed entire experimental setup must become.
In weiterer bevorzugter Ausgestaltung der Erfindung sind Mittel zum Injizieren von cDNA und/oder mRNA in die Zelle vorgesehen. Dies geschieht vorzugsweise dadurch, daß diese Mittel am Aktuator angeordnet sind.In Another preferred embodiment of the invention are means for Injecting cDNA and / or mRNA into the cell. This Preferably, this is done by having these means on the actuator are arranged.
Diese Maßnahmen haben den Vorteil, daß auch während des an sich bekannten Schritts des Injizierens dies in der erwähnten Weise automatisiert und gegebenenfalls für eine Vielzahl von Zellen gesteuert nacheinander stattfinden kann.These activities have the advantage that too while the step of injecting known per se in the manner mentioned automated and optionally for a variety of cells controlled can take place one after the other.
Es wurde bereits erwähnt, daß die Erfindung in besonders vorteilhafter Weise dann eingesetzt werden kann, wenn die Aufnahme für die Zellen als standardisierte Multi-Well-Platte ausgebildet ist.It has already been mentioned that the Invention can then be used in a particularly advantageous manner can when recording for the cells is designed as a standardized multi-well plate.
In diesem Fall wird eine besonders gute Wirkung dann erzielt, wenn die einzelnen Aufnahmen in der Platte mit einer lesbaren Codierung versehen sind und der Aktuator Mittel zum Lesen der Codierung umfaßt. Dies gilt vor allem dann, wenn die Codierung eine Bar-Codierung ist und die Mittel ein Bar-Code-Lesekopf sind.In In this case, a particularly good effect is achieved when the individual recordings in the record with a readable encoding are provided and the actuator comprises means for reading the coding. This is especially true if the encoding is a bar coding and the means are a bar code reading head.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, daß die erfindungsgemäße Vorrichtung zu Beginn des automatisierten Meßvorganges für viele Zellen an einer bestimmten, vorbestimmten Zelle in einem vorbestimmten Well beginnen kann und dann je nach Programmierung ihren Weg über die Mulit-Well-Platte fortsetzt. An jeder einzelnen Aufnahme, insbesondere an jedem einzelnen Well, kann dann durch Lesen des Bar-Codes überprüft werden, ob die Position des Meßkopfes insoweit korrekt ist.These measure has the advantage that the inventive device at the beginning of the automated measuring process for many Cells on a specific, predetermined cell in a predetermined Well can start and then depending on programming their way over the Mulit-well plate continues. At every single shot, especially at every single well, can then be checked by reading the bar code, whether the position of the measuring head so far correct.
Weitere Vorteile ergeben sich aus der Beschreibung und der beigefügten Zeichnung.Further Advantages will be apparent from the description and the accompanying drawings.
Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.It understands that the mentioned above and the features to be explained below not only in the specified combination, but also in other combinations or alone, without to leave the scope of the present invention.
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in der Zeichnung dargestellt und werden in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Es zeigen:embodiments The invention are illustrated in the drawings and in the following description explained. Show it:
In
Zum
Auffinden und Identifizieren einzelner Wells
Die
Reihen und Spalten der Wells
In
Um
die Oozyten
In
Der
Aktuator
Er
ist imstande, die Codierung
Der
Aktuator
In
Vorzugsweise
wird dabei so vorgegangen, daß zwar
die gesamte Reihe von Meßköpfen
In
den
Jeder
Meßkopf
Wie
man aus der vergrößerten Querschnittsdarstellung
gemäß
In
dem Träger
Die
Elektroden
Die
Anordnung ist dabei so gewählt,
daß die Spitzen
Die
Referenzelektroden
Die
Elektroden
Die
Referenzelektroden
Die
Perfusatleitungen
Die
sechs vorgenannten Elemente
In
So
erkennt man, daß die
erste Meßelektrode
Die
zweite Meßelektrode
Der
Perfusateinlaß
Der
Perfusatauslaß
Die
erfindungsgemäße Vorrichtung
ist ferner mit Elementen versehen, die es gestatten, die zu messenden
Oozyten
Mit
Hilfe der vorstehend erläuterten
Vorrichtung können
folgende Messungen durchgeführt
werden:
Zunächst
werden in die beispielsweise 96 Wells
First, in the example, 96 wells
Für die sich
nun anschließende
Messung wird der Aktuator
In
dieser Position wird der Meßkopf
Die
Anordnung arbeitet nun zunächst
im "current clamp"-Betrieb, in dem
der Strom im nA- bis μA-Bereich
konstant gehalten wird. Dies geschieht durch Einstellen der Stromquelle
Infolge
des zu diesem Zeitpunkt relativ niedrigen Widerstandes stellt sich
an der Meßelektrode
Der
Meßkopf
Aufgrund des sich schlagartig vergrößernden Widerstandes tritt nun ein erheblicher Spannungssprung in der Meßspannung U auf.by virtue of of abruptly increasing Resistance now occurs a significant voltage jump in the measuring voltage U up.
Die
Anordnung schaltet nun vom "current clamp"-Betrieb in den "voltage clamp"-Betrieb um. In dieser
Betriebsweise wird die Spannung U im Meßverstärker
In
diesem Augenblick ist die Förderpumpe
Insgesamt
wird auf diese Weise erreicht, daß die Testsubstanz die Oozyte
Durch
das Aufbringen der Testsubstanz verändert sich die Oozyte
Aufgrund
dessen treten Stromänderungen im
nA- bis μA-Bereich
auf, die über
den Meßverstärker
In
In
Im
ersten Feld
Das
zweite Feld
Das
Meßprotokoll
Der
Benutzer der Vorrichtung kann daher durch Betrachten des Meßprotokolls
Wenn
für ein
bestimmtes Well
Es kann sich dann eine weitere Messung anschließen, in der eine andere Meßsubstanz in der bereits beschriebenen Weise zugeführt wird. Die andere Meßsubstanz kann dabei die gleiche Meßsubstanz wie zuvor, jedoch in anderer Konzentration sein, es können jedoch auch völlig andere Meßsubstanzen zugeführt werden.It can then join another measurement in which another substance to be measured is supplied in the manner already described. The other measuring substance can be the same measuring substance as before, but in a different concentration, but it can also completely other measuring substances supplied become.
Es
versteht sich ferner, daß die
vorstehend erläuterten
Meß- und Spülschritte
auch alle in derselben Vertikalstellung z des Meßkopfes
Mit
der erfindungsgemäßen Vorrichtung
können
jedoch auch noch andere Funktionen außerhalb der eigentlichen Messungen
durchgeführt
werden:
Die in den Wells
The in the wells
Um
während
dieser längeren
Pausen vor den eigentlichen Messungen oder zwischen zwei Messungen
ein Austrocknen der Oozyten
Bei
der erfindungsgemäßen Vorrichtung
wird der Meßkopf
Es
versteht sich, daß bei
der erfindungsgemäßen Vorrichtung
der Meßkopf
Der
Meßkopf
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- 2001-02-16 DE DE10108968A patent/DE10108968B4/en not_active Expired - Fee Related
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