DE10108680A1

DE10108680A1 - Test strips for the assay of biological materials, for clinical diagnosis etc. carry affinity molecules and can take or support a flow to give time-related reactions

Info

Publication number: DE10108680A1
Application number: DE10108680A
Authority: DE
Inventors: Wilhelmina A Kaptein; Reinhard Renneberg
Original assignee: BIOGNOSTIC AG
Current assignee: BIOGNOSTIC AG
Priority date: 2001-02-23
Filing date: 2001-02-23
Publication date: 2002-09-26

Abstract

Assay system (I) comprising at least two test strips which are of flowable or flow supporting materials, is new. In (I) the test strips have either a common start point, or separate start points to take up one or more samples. The test strips have identical or different affinity molecules in increasing, decreasing or the same concentrations. The strips are preferred in the form of a barcode array in bands, points, point sequences or other geometric shapes. The end points of the lateral reaction flows can be in a direct relationship. The affinity molecules are A and G proteins or lectine or enzymes, receptors, ligands, single- and double-strand DNA or RNA or their fragments.

Description

Die Erfindung betrifft einen Assay zur schnellen und einfachen Analyse von Proben vorzugsweise biologischen Materials. Anwendungsgebiete der Erfindung sind vor allem die medizinische Diagnostik, die pharmazeutische Industrie und der Umweltschutz.The invention relates to an assay for the quick and simple analysis of samples preferably biological material. Areas of application of the invention are primarily medical diagnostics, the pharmaceutical industry and environmental protection.

State of the art

Die Verwendung spezifischer Affinitätsassays, zum Beispiel Immunoassays; Rezeptor- und DNA-Assays, ist von immer größerer Bedeutung für klinische und zahlreiche andere Anwendungen. Zur Analyse von biologischen Materialien, insbesondere von Körperflüssigkeiten, sind zahlreiche Verfahren bekannt. Sehr gebräuchlich ist der "Immuno- Lateral-Flow-Test". Der bei dieser Untersuchung angewendete Assay setzt sich aus vier Teilen auf einem Teststreifen zusammen: einem Probenfeld, einem Konjugatfeld, einem Analysenfeld (üblicherweise eine Nitrocellulosemembran) und einem Absorptionsfeld. Die Probenflüssigkeit fließt durch das Probenfeld mittels Kapillarkräfte in das Konjugatfeld. In und auf dem Konjugatfeld sind markierte Antikörper (z. B. mit kolloidalem Gold markiert, was eine Rotfärbung ergibt, oder mit Enzymen) gespeichert. Die Probenflüssigkeit fließt durch dieses Konjugatfeld und löst somit die markierten Antikörper ab. Die Probenlösung fließt dann, die markierten Antikörper und den Analyten mitführend, von dem Konjugatfeld in das Analysenfeld, auf dem Fängerantikörper adsorbiert sind. Schließlich fließt sie durch die Membran des Analysenfeldes zum Absorptionsfeld. Zusammen bilden sie den Teststreifen.The use of specific affinity assays, for example immunoassays; Receptor and DNA assays is of increasing importance for clinical and numerous others Applications. For the analysis of biological materials, especially of Body fluids, numerous procedures are known. The "immuno- Lateral Flow Test ". The assay used in this study consists of four Split together on a test strip: a sample field, a conjugate field, one Analysis field (usually a nitrocellulose membrane) and an absorption field. The Sample liquid flows through the sample field into the conjugate field by means of capillary forces. In and labeled antibodies (e.g., colloidal gold, which results in a red color, or with enzymes). The sample liquid flows through this conjugate field and thus removes the labeled antibodies. The sample solution then flows from the conjugate field, carrying the labeled antibodies and the analyte into the analysis field on which capture antibodies are adsorbed. Finally it flows through the Membrane of the analysis field to the absorption field. Together they form the test strip.

Gewöhnlich sind zwei immun-reaktive Linien auf dem Analysenfeld fixiert: eine für die Feststellung des interessierenden Analyten (z. B. Antikörper gegen einen Herzinfarktsmarker wie Troponin I) und eine dahinter gelegene Linie als positive Kontrolle für den Test (z. B. Antimaus-Antikörper). Der Teststreifen kann sich in einem zusätzlichen Plastikhalter befinden oder direkt in die Flüssigkeit getaucht werden. In einem Teststreifen für mehr als einen Parameter vergrößert sich dieser doppelte Bindebereich um die Zahl der Analyten, die mehr gemessen werden, z. B. gibt es für 3 Analyten drei Bindebereiche, die für den Analyten spezifisch sind, und einen zur Kontrolle, dass die verwendeten Antikörper intakt sind.Usually two immunoreactive lines are fixed on the analysis field: one for the Identification of the analyte of interest (e.g. antibodies against a heart attack marker like Troponin I) and a line behind it as a positive control for the test (e.g. Anti-mouse antibody). The test strip can be in an additional plastic holder located or immersed directly in the liquid. In a test strip for more than One parameter increases this double binding area by the number of analytes that be measured more, e.g. B. there are three binding areas for 3 analytes, those for the analyte are specific, and one to check that the antibodies used are intact.

Ist kein Analyt in der Probe enthalten, fließen die markierten Antikörper ungehindert zum Absorbtionsfeld und binden lediglich am Kontrollantikörper. Über die rote Farbe des kolloidalen Goldmarkers zeigen sie, daß der Assay prinzipiell funktioniert. Ist dagegen Analyt (z. B. Troponin I) in der Probe, bindet er zuerst im Konjugatfeld an die goldmarkierten Antikörper und fließt mit ihnen in die Analysenfeld. Dort bindet der Komplex aus Analyt (Troponin I) und markierten Antikörpern an die fixierten Fängerantikörper gegen den Analyten (Troponin I). Der nichtgebundene Rest der markierten Antikörper (ohne Analyt) bindet an die dahintergelegenen Kontrollantikörper. Die zwei roten Linien zeigen somit das Analytsignal und das Kontrollsignal.If there is no analyte in the sample, the labeled antibodies flow freely Absorption field and bind only to the control antibody. About the red color of the colloidal gold markers, they show that the assay works in principle. But is an analyte (e.g. Troponin I) in the sample, it first binds to the gold-marked in the conjugate field Antibodies and flows with them into the analysis field. The analyte complex binds there (Troponin I) and labeled antibodies to the fixed catcher antibodies against the Analytes (Troponin I). The unbound rest of the labeled antibodies (without analyte) binds to the control antibodies behind. The two red lines show that Analyte signal and the control signal.

Ähnliche Assays sind für Rezeptoren und DNA möglich, wenngleich auch noch nicht weitpraktiziert wie bei Immunoassays.Similar assays are possible for receptors and DNA, although not yet widely practiced as with immunoassays.

R. F. Zuk et al. (Clinical Chemistry 31, 1144-1150, 1985) beschreiben einen "immunografischen" Assay in Streifenform fuer den niedermolekularen Analyten Theophyllin. Ein Streifen, der ueber die volle Länge mit Antiköpermolekuelen gegen Theophyllin beschichtet ist, wird mit einem Ende in eine Loesung eingetaucht, die den Analyten (Theophyllin) und ein Theophyllin-Enzym-Konjugat enthaelt. Beide bewegen sich durch Kapilarkraefte aufwärts und konkurrieren um die Bindung an die Antikoerper. Nach Eintauchen in eine Enzymsubstratlösung entwickelt sich an den Bindungsstellen des Theophillin-Enzym-Konjugats ein gefaerbtes Produkt. Der Assay wird quantifiziert ohne zusätzliche Geräte, indem die Höhe der gefärbten Zone gemessen wird. Bei geringer Theophyllinkonzentration werden die Enzym-Konjugate bereits vollständig an den ersten Antikörpern gebunden. Bei hoher Theophyllinkonzentration binden sich dagegen Theophyllin und Enzymkonjugate konkurrierend an den Antikörpern und eine grössere gefärbte Zone entsteht. Nachteilig sind die zwei umständlichen Inkubationsschritte, die einen Einsatz beispielsweise in der Notfallmedizin unmöglich machen, und die lange Wartezeit zur Entwicklung der Farbreaktion. Korrekturfaktoren sind nicht vorhanden. Im US-Patent 4,435,504 wird von Zuk et al. zudem beschrieben, dass der Test auch ohne Enzym-Analyt- Konjugat erfolgen kann, dieses spaeter erst als Entwicklerloesung zugesetzt wird und danach eine zweite Inkubation mit dem Enzymsubstrat stattfindet.R. F. Zuk et al. (Clinical Chemistry 31, 1144-1150, 1985) describe one "Immunographic" assay in strip form for the low molecular weight analyte Theophylline. A strip of anti-antibody molecules along its full length Theophylline is coated, with one end immersed in a solution that the Contains analytes (theophylline) and a theophylline-enzyme conjugate. Both are moving through capillary forces and compete for binding to the body. To Immersion in an enzyme substrate solution develops at the binding sites of the Theophillin-enzyme conjugate is a colored product. The assay is quantified without additional equipment by measuring the height of the colored zone. With less Theophylline concentration, the enzyme conjugates are already completely at the first Antibodies bound. In contrast, theophylline binds at high theophylline concentrations and enzyme conjugates competing on the antibodies and a larger stained zone arises. Disadvantages are the two cumbersome incubation steps that use one in emergency medicine, for example, and the long waiting time Development of the color reaction. Correction factors are not available. In the U.S. patent 4,435,504 is described by Zuk et al. also described that the test can also be carried out without Conjugate can take place, this is added later as a developer solution and then a second incubation with the enzyme substrate takes place.

Eine Vielzahl von Immuntests ist heute verfügbar (Uebersicht in P. Tijssen: Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Elsevier Amsterdam 1985, S. 9-20; D. S. Hage, Immunoassays. Analytical Chemistry 71 (12) 1999, S. 294R-304R). Sie alle nutzen die einzigartigen Eigenschaften der Antikörper, die spezifische Erkennung und Bindung von Molekülen, zur Analyse. Diese Bindungsmöglichkeiten sind jedoch stark von Variablen wie Expositionszeit, von umgebenden Moleküle, die stören oder die Viskosität erhöhen, abhängig oder phasenabhängig (z. B. eine feste Phase, an die ein Antikörper gebunden ist). Die Bindung eines Antikörpers an ein Antigen hängt daher von verschiedenen Faktoren ab. Assays, die eine Quantifizierung eines Analyten zum Ziel haben, müssen deshalb einen internen oder externen Korrekturfaktor enthalten.A large number of immunoassays are available today (overview in P. Tijssen: Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Elsevier Amsterdam 1985, pp. 9-20; D. S. Hage, Immunoassays. Analytical Chemistry 71 (12) 1999, pp. 294R-304R). They all use it unique properties of the antibodies, the specific detection and binding of Molecules, for analysis. However, these attachment options are strongly dependent on variables such as Exposure time, depending on surrounding molecules that interfere or increase viscosity or phase-dependent (e.g. a solid phase to which an antibody is bound). The connection an antibody to an antigen therefore depends on various factors. Assays that To quantify an analyte, an internal or external correction factor included.

Ähnliches gilt für andere Affinitätsassays wie DNA-Assays. Hier werden meist an eine Oberfläche fixierte DNA-Bruchstücke durch Oligonucleotid-Sonden (probes) erkannt, die sich binden und markiert sind. Auch diese Assays und wie auch Rezeptor-Assays brauchen Korrekturfaktoren, um quantifizierbar zu sein.The same applies to other affinity assays such as DNA assays. Here are usually at one Surface-fixed DNA fragments recognized by oligonucleotide probes (probes) that bind and are marked. These assays as well as receptor assays also need Correction factors to be quantifiable.

Bei vielen klinischen Analysatoren und automatisierten Assays werden die o. g. Probleme durch eine Kombination verschiedener Methoden gelöst. Häufig ist eine Verdünnungsstufe in die Assays einbezogen, um den sog. "Matrixeffekt" (z. B. Viskosität, störende Verbindungen) zu minimieren. Für die Kalibrierung des Signals werden Standardproben verwendet. Das macht erforderlich, daß Spezialisten den Test durchführen und es kann häufig nur mit einer großen Probenreihe erfolgen (z. B. im Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA). Daher sind die meisten klinischen Analysatoren und automatisierten Assays für die "Point-of-care"- Notfalltestung nicht geeignet.Many clinical analyzers and automated assays use the above. issues solved by a combination of different methods. Often a dilution level is in the assays included to determine the so-called "matrix effect" (e.g. viscosity, interfering compounds) to minimize. Standard samples are used to calibrate the signal. The requires specialists to perform the test, and often only one large number of samples (e.g. in the enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA). Therefore are most clinical analyzers and automated assays for the "point-of-care" - Emergency testing is not suitable.

Aufgrund fehlender Korrekturfaktoren für signalgenerierende Parameter sind bisher nur qualitative oder halbquantitative (d. h., eine Konzentration oberhalb eines bestimmten Wertes anzeigende) für Lateral-flow-Teststreifen bzw. Teststreifens möglich gewesen. Daher ist es bei den gegenwärtig verfügbaren Methoden nicht möglich, ein und denselben Assay z. B. sowohl für Serum als auch Plasma zu verwenden, da sie eine sehr unterschiedliche Viskosität aufweisen. Darüber hinaus erfordert die Auswertung eines "quantitativen" Lateral-flow- Assays (Teststreifen) ein Spezialgerät (Reader) für das "Lesen". Visuell kann nur eine qualitative Bestimmung durch Festlegung eines Schwellenwertes erfolgen.Due to the lack of correction factors for signal-generating parameters, so far only qualitative or semi-quantitative (i.e., a concentration above a certain value indicating) for lateral flow test strips or test strips was possible. Therefore, it is with the currently available methods not possible to use one and the same assay e.g. B. Can be used for both serum and plasma as they have very different viscosities exhibit. In addition, the evaluation of a "quantitative" lateral flow Assays (test strips) a special device (reader) for "reading". Visually only one can qualitative determination by setting a threshold.

Ein wichtiges Anwendungsgebiet für diese Assays ist die Diagnose von Herzinfarkten. Während das klassische EKG nur in etwa 40-50% der Fälle bei Ankunft im Krankenhaus eine klare diagnostische Aussage trifft, kann ein "früher" biochemischer Herzinfarkt-Marker wie Fatty Acid-Binding Protein (FABP) die Frühdiagnose wesentlich verbessern (Renneberg, R., Cheng, S., Kaptein, W. A., McNeil, C. J., Rishpon, J., Gründig, B., Sanderson, J., Chu, A., Glatz, J. F. C. Novel immunosensors for rapid diagnosis of acute myocardial infarction: A case report, Advances in Biosensors ed. A. P. F. Turner, R. Renneberg, Biosensors: a Chinese perspective, Vol 4 (1999).)An important area of application for these assays is the diagnosis of heart attacks. While the classic EKG only occurs in about 40-50% of the cases upon arrival in the hospital A "previous" biochemical heart attack marker can make a clear diagnostic statement How Fatty Acid-Binding Protein (FABP) significantly improves early diagnosis (Renneberg, R., Cheng, S., Kaptein, W.A., McNeil, C.J., Rishpon, J., Gründig, B., Sanderson, J., Chu, A., Glatz, J.F.C. Novel immunosensors for rapid diagnosis of acute myocardial infarction: A case report, Advances in Biosensors ed. A. P. F. Turner, R. Renneberg, Biosensors: a Chinese perspective, vol 4 (1999).)

Die bisher verfügbaren Tests für "späte" Herzinfarkt-Marker sind jedoch entweder Labortests, die somit gutausgebildetes Personal, teuere Apparate und eine lange Verweilzeit erfordern, oder es sind Schnelltests. Diese messen verschiedene Markermoleküle mit einem kalibrierten Lesegerät quantitativ erst Stunden nach dem Infarktereignis (z. B. den "späten" Marker Troponin T von Roche, Patent EP 00394819A2) oder nur qualitativ (z. B. Jackowski, George von Spectral, US-Patent 5604105).However, the tests available so far for "late" heart attack markers are either laboratory tests, which therefore require well-trained personnel, expensive equipment and a long dwell time, or they are quick tests. These measure different marker molecules with a calibrated one Quantitative reader only hours after the infarction event (e.g. the "late" marker Troponin T from Roche, patent EP 00394819A2) or only qualitatively (e.g. Jackowski, George from Spectral, U.S. Patent 5604105).

Object of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen schnellen und zuverlässigen Assay zur Untersuchung von vorzugsweise biologischen Materialien zu entwickeln. Er soll einfach zu handhaben sein (möglichst ohne Meßinstrumente) und zu weitgehend quantitativen Ergebnissen führen.The invention has for its object to provide a fast and reliable assay To develop studies of preferably biological materials. He is just supposed to be handled (if possible without measuring instruments) and largely quantitative Lead results.

Essence of the invention

Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert. Die Hauptidee besteht darin, zum einen mindestens 2 Messungen einer Probe gleichzeitig oder zum anderen gleichzeitig oder zeitlich versetzt Messungen von mindestens 2 verschiedenen Proben durchzuführen und deren Ergebnisse zu vergleichen.The invention is implemented according to the claims. The main idea is, on the one hand at least 2 measurements of a sample simultaneously or on the other simultaneously or in time to carry out measurements of at least 2 different samples and their Compare results.

Der erfindungsgemäße universelle Affinitätsassay zur Untersuchung von biologischen Materialien besteht dem gemäß aus mindestens 2 Teststreifens aus fließfähigen oder flussunterstützendem Material, die
The universal affinity assay according to the invention for examining biological materials accordingly consists of at least 2 test strips made of flowable or flow-supporting material which

- either a common starting point or separate starting points for recording have one or more samples,
- With the same or different affinity molecules in ascending, descending or the same concentration, preferably prepared in the form of barcode-like arrays are and
- Are arranged so that preferably the end points of the test strips ongoing reactions can be directly related.

Bevorzugt ist die Verwendung von 2 Teststreifen, aber auch 3 und mehr Teststreifen sind für die Lösung bestimmter Aufgabenstellungen durchaus von Vorteil.The use of 2 test strips is preferred, but 3 and more test strips are also suitable for the solution of certain tasks is an advantage.

Bevorzugte Materialien für die Teststreifen sind Cellulosemembranen, aber auch Glasfiber, Nylon, andere Flüssigkeitsträger, wie Papier, Baumwolle oder teststreifenähnliche Strukturen aus Glas, Silicon, Plastik, Metall mit eingebrachten Kanälen oder poröse Materialien.Preferred materials for the test strips are cellulose membranes, but also glass fiber, Nylon, other liquid carriers such as paper, cotton or structures similar to test strips made of glass, silicone, plastic, metal with channels or porous materials.

Wenn man den erfindungsgemäßen Assay zur parallelen Messung einer einzigen Probe benutzen will, empfiehlt sich, daß die Teststreifen einen gemeinsamen Startpunkt zur Aufnahme der Probe haben. Wenn dagegen mehr als eine Probe gleichzeitig oder zeitlich versetzt gemessen werden soll, sind räumlich getrennte Startpunkte erforderlich.If the assay according to the invention for parallel measurement of a single sample it is recommended that the test strips have a common starting point for Have a sample. If, on the other hand, more than one sample occurs simultaneously or in time spatially separated starting points are required.

Die erfindungsgemäßen Teststreifen können mit identischen oder unterschiedlichen Affinitätsmolekülen in "Strichcode"-Form präpariert sein, wobei die Konzentration im Normalfall gleich bleibt. Sie kann jedoch auch aufsteigend oder absteigend sein. Die Abstände und Dicke der Affinitätsmolekül-"Striche" oder Linien (engl. bands) können gleichmässig oder ungleichmässig sein.The test strips according to the invention can be identical or different Affinity molecules in "barcode" form be prepared, the concentration in Usually remains the same. However, it can also be ascending or descending. The Spacing and thickness of the affinity molecule "dashes" or bands be even or uneven.

Die wichtigste Ausführungsform der Assays sind Teststreifen mit strichcode-ähnlichen Arrays, die auf der Oberfläche mindestens 2 Linien, Punkte oder andere geometrische Flächen verschiedener Groesse enthalten, die durch fixierte Affinitätsmoleküle gebildet sind. In den meisten Fällen sind 3 bis 10 Linien notwendig. Es koennen aber auch bis 200 Linien verwendet werden. Im Normalfall sind die Linien des Strichcode-Arrays in gleichen Abständen angeordnet, aber auch unterschiedliche Abstände und Dicken können in bestimmten Fällen zweckmäßig sein. Variationen je nach konkreter Aufgabe sind auch bezüglich der Konzentration der Affinitätsmoleküle per Linie möglich. Es können aber auch unterschiedliche Affinitätsmoleküle kombiniert werden. Anstelle von Linien können auch Punkte (dots) oder andere geometrische Formen und Flächen verwendet werden.The most important embodiment of the assays are test strips with bar code-like Arrays that have at least 2 lines, points or other geometric surfaces on the surface contain different sizes, which are formed by fixed affinity molecules. In the in most cases 3 to 10 lines are necessary. However, up to 200 lines can also be used be used. Normally the lines of the barcode array are the same Spaces arranged, but also different distances and thicknesses can be in be appropriate in certain cases. There are also variations depending on the specific task possible with regard to the concentration of the affinity molecules per line. But it can also different affinity molecules can be combined. Instead of lines, too Dots or other geometric shapes and surfaces can be used.

Die Art der Affinitätsmoleküle ist variabel, z. B. können verschiedene monoklonale oder polyklonale Antikörper oder deren Fragmente oder Fusionsprodukte eingesetzt werden, Protein A und G, Lectine, ferner Enzyme oder deren Substrate, Pseudosubstrate, Inhibitoren oder Aktivatoren, Cofaktoren, Rezeptoren, Liganden, ein- und doppelsträngige DNA oder RNA oder deren Fragmente, Aptamere oder sogenannte imprinted polymers.The type of affinity molecules is variable, e.g. B. can be different monoclonal or polyclonal antibodies or their fragments or fusion products are used, Protein A and G, lectins, also enzymes or their substrates, pseudo-substrates, inhibitors or activators, cofactors, receptors, ligands, single and double stranded DNA or RNA or its fragments, aptamers or so-called imprinted polymers.

Wichtig ist die gewinkelte Anordnung der mindestens 2 Teststreifen, wobei eine rechtwinklige Anordnung bevorzugt wird. Auch andere Winkel können erfindungsgemäß gewählt werden. Ebenfalls möglich ist eine parallele Anordnung: zwei Teststreifen sind im Winkel von null Grad angeordnet, verlaufen also parallel oder sind zu einem Streifen ueberlagert und somit verschmolzen sind.What is important is the angled arrangement of the at least 2 test strips, one of which rectangular arrangement is preferred. Other angles can also be used according to the invention to get voted. A parallel arrangement is also possible: two test strips are in the Angles of zero degrees are parallel, or are in a strip are superimposed and thus fused.

Nach Durchführung der Testreaktion können die Endpunkte auf vielerlei Weise abgelesen werden: Eine Methode ist die Bestimmung der Winkel zwischen den Endpunkten. Abb. 1 zeigt eine schematische Darstellung. Die Ergebnisse werden vom Anwender mit einer kalibrierten Skala verglichen.. Es ist ebenfalls möglich, die verschiedenen Signale zu vergleichen und auf einer matrixähnlichen Tabelle zu vergleichen. Es kann auch die Anzahl der gefärbten Linien ausgezählt werden.After the test reaction has been carried out, the end points can be read in a number of ways: one method is the determination of the angles between the end points. Fig. 1 shows a schematic representation. The results are compared by the user with a calibrated scale. It is also possible to compare the different signals and to compare them on a matrix-like table. The number of colored lines can also be counted.

Im speziellen Fall der Ueberlagerung von Teststreifen oder des Verschmelzens zu einem Streifen (Winkel null Grad) sind die Signale fuer die verschiedenen Reaktionen farblich unterscheidbar (z. B. blau und rot und weitere Farben) und die Endpunkte werden ausgezaehlt.In the special case of overlaying test strips or fusing into one Stripes (angle zero degrees) are the signals for the different reactions in color distinguishable (e.g. blue and red and other colors) and the end points out counts.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Analyse von Flüssigkeiten mittels des beschriebenen Assays ist also dadurch gekennzeichnet, daß Proben der Flüssigkeit am Startpunkt des Teststreifen-Winkels aufgetragen werden, die nach Ablauf der Reaktion auf dem Streifen entstehenden Markierungen verbunden werden und eine Messung des entstandenen Winkels und Vergleich mit einer kalibrierten Skala oder der Matrixtabelle erfolgt. Der Vergleich kann auch dadurch erfolgen, daß die erste Probe als "Kalibrator" für die zweite Probe fungiert.The method according to the invention for analyzing liquids by means of the described Assays is therefore characterized in that samples of the liquid at the starting point of the Test strip angles are applied after the reaction on the strip emerging markings are connected and a measurement of the resulting angle and comparison with a calibrated scale or the matrix table. The comparison can also done in that the first sample acts as a "calibrator" for the second sample.

Das Verfahren kann so gestaltet werden, daß Proben einer Flüssigkeit an der Verbindungsstelle des Teststreifen-Winkels aufgetragen werden und die Teststreifen sich unterscheiden. Dabei kann ebenfalls einer der Teststreifen als "Kalibrator" für die anderen dienen.The method can be designed so that samples of a liquid on the Junction of the test strip angle are applied and the test strips themselves differ. One of the test strips can also act as a "calibrator" for the others serve.

Ein dazu alternatives Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß verschiedene Proben auf verschiedenen Startpunkten aufgetragen werden und die Teststreifen identisch sind.An alternative method is characterized in that different samples different starting points and the test strips are identical.

Wichtig ist auch die Möglichkeit, Proben zeitlich versetzt auf räumlich getrennte Startpunkte aufzutragen und dann die Endpunkte zu bestimmen. Das ist z. B. bei der Untersuchung von Herzinfarktpatienten vorteilhaft. Man trägt von einem Patienten in zeitlichem Abstand entnommene aufeinanderfolgende Proben auf und analysiert damit den Krankheitsverlauf.It is also important to be able to place samples at different points in time plotted and then determine the end points. That is e.g. B. in the investigation of Heart attack patients beneficial. One carries one patient at a time consecutive samples taken and thus analyzes the course of the disease.

Die mit blossem Auge oder ein Messinstrument auswertbaren farbigen Endpunkte bzw. Endlinien entstehen durch markierte Antikörper, die über Analyten (Antigene) an streifenfixierten Fängerantikörpern gebunden sind.The colored endpoints that can be evaluated with the naked eye or a measuring instrument or End lines are created by labeled antibodies that pass through analytes (antigens) streak-fixed capture antibodies are bound.

Durch die visuelle Auswerung mit nacktem Auge oder Auswertung mit einem optischen oder optoelektronischen Instrument ist eine quantitative Bestimmung der Analytkonzentration möglich.By visual evaluation with the naked eye or evaluation with an optical or optoelectronic instrument is a quantitative determination of the analyte concentration possible.

Der hier vorgeschlagene Assay erlaubt eine genaue quantitative Analyse für Analyte auch ohne die notwendige Verwendung eines zusätzlichen Gerätes. Des weiteren ermöglicht es, die Spezifizität durch Bestimmung der Quelle der weniger spezifischen Marker zu erhöhen (durch Anwendung der Verhältnisanalyse, zum Beispiel des FABP/Myoglobin-Verhältnisses) und/oder einer Zeitfolge eines Markers (und ermöglicht es somit einem Patienten, seine eigene "Negativkontrolle" zu sein).The assay proposed here also allows accurate quantitative analysis for analytes without the need to use an additional device. Furthermore, it enables the Increase specificity by determining the source of the less specific marker (using the ratio analysis, for example the FABP / myoglobin ratio) and / or a time sequence of a marker (and thus enables a patient to to be your own "negative control").

Die Vorteile des neuen Assays gemäß der Erfindung sind:
Der Assay ist billig und sehr einfach zu handhaben. The advantages of the new assay according to the invention are:
The assay is cheap and very easy to use.

Er kann mit einer minimalen Probemenge durchgeführt werden, d. h., es werden keine so großen Probemengen wie in ELISAs werden benötigt.It can be performed with a minimal sample amount, i.e. that is, none will large sample quantities as in ELISAs are required.

Man hat nach wenigen Minuten bereits das Resultat.You have the result after just a few minutes.

Besonders vorteilhaft ist, daß er von technischen Kräften (z. B. Krankenschwestern) oder sogar von Laien durchgeführt werden kann.It is particularly advantageous that it is used by technical staff (e.g. nurses) or even can be carried out by laypeople.

Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.The invention will be explained in more detail below by means of exemplary embodiments.

embodiments

Technische Möglichkeiten für Auswertung (siehe Abb. 1)Technical options for evaluation (see Fig. 1)

1. Angle Measurement
2. Tabular matrix
3. Area measurement

example 1 Quantification of the signal; Correction of the matrix effects

In den Lateral-flow-tests, insbesondere in den unverdünnten Vollbluttests, spielt die Matrix eine wichtige Rolle für das gesamte Signal am Ende der Messung.The matrix plays in the lateral flow tests, especially in the undiluted whole blood tests an important role for the entire signal at the end of the measurement.

Hohe Viskosität erhöht z. B. das gesamte Signal auf einem einzigen Linie, da es die Strömungsgeschwindigkeit auf dem Teststreifen herabsetzt und es somit dem Antikörper ermöglicht, Antigen in größeren Mengen zu binden. Im Lateral-flow-test mit mehr als einer Linie bedeutet höhere Viskosität ein höheres Signal in der ersten Linie, jedoch weniger gefärbte Linien, da die gesamte Antigenmenge schneller erschöpft ist.High viscosity increases e.g. B. the entire signal on a single line, since it is the Flow rate on the test strip decreases and thus the antibody makes it possible to bind antigen in larger quantities. In the lateral flow test with more than one Line means higher viscosity, a higher signal in the first line, but less colored lines because the entire amount of antigen is exhausted more quickly.

Um diesen Effekt zu korrigieren, kann man den Test mit einem Kontrollstreifen kombinieren. Dieser Streifen korrigiert den Test bezueglich der Matrixeffekte. Dabei ist eine bestimmte Menge eines (direkt oder indirekt) nachweisbaren markierten Analyten vorhanden, die an ein Affinitätsmolekül binden kann. Andere Elemente, die die Bindung beeinflußen können, sind z. B. spezifische Arzneimittel (Heparin), die Fettkonzentration im Blut, nach Hämolyse.To correct this effect, the test can be combined with a control strip. This streak corrects the test for matrix effects. There is a certain one Amount of a (directly or indirectly) detectable labeled analyte present that is present in a Can bind affinity molecule. Other elements that can affect binding are z. B. specific drugs (heparin), the fat concentration in the blood, after hemolysis.

Eine Probe, die beispielsweise auf den frühen Herzinfarktmarker Fettsäurebindungsprotein (FABP) untersucht werden soll, wird am gleichen Startpunkt zwischen zwei gewinkelten Teststreifen (Analysestreifen 1 und Kontrollstreifen 2) aufgegeben und teilt ihren Fluss. Die Konjugatfelder der beiden Streifen tragen die gleichen goldmarkierten Anti-FABP- Antikörper. Auf der Analysenfeld des Analysenteststreifens (1) sind Anti-FABP-Antikörper, auf der Analysenfeld des Kontrollteststreifens (2) dagegen Anti-Maus-Antikörper fixiert. Eine grafische Darstellung dieses Beispiels ist in Abb. 2 zu sehen.A sample that is to be examined, for example, for the early heart attack marker fatty acid binding protein (FABP) is placed at the same starting point between two angled test strips (analysis strip 1 and control strip 2) and divides their flow. The conjugate fields of the two strips carry the same gold-labeled anti-FABP antibodies. Anti-FABP antibodies are fixed on the analysis field of the analysis test strip (1), but anti-mouse antibodies are fixed on the analysis field of the control test strip (2). A graphic representation of this example can be seen in Fig. 2.

Wenn bei einem Herzinfarkt und einer gleichgrossen Menge an FABP die Probe eine hohe Viskosität hat (A), werden weniger Linien des Analyseteststreifens (A1) gefärbt sein als bei geringer Viskosität (B1). Da Analyse- und Kontrollstreifen aber die gleichen Bedingungen haben, bleibt der Winkel zwischen in beiden Fällen A und B zwischen den Endpunkten unverändert.If with a heart attack and an equal amount of FABP the sample is high Viscosity has (A), fewer lines of the test strip (A1) will be colored than in low viscosity (B1). Since analysis and control strips, however, the same conditions the angle between A and B in both cases remains between the end points unchanged.

Wenn kein Herzinfarkt vorliegt und somit die Konzentration an FABP in der Probe sehr niedrig ist (C und D), werden auf dem Analysestreifen (C1) bei hoher Viskosität weniger Linien sichtbar werden als bei niedriger Viskosität (D1). Auch hier bleibt der Winkel gleich und ist unabhängig von der Viskosität der Probe.If there is no heart attack and therefore the concentration of FABP in the sample is very high is low (C and D), less on the analysis strip (C1) at high viscosity Lines become more visible than with low viscosity (D1). Here, too, the angle remains the same and is independent of the viscosity of the sample.

Der Winkel bei Herzinfarkt unterscheidet sich jedoch vom Winkel bei Nichtvorliegen eines Infarktes.The angle in heart attack differs from the angle in the absence of one Infarction.

Wenn der Winkel zwischen den Teststreifen null Grad betraegt (Abb 2E bis H), somit die Teststreifen parallel vorliegen oder letztlich zu einem Streifen ueberlagert sind, kann durch unterschiedliche farbliche Markierung die Analysereaktion von der Kontrollreaktion unterschieden werden. Durch Auszaehlen der Linien kann eine eindeutige Aussage ueber das Vorliegen eines Herzinfarktes, unabhaengig von Matrixeffekten wie Viskositaet, erfolgen.If the angle between the test strips is zero degrees (Fig. 2E to H), then the Test strips can be present in parallel or ultimately overlaid on a strip different colored markings the analysis reaction from the control reaction be distinguished. By counting the lines, a clear statement about the There is a heart attack, regardless of matrix effects such as viscosity.

Example 2 Increasing the specificity of the assay, the ratio between Cardiac muscle damage and skeletal muscle damage (FABP and myoglobin)

Viele im Blut enthaltene Analyte sind für bestimmte Krankheiten nicht spezifisch, während sie in verschiedenen physiologischen oder pathologischen Situationen erhöht sein können. Zum Beispiel sind Myoglobin und FABP im Blut relativ zeitig nach einem Herzanfall erhöht, da sie von dem sterbenden Herzmuskelgewebe schnell freigesetzt werden. Sie sind jedoch auch im Skelettmuskel vorhanden und daher auch im Fall einer Skelettmuskelschädigung erhöht, z. B. im Fall von übermäßigem Training. Im Herzmuskel beträgt allerdings das Verhältnis FABP zu Myoglobin 1 : 4.5 und im Skelettmuskel 1 : 20 bis 1 : 70.Many analytes in the blood are not specific for certain diseases, while they can be elevated in various physiological or pathological situations. For example, myoglobin and FABP are increased in the blood relatively early after a heart attack, because they are released quickly by the dying heart muscle tissue. However, you are also present in the skeletal muscle and therefore also in the case of skeletal muscle damage increased, e.g. B. in the case of excessive training. In the heart muscle, however, that is FABP to myoglobin ratio 1: 4.5 and in the skeletal muscle 1:20 to 1:70.

Durch eine Analyse beider Parameter in einem Test ist es daher möglich, die zwei verschiedenen Quellen (Herz- und Skelettmuskel) zu trennen. Eine Darstellung wird in Abb. 3 gegeben. Dabei tragen der eine (1) der gewinkelten Teststreifen auf dem Konjugatfeld goldmarkierte Antikörper gegen FABP und auf dem analysenfeld fixierte Antikörper gegen FABP der andere (2) auf den Konjugat- und Analysefeldern goldmarkierte Antikörper gegen Myoglobin und fixierte Antikörper gegen Myoglobin.By analyzing both parameters in one test, it is therefore possible to separate the two different sources (heart and skeletal muscle). An illustration is given in Fig. 3. One (1) of the angled test strips on the conjugate field has gold-labeled antibodies against FABP and on the analysis field fixed antibodies against FABP the other (2) gold-labeled antibodies against myoglobin and fixed antibodies against myoglobin on the conjugate and analysis fields.

Bei Herzinfarkt (A) entsteht ein völlig anderer Winkel zwischen den Endpunkten als bei Skelettmuskel-Schaden (B). Dieser Winkel ist wiederum nur abhängig vom FABP: Myoglobin-Verhältnis, nicht von Matrixeffekten.Heart attack (A) creates a completely different angle between the end points than that of Skeletal muscle damage (B). This angle is only dependent on the FABP: Myoglobin ratio, not matrix effects.

Example 3 Time difference to allow the patient to control himself; Difference between heart attack, angina pectoris and non-heart related chest pain

Wenn ein Patient mit Brustschmerzen zum Arzt kommt, kann das durch einen Herzinfarkt, Angina pectoris oder durch andere Prozesse (nicht-herz bedingten Brustschmerzen) verursacht sein.If a patient with chest pain comes to the doctor, it can be caused by a heart attack, Angina pectoris or other processes (non-heart-related chest pain) be caused.

Wenn von diesem Patienten zwei aufeinanderfolgende Proben (1 und 2) genommen werden, z. B. 30 Minuten nacheinander, kann die erste Probe als Standard (Kontrolle) für die andere genommen werden. Dazu werden 2 identische Teststreifen mit getrennten Startpunkten kombiniert.If two consecutive samples (1 and 2) are taken from this patient, z. B. 30 minutes in a row, the first sample can be used as a standard (control) for the other be taken. For this, 2 identical test strips with separate starting points combined.

Wenn kein Herzinfarkt vorliegt (Abb. 4A), sondern nicht-herzbedingte Brustschmerzen, dann ist nach 30 min keine Veränderung zur Kontrolle auf dem Streifen sichtbar (in der Abbildung beispielsweise ein 6 : 6 Verhältnis).If there is no heart attack ( Fig. 4A), but non-heart-related chest pain, then after 30 minutes no change to the control on the strip is visible (for example, a 6: 6 ratio in the figure).

Im Falle eines Herzinfarktes (B) ist jedoch der erste Wert schon deutlich über normal und der zweite erheblich höher sein sollte, als ersten Probe (zum Beispiel ein 6 : 13 Verhältnis). Bei dem Warnzeichen Angina pectoris (anhaltende Brustbeinschmerzen) (C) ist nach 30 min ein geringfügiger Anstieg der FABP-Konzentration zu sehen (zum Beispiel 6 : 8).In the case of a heart attack (B), however, the first value is clearly above normal and the the second should be significantly higher than the first sample (for example a 6:13 ratio). With the warning sign angina pectoris (persistent sternum pain) (C) after 30 min a slight increase in the FABP concentration can be seen (for example 6: 8).

Diese Methode ermöglicht es, die Zeit zu verkürzen, bevor gewisse Analyte diagnostiziert werden, während der Patient durch eigene Werte sich selbst kontrollieren zw. standardisieren kann. Zusaetzlich werden mit dieser Teststreifenkombination Matrixeffekte korrigiert.This method makes it possible to shorten the time before certain analytes are diagnosed standardize while the patient controls himself by his own values can. In addition, this test strip combination corrects matrix effects.

Claims

1. Universal assay for the investigation of preferably biological materials, consisting of at least 2 test strips made of flowable or flow-supporting material
either have a common starting point or separate starting points for taking one or more samples,
are prepared with the same or different affinity molecules in ascending, descending or the same concentration,
preferably in the form of a bar code-like array in the form of lines, dots, sequences of dots or other geometric shapes and are arranged such that the end points of the reactions running in lateral flow on the test strips can preferably be related directly.

2. Universal assay according to claim 1, characterized in that it consists of 2 Test strip exists.

3. Universal assay according to claim 1, characterized in that it consists of 3 or more Test strip exists.

4. Universal assay according to claim 1, characterized in that the test strips consist of cellulose or modified cellulose.

5. Universal assay according to claim 1, characterized in that the preferred Materials for the test strips glass fiber, nylon, other liquid carriers, such as Paper, or stripe-like structures made of glass, silicone, plastic, metal with etched or inserted channels or porous materials.

6. Universal assay according to claim 1, characterized in that the test strips have a common starting point for taking samples.

7. Universal assay according to claim 1, characterized in that the test strips have a separate starting point for taking different samples.

8. Universal assay according to claim 1, characterized in that the test strips with the same affinity molecules in ascending, descending or the same Concentration are prepared.

9. Universal assay according to claim 1, characterized in that the test strips with different affinity molecules in ascending, descending or the same Concentration are prepared.

10. Universal assay according to claim 1, characterized in that the barcode-like array on the strip chip at least 2 lines, dots, Point sequences or other geometrical figures or areas of different sizes contains, which are formed by affinity molecules.

11. Universal assay according to claim 1 and 10, characterized in that the Barcode-like array on the strip chip 3 to 200 lines, points, point sequences or contains other geometric figures or areas of different sizes.

12. Universal assay according to claim 1 and 10, characterized in that the lines Points, sequences of points or other geometrical figures or areas of different Size of the barcode-like array are arranged at equal intervals.

13. Universal assay according to claim 1 and 10, characterized in that the lines or other figures or areas of different sizes of the barcode-like Arrays are arranged at different distances.

14. Universal assay according to claim 1 and 10, characterized in that the Concentration of the affinity molecules per line, point, sequence of points or others geometric figure or area is the same.

15. Universal assay according to claim 1 and 10, characterized in that the Concentration of the affinity molecules per line, point, sequence of points or others geometric figure or area is different.

16. Universal assay according to claim 1 and 10, characterized in that the Affinity molecules in all lines, points, point sequences or other geometrical Figures or surfaces are the same.

17. Universal assay according to claim 1 and 10, characterized in that the Affinity molecules in different lines, points, sequences of points or others geometric figures or surfaces are combined differently or mixed.

18. Universal assay according to claim 1 and 10, characterized in that each some kind of affinity molecules or different combinations of Affinity molecules can be used for the test strips.

19. Universal assay according to claim 1 and 10, characterized in that the Affinity molecules same or different monoclonal or polyclonal Antibodies or their fragments or fusion products.

20. Universal assay according to claim 1 and 10, characterized in that the Affinity molecules are protein A and G or lectins.

21. Universal assay according to claim 1 and 10, characterized in that the Affinity molecules, enzymes or their substrates, pseudo-substrates, inhibitors, Activators or cofactors are.

22. Universal assay according to claim 1 and 10, characterized in that the Affinity molecules receptors, ligands, single and double stranded DNA or RNA or are fragments.

23. Universal assay according to claim 1 and 10, characterized in that the Affinity molecules are aptamers or so-called imprinted polymers.

24. Universal assay according to claim 1 and 10, characterized in that for Labeling and visualization of the affinity molecules colloidal gold, enzymes, Latex particles, micro or nanocapsules, dyes of any kind can be used.

25. Universal assay according to claim 1 and 10, characterized in that 2 to 12 Test strips are arranged at a certain angle to each other.

26. Universal assay according to claim 1 and 27, characterized in that 2 to 4 Test strips are arranged at right angles to each other.

27. Universal assay according to claim 1 and 27, characterized in that 2 Test strips are arranged parallel to one another, these test strips being separated from one another are separated or overlaid.

28. Universal assay according to claim 1 and 10, characterized in that as Assay Forms Sandwich, competition, or displacement assays be used.

29. Method for analyzing biological fluids using the assay according to Claims 1-28, characterized in that one, two or more samples of the biological fluid at the junction of the test strip angle (Starting point) are applied after the reaction to the test strip emerging markings are connected and a measurement of the resulting Angle and comparison with a calibrated scale.

30. Method of analyzing biological fluids using the assay Claims 1-28, characterized in that one, two or more samples of the biological fluid at the junction of the test strip angle (Starting point) are applied after the reaction on the test strip resulting markings are counted or with a table-like matrix be compared.

31. A method for analyzing body fluids by means of the assay according to claim 1- 28, characterized in that samples of the biological fluid on the one Connection point of the test strip angle (starting point) and the Test strips differ.

32. Method for analyzing biological fluids using the assay according to Claims 1-28 and 29-31, characterized in that samples on separate Starting points are applied at different times and the test strips are identical.