DE10108680A1 - Affinitätsassay zur schnellen Untersuchung biologischer Materialien - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft einen Assay zur schnellen und einfachen Analyse von Proben vorzugsweise biologischen Materials. Anwendungsgebiete der Erfindung sind vor allem die medizinische Diagnostik, die pharmazeutische Industrie und der Umweltschutz.

Stand der Technik

Die Verwendung spezifischer Affinitätsassays, zum Beispiel Immunoassays; Rezeptor- und DNA-Assays, ist von immer größerer Bedeutung für klinische und zahlreiche andere Anwendungen. Zur Analyse von biologischen Materialien, insbesondere von Körperflüssigkeiten, sind zahlreiche Verfahren bekannt. Sehr gebräuchlich ist der "Immuno- Lateral-Flow-Test". Der bei dieser Untersuchung angewendete Assay setzt sich aus vier Teilen auf einem Teststreifen zusammen: einem Probenfeld, einem Konjugatfeld, einem Analysenfeld (üblicherweise eine Nitrocellulosemembran) und einem Absorptionsfeld. Die Probenflüssigkeit fließt durch das Probenfeld mittels Kapillarkräfte in das Konjugatfeld. In und auf dem Konjugatfeld sind markierte Antikörper (z. B. mit kolloidalem Gold markiert, was eine Rotfärbung ergibt, oder mit Enzymen) gespeichert. Die Probenflüssigkeit fließt durch dieses Konjugatfeld und löst somit die markierten Antikörper ab. Die Probenlösung fließt dann, die markierten Antikörper und den Analyten mitführend, von dem Konjugatfeld in das Analysenfeld, auf dem Fängerantikörper adsorbiert sind. Schließlich fließt sie durch die Membran des Analysenfeldes zum Absorptionsfeld. Zusammen bilden sie den Teststreifen.

Gewöhnlich sind zwei immun-reaktive Linien auf dem Analysenfeld fixiert: eine für die Feststellung des interessierenden Analyten (z. B. Antikörper gegen einen Herzinfarktsmarker wie Troponin I) und eine dahinter gelegene Linie als positive Kontrolle für den Test (z. B. Antimaus-Antikörper). Der Teststreifen kann sich in einem zusätzlichen Plastikhalter befinden oder direkt in die Flüssigkeit getaucht werden. In einem Teststreifen für mehr als einen Parameter vergrößert sich dieser doppelte Bindebereich um die Zahl der Analyten, die mehr gemessen werden, z. B. gibt es für 3 Analyten drei Bindebereiche, die für den Analyten spezifisch sind, und einen zur Kontrolle, dass die verwendeten Antikörper intakt sind.

Ist kein Analyt in der Probe enthalten, fließen die markierten Antikörper ungehindert zum Absorbtionsfeld und binden lediglich am Kontrollantikörper. Über die rote Farbe des kolloidalen Goldmarkers zeigen sie, daß der Assay prinzipiell funktioniert. Ist dagegen Analyt (z. B. Troponin I) in der Probe, bindet er zuerst im Konjugatfeld an die goldmarkierten Antikörper und fließt mit ihnen in die Analysenfeld. Dort bindet der Komplex aus Analyt (Troponin I) und markierten Antikörpern an die fixierten Fängerantikörper gegen den Analyten (Troponin I). Der nichtgebundene Rest der markierten Antikörper (ohne Analyt) bindet an die dahintergelegenen Kontrollantikörper. Die zwei roten Linien zeigen somit das Analytsignal und das Kontrollsignal.

Ähnliche Assays sind für Rezeptoren und DNA möglich, wenngleich auch noch nicht weitpraktiziert wie bei Immunoassays.

R. F. Zuk et al. (Clinical Chemistry 31, 1144-1150, 1985) beschreiben einen "immunografischen" Assay in Streifenform fuer den niedermolekularen Analyten Theophyllin. Ein Streifen, der ueber die volle Länge mit Antiköpermolekuelen gegen Theophyllin beschichtet ist, wird mit einem Ende in eine Loesung eingetaucht, die den Analyten (Theophyllin) und ein Theophyllin-Enzym-Konjugat enthaelt. Beide bewegen sich durch Kapilarkraefte aufwärts und konkurrieren um die Bindung an die Antikoerper. Nach Eintauchen in eine Enzymsubstratlösung entwickelt sich an den Bindungsstellen des Theophillin-Enzym-Konjugats ein gefaerbtes Produkt. Der Assay wird quantifiziert ohne zusätzliche Geräte, indem die Höhe der gefärbten Zone gemessen wird. Bei geringer Theophyllinkonzentration werden die Enzym-Konjugate bereits vollständig an den ersten Antikörpern gebunden. Bei hoher Theophyllinkonzentration binden sich dagegen Theophyllin und Enzymkonjugate konkurrierend an den Antikörpern und eine grössere gefärbte Zone entsteht. Nachteilig sind die zwei umständlichen Inkubationsschritte, die einen Einsatz beispielsweise in der Notfallmedizin unmöglich machen, und die lange Wartezeit zur Entwicklung der Farbreaktion. Korrekturfaktoren sind nicht vorhanden. Im US-Patent 4,435,504 wird von Zuk et al. zudem beschrieben, dass der Test auch ohne Enzym-Analyt- Konjugat erfolgen kann, dieses spaeter erst als Entwicklerloesung zugesetzt wird und danach eine zweite Inkubation mit dem Enzymsubstrat stattfindet.

Eine Vielzahl von Immuntests ist heute verfügbar (Uebersicht in P. Tijssen: Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Elsevier Amsterdam 1985, S. 9-20; D. S. Hage, Immunoassays. Analytical Chemistry 71 (12) 1999, S. 294R-304R). Sie alle nutzen die einzigartigen Eigenschaften der Antikörper, die spezifische Erkennung und Bindung von Molekülen, zur Analyse. Diese Bindungsmöglichkeiten sind jedoch stark von Variablen wie Expositionszeit, von umgebenden Moleküle, die stören oder die Viskosität erhöhen, abhängig oder phasenabhängig (z. B. eine feste Phase, an die ein Antikörper gebunden ist). Die Bindung eines Antikörpers an ein Antigen hängt daher von verschiedenen Faktoren ab. Assays, die eine Quantifizierung eines Analyten zum Ziel haben, müssen deshalb einen internen oder externen Korrekturfaktor enthalten.

Ähnliches gilt für andere Affinitätsassays wie DNA-Assays. Hier werden meist an eine Oberfläche fixierte DNA-Bruchstücke durch Oligonucleotid-Sonden (probes) erkannt, die sich binden und markiert sind. Auch diese Assays und wie auch Rezeptor-Assays brauchen Korrekturfaktoren, um quantifizierbar zu sein.

Bei vielen klinischen Analysatoren und automatisierten Assays werden die o. g. Probleme durch eine Kombination verschiedener Methoden gelöst. Häufig ist eine Verdünnungsstufe in die Assays einbezogen, um den sog. "Matrixeffekt" (z. B. Viskosität, störende Verbindungen) zu minimieren. Für die Kalibrierung des Signals werden Standardproben verwendet. Das macht erforderlich, daß Spezialisten den Test durchführen und es kann häufig nur mit einer großen Probenreihe erfolgen (z. B. im Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA). Daher sind die meisten klinischen Analysatoren und automatisierten Assays für die "Point-of-care"- Notfalltestung nicht geeignet.

Aufgrund fehlender Korrekturfaktoren für signalgenerierende Parameter sind bisher nur qualitative oder halbquantitative (d. h., eine Konzentration oberhalb eines bestimmten Wertes anzeigende) für Lateral-flow-Teststreifen bzw. Teststreifens möglich gewesen. Daher ist es bei den gegenwärtig verfügbaren Methoden nicht möglich, ein und denselben Assay z. B. sowohl für Serum als auch Plasma zu verwenden, da sie eine sehr unterschiedliche Viskosität aufweisen. Darüber hinaus erfordert die Auswertung eines "quantitativen" Lateral-flow- Assays (Teststreifen) ein Spezialgerät (Reader) für das "Lesen". Visuell kann nur eine qualitative Bestimmung durch Festlegung eines Schwellenwertes erfolgen.

Ein wichtiges Anwendungsgebiet für diese Assays ist die Diagnose von Herzinfarkten. Während das klassische EKG nur in etwa 40-50% der Fälle bei Ankunft im Krankenhaus eine klare diagnostische Aussage trifft, kann ein "früher" biochemischer Herzinfarkt-Marker wie Fatty Acid-Binding Protein (FABP) die Frühdiagnose wesentlich verbessern (Renneberg, R., Cheng, S., Kaptein, W. A., McNeil, C. J., Rishpon, J., Gründig, B., Sanderson, J., Chu, A., Glatz, J. F. C. Novel immunosensors for rapid diagnosis of acute myocardial infarction: A case report, Advances in Biosensors ed. A. P. F. Turner, R. Renneberg, Biosensors: a Chinese perspective, Vol 4 (1999).)

Die bisher verfügbaren Tests für "späte" Herzinfarkt-Marker sind jedoch entweder Labortests, die somit gutausgebildetes Personal, teuere Apparate und eine lange Verweilzeit erfordern, oder es sind Schnelltests. Diese messen verschiedene Markermoleküle mit einem kalibrierten Lesegerät quantitativ erst Stunden nach dem Infarktereignis (z. B. den "späten" Marker Troponin T von Roche, Patent EP 00394819A2) oder nur qualitativ (z. B. Jackowski, George von Spectral, US-Patent 5604105).

Aufgabe der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen schnellen und zuverlässigen Assay zur Untersuchung von vorzugsweise biologischen Materialien zu entwickeln. Er soll einfach zu handhaben sein (möglichst ohne Meßinstrumente) und zu weitgehend quantitativen Ergebnissen führen.

Wesen der Erfindung

Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert. Die Hauptidee besteht darin, zum einen mindestens 2 Messungen einer Probe gleichzeitig oder zum anderen gleichzeitig oder zeitlich versetzt Messungen von mindestens 2 verschiedenen Proben durchzuführen und deren Ergebnisse zu vergleichen.

Der erfindungsgemäße universelle Affinitätsassay zur Untersuchung von biologischen Materialien besteht dem gemäß aus mindestens 2 Teststreifens aus fließfähigen oder flussunterstützendem Material, die

• - entweder einen gemeinsamen Startpunkt oder getrennte Startpunkte zur Aufnahme von einer oder mehreren Proben haben,
• - mit gleichen oder unterschiedlichen Affinitätsmolekülen in aufsteigender, absteigender oder gleicher Konzentration, bevorzugt in Form strichcode-ähnlicher Arrays präpariert sind und
• - so angeordnet sind, dass vorzugsweise die Endpunkte der auf den Teststreifen verlaufenden Reaktionen in eine direkte Beziehung gesetzt werden können.

Bevorzugt ist die Verwendung von 2 Teststreifen, aber auch 3 und mehr Teststreifen sind für die Lösung bestimmter Aufgabenstellungen durchaus von Vorteil.

Bevorzugte Materialien für die Teststreifen sind Cellulosemembranen, aber auch Glasfiber, Nylon, andere Flüssigkeitsträger, wie Papier, Baumwolle oder teststreifenähnliche Strukturen aus Glas, Silicon, Plastik, Metall mit eingebrachten Kanälen oder poröse Materialien.

Wenn man den erfindungsgemäßen Assay zur parallelen Messung einer einzigen Probe benutzen will, empfiehlt sich, daß die Teststreifen einen gemeinsamen Startpunkt zur Aufnahme der Probe haben. Wenn dagegen mehr als eine Probe gleichzeitig oder zeitlich versetzt gemessen werden soll, sind räumlich getrennte Startpunkte erforderlich.

Die erfindungsgemäßen Teststreifen können mit identischen oder unterschiedlichen Affinitätsmolekülen in "Strichcode"-Form präpariert sein, wobei die Konzentration im Normalfall gleich bleibt. Sie kann jedoch auch aufsteigend oder absteigend sein. Die Abstände und Dicke der Affinitätsmolekül-"Striche" oder Linien (engl. bands) können gleichmässig oder ungleichmässig sein.

Die wichtigste Ausführungsform der Assays sind Teststreifen mit strichcode-ähnlichen Arrays, die auf der Oberfläche mindestens 2 Linien, Punkte oder andere geometrische Flächen verschiedener Groesse enthalten, die durch fixierte Affinitätsmoleküle gebildet sind. In den meisten Fällen sind 3 bis 10 Linien notwendig. Es koennen aber auch bis 200 Linien verwendet werden. Im Normalfall sind die Linien des Strichcode-Arrays in gleichen Abständen angeordnet, aber auch unterschiedliche Abstände und Dicken können in bestimmten Fällen zweckmäßig sein. Variationen je nach konkreter Aufgabe sind auch bezüglich der Konzentration der Affinitätsmoleküle per Linie möglich. Es können aber auch unterschiedliche Affinitätsmoleküle kombiniert werden. Anstelle von Linien können auch Punkte (dots) oder andere geometrische Formen und Flächen verwendet werden.

Die Art der Affinitätsmoleküle ist variabel, z. B. können verschiedene monoklonale oder polyklonale Antikörper oder deren Fragmente oder Fusionsprodukte eingesetzt werden, Protein A und G, Lectine, ferner Enzyme oder deren Substrate, Pseudosubstrate, Inhibitoren oder Aktivatoren, Cofaktoren, Rezeptoren, Liganden, ein- und doppelsträngige DNA oder RNA oder deren Fragmente, Aptamere oder sogenannte imprinted polymers.

Wichtig ist die gewinkelte Anordnung der mindestens 2 Teststreifen, wobei eine rechtwinklige Anordnung bevorzugt wird. Auch andere Winkel können erfindungsgemäß gewählt werden. Ebenfalls möglich ist eine parallele Anordnung: zwei Teststreifen sind im Winkel von null Grad angeordnet, verlaufen also parallel oder sind zu einem Streifen ueberlagert und somit verschmolzen sind.

Nach Durchführung der Testreaktion können die Endpunkte auf vielerlei Weise abgelesen werden: Eine Methode ist die Bestimmung der Winkel zwischen den Endpunkten. Abb. 1 zeigt eine schematische Darstellung. Die Ergebnisse werden vom Anwender mit einer kalibrierten Skala verglichen.. Es ist ebenfalls möglich, die verschiedenen Signale zu vergleichen und auf einer matrixähnlichen Tabelle zu vergleichen. Es kann auch die Anzahl der gefärbten Linien ausgezählt werden.

Im speziellen Fall der Ueberlagerung von Teststreifen oder des Verschmelzens zu einem Streifen (Winkel null Grad) sind die Signale fuer die verschiedenen Reaktionen farblich unterscheidbar (z. B. blau und rot und weitere Farben) und die Endpunkte werden ausgezaehlt.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Analyse von Flüssigkeiten mittels des beschriebenen Assays ist also dadurch gekennzeichnet, daß Proben der Flüssigkeit am Startpunkt des Teststreifen-Winkels aufgetragen werden, die nach Ablauf der Reaktion auf dem Streifen entstehenden Markierungen verbunden werden und eine Messung des entstandenen Winkels und Vergleich mit einer kalibrierten Skala oder der Matrixtabelle erfolgt. Der Vergleich kann auch dadurch erfolgen, daß die erste Probe als "Kalibrator" für die zweite Probe fungiert.

Das Verfahren kann so gestaltet werden, daß Proben einer Flüssigkeit an der Verbindungsstelle des Teststreifen-Winkels aufgetragen werden und die Teststreifen sich unterscheiden. Dabei kann ebenfalls einer der Teststreifen als "Kalibrator" für die anderen dienen.

Ein dazu alternatives Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß verschiedene Proben auf verschiedenen Startpunkten aufgetragen werden und die Teststreifen identisch sind.

Wichtig ist auch die Möglichkeit, Proben zeitlich versetzt auf räumlich getrennte Startpunkte aufzutragen und dann die Endpunkte zu bestimmen. Das ist z. B. bei der Untersuchung von Herzinfarktpatienten vorteilhaft. Man trägt von einem Patienten in zeitlichem Abstand entnommene aufeinanderfolgende Proben auf und analysiert damit den Krankheitsverlauf.

Die mit blossem Auge oder ein Messinstrument auswertbaren farbigen Endpunkte bzw. Endlinien entstehen durch markierte Antikörper, die über Analyten (Antigene) an streifenfixierten Fängerantikörpern gebunden sind.

Durch die visuelle Auswerung mit nacktem Auge oder Auswertung mit einem optischen oder optoelektronischen Instrument ist eine quantitative Bestimmung der Analytkonzentration möglich.

Der hier vorgeschlagene Assay erlaubt eine genaue quantitative Analyse für Analyte auch ohne die notwendige Verwendung eines zusätzlichen Gerätes. Des weiteren ermöglicht es, die Spezifizität durch Bestimmung der Quelle der weniger spezifischen Marker zu erhöhen (durch Anwendung der Verhältnisanalyse, zum Beispiel des FABP/Myoglobin-Verhältnisses) und/oder einer Zeitfolge eines Markers (und ermöglicht es somit einem Patienten, seine eigene "Negativkontrolle" zu sein).

Die Vorteile des neuen Assays gemäß der Erfindung sind:
Der Assay ist billig und sehr einfach zu handhaben.

Er kann mit einer minimalen Probemenge durchgeführt werden, d. h., es werden keine so großen Probemengen wie in ELISAs werden benötigt.

Man hat nach wenigen Minuten bereits das Resultat.

Besonders vorteilhaft ist, daß er von technischen Kräften (z. B. Krankenschwestern) oder sogar von Laien durchgeführt werden kann.

Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiele

Technische Möglichkeiten für Auswertung (siehe Abb. 1)

• 1. Winkelmessung
• 2. Tabellarische Matrix
• 3. Flächenmessung

Beispiel 1 Quantifizierung des Signals; Korrektur der Matrixeffekte

In den Lateral-flow-tests, insbesondere in den unverdünnten Vollbluttests, spielt die Matrix eine wichtige Rolle für das gesamte Signal am Ende der Messung.

Hohe Viskosität erhöht z. B. das gesamte Signal auf einem einzigen Linie, da es die Strömungsgeschwindigkeit auf dem Teststreifen herabsetzt und es somit dem Antikörper ermöglicht, Antigen in größeren Mengen zu binden. Im Lateral-flow-test mit mehr als einer Linie bedeutet höhere Viskosität ein höheres Signal in der ersten Linie, jedoch weniger gefärbte Linien, da die gesamte Antigenmenge schneller erschöpft ist.

Um diesen Effekt zu korrigieren, kann man den Test mit einem Kontrollstreifen kombinieren. Dieser Streifen korrigiert den Test bezueglich der Matrixeffekte. Dabei ist eine bestimmte Menge eines (direkt oder indirekt) nachweisbaren markierten Analyten vorhanden, die an ein Affinitätsmolekül binden kann. Andere Elemente, die die Bindung beeinflußen können, sind z. B. spezifische Arzneimittel (Heparin), die Fettkonzentration im Blut, nach Hämolyse.

Eine Probe, die beispielsweise auf den frühen Herzinfarktmarker Fettsäurebindungsprotein (FABP) untersucht werden soll, wird am gleichen Startpunkt zwischen zwei gewinkelten Teststreifen (Analysestreifen 1 und Kontrollstreifen 2) aufgegeben und teilt ihren Fluss. Die Konjugatfelder der beiden Streifen tragen die gleichen goldmarkierten Anti-FABP- Antikörper. Auf der Analysenfeld des Analysenteststreifens (1) sind Anti-FABP-Antikörper, auf der Analysenfeld des Kontrollteststreifens (2) dagegen Anti-Maus-Antikörper fixiert. Eine grafische Darstellung dieses Beispiels ist in Abb. 2 zu sehen.

Wenn bei einem Herzinfarkt und einer gleichgrossen Menge an FABP die Probe eine hohe Viskosität hat (A), werden weniger Linien des Analyseteststreifens (A1) gefärbt sein als bei geringer Viskosität (B1). Da Analyse- und Kontrollstreifen aber die gleichen Bedingungen haben, bleibt der Winkel zwischen in beiden Fällen A und B zwischen den Endpunkten unverändert.

Wenn kein Herzinfarkt vorliegt und somit die Konzentration an FABP in der Probe sehr niedrig ist (C und D), werden auf dem Analysestreifen (C1) bei hoher Viskosität weniger Linien sichtbar werden als bei niedriger Viskosität (D1). Auch hier bleibt der Winkel gleich und ist unabhängig von der Viskosität der Probe.

Der Winkel bei Herzinfarkt unterscheidet sich jedoch vom Winkel bei Nichtvorliegen eines Infarktes.

Wenn der Winkel zwischen den Teststreifen null Grad betraegt (Abb 2E bis H), somit die Teststreifen parallel vorliegen oder letztlich zu einem Streifen ueberlagert sind, kann durch unterschiedliche farbliche Markierung die Analysereaktion von der Kontrollreaktion unterschieden werden. Durch Auszaehlen der Linien kann eine eindeutige Aussage ueber das Vorliegen eines Herzinfarktes, unabhaengig von Matrixeffekten wie Viskositaet, erfolgen.

Beispiel 2 Erhöhung der Spezifizität des Assays, des Verhältnisses zwischen Herzmuskelschaden und Skeletmuskelschaden (FABP und Myoglobin)

Viele im Blut enthaltene Analyte sind für bestimmte Krankheiten nicht spezifisch, während sie in verschiedenen physiologischen oder pathologischen Situationen erhöht sein können. Zum Beispiel sind Myoglobin und FABP im Blut relativ zeitig nach einem Herzanfall erhöht, da sie von dem sterbenden Herzmuskelgewebe schnell freigesetzt werden. Sie sind jedoch auch im Skelettmuskel vorhanden und daher auch im Fall einer Skelettmuskelschädigung erhöht, z. B. im Fall von übermäßigem Training. Im Herzmuskel beträgt allerdings das Verhältnis FABP zu Myoglobin 1 : 4.5 und im Skelettmuskel 1 : 20 bis 1 : 70.

Durch eine Analyse beider Parameter in einem Test ist es daher möglich, die zwei verschiedenen Quellen (Herz- und Skelettmuskel) zu trennen. Eine Darstellung wird in Abb. 3 gegeben. Dabei tragen der eine (1) der gewinkelten Teststreifen auf dem Konjugatfeld goldmarkierte Antikörper gegen FABP und auf dem analysenfeld fixierte Antikörper gegen FABP der andere (2) auf den Konjugat- und Analysefeldern goldmarkierte Antikörper gegen Myoglobin und fixierte Antikörper gegen Myoglobin.

Bei Herzinfarkt (A) entsteht ein völlig anderer Winkel zwischen den Endpunkten als bei Skelettmuskel-Schaden (B). Dieser Winkel ist wiederum nur abhängig vom FABP: Myoglobin-Verhältnis, nicht von Matrixeffekten.

Beispiel 3 Zeitdifferenz, um dem Patienten eine eigene Kontrolle zu ermöglichen; Differenz zwischen Herzinfarkt, Angina pectoris und nicht-herzbedingten Brustschmerzen

Wenn ein Patient mit Brustschmerzen zum Arzt kommt, kann das durch einen Herzinfarkt, Angina pectoris oder durch andere Prozesse (nicht-herz bedingten Brustschmerzen) verursacht sein.

Wenn von diesem Patienten zwei aufeinanderfolgende Proben (1 und 2) genommen werden, z. B. 30 Minuten nacheinander, kann die erste Probe als Standard (Kontrolle) für die andere genommen werden. Dazu werden 2 identische Teststreifen mit getrennten Startpunkten kombiniert.

Wenn kein Herzinfarkt vorliegt (Abb. 4A), sondern nicht-herzbedingte Brustschmerzen, dann ist nach 30 min keine Veränderung zur Kontrolle auf dem Streifen sichtbar (in der Abbildung beispielsweise ein 6 : 6 Verhältnis).

Im Falle eines Herzinfarktes (B) ist jedoch der erste Wert schon deutlich über normal und der zweite erheblich höher sein sollte, als ersten Probe (zum Beispiel ein 6 : 13 Verhältnis). Bei dem Warnzeichen Angina pectoris (anhaltende Brustbeinschmerzen) (C) ist nach 30 min ein geringfügiger Anstieg der FABP-Konzentration zu sehen (zum Beispiel 6 : 8).

Diese Methode ermöglicht es, die Zeit zu verkürzen, bevor gewisse Analyte diagnostiziert werden, während der Patient durch eigene Werte sich selbst kontrollieren zw. standardisieren kann. Zusaetzlich werden mit dieser Teststreifenkombination Matrixeffekte korrigiert.

Claims (32)

1. Universeller Assay zur Untersuchung von vorzugsweise biologischen Materialien, bestehend aus mindestens 2 Teststreifen aus fließfähigen oder flussunterstützendem Material, die
entweder einen gemeinsamen Startpunkt oder getrennte Startpunkte zur Aufnahme von einer oder mehreren Proben haben,
mit gleichen oder unterschiedlichen Affinitätsmolekülen in aufsteigender, absteigender oder gleicher Konzentration präpariert sind,
bevorzugt in Form eines strichcodeähnlichen-Arrays in Form von Strichen, Punkten, Punktfolgen oder anderen geometrischen Formen und so angeordnet sind, daß vorzugsweise die Endpunkte der in lateralem Fluß auf den Teststreifen verlaufenden Reaktionen in eine direkte Beziehung gesetzt werden können.

2. Universeller Assay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er aus 2 Teststreifen besteht.

3. Universeller Assay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er aus 3 oder mehr Teststreifen besteht.

4. Universeller Assay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Teststreifen aus Cellulose oder modifizierter Cellulose bestehen.

5. Universeller Assay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die bevorzugten Materialien für die Teststreifen Glasfiber, Nylon, andere Flüssigkeitsträger, wie Papier, oder streifenähnliche Strukturen aus Glas, Silicon, Plastik, Metall mit eingeätzten oder eingebrachten Kanälen oder poröse Materialien sind.

6. Universeller Assay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Teststreifen einen gemeinsamen Startpunkt zur Aufnahme von Proben haben.

7. Universeller Assay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Teststreifen einen getrennten Startpunkt zur Aufnahme verschiedener Probe haben.

8. Universeller Assay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Teststreifen mit gleichen Affinitätsmolekülen in aufsteigender, absteigender oder gleicher Konzentration präpariert sind.

9. Universeller Assay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Teststreifen mit unterschiedlichen Affinitätsmolekülen in aufsteigender, absteigender oder gleicher Konzentration präpariert sind.

10. Universeller Assay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der strichcodeähnliche Array auf dem Streifenchip mindestens 2 Linien, Punkte, Punktfolgen oder andere geometrische Figuren oder Flächen unterschiedlicher Größe enthält, die durch Affinitätsmoleküle gebildet werden.

11. Universeller Assay nach Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß der strichcodeähnliche Array auf dem Streifenchip 3 bis 200 Linien, Punkte, Punktfolgen oder andere geometrische Figuren oder Flächen unterschiedlicher Größe enthält.

12. Universeller Assay nach Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Linien, Punkte, Punktfolgen oder andere geometrische Figuren oder Flächen unterschiedlicher Größe des strichcodeähnlichen Arrays in gleichen Abständen angeordnet sind.

13. Universeller Assay nach Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Linien oder anderen Figuren oder Flächen unterschiedlicher Größe des strichcodeähnlichen Arrays in unterschiedlichen Abständen angeordnet sind.

14. Universeller Assay nach Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Affinitätsmoleküle per Linie, Punkt, Punktfolge oder anderer geometrischer Figur oder Fläche gleich ist.

15. Universeller Assay nach Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Affinitätsmoleküle per Linie, Punkt, Punktfolge oder anderer geometrischer Figur oder Fläche unterschiedlich ist.

16. Universeller Assay nach Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Affinitätsmoleküle in allen Linien, Punkten, Punktfolgen oder anderen geometrischen Figuren oder Flächen die gleichen sind.

17. Universeller Assay nach Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Affinitätsmoleküle in verschiedenen Linien, Punkte, Punktfolgen oder andere geometrische Figuren oder Flächen unterschiedlich oder gemischt kombiniert sind.

18. Universeller Assay nach Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet, dass jeweils eine Art von Affinitätsmoleküle oder verschiedene Kombinationen von Affinitätsmolekülen für die Teststreifen verwendet werden.

19. Universeller Assay nach Anspruch 1 und 10 dadurch gekennzeichnet, daß die Affinitätsmoleküle gleiche oder verschiedene monoklonale oder polyklonale Antikörper oder deren Fragmente oder Fusionsprodukte sind.

20. Universeller Assay nach Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Affinitätsmoleküle Protein A und G oder Lectine sind.

21. Universeller Assay nach Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Affinitätsmoleküle Enzyme oder deren Substrate, Pseudosubstrate, Inhibitoren, Aktivatoren oder Cofaktoren sind.

22. Universeller Assay nach Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Affinitätsmoleküle Rezeptoren, Liganden, ein- und doppelsträngige DNA oder RNA oder deren Fragmente sind.

23. Universeller Assay nach Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Affinitätsmoleküle Aptamere oder sogenannte Imprinted Polymers sind.

24. Universeller Assay nach Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet, dass zur Markierung und Visualisierung der Affinitätsmoleküle kolloidales Gold, Enzyme, Latexpartikel, Mikro- oder Nanokapseln, Farbstoffe jeglicher Art verwendet werden.

25. Universeller Assay nach Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß 2 bis 12 Teststreifen in einem bestimmten Winkel zueinander angeordnet sind.

26. Universeller Assay nach Anspruch 1 und 27, dadurch gekennzeichnet, daß 2 bis 4 Teststreifen rechtwinklig zueinander angeordnet sind.

27. Universeller Assay nach Anspruch 1 und 27, dadurch gekennzeichnet, daß 2 Teststreifen parallel zueinander angeordnet sind, wobei diese Teststreifen voneinander getrennt oder ueberlagert sind.

28. Universeller Assay nach Anspruch 1 und 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Assayformen Sandwich-, Konkurrenz- oder Verdrängungs-(displacement) Assays verwendet werden.

29. Verfahren zur Analyse von biologischen Flüssigkeiten mittels des Assays nach Anspruch 1-28, dadurch gekennzeichnet, daß eine, zwei oder mehrere Proben der biologischen Flüssigkeit an der Verbindungsstelle des Teststreifen-Winkels (Startpunkt) aufgetragen werden, die nach Ablauf der Reaktion auf den Teststreifen entstehenden Markierungen verbunden werden und eine Messung des entstandenen Winkels und Vergleich mit einer kalibrierten Skala erfolgt.

30. Verfahren zur Analyse von biologischen Flüssigkeiten mittels des Assays nach Anspruch 1-28, dadurch gekennzeichnet, daß eine, zwei oder mehrere Proben der biologischen Flüssigkeit an der Verbindungsstelle des Teststreifen-Winkels (Startpunkt) aufgetragen werden, die nach Ablauf der Reaktion auf dem Teststreifen entstehenden Markierungen ausgezählt bzw. mit einer tabellenartigen Matrix verglichen werden.

31. Verfahren zur Analyse von Körperflüssigkeiten mittels des Assays nach Anspruch 1- 28, dadurch gekennzeichnet, daß Proben der biologischen Flüssigkeit an der einer Verbindungsstelle des Teststreifen-Winkels (Startpunkt) aufgetragen werden und die Teststreifen sich unterscheiden.

32. Verfahren zur Analyse von biologischen Flüssigkeiten mittels des Assays nach Anspruch 1-28 und 29-31, dadurch gekennzeichnet, daß Proben auf getrennten Startpunkten zeitlich versetzt aufgetragen werden und die Teststreifen identisch sind.