DE10031839A1 - Erythropoietinkonjugate - Google Patents
ErythropoietinkonjugateInfo
- Publication number
- DE10031839A1 DE10031839A1 DE10031839A DE10031839A DE10031839A1 DE 10031839 A1 DE10031839 A1 DE 10031839A1 DE 10031839 A DE10031839 A DE 10031839A DE 10031839 A DE10031839 A DE 10031839A DE 10031839 A1 DE10031839 A1 DE 10031839A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- thr
- asn
- sequence
- glycoprotein
- conjugate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 title claims abstract description 97
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 title claims abstract description 97
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 86
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 title abstract description 75
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 102000044890 human EPO Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 38
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims abstract description 33
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 33
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims abstract description 17
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical group OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 claims abstract description 12
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 33
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 19
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 claims description 14
- 208000022831 chronic renal failure syndrome Diseases 0.000 claims description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 10
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 claims description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 claims description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N teixobactin Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H]1C(N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C[C@@H]2NC(=N)NC2)C(=O)N[C@H](C(=O)O[C@H]1C)[C@@H](C)CC)=O)NC)C1=CC=CC=C1 LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N 0.000 claims description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 3
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 claims description 2
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 claims description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 claims description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 claims description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 claims description 2
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 claims description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 claims 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 abstract description 4
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 51
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 31
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 27
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 24
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 16
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 13
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 13
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 11
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 9
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 9
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- -1 ethylene oxide radicals Chemical class 0.000 description 7
- 229960004592 isopropanol Drugs 0.000 description 7
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 6
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 6
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 5
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 5
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 3
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical group C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 2
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000010437 erythropoiesis Effects 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 2
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- SOWBFZRMHSNYGE-UHFFFAOYSA-N oxamic acid Chemical compound NC(=O)C(O)=O SOWBFZRMHSNYGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- NWXMGUDVXFXRIG-NAOJVREFSA-N (4s,4as,5as,12ar)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2C(O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O NWXMGUDVXFXRIG-NAOJVREFSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 101150002621 EPO gene Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010065426 Hemaccel Proteins 0.000 description 1
- 238000011993 High Performance Size Exclusion Chromatography Methods 0.000 description 1
- 101100333654 Homo sapiens EPO gene Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 125000000773 L-serino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])*)C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- XWEVVRRSIOBJOO-SRVKXCTJSA-N Leu-Pro-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O XWEVVRRSIOBJOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N Leu-Pro-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- CHJKEDSZNSONPS-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CHJKEDSZNSONPS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- IXHKPDJKKCUKHS-GARJFASQSA-N Lys-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N IXHKPDJKKCUKHS-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical group OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026933 Myelin-associated neurite-outgrowth inhibitor Human genes 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 1
- HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N N-ethylmaleimide Chemical compound CCN1C(=O)C=CC1=O HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 108010002885 Polygeline Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- FDMKYQQYJKYCLV-GUBZILKMSA-N Pro-Pro-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 FDMKYQQYJKYCLV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- GOMUXSCOIWIJFP-GUBZILKMSA-N Pro-Ser-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GOMUXSCOIWIJFP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- GMJDSFYVTAMIBF-FXQIFTODSA-N Pro-Ser-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GMJDSFYVTAMIBF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 241001415846 Procellariidae Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241001080173 Ridens Species 0.000 description 1
- JURQXQBJKUHGJS-UHFFFAOYSA-N Ser-Ser-Ser-Ser Chemical compound OCC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CO)C(O)=O JURQXQBJKUHGJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001275117 Seres Species 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- VTMGKRABARCZAX-OSUNSFLBSA-N Thr-Pro-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O VTMGKRABARCZAX-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010640 amide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- GHWVXCQZPNWFRO-UHFFFAOYSA-N butane-2,3-diamine Chemical compound CC(N)C(C)N GHWVXCQZPNWFRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical group 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N cibacron blue Chemical compound C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C1NC(C=C1S(O)(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC=C1S(O)(=O)=O YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N ethane-1,2-diol;propane-1,2-diol Chemical compound OCCO.CC(O)CO HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002337 glycosamines Chemical class 0.000 description 1
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 108010057760 hepatic sialoglycoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008288 physiological mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000003058 plasma substitute Substances 0.000 description 1
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 1
- 229960004250 polygeline Drugs 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 229940070376 protein Drugs 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 1
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 1
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001897 terpolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
- C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
- C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft Konjugate von Erythropoietin mit Poly(ethylenglycol), umfassend ein Erythropoietinglycoprotein mit mindestens einer freien Aminogruppe und die biologische in vivo-Aktivität aufweisen, um Knochenmarkzellen zur gesteigerten Erzeugung von Reticulozyten und roten Blutzellen zu veranlassen, und ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Humanerythropoietin und Analogen davon, die eine Sequenz von Humanerythropoietin, modifiziert durch Addition von 1 bis 6 Glycosylierungsstellen oder eine Umlagerung mindestens einer Glycosylierungsstelle, aufweisen, wobei das Glycoprotein kovalent an "n" Poly(ethylenglycol)-gruppen der Formel -CO-(CH 2 ) x -(OCH 2 CH 2 ) m -OR gebunden ist, wobei die Carbonylgruppe jeder Poly(ethylenglycol)gruppe eine Amidbindung mit einer der Aminogruppen bildet; wobei R Niederalkyl bedeutet; x 2 oder 3 bedeutet; m etwa 450 bis etwa 900 bedeutet; n 1 bis 3 bedeutet; und n und m so ausgewählt sind, daß das Molekulargewicht des Konjugats abzüglich des Erythropoietinglycoproteins 20 Kilodalton bis 100 Kilodalton beträgt.
Description
Die Erythropoese ist die Erzeugung von roten Blutzel
len, die zum Ausgleich des Zellabbaus erfolgt. Erythropoese
ist ein kontrollierter, physiologischer Mechanismus, der für
eine geeignete Versorgung des Gewebes mit Sauerstoff ausrei
chend rote Blutzellen zur Verfügung stellen kann. Natürlich
vorkommendes Humanerythropoietin (hEPO) wild in der Niere er
zeugt und ist der humorale Plasmafaktor, der die Erzeugung
von roten Blutzellen stimuliert (Carnot, P. und Deflandre, C.
(1906) C. R. Acad. Sci. 143: 432; Erslev, A. J. (1953) Blood 8:
349; Reissmann, K. R. (1950) Blood 5: 372; Jacobson, L. O.,
Goldwasser, E., Freid, W. und Plzak, L. F. (1957) Nature 179:
6331-4). Natürlich vorkommendes EPO stimuliert die Teilung
und Differenzierung von jeweiligen erythroiden Vorläufern im
Knochenmark und übt seine biologische Aktivität durch Binden
an Rezeptoren an erythroiden Vorstufen aus (Krantz, BS (1991)
Blood 77: 419).
Erythropoietin wurde biosynthetisch unter Verwendung
von rekombinanter DNA-Technologie hergestellt (Egrie, J. C.,
Strickland, T. W., Lane, J. et al. (1986) Immunobiol. 72: 213-
224) und ist das Produkt eines geklonten Human-EPO-Gens, in
seriert in und exprimiert in den Ovariumgewebszellen des Chi
nesischen Hamsters (CHO-Zellen). Die Primärstruktur der pre
dominanten voll ausgebildeten Form von hEPO wird in SEQ ID
NR.: 1 erläutert. Es gibt zwei Disulfidbrücken zwischen Cys7-
Cys161 und Cys29-Cys33. Das Molekulargewicht der Polypeptidket
te von EPO ohne die Zuckerreste ist 18236 Da. In dem intakten
EPO-Molekül machen die Kohlenhydratgruppen, die das Protein
an den Glycosylierungsstellen am Protein glycosylieren, etwa
40% des Molekulargewichts aus (Sasaki, H., Bothner, B., Dell,
A. und Fukuda, M. (1987) J. Biol. Chem. 262: 12059).
Da Humanerythropoietin bei der Bildung von roten
Blutzellen wesentlich ist, ist das Hormon bei der Behandlung
von Blutkrankheiten, die durch eine geringe oder mangelhafte
Erzeugung von Blutzellen gekennzeichnet sind, brauchbar. Kli
nisch wird EPO bei der Behandlung von Anämie bei Patienten
mit chronischer Niereninsuffizienz (CRF) (Eschbach, J. W.,
Egri, J. C., Downing, M. R. et al. (1987) NEJM 316: 73-78;
Eschbach, J. W., Abdulhadi, M. H., Browne, J. K. et al. (1989)
Ann. Intern. Med. 111: 992; Egrie, J. C., Eschbach, J. W.,
McGuire, T., Adamson, J. W. (1988) Kidney Intl. 33: 262; Lim,
V. S., Degowin, R. L., Zavala, D. et al. (1989) Ann. Intern.
Med. 110: 108-114) und bei AIDS und Krebspatienten, die mit
einer Chemotherapie behandelt werden (Danna, RP, Rudnick,
S. A., Abels, R. I. In: M. B. Garnick, Herausg. Erythropoietin
in Clinical Applications-An International Perspective. New
York, NY: Marcel Dekker; 1990: S. 301-324) eingesetzt. Die
Bioverfügbarkeit von handelsüblichen Proteintherapeutika, wie
EPO, ist allerdings durch ihre kurze Halbwertszeit in Plasma
und durch ihre Anfälligkeit für Proteaseabbau begrenzt. Diese
Nachteile verhindern das Erreichen einer maximalen klinischen
Wirkung.
Die Erfindung stellt ein Erythropoietin-Konjugat be
reit, wobei das Konjugat ein Erythropoietinglycoprotein mit
mindestens einer freien Aminogruppe umfaßt und die biologi
sche in vivo-Aktivität aufweist, um Knochenmarkzellen zur ge
steigerten Erzeugung von Reticulozyten und roten Blutzellen
zu veranlassen, und ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
Humanerythropoietin und Analogen davon, die eine Sequenz von
Humanerythropoietin, modifiziert durch die Addition von 1 bis
6 Glycosylierungsstellen oder eine Umlagerung mindestens ei
ner Glycosylierungsstelle, aufweisen, wobei das Glycoprotein
kovalent an "n" Poly(ethylenglycol)gruppen der Formel
-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR gebunden ist, wobei die Gruppe -CO
(d. h. Carbonyl) jeder Poly(ethylenglycol)gruppe eine Amidbin
dung mit einer der Aminogruppen bildet; wobei R Niederalkyl
bedeutet; x 2 oder 3 bedeutet; m etwa 450 bis etwa 900 bedeu
tet; n 1 bis 3 bedeutet; und n und m so ausgewählt sind, daß
das Molekulargewicht des Konjugats abzüglich des Erythropoi
etinglycoproteins 20 Kilodalton bis 100 Kilodalton beträgt.
Die Erfindung stellt außerdem Zusammensetzungen bereit, die
hierin beschriebene Konjugate enthalten, wobei der Prozent
satz an Konjugaten in der Zusammensetzung, in der n gleich 1
ist, mindestens neunzig Prozent beträgt.
Verglichen mit nicht modifiziertem EPO (d. h. EPO ohne
gebundenes PEG) und üblichen PEG-EPO-Konjugaten weisen die
vorliegenden Konjugate erhöhte Halbwertszeit im Kreislauf und
Verweilzeit im Plasma, vermindertes Clearance und verminderte
klinische in vivo-Aktivität auf. Die erfindungsgemäßen Konju
gate weisen dieselbe Verwendung wie EPO auf. Insbesondere
sind die erfindungsgemäßen Konjugate zur Behandlung von Pati
enten durch Stimulierung der Teilung und Differenzierung von
jeweiligen erythroiden Vorläufern im Knochenmark in derselben
Weise, in der EPO zur Behandlung von Patienten verwendet
wird, geeignet.
Die Erfindung stellt Konjugate bereit, wobei die Kon
jugate ein Erythropoietinglycoprotein mit mindestens einer
freien Aminogruppe umfassen und die biologische in vivo-
Aktivität aufweisen, um Knochenmarkzellen zur gesteigerten
Erzeugung von Reticulozyten und roten Blutzellen zu veranlas
sen, und ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Human
erythropoietin und Analogen davon, die eine Sequenz von Hu
manerythropoietin, modifiziert durch die Addition von 1 bis 6
Glycosylierungsstellen oder eine Umlagerung mindestens einer
Glycosylierungsstelle, aufweisen, wobei das Glycoprotein ko
valent an "n" Poly(ethylenglycol)gruppen der Formel
-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR gebunden ist, wobei die Gruppe -CO
(d. h. Carbonyl) jeder Poly(ethylenglycol)gruppe eine Amidbin
dung mit einer der Aminogruppen bildet; wobei R Niederalkyl
bedeutet; x 2 oder 3 bedeutet; m etwa 450 bis etwa 900 bedeu
tet; n 1 bis 3 bedeutet; und n und m so ausgewählt sind, daß
das Molekulargewicht des Konjugats abzüglich des Erythropoi
etinglycoproteins 20 Kilodalton bis 100 Kilodalton beträgt.
Es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Konjuga
te in derselben Weise wie nicht modifiziertes EPO verwendet
werden können. Die erfindungsgemäßen Konjugate weisen jedoch
eine höhere Halbwertszeit im Kreislauf und eine höhere Ver
weilzeit im Plasma, vermindertes Clearance und erhöhte in vi
vo-Aktivität auf. Aufgrund dieser verbesserten Eigenschaften
können die erfindungsgemäßen Konjugate einmal wöchentlich,
anstatt dreimal wöchentlich wie bei nicht modifiziertem EPO,
verabreicht werden. Eine verminderte Verabreichungshäufigkeit
führt erwartungsgemäß zu einer verbesserten Befolgung durch
den Patienten, was zu einem besseren Behandlungsergebnis so
wie zu einer besseren Lebensqualität des Patienten führt.
Verglichen mit üblichen Konjugaten von EPO, das an Po
ly(ethylenglycol) gebunden ist, wurde gefunden, daß Konjugate
mit dem Molekulargewicht und der Linkerstruktur der erfin
dungsgemäßen Konjugate eine verbesserte Wirksamkeit, Stabili
tät, AUC (Fläche unter der Serumkonzentration-Zeit-Kurve),
Halbwertszeit im Kreislauf und ein besseres Kostenprofil auf
weisen.
Die erfindungsgemäßen Konjugate können in der glei
chen Weise wie EPO in einer therapeutisch wirksamen Menge an
Patienten verabreicht werden. Die therapeutisch wirksame Men
ge ist jene Menge an Konjugat, die für die biologische in vi
vo-Aktivität erforderlich ist, um die Knochenmarkzellen zu
einer Steigerung der Erzeugung von Reticulozyten und roten
Blutzellen zu veranlassen. Die exakte Menge an Konjugat un
terliegt solchen Faktoren wie der genauen Art des zu behan
delnden Zustandes, dem Zustand des zu behandelnden Patienten
sowie anderen Bestandteilen in der Zusammensetzung. Bei
spielsweise können 0,01 bis 10 µg pro kg Körpergewicht, vor
zugsweise 0,1 bis 1 µg pro kg Körpergewicht, beispielsweise
einmal wöchentlich verabreicht werden.
Die das Konjugat enthaltenden pharmazeutischen Zusam
mensetzungen können in einer Stärke formuliert werden, die
zur Verabreichung durch verschiedene Maßnahmen an einen Pati
enten (Mensch) mit Blutkrankheiten, die durch eine geringe
oder mangelhafte Erzeugung von roten Blutzellen gekennzeich
net sind, wirksam ist. Mittlere therapeutisch wirksame Mengen
des Konjugats können variieren und insbesondere sollten sie
auf den Empfehlungen und Verschreibungen eines ausgebildeten
Arztes beruhen.
Die Erythropoietinglycoprotein-Produkte, welche gemäß
vorliegender Erfindung hergestellt wurden, können zu pharma
zeutischen Zusammensetzungen, geeignet zur Injektion mit ei
nem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Vehikulum, durch
an sich bekannte Verfahren zubereitet werden. Beispielsweise
wurden geeignete Zusammensetzungen in WO 97/09996, WO 97/40850,
WO 98/58660 und WO 99/07401 beschrieben. Unter den bevorzugten
pharmazeutisch verträglichen Trägern zur Formulierung der er
findungsgemäßen Produkte sind Humanserumalbumin, Humanplasma
proteine usw. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in 10
mM Natrium/Kaliumphosphatpuffer bei pH 7 mit einem Tonizi
tätsmittel, beispielsweise 132 mM Natriumchlorid, formuliert
werden. Gegebenenfalls kann die pharmazeutische Zusammenset
zung einen Konservierungsstoff enthalten. Die pharmazeutische
Zusammensetzung kann unterschiedliche Mengen an Erythropoi
etin, beispielsweise 10-1000 µg/ml, beispielsweise 50 µg
oder 400 µg enthalten.
Der Begriff "Erythropoietin" oder "EPO" betrifft ein
Glycoprotein mit der Aminosäuresequenz, die in (SEQ ID NR.:
1) oder (SEQ ID NR.: 2) angeführt ist, oder eine Aminosäure
sequenz, die im wesentlichen homolog dazu ist, deren biologi
sche Eigenschaften die Stimulierung der Erzeugung von roten
Blutzellen und die Stimulierung der Teilung und Differenzie
rung von jeweiligen erythroiden Vorläufern im Knochenmark be
treffen. Diese hier verwendeten Begriffe schließen solche
Proteine, die gezielt, beispielsweise durch direkte Ortsmuta
genese oder zufällig durch Mutationen modifiziert wurden,
ein. Diese Begriffe schließen auch Analoge mit 1 bis 6 zu
sätzlichen Glycosylierungsstellen, Analoge mit mindestens ei
ner zusätzlichen Aminosäure an dem Carboxy-endständigen Ende
von Glycoprotein, wobei die zusätzliche Aminosäure mindestens
eine Glycosylierungsstelle einschließt, und Analoge mit einer
Aminosäuresequenz, die eine Umlagerung von mindestens einer
Glycosylierungsstelle einschließt, ein. Diese Begriffe
schließen sowohl natürliches als auch rekombinant erzeugtes
Humanerythropoietin ein.
Die erfindungsgemäßen Erythropoietin-Konjugate können
durch die Formel I:
P-[NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]n (I)
wiedergegeben werden, wobei x, m, n und R wie vorstehend de
finiert sind. In Formel I ist P der Rest eines hier beschrie
benen Erythropoietinglycoproteins (d. h. ohne die Aminogruppe
oder Aminogruppen, die eine Amidbindung mit der in Formel I
gezeigten Carbonylgruppe bilden) mit der biologischen in vi
vo-Aktivität, die Knochenmarkzellen zur gesteigerten Erzeu
gung von Reticulozyten und roten Blutzellen veranlaßt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung
ist R Methyl. Vorzugsweise ist m etwa 650 bis etwa 750 und n
ist vorzugsweise 1.
In der besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Aus
führungsform ist R Methyl, m ist etwa 650 bis etwa 750 und n
ist 1, d. h. das wie vorstehend definierte Konjugat hat die
Formel
[CH3O(CH2CH2O)mCH2CH2CH2CO-NH]n-P
worin m 650 bis 750 ist, n 1 ist und P wie vorstehend defi
niert ist. Vorzugsweise weist n im Durchschnitt etwa 680 auf.
Vorzugsweise ist das Glycoprotein der vorstehend de
finierten Konjugate Humanerythropoietin. Humanerythropoietin
und wie vorstehend definierte analoge Proteine können durch
endogene Genaktivierung exprimiert werden. Bevorzugte Human
erythropoietinglycoproteine sind jene von SEQ ID NR.: 1 und
SEQ ID NR.: 2, besonders bevorzugt jene von SEQ ID NR.: 1.
Außerdem kann P aus der Gruppe ausgewählt werden, die
aus Resten von Humanerythropoietin und Analogen davon mit 1
bis 6 zusätzlichen Glycosylierungsstellen besteht. Wie nach
stehend genauer ausgeführt, sind die Zubereitung und Reini
gung von EPO auf dem Fachgebiet bekannt. EPO bedeutet das na
türliche oder rekombinante Protein, vorzugsweise humanen Ur
sprungs, wie es von einer üblichen Herkunft wie Gewebe, Pro
teinsynthese, Zellkulturen mit natürlichen oder rekombinanten
Zellen erhalten wird. Ein beliebiges Protein mit der Aktivi
tät von EPO, wie Muteine oder anderweitig modifizierte Pro
teine, sind mit umfaßt. Rekombinantes EPO kann über Expressi
on in CHO-, BHK- oder HeLa-Zellinien durch rekombinante DNA-
Technologie oder durch endogene Genaktivierung erzeugt wer
den. Expression von Proteinen, einschließlich EPO, durch en
dogene Genaktivierung ist auf dem Fachgebiet bekannt und wird
beispielsweise in den US-Patenten 5 733 761, 5 641 670 und 5
733 746 und in den internationalen Patentveröffentlichungen
WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO
91/06667 und WO 91/09955 offenbart, deren Inhalt jeweils
durch diesen Hinweis in die vorliegende Beschreibung aufge
nommen wird. Die bevorzugten EPO-Arten zur Zubereitung von
Erythropoietinglycoprotein-Produkten sind Human-EPO-Arten.
Besonders bevorzugt ist die EPO-Spezies des Human-EPO mit der
Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 1 oder SEQ ID NR.: 2
ausgeführt ist, vorzugsweise der Aminosäuresequenz SEQ ID
NR.: 1.
In einer Ausführungsform kann P der Rest eines Glyco
proteinanalogen mit 1 bis 6 zusätzlichen Glycosylierungsstel
len sein. Die Glycosylierung eines Proteins mit ein oder meh
reren Oligosaccharidgruppen findet an speziellen Orten längs
des Polypeptidgerüstes statt und beeinflußt in starkem Maße
die physikalischen Eigenschaften des Proteins, wie Protein
stabilität, Sekretion, subzelluläre Lokalisierung und biolo
gische Aktivität. Die Glycosylierung erfolgt gewöhnlich in
zwei Arten. O-gebundene Oligosaccharide werden an Serin- oder
Threoninreste gebunden und N-gebundene Oligosaccharide werden
an Asparaginresten gebunden. Eine Art Oligosaccharid, die man
sowohl an N-gebundenen als auch an O-gebundenen Oligosaccha
riden findet, ist N-Acetylneuraminsäure (Sialinsäure), näm
lich eine Familie von Aminozuckern mit 9 oder mehr Kohlen
stoffatomen. Sialinsäure ist gewöhnlich der endständige Rest
sowohl an N-gebundenen als auch an O-gebundenen Oligosaccha
riden und, da sie eine negative Ladung trägt, überträgt sie
auf das Glycoprotein saure Eigenschaften. Humanerythropoietin
mit 165 Aminosäuren enthält 3 N-gebundene und eine O-
gebundene Oligosaccharidkette, umfassend etwa 40% des gesam
ten Molekulargewichts des Glycoproteins. N-gebundene Glycosy
lierung findet an Asparaginresten, angeordnet an Positionen
24, 38 und 83, statt, und O-gebundene Glycosylierung findet
an einem Serinrest, angeordnet in Position 126, statt. Die
Oligosaccharidketten sind mit endständigen Sialinsäureresten
modifiziert. Die enzymatische Entfernung aller Sialinsäurere
ste aus dem glycosylierten Erythropoietin führt zu einem Ver
lust an in vivo-Aktivität, jedoch nicht an in vitro-
Aktivität, da Sialylierung von Erythropoietin dessen Bin
dungsvermögen und folglich Clearance durch hepatisches Bin
dungsprotein verhindert.
Die erfindungsgemäßen Glycoproteine schließen Analoge
von Humanerythropoietin mit ein oder mehreren Änderungen in
der Aminosäuresequenz von Humanerythropoietin, was zu einer
Steigerung in der Zahl der Sialinsäurebindungsstellen führt,
ein. Diese Glycoproteinanaloge können durch ortsgerichtete
Mutagenese mit Additionen, Deletionen oder Substitutionen von
Aminosäureresten, die die zur Glycosylierung verfügbaren
Stellen steigern oder ändern, erzeugt werden. Glycoprotein
analoge mit einem hohen Anteil an Sialinsäure, der größer ist
als jener, den man bei Humanerythropoietin findet, werden
durch Addition von Glycosylierungsstellen, die die zur biolo
gischen Aktivität erforderliche sekundäre oder tertiäre Kon
formation nicht stören, erzeugt. Die erfindungsgemäßen Glyco
proteine schließen auch Analoge mit erhöhten Anteilen an Koh
lenhydratbindung an einer Glycosylierungsstellen ein, welche
gewöhnlich die Substitution von ein oder mehreren Aminosäuren
in unmittelbarer Nähe zu einer N-gebundenen oder O-gebundenen
Stelle einbeziehen. Die erfindungsgemäßen Glycoproteine
schließen auch Analoge mit ein oder mehreren Aminosäuren, die
sich vom Carboxyende des Erythropoietins erstrecken und min
destens eine zusätzliche Kohlenhydratstelle bereitstellen,
ein. Die erfindungsgemäßen Glycoproteine schließen auch Ana
loge mit einer Aminosäuresequenz ein, die eine Umlagerung
mindestens einer Stelle für die Glycosylierung einschließt.
Eine solche Umlagerung der Glycosylierungsstelle bezieht die
Deletion von einer oder mehreren Glycosylierungsstellen in
Humanerythropoietin und die Addition von einer oder mehreren
nicht natürlich vorkommenden Glycosylierungsstellen ein. Die
Erhöhung der Zahl der Kohlenhydratketten am Erythropoietin
und daher der Zahl an Sialinsäuren pro Erythropoietin-Mole
kül kann vorteilhafte Eigenschaften, wie erhöhte Löslichkeit,
größere Beständigkeit gegen Proteolyse, verminderte Immunoge
nizität, erhöhte Serumhalbwertszeit und erhöhte biologische
Aktivität übertragen. Erythropoietinanaloge mit zusätzlichen
Glycosylierungsstellen sind genauer in EP-A-640 619, Elliot,
veröffentlicht am 1. März 1995, offenbart.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die er
findungsgemäßen Glycoproteine eine Aminosäuresequenz, die
mindestens eine zusätzliche Stelle für die Glycosylierung
einschließt, wie Erythropoietine, umfassend die Sequenz von
Humanerythropoietin, modifiziert durch eine Modifizierung,
ausgewählt aus den nachstehenden:
Asn30Thr32;
Asn51Thr53;
Asn57Thr59;
Asn69;
Asn69Thr71;
Ser68Asn69Thr71;
Val87Asn88Thr90;
Ser87Asn88Thr90;
Ser87Asn88Gly89Thr90;
Ser87Asn88Thr90Thr92;
Ser87Asn88Thr90Ala162;
Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90;
Asn30Thr32Val87Asn88Thr90;
Asn89Ile90Thr91;
Ser87Asn89Ile90Thr91;
Asn136Thr138;
Asn138Thr140;
Thr125; und
Pro124Thr125
Asn51Thr53;
Asn57Thr59;
Asn69;
Asn69Thr71;
Ser68Asn69Thr71;
Val87Asn88Thr90;
Ser87Asn88Thr90;
Ser87Asn88Gly89Thr90;
Ser87Asn88Thr90Thr92;
Ser87Asn88Thr90Ala162;
Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90;
Asn30Thr32Val87Asn88Thr90;
Asn89Ile90Thr91;
Ser87Asn89Ile90Thr91;
Asn136Thr138;
Asn138Thr140;
Thr125; und
Pro124Thr125
sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Die hierin zur Modifizierung von Aminosäuresequenzen
verwendete Bezeichnungsweise bedeutet, daß die Stellung(en)
des entsprechenden nicht modifizierten Proteins (d. h. hEPO
von SEQ ID NR.: 1 oder SEQ ID NR.: 2), angeführt durch die
hochgestellte(n) Zahl(en) zu den entsprechenden Aminosäure(n)
geändert wird, die unmittelbar der entsprechenden jeweiligen
Zahl(en) vorangeht/vorangehen.
Das Glycoprotein kann auch ein Analoges sein mit min
destens einer zusätzlichen Aminosäure am terminalen Carboxy
ende des Glycoproteins, wobei die zusätzliche Aminosäure min
destens eine Glycosylierungsstelle einschließt, d. h. das wie
vorstehend definierte Konjugat betrifft auch eine Verbindung,
worin das Glycoprotein eine Sequenz, umfassend die Sequenz
von Humanerythropoietin und eine zweite Sequenz an dem Carb
oxyende der Humanerythropoietin-Sequenz, aufweist, wobei die
zweite Sequenz mindestens eine Glycosylierungsstelle enthält.
Die zusätzliche Aminosäure kann ein Peptidfragment umfassen,
abgeleitet von dem Carboxy-terminalen Ende von Humanchorion-
Gonadotropin. Vorzugsweise ist das Glycoprotein ein Analoges,
ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (a) Humanerythro
poietin mit der Aminosäuresequenz Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro
Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp
Thr Pro Ile Leu Pro Gln (SEQ ID NR.: 3), die sich von dem
Carboxyterminus erstreckt, (b) dem Analogen in (a), außerdem
umfassend Ser87Asn88Thr90EPO; und (c) dem Analogen in (a), au
ßerdem umfassend Asn30Thr32Val87Asn88Thr90EPO.
Das Glycoprotein kann auch ein Analoges mit einer
Aminosäuresequenz, die eine Umlagerung von mindestens einer
Glycosylierungsstelle einschließt, sein. Die Umlagerung kann
eine Deletion von einer beliebigen N-gebundenen Kohlenhy
dratstelle in Humanerythropoietin und eine Addition einer N-
gebundenen Kohlenhydratstelle an Position 88 der Aminosäure
sequenz von Humanerythropoietin sein. Vorzugsweise ist das
Glycoprotein ein Analoges, ausgewählt aus der Gruppe, beste
hend aus Gln24Ser87Asn88Thr90EPO; Gln38Ser87Asn88Thr90EPO; und
Gln83Ser87Asn88Thr90EPO.
Der hier verwendete Begriff "Niederalkyl" bedeutet
eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit ein bis sechs
Kohlenstoffatomen. Beispiele für Niederalkylgruppen schließen
Methyl, Ethyl und Isopropyl ein. Erfindungsgemäß ist R eine
Niederalkylgruppe. Konjugate, worin R Methyl ist, sind bevor
zugt.
Das Symbol "m" bedeutet eine Zahl von Ethylenoxidre
sten (OCH2CH2) in der Poly(ethylenoxid)gruppe. Eine einzige
PEG-Untereinheit von Ethylenoxid weist, ein Molekulargewicht
von etwa 44 Dalton auf. Somit hängt das Molekulargewicht des
Konjugats (ausgenommen das Molekulargewicht des EPO) von der
Zahl "m" ab. In den Konjugaten dieser Erfindung ist "m" von
etwa 450 bis etwa 900 (entsprechend einem Molekulargewicht
von etwa 20 kDa bis etwa 40 kDa), vorzugsweise von etwa 650
bis etwa 750 (entsprechend einem Molekulargewicht von etwa 30
kDa). Die Zahl m wird so ausgewählt, daß das erhaltene Konju
gat der Erfindung eine physiologische Aktivität aufweist, die
mit nicht modifiziertem EPO vergleichbar ist, wobei die Akti
vität dieselbe, größer oder einen Bruchteil der entsprechen
den Aktivität von nicht modifiziertem EPO darstellen kann.
Ein Molekulargewicht von "etwa" einer bestimmten Zahl bedeu
tet, daß es in einem angemessenen Bereich dieser Zahl liegt,
was durch übliche analytische Techniken bestimmt wird. Die
Zahl "m" wird so ausgewählt, daß das Molekulargewicht jeder
Poly(ethylenglycol)-gruppe, die kovalent an dem Erythropoie
tinglycoprotein gebunden ist, etwa 20 kDa bis etwa 40 kDa und
vorzugsweise etwa 30 kDa beträgt.
In den erfindungsgemäßen Konjugaten ist die Zahl "n"
die Zahl von Polyethylenglycolgruppen, die kovalent an freie
Aminogruppen (einschließlich ε-Aminogruppen einer Lysinami
nosäure und/oder der Amino-endständigen Aminogruppe) eines
Erythropoietinproteins über Amidbindung(en) gebunden sind.
Ein erfindungsgemäßes Konjugat kann ein, zwei oder drei PEG-
Gruppen pro EPO-Molekül enthalten. "n" ist eine ganze Zahl im
Bereich von 1 bis 3, vorzugsweise ist "n" 1 oder 2 und bevor
zugter ist "n" 1.
Die Verbindung der Formel I kann aus dem bekannten
polymeren Material hergestellt werden:
worin R und m wie vorstehend beschrieben sind, durch Konden
sation der Verbindung der Formel II mit dem Erythropoi
etinglycoprotein. Verbindungen der Formel II, worin x 3 be
deutet, sind Alphaniederalkoxy-Buttersäuresuccinimidylester
von Poly(ethylenglycol) (Niederalkoxy-PEG-SBA). Verbindungen
der Formel II, worin x 2 ist, sind Alphaniederalkoxy-
Propionsäuresuccinimidylester von Poly(ethylenglycol) (Nie
deralkoxy-PEG-SPA). Ein beliebiges übliches Verfahren zur Um
setzung eines aktivierten Esters mit einem Amin zur Bildung
eines Amids kann verwendet werden. In der vorstehend be
schriebenen Reaktion ist der beispielhaft angeführte Succini
midylester eine Abgangsgruppe, die eine Amidbildung hervor
ruft. Die Verwendung von Succinimidylester wie die Verbindun
gen der Formel II zur Erzeugung von Konjugaten mit Proteinen
wird in US-A-5 672 662, herausgegeben am 30. September 1997
(Harris et al.), offenbart.
Human-EPO enthält neun freie Aminogruppen, die Amino
endständige Aminogruppe plus ε-Aminogruppen von 8 Lysinre
sten. Wenn das Pegylierungsreagenz mit einer SBA-Verbindung
der Formel II kombiniert wurde, wurde gefunden, daß bei pH
7,5, einem Verhältnis von Protein : PEG von 1 : 3 und einer Reak
tionstemperatur von 20-25°C ein Gemisch von mono-, di- und
Restmengen von tripegylierten Spezies erzeugt wurde. Wenn das
Pegylierungsreagenz eine SPA-Verbindung der Formel II bei
ähnlichen Bedingungen war, ausgenommen, daß das Verhältnis
von Protein : PEG 1 : 2 war, werden vorwiegend monopegylierte Ar
ten erzeugt. Das pegylierte EPO kann als Gemisch oder, wenn
durch Kationenaustauschchromatographie getrennt, als unter
schiedliche pegylierte Arten verabreicht werden. Durch Mani
pulierung der Reaktionsbedingungen (beispielsweise Verhältnis
von Reagenzien, pH-Wert, Temperatur, Proteinkonzentration,
Reaktionszeit usw.) können die relativen Mengen der unter
schiedlichen pegylierten Spezies variiert werden.
Humanerythropoietin (EPO) ist ein Humanglycoprotein,
das die Bildung von Erythrozyten stimuliert. Seine Herstel
lung und seine therapeutische Anwendung werden genauer in den
US-Patenten 5 547 933 und 5 621 080, EP-B-0 148 605, Huang,
S. L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 2708-2712, EP-B-0 205
564, EP-B-0 209 539 und EP-B-0 411 678 sowie Lai, P. H. et
al., J. Biol. Chem. 261 (1986) 3116-3121, und Sasaki, H. et
al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 12059-12076 beschrieben.
Erythropoietin für therapeutische Verwendungen kann durch re
kombinante Maßnahmen erzeugt werden (EP-B-0 148 605, EP-B-0
209 539 und Egrie, J. C., Strickland, T. W., Lane, J. et al.
(1986) Immunobiol. 72: 213-224).
Verfahren zur Expression und Zubereitung von Erythro
poietin in serumfreiem Medium werden beispielsweise in WO
96/35718, Burg, veröffentlicht am 14. November 1996, und in
der EP-A-513 738, Koch, veröffentlicht am 12. Juni 1992, be
schrieben. Zusätzlich zu den vorstehend genannten Veröffent
lichungen ist bekannt, daß eine serumfreie Fermentation von
rekombinanten CHO-Zellen, die ein EPO-Gen enthalten, ausge
führt werden kann. Solche Verfahren sind beispielsweise in
EP-A-0 513 738, EP-A-0 267 678 und in allgemeiner Form von
Kawamoto, T. et al., Analytical Biochem. 130 (1983) 445-453,
EP-A-0 248 656, Kowar, J. und Franek, F., Methods in Enzymo
logy 421 (1986) 277-292, Bavister, B. Expcology 271 (1981)
45-51, EP-A-0 481 791, EP-A-0 307 247, EP-A-0 343 635, WO
88/00967 beschrieben worden.
In EP-A-0 267 678 werden eine Ionenaustauschchromato
graphie an S-Sepharose, eine präparative Umkehrphasen-HPLC an
einer C8-Säule und eine Gelfiltrationschromatographie zur
Reinigung von EPO, erzeugt in einer serumfreien Kultur, nach
einer Dialyse, beschrieben. In diesem Zusammenhang kann der
Gelfiltrationschromatographieschritt durch Fast-Flow-Ionen
austauschchromatographie an S-Sepharose ersetzt werden. Es
wird auch vorgeschlagen, daß eine Farbstoffchromatographie an
einer Blue Trisacryl-Säule vor der Ionenaustauschchromatogra
phie ausgeführt werden kann.
Ein Verfahren zur Reinigung von rekombinantem EPO
wird von Nobuo, I. et al., J. Biochem. 107 (1990) 352-359,
beschrieben. Bei diesem Verfahren wird EPO allerdings mit ei
ner Lösung von Tween® 20, Phenylmethylsulfonylfluorid, Ethyl
maleimid, Pepstatin A, Kupfersulfat und Oxaminsäure vor den
Reinigungsschritten behandelt. Veröffentlichungen, ein
schließlich WO 96/35718, Burg, veröffentlicht am 14. November
1996, offenbaren ein Verfahren zur Herstellung von Erythro
poietin in einem serumfreien Fermentationsverfahren (EPOsf).
Die spezifische Aktivität von EPO oder EPO-Konjugaten
gemäß der Erfindung kann durch verschiedene bekannte Assays
ermittelt werden. Die biologische Aktivität von gereinigten
EPO-Proteinen dieser Erfindung ist dergestalt, daß die Verab
reichung von EPO-Protein durch Injektion an Patienten
(Mensch) in Knochenmarkzellen, verglichen mit Kontrollgruppen
oder Personen, die nicht injiziert wurden, zu einer erhöhten
Erzeugung von Reticulozyten und roten Blutzellen führt. Die
biologische Aktivität von EPO-Proteinen oder Fragmenten da
von, erhalten und gereinigt gemäß dieser Erfindung, kann
durch Verfahren gemäß Annable, et al., Bull. Wld. Hlth. Org.
(1972) 47: 99-112 und Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoi
etin BRP Bio 1997 (2), geprüft werden. Ein weiteres biologi
sches Assay zur Bestimmung der Aktivität von EPO-Protein, das
normozythämische Mausassay, ist in Beispiel 4 beschrieben.
Die Erfindung liefert eine wie vorstehend beschriebe
ne Konjugate umfassende Zusammensetzung. Eine mindestens
neunzig Prozent Mono-PEG-Konjugate enthaltende Zusammenset
zung, d. h. worin n 1 ist, kann wie in Beispiel 5 gezeigt zu
bereitet werden. Gewöhnlich sind Mono-PEG-Konjugate von
Erythropoietinglycoproteinen erwünscht, da sie in der Regel
eine höhere Aktivität als Di-PEG-Konjugate aufweisen. Der
Prozentsatz von Mono-PEG-Konjugaten sowie das Verhältnis von
Mono- und Di-PEG-Arten kann durch Zusammenfügen breiterer
Fraktionen um den Elutionspeak zur Senkung des Prozentsatzes
von Mono-PEG oder engerer Fraktionen zur Erhöhung des Pro
zentsatzes von Mono-PEG in der Zusammensetzung gesteuert wer
den. Etwa neunzig Prozent Mono-PEG-Konjugate sind ein guter
Ausgleich von Ausbeute und Aktivität. Manchmal können Zusam
mensetzungen, in denen beispielsweise mindestens zweiundneun
zig Prozent oder mindestens sechsundneunzig Prozent der Kon
jugate Mono-PEG-Arten (n gleich 1) sind, erwünscht sein. In
einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der Prozentsatz
an Konjugaten, worin n 1 ist, von neunzig Prozent bis sechs
undneunzig Prozent.
Die Erfindung betrifft auch die entsprechenden phar
mazeutischen Zusammensetzungen, die ein Konjugat oder eine
Zusammensetzung wie vorstehend beschrieben und einen pharma
zeutisch verträglichen Exzipienten umfassen.
Die Konjugate und Zusammensetzungen der vorliegenden
Erfindung sind besonders zur Herstellung von Medikamenten zur
Behandlung oder Prophylaxe von Krankheiten, die mit Anämie
bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz (CRF) ein
hergehen, AIDS und zur Behandlung von Krebspatienten, die mit
einer Chemotherapie behandelt werden, geeignet.
Eine zusätzliche Ausführungsform der vorliegenden Er
findung betrifft ein Verfahren zur prophylaktischen und/oder
therapeutischen Behandlung von Erkrankungen, die Anämie bei
Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz (CRF) einbezie
hen, AIDS und Krebspatienten, die mit einer Chemotherapie be
handelt werden, umfassend den Schritt der Verabreichung einer
vorstehend beschriebenen Zusammensetzung an einen Patienten.
Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur
Herstellung von vorstehend beschriebenen Verbindungen, wobei
das Verfahren die Kondensation der Verbindung der Formel II
mit einem Erythropoietinglycoprotein umfaßt und worin R, m
und x wie vorstehend definiert sind.
Die Erfindung betrifft auch wie vorstehend definierte
Verbindungen zur Behandlung von Krankheiten, die mit Anämie
einhergehen, bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz
(CRF), AIDS und Krebspatienten, die mit einer Chemotherapie
behandelt werden.
Die Erfindung wird durch Hinweis auf die nachstehen
den Beispiele besser verständlich, die die hierin beschriebe
ne Erfindung erläutern, aber nicht begrenzen.
Ein Fläschchen von Working Cell Bank, Ursprung einer
EPO-erzeugenden CHO-Zellinie (ATCC CRL8695, veröffentlicht in
EP 411 678 (Genetics Institute) kann verwendet werden) wird
aus der Gasphase des Lagertanks mit flüssigem Stickstoff ge
nommen. Die Zellen werden in Glasgefäße (glass spinner flask)
überführt und in einem Hydrogencarbonat-gepufferten Medium in
einem feuchtgehaltenen CO2-Inkubator gezüchtet. Typische
serumfreie Medien, die für die Inoculumzubereitung und die
Fermentation verwendet werden, sind in EP-A-513 738, Koch,
veröffentlicht am 12. Juni 1992, oder WO 96/35718, Burg, ver
öffentlicht am 14. November 1996, offenbart und enthalten
beispielsweise als Medium DMEM/F12 (z. B. JRH Biosciences/
Hazleton Biologics, Denver, US, Order Nr. 57-736) und zusätz
lich Natriumhydrogencarbonat, L+Glutamin, D+Glucose, rekombi
nantes Insulin, Natriumselenit, Diaminobutan, Hydrocortison,
Eisen(II)sulfat, Asparagin, Asparaginsäure, Serin und einen
Stabilisator für Säugerzellen, wie Polyvinylalkohol, Methyl
cellulose, Polydextran, Polyethylenglycol, Pluronic F68,
Plasmaexpander, Polygelin (HEMACCEL®) oder Polyvinylpyrroli
don (WO 96/35718).
Die Kulturen werden mikroskopisch hinsichtlich Abwe
senheit von kontaminierenden Mikroorganismen geprüft und die
Zelldichten werden bestimmt. Diese Tests werden bei jedem
Splittingschritt ausgeführt.
Nach einem anfänglichen Wachstumszeitraum wird die
Zellkultur mit frischem Medium zu der Ausgangszelldichte ver
dünnt und unterliegt einem weiteren Wachstumszyklus. Dieses
Verfahren wird wiederholt, bis ein Kulturvolumen etwa 2 l pro
Glasgefäß erhalten wurde. Nach etwa 12 Duplizierungen sind 1
bis 5 Liter dieser Kultur verfügbar, die dann als Inoculum
für den 10 l-Inoculumfermenter verwendet wird.
Nach 3-5 Tagen kann die Kultur in dem 10 l-Fermenter
als Inoculum für den 100 l-Fermenter verwendet werden.
Nach zusätzlichen 3-5 Tagen Züchtung kann die Kultur
in dem 100 l-Fermenter als Inoculum für den 1000 l-Produkti
onsfermenter verwendet werden.
Ein Batch-Refeed-Verfahren wird verwendet, d. h., wenn
die gewünschte Zelldichte erreicht ist, werden etwa 80% der
Kultur geerntet. Die zurückbleibende Kultur wird mit frischem
Kulturmedium aufgefüllt und bis zur nächsten Ernte gezüchtet.
Ein Produktionslauf besteht aus maximal 10 aufeinanderfolgen
den Ernten: 9 Teilernten und 1 Gesamternte am Ende der Fer
mentation. Das Ernten findet alle 3-4 Tage statt.
Das bestimmte Erntevolumen wird in ein gefülltes Ge
fäß überführt. Die Zellen werden durch Zentrifugation oder
Filtration entfernt und verworfen. Der EPO enthaltende Über
stand aus dem Zentrifugationsschritt wird in-line filtriert
und in einem zweiten gekühlten Gefäß gesammelt. Jede Ernte
wird während der Reinigung getrennt verarbeitet.
Ein typisches Verfahren zur Reinigung von EPO-Protein
ist in WO 96/35718, Burg, veröffentlicht am 14. November
1996, offenbart. Der Reinigungsschritt wird nachstehend er
läutert.
Blue Sepharose (Pharmacia) besteht aus Sepharosekü
gelchen, an deren Oberfläche Cibacron Blau-Farbstoff kovalent
gebunden ist. Da EPO stärker an Blue Sepharose bindet als die
meisten nicht proteinischen Verunreinigungen, können einige
proteinische Verunreinigungen und PVA entfernt werden und EPO
kann in diesem Schritt angereichert werden. Die Elution von
der Blue Sepharose-Säule erfolgt durch Erhöhen der Salzkon
zentration sowie des pH-Werts.
Die Säule wird mit 80-100 l Blue Sepharose gefüllt,
mit NaOH regeneriert und mit Konditionierungspuffer ins
Gleichgewicht gebracht (Natrium/Calciumchlorid und Natrium
acetat). Der angesäuerte und filtrierte Fermenterüberstand
wird aufgetragen. Nach Abschluß des Auftragens wird die Säule
zuerst mit einem Puffer ähnlich dem Konditionierungspuffer,
der allerdings eine höhere Natriumchloridkonzentration ent
hält, und anschließend mit einem Tris-Base-Puffer gewaschen.
Das Produkt wird mit Tris-Base-Puffer eluiert und in einer
einzigen Fraktion gemäß dem Masterelutionsprofil gesammelt.
Butyl Toyopearl 650 C (Toso Haas) ist eine Matrix auf
Polystyrolbasis, an die aliphatische Butylreste kovalent ge
kuppelt sind. Da EPO stärker an diesem Gel bindet als die
meisten Verunreinigungen und PVA, muß es mit einem Isopropa
nol enthaltenden Puffer eluiert werden.
Die Säule wird mit 30-40 l Butyl Toyopearl 650 C ge
füllt, mit NaOH regeneriert, mit Tris-Basepuffer gewaschen
und mit einem Isopropanol enthaltenden Tris-Basepuffer ins
Gleichgewicht gebracht.
Das Blue Sepharose-Eluat wird auf die Konzentration
an Isopropanol in dem Säulenkonditionierungspuffer einge
stellt und auf die Säule gegeben. Dann wird die Säule mit
Konditionierungspuffer mit steigender Isopropanolkonzentrati
on gewaschen. Das Produkt wird mit Elutionspuffer (Tris-
Basepuffer mit hohem Isopropanolgehalt) eluiert und in einer
einzigen Fraktion gemäß dem Masterelutionsprofil gesammelt.
Das Hydroxyapatit Ultrogel (Biosepra) besteht aus Hy
droxyapatit, das in eine Agarosematrix eingearbeitet ist, um
die mechanischen Eigenschaften zu verbessern. EPO weist eine
geringe Affinität für Hydroxyapatit auf und kann daher bei
geringeren Phosphatkonzentrationen eluiert werden als Pro
teinverunreinigungen.
Die Säule wird mit 30-40 l Hydroxyapatit Ultrogel ge
füllt und mit Kaliumphosphat/Calciumchlorid-Puffer und NaOH,
gefolgt von Tris-Basepuffer, regeneriert. Dann wird mit Tris-
Basepuffer, der eine geringe Menge Isopropanol und Natrium
chlorid enthält, ins Gleichgewicht gebracht.
Das EPO enthaltende Eluat aus der Butyl Toyopearl-
Chromatographie wird auf die Säule aufgetragen. Anschließend
wird die Säule mit Konditionierungspuffer und einem Tris-
Basepuffer ohne Isopropanol und Natriumchlorid gewaschen. Das
Produkt wird dann mit einem Tris-Basepuffer, der eine geringe
Konzentration an Kaliumphosphat enthält, eluiert und in einer
einzigen Fraktion gemäß dem Masterelutionsprofil gesammelt.
Das RP-HPLC-Material Vydac C4 (Vydac) besteht aus
Kieselgelteilchen, deren Oberfläche C4-Alkylketten tragen.
Die Abtrennung von EPO von den proteinischen Verunreinigungen
basiert auf dem Unterschied in der Stärke der hydrophoben
Wechselwirkungen. Die Elution wird mit einem Acetonitrilgra
dienten in verdünnter Trifluoressigsäure ausgeführt.
Präparative HPLC wird unter Verwendung einer Edel
stahlsäule (gefüllt mit 2,8 bis 3,2 Liter Vydac C4 Kieselgel)
ausgeführt. Das Hydroxyapatit Ultrogel-Eluat wird durch Zuga
be von Trifluoressigsäure angesäuert und auf die Vydac C4-
Säule aufgegeben. Zum Waschen und zur Elution wird ein Aceto
nitrilgradient in verdünnter Trifluoressigsäure verwendet.
Die Fraktionen werden gesammelt und sofort mit Phosphatpuffer
neutralisiert. Die EPO-Fraktionen, die innerhalb der IPC-
Grenzen liegen, werden zusammengeführt.
Das DEAE-Sepharosematerial (Pharmacia) besteht aus
Diethylaminoethyl (DEAE)-Gruppen, die kovalent an der Ober
fläche der Sepharosekügelchen gebunden sind. Die Bindung von
EPO an DEAE-Gruppen wird durch ionische Wechselwirkungen ver
mittelt. Acetonitril und Trifluoressigsäure gelangen durch
die Säule, ohne daß sie zurückgehalten werden. Nachdem diese
Stoffe fortgewaschen wurden, werden Spurenverunreinigungen
durch Waschen der Säule mit Acetatpuffer bei einem geringen
pH-Wert entfernt. Die Säule wird dann mit neutralem Phosphat
puffer gewaschen und EPO wird mit einem Puffer bei steigender
Ionenstärke eluiert.
Die Säule wird mit Fast-Flow-DEAE-Sepharose gefüllt.
Das Säulenvolumen wird eingestellt, um zu gewährleisten, daß
eine EPO-Beladung im Bereich von 3-10 mg EPO/ml Gel vor
liegt. Die Säule wird mit Wasser und mit Konditionierungspuf
fer (Äquilibrierungspuffer) (Natrium/Kaliumphosphat) gewa
schen. Die gesammelten Fraktionen des HPLC-Eluats werden auf
getragen und die Säule wird mit Konditionierungspuffer gewa
schen. Dann wird die Säule mit Waschpuffer gewaschen (Natri
umacetatpuffer), gefolgt von Waschen mit Konditionierungspuf
fer. Anschließend wird EPO von der Säule mit Elutionspuffer
(Natriumchlorid, Natrium/Kaliumphosphat) gewaschen und in ei
ner einzigen Fraktion gemäß dem Masterelutionsprofil gesam
melt.
Das Eluat der DEAE Sepharose-Säule wird auf eine spe
zifische Leitfähigkeit eingestellt. Der erhaltene Arzneistoff
wird in Teflonflaschen steril filtriert und bei -70°C gela
gert.
EPO, gereinigt gemäß dem serumfreien Verfahren von
Beispiel 1 (EPOsf), war homogen, bestimmt durch analytische
Verfahren, und zeigte das typische Isoformmuster, das aus 8
Isoformen bestand. Es hatte eine spezifische biologische Ak
tivität von 190000 IU/mg, ermittelt durch das normozythämi
sche Mausassay. Das verwendete Pegylierungsreagenz war ein
Methoxy-PEG-SBA, nämlich eine Verbindung der Formel II, worin
R Methyl ist, x 3 ist und m von 650 bis 750 beträgt (im
Durchschnitt etwa 680 entsprechend einem mittleren Molekular
gewicht von etwa 30 kDa).
Zu einhundert Milligramm EPOsf (9,71 ml einer 10,3
mg/ml EPOsf-Stammlösung, 5,48 µmol) wurden 10 ml 0,1 M Ka
liumphosphatpuffer, pH 7,5, enthaltend 506 mg eines 30 kDa
Methoxy-PEG-SBA (16,5 µmol) (erhalten von Shearwater Poly
mers, Inc., Huntsville, Alabama) gegeben und 2 h bei Raumtem
peratur (20-23°C) vermischt. Die Proteinendkonzentration be
trug 5 mg/ml und das Verhältnis von Protein : PEG-Reagenz be
trug 1 : 3. Nach zwei Stunden wurde die Reaktion durch Einstel
len des pH auf 4,5 mit Eisessig gestoppt und bei -20°C bis
zur Reinigung gelagert.
- 1. Konjugatgemisch: etwa 28 ml von SP-SEPHAROSE FF (Sulfopro pyl-Kationenaustauschharz) wurden auf eine AMICON-Glassäule (2,2 × 7,5 cm) gefüllt und mit 20 mM Acetatpuffer, pH 4,5, bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 50 ml/h ins Gleichge wicht gebracht. Sechs Milliliter des Reaktionsgemisches, ent haltend 30 mg Protein, wurden 5mal mit dem Konditionierungs puffer verdünnt und auf die Säule aufgetragen. Nicht adsor bierte Materialien wurden mit dem Puffer fortgewaschen und das adsorbierte PEG-Konjugat-Gemisch wurde von der Säule mit 0,175 M NaCl in dem Konditionierungspuffer eluiert. Nicht mo difiziertes EFOsf, das noch auf der Säule verblieb, wurde mit 750 mM NaCl eluiert. Die Säule wurde in dem Startpuffer re äquilibriert. Proben wurden durch SDS-PAGE analysiert und de ren Pegylierungsgrad wurde ermittelt. Es wurde gefunden, daß das 0,175 M NaCl-Eluat sowohl mono- als auch di- und Spuren mengen von tripegylierten Arten enthielt, wobei das 750 mM NaCl-Eluat nicht modifiziertes EPOsf enthielt.
- 2. Di-PEG und Mono-PEG-EPOsf: Das gereinigte Konjugatgemisch, das von der Säule im vorstehenden Schritt eluiert wurde, wur de 4fach mit dem Puffer verdünnt und wieder auf eine Säule aufgetragen und wie beschrieben gewaschen. Di-PEG-EPOsf und Mono-PEG-EPOsf wurden getrennt von der Säule mit 0,1 M NaCl bzw. 0,175 M NaCl eluiert. Die Elution wurde auch mit 750 mM NaCl ausgeführt, um verbliebenes nicht modifiziertes EPOsf zu eluieren.
Alternativ wurde das Reaktionsgemisch 5fach mit Ace
tatpuffer verdünnt und auf eine SP-Sepharose-Säule (~0,5 mg
Protein/ml Gel) aufgetragen. Die Säule wurde gewaschen und
adsorbierte Mono-PEG-EPOsf, Di-PEG-EPOsf und nicht modifi
ziertes EPOsf wurden wie im vorstehenden Abschnitt beschrie
ben eluiert.
PEG-EPOsf wurde durch chemische Konjugation eines li
nearen PEG-Moleküls mit einem zahlenmittleren Molekularge
wicht von 30 kDa synthetisiert. PEG-EPOsf stammte aus der Um
setzung zwischen primären Aminogruppen von EPOsf und dem
Succinimidylesterderivat einer 30 kDa PEG-Buttersäure, was zu
einer Amidbindung führt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Ge
reinigtes Konjugatgemisch umfaßte Mono- und Di-PEG-EPOsf und
war frei von nicht modifiziertem EPOsf, wie durch SDS-PAGE-
Analyse ermittelt. Das konjugiertes Gemisch machte 23,4 mg
oder 78% des Ausgangsmaterials aus. Trennung durch Kationen
austauschchromatographie von Mono- und Di-PEG-EPOsf zeigte
an, daß das Mono- zu Di-PEG-Verhältnis in dem Konjugatgemisch
fast 1 : 1 war. Nach Ablauf der Reaktion war das Verhältnis der
einzelnen Komponenten Mono : Di : nicht modifiziert 40 : 38 : 20 (%).
Die Gesamtausbeute war fast quantitativ.
Eine andere aliquote Menge von EPOsf, das in Beispiel
2 verwendet wurde, wurde mit 30 kDa Methoxy-PEG-SPA (Shearwa
ter Polymers, Inc., Huntsville, Alabama) umgesetzt. Die Reak
tion wurde bei einem Verhältnis von Protein : Reagenz von 1 : 2
ausgeführt und die Reinigungsvorgänge erfolgten gemäß Bei
spiel 2. Vorwiegend wurden monopegylierte Arten erzeugt.
Das normozythämische Mausbioassay ist auf dem Fachge
biet bekannt (Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP
Bio 1997(2)) und ein Verfahren in der Monographie von
Erythropoietin von Ph. Eur. BRP. Die Proben wurden mit BSA-
PBS verdünnt. Normale gesunde Mäuse, 7-15 Wochen alt, wurden
s. c. mit 0,2 ml der EPO-Fraktion mit nicht pegyliertem EPO
oder tri-, di- oder monopegyliertem EPO von Beispiel 2 oder 3
behandelt. Über einen Zeitraum von 6 Tagen wurde durch Punk
tur der Schwanzvene Blut entnommen und so verdünnt, daß 1 µl
Blut in 1 ml einer 0,15 µmol Acridinorange-Färbelösung vor
lag. Die Färbezeit betrug 3 bis 10 Minuten. Die Reticulo
zyten-Zählung wurde mikrofluorometrisch in einem Flowcytome
ter durch Analyse des roten Fluoreszenzhistogramms ausge
führt. Die Reticulozyten-Zählungen wurden in bezug auf abso
lute Zahlen (pro 30000 analysierten Blutzellen) angegeben.
Für die vorliegenden Daten bestand jede Gruppe aus 5 Mäusen
pro Tag und den Mäusen wurde nur einmal Blut entnommen.
In getrennten Versuchen wurde eine einzige Dosis von
nicht modifiziertem EPO (25 ng EPO), das PEG(SPA)-EPO-Gemisch
von Beispiel 2 (10 ng Konjugat), mono- und dipegylierte EPO
von Beispiel 2 (10 ng Konjugat), das PEG(SPA)-EPO von Bei
spiel 3 (10 ng Konjugat) und Pufferlösung den Mäusen verab
reicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Die Er
gebnisse zeigen die ausgezeichnete Aktivität und die längere
Halbwertszeit der pegylierten EPO-Spezies, angezeigt durch
die wesentlich höhere Mengen an Reticulozyten und der Ver
schiebung des Maximums der Reticulozyten-Zählung unter Ver
wendung derselben Dosis pro Maus (10 ng), verglichen mit ei
ner Dosis von 25 ng für nicht modifiziertes EPO.
Ausgehend von 100 mg (5,48 µmol) EPOsf in 100 mM Ka
liumphosphatpuffer, pH 7,5, hergestellt gemäß Beispiel 1,
wurden 329 mg (10,96 µmol) 30 kDa PEG-SBA-Reagenz, gelöst in
3 ml 1 mM HCl, zugegeben. Genügend 100 mM Kaliumphosphatpuf
fer, pH 7,5, wurde zugegeben, um das Volumen des Reaktionsge
misches auf 20 ml aufzufüllen. Die letztliche Proteinkonzen
tration betrug 5 mg/ml und das Verhältnis von Protein : PEG-
Reagenz betrug 1 : 2. Das Reaktionsgemisch wurde 2 h bei Raum
temperatur (20-22°C) gemischt. Nach 2 h wurde die Reaktion
durch Einstellen des pH-Werts auf 4,5 mit Eisessig gestoppt
und bis zur Reinigung bei -20°C gefroren gelagert.
Das Reaktionsgemisch aus dem vorangehenden Schritt
wurde mit 10 mM Natriumacetat, pH 4,5, 1 : 5 verdünnt und auf
300 ml SP-Sepharose FF (Sulfopropyl-Kationenaustauschharz),
gefüllt in eine 4,2 × 19 cm-Säule, aufgetragen. Die Säule
wurde vorher mit demselben Puffer ins Gleichgewicht gebracht.
Der Säulenabstrom wurde mit einem UV-Monitor von Gilson bei
280 nm verfolgt und mit einem Bandschreiber von Kipp und Zo
nen aufgezeichnet. Die Säule wurde mit 300 ml oder 1 Bettvo
lumen Konditionierungspuffer gewaschen, um überschüssige Rea
genzien, Reaktionsnebenprodukte und oligomeres PEG-EPO zu
entfernen. Dem folgte Waschen mit 2 Bettvolumen von 100 mM
NaCl, um Di-PEG-EPO zu entfernen. Mono-PEG-EPO wurde dann mit
200 mM NaCl eluiert. Während der Elution des Mono-PEG-EPO
wurden die ersten 50 ml des Proteinpeaks verworfen und das
Mono-PEG-EPO wurde als 150 ml-Fraktion gesammelt. Nicht modi
fiziertes EPOsf, das auf der Säule verblieb, wurde mit 750 mM
NaCl eluiert. Alle Elutionspuffer wurden in dem Konditionie
rungspuffer hergestellt. Alle eluierten Proben wurden durch
SDS-PAGE und durch High Performance Size Exclusion Chromato
graphie (SEC) analysiert. Der aus der 150 ml-Fraktion erhal
tene Mono-PEG-EPO-Pool, bei dem kein nicht modifiziertes
EPOsf nachgewiesen wurde, wurde dann auf ~4,5-7,5 mg/ml
konzentriert und in den Vorratspuffer, 10 mM Kaliumphosphat,
100 mM NaCl, pH 7,5, diafiltriert. Konzentrierung/Diafil
tration erfolgte mit einem Millipore LabscaleTM TFF-System,
ausgestattet mit einer 50 kDa Cut Off Millipore Pellicon XL
Biomax 50-Membran, bei Umgebungstemperatur. Konzentriertes
Mono-PEG-EPO wurde steril filtriert und bei -20°C gefroren
gelagert.
Etwa 75% des EPOsf waren pegyliert. Nach der Reini
gung betrug die Gesamtausbeute ~30% Mono-PEG-EPO ohne nach
weisbaren nicht modifiziertes EPOsf und etwa 25% Di-PEG-EPO.
Oligomere und nicht pegyliertes EPOsf machte das übrige Pro
tein aus. Der Mono-PEG-EPO-Pool, erhalten aus der 150 ml-
Fraktian, enthielt etwa 90% Mono-PEG-EPO und etwa 10% Di-PEG-
EPO.
Claims (30)
1. Konjugat, wobei das Konjugat ein Erythropoietinglycopro
tein mit mindestens einer freien Aminogruppe umfaßt und
die biologische in vivo-Aktivität aufweist, um Knochen
markzellen zur gesteigerten Erzeugung von Reticulozyten
und roten Blutzellen zu veranlassen, und ausgewählt aus
der Gruppe, bestehend aus Humanerythropoietin und Analo
gen davon, die eine Sequenz von Humanerythropoietin, mo
difiziert durch die Addition von 1 bis 6 Glycosylie
rungsstellen oder eine Umlagerung mindestens einer Gly
cosylierungsstelle, aufweisen, wobei das Glycoprotein
kovalent an "n" Poly(ethylenglycol)gruppen der Formel
-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR
gebunden ist, wobei die Gruppe -CO jeder Po ly(ethylenglycol)gruppe eine Amidbindung mit einer der Aminogruppen bildet; wobei
R Niederalkyl bedeutet;
x 2 oder 3 bedeutet;
m etwa 450 bis etwa 900 bedeutet;
n 1 bis 3 bedeutet; und
n und m so ausgewählt sind, daß das Molekulargewicht des Konjugats abzüglich des Erythropoietinglycopro teins 20 Kilodalton bis 100 Kilodalton beträgt.
-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR
gebunden ist, wobei die Gruppe -CO jeder Po ly(ethylenglycol)gruppe eine Amidbindung mit einer der Aminogruppen bildet; wobei
R Niederalkyl bedeutet;
x 2 oder 3 bedeutet;
m etwa 450 bis etwa 900 bedeutet;
n 1 bis 3 bedeutet; und
n und m so ausgewählt sind, daß das Molekulargewicht des Konjugats abzüglich des Erythropoietinglycopro teins 20 Kilodalton bis 100 Kilodalton beträgt.
2. Konjugat nach Anspruch 1 der Formel:
P-[NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]n (I)
worin x, m, n und R wie in Anspruch 1 definiert sind und P der Rest des Glycoproteins ohne die n Aminogruppe(n), die Amidbindung(en) mit der/den Poly(ethylenglycol)grup pe(n) bildet/bilden, ist.
P-[NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]n (I)
worin x, m, n und R wie in Anspruch 1 definiert sind und P der Rest des Glycoproteins ohne die n Aminogruppe(n), die Amidbindung(en) mit der/den Poly(ethylenglycol)grup pe(n) bildet/bilden, ist.
3. Konjugat nach einem vorangehenden Anspruch, wobei R Me
thyl ist.
4. Konjugat nach einem vorangehenden Anspruch, wobei m etwa
650 bis etwa 750 ist.
5. Konjugat nach einem vorangehenden Anspruch, wobei n 1
ist.
6. Konjugat nach einem vorangehenden Anspruch, wobei R Me
thyl ist; m etwa 650 bis etwa 750 ist und n 1 ist.
7. Konjugat nach einem vorangehenden Anspruch der Formel
[CH3O(CH2CH2O)mCH2CH2CH2CO-NH]n-P
worin m 650 bis 750 ist, n 1 ist und P wie in Anspruch 1 definiert ist.
[CH3O(CH2CH2O)mCH2CH2CH2CO-NH]n-P
worin m 650 bis 750 ist, n 1 ist und P wie in Anspruch 1 definiert ist.
8. Konjugat nach einem vorangehenden Anspruch, wobei das
Glycoprotein Humanerythropoietin ist.
9. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Hu
manerythropoietinglycoprotein durch endogene Genaktivie
rung exprimiert wird.
10. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das
Glycoprotein die Sequenz SEQ ID NR.: 1 aufweist.
11. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das
Glycoprotein die Sequenz von Humanerythropoietin, modi
fiziert durch die Addition von 1 bis 6 Glycosylierungs
stellen, aufweist.
12. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das
Glycoprotein die Sequenz von Humanerythropoietin, modi
fiziert durch eine Modifizierung, ausgewählt aus der
Gruppe, bestehend aus:
Asn30Thr32;
Asn51Thr53;
Asn57Thr59;
Asn69;
Asn69Thr71;
Ser68Asn69Thr71;
Val87Asn88Thr90;
Ser87Asn88Thr90;
Ser87Asn88Gly89Thr90;
Ser87Asn88Thr90Thr92;
Ser87Asn88Thr90Ala162;
Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90;
Asn30Thr32Val87Asn88Thr90;
Asn89Ile90Thr91;
Ser87Asn89Ile90Thr91;
Asn136Thr138;
Asn138Thr140;
Thr125; und
Pro124Thr125
aufweist.
Asn30Thr32;
Asn51Thr53;
Asn57Thr59;
Asn69;
Asn69Thr71;
Ser68Asn69Thr71;
Val87Asn88Thr90;
Ser87Asn88Thr90;
Ser87Asn88Gly89Thr90;
Ser87Asn88Thr90Thr92;
Ser87Asn88Thr90Ala162;
Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90;
Asn30Thr32Val87Asn88Thr90;
Asn89Ile90Thr91;
Ser87Asn89Ile90Thr91;
Asn136Thr138;
Asn138Thr140;
Thr125; und
Pro124Thr125
aufweist.
13. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das
Glycoprotein eine Sequenz aufweist, die die Sequenz von
Humanerythropoietin und eine zweite Sequenz am Carb
oxyterminus der Humanerythropoietin-Sequenz umfaßt, wo
bei die zweite Sequenz mindestens eine Glycosylierungs
stelle enthält.
14. Konjugat nach Anspruch 13, wobei die zweiten Sequenzen
eine Sequenz, abgeleitet von der Carboxy-endständigen
Sequenz von Humanchorion-Gonadotropin, umfaßt.
15. Konjugat nach Anspruch 13, wobei das Glycoprotein eine
Sequenz aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend
aus:
- a) der Sequenz von Humanerythropoietin und der Sequenz von SEQ ID NR.: 3 am Carboxyterminus der Humanery thropoietin-Sequenz;
- b) der Sequenz in (a), modifiziert durch Ser87Asn88Thr90; und
- c) der Sequenz in (a), modifiziert durch Asn30Thr32Val87Asn88Thr90.
16. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das
Glycoprotein die Sequenz von Humanerythropoietin, modi
fiziert durch eine Umlagerung mindestens einer Glycosy
lierungsstelle, aufweist.
17. Konjugat nach Anspruch 16, wobei die Umlagerung die De
letion von beliebigen der N-gebundenen Glycosylierungs
stellen in Humanerythropoietin und Addition einer N-
gebundenen Glycosylierungsstelle in Position 88 der Se
quenz von Humanerythropoietin umfaßt.
18. Konjugat nach Anspruch 17, wobei das Glycoprotein die
Sequenz von Humanerythropoietin, modifiziert durch eine
Modifizierung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
Gln24Ser87Asn88Thr90;
Gln38Ser87Asn88Thr90; und
Gln83Ser87Asn88Thr90
aufweist.
Gln24Ser87Asn88Thr90;
Gln38Ser87Asn88Thr90; und
Gln83Ser87Asn88Thr90
aufweist.
19. Zusammensetzung, umfassend Konjugate, wobei jedes der
Konjugate ein Erythropoietinglycoprotein mit mindestens
einer freien Aminogruppe umfaßt und die biologische in
vivo-Aktivität aufweist, um Knochenmarkzellen zur ge
steigerten Erzeugung von Reticulozyten und roten Blut
zellen zu veranlassen, und ausgewählt aus der Gruppe,
bestehend aus Humanerythropoietin und Analogen davon,
die eine Sequenz von Humanerythropoietin, modifiziert
durch die Addition von 1 bis 6 Glycosylierungsstellen
oder eine Umlagerung mindestens einer Glycosylierungs
stelle, aufweisen, wobei das Glycoprotein in jedem Kon
jugat kovalent an "n" Poly(ethylenglycol)gruppen der
Formel -CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR gebunden ist, wobei die
Gruppe -CO jeder Poly(ethylenglycol)gruppe eine Amidbin
dung mit einer der Aminogruppen bildet; wobei in jedem
der Konjugate R Niederalkyl bedeutet; x 2 oder 3 bedeu
tet; m von etwa 450 bis etwa 900 bedeutet; n 1 bis 3 be
deutet; und n und m so ausgewählt sind, daß das Moleku
largewicht von jedem Konjugat abzüglich des Erythropoie
tinglycoproteins 20 Kilodalton bis 100 Kilodalton be
trägt, wobei der Prozentsatz der Konjugate, wenn n 1
ist, mindestens neunzig Prozent beträgt.
20. Zusammensetzung, umfassend Konjugate nach einem der An
sprüche 1 bis 18, wobei der Prozentsatz der Konjugate,
wenn n 1 ist, mindestens neunzig Prozent beträgt.
21. Zusammensetzung nach Ansprüchen 19 oder 20, wobei der
Prozentsatz der Konjugate, wenn n 1 ist, mindestens
zweiundneunzig Prozent beträgt.
22. Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei der Prozentsatz
der Konjugate, wenn n 1 ist, mindestens sechsundneunzig
Prozent beträgt.
23. Zusammensetzung nach Anspruch 19 oder 20, wobei der Pro
zentsatz der Konjugate, wenn n 1 ist, von neunzig Pro
zent bis sechsundneunzig Prozent beträgt.
24. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Konjugat
oder eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis
23 und einen pharmazeutisch verträglichen Exzipienten.
25. Verwendung eines Konjugats oder einer Zusammensetzung
nach einem der Ansprüche 1 bis 23 zur Herstellung von
Arzneimitteln zur Behandlung oder Prophylaxe von Krank
heiten, die mit Anämie bei Patienten mit chronischer
Niereninsuffizienz (CRF) in Beziehung stehen, AIDS oder
zur Behandlung von Krebspatienten, die mit einer Chemo
therapie behandelt werden.
26. Verfahren zur prophylaktischen und/oder therapeutischen
Behandlung von Erkrankungen, die Anämie bei Patienten
mit chronischer Niereninsuffizienz (CRF) einbeziehen,
AIDS und Krebspatienten, die mit einer Chemotherapie be
handelt werden, umfassend den Schritt der Verabreichung
einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 23
an einen Patienten.
27. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen nach einem
der Ansprüche 1 bis 23, umfassend die Kondensation der
Verbindung der Formel II
mit einem Erythropoietinglycoprotein und worin R, m und x wie für einen der Ansprüche 1 bis 6 definiert sind.
mit einem Erythropoietinglycoprotein und worin R, m und x wie für einen der Ansprüche 1 bis 6 definiert sind.
28. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wenn im
mer durch das Verfahren von Anspruch 27 hergestellt.
29. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 23 zur Be
handlung von Krankheiten, die mit Anämie bei Patienten
mit chronischer Niereninsuffizienz (CRF) verbunden sind,
AIDS und Krebspatienten, die mit einer Chemotherapie be
handelt werden.
30. Neue Verbindungen, Verfahren und Vorgehensweisen sowie
die Verwendung solcher Verbindungen im wesentlichen, wie
vorstehend beschrieben.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US14225499P | 1999-07-02 | 1999-07-02 | |
US15022599P | 1999-08-23 | 1999-08-23 | |
US15154899P | 1999-08-31 | 1999-08-31 | |
US16615199P | 1999-11-17 | 1999-11-17 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE10031839A1 true DE10031839A1 (de) | 2001-02-01 |
Family
ID=27495518
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE60036053T Expired - Lifetime DE60036053T2 (de) | 1999-07-02 | 2000-06-28 | Erythropoietinkonjugate |
DE122007000064C Active DE122007000064I2 (de) | 1999-07-02 | 2000-06-28 | Erythropoietinkonjugate |
DE10031839A Ceased DE10031839A1 (de) | 1999-07-02 | 2000-06-30 | Erythropoietinkonjugate |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE60036053T Expired - Lifetime DE60036053T2 (de) | 1999-07-02 | 2000-06-28 | Erythropoietinkonjugate |
DE122007000064C Active DE122007000064I2 (de) | 1999-07-02 | 2000-06-28 | Erythropoietinkonjugate |
Country Status (52)
Families Citing this family (224)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999029732A2 (en) * | 1997-12-08 | 1999-06-17 | Lexigen Pharmaceuticals Corporation | Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation |
US20030105294A1 (en) * | 1998-02-25 | 2003-06-05 | Stephen Gillies | Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins |
JP2002511432A (ja) * | 1998-04-15 | 2002-04-16 | レキシジェン ファーマシューティカルズ コーポレイション | 新脈管形成インヒビターの同時投与による抗体−サイトカイン融合タンパク質媒介性免疫応答の増強 |
US7304150B1 (en) | 1998-10-23 | 2007-12-04 | Amgen Inc. | Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia |
US7345019B1 (en) * | 1999-04-13 | 2008-03-18 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Modulation of excitable tissue function by peripherally administered erythropoietin |
CZ299516B6 (cs) * | 1999-07-02 | 2008-08-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem |
US7067110B1 (en) | 1999-07-21 | 2006-06-27 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
SK782002A3 (en) | 1999-07-21 | 2003-08-05 | Lexigen Pharm Corp | FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
CN1235911C (zh) * | 1999-08-09 | 2006-01-11 | 利思进药品公司 | 多细胞因子-抗体复合物 |
US20050202538A1 (en) * | 1999-11-12 | 2005-09-15 | Merck Patent Gmbh | Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics |
DK1252192T3 (da) * | 2000-02-11 | 2006-11-20 | Merck Patent Gmbh | Forbedring af antistofbaserede fusionsproteiners serumhalveringstid |
US6586398B1 (en) * | 2000-04-07 | 2003-07-01 | Amgen, Inc. | Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods |
MEP90708A (en) * | 2000-05-15 | 2011-12-20 | New pharmaceutical composition | |
ES2288967T3 (es) * | 2000-06-29 | 2008-02-01 | Merck Patent Gmbh | Reforzamiento de las respuestas inmunes mediadas por la proteina de fusion anticuerpo-citoquina por medio del tratamiento combinado por agentes que mejoran la incorporacion de inmunocitoquina. |
ATE421535T1 (de) * | 2000-10-16 | 2009-02-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Peg-modifiziertes erythropoietin |
EP1345628B1 (de) * | 2000-12-20 | 2011-04-13 | F. Hoffmann-La Roche AG | Konjugate von erythropoietin (epo) mit polyethylenglykol (peg) |
CA2431964C (en) * | 2000-12-20 | 2013-09-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Conjugates of erythropoietin (pep) with polyethylene glycol (peg) |
US7767643B2 (en) | 2000-12-29 | 2010-08-03 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs |
US20030072737A1 (en) * | 2000-12-29 | 2003-04-17 | Michael Brines | Tissue protective cytokines for the protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues and organs |
EP1234583A1 (de) | 2001-02-23 | 2002-08-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | PEG-Konjugate des HGF-NK4 |
MXPA03008031A (es) * | 2001-03-07 | 2003-12-04 | Merck Patent Gmbh | Tecnologia de expresion para proteinas que contienen porcion de anticuerpo isotipo hibrida. |
DE10112825A1 (de) | 2001-03-16 | 2002-10-02 | Fresenius Kabi De Gmbh | HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung |
US6992174B2 (en) | 2001-03-30 | 2006-01-31 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
US6969517B2 (en) * | 2001-05-03 | 2005-11-29 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Recombinant tumor specific antibody and use thereof |
US6818613B2 (en) | 2001-11-07 | 2004-11-16 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Aqueous sustained-release formulations of proteins |
KR100467751B1 (ko) | 2001-12-03 | 2005-01-24 | 씨제이 주식회사 | 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 |
ES2381025T3 (es) * | 2001-12-04 | 2012-05-22 | Merck Patent Gmbh | Inmunocitocinas con selectividad modulada |
CA2916093C (en) * | 2001-12-06 | 2020-11-03 | Fibrogen, Inc. | Use of hif prolyl hydroxylase inhibitors for treating neurological disorders |
DE10209822A1 (de) | 2002-03-06 | 2003-09-25 | Biotechnologie Ges Mittelhesse | Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid |
DE10209821A1 (de) | 2002-03-06 | 2003-09-25 | Biotechnologie Ges Mittelhesse | Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid |
WO2003078959A2 (en) | 2002-03-11 | 2003-09-25 | Ortho Mcneil Pharmaceutical, Inc | Methods for shp1 mediated neuroprotection |
PL374580A1 (en) * | 2002-07-01 | 2005-10-31 | The Kenneth S.Warren Institute, Inc. | Recombinant tissue protective cytokines and encoding nucleic acids thereof for protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues, and organs |
KR100608415B1 (ko) | 2002-07-24 | 2006-08-02 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 폴리알킬렌 글리콜산 첨가제 |
US7459435B2 (en) * | 2002-08-29 | 2008-12-02 | Hoffmann-La Roche Inc. | Treatment of disturbances of iron distribution |
US20050176627A1 (en) * | 2002-09-09 | 2005-08-11 | Anthony Cerami | Long acting erythropoietins that maintain tissue protective activity of endogenous erythropoietin |
AU2003263552A1 (en) * | 2002-09-09 | 2004-03-29 | Nautilus Biotech | Rational evolution of cytokines for higher stability, the cytokines and encoding nucleic acid molecules |
IL166506A0 (en) | 2002-09-11 | 2006-01-15 | Fresenius Kabi De Gmbh | Hasylated polypeptides especially hasylated erythropoietin |
US7459436B2 (en) * | 2002-11-22 | 2008-12-02 | Hoffmann-La Roche Inc. | Treatment of disturbances of iron distribution |
US7388079B2 (en) * | 2002-11-27 | 2008-06-17 | The Regents Of The University Of California | Delivery of pharmaceutical agents via the human insulin receptor |
PT1572748E (pt) * | 2002-12-17 | 2010-09-28 | Merck Patent Gmbh | Anticorpo humanizado (h14.18) do anticorpo 14.18 de rato que se liga ao gd2 e a sua fusão com a il-2 |
US7553930B2 (en) | 2003-01-06 | 2009-06-30 | Xencor, Inc. | BAFF variants and methods thereof |
US20060104968A1 (en) | 2003-03-05 | 2006-05-18 | Halozyme, Inc. | Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases |
US7610156B2 (en) | 2003-03-31 | 2009-10-27 | Xencor, Inc. | Methods for rational pegylation of proteins |
US7642340B2 (en) | 2003-03-31 | 2010-01-05 | Xencor, Inc. | PEGylated TNF-α variant proteins |
CA2520875A1 (en) | 2003-03-31 | 2004-10-21 | Xencor, Inc. | Methods for rational pegylation of proteins |
US7279174B2 (en) * | 2003-05-08 | 2007-10-09 | Advanced Cardiovascular Systems, Inc. | Stent coatings comprising hydrophilic additives |
AU2004238869B2 (en) * | 2003-05-12 | 2009-06-25 | Affymax, Inc. | Novel poly(ethylene glycol) modified compounds and uses thereof |
AP2042A (en) | 2003-05-12 | 2009-09-07 | Affymax Inc | Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor |
BRPI0411166A (pt) * | 2003-05-12 | 2006-07-18 | Affymax Inc | composto compreendendo uma parcela de peptìdeo, uma parcela espaçadora e uma parcela de polìmero solúvel em água e composição farmacêutica compreendendo tal composto |
EA010099B1 (ru) * | 2003-05-12 | 2008-06-30 | Афимакс, Инк. | Пептиды, которые связываются с рецептором к эритропоэтину, и способы их применения |
US6995245B2 (en) * | 2003-05-30 | 2006-02-07 | Centocor, Inc. | Formation of novel erythropoietin conjugates using transglutaminase |
WO2005011587A2 (en) * | 2003-07-30 | 2005-02-10 | New Century Pharmaceuticls | Chalaropsis lysozyme protein and its method of use in anti-bacterial applications |
WO2005014655A2 (en) | 2003-08-08 | 2005-02-17 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein |
US7645733B2 (en) * | 2003-09-29 | 2010-01-12 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Tissue protective cytokines for the treatment and prevention of sepsis and the formation of adhesions |
AU2004279895A1 (en) | 2003-10-10 | 2005-04-21 | Xencor, Inc | Protein based TNF-alpha variants for the treatment of TNF-alpha related disorders |
PL1696947T3 (pl) * | 2003-12-19 | 2014-08-29 | Hoffmann La Roche | Zastosowanie erytropoetyny w leczeniu zaburzeń dystrybucji żelaza w przewlekłych chorobach zapalnych jelit |
EP1548031A1 (de) * | 2003-12-22 | 2005-06-29 | Dubai Genetics FZ-LLC | Naturidentischer Erythropoietin |
EP1699821B1 (de) * | 2003-12-31 | 2012-06-20 | Merck Patent GmbH | Fc-ERYTHROPOIETIN-FUSIONSPROTEIN MIT VERBESSERTER PHARMAKOKINETIK |
CN1934143B (zh) * | 2004-01-21 | 2010-10-20 | 耐科塔医药公司 | 丙酸封端聚合物的制备方法 |
CN1914223B (zh) * | 2004-02-02 | 2012-02-29 | Ambrx公司 | 经修饰的人类四螺旋束多肽及其用途 |
CN101659704A (zh) | 2004-03-11 | 2010-03-03 | 弗雷泽纽斯卡比德国有限公司 | 通过还原氨基化制备的羟烷基淀粉和蛋白质的偶联物 |
US7588745B2 (en) * | 2004-04-13 | 2009-09-15 | Si Options, Llc | Silicon-containing products |
US7253650B2 (en) | 2004-05-25 | 2007-08-07 | International Business Machines Corporation | Increase productivity at wafer test using probe retest data analysis |
WO2006062685A2 (en) * | 2004-11-11 | 2006-06-15 | Affymax, Inc. | Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor |
AU2005310189A1 (en) * | 2004-11-11 | 2006-06-08 | Affymax, Inc. | Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor |
AU2006208199B2 (en) | 2005-01-25 | 2012-06-07 | Cell Therapeutics, Inc. | Conjugates of biologically active proteins having a modified in vivo half-life |
WO2006089228A2 (en) * | 2005-02-16 | 2006-08-24 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Conjugates of an epo moiety and a polymer |
US8324159B2 (en) * | 2005-06-03 | 2012-12-04 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
US7919461B2 (en) | 2005-06-03 | 2011-04-05 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
US7550433B2 (en) * | 2005-06-03 | 2009-06-23 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
US20070072795A1 (en) * | 2005-09-28 | 2007-03-29 | Anton Haselbeck | Treatment of neurodegenerative disorders |
SI1931704T1 (sl) * | 2005-10-04 | 2011-04-29 | Zymogenetics L L C | Priprava in čiščenje IL-29 |
US8053569B2 (en) * | 2005-10-07 | 2011-11-08 | Armagen Technologies, Inc. | Nucleic acids encoding and methods of producing fusion proteins |
US8741260B2 (en) * | 2005-10-07 | 2014-06-03 | Armagen Technologies, Inc. | Fusion proteins for delivery of GDNF to the CNS |
US8124095B2 (en) * | 2005-10-07 | 2012-02-28 | Armagen Technologies, Inc. | Fusion proteins for delivery of erythropoietin to the CNS |
JP2009514814A (ja) * | 2005-10-21 | 2009-04-09 | シナジェバ・バイオファーマ・コーポレイション | グリコール化およびグリコシル化された家禽類由来の治療用たんぱく質 |
US20080171696A1 (en) * | 2005-10-21 | 2008-07-17 | Avigenics, Inc. | Pharmacodynamically enhanced therapeutic proteins |
US8841255B2 (en) | 2005-12-20 | 2014-09-23 | Duke University | Therapeutic agents comprising fusions of vasoactive intestinal peptide and elastic peptides |
US20130172274A1 (en) | 2005-12-20 | 2013-07-04 | Duke University | Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties |
US20100166700A1 (en) * | 2006-02-28 | 2010-07-01 | Oligasis Corporation | Acryloyloxyethylphosphorylcholine Containing Polymer Conjugates and Their Preparation |
US8546329B2 (en) | 2006-03-22 | 2013-10-01 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Erythropoietin solution preparation |
CA2659990C (en) * | 2006-08-04 | 2016-03-22 | Prolong Pharmaceuticals, Inc. | Polyethylene glycol erythropoietin conjugates |
US7741446B2 (en) | 2006-08-18 | 2010-06-22 | Armagen Technologies, Inc. | Fusion antibodies that cross the blood-brain barrier in both directions |
EP2120998B1 (de) * | 2006-11-28 | 2013-08-07 | HanAll Biopharma Co., Ltd. | Modifizierte erythropoetin-polypeptide und ihre verwendungen zur behandlung |
PE20090722A1 (es) * | 2007-02-02 | 2009-07-13 | Amgen Inc | Hepcidina, antagonistas de la hepcidina y metodos de uso |
WO2008137066A1 (en) * | 2007-05-02 | 2008-11-13 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Use of compacted nucleic acid nanoparticles in non-viral treatments of ocular diseases |
CL2008002053A1 (es) * | 2007-07-17 | 2009-05-22 | Hoffmann La Roche | Metodo para la purificacion de una eritropoyetina monopeguilada (epompeg) que consiste en proporcionar una solucion que contiene eritropoyetina mono, poli y no peguilada y hacerla pasar por dos pasos de cromatografia de intercambio cationico y metodo para producir epo mpeg que incluye metodo de purificacion. |
CL2008002054A1 (es) * | 2007-07-17 | 2009-05-29 | Hoffmann La Roche | Metodo para la regeneracion de una columna de cromatografia de intercambio cationico despues de la elusion de eritropoyetina monopeguilada y metodo para obtener una eritropoyetina monopeguilada, incorporando el metodo de regeneracion de la columna de intercambio cationico. |
EP2997976A1 (de) | 2007-07-27 | 2016-03-23 | Armagen Technologies, Inc. | Verfahren und zusammensetzungen zur erhöhung der alpha-iduronidase-aktivität im zns |
CA2701032C (en) | 2007-09-27 | 2021-01-26 | Amgen Inc. | Pharmaceutical formulations |
US8796206B2 (en) | 2007-11-15 | 2014-08-05 | Amgen Inc. | Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stabilised by antioxidants for parenteral administration |
WO2009089542A2 (en) | 2008-01-11 | 2009-07-16 | Serina Therapeutics, Inc. | Multifunctional forms of polyoxazoline copolymers and drug compositions comprising the same |
US8101706B2 (en) | 2008-01-11 | 2012-01-24 | Serina Therapeutics, Inc. | Multifunctional forms of polyoxazoline copolymers and drug compositions comprising the same |
ES2500066T3 (es) | 2008-01-25 | 2014-09-30 | Amgen, Inc | Anticuerpos frente a ferroportina y métodos de uso |
NZ586947A (en) | 2008-02-08 | 2012-11-30 | Ambrx Inc | Modified leptin polypeptides and their uses |
TWI395593B (zh) | 2008-03-06 | 2013-05-11 | Halozyme Inc | 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制 |
WO2009128917A2 (en) | 2008-04-14 | 2009-10-22 | Halozyme, Inc. | Modified hyaluronidases and uses in treating hyaluronan-associated diseases and conditions |
AU2009246946B2 (en) | 2008-05-01 | 2013-09-26 | Amgen Inc. | Anti-hepcidin antibodies and methods of use |
JP2011526303A (ja) | 2008-06-27 | 2011-10-06 | デューク ユニバーシティ | エラスチン様ペプチドを含む治療剤 |
CN102232085A (zh) | 2008-09-26 | 2011-11-02 | Ambrx公司 | 修饰的动物促红细胞生成素多肽和其用途 |
CA2742871C (en) | 2008-11-13 | 2018-10-23 | Herb Lin | Methods and compositions for regulating iron homeostasis by modulation of bmp-6 |
EA022752B1 (ru) | 2008-12-09 | 2016-02-29 | Галозим, Инк. | Длинные растворимые полипептиды рн20 и их использование |
WO2010108048A2 (en) | 2009-03-18 | 2010-09-23 | Armagen Technologies, Inc. | Compositions and methods for blood-brain barrier delivery of igg-decoy receptor fusion proteins |
JP5813638B2 (ja) | 2009-07-30 | 2015-11-17 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | 可動クロマトグラフィーカラムセパレータ |
WO2011024025A1 (en) * | 2009-08-28 | 2011-03-03 | Avesthagen Limited | An erythropoietin analogue and a method thereof |
EA026112B1 (ru) | 2009-09-17 | 2017-03-31 | Бакстер Хелскэа, С.А. | Стабильная композиция, содержащая гиалуронидазу и иммуноглобулин, и способы ее применения |
KR20120117728A (ko) * | 2009-09-23 | 2012-10-24 | 바이오제너릭스 에이지 | 재조합 인간 에리트로포이에틴(epo)의 정제 방법, 이렇게 정제된 epo 및 이를 포함하는 약학적 조성물 |
PL2485761T3 (pl) | 2009-10-09 | 2019-10-31 | Armagen Inc | Sposoby i kompozycje do zwiększania aktywności 2-sulfatazy iduronianu w cns |
US9662271B2 (en) | 2009-10-23 | 2017-05-30 | Amgen Inc. | Vial adapter and system |
US8765432B2 (en) | 2009-12-18 | 2014-07-01 | Oligasis, Llc | Targeted drug phosphorylcholine polymer conjugates |
RU2588658C2 (ru) * | 2010-04-27 | 2016-07-10 | ЭсСиАйЭл Текнолоджи ГмбХ | Стабильные водные композиции белка mia/cd-rap |
ES2545411T3 (es) | 2010-06-07 | 2015-09-10 | Amgen Inc. | Dispositivo de administración de fármaco |
ES2661089T3 (es) | 2010-07-20 | 2018-03-27 | Halozyme Inc. | Métodos de tratamiento o prevención de los efectos secundarios adversos asociados con la administración de un agente anti-hialuronano |
RU2566267C2 (ru) | 2010-09-14 | 2015-10-20 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Способ очистки пегилированного эритропоэтина |
EP2671074A1 (de) | 2011-02-02 | 2013-12-11 | F. Hoffmann-La Roche AG | Chromatographiesäulenunterstützung |
EP2672958A1 (de) | 2011-02-08 | 2013-12-18 | Halozyme, Inc. | Zusammensetzung und lipidformulierung eines hyaluronan-abbauenden enzym und seine verwendung zur behandlung von benigner prostatahyperplasie |
WO2012135315A1 (en) | 2011-03-31 | 2012-10-04 | Amgen Inc. | Vial adapter and system |
ES2725785T3 (es) | 2011-04-20 | 2019-09-27 | Amgen Inc | Aparato autoinyector |
US20130011378A1 (en) | 2011-06-17 | 2013-01-10 | Tzung-Horng Yang | Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme |
DK3045187T3 (da) | 2011-10-14 | 2019-06-11 | Amgen Inc | Injektor og fremgangsmåde til samling |
WO2013063155A2 (en) | 2011-10-24 | 2013-05-02 | Halozyme, Inc. | Companion diagnostic for anti-hyaluronan agent therapy and methods of use thereof |
EP4338797A2 (de) | 2011-12-02 | 2024-03-20 | Armagen, Inc. | Verfahren und zusammensetzungen zur erhöhung der arylsulfatase-a-aktivität im zns |
DK2797622T3 (en) | 2011-12-30 | 2017-01-16 | Halozyme Inc | PH20 polypeptide variants, formulations and uses thereof |
KR101809858B1 (ko) | 2012-04-04 | 2017-12-15 | 할로자임, 아이엔씨 | 항-히알루로난 제제 및 종양-표적 탁산을 이용한 병용 치료 |
CN102816227A (zh) * | 2012-08-30 | 2012-12-12 | 深圳赛保尔生物药业有限公司 | 回收促红细胞生成素的方法 |
US9278124B2 (en) | 2012-10-16 | 2016-03-08 | Halozyme, Inc. | Hypoxia and hyaluronan and markers thereof for diagnosis and monitoring of diseases and conditions and related methods |
EP2922590B1 (de) | 2012-11-21 | 2020-02-05 | Amgen Inc. | Arzneimittelabgabevorrichtung |
US9657098B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-05-23 | Intrinsic Lifesciences, Llc | Anti-hepcidin antibodies and uses thereof |
TWI614041B (zh) | 2013-03-15 | 2018-02-11 | 安美基公司 | 用於注射器之匣盒 |
JP6336564B2 (ja) | 2013-03-15 | 2018-06-06 | アムゲン・インコーポレーテッド | 薬物カセット、自動注入器、および自動注入器システム |
US10850037B2 (en) | 2013-03-22 | 2020-12-01 | Amgen Inc. | Injector and method of assembly |
TW201534726A (zh) | 2013-07-03 | 2015-09-16 | Halozyme Inc | 熱穩定ph20玻尿酸酶變異體及其用途 |
JP6463361B2 (ja) | 2013-09-08 | 2019-01-30 | コディアック サイエンシーズ インコーポレイテッドKodiak Sciences Inc. | 第viii因子両性イオンポリマーコンジュゲート |
SG11201602876WA (en) | 2013-10-24 | 2016-05-30 | Amgen Inc | Injector and method of assembly |
EP3957345A1 (de) | 2013-10-24 | 2022-02-23 | Amgen, Inc | Arzneimittelabgabesystem mit temperaturempfindlicher steuerung |
WO2015119906A1 (en) | 2014-02-05 | 2015-08-13 | Amgen Inc. | Drug delivery system with electromagnetic field generator |
CN106413779B (zh) | 2014-05-07 | 2020-06-05 | 安姆根有限公司 | 具有减震元件的自助注射器 |
EP3152694B1 (de) | 2014-06-03 | 2024-03-06 | Amgen Inc. | Systeme und verfahren zur entfernten verarbeitung von daten, die von einer arzneimittelausgabevorrichtung gesammelt wurden |
US9840553B2 (en) | 2014-06-28 | 2017-12-12 | Kodiak Sciences Inc. | Dual PDGF/VEGF antagonists |
HUE043847T2 (hu) | 2014-08-28 | 2019-09-30 | Halozyme Inc | Hialuronán-lebontó enzimmel és egy immun checkpoint inhibitorral végzett kombinációs terápia |
NZ730186A (en) | 2014-09-22 | 2020-04-24 | Intrinsic Lifesciences Llc | Humanized anti-hepcidin antibodies and uses thereof |
EP3206739B1 (de) | 2014-10-14 | 2021-12-01 | Amgen Inc. | Vorrichtung zur injektion von medikamenten mit visuellen indikatoren und audio-indikatoren |
CN108064282A (zh) | 2014-10-14 | 2018-05-22 | 哈洛齐梅公司 | 腺苷脱氨酶-2(ada2)、其变体的组合物及使用其的方法 |
CN107208076A (zh) | 2014-10-17 | 2017-09-26 | 科达制药 | 丁酰胆碱酯酶两性离子聚合物缀合物 |
JP2017538512A (ja) | 2014-12-19 | 2017-12-28 | アムジエン・インコーポレーテツド | ライブボタンまたはユーザインタフェースフィールドを含む薬物送達装置 |
EP3233163B1 (de) | 2014-12-19 | 2021-10-13 | Amgen Inc. | Medikamentenabgabevorrichtung mit näherungssensor |
US10538589B2 (en) | 2015-01-14 | 2020-01-21 | Armagen Inc. | Methods and compositions for increasing N-acetylglucosaminidase (NAGLU) activity in the CNS using a fusion antibody comprising an anti-human insulin receptor antibody and NAGLU |
MX2017010466A (es) | 2015-02-17 | 2018-06-06 | Amgen Inc | Dispositivo de administracion de farmacos con sujecion asistida de vacio y/o respuestas. |
WO2016138434A1 (en) | 2015-02-27 | 2016-09-01 | Amgen Inc. | Drug delivery device having a needle guard mechanism with a tunable threshold of resistance to needle guard movement |
WO2017039786A1 (en) | 2015-09-02 | 2017-03-09 | Amgen Inc. | Syringe assembly adapter for a syringe |
JP7082568B2 (ja) | 2015-12-09 | 2022-06-08 | アムジエン・インコーポレーテツド | 信号伝達キャップ付き自動注射器 |
US11066465B2 (en) | 2015-12-30 | 2021-07-20 | Kodiak Sciences Inc. | Antibodies and conjugates thereof |
WO2017120178A1 (en) | 2016-01-06 | 2017-07-13 | Amgen Inc. | Auto-injector with signaling electronics |
US11200298B2 (en) | 2016-03-15 | 2021-12-14 | Amgen Inc. | Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices |
CN105820232B (zh) * | 2016-04-08 | 2019-05-17 | 昂德生物药业有限公司 | 单修饰聚乙二醇重组人促红素的制备方法及其制品和应用 |
US11541168B2 (en) | 2016-04-29 | 2023-01-03 | Amgen Inc. | Drug delivery device with messaging label |
WO2017192287A1 (en) | 2016-05-02 | 2017-11-09 | Amgen Inc. | Syringe adapter and guide for filling an on-body injector |
CA3018426A1 (en) | 2016-05-13 | 2017-11-16 | Amgen Inc. | Vial sleeve assembly |
WO2017200989A1 (en) | 2016-05-16 | 2017-11-23 | Amgen Inc. | Data encryption in medical devices with limited computational capability |
WO2017209899A1 (en) | 2016-06-03 | 2017-12-07 | Amgen Inc. | Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices |
EP3478342A1 (de) | 2016-07-01 | 2019-05-08 | Amgen Inc. | Arzneimittelabgabevorrichtung mit minimiertem teilebruchrisiko nach aufprallereignissen |
WO2018011381A1 (en) | 2016-07-15 | 2018-01-18 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for purifying pegylated erythropoietin |
WO2018034784A1 (en) | 2016-08-17 | 2018-02-22 | Amgen Inc. | Drug delivery device with placement detection |
EP3532127A1 (de) | 2016-10-25 | 2019-09-04 | Amgen Inc. | Injektor am körper |
EP3570917A1 (de) | 2017-01-17 | 2019-11-27 | Amgen Inc. | Injektionsvorrichtungen und zugehörige verfahren zur verwendung sowie anordnung |
CA3052204A1 (en) | 2017-02-17 | 2018-08-23 | Amgen Inc. | Insertion mechanism for drug delivery device |
WO2018151890A1 (en) | 2017-02-17 | 2018-08-23 | Amgen Inc. | Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly |
MX2019010544A (es) | 2017-03-06 | 2019-10-21 | Amgen Inc | Dispositivo de administracion de farmacos con caracteristica de prevencion de la activacion. |
AU2018230546B2 (en) | 2017-03-07 | 2024-03-21 | Amgen Inc. | Needle insertion by overpressure |
WO2018165499A1 (en) | 2017-03-09 | 2018-09-13 | Amgen Inc. | Insertion mechanism for drug delivery device |
WO2018172219A1 (en) | 2017-03-20 | 2018-09-27 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for in vitro glycoengineering of an erythropoiesis stimulating protein |
ES2959935T3 (es) | 2017-03-28 | 2024-02-29 | Amgen Inc | Sistema y método de vástago de émbolo y conjunto de jeringa |
CA3066399A1 (en) | 2017-06-08 | 2018-12-13 | Amgen Inc. | Torque driven drug delivery device |
WO2018226515A1 (en) | 2017-06-08 | 2018-12-13 | Amgen Inc. | Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly |
EP3641857A1 (de) | 2017-06-22 | 2020-04-29 | Amgen Inc. | Aufprall-/stossdämpfungsminderung bei geräteaktivierung |
JP7091373B2 (ja) | 2017-06-22 | 2022-06-27 | カタリスト・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド | 改変された膜型セリンプロテアーゼ1(mtsp-1)ポリペプチドおよび使用方法 |
CA3063921A1 (en) | 2017-06-23 | 2018-12-27 | Amgen Inc. | Electronic drug delivery device comprising a cap activated by a switch assembly |
JP7408398B2 (ja) | 2017-07-14 | 2024-01-05 | アムジエン・インコーポレーテツド | 二重ねじりばねシステムを有する針挿入後退システム |
MA49626A (fr) | 2017-07-21 | 2020-05-27 | Amgen Inc | Élément d'étanchéité perméable aux gaz pour récipient à médicament et procédés d'assemblage |
EP4085942A1 (de) | 2017-07-25 | 2022-11-09 | Amgen Inc. | Arzneimittelabgabevorrichtung mit getriebemodul und verwandtes verfahren zur montage |
EP3658206A1 (de) | 2017-07-25 | 2020-06-03 | Amgen Inc. | Arzneimittelabgabevorrichtung mit behälterzugangssystem und zugehörigem verfahren zur montage |
MA49838A (fr) | 2017-08-09 | 2020-06-17 | Amgen Inc | Systèm de administration de médicaments avec pression hydraulique-pneumatique de chambre |
MA49897A (fr) | 2017-08-18 | 2020-06-24 | Amgen Inc | Injecteur sur-corps avec patch adhésif stérile |
US11103636B2 (en) | 2017-08-22 | 2021-08-31 | Amgen Inc. | Needle insertion mechanism for drug delivery device |
ES2939292T3 (es) | 2017-10-04 | 2023-04-20 | Amgen Inc | Adaptador de flujo para dispositivo de administración de fármacos |
EP3691716B1 (de) | 2017-10-06 | 2023-11-29 | Amgen Inc. | Arzneimittelabgabevorrichtung mit verriegelungsvorrichtung und zugehöriges montageverfahren |
US11464903B2 (en) | 2017-10-09 | 2022-10-11 | Amgen Inc. | Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly |
WO2019090079A1 (en) | 2017-11-03 | 2019-05-09 | Amgen Inc. | System and approaches for sterilizing a drug delivery device |
CA3079197A1 (en) | 2017-11-06 | 2019-05-09 | Amgen Inc. | Drug delivery device with placement and flow sensing |
EP3707075A1 (de) | 2017-11-06 | 2020-09-16 | Amgen Inc. | Füllabschlussanordnungen und zugehörige verfahren |
AU2018364933B2 (en) | 2017-11-10 | 2024-01-25 | Amgen Inc. | Plungers for drug delivery devices |
AU2018368340B2 (en) | 2017-11-16 | 2024-03-07 | Amgen Inc. | Door latch mechanism for drug delivery device |
MX2020005066A (es) | 2017-11-16 | 2020-08-20 | Amgen Inc | Autoinyector con deteccion de detencion y punto final. |
JP7137625B2 (ja) | 2017-12-29 | 2022-09-14 | エフ.ホフマン-ラ ロシュ アーゲー | Peg化タンパク質組成物を提供するための方法 |
CN111801120A (zh) | 2017-12-29 | 2020-10-20 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于提供聚乙二醇化蛋白质组合物的方法 |
HRP20220388T1 (hr) | 2017-12-29 | 2022-05-27 | F. Hoffmann - La Roche Ag | Postupak za dobivanje pegiliranog proteinskog pripravka |
WO2019222435A1 (en) | 2018-05-16 | 2019-11-21 | Halozyme, Inc. | Methods of selecting subjects for combination cancer therapy with a polymer-conjugated soluble ph20 |
US10835685B2 (en) | 2018-05-30 | 2020-11-17 | Amgen Inc. | Thermal spring release mechanism for a drug delivery device |
US11083840B2 (en) | 2018-06-01 | 2021-08-10 | Amgen Inc. | Modular fluid path assemblies for drug delivery devices |
EP3826701A1 (de) | 2018-07-24 | 2021-06-02 | Amgen Inc. | Ausgabevorrichtung zur verabreichung von arzneimitteln |
US20210228815A1 (en) | 2018-07-24 | 2021-07-29 | Amgen Inc. | Hybrid drug delivery devices with grip portion |
US20210260279A1 (en) | 2018-07-24 | 2021-08-26 | Amgen Inc. | Hybrid drug delivery devices with optional grip portion and related method of preparation |
MX2021000749A (es) | 2018-07-24 | 2021-03-29 | Amgen Inc | Dispositivos de suministro para administrar farmacos. |
EP3829692A1 (de) | 2018-07-31 | 2021-06-09 | Amgen Inc. | Flüssigkeitsweganordnungen für wirkstofffreisetzungsvorrichtung |
EP3613486B1 (de) * | 2018-08-24 | 2020-10-07 | UGA Biopharma GmbH | Verfahren und anlage zur reinigung von epo und/oder einem epo-derivat |
WO2020068623A1 (en) | 2018-09-24 | 2020-04-02 | Amgen Inc. | Interventional dosing systems and methods |
AU2019350660A1 (en) | 2018-09-28 | 2021-03-18 | Amgen Inc. | Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device |
AU2019352616A1 (en) | 2018-10-02 | 2021-03-18 | Amgen Inc. | Injection systems for drug delivery with internal force transmission |
TWI824026B (zh) | 2018-10-05 | 2023-12-01 | 美商安進公司 | 具有劑量指示器之藥物遞送裝置 |
CN117138169A (zh) | 2018-10-15 | 2023-12-01 | 安进公司 | 药物递送装置 |
CA3109988A1 (en) | 2018-10-15 | 2020-04-23 | Amgen Inc. | Platform assembly process for drug delivery device |
AU2019370159A1 (en) | 2018-11-01 | 2021-04-22 | Amgen Inc. | Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction |
EP3873567A1 (de) | 2018-11-01 | 2021-09-08 | Amgen Inc. | Arzneimittelabgabevorrichtungen mit teilweisem nadelrückzug |
MA54048A (fr) | 2018-11-01 | 2022-02-09 | Amgen Inc | Dispositifs d'administration de médicament avec rétraction partielle de l'organe d'administration de médicament |
US11613744B2 (en) | 2018-12-28 | 2023-03-28 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use |
AU2020263289A1 (en) | 2019-04-24 | 2021-09-16 | Amgen Inc. | Syringe sterilization verification assemblies and methods |
EP4017560A2 (de) | 2019-08-23 | 2022-06-29 | Amgen, Inc | Arzneimittelabgabevorrichtung mit konfigurierbaren nadelschutzeingriffskomponenten und zugehörige verfahren |
AU2020364071A1 (en) | 2019-10-10 | 2022-05-26 | Kodiak Sciences Inc. | Methods of treating an eye disorder |
US20230331798A1 (en) | 2020-09-22 | 2023-10-19 | Jecho Laboratories, Inc. | Glycosylation-modified erythopoietin and use thereof |
WO2022159414A1 (en) | 2021-01-22 | 2022-07-28 | University Of Rochester | Erythropoietin for gastroinfestinal dysfunction |
JPWO2022239704A1 (de) | 2021-05-10 | 2022-11-17 | ||
CN117320964A (zh) | 2021-05-21 | 2023-12-29 | 美国安进公司 | 优化药物容器的灌装方案的方法 |
WO2023209074A1 (en) | 2022-04-28 | 2023-11-02 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | Methods of restoring erythropoiesis in patients suffering from a sf3b1 mutant myelodysplastic syndrome by correcting coasy mis-splicing |
CN116492448A (zh) * | 2023-04-12 | 2023-07-28 | 深圳赛保尔生物药业有限公司 | 负载peg-epo及间充质干细胞的组合物、药物及其制备方法 |
Family Cites Families (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4179337A (en) | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
KR850004274A (ko) * | 1983-12-13 | 1985-07-11 | 원본미기재 | 에리트로포이에틴의 제조방법 |
EP0154316B1 (de) | 1984-03-06 | 1989-09-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Chemisch modifizierte Lymphokine und Verfahren zu ihrer Herstellung |
JPS6197229A (ja) | 1984-10-18 | 1986-05-15 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 安定なエリトロポエチン製剤 |
US4917888A (en) | 1985-06-26 | 1990-04-17 | Cetus Corporation | Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
US5641663A (en) * | 1985-11-06 | 1997-06-24 | Cangene Corporation | Expression system for the secretion of bioactive human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and other heterologous proteins from steptomyces |
US4902502A (en) | 1989-01-23 | 1990-02-20 | Cetus Corporation | Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate |
US5166322A (en) | 1989-04-21 | 1992-11-24 | Genetics Institute | Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof |
US5674534A (en) * | 1992-06-11 | 1997-10-07 | Alkermes, Inc. | Composition for sustained release of non-aggregated erythropoietin |
NZ250375A (en) | 1992-12-09 | 1995-07-26 | Ortho Pharma Corp | Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives |
US5359030A (en) * | 1993-05-10 | 1994-10-25 | Protein Delivery, Inc. | Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same |
US5681811A (en) | 1993-05-10 | 1997-10-28 | Protein Delivery, Inc. | Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same |
CN1057534C (zh) * | 1993-08-17 | 2000-10-18 | 柯瑞英-艾格公司 | 促红细胞生成素类似物 |
US5643575A (en) * | 1993-10-27 | 1997-07-01 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
US5919455A (en) * | 1993-10-27 | 1999-07-06 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
US5932462A (en) * | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
DE741187T1 (de) * | 1995-05-05 | 1997-04-30 | Hoffmann La Roche | Rekombinante Obesitäts-(OB)-Proteine |
US5672662A (en) | 1995-07-07 | 1997-09-30 | Shearwater Polymers, Inc. | Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications |
US6025324A (en) * | 1996-05-15 | 2000-02-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Pegylated obese (ob) protein compositions |
TW517067B (en) * | 1996-05-31 | 2003-01-11 | Hoffmann La Roche | Interferon conjugates |
DK0902085T3 (da) * | 1997-09-01 | 2004-04-05 | Aventis Pharma Gmbh | Rekombinant human erythropoietin med fordelagtig glycosyleringsprofil |
JP2002531089A (ja) | 1998-11-30 | 2002-09-24 | イーライ・リリー・アンド・カンパニー | 赤血球産生性化合物 |
PE20010288A1 (es) * | 1999-07-02 | 2001-03-07 | Hoffmann La Roche | Derivados de eritropoyetina |
CZ299516B6 (cs) * | 1999-07-02 | 2008-08-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem |
WO2001068141A2 (en) | 2000-03-17 | 2001-09-20 | Maxygen Aps | Dispersions of polypeptide conjugates |
US6586398B1 (en) | 2000-04-07 | 2003-07-01 | Amgen, Inc. | Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods |
MEP90708A (en) * | 2000-05-15 | 2011-12-20 | New pharmaceutical composition |
-
2000
- 2000-06-23 CZ CZ20002386A patent/CZ299516B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-06-27 US US09/604,938 patent/US6583272B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-27 SK SK987-2000A patent/SK286301B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-06-28 NO NO20003372A patent/NO327043B1/no not_active IP Right Cessation
- 2000-06-28 IL IL13705600A patent/IL137056A0/xx active Protection Beyond IP Right Term
- 2000-06-28 DO DO2000000030A patent/DOP2000000030A/es unknown
- 2000-06-28 AT AT00113115T patent/ATE370748T1/de active
- 2000-06-28 SI SI200030963T patent/SI1064951T1/sl unknown
- 2000-06-28 NZ NZ505454A patent/NZ505454A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-06-28 DE DE60036053T patent/DE60036053T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-28 CA CA002310536A patent/CA2310536C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-28 DK DK00113115T patent/DK1064951T3/da active
- 2000-06-28 DE DE122007000064C patent/DE122007000064I2/de active Active
- 2000-06-28 PE PE2000000654A patent/PE20010297A1/es not_active IP Right Cessation
- 2000-06-28 EP EP00113115A patent/EP1064951B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-28 RS YUP-407/00A patent/RS49928B/sr unknown
- 2000-06-28 AU AU42744/00A patent/AU736067B2/en active Active
- 2000-06-28 PT PT00113115T patent/PT1064951E/pt unknown
- 2000-06-28 EP EP07010693A patent/EP1839676A3/de not_active Withdrawn
- 2000-06-28 TR TR2000/01956A patent/TR200001956A2/xx unknown
- 2000-06-28 ID IDP20000533D patent/ID26447A/id unknown
- 2000-06-28 ES ES00113115T patent/ES2289985T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-28 HR HR20000436A patent/HRP20000436B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-06-29 SG SG200003658A patent/SG92717A1/en unknown
- 2000-06-29 GT GT200000109A patent/GT200000109A/es unknown
- 2000-06-29 GE GEAP20005430A patent/GEP20022804B/en unknown
- 2000-06-29 PA PA20008497801A patent/PA8497801A1/es unknown
- 2000-06-29 CN CNB2004100036029A patent/CN1283664C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-29 CO CO00048963A patent/CO5190661A1/es active IP Right Grant
- 2000-06-29 CN CNB001078895A patent/CN1184233C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-29 AR ARP000103318A patent/AR024625A1/es active IP Right Grant
- 2000-06-29 MY MYPI20002954A patent/MY128500A/en unknown
- 2000-06-30 IT IT2000MI001479A patent/IT1318606B1/it active
- 2000-06-30 OA OA1200000197A patent/OA11442A/fr unknown
- 2000-06-30 MX MXPA00006547A patent/MXPA00006547A/es active IP Right Grant
- 2000-06-30 UY UY26228A patent/UY26228A1/es not_active IP Right Cessation
- 2000-06-30 BG BG104570A patent/BG65449B1/bg unknown
- 2000-06-30 TN TNTNSN00147A patent/TNSN00147A1/fr unknown
- 2000-06-30 HU HU0002553A patent/HU226233B1/hu active Protection Beyond IP Right Term
- 2000-06-30 DE DE10031839A patent/DE10031839A1/de not_active Ceased
- 2000-06-30 IS IS5554A patent/IS2492B/is unknown
- 2000-06-30 MA MA26014A patent/MA26746A1/fr unknown
- 2000-06-30 ES ES200001625A patent/ES2191511B1/es not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-30 GB GB0016205A patent/GB2353281B/en not_active Withdrawn - After Issue
- 2000-06-30 GB GB0400086A patent/GB2393960C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-30 TW TW089112948A patent/TWI235667B/zh not_active IP Right Cessation
- 2000-06-30 KR KR1020000036976A patent/KR100593143B1/ko active IP Right Grant
- 2000-06-30 SV SV2000000120A patent/SV2002000120A/es active IP Right Grant
- 2000-07-02 GC GCP2000749 patent/GC0000197A/en active
- 2000-07-03 BR BR0002276-4A patent/BR0002276A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-07-03 BR BRPI0002276A patent/BRPI0002276B8/pt unknown
- 2000-07-03 EA EA200000607A patent/EA003777B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-07-03 PL PL341187A patent/PL202758B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2000-07-03 JP JP2000201525A patent/JP3727009B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-03 FR FR0008609A patent/FR2795734B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-06-12 HK HK05100477A patent/HK1068354A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2001-06-12 HK HK01104020A patent/HK1033328A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-11-14 US US10/293,551 patent/US20030120045A1/en not_active Abandoned
-
2003
- 2003-12-17 JP JP2003419520A patent/JP2004155787A/ja active Pending
-
2006
- 2006-09-25 AR ARP060104175A patent/AR055650A2/es unknown
-
2007
- 2007-08-23 CY CY20071101097T patent/CY1107719T1/el unknown
- 2007-09-05 NL NL300289C patent/NL300289I9/nl unknown
- 2007-09-06 CY CY200700021C patent/CY2007021I1/el unknown
- 2007-09-12 LU LU91363C patent/LU91363I2/fr unknown
- 2007-10-19 FR FR07C0051C patent/FR07C0051I2/fr active Active
-
2009
- 2009-05-05 NO NO2009010C patent/NO2009010I2/no unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE60036053T2 (de) | Erythropoietinkonjugate | |
DE60011087T2 (de) | Konjugate zwischen erythropoietin und polyethylenglycol | |
DE60224415T2 (de) | Pegyliertes und diglykosyliertes erythropoietin | |
DE60109625T3 (de) | Flüssige arzneizubereitung enthaltend ein erythropoietin derivat | |
DE69935345T3 (de) | Methoden und zusammensetzungen zur prävention und behandlung der anämie | |
RU2232163C2 (ru) | Конъюгаты эритропоэтина и полиэтиленгликоля, фармацевтические композиции (варианты), способ профилактического и/или терапевтического лечения нарушений и способ получения коньюгата или композиции |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
8172 | Supplementary division/partition in: |
Ref document number: 10066402 Country of ref document: DE Kind code of ref document: P |
|
Q171 | Divided out to: |
Ref document number: 10066402 Country of ref document: DE Kind code of ref document: P |
|
8131 | Rejection |