DE10025145A1 - Phosphorescent polyelectrolyte aggregate used e.g. for the labelling and detection of biomolecules, e.g. toxins or hormones, comprises a luminescent metal-ligand complex in a screening sheath of polyelectrolyte - Google Patents
Phosphorescent polyelectrolyte aggregate used e.g. for the labelling and detection of biomolecules, e.g. toxins or hormones, comprises a luminescent metal-ligand complex in a screening sheath of polyelectrolyteInfo
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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- G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
Abstract
Description
Die Messung der Lumineszenz ist eine weit verbreitete Methode in der Bio- und Chemoanalytik. Ihre Attraktivität verdankt sie ihrer hohen Empfindlichkeit, der Vielseitigkeit sowie der Eliminierung der Strahlenbelastung durch radioaktive Markierungsreagenzien. In der Praxis werden in der Regel Fluoreszenzmarker eingesetzt, die sich durch eine hohe Quantenausbeute auszeichnen eingesetzt. Meist wird die Korrelation zwischen Fluoreszenzintensitätssignal sowie der Konzentration des Fluoreszenzmarkers in der Probe als Meßparameter ausgewertet. Nachteilig wirkt sich bei solchen Messungen aus, daß die quantitative Auswertung der Fluoreszenzintensität durch eine Vielzahl von Faktoren gestört wird. Dabei kann es sich zum einen um Schwankungen der Intensität im optischen System (Lichtquelle, Detektor und optischer Weg), aber auch um intrinsische optische Eigenschaften der Probe handeln (Färbung, Trübung und Untergrundfluoreszenz) handeln. Um diese Störeinflüsse zu eliminieren, benötigt man effiziente Methoden zur Referenzierung der Fluoreszenzsignale. Eine kürzlich patentierte Methode zum Referenzieren von Fluoreszenzsignalen beruht darauf, daß zur Probe ein phosphoreszierender Referenzstandard zugegeben wird, der ähnliche (im besten Fall identische) spektrale Eigenschaften wie der eigentliche Fluoreszenzmarker aufweist (DE 198 29 657 A1). In Kombination mit einer Frequenzmodulations- oder zeitaufgelösten Lumineszenzmessung wird auf diese Weise die Intensitätsinformation in ein Phasensignal oder einen zeitabhängigen Parameter umgewandelt. Um auf diese Weise eine fehlerfreie Referenzierung des Meßsignals zu realisieren, werden inerte phosphoreszierende Referenzstandards benötigt, deren Phosphoreszenzeigenschaften von den Probenparametern nicht beeinflußt werden. Dafür kommen zum Beispiel phosphoreszierende anorganische Feststoffe wie zum Beispiel mit Cr(III) dotierte Mischoxide in Frage, die in gepulverter Form der Probe zugemischt werden können. Besser geeignet für diesen Zweck sind jedoch Phosphoreszenzfarbstoffe, die in organische und anorganische Trägermaterialien eingebaut werden und in Form von Mikro- oder Nanopartikeln der Probe zugemischt werden. Dabei kann es sich um lumineszierende Polypyridylkomplexe mit Ru(II), Os(II), Re(I), Pt(II) oder Ir(III) als Zentralatom, oder phosphoreszierende Porphyrine des Pt(II) oder Pd(II) oder Komplexe der Seltenerdenmetalle wie Tb(III) oder Eu(III) handeln. Eine weitere weitverbreitete Methode in der Bioanalytik um lumineszenzmarkierte Moleküle sehr empfindlich und ohne Störung durch die Eigenfluoreszenz der Probe nachzuweisen, besteht darin, Lumineszenzfarbstoffe zum Markieren der Biomoleküle zu verwenden, die sich durch lange Abklingzeiten (im Bereich von 100 ns bis einige Millisekunden) auszeichnen. Solche Phosphoreszenzsignale lassen sich durch Zeit- oder phasenaufgelöste Messmethoden leicht vom Untergrundsignal abtrennen. Es können wiederum die oben beschriebenen Phosphoreszenzfarbstoffe zum Einsatz kommen.The measurement of luminescence is a widely used method in bio and Chemoanalytics. It owes its attractiveness to its high sensitivity and versatility and the elimination of radiation exposure by radioactive labeling reagents. In In practice, fluorescent markers are usually used, which are characterized by a high Marking quantum yield used. Mostly the correlation between Fluorescence intensity signal and the concentration of the fluorescence marker in the sample evaluated as a measurement parameter. A disadvantage of such measurements is that the quantitative evaluation of fluorescence intensity disrupted by a variety of factors becomes. On the one hand, there may be fluctuations in the intensity in the optical system (Light source, detector and optical path), but also about intrinsic optical properties act on the sample (staining, turbidity and background fluorescence) act. Around To eliminate interference, you need efficient methods for referencing the Fluorescence signals. A recently patented method for referencing Fluorescence signals are based on the fact that a phosphorescent sample Reference standard is added, the similar (in the best case identical) spectral Properties as the actual fluorescent marker has (DE 198 29 657 A1). In Combination with a frequency modulation or time-resolved luminescence measurement In this way, the intensity information is converted into a phase signal or a converted time-dependent parameters. To be a flawless in this way Realizing referencing of the measurement signal are inert phosphorescent Reference standards are required, the phosphor properties of which Sample parameters are not affected. For example, come for that Phosphorescent inorganic solids such as mixed oxides doped with Cr (III) in question, which can be added to the sample in powdered form. More suitable for however, this purpose are phosphorescent dyes that are used in organic and inorganic Carrier materials are installed and in the form of micro or nanoparticles of the sample be added. These can be luminescent polypyridyl complexes with Ru (II), Os (II), Re (I), Pt (II) or Ir (III) as the central atom, or phosphorescent porphyrins of the Pt (II) or Pd (II) or complexes of rare earth metals such as Tb (III) or Eu (III) act. Another widely used method in bioanalytics around luminescence-labeled molecules very sensitive and without any interference due to the inherent fluorescence of the sample, is to use luminescent dyes to label the biomolecules that long decay times (in the range of 100 ns to a few milliseconds) award. Such phosphorescence signals can be resolved by time or phase Easily separate measurement methods from the background signal. Again, it can be the above described phosphorescent dyes are used.
Bei allen analytischen Anwendungen bei denen phosphoreszierende Moleküle eingesetzt werden, besteht das Problem, daß die Phosphoreszenzeigenschaften nicht nur vom nachzuweisenden Analyten, sondern von einer Vielzahl an weiteren Parametern des Mediums beeinflußt wird. Dies ist auf die lange Verweilzeit dieser Moleküle im angeregten Zustand zurückzuführen. Um die Vorteile von analytischen Phosphoreszenztests (extrem hohe Sensitivität) nutzen zu können, ist es notwendig, daß die photophysikalischen Eigenschaften des Phosphoreszenzfarbstoffs nicht oder nur vernachlässigbar von der Zusammensetzung des Mediums abhängen. Werden solche Farbstoffe der Probe im gelösten Zustand zugegeben, sind diese Voraussetzungen nicht gegeben. Insbesondere Phosphoreszenzlöschung durch molekularen Sauerstoff sowie oxydative und reduktive Löscher bewirken Fehlinterpretationen des Meßsignals.For all analytical applications where phosphorescent molecules are used there is the problem that the phosphor properties not only from analytes to be detected, but from a variety of other parameters of the Medium is affected. This is due to the long residence time of these molecules in the excited state Condition attributed. To take advantage of analytical phosphorescence tests (extreme high sensitivity), it is necessary that the photophysical Properties of the phosphorescent dye not or only negligibly from the Depending on the composition of the medium. Are such dyes in the sample dissolved state, these requirements are not met. In particular Phosphorescence quenching by molecular oxygen as well as oxidative and reductive Erasers cause misinterpretations of the measurement signal.
In einer kürzlich beschriebenen Erfindung werden phosphoreszierende Farbstoffe in hydrophobe Polymere eingebaut um sie vor dem störenden Einfluß des Mediums abzuschirmen (DE 199 33 104.9). Es wurden auf diese Weise Partikel mit Durchmessern im Bereich zwischen 50 Nanometern und wenigen Mikrometern hergestellt. Optimale Einbettungsmaterialien für die Phosphoreszenzfarbstoffe waren Polyacrylnitril oder Sol-Gele. Diese Materialien zeichnen sich insbesondere durch ihre geringe Permeabilität für Gase wie Sauerstoff und ionische Verbindungen aus. So war es möglich, den Löscheinfluß von molekularem Sauerstoff im Vergleich zu den gelösten Farbstoffen um einen Faktor von ca. 100 zu reduzieren. Partikel mit solch kleinen Dimensionen haben weite Verbreitung in der Bioanalytik gefunden. Der Grund dafür liegt hauptsächlich in der Signalverstärkung wenn statt einzelner kovalent gebundener Fluoreszenzmolküle ein lumineszierender Partikel mit einer Vielzahl an eingebauten Farbstoffmolekülen ein einzelnes Bindungsereignis anzeigt. Auf diese Weise läßt sich ein Verstärkungsfaktor des Lumineszenzintensitätssignals bis zu einem Faktor von 1000 zu erzielen.In a recently described invention, phosphorescent dyes are incorporated into Hydrophobic polymers built in to avoid the disturbing influence of the medium shield (DE 199 33 104.9). In this way, particles with diameters became manufactured in the range between 50 nanometers and a few micrometers. Optimal Embedding materials for the phosphorescent dyes were polyacrylonitrile or sol-gels. These materials are particularly characterized by their low permeability to gases such as Oxygen and ionic compounds. So it was possible to suppress the extinguishing influence of molecular oxygen compared to the dissolved dyes by a factor of approx. Reduce 100. Particles with such small dimensions are widely used in the Bioanalytics found. The reason for this is mainly in the signal amplification when instead single covalently bound fluorescence molecule a luminescent particle with a Numerous built-in dye molecules indicate a single binding event. On in this way, an amplification factor of the luminescence intensity signal can be up to to achieve a factor of 1000.
Ein Problem der Anwendung von solchen Partikel zum Nachweis der Bindung von Biomolekülen besteht darin, daß sich bestimmte Eigenschaften des Biomoleküls nach Konjugation mit einem Partikel mit Dimensionen von 100 nm bis zu einigen Mikrometern deutlich verändern können. Dabei handelt es sich um solch wichtige Eigenschaften wie Mobilität (Diffusion), Rotation oder die Affinität zu entsprechenden Bindungspartnern. Desweiteren werden für Bindungsassays auf der Basis von strahlungslosen Energietransfer, bei denen ein ET-Partner in einem Partikel eingebaut vorliegt, sehr kleine Aggregate benötigt, da ansonsten die notwendige räumliche Nähe zwischen Donor und Akzeptor (im Bereich der sogenannten Försterdistanz) nicht gewährleistet ist. Auch für Lumineszenzassays zum Nachweis des Bindens von Proteinen auf der Basis von Lumineszenzdepolarisation werden sehr kleine (optimal im Größenbereich von Proteinen) Phosphoreszenzmarker benötigt.A problem of using such particles to detect the binding of Biomolecules consist of certain properties of the biomolecule Conjugation with a particle with dimensions from 100 nm up to a few micrometers can change significantly. These are such important properties as Mobility (diffusion), rotation or the affinity for corresponding binding partners. Furthermore, for binding assays based on radiation-free energy transfer, where an ET partner is installed in a particle, very small aggregates required, otherwise the necessary spatial proximity between donor and acceptor (im Range of the so-called ranger distance) is not guaranteed. Also for Luminescence assays for the detection of the binding of proteins based on Luminescence depolarization becomes very small (optimal in the size range of proteins) Phosphorescence marker needed.
Diese Erfindung beschreibt eine neue Art von Phosphoreszenzmarkern, die sich durch extrem kleine Dimensionen (von wenigen Nanometern) und hohe Phosphoreszenzhelligkeit auszeichnen. Dazu werden Phosphoreszenzfarbstoffe in Polyelektrolytmoleküle eingebaut. This invention describes a new type of phosphorescent markers that stand out extremely small dimensions (of a few nanometers) and high phosphorescence brightness award. For this purpose, phosphorescent dyes are built into polyelectrolyte molecules.
Aufgrund der elektrostatischen Abstoßung zwischen den einzelnen gleichartig geladenen Polyelektrolytmolekülen erreicht man, daß die Größe der Farbstoff-Polyelektrolytaggregate im Bereich der Molekülgrößen des Polyelektrolyten liegen.Due to the electrostatic repulsion between the individual charged in the same way Polyelectrolyte molecules achieve that the size of the dye-polyelectrolyte aggregates are in the range of the molecular sizes of the polyelectrolyte.
Auf diese Weise lassen sich extrem kleine phosphoreszierende Aggregate mit molaren Massen zwischen 10.000 g/mol bis zu mehreren Millionen g/mol auf einfache Weise gezielt herstellen. Es werden dazu nur Polyelektrolyte mit definierten Molekülmassen benötigt. Trotz der geringen Abmessungen wird der angeregte Zustand der eingebauten Phosphoreszenzfarbstoffe noch hinreichend effizient abgeschirmt. Eine Verringerung der Löschung durch molekularen Sauerstoff um einen Faktor von 20 ist auf diese Weise noch zu erzielen. Die auf diese Weise herstellbaren Aggregate sind wesentlich kleiner als Polymerpartikel, die mit Emulsionspolymerisation oder Fällung hergestellt werden können. Durch gezielte Verwendung von Polyelektrolyten mit reaktiven Gruppen (Carboxy, Amino, Sulfo oder Epoxy) lassen sich diverse Biomoleküle wie Proteine, Viren, DNA- und RNA- Fragmente sowie Oligonukleotide an die phosphoreszierenden Polyelektrolytaggregate koppeln.In this way, extremely small phosphorescent aggregates can be used with molar ones Masses between 10,000 g / mol up to several million g / mol targeted in a simple manner produce. Only polyelectrolytes with defined molecular masses are required. Despite The small dimensions are the excited state of the installed Phosphorescent dyes are still shielded sufficiently efficiently. A decrease in Extinguishing by molecular oxygen by a factor of 20 is still too achieve. The aggregates that can be produced in this way are much smaller than Polymer particles that can be produced by emulsion polymerization or precipitation. Through the targeted use of polyelectrolytes with reactive groups (carboxy, amino, Sulfo or epoxy) various biomolecules such as proteins, viruses, DNA and RNA Fragments and oligonucleotides on the phosphorescent polyelectrolyte units couple.
Die hier beschriebenen phosphoreszierenden Polyelektrolytaggregate lassen sich sehr einfach und reproduzierbar herstellen.The phosphorescent polyelectrolyte aggregates described here can be very easy and reproducible production.
Aufgrund ihrer sehr geringen Größe können sie für viele Anwendungen eingesetzt werden. Sie eignen sich zum Beispiel für homogene oder heterogene Immunoassays auf der Basis von strahlungslosen Energietransfer, da ihre Abmessungen im Bereich des Försterradius liegen. Weitere Einsatzfelder ergeben sich als phosphoreszierende Referenzstandards, die zu Fluoreszenzassays oder Sensoren zugegeben werden und dann mit Hilfe von Zeit- oder phasenaufgelösten Meßtechniken die referenzierte Messung der Fluoreszenzintensität des Assays ermöglichen.Due to their very small size, they can be used for many applications. They are suitable, for example, for homogeneous or heterogeneous immunoassays based on of radiationless energy transfer, as their dimensions are in the range of the forester radius lie. Further fields of application arise as phosphorescent reference standards that added to fluorescence assays or sensors and then using time or phase-resolved measurement techniques the referenced measurement of the fluorescence intensity of the Enable assays.
Die in der Erfindung beschriebenen phosphoreszierenden Polyelektrolytaggregate sind in Abb. 1 dargestellt. Die Farbstoffmoleküle werden von dem polymeren Rückgrat des Polyelektrolyten umhüllt und damit vom umgebenden Medium abgeschirmt. Die Bindung des Farbstoffs an den Polyelektrolyten erfolgt vorzugsweise durch zwei verschiedene Wechselwirkungen.The phosphorescent polyelectrolyte aggregates described in the invention are shown in Fig. 1. The dye molecules are enveloped by the polymer backbone of the polyelectrolyte and thus shielded from the surrounding medium. The dye is preferably bound to the polyelectrolyte by two different interactions.
- 1. elektrostatische Wechselwirkungen, wenn der Farbstoff entgegengesetzte Ladungen als der umhüllende Polyelektrolyt trägt.1. electrostatic interactions when the dye is opposite charges the enveloping polyelectrolyte carries.
- 2. Van-der Waals Wechselwirkungen zwischen hydrophoben Bereichen des eingebauten Farbstoffs und des polymeren Rückgrats des umhüllenden Polyelektrolyten.2. Van-der Waals interactions between hydrophobic areas of the built-in Dye and the polymeric backbone of the enveloping polyelectrolyte.
Wenn beide Arten von Wechselwirkungen zwischen Farbstoff und Polyelektrolyt stark genug ausgeprägt sind, erfolgt keine Dissoziation des phosphoreszierenden Polyelektrolytaggregates.If both types of dye-polyelectrolyte interactions are strong enough are pronounced, there is no dissociation of the phosphorescent Polyelectrolyte unit.
Auch in Anwesenheit von hohen Konzentrationen an Fremdelektrolyten (z. B. Natriumchlorid oder Pufferelektrolyte) sind die Aggregate noch stabil. Verdünnungsserien, die bis zu einer Konzentration von 100 pM durchgeführt wurden, bewirken keine signifikante Veränderung der Phosphoreszenzeigenschaften der eingebauten Phosphoreszenzfarbstoffe. Das beweist die Stabilität der Aggregate.Even in the presence of high concentrations of foreign electrolytes (e.g. sodium chloride or buffer electrolytes) the aggregates are still stable. Dilution series up to one Concentrations of 100 pM were carried out, cause no significant change the phosphorescence properties of the built-in phosphorescent dyes. That proves the stability of the aggregates.
Vorzugsweise werden Phosphoreszenzfarbstoffe eingebaut, die besonders starke Wechselwirkungen mit dem umhüllenden Polyelektrolytmolekül eingehen. Dabei handelt es sich vorzugsweise um Farbstoffe, die die entgegengesetzte Ladung zum Polyelektrolyten tragen, wenn möglich 2-fach oder 3-fach geladen sind, und zusätzlich hydrophobe Bereiche aufweisen. Werden die Ladungen dieser Farbstoffe mit lipophilen Gegenionen abgesättigt (wie Perchlorat oder Hexafluorophosphat) sollten sie völlig wasserunlöslich sein. Diese Eigenschaften treffen insbesondere auf phosphoreszierende Metall-Liganden Komplexe zu, die lipophile Liganden besitzen. Dabei handelt es sich vorzugsweise um Metall-Liganden- Komplexe mit Ruthenium(II), Osmium(II), Rhenium(I), Iridium(III) oder Pt(II) als Zentralatom. Bei den Liganden handelt es sich vorzugsweise um Polypyridylverbindungen mit hydrophoben Seitengruppen.Phosphorescent dyes, which are particularly strong, are preferably incorporated Interact with the enveloping polyelectrolyte molecule. This is what it is about are preferably dyes that have the opposite charge to the polyelectrolyte wear double or triple charge if possible and additional hydrophobic areas exhibit. The charges of these dyes are saturated with lipophilic counterions (like perchlorate or hexafluorophosphate) they should be completely water-insoluble. This Properties apply in particular to phosphorescent metal-ligand complexes, which have lipophilic ligands. These are preferably metal ligand Complexes with ruthenium (II), osmium (II), rhenium (I), iridium (III) or Pt (II) as the central atom. The ligands are preferably polypyridyl compounds with hydrophobic side groups.
Die Moleküle des umhüllenden Polyelektrolyten sollten neben den geladenen Gruppen auch deutlich hydrophobe Bereiche aufweisen, da diese die abschirmende Wirkung der eingebauten Farbstoffe hauptsächlich bewirken. Bei den Polyelektrolyten kann es sich zum einen um Polymere der Gruppe der Homopolymere handeln, bei denen der Monomerbaustein Ladungen trägt und hydrophobe Bereiche aufweist. Ein besonders gut geeigneter Polyelektrolyt dieser Gruppe, der diese Eigenschaften ausweist ist die Polystyrensulfonsäure. Die phenolischen Styrengruppen bewirken starke Wechselwirkungen mit vielen Polypyridylliganden.The molecules of the enveloping polyelectrolyte should also be next to the charged groups clearly have hydrophobic areas, since these have the shielding effect of mainly cause built-in dyes. In the case of the polyelectrolytes, one are polymers of the group of homopolymers in which the Monomer block carries charges and has hydrophobic areas. A particularly good one suitable polyelectrolyte of this group, which shows these properties is the Polystyrene sulfonic acid. The phenolic styrene groups cause strong interactions with many polypyridyl ligands.
Es können aber Heteropolymere verwendet werden bei denen die geladenen Gruppen und die hydrophoben Bereiche von unterschiedlichen Monomerbausteinen herrühren.However, heteropolymers can be used in which the charged groups and the hydrophobic areas come from different monomer units.
Die Effizienz der Abschirmung der Farbstoffe von den Bestandteilen des Mediums hängt aber nicht nur von der Struktur des Polyelektrolyten, sondern auch stark von dessen Molekülgröße ab. Je höher das Molekulargewicht des Polyektrolyten ist, desto größere Aggregate bildet es mit dem Farbstoff, womit die abschirmende Wirkung verbessert wird. Da auf Grund hinreichend starker physikalischer Wechselwirkungen auf eine kovalente Verknüpfung des Phosphoreszenzfarbstoffes an das abschirmende Makromolekül verzichtet werden kann, ist die Herstellung dieser Aggregate sehr einfach. Es brauchen nur zwei Lösungen, von denen eine den Polyelektrolyten (wässriges System) und die andere den Farbstoff (entweder wässrige Lösung oder mit Wasser mischbare Lösung) gemischt werden. Auf diese Weise wird der Farbstoff vollständig in den Polyelektrolyten eingebaut. Damit ist es möglich die Farbstoffkonzentration definiert einzustellen. Es entstehen tief gefärbte vollständig klare Lösungen, die intensiv phosphoreszieren.The efficiency of shielding the dyes depends on the components of the medium but not only of the structure of the polyelectrolyte, but also strongly of its Molecular size. The higher the molecular weight of the polyelectrolyte, the larger It forms aggregates with the dye, which improves the shielding effect. Because of sufficiently strong physical interactions on a covalent Linking of the phosphorescent dye to the shielding macromolecule is dispensed with can be made, the production of these units is very simple. It only takes two Solutions, one of which is the polyelectrolyte (aqueous system) and the other of which Dye (either aqueous solution or water-miscible solution). In this way, the dye is completely incorporated into the polyelectrolyte. So that is it is possible to set the dye concentration in a defined manner. There are deeply colored ones completely clear solutions that intensely phosphoresce.
Wird das Mengenverhältnis Farbstoff zu Polyelektrolyt zu hoch gewählt - was im Interesse hoher Lumineszenzsignale wünschenswert ist - und trägt der Farbstoff mehrere Ladungen können während der Herstellung große Aggregate ausfallen. Dies ist darauf zurückzuführen, daß der Farbstoff als Vernetzer von mehreren Polyelektrolytmolekülen fungieren kann. Der Anteil an Farbstoff in den Aggregaten sollte deswegen 10% (w/w) nicht übersteigen.If the quantitative ratio of dye to polyelectrolyte is chosen too high - which is in the interest high luminescence signals is desirable - and the dye carries multiple charges large aggregates can fail during manufacture. This is on it attributed that the dye as a crosslinker of several polyelectrolyte molecules can act. The proportion of dye in the aggregates should therefore not be 10% (w / w) exceed.
Im folgenden werden einige Ausführungsbeispiele für die Herstellung von phosphoreszierenden Polyelektrolytaggregaten gegeben.The following are some embodiments for the production of given phosphorescent polyelectrolyte units.
200 ml einer 2% wässrigen Polystyrensulfonsäurelösung (MW. 150.000 Natriumsalz) werden in einem Becherglas vorgelegt. Diese Lösung wird aus einer 20% Lösung (Aldrich) durch Verdünnung hergestellt. Dann werden 100 ml eines Ethanol/Wasser Gemisches (70/30) in dem 200 mg an Ruthenium(II)-tris-4,7-diphenyl-1,10 phenanthrolin dichlorid gelöst sind unter intensiven Rühren zugetropft. Es entsteht eine tieforange gefärbte klare Lösung. Der Ethanol wird anschließend durch Erwärmen des Lösungsgemisches in einem Wasserbad von 80°C entfernt.200 ml of a 2% aqueous polystyrene sulfonic acid solution (MW. 150,000 sodium salt) are presented in a beaker. This solution is made from a 20% solution (Aldrich) made by dilution. Then 100 ml of an ethanol / water mixture (70/30) in which 200 mg of ruthenium (II) tris-4,7-diphenyl-1,10 phenanthroline dichloride dissolved are added dropwise with vigorous stirring. A deep orange colored clear solution is created. The ethanol is then mixed in one by heating the solution mixture Water bath removed from 80 ° C.
Die Polyelektrolytaggregate werden anschließend durch Gefriertrocknung isoliert.The polyelectrolyte units are then isolated by freeze-drying.
Sie werden entweder im getrockneten Zustand gelagert oder in einem wässrigen gepufferten System verwendet.They are either stored in the dry state or in an aqueous buffered one System used.
Die Quantenausbeute und die Lumineszenzlebenszeit des freien Farbstoffs in Lösung beträgt (unter luftgesättigten Bedingungen) ca. 0.05 und 700 ns. Die phosphoreszierenden Polyelektrolytaggregate sind abgeschirmt und emittieren deswegen wesentlich intensiver mit einer Quantenausbeute von ca. 0.35 und einer Abklingzeit von 4.8 µsek. In jedem Polyelektrolytmolekül sind ca. 7-8 Farbstoffmoleküle eingebaut. The quantum yield and the luminescence lifetime of the free dye in solution is approximately 0.05 and 700 ns (under air-saturated conditions). The phosphorescent Polyelectrolyte units are shielded and therefore emit much more intensely a quantum yield of approx. 0.35 and a decay time of 4.8 µsec. In each Polyelectrolyte molecule contains approx. 7-8 dye molecules.
Die Anwesenheit von anionisch geladenen reduktiven Lumineszenzlöschern wie Ascorbat, Sulfit oder Oxalat, die den freien Phosphoreszenzfarbstoff vollständig löschen hat keinen Einfluß auf das Lumineszenzverhalten der Aggregate.The presence of anionically charged reductive luminescence quencher like ascorbate, Sulfite or oxalate, which completely extinguishes the free phosphorescent dye, has none Influence on the luminescence behavior of the aggregates.
200 ml einer 2% wässrigen Polystyrensulfonsäure-co-maleinsäurelösung (MW. 20.000 Natriumsalz) werden in einem Becherglas vorgelegt. Diese Lösung wird durch Lösen des festen Natriumsalzes dieses Polyelektrolyten hergestellt (Aldrich) hergestellt. Dann werden 100 ml eines Ethanol/Wasser Gemisches (70/30) in dem 400 mg an Ruthenium(II)-tris-4,4'- diphenyl-2,2'-bipyridyldichlorid gelöst sind unter intensiven Rühren zugetropft. Es entsteht eine tieforange gefärbte klare Lösung. Der Ethanol wird anschließend durch Erwärmen des Lösungsgemisches in einem Wasserbad von 80°C entfernt. Dabei kann eine leichte Trübung der Lösung auftreten. Die ausgefallenen größeren Aggregate werden durch Zentrifugation abgetrennt und verworfen. Die entstandene Lösung ist wiederum klar. Die Polyelektrolytaggregate werden aus dieser Lösung anschließend durch Gefriertrocknung isoliert. Sie werden entweder im getrockneten Zustand gelagert oder in einem wässrigen gepufferten System verwendet. Durch die Verwendung des Copolymers sind bereits reaktive Carboxylgruppen vorhanden, die zum Ankoppeln von Biomolekülen verwendet werden können.200 ml of a 2% aqueous polystyrene sulfonic acid co-maleic acid solution (MW. 20,000 Sodium salt) are placed in a beaker. This solution is achieved by solving the solid sodium salt of this polyelectrolyte (Aldrich). Then be 100 ml of an ethanol / water mixture (70/30) in which 400 mg of ruthenium (II) -tris-4,4'- Diphenyl-2,2'-bipyridyl dichloride dissolved are added dropwise with vigorous stirring. It arises a deep orange colored clear solution. The ethanol is then by heating the Solution mixture removed in a water bath of 80 ° C. This can cause a slight cloudiness of the solution occur. The larger aggregates that have failed are centrifuged separated and discarded. The resulting solution is again clear. The Polyelectrolyte units are then freeze-dried from this solution isolated. They are either stored in the dry state or in an aqueous one buffered system used. By using the copolymer are already reactive Carboxyl groups present, which are used to couple biomolecules can.
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