DE10015547C2

DE10015547C2 - Method for the detection of molecules by means of impedance spectroscopy and device for carrying out these methods

Info

Publication number: DE10015547C2
Application number: DE2000115547
Authority: DE
Inventors: Claus Escher; Norbert Windhab; Jochen Muth
Original assignee: Aventis Research and Technologies GmbH and Co KG
Current assignee: Nanogen Inc
Priority date: 2000-03-30
Filing date: 2000-03-30
Publication date: 2002-02-14
Anticipated expiration: 2020-03-31
Also published as: EP1272851A1; WO2001075445A1; DE10015547A1

Abstract

Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Detektion von Zielstrukturen dadurch gekennzeichnet, daß ein dreidimensionaler, aus nicht leitfähigem Material bestehender, poröser Träger mit einer gegebenenfalls zu detektierende Moleküle enthaltenden Lösung versehen wird und anschließend die Beladung des Trägers mit diesen Molekülen durch elektrische Impedanzmessung bestimmt wird. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zur Detektion von Zielstrukturen mittels Impedanzmessung, bestehend aus einem schichtförmig aufgebauten Chip, der zumindest eine gegeneinander schaltbare Elektroden enthaltenden Lage und dem darauf und/oder darunter aufgebrachten, aus elektrisch nicht leitfähigem Material bestehenden, porösen Träger enthält.The invention describes a method for the detection of target structures, characterized in that a three-dimensional, porous carrier consisting of non-conductive material is provided with a solution which may contain molecules to be detected, and then the loading of the carrier with these molecules is determined by electrical impedance measurement. Another object of the invention is a device for the detection of target structures by means of impedance measurement, consisting of a layered chip which contains at least one layer containing electrodes which can be switched against one another and the porous carrier made of electrically non-conductive material and placed thereon and / or below.

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Detektion von Molekülen mittels Impedanzmessung und eine Vorrichtung zur Durchführung solcher Verfahren.The invention relates to a new method for the detection of molecules by means of Impedance measurement and a device for performing such methods.

Die Möglichkeit der Detektion einer oder mehrerer unterschiedlicher immobilisierter Molekülstrukturen ist ein essentieller Bestandteil vieler biochemischer Untersuchungen. Typischerweise werden die Molekülstrukturen aus Liganden gebildet, die durch spezifische Rezeptoren erkannt werden, wie Antikörper, Antigene, Enzyme, Enzyminhibitoren und -aktivatoren, Proteine, Nukleinsäuren, Hormone, Agonisten und Antagonisten für Zellmembranrezeptoren, Oligosaccharide, Lectine, Toxine, Pathogene, Bakterien, monoklonale Antikörper etc.. Die Erkennung der Präsens solcher Molekülstrukturen ist insbesondere in der Wirkstoffentwicklung der pharmazeutischen Industrie, der Therapieverfolgung bei medizinischer Behandlung, der medizinischen Diagnostik aber auch in den Agrarwissenschaften und der Forensik von Bedeutung.The possibility of detection of one or more different immobilized Molecular structures are an essential part of many biochemical Investigations. Typically, the molecular structures are made up of ligands formed that are recognized by specific receptors, such as antibodies, Antigens, enzymes, enzyme inhibitors and activators, proteins, nucleic acids, Hormones, agonists and antagonists for cell membrane receptors, oligosaccharides, Lectins, toxins, pathogens, bacteria, monoclonal antibodies etc. The detection the presence of such molecular structures is particularly in drug development the pharmaceutical industry, therapy tracking in medical Treatment, medical diagnostics but also in agricultural sciences and forensics matter.

Zum Zwecke der Detektion sind eine ganze Reihe von Verfahren entwickelt worden, wie Autoradiographie, Massenspektrometrie oder optische Auslesung z. B. mittels Fluoreszenzspektroskopie.A whole series of methods have been developed for the purpose of detection, such as autoradiography, mass spectrometry or optical reading z. B. means Fluorescence spectroscopy.

Die Nachteile dieser Verfahren sind vielfältig. Die meisten bedürfen einer radioaktiven oder fluoreszierenden Markierung der Moleküle, andere, wie die Massenspektrometrie sind apparativ aufwendig und schwierig zu miniaturisieren.The disadvantages of these methods are numerous. Most need one radioactive or fluorescent labeling of the molecules, others like that Mass spectrometry is complex in terms of equipment and difficult to miniaturize.

Aus diesem Grunde wird in zunehmendem Maße daran gearbeitet, elektrische oder elektrochemische Verfahren zur die Detektion von Molekülstrukturen zu nutzen. For this reason, work is increasingly being done on electrical or to use electrochemical methods for the detection of molecular structures.

Beispiele für solche Verfahren und Vorrichtungen sind z. B. offenbart in WO 88/09499, EP 0543550, US 5653939, WO 97/21094 und WO 97/34140. Bei den dort beschriebenen Verfahren werden die zu detektierenden Moleküle in Form einer dünnen Lage entweder direkt auf dem mit Elektroden bestückten Meßchip oder auf einer dafür vorgesehenen Schicht auf dem Chip immobilisiert. Bislang konnte noch keines dieser Verfahren in größerem Umfang demonstriert werden.Examples of such methods and devices are e.g. B. disclosed in WO 88/09499, EP 0543550, US 5653939, WO 97/21094 and WO 97/34140. In the methods described there, the molecules to be detected are in Form a thin layer either directly on the one equipped with electrodes Measuring chip or immobilized on a designated layer on the chip. So far, none of these methods has been demonstrated on a large scale become.

In US 4787963 und WO 96/01836 wird ein Verfahren vorgestellt, wie die Immobilisierung der Moleküle elektrisch gesteuert und beschleunigt werden kann.In US 4787963 and WO 96/01836 a method is presented, such as Immobilization of the molecules can be controlled and accelerated electrically.

Ein Nachteil der bislang vorgestellten elektrischen Detektionsverfahren ist, daß die Immobilisierung auf eine sehr dünne, in der Regel monomolekulare Schicht beschränkt ist, daraus resultiert eine relativ geringe räumliche Dichte der zur. Meßsignaländerung beitragenden immobilisierten Moleküle und Unempfindlichkeit der Messung bei hohem Hintergrundpegel.A disadvantage of the electrical detection methods presented so far is that Immobilization on a very thin, usually monomolecular layer is limited, this results in a relatively low spatial density of the. Measurement signal change contributing immobilized molecules and insensitivity measurement at a high background level.

Hier konnte bislang nur durch einen Verstärkungseffekt aufgrund einer katalytisch wirksamen Markierung wie in WO 97/34140 beschrieben ein gutes Signal/Rausch Verhältnis erreicht werden.So far, this has only been possible through a reinforcing effect due to a catalytic effective marking as described in WO 97/34140 a good signal / noise Ratio can be achieved.

Weitere Nachteile der bislang vorgestellten Verfahren sind mit der Anbindung von Fängermolekülen auf eine bereits auf einem mit Elektroden versehenen Träger aufgebrachte Anbindungsschicht (diese Schicht kann auch die Elektrode selbst sein) verknüpft. So erfordert die Anbindung aufgrund der vorgegebenen, sehr kleinen Elektrodenpositionen eine hohe absolute Genauigkeit bei der Dispensierpositionierung.Further disadvantages of the methods presented so far are the connection of Capture molecules on a carrier already provided with electrodes applied connection layer (this layer can also be the electrode itself) connected. So the connection requires due to the given, very small Electrode positions a high absolute accuracy in the Dispensierpositionierung.

Aufgabe der Erfindung ist es ein Verfahren zur elektrischen Detektion von Molekülen zur Verfügung zu stellen, das gegenüber dem Stand der Technik ein verbessertes Signal/Rausch-Verhältnis und damit eine erhöhte Effizienz besitzt.The object of the invention is a method for the electrical detection of molecules to make available an improved compared to the prior art Signal / noise ratio and thus has increased efficiency.

Die Aufgabe wird durch die im Patentanspruch 1 angegebenen Merkmale gelöst.The task is performed by the Features specified in claim 1 solved.

Die elektrische Auslesung erfolgt durch gegeneinander geschaltete Elektroden, zwischen denen eine Wechselspannung unterschiedlicher Frequenz angelegt wird. Die Frequenz der Wechselspannung sowie die Stärke der angelegten Wechselspannung sind frei wählbar. Der typische Frequenzbereich reicht dabei von 0,1 Hz bis 20 MHz, bevorzugt ist ein Bereich von 100 Hz bis 5 MHz. Der typische Spannungsbereich reicht von 0,1 mV bis, zu 10 V, bevorzugt ist hier 1 bis 100 mV. Ebenso frei wählbar ist die geometrische Anordnung und Größe der Elektroden, durch die auch die Wahl der vorteilhaftesten Frequenz und Spannung gesteuert werden kann. Vorteilhaft ist ein schichtförmiger Aufbau aus zwei Lagen kreisförmiger Elektroden zwischen die der beladene Träger eingeführt wird. Die Elektrodenlagen werden so justiert das sich ein weitgehend homogenes Feld zwischen den einzelnen gegenüberliegenden Elektroden ausbilden kann. Die gegeneinander schaltbaren Elektroden können aber auch koplanar in einer Ebene liegen. Sie können z. B. streifenförmig, kreisförmig oder auch konzentrisch angeordnet sein. Insbesondere regelmäßig-matrixförmige Anordnungen der einzelnen Elektroden haben sich bewährt. Je nach Problemstellung kann allerdings eine speziell angepaßte geometrische Anordnung der Elektroden vorgenommen werden. Bevorzugt sollte der Durchmesser oder die in Richtung der benachbarten bzw. als Gegenelektrode verwendeten Elektrode zeigende Kantenlänge L der Elektroden ungefähr dem Abstand zwischen den Elektroden entsprechen. Die optimale Dicke des Trägers beträgt dann 2L bis 4L. Eine solche Geometrie gewährleistet eine sehr gute Durchdringung des Trägervolumens mit dem angelegten Wechselfeld.The electrical reading is carried out by electrodes connected to each other, between which an alternating voltage of different frequency is applied. The frequency of the AC voltage and the strength of the applied AC voltage can be freely selected. The typical frequency range ranges from 0.1 Hz to 20 MHz, a range from 100 Hz to 5 MHz is preferred. The typical one Voltage range extends from 0.1 mV up to 10 V, preferred is 1 to 100 mV. The geometric arrangement and size of the electrodes can also be freely selected, controlled by which also the choice of the most advantageous frequency and voltage can be. A layered structure consisting of two layers of circular shape is advantageous Electrodes between which the loaded carrier is inserted. The electrode layers are adjusted so that there is a largely homogeneous field between the individual can form opposite electrodes. The switchable against each other Electrodes can also be coplanar in one plane. You can e.g. B. be arranged in strips, circles or concentrically. In particular there have been regular matrix arrangements of the individual electrodes proven. Depending on the problem, however, a specially adapted one Geometrical arrangement of the electrodes can be made. Preferably the Diameter or in the direction of the neighboring or as a counter electrode used edge length L of the electrodes used approximately that Distance between the electrodes. The optimal thickness of the carrier is then 2L to 4L. Such a geometry ensures a very good one Penetration of the carrier volume with the alternating field created.

Durch die Verwendung eines Trägers in Verbindung mit der Verwendung der Impedanzspektroskopie werden vielfältige, bisher ungelöste Probleme beseitigt. Eine direkte Anbindung der Fänger- bzw. Zielstrukturen an den Elektroden ist nicht mehr nötig. Die einzelnen porösen Träger besitzen eine große Oberfläche, so daß eine hohe Anreicherung von zu detektierenden Molekülen im Träger erreicht wird. Zusätzlich gewährleistet der Träger eine optimale Raumausnutzung über und/oder zwischen den Elektroden. Dadurch steigt die Sensitivität der Messung und das Signal/Rausch-Verhältnis wird erhöht. Mit Steigerung der Sensitivität der Messung wird auch eine quantitative Bestimmung der Trägerbeladung mit den zu detektierenden Molekülen und Molekülkomplexen möglich, was impedometrische Meßverfahren aus dem Stand der Technik nicht erlauben. Zusätzlich ermöglicht der Einsatz eines Trägers die räumliche Trennung des Beladungsprozesses vom Messvorgang. Wasch- und Trocknungsschritte können ebenfalls einfach außerhalb der Messvorrichtung durchgeführt werden. Somit werden herkömmliche Medien wie Gele und Membranen direkt für die Impedanzmessungen zugänglich. Es können folglich auch Reaktionsmedien verwendet werden, die in direktem Kontakt mit den Elektroden ungewünschte Wechselwirkungen eingehen würden.By using a carrier in conjunction with the use of the Impedance spectroscopy eliminates a variety of previously unsolved problems. A direct connection of the catcher or target structures to the electrodes is no longer possible necessary. The individual porous supports have a large surface, so that a high concentration of molecules to be detected is achieved in the carrier. In addition, the carrier ensures optimal space utilization over and / or between the electrodes. This increases the sensitivity of the measurement and that Signal / noise ratio is increased. With increasing the sensitivity of the measurement is also a quantitative determination of the carrier loading with the Detecting molecules and molecular complexes possible, which is impedometric Do not allow measuring methods from the prior art. In addition, the Use of a carrier the spatial separation of the loading process from the Measurement. Washing and drying steps can also be done easily outside of the measuring device. Thus, conventional media like Gels and membranes directly accessible for impedance measurements. It can consequently reaction media are used which are in direct contact with the Electrodes would enter undesired interactions.

Als Träger kommen alle dreidimensionalen aus elektrisch nicht leitfähigen Materialien bestehenden porösen Stoffe in Frage. Die Permeabilität muß die Beladung des Trägers mit Fängermolekülen oder direkt mit den zu detektierenden Molekülen oder mit Fänger-/Zielstruktur-Komplexen erlauben. Die Beladung kann ebenfalls durch eine Vorabbestückung des Trägers mit Fängermolekülen erfolgen, wobei dann die anschließende Zugänglichkeit der zu detektierenden Moleküle oder Molekülkomplexen zu den trägerfixierten Fängermolekülen gewährleistet sein muß. Bevorzugt liegen die Porengrößen des Trägers im Bereich zwischen 50 nm und 500 nm. Über die Porengröße können der Beladungsgrad und die Homogenität der Beladung eingestellt werden. Der Träger muß darüber hinaus die Fängermoleküle fixieren können. Dies kann z. B. über kovalente Bindungen aber auch über zwischenmolekulare Wechselwirkungen, wie der Absorption und Adsorption, erfolgen. Bevorzugt ist eine Ausführung, in der die Fängermoleküle z. B. durch Temperierung oder UV-Behandlung der Membran immobilisiert werden und die zu detektierenden Moleküle oder Molekülkomplexe danach spezifisch an die passenden Fängermoleküle gebunden werden.All three-dimensional carriers come from electrically non-conductive Materials existing porous substances in question. The permeability must Loading of the carrier with capture molecules or directly with those to be detected Allow molecules or with capture / target complexes. The load can likewise by pre-loading the carrier with capture molecules, then the subsequent accessibility of the molecules to be detected or Molecular complexes to the carrier-fixed capture molecules must be guaranteed. The pore sizes of the support are preferably in the range between 50 nm and 500 nm. The degree of loading and the homogeneity of the Load can be set. The carrier must also have the capture molecules can fix. This can e.g. B. via covalent bonds but also intermolecular interactions, such as absorption and adsorption, respectively. An embodiment is preferred in which the capture molecules e.g. B. by Tempering or UV treatment of the membrane can be immobilized and that too Detecting molecules or molecular complexes then specifically to the appropriate Capture molecules are bound.

Als Trägermaterialien kommen z. B. Polymere, Fasern, Membranen, Gele oder chromatographische Trennmaterialien in Frage. So können z. B. Biopolymere, wie Cellulose, Dextran oder Agarose, synthetische Polymere, wie Polyamide, Methacrylate Polyvinylbenzol oder Polystyrol, anorganische Polymere, wie unsubstituierte oder alkylierte Kieselsäure, Membranen, wie Polyvinylidenfluorid (PVDF)-, Polypropylen-, Nylon-, Nitrocellulose- oder Celluloseacetatmembranen, Gele, wie Agarose- oder Polyacrylamidgele als Träger eingesetzt werden. As support materials such. B. polymers, fibers, membranes, gels or chromatographic separation materials in question. So z. B. biopolymers, such as Cellulose, dextran or agarose, synthetic polymers such as polyamides, Methacrylates polyvinylbenzene or polystyrene, inorganic polymers such as unsubstituted or alkylated silica, membranes such as polyvinylidene fluoride (PVDF), polypropylene, nylon, nitrocellulose or cellulose acetate membranes, Gels such as agarose or polyacrylamide gels are used as carriers.

Gegebenenfalls können die Trägermaterialien durch entsprechende Substitutionen funktionalisiert sein, um eine Anbindung von Molekülen zu ermöglichen oder zu unterstützen.If necessary, the carrier materials can be replaced by appropriate substitutions be functionalized to enable or to connect molecules support.

Die Beladung des Trägers kann auch direkt mit den zu detektierenden Molekülen oder Molekülkomplexen erfolgen. Dazu kann auf herkömmliche chromatographische oder elektrophoretische Techniken eventuell in Verbindung mit Blotverfahren zurückgegriffen werden.The carrier can also be loaded directly with the molecules to be detected or molecular complexes. This can be done using conventional chromatographic or electrophoretic techniques possibly in connection with blot procedures be resorted to.

So kann z. B. die Beladung eines Polyacrylamidgelträgers unter gleichzeitiger Auftrennung einer Proteine enthaltenden Lösung aus 0,1% SDS in Tris-HCl/Tris- Glycin-Puffersystemen mittels herkömmlicher Gelelektrophorese erfolgen. Die Auftrennung erfolgt dabei anhand der Größe der denaturierten Peptidketten. Ebenso ist die Verwendung von 2D-Elektrophoresegelen als Träger möglich. Die Beladung und der erste Trennungschritt erfolgen üblicherweise durch isoelektrische Fokussierung unter nicht denaturierenden Bedingungen anhand eines immobilisierten pH-Gradienten zwischen pH 3 und pH 10. Als zweiter Trennungsschritt kann dann eine SDS-Polyacralamid-Gelelektrophorese angeschlossen werden.So z. B. the loading of a polyacrylamide gel carrier with simultaneous Separation of a protein-containing solution from 0.1% SDS in Tris-HCl / Tris- Glycine buffer systems are carried out using conventional gel electrophoresis. The The separation is based on the size of the denatured peptide chains. As well it is possible to use 2D electrophoresis gels as carriers. The load and the first separation step is usually done by isoelectric Focusing under non-denaturing conditions using a immobilized pH gradients between pH 3 and pH 10. Second Separation step can then be SDS-polyacralamide gel electrophoresis be connected.

Analog kann auch die Beladung von Trägern mit Nukleinsäuren erfolgen. So können zum Beispiel DNA-Fragmente auf ein Agarosegel (in der Regel 1-3%ig) elektrophoretisch aufgebracht und getrennt werden. Als Puffer werden z. B. Tris- Acetat- oder Tris-Borat-Puffer eingesetzt.The loading of carriers with nucleic acids can also be carried out analogously. So can for example DNA fragments on an agarose gel (usually 1-3%) be applied electrophoretically and separated. As a buffer z. B. Tris Acetate or tris borate buffer used.

Ebenso kann über einen elektrophoretischen Shift-Assay die Beladung eines Trägers mit DNA-Protein-Komplexen erfolgen. Als Träger werden in diesem Fall bevorzugt Polyacrylamidgele verwendet.An electrophoretic shift assay can also be used to load a Carrier with DNA-protein complexes. In this case, as a carrier preferably used polyacrylamide gels.

Die pufferhaltigen Gele können direkt über einer Elektrodenschicht mittels Impedanzmessung elektrisch ausgelesen werden. Es besteht aber auch die Möglichkeit über Blotverfahren, bevorzugt durch Elektroblotting, die Proteine oder Nukleinsäurefragmente auf eine geeignete Membran, aufzubringen und den Puffer auszuwaschen. Bei der Membranbeladung mit Proteinen werden bevorzugt Polyvinylidenfluorid (PVDF)- oder Polypropylenmembranen, bei der Beladung mit Nukleinsäuren Nitrocellulose- oder Nylonmembranen verwendet.The buffered gels can be applied directly over an electrode layer Impedance measurement can be read out electrically. But there is also Possibility via blot method, preferably by electroblotting, the proteins or Apply nucleic acid fragments to a suitable membrane, and the buffer wash out. When membrane loading with proteins are preferred Polyvinylidene fluoride (PVDF) or polypropylene membranes, when loaded with Nucleic acid nitrocellulose or nylon membranes used.

Vorteilhaft ist bei der impedometrischen Auslesung der Elektrophoresegele oder der Blotmembranen, daß keine Markierung der Proteine oder Nukleinsäurefragmente mehr nötig ist. Die Detektion erfolgt direkt über einer Elektrodenmatrix. Darüber hinaus ist die Impedanzmessung sehr empfindlich, es können noch sehr geringe Molekülkonzentrationen im Gel nachgewiesen werden. Probleme können allerdings aufgrund von Inhomogenitäten im Gel selbst oder im Puffer hervorgerufen werden. Solche Inhomgenitäten können durch nachgeschaltete Blotverfahren ausgeräumt werden.It is advantageous for the impedometric reading of the electrophoresis gels or the Blot membranes that no labeling of the proteins or nucleic acid fragments more is needed. The detection takes place directly over an electrode matrix. About that In addition, the impedance measurement is very sensitive, it can still be very low Molecular concentrations can be detected in the gel. Problems can, however due to inhomogeneities in the gel itself or in the buffer. Such inhomogeneities can be eliminated by subsequent blot processes become.

Ein Vorteil der unspezifischen Beladung von Gelen und Membranen ist, daß ein breites Spektrum von zu detektierenden Molekülen oder Molekülkomplexen untersucht werden kann, und zwar ohne einen spezifischen Bindungspartner kennen zu müssen bzw. auf einem Träger immobilisieren zu müssen.An advantage of the non-specific loading of gels and membranes is that a Wide range of molecules or molecular complexes to be detected can be investigated without knowing a specific binding partner to have to or to immobilize on a carrier.

Neben der unspezifischen Beladung von Gelen und Membranen durch herkömmliche elektrophoretische und chromatographische Trennverfahren, gegebenenfalls mit anschließendem Blotvorgang, kann auch eine zielgerichtete Beladung des Trägers stattfinden. Dazu werden Fängermoleküle selektiv im Träger fixiert. Die Aufbringung von Fängermolekülen erfolgt z. B. mit Hilfe eines Dispensers, bevorzugt lateral strukturiert und in der Tiefe homogen. Die Durchdringung des Gels oder der Membran mit den Fängermolekülen kann durch Anlegen von Druckdifferenzen (Saugen mit Vakuum) oder mittels elektrischer Felder unterstützt und beschleunigt werden.In addition to the non-specific loading of gels and membranes conventional electrophoretic and chromatographic separation processes, if necessary with subsequent blotting, a targeted one can also be used Carrier loading take place. For this purpose, catcher molecules are selectively in the carrier fixed. Catcher molecules are applied e.g. B. with the help of a dispenser, preferably laterally structured and homogeneous in depth. Penetration of the gel or the membrane with the capture molecules can be created by applying Pressure differences (vacuum suction) or supported by electrical fields and be accelerated.

Der so behandelte Träger kann dann der gegebenenfalls zu detektierende Zielstrukturen enthaltenden Reaktionslösung ausgesetzt werden. Danach wird der Träger durch Waschen von nicht spezifisch gebundenen Substanzen befreit, es bleiben nur die an den Fängermolekülen gebundenen Substanzen zurück.The carrier treated in this way can then be the one to be detected if necessary Reaction solution containing target structures are exposed. Then the Carrier freed of non-specifically bound substances by washing it only the substances bound to the capture molecules remain.

Die Beladung des Fängermoleküle enthaltenden Trägers kann darüber hinaus direkt auf der Elektrodenlage erfolgen. Durch eine elektrische Feldbehandlung ist dieser Prozeß beschleunigbar. Der beladene dreidimensionale poröse Träger wird dazu in einer geeigneten Pufferlösung getränkt (wie z. B. beschrieben in Nucleic Acids Research, 1997, 25, (24), p. 4908), die die zu detektierenden Moleküle oder Molekülkomplexe enthält. Gleichzeitig oder nach der Tränkung mit der Pufferlösung wird der Träger in direkten oder indirekten Kontakt mit einer Elektrodenmatrix gebracht. Die selektiv mit Fängermolekülen beladenen Stellen des Netzwerks können dann über den Elektroden positioniert werden.In addition, the carrier containing carrier molecules can be loaded directly done on the electrode layer. This is due to an electrical field treatment Process can be accelerated. The loaded three-dimensional porous carrier is used in a suitable buffer solution (such as described in Nucleic Acids Research, 1997, 25, (24), p. 4908), which are the molecules to be detected or Contains molecular complexes. Simultaneously or after impregnation with the buffer solution the wearer is in direct or indirect contact with an electrode matrix brought. The sites of the network that are selectively loaded with capture molecules can then be positioned over the electrodes.

Geladene Zielstrukturen, wie im Falle von Nukleinsäurefragmenten, die eine negative Ladung tragen, können durch Anlegen eines elektrischen Feldes im Träger aufkonzentriert werden. Die nötige Zeit zur Beladung des Trägers wird so über eine stark beschleunigte Fänger-/Zielmolekül-Erkennung verkürzt. In der Folge kann durch geeignetes Umpolen des Feldes eine Stringenzbehandlung erfolgen (wie z. B. beschrieben in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 1119-1123, Feb. 1997). Nach Austausch der Pufferlösung kann dann die impedometrische Detektion erfolgen.Charged target structures, as in the case of nucleic acid fragments, the one can carry negative charge by applying an electrical field in the carrier be concentrated. The time required to load the carrier is thus a greatly accelerated capture / target molecule recognition shortened. As a result A stringency treatment is carried out by appropriately reversing the polarity of the field (e.g. described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 1119-1123, Feb. 1997). To The impedometric detection can then be carried out by exchanging the buffer solution.

Als Fängermoleküle können Verbindungen eingesetzt werden, die stabile Bindungen mit ihren Zielstrukturen eingehen. Besonders bevorzugt sind dabei spezifische wirkende Fängermoleküle, wie z. B. mono- oder polyklonale Antikörper, Antigene, Enzyme, Coenzyme, Enzyminhibitoren, Enzymaktivatoren, Liganden, Rezeptoren und deren korrespondierenden Agonisten und Antagonisten, Hormone, Hormonrezeptoren, Oligonukleotide, Nukleinsäuren, Nukleinsäure bindende Proteine und Peptide oder auch synthetische Paarungssysteme, wie PNA, p-RNA, p-DNA oder CNA. Aber auch unspezifisch wirkende Fängermoleküle, wie z. B. Lectine, Oligosaccharide sind verwendbar. Unter dem Begriff Zielstruktur fallen dabei alle spezifisch an die Fängermoleküle bindenden Substanzen, wie Moleküle oder Molekülkomplexe.Compounds that have stable bonds can be used as capture molecules with their target structures. Specific ones are particularly preferred acting capture molecules, such as B. mono- or polyclonal antibodies, antigens, Enzymes, coenzymes, enzyme inhibitors, enzyme activators, ligands, receptors and their corresponding agonists and antagonists, hormones, Hormone receptors, oligonucleotides, nucleic acids, nucleic acid binding proteins and peptides or synthetic pairing systems, such as PNA, p-RNA, p-DNA or CNA. But also non-specific acting capture molecules, such as. B. lectins, Oligosaccharides can be used. Everyone falls under the term target structure substances that bind specifically to the capture molecules, such as molecules or Molecular complexes.

Über die sehr spezifisch wirkende Fängermolekül/Zielstrukturerkennung, wie z. B. bei einer Antigen-Antikörper-Reaktion oder einer Ligand-Rezeptor-Reaktion können vorhandene Zielstrukturen selektiv auf dem Träger angereichert werden.About the very specific acting capture molecule / target structure recognition, such as B. in an antigen-antibody reaction or a ligand-receptor reaction existing target structures can be selectively enriched on the carrier.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird an eine Membran, die keine unspezifischen Bindungen mit Proteinen oder Nukleinsäuren eingeht, wie z. B. bei Celluloseacetatmembranen, Streptavidin kovalent gebunden. Die Anbindung kann z. B. mit Carbonsäuregruppen funktionalisiertem Trägermaterial erfolgen, an die dann Aminogruppen enthaltende Fänger, wie z. B. Streptavidin kovalent gekoppelt werden können. Danach werden mit einem Dispenser biotinylierte Antikörper irreversibel an der Membran befestigt. So können unterschiedliche Antikörper an einem definierten Ort auf der Membran aufgebracht werden. Die Auftragungsorte werden von der Form der Elektrodenlage bestimmt. So wird bei Verwendung eines Elektrodenarrays eine entsprechend matrixförmige Beladung der Membran vorgenommen. Die so preparierte Membran kann dann einer Antigene enthaltenden Lösung ausgesetzt werden. Die inkubierte Membran wird dann mit einer physiologischen Pufferlösung gewaschen und so auf der Elektrodenmatrix gelegt, daß die Durchdringung der mit Antikörpern beladenen Membranorte bei der impedometrischen Messung mit Feldlinien möglichst groß ist.In a preferred embodiment, a membrane that does not non-specific bonds with proteins or nucleic acids, such as. B. at Cellulose acetate membranes, streptavidin covalently bound. The connection can e.g. B. Carrier material functionalized with carboxylic acid groups, to which then Catchers containing amino groups, such as. B. streptavidin can be covalently coupled can. Then, with a dispenser, biotinylated antibodies become irreversible attached to the membrane. So different antibodies can on a defined Place on the membrane. The places of application are from the Shape of the electrode position determined. So when using an electrode array a corresponding matrix-shaped loading of the membrane is carried out. The so prepared membrane can then be exposed to a solution containing antigens become. The incubated membrane is then covered with a physiological buffer solution washed and placed on the electrode matrix so that the penetration of the Antibody-loaded membrane locations with the impedometric measurement Field lines is as large as possible.

In einer weiteren Ausführungsform werden Antikörper mit einem Dispenser auf eine mit geringen Mengen Celluloseacetat versetzten Nitrocellulosemembran aufgebracht. Durch das Celluloseacetat wird die Aufnahmekapazität der Membran bezüglich der unspezifisch bindenden Proteine und Nukleinsäuren herabgesetzt. Die verbleibende Aufnahmekapazität der Membran wird vollständig mit den entsprechenden Fängermolekülen, z. B. mit Antikörpern gesättigt, so daß keine weiteren unspezifischen Bindungen an der Membran möglich sind.In a further embodiment, antibodies are dispensed onto a dispenser nitrocellulose membrane mixed with small amounts of cellulose acetate applied. The absorption capacity of the membrane is increased by the cellulose acetate reduced with regard to the non-specifically binding proteins and nucleic acids. The remaining membrane capacity is completely with the corresponding capture molecules, e.g. B. saturated with antibodies so that none further non-specific bindings on the membrane are possible.

Es ist darüber hinaus möglich, auch herkömmliche Nitrocellulosemembranen oder Nylonmembranen als Träger zu verwenden. Die nach der Beladung mit Fängermolekülen nicht besetzten Bindungsstellen der Membran werden anschließend mit einer den Wechselstromwiderstand kaum oder in bekannter Weise beeinflussenden Substanz blockiert. Geeignete Blocker sind z. B. Polyamine, wie Spermidin oder auch Nukleinsäure freie käufliche Hybridisierungspuffer. Die beim Blotten üblicherweise verwendeten Blocker, wie z. B. Rinderserumalbumin oder Nukleinsäurefragmente mit unspezifischen Sequenzen können hier nicht verwendet werden. Nach der Blockierung der Membran kann dann die Fänger-/Zielstruktur Reaktion durchgeführt werden. Dazu wird die Membran einer die zu detektierende Moleküle oder Molekülkomplexe enthaltende Lösung ausgesetzt und anschließend mit physiologischer Pufferlösung gewaschen. It is also possible to use conventional nitrocellulose membranes or To use nylon membranes as supports. The after loading with Capture molecules will not occupy binding sites on the membrane then with the AC resistance hardly or in a known manner influencing substance blocked. Suitable blockers are e.g. B. polyamines, such as Spermidine or nucleic acid-free commercially available hybridization buffers. The at Blotting commonly used blockers, such as B. bovine serum albumin or Nucleic acid fragments with unspecific sequences cannot be used here become. After blocking the membrane, the capture / target structure can then Reaction. For this purpose, the membrane becomes one to be detected Suspended solution containing molecules or molecular complexes and then washed with physiological buffer solution.

Als Messvorrichtung wird bevorzugt ein schichtförmig aufgebauter Chip verwendet, der zumindest aus einer Elektroden enthaltenden Lage und dem darauf und/oder darunter aufgebrachten Träger besteht. Der Chip kann neben den Elektroden- und Trägerschichten noch weitere funktionelle Schichten beinhalten, wie z. B. Isolationsschichten, Permeationsschichten oder Schichten, die zur Anbindung von Molekülen oder weiteren Schichten funktionalisiert wurden.A layered chip is preferably used as the measuring device, the layer comprising at least one electrode and the layer thereon and / or carrier applied underneath. The chip can next to the electrode and Backing layers include other functional layers, such as. B. Insulation layers, permeation layers or layers used to connect Molecules or other layers have been functionalized.

example 1

Dieses Beispiel zeigt die hohe und beständige Beladungsmöglichkeit von geeigneten Membranen.This example shows the high and constant loading possibility of suitable ones Membranes.

Eine kommerziell erhältliche Nylon-Membran (Nytran SuPerCharge, Dicke 200 µm) wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden lang mit einer 250 µmolaren Lösung eines 20- mer Oligonukleotids in 50 mmolarem L-Histidin-Puffer inkubiert. Das verwendete Oligo war am 3'-Ende mit einer Amingruppe und am 5'-Ende mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy3 modifiziert. Nach der Inkubation wurde die Membran ½ Stunde lang bei 80° getempert. Danach wurde die Membran gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen. Die anschließende Auswertung des optischen Fluoreszenzsignals erfolgt gegen eine Eichkurve, ermittelt aus der Differenz der Flureszenzemission in Lösung und dem Fluoreszenzabsorptionswert der Membran. Es wurde eine Beladungsdichte von mehr als 1 mM je Liter ermittelt. Die Dichte nimmt von außen her zur Mitte der Membran hin ab, in der Mitte auf etwa die Hälfte des Oberflächenwertes.A commercially available nylon membrane (Nytran SuPerCharge, thickness 200 µm) was at room temperature for 3 hours with a 250 µmolar solution of a 20- mer oligonucleotide incubated in 50 mmolar L-histidine buffer. The used Oligo was at the 3 'end with an amine group and at the 5' end with the Fluorescent dye Cy3 modified. After the incubation, the membrane was ½ Annealed at 80 ° for one hour. After that, the membrane was thoroughly cleaned distilled water. The subsequent evaluation of the optical Fluorescence signal occurs against a calibration curve, determined from the difference between Fluorescence emission in solution and the fluorescence absorption value of the membrane. A loading density of more than 1 mM per liter was determined. The concentration decreases from the outside towards the middle of the membrane, in the middle to about half of the surface value.

Im Vergleich dazu führt eine typisch erreichbare Belegungsdichte auf planaren Oberflächen von ca. 1 fMol/mm² nur zu einer vergleichbaren, über die 200 µm dicke Membran verteilte Dichte von ca. 1 µMol je Liter.In comparison, a typically achievable coverage density on planar surfaces of approx. 1 fMol / mm ² only leads to a comparable density of approx. 1 µmol per liter distributed over the 200 µm thick membrane.

Example 2

Eine auf ein Glassubstrat fest aufgebrachte Nylon-Membran (Cast^TM Slide, Dicke 200 µm) wurde mit Tropfen 250 µmolarer Lösung eines 20-mer Oligonukleotids in 50 mmolarem L-Histidin-Puffer für 3 h in gesättigter Wasserdampfatmosphäre inkubiert. Auch hier wurde nach Waschen mit destilliertem Wasser eine Beladungsdichte von mehr als 1 mM je Liter gemessen. Auf der dem Glas zugewandten Seite war die Beladungsdichte auf etwa 30% des Wertes auf der freien Oberfläche abgefallen. A nylon membrane (Cast ^™ Slide, thickness 200 μm) firmly attached to a glass substrate was incubated with drops of 250 μmolar solution of a 20-mer oligonucleotide in 50 mmolar L-histidine buffer for 3 h in a saturated water vapor atmosphere. Here too, a loading density of more than 1 mM per liter was measured after washing with distilled water. On the side facing the glass, the loading density had dropped to about 30% of the value on the free surface.

Die Membran wurde im folgenden einer elektrischen Impedanzmessung unterzogen. Dazu wurde eine Epoxy-Platine mit einer Kupferelektrode versehen, die aus zwei Halbkreisen (Radius ca. 3 mm) mit jeweiligen Zuleitungen bestand. Die beiden Halbkreise waren durch einen ca. 300 µm breiten Spalt voneinander getrennt. Nunmehr wurde die mit L-Histidin-Puffer getränkte, teilweise beladene Membran zur Einstellung des Abstandes mit ihrer offenen Seite mit definierter Kraft gegen die Kupferelektrode gedrückt, eine Wechselspannung von 0,1 bis 10 kHz und 10 mV Amplitude appliziert und der Betrag der Impedanz gemessen. Je nachdem, ob ein unbeladener oder beladener Bereich der Membran über dem Spalt positioniert wurde, ergab sich ein um ca. 10% niedrigerer oder höherer Betrag für den Absolutwert der gemessenen Impedanz. Absolut wurde eine Impedanz von 22 kOhm im beladenen Zustand gegen über 20 kOhm im unbeladenen Zustend ermittelt.The membrane was subsequently subjected to an electrical impedance measurement. For this purpose, an epoxy circuit board was provided with a copper electrode consisting of two Semicircles (radius approx. 3 mm) with respective supply lines existed. The two Semicircles were separated from each other by an approx. 300 µm wide gap. Now the partially loaded membrane soaked with L-histidine buffer became Setting the distance with its open side with a defined force against the Copper electrode pressed, an AC voltage of 0.1 to 10 kHz and 10 mV Applied amplitude and measured the amount of impedance. Depending on whether a unloaded or loaded area of the membrane positioned over the gap was, the amount was approximately 10% lower or higher for the Absolute value of the measured impedance. An impedance of 22 kOhm was absolute determined in the loaded state against over 20 kOhm in the unloaded state.

Claims

1. A method for the detection of target structures which are present as molecules or molecular complexes in a solution, characterized in that a three-dimensional, non-conductive material consisting of a porous carrier is exposed to the solution and then a loading of the carrier with the molecules or molecular complexes by electrical Impedance measurement is determined.

2. The method according to claim 1, characterized in that catcher molecules on / in are fixed to the three-dimensional support.

3. The method according to claim 2, characterized in that the catcher molecules Oligonucleotides, PNA, p-RNA, p-DNA, CNA, nucleic acid fragments and / or Are proteins and / or peptides.

4. The method according to claim 3, characterized in that the catcher molecules Antibodies and / or antigens and / or enzymes, coenzymes and / or Enzyme inhibitors, activators and / or DNA binding proteins, such as. B. Transcription factors and / or receptors and / or their agonists or Are antagonists.

5. The method according to claim 1, characterized in that the loading of the Carrier carried out via electroblotting.

6. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the The carrier is loaded via a capture molecule / target structure bond.

7. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the three-dimensional carrier made of a polyvinylidene fluoride (PVDF) -, Polypropylene, nitrocellulose, cellulose acetate or nylon membrane.

8. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the carrier has a thickness of 20 microns to 200 microns.

9. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the carrier between two complementary layers containing electrodes is introduced and an alternating electrical field by interconnecting two opposing electrodes is built up.

10. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the Carrier is applied to a layer containing coplanar electrodes and an alternating electrical field between two or more against each other switched electrodes is built.

11. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that Insulation layers, permeation layers or layers used to connect Molecules or other layers have been functionalized between the carrier and Electrode layer can be attached as functional layers.

12. The method according to claim 11, characterized in that on at least one Side of the carrier a functional layer made of non-electrically conductive Material is attached through which only water and small ions pass can.

13. Device for the detection of target structures by means of impedance measurement, consisting of a layered chip that has at least one position containing switchable electrodes and a layer thereon and / or applied below, made of electrically non-conductive material existing porous carrier contains.

14. The apparatus according to claim 13, characterized in that the carrier is a Membrane or a gel.

15. The apparatus according to claim 14, characterized in that in the carrier Capture molecules are immobilized.

16. The device according to one of claims 13 to 15, characterized in that the carrier is clamped between two layers containing electrodes.

17. The device according to one of claims 13 to 16, characterized in that the chip insulation layers, permeation layers or layers used for Binding of molecules or other layers were functionalized as includes functional layers.