DE10004191B4

DE10004191B4 - Fluoreszenz-Scanmikroskop

Info

Publication number: DE10004191B4
Application number: DE10004191A
Authority: DE
Inventors: Yuri Foster City Osipchuk; Sasha Irvine Dromaretsky; Yuriy Foster City Roll; Stephen Los Altos Smith
Original assignee: Axon Instruments Inc
Current assignee: Molecular Devices LLC
Priority date: 1999-02-05
Filing date: 2000-02-01
Publication date: 2004-11-25
Anticipated expiration: 2020-02-02
Also published as: US6833916B2; US6628385B1; US20040042007A1; DE10004191A1

Abstract

Fluoreszenz-Scanmikroskop,
– mit einer wenigstens zwei Anregungsstrahlen (B1, B2) abgebenden Beleuchtungseinrichtung (L1, L2),
– mit einer die Anregungsstrahlen (B1, B2) über ein zu untersuchendes Objekt (12) scannenden Abtasteinrichtung (17),
– mit einer Objektiveinrichtung (14), welche die Anregungsstrahlen (B1, B2) auf das Objekt (12) fokussiert, von den durch die Anregungsstrahlen (B1, B2) angeregten Objektpunkten (S1, S2) emittiertes Fluorenzlicht empfängt und je angeregtem Objektpunkt (S1, S2) eine paralleles Fluoreszenzlichtbündel (16, 18) erzeugt,
– und mit einer Detektionseinrichtung mit jeweils einem Detektor (PMT 1, PMT 2) je Fluoreszenzlichtbündel (16, 18), der ausschließlich dieses Fluoreszenzlichtbündel (16, 18) registriert,
gekennzeichnet durch
– einen Strahlteiler, der als ein dem Querschnitt des durch die Objektivanordnung (14) aufgeweiteten Fluoreszenlichtbündels (16, 18) angepasster Parabolspiegel (100) ausgebildet ist, der in seinem mittleren Bereich ein Loch (102) aufweist, durch das die Anregungsstrahlen (B1, B2) auf das Objekt einfallen, und der die Fluoreszenzlichtbündel (16, 18) direkt...

Description

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop der im Oberbegriff des Patentanspruchs beschriebenen, aus der DE 691 15 701 T2 bekannten Art.

Aus der DE 691 15 701 T2 ist ein konfokales optisches Rastermikroskop bekannt, welches ein optisches Abtastsystem und Einrichtungen zum gleichzeitigen Erzeugen von zwei oder mehreren Anregungsstrahlen aufweist. Das bekannte Mikroskop beinhaltet ferner zwei oder mehrere Detektoren zum Erfassen der von dem mit den Anregungsstrahlen beleuchteten Objekt ausgehenden Emissionsstrahlen.

Aus der DE 42 43 144 A1 ist ein Raman-Mikroskop bekannt, welches ein Objektiv zur vergrößernden Abbildung eines punktförmigen Bereiches auf einer Oberfläche einer Meßprobe aufweist. Das bekannte Raman-Mikroskop weist ferner Mittel zum Einstrahlen von Laserstrahlung auf den punktförmigen Bereich sowie Mittel zur Detektion der emittierten Raman-Strahlung auf. Das Objektiv in dem aus der DE 42 43 144 A1 bekannten Raman-Mikroskop ist ein Cassegrain-Spiegelobjektiv mit einem rotationssymmetrisch zur optischen Achse angeordneten Konvexspiegel und einem ebenfalls zur optischen Achse des Objektivs rotationssymmetrischen Konkavspiegel.

Die DE 43 43 076 C2 offenbart eine optische Einrichtung zum photothermischen Prüfen einer Oberfläche. Diese Einrichtung richtet Anregungsstrahlung auf einen zu prüfenden Oberflächenbereich und erfaßt mittels eines Detektors die von der Oberfläche abgegebene Wärmestrahlung.

Aus der DE 42 28 366 C2 ist eine Fluoreszenz-Messvorrichtung zum Bestimmen von Ionenkonzentrationen in einem Untersuchungsobjekt bekannt. Diese Fluoreszenz-Meßvorrichtung weist eine polychromatische Lichtquelle, eine Detektoreinheit zum Empfang des Fluoreszenzlichts und eine Auswerteeinrichtung auf. Zur Auswahl vorgebbarer Wellenlängen ist ein holographisches Volumengitter vorhanden, das auf einem verstellbaren Scanner angeordnet ist. Der verstellbare Scanner ist zur Erzeugung der Wellenlängen und Einstellung der Belichtungszeit in die entsprechende Wellenlängenposition und zur Einstellung der Dunkelpausen in eine das optische System nicht anregende Wellenlängenposition einstellbar.

Aus der US 4 154 529 ist ein System zur Erfassung reflektierter Laserstrahlen bekannt, bei dem die Laserstrahlen einer Laserquelle durch einen gelochten Spiegel auf eine Probe gerichtet und die von dieser reflektierten Strahlen vom Spiegel auf einen photoelektrischen Wandler gelenkt werden.

Schwierigkeiten können bei der Fluoreszenzmikroskopie auftreten, wenn mehrere Fluorophore mit nahe beieinanderliegenden Spektraleigenschaften abgebildet werden. Es kann sich aufgrund der Überlagerung von Absorptionsspektren oder der Spektralbandbreite der Quelle als unpraktikabel herausstellen, nur ein Fluorphor mit einem Quellenstrahl (z.B. einem Laserstrahl) anzuregen. Die Spektralemissionsbereiche mehrerer Fluorophore können sich überlagern, was es schwierig macht, die Emission vom jeweiligen Fluorphoreffizient und ohne Störungen zu einem einzigen Detektor zu leiten. Selbst wenn sich die Emissionsbereiche nicht überlagern, können sie so nahe beieinander liegen, daß es schwierig wird, eine wirksame optische Komponente (z.B. Filter, Gitter oder Prisma) zu deren Trennung herzustellen. Eine Lösung besteht darin, jede Wellenlänge unabhängig abzutasten und dann ein Kompositbild aus mehreren Abtastungen zusammenzusetzen. Hier werden dann jedoch die Geschwindigkeit und die Bilddeckung ein Thema.

US-Patent Nr. 5 304 810 offenbart ein konfokales Rastermikroskop, bei dem zwei oder mehr Quellenstrahlen mit unterschiedlichen Winkelausrichtungen zwei getrennte Punkte beleuchten, die sich auf einer Probe in der Objektebene eines Mikroskopobjektivs befinden. Das dabei entstehende reflektierte oder fluoreszierende Licht wird durch eine gleiche Anzahl beabstandeter Detektoren aufgefangen, wobei jeder Licht von einem einzigen beleuchteten Punkt empfängt. Bei diesem System ist der Bereich, aus dem Licht vom jeweiligen Detektor gesammelt wird (sein "Blickfeld), räumlich auf fast die gleiche Ausdehnung wie die Anregungspunktgröße beschränkt.

Ein Vorteil des bekannten Systems ist, daß damit eine hohe räumliche Ausdehnung bei jedem einzelnen auf dem Musterbeleuchteten Punkt erreicht wird, was für viele Anwendungsbereiche höchst erwünscht ist. Bei anderen Anwendungsbereichen reicht jedoch auch eine geringere Auflösung.

Shalon, D., S. Smith und P.O. Brown beschreiben in "A DNA micro-array system for analyzing complex DNA samples using two-color fluorescent probe hybridization" ("DNA-Mikrofeldsystem zum Analysieren komplexer DNA-Proben unter Verwendung einer zweifarbigen Fluoreszenzprobenhybridisierung"), Genome Research 6:639-645 (1996), einen Scanner zur Zwei-Wellenlängen-Fluoreszenzerfassung von DNA-Mikrofeldern, die Punkte beträchtlicher Größe auf der Probe beleuchten. Dies geschieht durch ein absichtliches Unterfüllen der Objektiv-Eingangspupille (d.h. der Rückapertur), was durch ein Verringern der numerischen Apertur (NA) des konvergierenden Strahls die durch Diffraktion eingeschränkte Punktgröße in der Brennebene vergrößert. Hierbei ist zu bemerken, daß ein beträchtliches Unterfüllen der Objektivapertur mit einem Einzel-Quermoden-Laserstrahl mit großer Wahrscheinlichkeit zu einer Gauß'schen Tiefenunterscheidung führt und mit gutem Signal-Rausch-Verhältnis abgerastert und untersucht werden kann.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Fluoreszenzlichtbündel ohne verfälschend wirkende Bauteile direkt zur Detektoreinrichtung zu lenken.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch ein Fluoreszenz-Scanmikroskop nach dem Patentanspruch.

Das mit dem erfindungsgemäßen Mikroskop erhaltene Bildfeld ist wesentlich größer als das herkömmlicher Fluoreszenzmikroskope, bei denen das Bildfeld typischerweise durch die optische Konstruktion der Objektivlinse eingeschränkt ist. Das erfindungsgemäße Mikroskop kann zur Untersuchung von Proben, wie z.B. DNA-Mikrofelder oder Gewebe-Mikrofelder angewendet werden, ist jedoch nicht auf diesen Anwendungsbereich beschränkt, wobei eine kurze Tiefenschärfe nicht benötigt wird, die nämlich die Systemleistung beeinträchtigen würde (Cheung, V.G., M. Morley, F. Aguilar, A. Massimi, R. Kucherlapati and G. Childs, "Making and reading microarrays" ("Herstellen und Abtasten von Mikrofeldern") Nature Genetics Supplement 21:15-19 (1999)). Das erfindungsgemäße Mikroskop ist außerdem für Proben geeignet, die fluoreszente Markierungen mit kleinen Stokes-Verschiebungen und/oder sich überlagernden Absorptions- und Emissionsspektren verwenden.

Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Mikroskops werden nachfolgend anhand von Figuren erläutert. Es zeigt:
1 eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen optischen Abbildungssystems (Mikroskops),
2 ein Schema, bei dem die Anregungspunktgröße und das Emissionsbildfeld des optischen Abbildungssystems von 1 kontrastiert werden,
3 eine schematische Darstellung einer ersten praktischen Ausführungsform des optischen Abbildungssystems von 1,
4 eine schematische Darstellung wie 3 einer zweiten praktischen Ausführungsform, bei der der Spiegel und die Objektivlinse durch einen Parabolspiegel ersetzt wurden,
5 ein Schema einer Ausführungsform einer weiteren alternativen Ausführungsform eines Parallel-Zweistrahl-Abbildungssystems,
6 eine vergrößerte schematische Darstellung des Strahlteilers von 1,
7–13 alternative Konstruktionen für Strahlteiler.
Die bevorzugten Ausführungsformern der Erfindung werden nun im einzelnen beschrieben, von denen Beispiele in den Zeichnungen dargestellt sind. Die Erfindung wird zwar anhand bevorzugter Ausführungsformen beschrieben, doch versteht es sich, daß die beschriebenen Ausführungsformen nicht als spezifische Einschränkung der Erfindung auf diese Ausführungsformen gedacht sind. Vielmehr soll die Erfindung sich auch auf Alternativen, Modifikationen und Äquivalente erstrecken, die im Geist und im Umfang der Erfindung, wie er durch die nachfolgenden Ansprüche definiert ist, beinhaltet sein können.
Die hier gebotene Offenbarung ist als allgemeine Beschreibung des Systems gedacht, wobei solche Eigenschaften wie Bildfeld, Auflösung, Vergrößerung, Ausleuchtungsleistung und Abbildungsmodi erörtert werden. Mehrere potentielle Variationen des Systems werden auch beschrieben.
1. Systembeschreibung
Gemäß 1 ist das erfindungsgemäße optische Fluoreszenz-Abbildungssystem 10 hier zur Verwendung in einem optischen Rastermikroskop offenbart, es hat jedoch weitere Anwendungsmöglichkeiten, wie noch erörtert wird. Zwei voneinander getrennte Punkte S₁ und S₂ werden auf einer Probe 12 durch ein Paar Anregungslaserstrahlen B₁ und B₂ beleuchtet, die durch einen ersten und einen zweiten Laser L₁ und L₂ erzeugt werden. Jede der Laserquellen L₁ und L₂ enthält dabei tatsächlich mehrere Komponenten (z.B. einen Frequenzverdopplungskristall zum Erzeugen eines 532-nm-Strahls). Die Anregungs-Laserstrahlen B₁ und B₂ gelangen in geringfügig verschiedenen Winkeln zuerst durch eine Apertur 15 eines 45°-Umlenkspiegels 13 und dann durch ein Objektivelement 14, das in 1 als Linse dargestellt ist. Dadurch werden Emissionslichtstrahlen S₁ und S₂ relektiert und durch den Spiegel 13 umgelenkt und durch eine zweite Linse 19 geleitet, bevor sie einen der beiden Detektoren PMT 1 oder PMT 2 erreichen. Der Emissionsstrahl 16 wird an einem zweiten 45°-Spiegel 22 reflektiert, bevor er den Detektor PMT 1 erreicht, während der Emissionsstrahl 18 direkt zum PMT 2 gelangt. Gegebenenfalls können optische Trennelemente 24, wie zum Beispiel dichroitische Filter, Prismen oder Gitter vor jedem Detektor PMT 1 und PMT 2 positioniert werden. Es versteht sich, daß die optimale relative Position optischer Trennelemente 24 und ihrer entsprechenden Detektoren, PMT 1 und PMT 2, etwas anders sein kann, als in 1 gezeigt.
Das optische Fluoreszenz-Abbildungssystem 10 kann ein Abtastsystem verwenden, das durch die Referenznummer 17 allgemein in Phantomdarstellung angedeutet ist, das zum Beleuchten und Abbilden des gesamten Bereichs der Probe 12 dient. Vorzugsweise verwendet das Abtastsystem 17 einen Objektivlinsenscanner für eine Achse und einen Proben-(Tisch-)Scanner für die andere, darauf senkrecht stehende Achse. Das Abtastsystem 17 ist anhand von 3 eingehender beschrieben.
Es können unterschiedliche Verfahren zum Erzeugen einer Winkelversetzung, wie sie durch den Winkel θ angegeben ist, für die Anregungsstrahlen B₁ und B₂ verwendet werden. Einer der Strahlen B₁ und B₂ kann durch einen 45°-Umlenkspiegel 20 gerichtet werden, so daß die Strahlen B₁ und B₂ mit einer leichten Winkelversetzung ihrer Propagationsrichtungen in das optische Abtastsystem eintreten. Bei dieser Konstruktion sind die Anregungsstrahlen selbst kollimiert oder annähernd kollimiert.
Die Größe des beleuchteten Bereichs der Punkte S₁ und S₂ auf der Probe 12 wird durch die Anregungsstrahldurchmesser, die Brennweite F₁ der Objektivlinse 14 und den Grad der Defokussierung der Probe bestimmt. Vorzugsweise sind die Anregungsstrahldurchmesser viel kleiner als die Eingangspupille der Objektivlinse. Die Eingangspupille ist die Abbildung der Aperturblende der Linse aus der Sicht der Quelle und der Detektoren (und nicht der Probe).
Das Objektivelement 14 ist eine asphärische Einzellinse. Der nominelle Probenbrennpunkt liegt auf halbem Weg zwischen den Brennpunkten der beiden Anregungsstrahlen (wobei die Brennpunkte aufgrund axialer chromatischer Aberration axial voneinander getrennt sind). Bei der aktuellen Anwendungsweise haben die Beleuchtungspunkte S₁ und S₂ einen Durchmesser in der Größenordnung von 5 – 10 μm. Die erwünschte Punktgröße und axiale Trennung kann dadurch eingestellt werden, daß einer oder alle beide Anregungsstrahlen B₁ und B₂ leicht konvergierend oder divergierend und nicht kollimiert sind. Die seitliche Versetzung zwischen den beiden Punkten wird durch den Winkel θ der Anregungsstrahlen und die Brennweite der Objektivlinse bestimmt. Wie noch erörtert wird, kann das Objektivelement 14 alternativ auch anders konstruiert sein.
Das optische Fluoreszenz-Abbildungssystem 10 verwendet zwei Detektoren PMT 1 und PMT 2, von denen jeder Licht von einem der zwei beleuchteten Punkte S₁ und S₂ auffängt. Durch den 45°-Umlenkspiegel 22, der den Emissionsstrahl 16 umlenkt, wird verhindert, daß die Detektoren PMT 1 und PMT 2 Licht vom falschen Beleuchtungspunkt empfangen, wodurch die Probe in zwei Bereiche aufgeteilt wird, von denen jeder von einem einzigen Detektor "gesehen" wird. Die Detektoren PMT 1 und PMT 2 können PMT (photomultiplier tubes/Photovervielfacherröhren), Photodioden, Lawinen-Photodioden, CCD-Elemente und andere optische Detektoren enthalten.
Gemäß 2 "sieht" jeder Detektor einen von zwei (oder mehr, im allgemeinen Fall) sich nicht überlagernde Bereiche R₁ und R₂ der Probe, wobei eine Grenze 25 zwischen diesen Bereichen verläuft, die durch die Position des Spiegels 22 im Verhältnis zur zweiten Linse 19, wie in 1 gezeigt, bestimmt wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform haben die Anregungspunkte S₁ und S₂ einen Durchmesser in der Größenordnung von 5 – 10 μm. Die Größe dieser Punkte wird durch die Durchmesser und Wellenlängen der eintreffenden Laserstrahlen B₁ und B₂ und dadurch bestimmt, daß diese Strahlen nicht die ganze Apertur der Objektivlinse 14 ausfüllen. Vorzugsweise ist die Entfernung zwischen diesen Punkten ungefähr 70 μm. Im Gegensatz dazu ist bei einem konfokalen Mikroskop eine typische Anregungspunktgröße in der Größenordnung von 1 μm oder weniger, was daran liegt, daß der Punkt durch die diffraktionsbegrenzte Punktgröße einer Mikroskoplinse mit einer mittleren bis hohen NA bestimmt wird.
Zum Erreichen der erwünschten Größe der beleuchteten Punkte S₁ und S₂ der vorliegenden Erfindung wird die Eingangspupille der Objektivlinse 14 unterfüllt, indem die Laserstrahlen B₁ und B₂ direkt in die Linse gerichtet und nicht auf den Durchmesser der Eingangspupille expandiert werden. Diese Anordnung vermeidet die Verwendung eines dichroitischen Spiegels zum Trennen des Anregungslichts und des Emissionslichts, wie das sonst bei konfokalen Mikroskopen und anderen optischen Abtastsystemen normalerweise getan wird. Stattdessen ist ein (idealerweise) 100-reflektierender Spiegel 13 mit einem 1 mm großen Loch 15 in dessen Mitte vorgesehen. Das Loch kann kreisförmig, elliptisch oder schlitzförmig sein. Die Anregungslichtstrahlen (typischerweise mit einem Durchmesser von 0,8 mm) gelangen durch das Loch, während das Fluoreszenz-Emissionslicht vom Spiegel reflektiert wird und, falls nötig, durch ein Sperrfilter, durch das gestreutes Anregungslicht herausgefiltert wird, und durch die zweite Linse 19 zu den Lichtdetektoren PMT 1 und PMT 2.
Das Blickfeld der Detektoren PMT 1 und PMT 2 unterscheidet sich auch vom Blickfeld der Detektoren eines typischen konfokalen Mikroskops. Hier ist zu bemerken, daß das Blickfeld sich in diesem Zusammenhang auf das Bild des Detektors oder der Detektorapertur auf der Probe und nicht die Gesamtgröße des abgetasteten Bereichs bezieht. Wie in 2 gezeigt, ist das gesamte Blickfeld der Detektoren bei der vorliegenden Erfindung der Bereich 26, der beide Anregungspunkte S₁ und S₂ umfaßt. Es ist in 2 zwar als Kreis gezeigt, doch versteht es sich, daß der Bereich 26 auch andere Formen annehmen kann. Zum Beispiel kann das Blickfeld bei der Probe 12 eine Querabmessung von 200 mm haben. Der vor die Detektoren PMT 1 und PMT 2 geschaltete Spiegel 22 teilt das Blickfeld in zwei Hälften 28 und 30, so daß jeder Detektor ungefähr die Hälfte des gesamten Blickfelds "sieht". Dagegen ist das Blickfeld eines konfokalen Mikroskops räumlich auf 1 μm oder weniger beschränkt, was fast die gleiche Größe wie der Anregungspunkt ist, was zum Maximieren der hohen seitlichen Auflösung nötig ist. Das Blickfeld wird bei einem konfokalen Mikroskop typischerweise durch eine vor den Detektor geschaltete Apertur beschränkt.
Ein zusätzlicher Unterschied zwischen dem vorliegenden System und einem konfokalen System hängt mit der Tiefenschärfe (axialen Auflösung) zusammen. Bei einem typischen hoch vergrößernden konfokalen Mikroskop beschränkt die Verwendung einer Detektorapertur zum Abweisen von unscharfem Licht die Tiefenschärfe auf 1 mm oder weniger. Da das erfindungsgemäße optische System nicht aktiv unscharfes Licht mit Detektoraperturen oder kleinen Detektoren abweist, ist die Tiefenschärfe wesentlich größer als bei einem konfokalen Mikroskop.
Wie bei allen optischen Rastermikroskopen erzeugt das Abbildungssystem 10 ein Bild durch ein sequentielles Erfassen von Pixeldaten (z.B. Fluoreszenz) und Konstruieren eines Bilds durch bekannte Computergraphikverfahren. Bei zwei Anregungsstrahlen mit einer kleinen seitlichen Versetzung zwischen ihren Testorten auf der Probe bildet das vorliegende System zwei komplette Bilder mit einer bekannten seitlichen Versetzung dazwischen. Die Abtastung erfolgt in den beiden lateralen Richtungen.
Bei einer ersten praktischen Ausführungsform des Systems, wie es in 3 gezeigt ist, werden zwei Abtastmechanismen verwendet, jeder in der Form eines Translationstisches 40, 42. Der Translationstisch 40 ist mit einer linearen Kodierein richtung 43 kombiniert. In einer ersten Abtastrichtung, die durch den Pfeil 44 angezeigt ist, gelangen die Anregungsstrahlen B₁ und B₂ in den Abtasttischbereich in einer ungefähr horizontalen Richtung, werden durch einen Umlenkspiegel 46 nach oben zur Probe 12 reflektiert, und dann durch eine Objektivlinse 14 auf die Probe 12 fokussiert. Die Bewegung des Translationstischs 40 in der Richtung des Pfeils 44 ergibt die Bewegung in einer ersten Richtung, bei der der Meßort auf der Probe durch die optische Achse des Objektivelements 14 bestimmt wird. Die Langsam-Achsen-Abtastung wird durch ein Bewegen der Probe 12 über den Translationstisch 42 in einer zweiten Richtung im rechten Winkel zur ersten Abtastrichtung bewerkstelligt, wobei die zweite Richtung, wie gezeigt, senkrecht auf der Seite steht.
3 zeigt auch eine alternative Zwei-Wellenlängen-Version des erfindungsgemäßen Abbildungssystems. Zusätzliche dichroitische Strahlteiler 44, 50 und Bandpaßfilter 54, 56 werden zum Zusammenmischen von Licht aus mehreren Lasern (zwei Laser sind gezeigt) und zum Trennen fluoreszierenden Emissionslichts auf mehrere Bänder verwendet. Diese Anordnung kann zum simultanen Abtasten mit mehreren Quellen- und Erfassungswellenlängen verwendet werden. Wie unten bezüglich des in 10 gezeigten Strahlteilers erörtert, kann die Leistung dieser Konstruktion durch die Eigenschaften der dichroitischen Strahlteiler eingeschränkt sein.
2. Alternative Konstruktionsformen
Kleinere Abänderungen der Konstruktion des vorliegenden Systems können daraus ein Allzweckmikroskop machen oder es auf spezifische Verwendungsweisen zuschneiden. Diese Abänderungen beziehen sich auf die Strahlquelle oder -quellen und die Strahlteilungs-, Erfassungs- und Abtastungseigenschaften, wie hier erörtert.
A) Strahlquellen
Eine Anzahl alternativer Anregungslichtquellenkonfigurationen kann bei dem vorliegenden System verwendet werden. Der einfachste Fall ist die Verwendung eines einfachen axialen Laserstrahls. Der Probenort liegt dann am Brennpunkt der Objektivlinse (wenn man einen kollimierten Laserstrahl annimmt). Der Teil der Linse, durch den der Strahl gelangt ändert sich nicht mit der Abtastposition. Dies ist etwas einfacher als die in 1 gezeigte allgemeine Anwendung, bei der die finiten Winkel, die die beiden Anregungsstrahlen mit der optischen Achse bilden, die Auswirkung haben, daß sie sich während der Abtastbewegung der Linse zur Mitte der Objektivlinse und von ihr weg bewegen. Hierdurch entstehen sich leicht verändernde Beleuchtungsbedingungen während des Abtastung, was nicht passiert, wenn die Strahlen mit der Linsenachse koaxial verlaufen. Es ist auch möglich, zwei oder mehr koaxiale Quellenstrahlen zu verwenden. In diesem Fall beleuchten sie den gleichen Punkt auf der Probe (wenn die chromatische Aberration vernachlässigt wird).
Außerdem ist es möglich, getrennte Beleuchtungspunkte zu erhalten, indem parallele Strahlen verwendet werden, von denen jeder einen Teil der Objektivlinsenapertur ausleuchtet. Die einzelnen Strahlen konvergieren als getrennte Lichtkegel und sind in der Brennebene der Linse koinzident (wenn man annimmt, daß kollimierte Quellenstrahlen auf die Objektivlinse auftreffen). Ein Nachteil bei diesem Verfahren im Vergleich zu den in einem Winkel verlaufenden Strahlen ist, daß sich der Abstand zwischen den zwei konvergierenden Strahlen mit einer Unschärfe der Probe verändert, und es wirkt sich ein vertikaler Lauffehler (Unschärfe) während der Abtastung auf sie aus. Wenn die Probe dem Brennpunkt der Linse näherkommt, nähern sich die beiden Beleuchtungspunkte einander. In dem Fall der Winkelversetzung der vorliegenden Konstruktion ist dieser Effekt wesentlich weniger stark ausgeprägt (die beiden Punkte liegen nie übereinander, wenn man annimmt, daß sich die beiden Strahlen vor der Objektlinse und nicht zwischen der Linse und der Probe überkreuzen). Die Auswirkungen eines Lauffehlers auf den Abstand zwischen den Beleuchtungspunkten können bei der vorliegenden Erfindung minimiert werden, indem man die beiden Beleuchtungsstrahlen sich am oder nahe dem vorderen Brennpunkt der Objektivlinse kreuzen läßt.
Mehrere Strahlen können von einer oder mehr Quellen kommen und können unterschiedliche Spektraleigenschaften haben oder nicht. Außerdem ist es möglich, einen oder beide Quellenstrahlen über der Probe (also von gegenüber der Objektivlinse) einstrahlen zu lassen. Dies ist unten im Abschnitt über Durchleuchtungsmöglichkeiten bei den alternativen Abbidungsmodi beschrieben.
Kleinere Beleuchtungspunkte können dadurch erreicht werden, daß der Durchmesser der Quellenstrahlen erhöht wird (z.B. indem die Strahlen durch ein Raumfilter/einen Strahlaufweiter geleitet werden) und die Eingangspupille der Objektivlinse überfüllt wird. Das Raumfilter besteht aus einer positiven Linse zum Fokussieren des Strahls und einer Lochblende, das zum Durchlassen von lediglich der mittleren Keule des Brechungsmusters (Airy-Musters) gedacht ist. Der Strahl expandiert jenseits der Lochblende und wird durch eine weitere Linse kollimiert. Dieser Strahl wird dann durch die Objektivlinse auf die Probe fokussiert, wodurch ein diffraktionsbeschränkter Beleuchtungspunkt erzeugt wird. Bei dieser Anwendungsform sind die durch zwei im Winkel zueinander stehende Quellenstrahlen nur im Zwischenbereich des Brennpunkts voneinander getrennt, und es kann eine gut korrigierte Objektivlinse nötig sein, um eine angemessene Leistung zu erzielen.
4 zeigt eine Abänderung der Konstruktion von 3. Bei dieser Ausführungsform wird ein einziger außeraxialer Parabolspiegel 60 anstelle der Kombination der Objektivlinse und des 45°-Spiegels verwendet. Der Parabolspiegel 60 hat viele Funktionen. Er lenkt die Achse der eintreffenden Laserstrahlen B₁ und B₂ um 90° ab; er fokussiert die Strahlen zu Einschnürungen, die auf die Probenoberfläche 12 fallen; er sammelt und rekollimiert Fluoreszenzemissionen und lenkt die Emissionstrahlen um 90° um.
5 veranschaulicht ein gespaltenes paralleles Zweistrahlsystem. Die Anregungslichtstrahlen B₁ und B₂ werden durch getrennte Laser L₁ und L₂ in paralleler Ausrichtung erzeugt. Ein Spiegel 64 mit zwei Löchern 66, 68 ist im Pfad der Anregungsstrahlen B₁ und B₂ zum Richten der Strahlen auf zwei nebeneinanderliegende Objektivlinsen 70, 72 vorgesehen. Ein Paar beleuchteter Punkte S₁ und S₂ wird erzeugt, von denen Fluoreszenzemissionen durch die Objektivlinsen 70, 72 als Emissionsstrahlen 76, 78 kollimiert werden. Der Spiegel 64 lenkt die Emissionsstrahlen 76, 78 in räumlich getrennter Weise zu den Detektoren PMT 1 und PMT 2 um, wobei ein 45°-Spiegel 80 für den Emissionsstrahl 78 vorgesehen ist. Diese optische Anordnung braucht keine zweite Linse, die aber, wenn das von Vorteil ist, natürlich auch mit eingebaut werden kann.
B) Strahlteiler
Das erfindungsgemäße optische System verwendet eine neue Konstruktion für einen Strahlteiler, die in 1 in der Form eines Spiegels mit einem kleinen Loch dargestellt ist. Eine vergrößerte Darstellung dieser Konstruktion ist in 6 gezeigt. Die Anregungsstrahlen B₁ und B₂ (zwei beim gezeigten System, in allgemeinen Fällen jedoch auch einer oder mehr) gelangen durch das Loch 15 in der Mitte des Spiegels 13. Die Objektivseite des Spiegels 13 weist eine reflektierende Beschichtung 84 zum Umlenken der Emissionslichtstrahlen 16, 18 auf.
Das von der Probe ausgestrahlte fluoreszente Emissionslicht 16, 18 kehrt entlang der gleichen Richtung zurück, jedoch mit einem viel größeren Durchmesser als die Anregungsstrahlen B₁ und B₂. Insbesondere haben die Anregungsstrahlen B₁ und B₂ einen kleineren Durchmesser als die Eingangspupille der Objektivlinse, während das gesammelte Emissionslicht 16, 18 den Durchmesser der Objektivpupille hat (wenn kollimierte Emissionsstrahlen angenommen werden). Aufgrund des großen Mißverhältnisses zwischen den Durchmessern der Anregungs- und der Emissionsstrahlen wird durch das Loch 15 in der Mitte des Spiegels 13 nur eine geringe Menge Emissionslicht verloren, wodurch ein wirksamer Strahlteiler entsteht.
Die Strahlen B₁ und B₂ von 6 sowie in 7–13 sind aus Gründen der Veranschaulichung koaxial. In der Praxis können sie koaxial sein oder auch nicht.
Wie in 7 gezeigt, kann das Loch in der Mitte des Spiegels dadurch erzeugt werden, daß eine reflektierende Beschichtung 86 auf der einen Oberfläche eines optischen Fensters 88 angebracht wird, wobei ein kleiner Bereich 90 in der Mitte unbeschichtet bleibt (oder antireflektierend beschichtet wird).
Die reflektierende Beschichtung kann durch eine total reflektierende Innenoberfläche ersetzt werden, wie in 8 gezeigt. In diesem Fall werden ein kleines Prisma 85 und ein großes Prisma 87 so kombiniert, daß die Beleuchtungsstrahlen B₁, B₂ in das kleine Prisma eintreten, durch die Schnittstelle zwischen den Prismen hindurchtreten und aus dem großen Prisma heraustreten. Die Emissionsstrahlen 16, 18, die einen viel größeren Durchmesser als die Beleuchtungsstrahlen haben, treten in das große Prisma 87 ein, gelangen jedoch nicht zum kleinen Prisma 85 hindurch, außer an der Stelle, an der die beiden Prismen in Kontakt sind. Stattdessen wird der Großteil des Strahls innen total reflektiert und tritt auf der anderen Fläche des großen rechtwinkligen Prismas wieder aus.
Ein weiteres Beispiel ist in 9 gezeigt, bei dem ein transparentes Spiegelsubstrat 90 (optisches Fenster) eine teilreflektierende Beschichtung 92 auf einer Oberfläche hat. Bei dieser Ausführungsform gelangt ein Teil der Emissionsstrahlen 16' und 18' zurück durch das optische Fenster 90.
Bei dieser Konstruktion bewirkt die teilweise reflektierende Beschichtung, daß ein Teil (z.B. 50%) eines auf sie auftreffenden Strahls reflektiert wird und der verbleibende Teil hindurchgelassen wird (wenn man die Absorption vernachlässigt). Dies ist eine gebräuchliche Konstruktion für vergleichbare Beleuchtungs- (Anregungs-) und Erfassungs-(Emissions-)Strahldurchmesser. Es gehen dabei jedoch mindestens 75% verloren (der Beleuchtungsstrahl wird durch den Strahlteiler hindurchgelassen und der Erfassungsstrahl von ihm reflektiert oder umgekehrt). Beim vorliegenden System, bei dem der Durchmesser des Anregungsstrahls wesentlich kleiner ist als der des Emissionsstrahls, ist dieser Verlust unnötig hoch, und aus diesem Grund handelt es sich hierbei nicht um eine bevorzugte Ausführungsform. Ein Platten-Strahlteiler ist in 9 gezeigt, doch kann diese Art von Strahlteiler auch in anderen Formen, wie zum Beispiel als Kubus oder als Membran, verwirklicht werden.
Eine Abänderung der in 9 gezeigten Konstruktion verwendet einen Polarisierungs-Strahlteiler und ein Viertelwellenplättchen zum Verbessern des Wirkungsgrads des Systems. In diesem Fall reflektiert der Strahlteiler linear polarisiertes Licht, das dann durch das Viertelwellenplättchen in zirkulär polarisiertes Licht umgewandelt wird. Nach der Reflexion von der Probe wird der Rückstrahl durch das Viertelwellenplättchen wieder in linear polarisiertes Licht zurückverwandelt, nun jedoch mit der richtigen Polarisierung, die vom Polarisierungsstrahlteiler hindurchgelassen wird. Die Reihenfolge von Reflexion und Transmission durch den polarisierenden Strahlteiler kann auch umgekehrt sein. Dieses Polarisierungsverfahren wird aufgrund der Beibehaltung der Polarisierung typischerweise bei der Reflexion, nicht bei der Fluoreszenz verwendet.
Ein weiteres Beispiel für einen Strahlteiler ist in 10 gezeigt, wo ein dichroitischer Strahlteiler 94 verwendet wird, der eine dichroitische Beschichtung 96 aufweist. Bei der dichroitischen Strahlteilerkonstruktion wird eine Strahlteilerbeschichtung verwendet, die einen oder mehrere Wellenlängenbereiche reflektiert (oder hindurchläßt), während sie andere Wellenlängenbereiche hindurchläßt (bzw. reflektiert). Dies ist eine effiziente Lösung im fluoreszierenden Betrieb, wo zwischen den Beleuchtungswellenlängen und den Emissionswellenlängen eine spektrale Verschiebung besteht. Die praktischen Einschränkungen von dünnen Beschichtungen und die Überlagerung zwischen dem Absorptions- und dem Emissionsspektrum fluoreszierender Farbstoffe verhindern, daß dies eine ideale Lösung in der Fluoreszenzmikroskopie ist.
Noch ein weiteres Beispiel für einen Strahlteiler ist in 11 gezeigt. Ein kleiner Spiegel 95 reflektiert die Anregungsstrahlen B₁ und B₂, während die Emissionsstrahlen 16, 18 hauptsächlich am Spiegel vorbeigehen. 11 zeigt im wesentlichen den umgekehrten Fall von 6. Hier werden nicht die Anregungsstrahlen durch ein kleines Loch im Spiegel hindurch gelassen, der den Erfassungsstrahl reflektiert, wie das beim Strahlteiler von 6 geschieht, vielmehr werden die Strahlen von einem kleinen Spiegel 95 reflektiert, während die Emissionsstrahlen 16, 18 um den Spiegel herum durchgelassen werden. Der kleine Spiegel kann auch dadurch hergestellt werden, daß eine reflektierende Beschichtung auf lediglich einen kleinen Teil eines optischen Fensters aufgebracht wird, wobei. der Rest des Fensters unbeschichtet bleibt (oder mit einer Antireflexionsbeschichtung beschichtet wird). Alternativ dazu könnte der Spiegel die Anregungsstrahlen zusätzlich zum Reflektieren auch noch kollimieren (oder sonst abbilden). Dies könnte für eine von der Seite des Strahls eingebrachte Faserquelle geeignet sein.
12 zeigt ein weiteres Beispiel, bei dem eine Faserquelle 99 mit einer Linse 98 einen kollimierten Anregungsstrahl B₁ auf das Objektivelement richtet. Der Emissionsstrahl 16 geht an der Linse 98 und der Faserquelle 99 vorbei zum Detektor.
Außerdem ist es möglich, den Strahlteiler mit einer Fokussierfähigkeit zu versehen. In 13 lenkt ein außeraxiales Parabolspiegelsegment 100 mit einem Loch 102 in der Mitte Emissionsstrahlen 16, 18 um und fokussiert sie auf die Detektoren. Der in 13 gezeigte Parabolspiegel ermöglicht es, den Anregungs- und den Emissionstrahl zu kombinieren, wie das auch beim Strahlteiler von 6 geschieht, gleichzeitig wird jedoch der Emissionsstrahl fokussiert. Auf die zum Fokussieren des Lichts auf die Detektoren verwendete Abbildungslinse kann nun verzichtet werden, weil ihre Funktion vom Parabolspiegel übernommen wird. Ein Parabolspiegel leistet eine perfekte (aberrationsfreie) Abbildung eines kollimierten, axialen Eingangsstrahls. Die Abbildungsleistung des Parabolspiegels läßt jedoch bei der außeraxialen Abbildung schnell nach, und unterschiedlich geformte Linsen sind in bestimmten Fällen wohl zu bevorzugen.
C. Detektoren
Ein einziger Detektor wird derzeit zum Sammeln von Licht vom jeweiligen Beleuchtungsbereich auf der Probe verwendet.
Zwei oder mehr Detektoren können zum Sammeln von Licht vom jeweiligen Punkt verwendet werden, wobei zum Beispiel spektrale oder räumliche Unterschiede zwischen dem von den Detektoren empfangenen Licht bestehen. Die Emission von der Probe kann zum Beispiel von einem dichroitischen Strahlteiler, einem dispersiven Element, wie zum Beispiel einem Prisma, oder einem anderen Brechungselement, wie zum Beispiel einem Gitter in zwei oder mehr spektrale Bereiche aufgeteilt werden.
Bei dem bevorzugten Erfassungsverfahren wird ein Spiegel zum Ablenken von Licht von einem der beiden beleuchteten Punkte zu einem der Detektoren verwendet, während Licht von dem anderen beleuchteten Punkt ungestört zum anderen Detektor hindurchgelassen wird. In gewissem Sinn wird die Kante dieses Spiegels auf die Probe projiziert, wodurch diese in zwei sich nicht überlagernde "Erfassungs"-Bereiche aufgeteilt wird.
Es ist möglich, die Größe dieser Erfassungsbereiche zu verringern, indem Aperturen vor einem oder vor mehr Detektoren angebracht werden. Das Anbringen von solchen Aperturen macht aus dem vorliegenden System kein konfokales Mikroskop. Bei einem konfokalen Mikroskop ist eine dreidimensionale Abbildung möglich, weil Licht von unscharfen Bereichen der Probe abgewiesen wird. Dies geschieht durch gleichzeitiges diffraktionsbegrenztes Abbilden einer Punktquelle und eines Punktdetektors auf den gleichen Punkt auf der Probe; diese Bedingungen sind beim vorliegenden System nicht erfüllt.
4. Abbildungsmodi
Das vorliegende System ist zwar nominell für eine Epi-Beleuchtungs-Fluoreszenz-Abbildung konstruiert, doch sind auch eine Anzahl anderer Betriebsarten möglich. Diese Modi sind zum Beispiel Transillumination (Durchleuchtung), Dunkelfeld-, Hellfeld-, konfokale, interferometrische, Polarisations- und Differenz-Interferenz-Kontrast-Beleuchtung (DIC-Beleuchtung), sind auf diese jedoch nicht beschränkt.
Bei einem Epi-Beleuchtungssystem beleuchten die Quellenstrahlen die Probe durch die gleiche Linse, die auch zum Sammeln des Lichts zur Erfassung verwendet wird. Das vorliegende System kann in ein Durchleuchtungssystem verändert werden, indem die Probe von oben beleuchtet wird, während die Objektivlinse das resultierende Fluoreszenzlicht unterhalb der Probe sammelt. In gleicher Weise. kann die Probe auch von unten beleuchtet werden, während die Sammellinse über der Probe angebracht ist. Beim Durchleuchtungs-Fluoreszenzbetrieb kann der Teil des Beleuchtungsstrahls, der von der Probe durchgelassen wird, zu den Detektoren weitergelangen. Eine Trennung der Quellen- und Fluoreszenzsignale wird allgemein durch Spektralfilter erreicht, und Fehler in diesen Filtern (d.h. finite Sperrbereichs-Durchleuchtung) verringern dann das Signal-Rauschen-Verhältnis des Systems. Das vorliegende System verwendet einen neuartigen Strahlteiler mit einem kleinen Loch zum Hindurchlassen der Beleuchtungsstrahlen, während die einen größeren Durchmesser aufweisenden Erfassungsstrahlen hauptsächlich reflektiert werden. Bei einem Durchleuchtungssystem kann ein ähnliches Loch in einen Umlenkspiegel im Erfassungspfad angebracht werden, wodurch verhindert wird, daß hindurchgelassene Quellenstrahlen zu den Detektoren gelangen.
Das vorliegende System ist zum Untersuchen fluoreszenter Eigenschaften von DNA-Chips geeignet, wie zum Beispiel Bildern mit geringer Tiefenauflösung, womit bestimmt werden kann, welche Sequenz von Nukleotiden in der DNA-Probe vorhanden ist oder welche Gene über- oder unterexprimiert sind, was einfach dadurch geschieht, daß bestimmt wird, welcher Bereich des komplementäre DNA-Sequenzen enthaltenden DNA-Chips fluoreszent ist. Das vorliegende System kann aber auch einfach zum Untersuchen der Streueigenschaften dieser oder anderer Proben eingesetzt werden. Im Epi-Beleuchtungsmodus erlaubt eine Entfernung der Spektralfilter im Erfassungspfad (in den Erfassungspfaden) das Sammeln von Licht, das von der Probe reflektiert wurde (wenn auch Sorgfalt darauf verwendet werden muß, daß die reflektierten Quellenstrahlen auch wirklich zu den Detektoren gelangen und nicht durch das Loch im Strahlteiler entweichen). Dies ist auch bei der Durchleuchtung möglich, wobei die Hindurchlassung und das Vorwärtsstreuen des Lichts gemessen wird.
Mehrere andere Abbildungsmodi sind bei Modifikationen des vorliegenden Systems möglich. Wie oben erörtert, führt das Anbringen von kleinen Aperturen vor den Detektoren zusammen mit verkleinerten Beleuchtungspunkten zu einem konfokalen System. Hierdurch wird eine Abbildung dicker Objekte und eine dreidimensionale Abbildung möglich. Eine weitere Möglichkeit besteht in der Verwendung als Interferenzmikroskop (eine nicht fluoreszierende Verwendung), wobei die Objektivlinse dann einen Strahlteiler und eine Referenzoberfläche aufweisen muß. Hierdurch wird eine dreidimensionale Abbildung reflektierender Gegenstände möglich mit einer axialen Auflösung, die unter der Wellenlänge liegt. Es sind auch Polarisations- und DIC-Abbildungsmodi denkbar, wenn diese auch zusätzliche Komponenten des Systems benötigen würden.

Claims

Fluoreszenz-Scanmikroskop, – mit einer wenigstens zwei Anregungsstrahlen (B1, B2) abgebenden Beleuchtungseinrichtung (L1, L2), – mit einer die Anregungsstrahlen (B1, B2) über ein zu untersuchendes Objekt (12) scannenden Abtasteinrichtung (17), – mit einer Objektiveinrichtung (14), welche die Anregungsstrahlen (B1, B2) auf das Objekt (12) fokussiert, von den durch die Anregungsstrahlen (B1, B2) angeregten Objektpunkten (S1, S2) emittiertes Fluorenzlicht empfängt und je angeregtem Objektpunkt (S1, S2) eine paralleles Fluoreszenzlichtbündel (16, 18) erzeugt, – und mit einer Detektionseinrichtung mit jeweils einem Detektor (PMT 1, PMT 2) je Fluoreszenzlichtbündel (16, 18), der ausschließlich dieses Fluoreszenzlichtbündel (16, 18) registriert, gekennzeichnet durch – einen Strahlteiler, der als ein dem Querschnitt des durch die Objektivanordnung (14) aufgeweiteten Fluoreszenlichtbündels (16, 18) angepasster Parabolspiegel (100) ausgebildet ist, der in seinem mittleren Bereich ein Loch (102) aufweist, durch das die Anregungsstrahlen (B1, B2) auf das Objekt einfallen, und der die Fluoreszenzlichtbündel (16, 18) direkt auf den jeweils zugehörigen Detektor (PMT 1, PMT 2) fokussiert.