CN86106234A - 多潜能粒细胞集落刺激因子的生产 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了具有哺乳类动物(例如人)的多潜能粒细胞集落-刺激因子(“hpG-CSF”)的部分或全部一级结构构象和一种或多种生物学特性的新型的多肽，把编码hpG-CSF氨基酸残基序列或其同系物的部分或全部序列加到被用于转化或转录适当的原核生物或真核生物宿主细胞，本发明也公开了具有生物化学和免疫学特性的hpG-CSF的化学合成的多肽。

Description

本发明总的说来是关于造血生长因子和编码这些因子的多聚核苷酸。本项申请特别关系到哺乳类动物多潜能集落刺激因子，尤其是人的多潜能粒细胞集落刺激因子（hpG-CSF）、片断及其多肽类似物以及编码这些物质的多聚核苷酸。
人类造血系统补充各种白细胞（包括中性白细胞，巨噬细胞，和嗜碱细胞/肥大细胞），红细胞（红血球）和凝血细胞（巨核细胞/血小板）。普通男性的造血系统估计每年可产生大约4.5×1011个粒细胞和红细胞，相当于总体重的年替换量。Dexter等，BioEssays，2，154-158（1985）。
一般认为少量的某些造血生长因子使少数的前体“干细胞”分化成各种血细胞系，使这些系的大量增殖，并使这些系最后分化为成熟血细胞。由于造血生长因子是以极少量存在的，所以对这些因子的检测和鉴定依赖于一系列分析，这些分析仅是在人工条件下，根据对培养细胞的刺激效应，来区别不同的因子。结果杜撰出一大堆名称来指明为数少得多的因子，因而造成混乱，例如，如名称IL-3，BPA，多-CSF，HCGF，MCGF和PSF全都是acronyms，现在认为都是用来表示一种鼠的单一造血生长因子。Metcalt，Slienle，229，16-22（1985），关于各种鼠的生长调节糖蛋白还可参见Burgess，et    al。J.Biol.Chem.，252，1988（1977），Das，et    al.Blood，58，600（1980），Thle，et    al.，J.Zmmunol.，129，2431（1982），Nicola，et    al.，J.Biol.Chem.，258，9017（1983），Metcalf，et    al.，Int.J.Canler，30，773（1982），和Burgess，et    al.Int.J.Cancer，26，647（1980）。
应用遗传学重组技术使得这种混乱得到某种澄清。例如已经得到了人红细胞生成素的氨基酸和DNA序列它能刺激红细胞的生成（见，Lin，PCT    Published    Application    No.85/02610，published    June    20，1985）重组方法还可应用于人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的eDNA分离。参见Lee，et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.（USA），82，4360-4364（1985）和Wong，et    al.Slienle，228，810-814（1985）。关于鼠基因的克隆还可参见Yokota，et    al.Prol.Natl.Acad.Sci.（USA），81，1070（1984），Fung，et    al.，Nature，307，233（1984），和Gough，et    al.，Nature，309，763（1984），而关于人的M-CSF可参见KawasaRi，et    al.，Slieule，230，291（1985）。
人的造血生长因子，称做人的多潜能集落刺激因子（hpCSF）或叫phripoietin，（造血素？）已经证实存在于称作5637的人膀胱癌细胞系的培养基中，并在特定的条件下用美国型培养收集器保存，Rockville，Marylanol作为A、T、C、C、保存号NO.HTB-9已报导在用人骨髓的祖细胞的实验中。由这种细胞系中提纯的hplSF能刺激多潜能祖细胞的增殖和分化，从而形成各种主要的血细胞。Welte等，Proc.Natl.Acaol.Sci（USA），82，1526-1530（1985）。所用的hpCSF的纯化方法：（NH4）2SO4沉淀;阴离子交换层析（DEAE纤维素，DE52）;凝胶过滤（AcA54柱）;和C18反相高效液相层析法。鉴定为hpCSF的蛋白质，它是在C18反相HPLC（HPLC-即高效液相层析的缩写）洗脱部分的二个活性峰中的第二峰中被洗脱出来的，用十二烷基磺酸钠（SDS）-聚丙酰胺凝胶电泳（PAGE），用银染色法测定的。已报告它具有的早期报告hpCSF有一个等电点为5.5〔Welte，at al.，J.Cell.Biochem.，Supp 9A，116（1985）〕，对小鼠粒白血病细胞系WEHI-3BD+有很高的分化活性〔Welte，et al.，UCLA Symposia on Molecular和Cellwlar Biology，Gale，et al.，eds.，New Series，28（1985）〕。初步的研究表明，鉴定为hpCSF的因子，当在对人CFU-GM试验中的头七天时具有突出的粒细胞集落-刺激活性。
另一个叫做人CSF-β的因子，也已从人膀胱癌细胞系5637中分离出来，并已作为鼠的125Ⅰ标记的粒细胞集落-刺激因子（G-CSF）结合WEHI-3B D+细胞的竞争剂，与未标记的鼠G-CSF有相同的剂量-反应关系〔Nicola，et al.，Nature，314，625-628（1985）〕。以前曾报告这种剂量-反应关系是未标记的鼠G-CSF所特有的，而如M-CSF，GM-CSF，或多-CSF等因子并不具有这种关系。〔Nicola，et al.，Proc.Natl.Acad，Sci.（USA），81，3765-3769（1984）〕。CSF-β和G-CSF在CSF因子中也是独特的，它们诱导WEHI-3B D+细胞分化的能力都很高。Nicola，et al.，lmmnnology Today，5，76-80（1984）。在高浓度时，G-CSF刺激混合的粒细胞/巨噬细胞集落形成细胞〔Nicola，et al.，（1984）supra〕.，hpCSF与人骨髓一起培养14天后出现粒细胞、单核白细胞、混合的粒细胞/单核细胞以及嗜酸细胞集落这一初步结果与上述观点相吻合。还介绍了CSF-β在用小鼠骨髓细胞的试验中能刺激中性白细胞和粒细胞集落的形成，对鉴定象G-CSF这样的因子此特性已成为标准。基于这些共同点，已用G-CSF（粒细胞集落刺激因子）鉴定人类CSF-β。Nicola    et    al.，Nature，314，625-628（1985）。
基于他们的共同特性，看来Nicola等“supra”的人CSF-β和Welte等（supra）的hpCSF是同一种因子，恰可归之为人的多潜能粒细胞集落刺激因子（hpG-CSF）。鉴于已报导过的鼠的G-CSF在“相当正常浓度”时，完全抑制体外WEHI 3B D+白血病细胞群的能力和鼠G-CSF粗制注射剂抑制鼠的移植髓样白血病的能力，hpG-CSF特征的确定和重组生产将是特别需要的。
参见Metcalf，Slience，229，16-22（1985）。也可见Sachs，Scientific    American，284（1），40-47（1986）。
可以证明hpG-CSF在治疗上是有效的，因此需要有商业规模的用量，从细胞培养物中分离的方法不大可能提供一合适的材料来源。例如，值得注意的是人肿瘤细胞库在商业上使用就会出现局限性，就象，人膀胱癌细胞系5637（A.T.C.C.HTB9），它已被报告用做天然的hpCSF分离物的来源，Welte，et    al（1985，supra）。
根据本发明，提供了编码全部或部分hpG-CSF的DNA序列。这些序列可包括：用选定的非哺乳类动物的宿主，掺入表达“优选的”密码子;提供限制性核酸内切酶切割位点;提供附加的起始的、终止的或中间的DNA序列，这些序列便于构建易表达的载体。本发明还提供了为hpG-CSF的多肽类似物或衍生物的微生物表达编码的DNA序列，这些物质在一种或多种氨基酸残基的特性和定位上区别于天然存在的形式（即含有少于hpG-CSF所特有的全部残基的缺失类似物;取代类似物，譬如〔Ser17〕hpG-CSF，其中特有的一个或多个残基被别的残基取代;和其它的类似物，其中在多肽的末端或中间部分加一个或多个氨基酸残基），而它们具有天然存在型的某些或全部特性。
本发明中新的DNA序列包括：在原核的或真核的宿主细胞中用于安全表达多肽产物的序列，这些多肽产物至少具有天然存在的多潜能粒细胞集刺激因子中的部分一级结构的构型和一种或多种生物学特性。本发明的DNA序列可特别看出包括：（a）陈述在表Ⅶ和表Ⅷ中的DNA序列或是他们的互补链;（b）一种DNA序列，它能与另一些DNA序列（见表Ⅶ）或片段杂交（在如同此处所说明的杂交条件下或在更严格的杂交条件下）（c）一种DNA序列，如果没有遗传密码简并，它会杂交到表Ⅶ的DNA序列上。在（b）部分中特别包括一个基因组DNA序列，能编码hpG-CSF的等位变异型和/或能编码其他种属哺乳类动物的多潜能粒细胞集落刺激因子。在（c）部分特别包括一个人工的DNA序列，它能编码hpG-CSF、hpG-CSF片段和hpG-CSF类似物;这些DNA序列可掺入便于mRNA在微生物宿主中翻译的密码子。按照Alton等的方法（pCT    published    application    WO    83/04053）。可很容易地制备这些人工DNA序列。
本发明还包括一类多肽，它能被部分DNA
Figure 86106234_IMG1
体编码到顶束人的cDNA上或基因组DNA序列（见表Ⅶ和Ⅷ）上，即“互补倒转蛋白”如Tramontuno等所述，Nucleic Acids Res.，12，5049-5059（1984）。
本发明提供纯化和分离的多肽产物，产物具有天然存在的hpG-CSF（包括其等位变异体）的部分或全部的一级结构构型（即氨基酸残基的连续序列），和一种或多种生物学特性（例如：免疫特性和体外生物学活性），和物理特性（例如分子量）。这些多肽也可通过下列产物定性;化学金合成的产物;由基因组成CDNA克隆，或基因合成得到的外源性DNA序列的原核或真核生物宿主表达（例如：用细菌，酵母，高等植物，昆虫，培养的哺乳动物细胞等）的产物。
典型酵母（例如Sallapomyces    cerevisiae）或原核〔例如：Escherichia    coli（E.coli）〕宿主细胞的产物是不与任何哺乳类动物的蛋白质结合的。在脊椎动物（例如除人外的哺乳类动物和鸟类）细胞中的微生物表达的产物也不与任何人类蛋白结合。根据所使用的宿主，本发明的各种多肽可以同哺乳类动物的糖或其它真核生物的糖类发生糖基化作用，也可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括一种起始的甲硫氨酸残基（在-1位上）。
本发明还包括药物成分，它含有有效量的本发明的多肽产物，并配有适量的稀释剂、辅料和/或hpG-CSF用于治疗的载体。
本发明的多肽产品可以通过结合可探测的标志物（例如用125Ⅰ作放射标记）。标记，以提供一试剂，用于在固体组织和液体样品（例如，血或尿）中对人类hpG-CSF检测和定量。本发明的DNA产品也可用可探测的标志物、标记（例如放射标记和非同位素标记，如生物素标记），产品还可用在DNA杂交过程，以确定人类hpG-CSF基因定位和/或在染色体图谱中的任何有关基因簇的定位。这些产品还可用来在DNA水平上鉴定人类hpG-CSF基因异常，以及用作基因标志物来鉴定邻近基因及其异常。
本发明的多肽产品可以单独使用，也可与其它造血因子或与治疗造血异常（例如再生障碍性贫血）的药物联合使用。这些产品还可用于治疗由于化疗或放疗而引起的造血细胞不足。举例来说，骨髓移植的成功可能由于应用hpG-CSF而加强。医治烧伤和治疗细菌感染也可能由于应用hpG-CSF收益。此外，基于hpG-CSF分化白血病细胞的能力，可用于白血病的治疗。Welte，et    al.，Proc.Natl.Acaol.Sci（VSA），82    1526-1530（1985）和Sachs，（见前）。
根据以下详细描述本发明的许多方面和众多优点对于工艺熟练者将是明显的，这些描述提供了在目前更为具体地实施本发明的说明。
附图是hpG-CSF基因的部分限制性核酸内切酶图，并用箭头符号画出为得到基因组序列所用的测序方案。
根据本发明，对于部分或全部hpG-CSF多肽序列进行编码的DNA序列已被分离出来并做了定性。
列出的以下实例是为了解释本发明，并特别指导在hpG-CSF    cDNA和基因组克隆的鉴定之前所实行的操作步骤，进行这种鉴定的步骤，以及定序列的步骤，根据cDNA、基因组和人工基因建立表达系统并证实在这种系统中表达hpG-CSF产品和类似物产品。
尤其，例1是指导hpG-CSF的氨基酸确定序列的。例2是指导为菌落杂交筛选而制备cDNA库。例3是关于杂交探针的构建。例4是关于杂交筛选，阳性克隆的鉴定，阳性cDNA克隆的DNA定序以及多肽一级结构构型（氨基酸序列）信息的产生。例5是指导编码hpG-CSF的基因组克隆的鉴定和序列分析。例6是指导建造编码hpG-CSF的人工基因，其中使用了E.coli优选的密码子。
例7是指导为构建掺入hpG-CSF-编码DNA的E.coli转化载体的步骤，在hpG-CSF的原核生物的表达中使用运载体，以及本发明的重组产品的特性分析。例8是指导生产hpG-CSF类似物的程序，其中半胱氨酸残基通过编码hpG-CSF的DNA诱发突变被其它合适的氨基酸所替换。例9是指导构建一种掺入由阳性cDNA克隆产生的hpG-CSF类似物-编码DNA的运载体，使用这种运载体转染COS-1细胞，以及培养转染细胞生长的程序。例10是关于本发明重组多肽产物的物理学的和生物学的特性。
实例1
（A）用文献方法提供的材料的定序
hpG-CSF样品（3-4微克，85-90%纯的SDS，银染料-PAGE）是从纽约Sloam    Kettering研究所得到的，是按照Welte等人的方法〔Proc.Natl.Acaol.Sci.（USA），82，1526-1530（1985）〕分离和纯化的。
用AB407A型气相序列仪（Applied    Biosystems，Foster    City，Calitornia）用微量序列分析方法在运行＃Ⅰ中测定了这种hpG-CSF样品的N-末端的氨基酸序列下面的表Ⅰ列出所得序列资料。在表Ⅰ至表Ⅳ中使用的是单字母的字符“X”是指不能明确测定的残基，括弧内的残基仅是可更换的或是暂定的。
表Ⅰ
1    5    10    15
K-P-L-G-P-A-S-K-L-K-Q-（G.V.S）-G-L-X-X-X
在每一个运行循环里都出现有高的本底，对此结果已列于在表1中，这表明样品含有许多污染的成份，可能是由纯化过程产生的化学残基形式的杂质。保留此序列仅作为参考用。
在运行＃2中，第二个样品（5～6微克，约95%纯度）如在运行＃1中一样是得自Sloan    kettering，定序列的操作步骤也如同运行＃1中所使用的。本样品与Welte等〔Proc.Natl.Acad.Sci（USA）82，1528-1530（1985）〕的图4使用的材料是同一批。结果列于表Ⅱ。
表Ⅱ
尽管鉴定出了较多个残基，但运行＃2并设有提供足够的长和明确的序列，由此序列可以制造相当数量的探针，用来研究hpG-CSF    DNA。已计算过若想根据表Ⅱ的序列分出cDNA，则至少需要1536枚探针。再有，样品的污染是个问题。
据此，第三个样品（3～5微克，～40%纯）同上面一样是得自Sloam    Kettering。这个制剂当用SDS-PAGE分离以后又做了电印迹（electroblot），以进一步纯化。此样品的序列分析没有得到数据。
（B）用修正方法提供的材料的定序
为了得到足够量的纯物质以进行合适的确定氨基酸序列的分析，从E.Platzer博士处得到如在Sloam-Kettering所生产的。膀胱癌细胞系5637（亚克隆1A6）的细胞。将细胞放在烧瓶中，最初用Lscove′s培养基（GIBCO，Grand Island，New York）培养使细胞融合。当融合后，将培养物用胰酶消化并接种到滚动瓶中（1～ 1/2 烧瓶/瓶），每瓶含25毫升预先在5%CO2下处理过的Zscove培养基。在37℃和0.3rpm条件下细胞生长过夜。
用以下步骤将Cytodex-1珠（Pharmacia，leppsala，瑞典）进行洗涤和灭菌。将8克珠子装入瓶中，再加入400毫升PBS。缓慢涡旋3小时，将珠悬浮起来。让珠沉降下来以后，倒出PBS，将珠子用PBS漂洗，再加入新鲜的PBS。将珠子用高压锅消毒15分钟。使用之前，将珠子再放在Islove培养基加10%胎牛血清（FCS）中洗涤，然后再加入新鲜的培养基加10%FCS以便得到处理过的珠子。
使每一个滚动瓶中保留30毫升的培养基，其余的都倒出，再向每个瓶中加入30毫升新鲜的培养基，加10%FCS和40毫升处理过的珠子。将5%CO2气通入瓶中，并用抽气法除去所有的气泡，将瓶子放在滚动架上以每分钟3转的速率滚动半小时，然后再把速度降到每分钟0.3转。3小时后，将另一瓶进行胰酶消化并加入到每一个内含珠子的滚动瓶中。
当40%到50%融合时，用50毫升PBS洗涤滚动瓶中的培养物，涡旋10分钟，再除去PBS。将细胞放在培养基A〔Lscove培养基，内含0.2%FCS，10-8摩尔氢化可的松，2毫摩尔谷酰胺，100单位/毫升青霉素，和100微克/毫升链霉素〕中培养48小时。然后，在3000rpm下离心15分钟，收集培养物的上清液，在-70℃贮存。培养物再用内含10%FCS的培养基A孵育，并培养48小时。当除去培养基之后，如前用PBS洗涤细胞并放入培养基A中培养48小时。再收集上清液并用以前所介绍的方法处理。
将大约30升用1A6细胞处理过的培养基浓缩至约2升，使用微孔薄膜，配有2块分子量为10，000的Cutoffs，滤速约为200毫升/分。保留速率约为1000毫升/分。使用同样的仪器和同样的流速。用约10升50毫摩尔Tris（PH7.8）将浓缩液进行透析过滤。将经过透析过滤的浓缩液以40毫升/分速度加到1升的DE纤维素柱上，柱已在50毫摩尔Tris（PH7.8）中平衡。上样后，将柱子用1升50毫摩尔的Tris（PH7.8）以同样的流速冲洗，再用2升带有50毫摩尔Nall的50毫摩尔的Tris（PH7.8）冲洗。然后将柱子用六份1升的50毫摩尔Tris（PH7.5）溶液顺序洗脱，这些溶液中分别含有以下浓度的NaCl：75mM;100mM;125mM;150mM;200mM;和300mM。收集各部分洗脱液（各50毫升）。合并活性部分并在Amicom超滤搅拌池装置（配有YM5的膜）上浓缩至65毫升。把此浓缩液加到2升AcA54预先用PBS平衡凝胶过滤柱上。以80毫升/小时速率过柱，以每份10毫升进行收集。合并活性部分并直接加到C4的高性能液相色谱（HPLC）柱上。
样品的体积范围从125毫升至850毫升，内含1～8毫克蛋白质，样品中约有10%的hpG-CSF，将此样品上柱，流速范围为每分钟从1毫升至4毫升。上样后，用0.1摩尔醋酸铵（PH6.0-7.0）在80%2-丙醇中的溶液开始冲洗，流速为1毫升/分。以每份1毫升收集，并分别在220nm，260nm和280nm处检测蛋白质。
纯制结果，含hpG-CSF的部分已被彻底与其它含蛋白的部分分开（80份中的第72和73部分）分离出的hpG-CSF（150～300微克）纯度约为85±5%，产率约为50%。在运行＃4中使用了这种纯化了的物质9μg，在做氨基酸序列分析时将蛋白质样品加到TFA-活化的，没有polybrene的玻璃纤维圆盘上。用AB470A序列仪做序列分析，方法按照Hewick，et    al.，J.Biol.chem.，256，7990-7997（1981）和Lai，Anal.Chim    Acta，163，243-248（1984）。运行＃4的结果见表Ⅲ。
表Ⅲ
1    5    10
Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser-Leu-Pro-
15    20
Gln-Ser-Phe-Leu-Leu-Lys-（Lys）-Leu-（Glu）-Glu-
25    30
Val-Arg-Lys-Ile-（Gln）-Gly-Val-Gly-Ala-Ala-
Leu-X-X-
在运行＃4中，超出31的循环（相当于表Ⅲ中残基31）没有得到更明显的序列信息。为了得到一个更长的明确的序列，在运行＃5中，将14微克由处理过的培养基中纯化的hpG-CSF用10微升β-巯基乙醇在45℃的条件下还原一个小时，然后真空下彻底干燥。然后将蛋白质残渣再溶解于5%甲酸中，再加到polybrenized玻璃纤维圆盘上。用上面运行＃4同样的方法做序列分析。运行＃5的结果见表Ⅳ。
表Ⅳ
1    5    10
Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser-Leu-Pro-
15    20
Gln-Ser-Phe-Leu-Leu-Lys-Cys-Leu-Glu-Gln-
25    30
Val-Arg-Lys-Ile-Gln-Gly-Asp-Gly-Ala-Ala-
35    40
Leu-Gln-Phe-Lys-Leu-Gly-Ala-Thr-Tyr-Lys-
45
Val-Phe-Ser-Thr-（Arg）-（Phe）-（Met）-X-
对于infra中所述制备hpG-CSF    CDNA所需探针的建立来说，表Ⅳ中的氨基酸序列是足够长（44个残基）和肯定的。
例2
在分离CDNA的有意义序列标准步骤中，制备一个质粒CDNA库，此库来自于根据靶基因表达而筛选的供体细胞中大量存在的反转录mRNA。此处多肽氨基酸序列的重要部分是已知的，标记的单链DNA探针序列与被认为存在于“靶”cDNA上的序列配对可以用于DNA/DNA杂交过程，此过程是在已变性成单链形式的cDNA的克隆拷贝上进行的。Weissmom，et    al.，U.S.Patant    NO.4，394，443;Wallace，et    at.，Nucleic    Acids    Res.，6，3543-3557（1979），和Reyes，et    al.，Proc.Natl.Acad.sci.（USA），79，3270-3274（1982），和Jaye，et    al.，Nucleic    Acids    Res.，11，2325-2335（1983）。关于用作诊断的DNA/DNA杂交过程还可参见Falkow等人的U.S.专利NO.4，358，535。关于集落和噬菌斑杂交技术可参见Davis等人的“遗传工程手册，细菌遗传学进展”，Cold    Spring    Harbor实验室，Cold    Spring    Harbor，N.Y.（1980）pp.55-58和174-176。
总RNA是从大约1克的膀胱癌细胞系5637（1A6）的细胞中抽提出来的，为了定量的分离完整的RNA采用了硫氰胍方法〔Chirgwin，et    al.，Biochemistry，18，5294-5299（1979）〕。
无菌RNA水溶液含有从1A6细胞中制得的总RNA。为了从总RNA溶液中只得到信使mRNA，RNA，使溶液通过含有寡脱氧胸苷酸的柱子〔oligo（dT）〕（Collaborative Research，Inc.，Waltham，Massachusetts.）当洗脱核糖体的RNA时，有信使RNA特征的多聚-腺苷酸（poly-A+）尾部附着在柱子上。本方法的结果，分离出大约90微克多聚-腺苷酸信使RNA（poly-A+mRNA）。在用于cDNA反应之前用氢氧化甲基汞（Alpha Ventron，Danvers，Massachusetts）将分离出的poly-A+信息RNA进行预处理。氢氧化甲基汞最终浓度为4毫摩尔，在室温下处理5分钟。氢氧化甲基汞处理使得信息RNA无论与其本身，或是与抑制转录的杂质分子之间的相互作用失活。Payvar，et al.，J.Biol.chem.，258，7636-7642（1979）。
根据Okayama的方法〔Okayama，et    al.，Molecular    Cellular    Biology，2，161-170（1982）〕，用从1A6细胞中得到的mRNA制备了一个cDNA库。然后cDNA通过孵育转化到宿主微生物E.colik-12菌株HBlOl中扩增。
例3
根据表Ⅳ的hpG-CSFN末端序列设计的杂交探针是由一组24个寡核苷酸组成，每个长度为23个硷基，并含有三个次黄嘌呤核苷残基。寡核苷酸探针是按照Caruthers等人的方法制造的，Cenetic    Engineering，4，1-18（1982），并用r-32P    ATP通过多聚核苷酸激酶作用来标记的寡核苷酸探针相当于表Ⅳ中23-30残基序列的mRNA，详见表Ⅴ。
表Ⅴ
hpG-CSF    Probes
5′GC IGC ICC
Figure 86106234_IMG3
Figure 86106234_IMG4
TT3′
把次黄嘌呤核苷定为中性是基于Takahashi等和Ohtsuka等已发表的工作〔Takahashi，et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci（USA），82，1931-1935（1985）和Ohtsuka.et    al.，J.Biol.chem.，260，2605-2608（1985）。但是，若次黄嘌呤核苷与G或T配对时，则此硷基也可能有不稳定的效应。在Takahashi等人的方法中，次黄嘌呤核苷可以似乎有中性的效应，因为它们做为一个基因平均起来接近中性（例如，有利于与C配对的有三个和不利于与T配对的有二个）。
为了试验I硷基有与G硷基配对的效应，采用N-myc基因序列和克隆来设计对照实验。从N-myc基因中所选择的序列在每个密码子的头两个位置上具有hpG-CSF探针所规定的全部相同的G和C成分。所以如同hpG-CSF探针一样，N-myc的测试探针都是长度相同，所含的I是在同样的相对位置上，并可能具有相同的平均Tm（62～66℃，不计算所包括的3个或4个次黄嘌吟核苷残基）。
按照Charuthers等（Supra）的方法构建了两组N-myc的试验探针。第I组，如在表Ⅵ中所说明的包括：1.23个碱基个体有理想的匹配;2.其中三个第3位的C用I置换，对于添加I产生最不利的可能情况;3.其中四个第3位的C用I置换。第二组测试探针设计成代表次黄嘌呤碱基对更杂乱的分配，这样可能得到一个整个中性的碱基配对效果。第Ⅱ组，如在表Ⅵ中所说明的，包括：4.含有两个I，它们将与C配对，一个与G配对;5.与4相同，外加多于一个I：G硷基对。
表Ⅵ
N-myc试验探针
1.5′CAC AAC TAT GCC GCC CCC TCC CC3′
2.5′CAC AAC TAT GCI GCC CCI TCI CC3′
3.5′CAI AAC TAT GCI GCC CCI TCI CC3′
4.5′AAC GAG CTG TGI GGC AGI CCI GC3′
5.5′AAI GAG CTG TGI GGC AGI CCI GC3′
五个复制滤膜，内含N-myc    DNA序列和鸡的生长激素DNA序列（做为空白对照）在杂交之前放入真空炉中在80℃下烘烤2小时。将所有的滤膜进行杂交，如例4中用于hpG-CSF探针的方法相同，但杂交时间只有6小时。滤膜在室温下洗涤三次，再在45℃下洗一次，每次10分钟。用Geiger计数器检测滤膜。
代表N-myc探针3的滤膜比其它四种探针的滤膜给出的信号更弱，并不能再进一步洗涤。在50℃10分钟洗涤以后，Geiger计数器给出如下的百分信号，用常规探针的为100%，探针2.20%;探针3（45℃），2%;探针4.92%;探针5.75%;在55℃下洗涤以后，其百分数是：探针2.16%;探针4.100%;和探针5.80%。在60℃最后洗涤产生以下的百分数：探针2.1.6%;探针4.90%;和探针5.70%。
因此，有三个I出现时，象在探针2和4中，当接近理论Tm（I末包括在计算值内）时，观察到在信号上有高达60倍的差别，〔根据不利情况的I碱基对（探针2）和相对中性的I硷基对（探针4）〕。
由N-myc试验杂交所获得的标准化信息被用于hpG-CSF杂交的洗涤和检测（如下所表明的那样）中测量不够严格的洗涤结果可能被接受时的可靠程度。
例4
按照Hanahan，等人的方法，J.Mol.Biol.，166，557-580（1983），将含有用cDNA嵌入重组物的细菌（如在例2中所制备的）涂布在平放于琼脂平皿上的24张硝酸纤维素滤膜上（微孔滤膜，Bedford，Massachusetts）。再把平皿孵育以形成大约150，000个菌落，将其再复制到另外的24张硝酸纤维素滤膜上。培育复制膜直到出现明显的菌落。将滤膜上的细菌在用氢氧化钠（0.5摩尔）饱和10分钟到几张Whatman3号滤纸上溶菌，再用Tris（1摩尔）吸印2分钟，然后再用内含NaCl（1.5摩尔）的Tris（0.5摩尔）吸印10分钟。当滤膜接近干时放在真空炉中在80℃下烘烤2小时。再进行核酸杂交。〔Wahl，et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci（USA），76，3683-3687（1979）〕和Maniatis，et    al.，Cell，81，163-182（1976）。
在750毫升10×Denhardt′s0.2%SDS和6×ssc中，在65℃下将滤膜预杂交2小时。滤膜经6×ssc漂洗，一袋放4片，在6×ssc和10×Deuharolt内杂交14小时。每袋约有15毫升溶液，内含50×106cpm的32P-标记的探针（寡核苷酸）。
杂交以后，在室温下将滤膜放在6×ssc中洗涤三次（1升/洗涤），每次10分钟。再把滤膜放在45℃下洗两次，每次15分钟，在50℃下洗一次，15分钟，在55℃下洗一次，15分钟，共用1升体积的6×ssc。把滤膜使用一种增感屏和柯达XAR-2胶片。进行放射自显影，-70℃，2小时，在这种放射自显影图上，有40～50个检测出来的阳性信号，包括5个非常深的信号。
将含有最强的五个信号的区域和另外五个阳性区域从主平皿上刮下来再铺板，使用同样的探针混合物，在同样的条件下进行第二次筛选。洗涤方法有些不同，即高温洗涤包括在55℃两次，每次15分钟，再在60℃一次，15分钟。基于例3的对N-myc探针的研究，在第二次筛选上中最后的洗涤温度提高了，因为对于24，23聚合体来说聚集物的解链温度是60～68℃，与N-myc探针相同。就在第二个55℃洗涤之后，滤膜还是潮湿时进行放射自显影。将此放射自显影图与第二张同时进行而最后在60℃下洗涤的放射自显影图作比较，表明在受测试的10个克隆中当温度从55℃升至60℃后只有2个在信号上没有受到重大损失。以后将表明这两个克隆有接近一致的长度和限制性核酸内切酶的图谱。标明为PPO2的一个克隆被选作测定序列。
由上面方法所得到的重组物hpG-CSFcDNA克隆，pPO2，的序列是用Sanger等的双脱氧方法完成的，Sanger，et al.，Proc Natl.Acad.Sci.（USA）74，5463-5467（1977）。用单链的噬菌体M-13DNA作为克隆载体，提供来自双链cDNA克隆的单链DNA模板。Sanger等的方法揭示了此序列，如表Ⅶ中的第四组，并附有它氨基酸转录和在多肽编码区的互补链。
表Ⅶ（见下页）
需要指出表Ⅶ中序列的以下特征。在序列的5′端存在相应于多聚GcDNA连接物的碱基。随之出现约5个硷基（用“N”表明），由于前面含有多个G，所以用Sanger等人的方法不容易准确地测出它们的序列。其后展现的是12个密码子为一组的序列，这些密码子编码被认为是多肽的引导序列。根据在例1中所叙述的与天然hp-CSF分离物相应的氨基末端的序列，被认为是hpG-CSF的“成熟”型的起始苏氨酸残基，用+1表示。成熟的hpG-CSF后来被揭示为含有174个残基（如所示）。后面的“终止”密码子（OP密码子，TGA）是大约856个碱基，一种不能转译的3′序列和多聚A“尾”的多个A。特殊的HgiAi，和ApaⅠ限制性内切酶识别的位点，以及两个stuⅠ的位点（后面讨论关于建造原核生物的和真核生物的表达系统）也都在表Ⅶ中指明了。由于在多肽中缺少天冬酰胺残基，所以对于N-糖基化作用没有明显的位置。靠近3′未译序列的末端处下面划线的6个残基代表潜在的多聚腺苷酸作用的位点。
Figure 86106234_IMG5
Figure 86106234_IMG6
值得注意的是，用如上所述杂交方法从总数为450，000个克隆中鉴定的两个附加的cDNA克隆不包含从转录的起始位置向前编码整个引导序列的DNA。的确，所有三个hpG-CSF克隆都准确地在相同位置上终止在5′区域，这表明转录的mRNA的二级结构严重地防碍着cDNA形成越过此位置。因此，当实际操作时，筛选cDNA的表达，正如Okayama等所述〔Okayama，et    al.，Mol.and    Cell.Biol.，3，280-289（1983）〕和woag等人实际上用于分离GM-CSF的方法〔Wong，et    al.，Science，228，810-814（1985）〕并不能很容易地应用于分离hpCSFDNA，因为这样的分离系统通常依赖于在所分析的克隆中存在有足够长的cDNA转录本。
上面的序列在细菌宿主中可靠的直接表达hpG-CSF是稳定的。为了保证这种表达，应用起始密码子ATG提供hpG-CSF的编码区，并在合适的启动子/调节子DNA序列控制下把序列插入到转化载体的一个位点上。
例5
在此例中，编码hpG-CSF的cDNA（如同在前面的例子中所分离出的）被用于筛选一个基因组克隆。λ-噬菌体的人胎儿肝脏基因组库〔按照Lawn等人的方法制备的。Cell，15，1157-1174（1978）并从T.Maniatisl处得到〕用一个缺口转移的探针来筛选，探针是由两个用HgiAl和Stul消化而分离出来的hpG-CSF    cDNA片段组成，（HgiAI    to    stuI，649    b.p.i    stuI    to    stuI，639b.p.）。将总数约为500，000的噬菌体涂在12个（15厘米）Petri培养皿上，取出噬菌斑，并用Benton/Davison的方法与探针杂交〔Benton，et，al.，Science，196，180（1977）〕。观察到总共12个阳性克隆。在二级筛选中，基于放射性自显影产生最强信号的三个克隆（1-3）使之生长在1升的培养基中，并用限制性酶消化制图，并用放射性标记的24个-寡核苷酸（带有γ-32P ATP的激酶）5′CTGCACTGTCCAGAGTGCACTGTG3′做Southern印迹。图谱结果表明分离物1和3都是相同的，而分离物2含有2000附加硷基5′到hpG-CSF基因上。因此，克隆2被用来做进一步鉴定。由克隆2得到的DNA用Rl进行消化以释放出一个8500 bp hpG-CSF，内含的片段随后亚克隆到p BR322上并进一步用限制性核酸内切酶消化绘图，Southern印迹，M13亚克隆和定序列。所得到的序列如在表Ⅷ中所列出的。
表Ⅷ（见下页）
Figure 86106234_IMG8
Figure 86106234_IMG9
Figure 86106234_IMG10
Figure 86106234_IMG11
在图1中详细介绍了含有hpG-CSF基因的基因组DNA的限制性核酸内切酶图（大约3.4Kb）。在图1中所示的限制性内切酶有：NcoⅠ，N;PstⅠ，P;BamHⅠ，B;ApaⅠ，A;XhoⅠ，X;和Kpn，K。图下的箭头表出了用以获得基因组序列的定序列步骤。在cDNA克隆中发现有盒区，用带虚线的打开末端的小盒代表不存在于cDNA克隆中的序列，用探测mRNA印迹的方法鉴定。为外显子检的编码序列作鉴定。应用Northern印迹分析法24链节的寡核苷酸探针，5′CAGCAGCTGCAGGGCCATCAGCTT3′，跨越外显子1和2预定的切接处，以Northern印迹的方式杂交到hpG-CSFmRNA上。产生的印迹显示mRNA与用外显子2寡核苷酸探针所见到的有同样大小（～1650个硷基对）。这个数据结合hpG-CSF的直接表达能力定出在外显子1所含的编码顺序，而hpG-CSF来自psvGM-PPO1载体（例9）采用表Ⅷ中所表明的Met甲硫氨酸起始密码子。外显子2-5是由hpG-CSF基因（表Ⅶ）的cDNA克隆（PPO2）所得到的编码序列确定的。
例6
本例是关于制备一种人工基因，它能编码hpG-CSF并含有E.coli优选的密码子。
简单来说，所使用的方案大体上与共同所有人Alton等在专利公开中所设计的一样，PCT    Publication    No.WO83/04053，再加在此处作为参考。设计基因是为了把寡核苷酸成分先组合成复合的双倍体，再依次组装成三个独立的片段。这些片段的设计为了易于扩增，当它们从扩增体系中移出时，能按顺序组合或通过多片段连结组合在适宜的表达载体中。
在表Ⅸ到ⅩⅣ中说明了段Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的建造。段Ⅰ的建造，如在表Ⅸ和Ⅹ中说明的，将寡核苷酸1-14组合成7个复体（1和8;2和9;3和10;4和11;5和12;6和13;7和14）。然后连接7个复体形成段Ⅰ，如表Ⅹ所示。还应指出的是在表Ⅹ中段Ⅰ包括一个上流的XbaⅠ粘性末端和一个下流的BamHⅠ粘性末端，这对连接到扩增和表达的载体上以及对于连接到段Ⅱ上都是有用的。
表Ⅸ
EChpG-CSFDNA    SECTION    I
CTAGAAAAAACCAAGGAGGTAATAAA    1
TAATGACTCCATTAGGTCCTGCTTCTTCT    2
CTGCCGCAAAGCTTTCTGCTGAAATGTCTGG    3
AACAGGTTCGTAAAATCCAGGGTGACGGT    4
GCTGCACTGCAAGAAAAACTGTGCGCTA    5
CTTACAAACTGTGCCATCCGGAAGAGC    6
TGGTACTGCTGGGTCATTCTCTTGG    7
CATTATTTATTACCTCCTTGGTTTTTT    8
GCAGAGAAGAAGCAGGACCTAATGGAGT    9
TGTTCCAGACATTTCAGCAGAAAGCTTTGCG    10
CAGCACCGTCACCCTGGATTTTACGAACC    11
TAAGTAGCGCACAGTTTTTCTTGCAGTG    12
ACCAGCTCTTCCGGATGGCACAGTTTG    13
GATCCCAAGAGAATGACCCAGCAGT    14
Figure 86106234_IMG13
如表Ⅺ和表Ⅻ中所述，在建造段Ⅱ时，是把寡核苷酸15-30组合成8个复体（15和23;16和24;17和25;18和26;19和27;20和28;21和29;22和30）。再将这8个复体连接起来以形成段Ⅱ，如在表Ⅻ中所示。如在表Ⅻ中进一步表明的那样，段Ⅱ有一个上流的BamHⅠ粘性末端和一个下流的EcoRⅠ粘性末端，这对于连到扩增载体上或是对于连接到段Ⅰ上都是有用的。在其下流端附近，段Ⅱ还含有一个下流的SstⅠ位点，这对最终段Ⅱ和段Ⅲ的连接是有用的。
表Ⅺ
ECHpG-CSFDNA    SECTION    Ⅱ
GATCCCGTGGGCTCCGCTGTCTTCT    15
TGTCCATCTCAAGCTCTTCAGCTGGC    16
TGGTTGTCTGTCTCAACTGCATTCTGGT    17
CTGTTCCTGTATCAGGGTCTTCTG    18
CAAGCTCTGGAAGGTATCTCTCCGGA    19
ACTGGGTCCGACTCTGGACACTCTGCA    20
GCTAGATGTAGCTGACTTTGCTACTACT    21
ATTTGGCAACAGATGGAAGAGCTCAAAG    22
GACAAGAAGACAGCGGAGCCCACGG    23
ACCAGCCAGCTGAAGAGCTTGAGATG    24
ACAGACCAGAATGCAGTTGAGACAGACA    25
CTTGCAGAAGACCCTGATACAGGA    26
CAGTTCCGGAGAGAGATACCTTCCAGAG    27
TAGCTGCAGAGTGTCCAGAGTCGGACC    28
AAATAGTAGTAGCAAAGTCAGCTACATC    29
AATTCTTTGAGCTCTTCCATCTGTTGCC    30
最后，段Ⅲ的建造如在表ⅩⅢ和ⅩⅣ中所示。为了这个构建，将寡核苷酸31～42组合成6个复体（31和37;32和38;33和39;34和40;35和41;36和42）。再把这6个复体连接起来形成段Ⅲ，如在图ⅩⅣ中所示。在图ⅩⅣ中还示出，段Ⅲ含有一个上流的BamHⅠ粘性末端和一个下流的EcoRⅠ粘性末端，这对于连接到一个扩增载体上是有用的，至少在EcoRⅠ末端的情况下，有助于连到表达载体上。另外，段Ⅱ有一个上流的SstⅠ位点，这在最终的段Ⅱ和段Ⅲ的连接中是有用的。
表ⅩⅢ
EChpG-CSFDNA    SECTION    Ⅲ
GATCCAAAGAGCTCGGTATGGCACCAG    31
CTCTGCAACCGACTCAAGGTGCTATGCCG    32
GCATTCGCTTCTGCATTCCAGCGTCGTGC    33
AGGAGGTGTACTGGTTGCTTCTCATCTG    34
CAATCTTTCCTGGAAGTATCTTACCGTGT    35
TCTGCGTCATCTGGCTCAGCCGTAATAG    36
AGAGCTGGTGCCATACCGAGCTCTTTG    37
ATGCCGGCATAGCACCTTGAGTCGGTTGC    38
TCCTGCACGACGCTGGAATGCAGAAGCGA    39
ATTGCAGATGAGAAGCAACCAGTACACC    40
CAGAACACGGTAAGATACTTCCAGGAAAG    41
AATTCTATTACGGCTGAGCCAGATGACG    42
Figure 86106234_IMG15
由段Ⅰ形成的XbaⅠ到BamHⅠ的片断被连到用XbaⅠ和BamHⅠ打开的M13    mpll噬菌体载体上。再将载体用BamHⅠ和EcoRⅠ消化使载体重新打开，然后再将BamHⅠ连到由段Ⅱ形成的EcoRⅠ片断上，在这个步骤上，已把段Ⅰ和段Ⅱ以适宜的定位联结起来了。下一步，用BamHⅠ到EcoRⅠ消化打开另一个M13mpll载体，再用BamHⅠ连到由段Ⅲ形成的EcoRⅠ片断上。
用XbaⅠ和SstⅠ消化含有段Ⅰ和段Ⅱ的载体。同样地，含有段Ⅲ的载体是用SstⅠ和EcoRⅠ消化的。从每一个消化所产生的两个片断中，取较小的两个连到事先用XbaⅠ和EcoRⅠ打开的质粒pCFM1156上。这个反应的产物是一个表达质粒，内含一个连续的DNA序列，如在表ⅩⅤ中所示，能编码带有一个氨基末端的甲硫氨酸密码子（ATG）一个完整的hpG-CSF多肽，用于启动E.coli转录。
Figure 86106234_IMG16
虽然任何合适的载体都可用来表达这种DNA，但是表达质粒pCEM1156可很容易地由质粒pCFM836构建，它的构建叙述在已发表的欧洲专利申请№136，490内。pCFM836先用NdeⅠ切，再用PolⅠ切齐末端，这样一来，原有的两个NdeⅠ位点就都破坏了。下一步，将载体用ClaⅠ和SacⅡ消化以除去一个原有的多聚连接物，然后再连接到一个替换的多聚连接物上，如在表ⅩⅥ中所述。这个取代的多聚连接物可按照Alton等人（见前）的方法建造。在表达pCEM1156质粒中控制表达是用λPL启动子，启动子本身可受C1857阻遏基因的控制（例如由E.coli菌株K12△Htrp提供）。
表ⅩⅥ
ATCGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTACCAT
TAGCTAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGCCATGGTA
1    Clal，12    XbaⅠ，29    Ndel，35    Hincll，Hpal，39    Mlul，47    EcoRIl
53    HgiCl    Kpnl，57    Ncol    Styl，
GGAAGCTTACTCGAGGATCCGCGGATAAATAAGTAACGATCC
CCTTCGAATGAGCTCCTAGGCGCCTATTTATTCATTGCTAGG
63    Hindlll，70    Aval    Xhol，75    BamHⅠ    Xho2，79    Sac2，
例7
本例涉及用编码〔Met-1〕hpCSF的DNA序列方法的hpG-CSF多肽的E.coli表达，所使用的序列部分是合成的，部分是来自cDNA。合成的序列利用E.coli优选的密码子。
质粒PPO2，内含hpG-CSF基因（见表Ⅶ），用HgiAⅠ和StuⅠ进行消化，提供大约645个硷基对的片断，内含由7个在5′端的引导序列残基的密码子和3′非-编码区的约100个硷基对的完全hpCSF的基因（如在表Ⅶ中所述），HgiAⅠ消化留下一个5′，4-硷基的粘性末端，它与PstⅠ的粘性末端一致，同时StuⅠ留下一个平齐末端。这就允许片段易于插入到M13mp8（RF）中，它是用PstⅠ和用形成的平齐末端的限制性酶（HincⅡ）切下来的。在M13中扩增后，用ApaⅠ和BamHⅠ消化切开hpG-CSFDNA，分别切在复盖hpCSF+3到+5残基的密码子的ApaⅠ位点和在M13mp8限制性多聚连接物HincⅡ位点下游的BamHⅠ位点上。为允许使hpG-CSF多肽的E.coli表达，制备了合成的片断，示于下面的表ⅩⅦ中。
表ⅩⅦ
5′-C    TAG    AAA    AAA    CCA    AGG    TAA    TAA    ATA
3′-TTT    TTT    GGT    TCC    TCC    ATT    ATT    TAT
XbaⅠ
-1    +1
Met    Thr    Pro    Leu
ATG    ACA    CCT    CTG    GGC    C-5′
TAC    TGT    GGA    GAC-3′
ApaⅠ
从表ⅩⅦ的分析中可以测出，连接物包括：一个ApaⅠ粘性末端，对hpG-CSF的氨基末端中起始的三个残基特异的密码子（“再生的”Thr1、Pro2、Len3-特异的密码子，它在上述M13DNA的ApaⅠ消化中被消掉，并用此密码子在E.coli中做优选表达），一个起动翻译的ATG，一个24个硷基对的序列，它提供核蛋白体的结合位点，和一个XbaⅠ粘性末端。
对E.coli表达所用的表达载体被称为pCFM536，1985.4.10，由Morris公布的欧洲专利申请No.136，490所述（还可参见A.T.C.C.39934，保藏pCFM536的E.coli    JM1013）。简单地说，质粒pCFM536是用XbaⅠ和BamHⅠ消化的。将hpG-CSF片段（ApaⅠ/BamHⅠ）和上述的衔接物（XbaⅠ/ApaⅠ）再往其中连接以形成所期望的p536Ppo2质粒。
把质粒p536Ppo2转化到一种能抗Ecoli AM7菌株变种的噬菌体中，该株先已用含有CI857基因的质粒pMWI（A.T.C.C.No39933）转化过了。基于装在pCFM536祖先质粒上的抗性标志基因（Amp）来证实转化。在LB液体培养基（氨苄青霉素50微克/毫升）中的细胞培养物放在28℃保温，当细胞在培养基中生长到A600＝0.5时，把培养基升温至42℃，3小时，引起hpCSF表达。培养基的最后O.D.值为A600＝1.2。
被转化细胞hpG-CSF表达的水平是在SDS考马斯兰染色的聚丙酰胺凝胶上测定的，为总细胞蛋白量的3～5%。
用离心法收集细胞，在JS-4.2转头中3500g离心10分钟。25%（w/v）的细胞水溶液在10，000P.s.i（每平方吋磅）的压力下三次通过French Pressure Cell，细胞被破碎。将破碎细胞悬液在JA-20转头中10，000g下离心15分钟。将沉淀物再悬浮于水中，在1%月桂酸和50毫摩尔Tris PH8.7中制成约有5毫克/毫升的总蛋白的溶液。溶解了的沉淀物再置于15，000g下离心10分钟，往上清液中加入CuSO4使成20毫摩尔。1小时后，将此样品加到C4HPLC柱上进行纯化，并按照例1（B）的方法调节体积和浓度。
第二种纯制方法是用来产生较大量的hpG-CSF，它是在含非有机物的缓冲液中配制的。这种物质适合于作体内研究。将150克的细胞膏再悬浮于大约600毫升的1毫摩尔DTT中，在大约7000PSI下使通过Manton Gualin Homogenizer4次。破碎的细胞悬液在10，000g下离心30分钟，将此沉淀物再悬浮于400毫升1%脱氧胆酸盐（DOC）、5毫摩尔EDTA、5毫摩尔DTT和50毫摩尔Tris PH9的溶液中。把这个悬浮液置于室温下混合30分钟，再在10，000g离心30分钟。再将沉淀物悬浮于大约400毫升的水中，在10，000g下离心30分钟。将沉淀物溶于100毫升2%的Sarkosyl和50毫摩尔（？）PH8。加入CuSO4使成20微摩尔，混合物在室温下搅拌16小时，再在20，000g下离心30分钟。往上清液中加入300毫升丙酮。将此混合物置于冰上20分钟，再在5000g下离心30分钟。将沉淀物溶于250毫升6摩尔胍和40毫摩尔醋酸钠，（在PH4）的溶液中，使通过一个1，200毫升的G-25柱，柱在20毫摩尔PH5.4的醋酸钠溶液中平衡和运行。合并hpG-CSF峰（约400毫升），加到一根15毫升的CM-纤维素柱上，此柱是在20毫摩尔（PH5.4）的醋酸钠中平衡的。上样以后，柱子用60毫升20毫摩尔的醋酸钠（PH5.4），和25毫摩尔氯化钠冲洗，然后用200毫升20毫摩尔醋酸钠（PH5.4）和37毫摩尔氯化钠洗脱柱子。将此洗脱液150毫升浓缩至10毫升并加到300毫升G-75柱上，柱子在20毫摩尔醋酸钠和100毫摩尔氯化钠的溶液（PH5.4）中平衡和运行。合并35毫升的峰部分，并过滤灭菌。hpG-CSF的终浓度为1.5毫克/毫升，用凝胶分析方法测定纯度大于95%，热原含量少于0.5微克/0.5毫克hpG-CSF。热原水平的测定使用Limulus Ameboyte Lysate（LAL）测试箱（M.A.Bioproducts，Walkersville，Maryland）。
例8
本例是关于使用重组的方法生产hpG-CSF的类似物，其中出现在17，36，42，64和74位上的半脱氨酸残基分别用一合适的氨基酸残基置换。
按照Souza等人的方法（Souza，et al.，published PCT Application No WO85/00817，1985年2月28日公布），将引起诱变的位点在质粒p536Ppo2的〔Met-1〕编码DNA上进行，如下文所述，使用合成的寡核苷酸，其大小范围从20到23个硷基如下面在表ⅩⅧ中所列。使寡核苷酸No，1形成编码〔Ser17〕hpG-CSF基因;使寡核苷酸№.2形成的为〔Ser36〕hpG-CSF，等等。
表ⅩⅧ
寡核苷酸    顺序
1.    5′-CTG    CTC    AAG    TCC    TTA    GAG    CAA    GT-3′
2.    5′-GAG    AAG    CTG    TCT    GCC    ACC    TACA-3′
3.    5′-TAC    AAG    CTG    TCC    CAC    CCC    GAG-3′
4.    5′-TGA    GCA    GCT    CCC    CCA    GCC    AG-3′
5.    5′-CTG    GCA    GGC    TCC    TTG    AGC    CAA-3′
引起诱变阻碍的Cys到Ser位点是用M13mp10来完成的，其中含有XbaⅠ-BamHⅠ hpG-CSF片断，它是作为模板从p536Ppo2中分离的。从每个含有Cys-Ser取代物的M13mp10克隆中得出的DNA再用XbaⅠ和BamHⅠ处理。将所产生的片断克隆成表达载体，pCFM746，表达产物的分离如例7。
质粒pCEM746可用ClaⅠ和BamHⅠ切开质粒pCEM736的方法来构建（关于由存放的和公开买到的材料中制造此物已在Morris的方法中介绍，published    PCT    Application    №.WO85/00829，published    1985年2月28日公布），以除去原有的多聚连接物，也可用取代下列的多聚连接物的方法来构建。
表ⅩⅨ
ClaⅠ
5′CGATTTGATTCTAGAATTCGTTAACGGTACCATGGAA
3′TAAACTAAGATCTTAAGCAATTGCCATGGTACCTT
GCTTACTCGAGGATCCGCGGATAAATAAGTAAC3′
CGAATGAGCTCCTAGGCGCCTATTTATTCATTGCTAG5′
Sau3a
按照本发明纯化Cys到Ser类似物的方法，将大约10-15克的细胞膏再悬浮于40毫升1毫摩尔的DTT中，使通过French    Pressure    Cell，在10，000psi下三次。将破碎细胞悬浮在1，000g下离心30分钟。将沉淀物再悬浮于1%DOC，5毫摩尔EDTA，5毫摩尔DTT，50毫摩尔Tris，PH9的溶液中，让它在室温下混合30分钟。混合液在10，000g下离心30分钟，再悬浮于40ml水中，在10，000g下再离心30分钟。将沉淀物溶于10毫升2%Sarkosyl，50毫摩尔DTT，50毫摩尔Tris，PH8的溶液中。混合1小时后，在20，000g下离心30分钟使混合液澄清，然后加样到300毫升G-75柱上，用1%Sorkosy    1，50毫摩尔的Tris，PH8溶液平衡和运行。合并含类似物的部分，并让它发生空气氧化，即暴露于空气中放置至少一天。终浓度范围为0.5～5毫克/毫升。
例9
在本例中，设计了一种哺乳类动物的细胞表达系统，用以查明是否hpG-CSF    DNA的活性多肽产物可在它上面表达并被哺乳类动物细胞所分泌（COS-1，A.T.C.C.CRL-1650）。这一系统用于促使分泌hpGCSF多肽同系物。具体方法是：用带有被认为是人类GM-CSF残基序列的多肽引部〔见：Wong，等人，Science，228，810-815（1985）和Lee，等人，Proe.Na+1.Sci（uSA），82.4360-4364（1985）〕，进行编码〔Ala′〕hpG-CSF的cDNA半合成，半衍生构建。该cDNA通过表达和分泌过程提供上述多肽同系物。
在本发明的多肽产品表达的初步研究中，所使用的表达载体是一种pBR322和SV40    DNA的“穿梭”载体，这种设计允许在E.coli细胞和哺乳类细胞中的自发复制，在病毒的启动子/调控子的DNA序列的控制下，插入的外源DNA在哺乳类动物细胞内表达。此载体定名为pSVDM-19并藏匿在E.coli    HB101中，于1985年8月23日用American    Type    Culture    Collection，保存12301    Parklawn    Drive、Rockville、Maryland，并收到同意号为No.A.T.C.C.53241。
在表达载体构建中的专门操作如下。合成了一种引导编码的DNA序列，如下面表ⅩⅩ中所列。
表ⅩⅩ
-17
HindⅢ    Met    Trp
5′-A    GCT    TCC    AAC    ACC    ATG    TGG
3′-AGG    TTG    TGG    TAC    ACC
-10
Leu    Gln    Ser    Leu    Leu    Leu    Leu    Gly    Thr    Val
CTG    CAG    AGC    CTG    CTG    CTC    TTG    GGC    ACT    GTG
GAC    GTC    TCG    GAC    GAC    GAG    AAC    CCG    TGA    CAC
-1    +1
Ala    Cys    Ser    Ile    Ser    Ala    Pro    Leu
GCC    TGC    AGC    ATC    TCT    GCA    CCC    CTG    GGC    G-3′
CGG    ACG    TCG    TAG    AGA    CGT    GGG    GAC    -5′
ApaⅠ
如在表ⅩⅩ中所指明的，序列包括HindⅢ和ApaⅠ粘性末端和可归之为人类GM-CSF的“引导物”。17个氨基酸残基的密码子。跟随的密码子就是丙氨酸基，脯氨酸基和亮氨酸基的密码子。脯氨酸基和亮氨酸基与出现在hpG-CSF的+2位和+3位上的氨基酸对，而丙氨酸基与GM-CSF上的初始氨基端（+1）残基一致，但与hpG-CSF是不一致的。用丙氨酸代替苏氨酸是想用来促使相应的宿主细胞通过在GM-CSF分泌过程中通常涉及的细胞机制“加工出”GM-CSF引导物。
质粒pSVDM-19用KpnⅠ消化，该位点用Klenow酶将末端钝化。此后用HindⅢ切割DNA。产生的大片断，被组合并同示于表Ⅶ的HindⅢ/PvuⅡ片断相连接（从质粒Ppo2分离的由HindⅢ消化和用PvuⅡ部分消化所产生的第2个最大的片断）以便形成质粒pSV-Ppo1。将表Ⅷ中制造的GM-CSF的引导者序列的片断再连接到pSV-Ppo1上（在用HingⅢ和ApaⅠ将它切开以后）以产生质粒pSVGM-Ppo1。
质粒pSVGM-PpoⅠDNA的磷酸钙沉淀物（1～5微克）转化成COS-1细胞60mm复制板，基本上如Wigler等人所述〔Wigler，et al.，Cell，14，725-731（1978）〕。做为对照，也将质粒pSVDM-19转化入COS-1细胞。转染后5天收集组织培养基的上清液，并分析hpG-CSF的活性从培养基上清液中获得〔Ala′〕hpG-CSF的产量为1到2.5微克/毫升的数量级内。
在COS-1细胞中编码质粒pSVGM-Ppo1的〔Ala′〕hpG-CSF产品获得成功的表达之后，又构建了另一个载体，它包括人GM-CSF的引导物序列，但具有在那个位置上置换了丙氨酸密码子的苏氨酸基的密码子（天然出现在hpG-CSF1位置上）。简短地说合成了寡核苷酸（5′CAGCATCTCTACACCTCTGGG）作为引起突变的位置（SDM）。为了SDM，将在pSVGM-Ppo1中的HindⅢ到BamHⅠhpG-CSF片断连到M13mp10上。新合成的hpG-CSF基因，在1位上含有一个Thr的密码子，是用HindⅢ和EcoRⅠ切开分离出来的。再将片断克隆到用相同的二个限制性核酸内切酶切开的方法制备的pSVDM-19中。产生的载体pSVGM-Ppo（Thr）被转化到COS细胞上，并在培养基上清液中测量到的hpG-CSF的产率为1到5微克/毫升范围。
最后，用基因组序列（它的分离方法介绍在例5中）来形成一种对hpG-CSF的哺乳类动物的细胞有表达的表达载体。更准确地说，用KpnⅠ和HindⅢ消化pSVDM-19，大片段用与带有HindⅢ和NcoⅠ粘性末端的合成连接物的四路连接中如在表ⅩⅪ中所示。含有外显子1的NcoⅠ-BamHⅠ片断是从pBR322中分离出来的，（8500hpG-CSF），一个基因组型克隆？，含有外显子2-5个BamHⅠ-KpnⅠ片断是从质粒pBR322（8500hpG-CSF基因组型克隆）中分离出来的。产生的哺乳动物表达运载体pSV/ghG-CSF从转化的COS细胞中产生出1到2.5微克/毫升hpG-CSF。
表ⅩⅪ
HindⅢ
5′AGCTTCCAACAC
AGGTTGTGGTAC5′
NcoⅠ
例10
本例是关于本发明的重组多肽产品，物理学和生物学特性。
1、分子量
在例7中E.coli表达的重组hpG-CSF产物在还原SDS-PAGE中测定时，具有表观分子量为18.8KD（千道尔顿）（如从表Ⅶ的氨基酸分析中推断的），反之纯化了的天然分离物（如在例1中所述）具有表观分子量为19.6KD。与天然分离物在一起的N-聚糖实际上不可能存在，根据是表Ⅶ中hpG-CSF的初级序列中缺少门冬酰胺基，因此，设计出一种方法来测定O-聚糖是否在天然分离物和非糖基化的重组产品之间造成分子量差别。用神经氨〔糖〕酸苷酶（Calbiochem，LaJolla，California）处理，大约5微克的天然分离物移出0.5微克的样品，留下的物质在37℃与4mU，O-聚糖酶（endo-X-n-acetylgala-ctoseaminidase，Genzyme.Boston，Massachnsetts）孵育。保温 1/2 ，2，和4小时后分别取出等份样品。将这些样品与E.coli产生的重组物质并排进行SDS-PAGE。经神经氨〔糖〕酸苷酶处理以后，分离物的表观分子量从19.6KD移至19.2KD，启示除去了Sailic acid基。用O-聚糖酶处理2小时后，分子量移至18.8KD，这与E.coli衍生物的表观分子量一致。碳水化合物结构对神经氨酶和O-聚糖酶的敏感性启示此碳水化合物成份有下结构：N-乙酰神经胺酸-α（2-6）〔半乳糖β（1-3）〕N-乙酰半乳糖胺酸-R，其中R为丝氨酸或苏氨酸。
2、3H-胸腺嘧啶的摄取
根据3H-胸腺嘧啶掺入增加，来测定人骨髓细胞的增殖诱导。来自健康的供体的人骨髓用Ficoll-Hypague（1.077g/ml，pharmacia）进行密度分离，将低密度的细胞悬浮于Islove培养基（GIBCO）中，内含10%胎牛血清和谷氨酰胺pcn-Strep。随后，将2×104人骨髓细胞与空白培养基或与例7的重组的E.coli物质一起放在96个平底孔的板上，在37℃，在5%CO2气中保温2天。分析复制品中的样品，浓度变化超过10，000倍范围。然后将培养物用0.5微居里/孔的3H-胸腺嘧啶（New Englomd Nuclcar，Boston，Massachusetts）输送脉冲4小时。用Ventua等人的方法测量3H-胸腺嘧啶的摄取，Vcntua，et al.，Blood，61，781（1983）。在这种测定中，人hpG-CSF分离物能诱导3H-胸腺嘧啶掺入到人的骨髓细胞中，以高出对照上清液大约4-10倍的水平。产生例6的hpG-CSG物质的大肠杆菌E.coli具有同样的特性。
第二种人骨髓细胞增殖的研究是用转染COS-1细胞完成的，COS-1细胞是用例9的方法制备，得到相同的结果，这表明编码的多肽产物确实作为活性物质分泌到培养基中。
3、WEHI-3B D+的分化诱导
重组的E.coli产生的物质对鼠粒单核白血病细胞系WEHⅠ-3B D+的诱导分化的能力是在半固体的琼脂培养基上，用Metcalf的方法测定的。Int.J.Cancer，25，225（1980）。将重组的hpG-CSF产物和培养基对照都用～60WEHI-3B D+细胞/孔放在一起在37℃下5%CO2气中保温7天。将样品放在24个平底的多孔板上孵育，使浓度变化在2000倍的范围以内。将菌落分成未分化的，部分分化或全分化的，在显微镜下进行菌落细胞计数。发现E.coli重组物质能诱导分化。
4、CFU-GM，BFU-E和CFU-GEMM的测定
发现天然的多潜能的人G-CSF（hpG-CSF）分离物和重组的多潜能人G-CSF（rhpG-CSF）都能引起人骨髓细胞的增殖和分化。在CFU-GM〔Broxmeyer，et    al.，Exp.Hematol.，5，87，（1971）〕，BFU-E和CFU-GEMM〔Lu，et    al.，Blood，61，250（1983）〕的测定中，用低密度非粘连的骨髓细胞（得自健康的志愿者）测量这些活性。使用500单位的hpG-CSF或rhpG-CSF对CFU-GM，BFU-E和CFU-GEmm生物学活性进行比较，示于下面的表ⅩⅫ中。
所有的集落分析都是用低密度非粘连骨髓细胞完成的。使用Ficoul-Hypague（密度，1077克/厘米3;Pharmacia）。对人髓细胞进行密度分离，然后把低密度的细胞再悬浮于含胎牛血清的改良Islove的Dulbello培养基中，放于Falcon组织培养皿（No.3003，Becton Dickenson，Cockeysivlle，MD.）中在37℃使粘附1- 1/2 小时。
表ⅩⅫ
CFU-GM    BFU-E    CFU-GEMM
培养基    0±0    26±1    0±0
天然的    83±5.4    83±6.7    4±0
hpG-CSF
重组的    87±5    81±0.1    6±2
rhpG-CSF
培养基对照包括改良Iscove的Dulbello培养基加上10%FCS，0.2毫摩尔氯高铁血红素和1个单位重组的促红细胞生成素。
对于CFU-GM测定，是将靶细胞以1×105/ml铺在0.3%琼脂培养基上，其中含有辅助的McCoy5A培养基和10%热失活的胎牛血清。将培养基的集落（每个集合区中多于40个细胞的）划线打上记号，并在培养7天时做形态学评定。集落数目是以式四份板上测定的平均值±SEM表示。
对于BFU-E和CFU-GEMM测定，将细胞（1×105）加到1毫升混合液中，其中有改良Iscov的Dulbello培养基（Gibco），0.8%甲基纤维素，30%胎牛血清，0.05毫微摩尔2巯基乙醇，0.2毫摩尔氯高铁血红素和1个单位重组的促红细胞生成素。将培养皿放在湿润的含5%CO2和5%O2的保护气中培育。使用一种氧气减压器（Reming Bioinstrumeuts生产，Syracuse.N.Y.）获得低氧张力。培育14天后把集落打上记号。集落数目以平均值±SEM表示，是从一式二份的板上测定的。
发现在CFU-GM分析中所形成集落都是氯乙酸酯酶阳性的和非特异性的酯酶（α-萘酚醋酸酯酶）阴性的，与粒细胞型的集落一致。当在CFU-GM分析中经一系列稀释作分析时发现不论是天然的hpG-CSF，还是rhpG-CSF都具有大约1×108单位/毫克纯蛋白的比活性，在表ⅩⅫ中BFU-E和CFU-GEMM的数据是有代表性的三次独立的实验，它与以前对天然的hpG-CSF所报导的数据相似，值得指出的在E.coli中生产的rhpG-CSF是十分纯的，不含有其它可能的哺乳类动物的生出因子。所以当把rhpG-CSF加在有重组的促红细胞生长素中时，rhpG-CSF，能供养形成混合的集落（CFU-GEMM）和BFU-E。
5、细胞结合分析
以前曾报导WEHI-3B（D+）细胞和从新近诊断的白血病人中得到的人白血病细胞将结合125Ⅰ-标记的鼠G-CSF，并因加入未标记的G-CSF或人CSF-β，则可使此结合完全，测定了天然的hpG-CSF和rhpG-CSF对于125I-hpG-CSF结合到人和鼠的白血病细胞上去的竞争能力。将高度纯化的天然hpG-CSF（纯度＞95%，1微克）进行碘化〔Tejedor，等人，Anal.Biochem.，127，143（1982）〕并用凝胶过滤和离子交换层析法把它从反应物中分离出来。天然125Ⅰ-hpG-CSF的比活度大约是？微居里/微克蛋白质。测定了鼠的WEHI-3B（D+）和二份人的外周血的粒细胞白血病细胞制备物〔ANLL，一种分类为M4，其它分类为M5B）结合125Ⅰ-hpG-CSF的能力。
将鼠和新鲜的人外周血髓样白血病细胞用PBS/1%BSA洗三次。将WEHI-3B（D+）细胞（5×106）或新鲜的白血病细胞（3×106）以一式双份在PBS/1%BSA（100微升）中，在存在或不存在各种浓度（体积：10微升）的未标记的hpG-CSF，rhpG-CSF或GM-CSF时在有125Ⅰ-hpG-CSF（大约100，000计数/分或1毫微克）存在时，以及在0℃培育90分钟。（总体积：120微升）。然后将细胞再悬浮起来，加入200微升冰冷的FCS，放入350微升的塑料离心管中，进行离心使分层（1000g;1分钟）。切除管末端收集沉淀物，将沉淀和上清液分别用γ计数器（Packard）计数。
测定特异性结合数（计数/分），即是在无竞争者存在时的总结合数（两份平均值）减去有100倍过量的未标记的hpG-CSF存在（未特异结合）时的结合数（计数/分）。非特异性结合的最大值对于WEHI-3B（D+）细胞是2503计数/分（CPm），对于ANLL（M4）细胞是1072计数/分Cpm，对于ANLL（M5B）细胞是1125。实验1和2是在不同的日期做的，使用同样的125Ⅰ-hpG-CSF制剂，在对2000单位hpG-CSF的抑制百分数上呈现本质的一致性。所得到的数据报告在下面的表ⅩⅩⅢ中。
如表ⅩⅩⅢ所示，证明125Ⅰ-hpG-CSF结合到WEHI-3B（D+）白血病细胞上。在剂量相关法中，结合受到了未标记的天然hpG-CSF或rhpG-CSF的抑制，但不受GM-CSF的抑制。另外，观察到hpG-CSF能结合到人的粒单核细胞白血病细胞（ANLL，M4）上。在液体培养基中对天然hpG-CSF反应方面，这些细胞与天然hpG-CSF的结合与形态学划定这些细胞分化为成熟的巨噬细胞相平行。天然的125Ⅰ-hpG-CSF不能结合到另一个病人的（ANLL，M5B）单核白血病细胞上，这就可以提示某些白血病可能对hpG-CSF有不同表达或缺少对其的受体。rhpG-CSF对于竞争天然的125Ⅰ-hpG-CSF的结合能力，与天然的hpG-CSF相同，因此可假定受体能很好地识别这两种形式。
这些研究证明天然的125Ⅰ-标记的hpG-CSF与白血病细胞的结合与在培养基中天然的hpG-CSF诱导低密度骨髓细胞的粒细胞和单核细胞分化的能力相平行，这些细胞是取自一个急性早幼粒细胞白血病患者（M3）和另一个急性粒细胞白血病（M2）。将每一个病人的细胞都放在单独的培养基中或有1×105单位的rhpG-CSF存在的培养基中培养4天。单纯培养基孵育的M3对照培养物所得细胞仍然是早幼粒细胞型;而培育在有rhpG-CSF存在的培养基中显示有成熟型粒细胞，包括晚幼粒细胞，巨大带状和分叶的嗜中性白细胞以及单核细胞。此病人的细胞实际分化，对照组计数100个细胞，100%早幼粒细胞，而对于rhpG-CSF处理的细胞，22%原始细胞加早幼粒髓细胞，7%粒细胞，35%晚幼粒细胞，20%带状加分叶的嗜中性白细胞，14%单核细胞和2%巨噬细胞。值得注意的事实是一种多形核粒细胞仍含有明显的奥尔氏小体，提示至少这种细胞代表一种分化的白血病细胞。第二名粒细胞白血病（M2）患者的细胞也放在无rhpG-CSF存在的情况下培养4天。在单纯培养基中M2细胞培养物的肉眼分析可见大量“原始细胞样”的细胞，其中某些具有核仁。某些M2细胞，当用rhpG-CSF处理时，分化为成熟的分叶嗜中性白细胞，在中央的中性白细胞内显示出残留的奥尔氏小体，这启示分化是发生在属于白血病细胞克隆的细胞内。从形态学上估价100个细胞的实际分化显示出对照细胞100%为原始细胞。而rhpG-CSF处理过的细胞是由43%原始细胞，1%粒细胞，15%晚幼粒细胞，28%带状加分叶的嗜中性细胞，2%原始单核细胞和11%单核细胞组成。还检查了白血病细胞在另外4种rhpG-CSF浓度（5×103，1×104，2.5×104和5×104U/ml，数据未列出）下的分化。甚至在rhpG-CSF的最低浓度下（5×103单位/毫升）测试，也有M3（50%）和M2（37%）白血病细胞显著分化。（不仅是粒细胞的分化）
6、免疫测定
为制备免疫测定用的多克隆抗体，使用的抗原是多潜能的G-CSF，它是由人的膀胱癌细胞系5637（1A6）中纯制出来的，制法如例1（B）。此物质根据硝酸银染色的聚丙酰胺凝胶判定为85%纯。给6周的Balb/C小鼠多部位皮下抗原注射进行免疫。将抗原再悬浮于PBS中并用等体积的Freund完全佐剂进行乳化。剂量为每只小鼠每次注射抗原5到7微克。以同样量的用等体积Freund不完全佐剂乳化的抗原在18天后再给予小鼠以加强免疫。4天以后取小鼠血清，检测对人的多潜能G-CSF特异的抗体。
用hpG-CSF5微克/毫升（在50毫摩尔碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中，PH9.2）涂布在架上（Dynateck，Lab.，Inc.，Alexandria，Virginia）的Dynatech Immulon Ⅱ Removawell条上。孔用0.25微克（体积150微升）涂布。将涂有抗原的板置于室温下保温2小时，在4℃下过夜。滗去溶液并将板用PBS培养30分钟，内含5%BSA以封闭易反应的表面。将溶液滗出并在免疫前进行稀释或将测试血清加到孔中并在室温下保温2小时。用含1%BSA的PBS，PH7.0稀释血清。然后滗去血清溶液并用洗液（KPL，Gaithersburg，Maryland）把板洗三次。将大约200，000计数/分（CPm）碘化了的兔子抗鼠IgG（NEN，Boston，Massaclusetts），在50微升PBS中，PH7.0、含有1%BSA，加入到每一个孔中。在室温下培育1- 1/2 小时后，滗出溶液，并将板用洗液洗5次。将孔从架上取出并放在贝克曼5500γ计数器上计数。当1∶100稀释时高滴度的小鼠血清显示有较高的反应性，比相应的免疫前的血清大12倍。
用对高滴度的鼠血清的反应性来测定E.coli-衍生的hpG-CSF免疫学特性，这种血清是对哺乳类动物细胞产生的hpG-CSF有特异性的。将0.25微克90%纯的E.coli-衍生的蛋白质（50微升体积）涂布到ImmulonⅡ    Removawells上并如上所述分析鼠血清。
当1∶100稀释时，高滴度的鼠血清对E.coli-衍生的物质显示有较高的反应性，比相应的免疫前的血清的高24倍。
7、丝氨酸类似物的生化分析
〔Ser17〕hpG-CSF，〔Ser36〕hpG-CSF，〔Ser42〕hpG-CSF，〔Ser64〕hpG-CSF，和〔Ser74〕hpG-CSF，按照例9方法所制备的上述产品，在3H-胸腺嘧啶摄取，CFU-GM，和WEH13B D+分析中测定hpG-CSF的活性。在每一个测试中，〔Ser17〕类似物具有的活性类似于具有天然结构的重组分子活性。其余的类似物，在3H-胸腺嘧啶摄取分析中活性大约低100倍，在CFU-GM分析中活性低250倍，在WEHI-3B D+分析中活性低500倍。这些数据支持在36，42，64和74位置上的半脱氨酸可能需要，完整的生物学活性这一主张。
8、体内生物测定
在7支雄性Syrian    golden地仓鼠上将Alzet渗透泵（Alzet    Corp.，Palo    Alto，CA;Model    2001）插入右颈静脉的导管中并埋入皮下。4个泵中含有缓冲液〔20毫摩尔醋酸钠（PH5.4）和37毫摩尔氯化钠〕和1.5毫克/毫升E.coli-衍生的hpG-CSF，而3个泵仅有缓冲液。对于渗透泵要求泵唧速率为1微升/小时。实验进行7天。在植入泵以后的第3天时，4支处理过的仓鼠的平均粒细胞计数比3支（缓冲液）对照的高6倍，并且总淋巴细胞数增加4倍也反映了粒细胞计数的增加。经处理红细胞计数不变。这些结果表明重组物质在哺乳类动物中对粒细胞的产生和/或释放能产生一种特异性的增强作用。
除了天然存在的几种hpG-CSF的等位型以外，本发明还包括其它几种hpG-CSF产物，例如hpG-CSF的多肽类似物和hpG-CSF的片段。按照上面注明的用Alton等人公开申请的操作过程（WO/83/04053），任何人都可很容易地设计和制造基因，它能给微生物表达的多肽编码，这些多肽具有在一个或多个残基的的确定或定位上不同于那些在这当中已被规定的一级结构。（例如取代，末端和中间的添加和消除）。再有，用已知的位点-定向的突变技术可很容易地完成cDNA和染色体基因的修饰，并用于产成有关的类似物和衍生物。这些产物具有至少一种hpG-CSF的生物学特性，但其它特性可能有区别。例如，本发明设计的产品包括那些已被缩小的（例如用删除法）;或是那些对水解更稳定的（因此，比天然存在的可能具有更明显的或更长的持久效应）;或是那种已被更换成对O-糖基化作用少去一个或多个可能位点的（这对酵母生成的产物可能得到更高的活性）;或是那种有一个或多个被消除或被置换的半胱氨酸残基的（例如被丙氨酸或丝氨酸基置换并可能更容易以活性形式从微生物系统中分离出来）;或是那些具有一个或多个被苯丙氨酸置换的酪氨酸残基并可能或多或少更容易结合到靶细胞的hpG-CSF受体上的。还包括有一些多肽片断，仅与连续氨基酸序列中的一部分或hpG-CSF中二级构象的一部分相符合，这些片段可能具有一种活性（例如受体结合）而没有其他的活性（例如刺激群落生长的活性）。值得注意的是，对于本发明的任何一个或多个有治疗用处的或用在其他范围（例如在hpG-CSF拮抗作用的分析中）的产品来说那种活性不是必须的〔见Weiland，et    al.，Blut，44，173-175（1982）〕。竞争性拮抗剂可能相当有用，例如，在hpG-CSF过量产生时。
根据本发明的另一方面，在这当中所叙述的那种能编码hpG-CSF多肽的DNA序列是有价值的，它提供了有关的哺乳类动物蛋白质的氨基酸序列的资料，这种蛋白质至今还没有被利用，尽管已经分析了天然存在产物的分离物。在把各种重组技术用于进行大规模微生物合成hpG-CSF时，DNA序列作为产品也是有明显价值的。换句话说，本发明所提供的DNA序列有助于形成新的和有用的病毒质粒DNA载体和环状质粒DNA载体，新的和有用的被转化和被转染的微生物原核的和真核的宿主细胞（包括细菌和酵母细胞以及在培养基中生长的哺乳类动物的细胞），以及新的和有用的方法，培养这些微生物的宿主细胞生长，使能表达hpG-CSF和它的相关产物。
在分离hpG-CSF和与编码人的基因组DNA和其它哺乳类动物的cDNA和基因组DNA有关的蛋白质时，做为标记探针使用，本发明的DNA序列也是明显合适的材料。DNA序列还可用于蛋白质合成的各种替换方法中（例如，在昆虫细胞中）或用于人和其他哺乳类的遗传治疗中。在建立基因突变的哺乳类动物的种属时，它们可用做真核生物的“宿主”来大量产生hpG-CSF和hpG-CSF产物，就这方面来说，本发明的DNA序列预期也是有用的。一般性地，见Palmiter，et    al.，Science，222（4625），809-814（1983）。
关于本发明的hpG-CSF片段和多肽类似物的适用性见合成肽免疫活性的一些报告，这些肽实际上重复了天然存在的蛋白质、糖蛋白和核蛋白中现存的氨基酸序列。更具体地说，已经表明较低分子量的多肽所参与的免疫反应，与生理学上有意义的蛋白质（例如病毒抗原，多肽激素，等等）的免疫反应，在持续时间和范围上都是一样的。这些多肽的免疫反应包括免疫活性动物中引起特异性免疫抗体的形成。参见：Lerner，el    al.，Cell，23，309-310（1981）;Ross，et    al.，Nature，294，654-656（1981）;Walter，et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.（USA），77，5197-5200（1980）;Lerner，et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.（USA），78，3403-3407（1981）;Walter，et    al.，Proc.Natl.Acael.Sci.（USA），78，4882-4886（1981）;Wong，et    al.，Proc.Natl.Acael.Sci.（USA）.78，7412-7416（1981）;Green，etal.，Cell，28，477-487（1982）;Nigg，et    al.，Proc.Natl.Acael.Sci（USA），79，5322-5326（1982）;Baron，et    al.，Cell，28，395-404（1982）;Dreesman，et    al.，Nature，295，185-160（1982）;和Lerner，Scientific    American，248，№    2，66-74（1983）。合成的多肽大致上具有肽激素的二级结构，但并不具有它们的一级结构构象，关于合成肽类的生物活性和免疫活性，还可参见Kaiser，et    al.，Science，223，249-255（1984）。
虽然已经对本发明做了十分具体化的说明，但是应该理解那些工艺熟练者还会提出改动和修正。因此，打算用附加的权利要求概括所有这些等效的变动，把它们作为权利要求归入本发明范围内。
Figure 86106234_IMG18
Figure 86106234_IMG20
Figure 86106234_IMG22

Claims (44)

1、一种已纯化和分离的多肽，它具有天然存在的多潜能粒细胞集落-刺激因子的部分或全部一级结构构象和一种或多种生物学活性，其特征为：此多肽是一种外源DNA序列的原核生物或真核生物表达的产物。
2、按照权利要求Ⅰ的一种多肽，其进一步的特征为：没有与任何哺乳类动物的蛋白质结合在一起。
3、按照权利要求Ⅰ的一种多肽，其中外源的DNA序列是一种cDNA序列。
4、按照权利要求Ⅰ的一种多肽，其中外源的DNA序列是一种人工DNA序列。
5、按照权利要求Ⅰ的一种多肽，其中外源的DNA序列是一种基因组的DNA序列。
6、按照权利要求Ⅰ的一种多肽，其中外源的DNA序列被装在一种能自发复制DNA的质粒或病毒载体上。
7、按照权利要求Ⅰ的一种多肽，它具有人的多潜能性粒细胞集落刺激因子（如表Ⅶ所述）或是任何天然存在的它的等位变异体的部分或全部一级结构构象。
8、按照权利要求Ⅰ的一种多肽，它具有天然存在的多潜能粒细胞集落刺激因子的免疫学特性。
9、按照权利要求Ⅰ的一种多肽，它具有天然存在的多潜能粒细胞集落刺激因子的体外生物学活性。
10、按照权利要求Ⅰ的一种多肽，其进一步的特征为：与可探测的标记物质以共价结合。
11、按照权利要求10的一种多肽，其中所称的可探测的标记是放射标记。
12、一种DNA序列，用于在原核生物或真核生物的宿主细胞中，多肽产物的安全表达，此多肽产物至少具有天然存在的多潜能性粒细胞群落刺激因子的部分的一级结构构象和一种或多种它们的生物学特性，在以下诸条中选择上述的DNA序列：
（a）在表Ⅶ，和表Ⅷ中列出DNA序列或它们的互补链;
（b）杂交到（a）中所确定的DNA上的DNA序列或是它的片段;和
（c）如果没有遗传密码的简并，会杂交到（a）和（b）中所确定的DNA序列上的DNA序列。
13、在让宿主细胞表达上述的多肽产物的方法中，用权利要求12的一种DNA序列转化或转染一种原核的或真核的宿主细胞。
14、在原核或真核生物的宿主中，权利要求12的DNA序列表达的一种多肽产物。
15、一种纯化和分离的DNA序列，它能编码为原核或真核生物的宿主表达的多肽，这种多肽具有多潜能性粒细胞集落刺激因子的部分或全部一级结构构象，及其一种或多种生物学特性。
16、按照权利要求15的一种cDNA序列。
17、按照权利要求16的一种基因组DNA序列。
18、按照权利要求15的一种人工DNA序列。
19、按照权利要求18的一种人工的DNA序列，并包括在E.coli细胞中优先表达一种或多种密码子。
20、按照权利要求18的一种人工的DNA序列，能对人类的多潜能性粒细胞集落刺激因子表达编码。
21、按照权利要求20的一种人工的DNA序列，包括一种或多种在酶母细胞中优先表达的密码子。
22、按照权利要求16、17，或18的一种人类的多潜能性粒细胞群落刺激因子-编码DNA序列。
23、按照权利要求15的一种DNA序列，它与可探测的标记物共价结合。
24、按照权利要求13的一种DNA序列，其中可探测的标记物是放射性标记物。
25、按照权利要求23的一种单链的DNA序列。
26、一种DNA序列，能为天然存在的多潜能性粒细胞集落刺激因子的多肽片段或多肽同系物编码。
27、一种能对〔Ala′〕hpG-CSF编码的DNA序列。
28、一种包括按照权利要求12，15或26之一的一种DNA序列，有生物学功能的质粒或病毒DNA载体。
29、能够用权利要求28所述载体稳定地转化或转染的一种原核生物或真核生物的宿主细胞。
30、一种多肽产物，它是按照权利要求15或16的DNA序列在原核生物的或真核生物的宿主细胞中表达出来的。
31、一种具有如在表Ⅶ中所陈述的部分或全部的氨基酸序列，并在体外具有天然存在的多潜能性粒细胞集落刺激因子的一种或多种生物学活性的合成多肽。
32、一种合成的多肽，它具有陈述在表Ⅶ中的部分或全部氨基酸序列的部分或全部的二级构象，并具有天然存在的人的多潜能性粒细胞集落刺激因子的生物学特性。
33、一种生产多肽的工艺过程，这种多肽具有天然存在的多潜能性粒细胞集落刺激因子的部分或全部一级结构的构象以及一种或多种的生物学特性，上述过程包括：
在适当的营养条件下使按照权利要求28用DNA载体转化或转染的原核或真核生物的宿主细胞生长，并分离出在上述载体中DNA序列表达出来所期望的多肽产物。
34、纯化和分离没有以糖基化或非糖基化形式与任何的人蛋白结合在一起的，人类多潜能性粒细胞集落刺激因子。
35、一种药物成份，包含按照权利要求1或34所得到的一种有效量的多肽，和一种制药上可接受的稀释剂，辅助剂或载体。
36、给哺乳类提供一种造血治疗的方法，包括给予有效量的按照权利要求1或34得到的多肽。
37、抑制白血病细胞增殖的一种方法，包括给予有效量的按照权利要求1或34得到的多肽。
38、一种DNA序列，它能为〔Ser17〕hpG-CSF编码。
39、一种按照权利要求38的DNA序列在原核或真核生物的宿主细胞中表达出来的多肽产物。
40、一种包括按照权利要求38的DNA序列的，有生物学功能的质粒或病毒DNA载体。
41、一种用按照权利要求40的DNA载体稳定地转化或转染的原核或真核生物的宿主细胞。
42、一种DNA序列，它能为从下组中所选定的hpG-CSF的同系物编码，
〔Ala1〕hpG-CSF;
〔Ser36〕hpG-CSF;
〔Ser42〕hpG-CSF;
〔Ser64〕hpG-CSF;
〔Ser74〕hpG-CSF;
〔Met-1，Ser17〕hpG-CSF;
〔Met-1，Ser36〕hpG-CSF;
〔Met-1，Ser42〕hpG-CSF;
〔Met-1，Ser64〕hpG-CSF;和
〔Met-1，Ser74〕hpG-CSF。
43、一种按照权项42的DNA序列在原核或真核生物的宿主细胞中表达的多肽产物。
44、一种hpG-CSF的制剂，它有95%以上的纯度，在每0.5毫克的hpG-CSF中含有少于0.5毫微克的热原。
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