CN85109718A - 酵母菌异质基因表达的调节区 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的DNA顺序，它关系到甲醇和不 抑制碳源的可分解产物和碳素缺乏的出现及包含该 DNA顺序的新工程产物以及用它转化的微生物。还 涉及制造该DNA顺序及其工程产物的方法。也叙述 了在该调节区控制下生产肽的方法。

Description

本发明是有关重组DNA的生物技术。一方面它是关于调节DNA转录成信息RNA（mRNA）及调节由mRNA转译成蛋白质的DNA片段。另一方面它还涉及包括上述DNA片段的表达载体。此外，本发明还涉及用上述表达载体转化的新微生物，以及生产的有关肽链。
由于重组DNA技术最近几年的发展，通过微生物生产各种各样的有用的肽已成为可能。通过不同的微生物已经生产出很多真核生物的肽，诸如人生长激素，白细胞干扰素，人胰岛素和人的胰岛素原等。我们手中申请的技术是希望今后能通过微生物生产出更多其它有用的肽。
重组DNA领域所用的基本技术已为该领域的普通专业人员所知。在重组DNA技术实践中使一个宿主微生物有用的所需因素包括但不被限制在下述几个方面：
（1）给一个或多个所需要肽编码的一个基因，并具有在宿主微生物中表达它所需的适当的控制顺序。
（2）一个基因可被插入的载体，通常为质粒。载体保证把特定基因转移到细胞中，在细胞中保持DNA顺序，同时能保证上述基因有一个高水平的表达。
（3）一个合适的宿主微生物，可被携带所需要基因的载体转化，宿主微生物也有自己细胞器允许通过插入基因带来信息的表达。
用于重组DNA技术的一个基本因素是质粒，它是在一些微生物中发现的染色体外双链DNA。在一些微生物中质粒被发现是自然产生的，每个细胞可产生多个拷贝。除了自然产生的外，也制备出很多人造质粒或杂交载体。在质粒DNA中编码的信息就需要在子细胞中繁殖质粒而复制，也就是需要自主地复制顺序或称为一个复制起点。质粒DNA中还必须包括一个或多个供选择用的表现型特征。供选择的表现型特征使得含有趣质粒的宿主细胞的克隆可以通过在选择培养基上生长的细胞中被识别和选出。
质粒的实用性在于它们可以特异地被一种或另一种限制酶切割，每种酶可识别质粒上一个特定的，唯一的位点。因而，以其它非宿主微生物衍生的同质或异质基因或基因片段都可通过切割的质粒和所需遗传材料在切点或在邻近切点的重组端连接而插入进质粒。因而所得重组DNA材料可被看作是杂交载体。
DNA重组是在宿主微生物外进行的。得到的杂交载体又通过已知的转化过程进入宿主微生物的。随着转化了的微生物的生长，可得到大量的杂交载体。基因随着插入到支配编码DNA信息的质粒中，使得到的杂交载体能用于直接生产插入被基因编码的肽。这种方式生产肽我们称之为基因表达。
基因表达是在称为启动区的DNA区开始的。在表达的转录期，DNA解旋暴露出来作为合成信息RNA启动区模板。RNA聚合酶结合到启动区，并沿着解旋的DNA从它的3′末端移到5′末端把包含在编码链的信息从mRNA5′端到3′端转录到信息RNA。相反，信息RNA附着在核糖体上，在那儿mRA转译成肽链。每个氨基酸都被一个核苷酸三联体或称密码所编码，它们是构成结构基因部分，也就是说给表达产物氨基酸顺序编码的基因部分。由于三个核苷酸为每个氨基酸编码，因为核苷酸顺序就可以以三种不同方式被“阅读”。为所需肽产物编码的特定读码被称叫特定的读码。
附着到启动子上后，RNA聚合酶从mRNA5′末端开始转录，然后转译起始因子或称起始密码使结构基因内核苷酸码转译。为了得到所需基因产物，必须使起始因子或起始密码正确开始通过核糖体在适当读码上转译信息RNA。最后，终止密码在结构基因末端被转录，该密码使mRNA任何附加顺序已由RNA聚合酶与DNA模板相互作用已形成。因此，终止信号决定着转译末端，把肽末端氨基酸结合到肽产品上去。然后肽产物从宿主细胞上释放出，可通过适当方法使其与其它微生物蛋白分离，纯化。或在某些情况下把微生物分泌的肽与它生长的发酵基质中分离纯化出来。
实际上，应用重组DNA技术可以制造能全部表达异质肽的微生物，异质肽即不是在某特定微生物中发现并为它制造的所谓直接表达产生的肽。相反，它能表达一种融合蛋白，即融合到一种在野生型宿主微生物中发现或由它产生的同质肽氨基酸顺序一部分的异质肽称之为非直接表达。用这种非直接表达开始得到的融合蛋白产物有时是对其目的用途不显示活性的，必须在细胞外把同质/异质肽部分切割方显活性。例如：用溴化氰从融合的同质/异质肽蛋氨酸残基得到生长激素抑制素，胸腺素α1和人胰岛素的A和B链，而用酶切特定的残基得到了β-endorphin。
迄今为止，为生产不同肽所作的应用重组DNA技术的商业努力已把注意力放在用大肠杆菌作宿主微生物上。然而在某些情况下大肠杆菌已被证实不适于作宿主。例如：大肠杆菌含有一些有毒的热源因子，用作药物的肽必须排除这些因子。当然，纯化所得肽的效率也因不同肽而异。此外，大肠杆菌的蛋白水解活性也严重地限制了有用产物的产量，特别是在用真核生物生产肽产品出现后，这些和其它另一
些因素使人们增加了对其它宿主的兴趣。
与原核系统诸如：大肠杆菌生产重组DNA编码的肽相比，在真核系统生产肽方面应用酵母可能提供意味深长的优越性。几世纪以来，酵母用来大规模发酵，而最近几年才出现用大肠杆菌的大规模发酵。酵母可以比细菌更高的细胞密度生长和更容易适应连续发酵工艺。事实上，像PiChia    Pastoris以超高细胞密度，即超过100克/升密度生长已为Wigner所提示（在美国专利4，414，329已转让给菲力浦石油公司）。酵母宿主的优点还包括机体的很多机能例如：氧化磷酸化磷位于细胞器之中，从而使机体生产的外源危害野生宿主细胞。作为真核生物，酵母还能糖基化表达后的肽产物，这种糖基化作用对肽产物的生物活性是重要的。它还显示与高等生物一样的密码选择性，从而可更有效地生产哺乳动物基因或从哺乳动物mRNA反向转录的互补DNA的表达产物。
具特征性酵母种未能很好地发展为宿主/载体系统是由于缺乏关于转化条件及合适载体方面的知识。此外，营养缺陷型突变常是不可利用的，因而它排除通过补充营养缺陷而直接选择转化体。如果重组DNA技术能充分地支持它的希望，真的宿主/载体系统必定会设计出来，以满足基因工程及使插入的DNA顺序充分表达，从而可在人工控制条件下高产地生产所需肽。
本发明的目的是生产甲醇的新调节区。
另一个目的是一种新的降解物敏感的调节区，它与一些碳源的生产有关，而与另一些碳源生产无关。
本发明的再一个目的是与碳源缺乏有关的新调节区。
本发明还有一个目的是能表达插入的肽编码顺序的载体。
本发明再有一个目的是PiChia和Sacharomyces属的一些新酵母菌株。
本发明进一步的目的是用上述新酵母菌株生产肽的一个方法。
本发明的这些目的从说明书和权利要求中揭示的内容中可明显看出。
根据本发明，我们发现，分离和特征了控制DNA转录成mRNA和mRNA转译成肽产物的DNA顺序。本发明的这新的DNA顺序通过（a）能以甲醇为碳源和能源而生长的酵母菌株，（b）能在葡萄糖，乙醇，果糖及类似物上生长的酵母菌株，和（c）能生长在甘油，半乳糖，乙酯及类似物上的酵母菌株生长肽产物。
图1表示基因组克隆（PPG6.0）和蛋白P76的cDNA克隆（PPC15.0）间关系。
图2表示基因组克隆（PPG4.0）和蛋白P72（醇氧化酶）的cDNA克隆（PPC8.3和PPC8.0）的关系。
图3表示基因组克隆（PPC4.8）和蛋白P40的cDNA克隆（PPC6.7）的关系。
图4表示从克隆PPG6.0得到的本发明调节区的限制酶切图。
图5是从克隆PPG4.0得到的本发明的调节区的限制酶切图。
图6是从克隆PPG4.8得到的本发明调节区的限制酶切图。
图7是从P76结构基因3′末端得到的DNA顺序的限制酶切图。
图8是P72（醇氧化酶）结构基因3′末端得到的DNA顺序的限制酶切图。
图9是P40结构基因3′末端得到的DNA顺序的限制酶切图。
图10是蛋白P76的结构基因及它的5′端调节区的限制酶切图。
图11是蛋白P40的结构基因及它的5′端调节区的限制酶切图。
图12是蛋白P76CDNA的限制酶切图。
图13是蛋白P72（醇氧化酶）CDNA的限制酶切图。
图14是蛋白P40CDNA的限制酶切图。
图15是本发明建立的两个新的P76调节区-Lacz DNA的限制酶切图。
图16是本发明建立的一个新的P72（醇氧化酶）调节区-Laca DNA的限制酶切图。
图17是质粒PSAOH1的限制酶切图。
图18是质粒PSAOH5的限制酶切图。
图19是质粒PSAOH10的限制酶切图。
图20是质粒PTAFH85的限制酶切图。
图21是质粒PT76H1的限制酶切图。
图22是质粒PT76H2的限制酶切图。
图22a是质粒PT76H3的限制酶切图。
图22b是质粒PT76H4的限制酶切图。
图23是质粒PYA2的限制酶切图。
图24是质粒PYA4的限制酶切图。
图25是质粒PYJ8的限制酶切图。
图26是质粒PYJ8△Clα限制酶切图。
图27是质粒PYJ30的限制酶切图。
图28是供一个质粒PTAFH1的限制酶切图，说明该质粒是如何衍生的。
图29提供一个质粒PTAO12的限制酶切图，说明该质粒是如何衍生的。
图30是质粒PTAO13的限制酶切图。
图30a是质粒PT76U1的限制酶切图。
图31提供一个质粒PTAO1的限制酶切图，说明该质粒是如何衍生的。
图32提供一个质粒PTAF·85的限制酶切图，说明该质粒是如何衍生的。
图33提供质粒YEp13的限制酶切图。
图34是质粒PBPf1的限制酶切图。
下面本申请说明书用的缩写表示所用的限制性内切酶：
A＝AsuⅡ    RS＝RSaⅠ
B＝BamHⅠ    S＝SalⅠ
B2＝BglⅡ S3＝Sau3AⅠ
BC＝BclⅠ SC＝SacⅠ
C＝ClaⅠ    Sm＝SmaⅠ
H2＝HincⅡ SP＝SPhⅠ
H3＝HindⅢ Ss＝SstⅠ
K＝KPnⅠ    T＝TaqⅠ
Nd1＝NdeⅠ Th＝ThaⅠ
Nr＝NruⅠ    Xb＝XbaⅠ
Ps＝PstⅠ    Xh＝XhOⅠ
PV2＝PVuⅡ Xm＝XmaⅠ
R1＝EcoRⅠ
Rs＝EcoRⅤ
附图中DNA片段的切点用括号中内切酶的缩写标出。
本发明提供的包含一个调节区的新的DNA片段关系着至少下列情况之一的出现：当细胞生长在不是甲醇的一些底物时产生甲醇，碳素缺乏或产生抑制除甲醇外的碳源的不能降解的产物。本发明的DNA片段调节区，在mRNA位于为它编码的DNA    5′末端时，能控制它的转录。上述DNA片段的突变体也在我们的发明范围内。
进而本发明还提供一个包含着在mRNA位于它编码的肽的3′末端时能控制mRNA转录和转译末端的聚腺苷酰化的调节区的DNA片段。控制mRNA转录和转译的条件区负责着至少下列情况之一的出现：当细胞生长在一些不是甲醇的一些底物时产生甲醇，碳素缺乏或产生抑制除甲醇外的碳源不能降解的产物。上述DNA片段的突变体也在我们的发明范围内。
根据本发明的特殊实施例，还提供了指导把其编码的肽并入过氧化物酶体中的DNA片段。过氧化物酶体是大量出现在生长于甲醇上的酵母的细胞中的细胞内含物。这些细胞内含物可用于把併合的肽产物从细胞液和蛋白酶中分离出来。
根据本发明另一个实施例，为还提供了醇氧化酶编码的一个基因，一个为大约40千对碱基，蛋白的基因和一个为大约76千对碱对蛋白编码的基因。
本发明的再一个实施例是提供了制造本发明一系列质粒，DNA片段以及异质肽（即不是宿主固有的肽）的方法。
用从生长在以甲醇为唯一碳源的Pichia Pastoris中分离的PolyA+RNA（见例Ⅲ）制备含大约20，000个CDNA的基因文库。再用从生长在甲醇或乙醇上的Pichia Pastoris分离出的激化的PolyA+RNA杂交筛选基因文库。经过几轮正负筛选，鉴定出三个明显不同质的CDNA克隆作为甲醇特异的信息RNA的拷贝。这些克隆命名为PPC6.4，PPC8.0和PPC15.0。并测定了它们分别含470，750和110个核苷酸的插入部分。
为得到更长的CDNA克隆，用较温和的S1核酸酶酶解制备第二CDNA基因文库，这个新文库的成员用32P标记的CDNA克隆PPC6.4，PPC8.0和PPC8.0分别筛选。结果分离出相应CDNA克隆PPC6.4和PPC8.0的较大的CDNA克隆。发现较大的克隆PPC6.7和PPC8.3分别含有1200和2100个核苷酸的插入体。（见图2和图3）。筛选了40，000个CDNA克隆后没观察到具有大于1100个核苷酸的PPC15.0的插入体的CDNA克隆。
用32P标记的PPC15.0，PPC8.0或PPC6.4与染色体DNA杂交，然后用限制性的内切酶酶解该Pichia    Pastoris    DNA，跑电泳，再切下电泳带用电泳洗脱分离相应于这些CDNA克隆的基因组DNA片段，再把这些片段克隆到大肠杆菌中去。然后用上述每个CDNA的探针多次筛选鉴定合适的基因组克隆。
每个CDNA克隆与它相应的基因组克隆的关系示在图1、2和3。PPC15.0蛋白是被编码在克隆PPG6.0中的一个6000个核苷酸的HindⅢ基因组片段内（图1）。为PPC15.0编码的基因的5′末端朝向包含在PPG6.0的1300个碱基对的HindⅢ-EcoRⅠ片段，而其3′末端接近PPG6.8的PSTⅠ切点。
CDNA克隆PPC8.3包括在基因组克隆PPG4.0之中（图2），PPG4.0含有一个邻近基因组DNA的4，000个核苷酸的EcoKⅠ-PVuⅡ插入体。PPC8.3在PPG4.0中的方向是沿着紧靠着BamHⅠ切点的CDNA克隆的基因的5′末端，而这基因的3′末端位于PVaⅡ切点附近。PPC8.9（一个有关的CDNA克隆）在PPG4.0内的方向沿着靠近PPG4.0    3′末端的KPnⅠ切点的这个CDNA的5′末端，这个CDNA3′末端位于PVaⅡ切点附近。
CDNA克隆PPC6.7完全置于一个4800个核苷酸的EcoRⅠ-BamHⅠ基因组片段（图3）。相反克隆PPC6.4完全置于CDNA克隆PPC6.7之中。由于PPC6.7是一个比PPC6.4更完全的拷贝，因此后者没有被进一步研究。该基因的5′末端靠近基因组克隆PPG4.8的BamHⅠ端而不是它的EcoRⅠ端（图3）。
在所有在上述这些的基因组克隆中，至少有侧面连接基因组DNA顺序的1.2千对碱基，它是每个CDNA克隆复制的结构基因的5′末端。
每个上述的基因组和CDNA的克隆都已被贮藏在美国北部研究中心，（Peoria，Iuinois）为保证本申请作为专利的充分公开，所有克隆均被贮存在大肠杆菌宿主中：
质粒    宿主    贮藏编号
PPG6.0    大肠杆菌Coli    LE392-PPG6.0    NRRLB-15867
PPG4.0    E·Coli    LE392-PPG4.0    NRRL-B15868
PPC4.8    Ecoli    LE392-PPC4.8    NRRLB-15869
PPC15.0    Ecoli    LE392-PPC15.0    NRRLB-15870
PPC8.3    Ecoli    LE392-PPC8.3    NRRLB-15871
PPC6.7    Ecoli    LE392-PPC6.7    NRRLB-15872
PPC8.0    ELoli    MM294-PPC8.0    NRRLB-15873
所有上述菌株都稳定地被贮存，以便从1984年8月31日供公众取用。
PPG6.6，PPG4.0和PPG4.8CDNA克隆都被标记以用作一系列同化甲醇的酵母和一个不同化甲醇的酵母的染色体DNA顺序的探针。在几乎所有同化甲醇的酵母中都发现有上面三个CDNA的同质基因，但它们明显地不存在于不同化甲醇的酵母中。因此人们相信这些基因对同化甲醇的酵母是特有的。此外，在例ⅩⅦ中详述的Southern分于杂交试验也表明了从不同的能同化甲醇的酵母中分离的该基因是高度同质的。
研究这些基因对转录的作用，可通过观察甲醇对这些克隆的基因表达的影响而完成。从生长在以乙醇或甲醇为唯一碳源的Pichia Pastoris细胞分离PolyA+RNA，将其用于制备性Northern滤纸杂交（见例Ⅳ），三个用生长在甲醇和乙醇上细胞RNA浸泡得到的滤纸分别用32P标记的PPC15.0，PPC6.4探取。克隆PPC15.0，PPC8.0和PPC6.4与从生长在甲醇上的细胞得到的RNA分子（分别大约为2400，2300和1300个核苷酸）杂交。用从乙醇的培养基上生长的细胞得到RNA观察到PPC1.5和PPC8.0没与探针杂交。而它与PPC6.4杂交时，该克隆与一个1300个核苷酸的RNA分子杂交，这RNA分子与在甲醇培养基上生长的细胞中得到的一样，但其质量上低于甲醇培养基上细胞得到的RNA5倍。
为鉴定上述每种CDNA克隆编码的蛋白产物，用从生长在甲醇培养基上的Pichia Pastoris细胞得到的PolyA+RNA与每种CDNA选择性地杂交。把杂交选择的mRNA，即与每个CDNA克隆杂交的mRNA用于体外翻译其相应的蛋白产物，并用SDS变性电泳分析之（见例Ⅴ），体外正杂交翻译试验的结果说明克隆PPC15.0，PPC8.3和PPC6.7分别选择了为P76，P72和P40肽编码的mRNA。当用从甲醇培养基上生长的Pichia Pastoris细胞分离的总体PolyA+RNA在相同体外翻译系统转译时，得到这些相同的蛋白。
通过在水中透析溶胞产物，可简单地制取高富集的醇氧化酶蛋白（见例Ⅶ），电泳法分析透析得到的结晶沉淀表明主要含有两个肽，分别为76000道尔顿和72000道尔顿。进一步用Sephacryl    200层析以纯化该沉淀（见例Ⅶ），证明醇氧化酶的活性是相对于72，000道尔顿的肽。这个肽的大小与CDNA克隆PPC8.3选择的蛋白相同。（见例Ⅴ）。
用免疫沉淀法也证明了克隆PPC8.3和PPG4.0是为了醇氧化酶的结构基因编码。从Pichiu Pastoris分离的含76，000和72，000道尔顿肽的蛋白制剂被用来在家兔中产生特异性的抗血清。当从克隆PPC8.3得到选择杂交的PolyA+RNA，在体外翻译时，仅72000道尔顿的转译产物被抗Pichia Pastoris细胞蛋白制品的抗血清沉淀。
为进一步证实克隆PPC8.5确是为Pichiu    Pastoris醇氧化酶编码的CDNA克隆，把该蛋白N末端的氨基酸顺序与被PPC编码的蛋白予测的顺序相比较。72000道尔顿蛋白N末端顺序是：（顺序A，见例Ⅷ）。
丙-异    亮-脯-谷-谷-苯    丙-天冬-异    亮-亮-缬-亮-甘-甘-甘-丝-丝-甘-丝（顺序A）
与其氨基酸顺序平行，测定了在PPC8.3和PPG4.0中的编码基因的5′末端的核苷酸顺序。予测的从基因组和CDNA克隆DNA顺序衍化的2-19氨基酸的顺序（见顺序B）与上述测定的Pichia    Pastosis醇氧化酶的头18个氨基酸的顺序完全一致：
予测的氨基酸顺序：蛋    丙    异    亮    脯
核苷酸顺序：5-ATG    GCT    ATC    CCC
（PPC8.3和PPG4.0）    3-TAC    CGA    TAG    GGG
谷    谷    苯丙    天冬    异亮    亮    缬
GAA    GAG    TTT    GAT    ATC    CTA    GTT
CTT    CTC    AAA    CTA    TAG    GAT    CAA
亮    甘    甘    甘    丝    丝    甘    丝
CTA    GGT    GGT    GGA    TTC    AGT    GGA    TCC-3′
GAT    CCA    CCA    CCT    AGG    TCA    CCT    AGG-5′
（顺序B）
此外，测定了醇氧化酶基因编码区的整个核苷酸顺序。测定的核苷酸顺序和予测的氨基酸顺序列在顺序B′，它们是：
予测的氨基酸顺序：蛋    丙    异亮    脯    谷
核苷酸顺序：5′-ATG    GCT    ATC    CCC    GAA
3′-TAC    CGA    TAG    GGG    GTT
（PPC8.3和PPG4.0）
谷    谷    苯丙    天冬    异亮    亮    缬
GAA    GAG    TTT    GAT    ATC    CTA    GTT
CTT    CTC    AAA    CTA    TAG    GAT    CAA
亮    甘    甘    甘    丝    丝    甘
CTA    GGT    GGT    GGA    TTC    AGT    GGA
GAT    CCA    CCA    CCT    AGG    TCA    CCT
丝    半胱    异亮    丝    甘    精    亮
TCC    TGT    ATT    TCC    GGA    AGA    TTG
AGG    ACA    TAA    AGG    CCT    CCT    AAC
丙    天冬酰
GCA    AAC
CGT    TTG
亮    天冬    组    丝    亮    赖    缬    甘
TTG    GAC    CAC    TCC    TTG    AAA    GTT    GGT
AAC    CTG    GTG    AGG    AAC    TTT    CAA    CCA
亮    异亮    谷    丙    甘    谷    天冬酰    谷酰
CTT    ATC    GAA    GCA    GGT    GAC    AAC    CAA
GAA    TAG    CTT    CGT    CCA    CTC    TTG    GTT
脯    谷酰    谷酰    脯    蛋    甘    亮    脯
CCT    CAA    CAA    CCC    ATG    GGT    CTA    CCT
GGA    GTT    GTT    GGG    TAC    CCA    GAT    GGA
丝    精    酪    亮    脯    赖    赖    谷酰
TCC    AGG    TAT    TTA    CCC    AAG    AAA    CAG
AGG    TCC    ATA    AAT    GGG    TTC    TTT    GTC
赖    亮    天冬    丝    赖    苏    丙    丝
AAG    TTG    GAC    TCC    AAG    ACT    GCT    TCC
TTC    AAC    CTG    AGG    TTC    TGA    CGA    AGG
苯丙    酪    苏    丝    天冬酰    脯    丝    脯
TTC    TAC    ACT    TCT    AAC    CCA    TCT    CCT
AAG    ATG    TGA    AGA    TTG    GGT    AGA    GGA
组    亮    天冬酰    甘    精    精    丙    异亮
CAC    TTG    AAT    GGT    AGA    AGA    GCC    ATC
GTG    AAC    TTA    CCA    TCT    TCT    CGG    TAG
缬    脯    半胱    丙    天冬酰    缬    亮    甘
GTT    CCA    TGT    GCT    AAC    GTC    TTG    GGA
CTT    GGT    ACA    CGA    TTG    CAG    AAC    CCA
甘    甘    丝    丝    异亮    天冬酰    苯丙    蛋
GGT    GGT    TCT    TCT    ATC    AAC    TTC    ATG
CCA    CCA    AGA    AGA    TAG    TTG    AAG    TAC
蛋    酪    苏    精    甘    丝    丙    丝
ATG    TAC    ACC    AGA    GGT    TCT    GCT    TCT
TAC    ATG    TGG    TCT    CCA    AGA    CGA    AGA
天冬    丝    天冬    天冬    ？    谷酰    丙    谷
GAT    TCT    GAT    GAC    TTN    CAA    GCC    GAG
CTA    AGA    CTA    CTG    AAN    GTT    CGG    CTC
甘    丝    赖    苏    谷    天冬    亮    亮
GGC    TCG    AAA    ACA    GAG    GAC    TTG    CTT
CCG    AGC    TTT    TGT    CTC    CTG    AAC    GAA
脯    亮    蛋    赖    赖    苏    谷    苏
CCA    TTG    ATG    AAA    AAG    ACT    GAG    ACC
GGT    AAC    TAC    TTT    TTC    TGA    CTC    TGG
酪    谷酰    精    丙    ？    谷酰    ？    酪
TAC    CAA    AGA    TGN    TGN    CAA    CNA    TAC
ATG    GTT    TCT    ACN    ACN    GTT    GNT    ATG
脯    天冬    异亮    组    甘    苯丙    谷    甘
CCT    GAC    ATT    CAC    GGT    TTC    GAA    GGA
GGA    CTG    TAA    GTG    CCA    AAG    CTT    CCA
脯    异亮    赖    缬    丝    苯丙    甘    天冬酰
CCA    ATC    AAG    GTT    TCT    TTC    GGT    AAC
GGT    TAG    TTC    CAA    AGA    AAG    CCA    TTG
酪    苏    酪    脯    缬    半胱    谷酰    天冬
TAC    ACC    TAC    CCA    GTT    TGC    CAG    GAC
ATG    TGG    ATG    GGT    CAA    ACG    GTC    CTG
苯丙    亮    精    丙    丝    谷    丝    谷酰
TTC    TTG    AGG    GCT    TCT    GAG    TCC    CAA
AAG    AAC    TCC    CGA    AGA    CTC    AGG    GTT
甘    异亮    脯    酪    缬    天冬    天冬    亮
GGT    ATT    CCA    TAC    GTT    GAC    GAT    CTG
CCA    TAA    CGT    ATG    CAA    CTG    CTA    GAC
谷    天冬    亮    缬    亮    苏    组    甘
GAA    TTG    TTG    GTA    CTG    ACT    CAC    GGT
CTT    AAC    AAC    CAT    GAC    TGA    GTG    CCA
丙    谷    组    色    亮    赖    色    异亮
GCT    GAA    CAC    TGG    TTG    AAG    TGG    ATC
CTA    CTT    GTG    ACC    AAC    TTC    ACC    TAG
天冬酰    精    天冬    苏    甘    精    精    丝
AAC    AGA    GAC    ACT    CGT    CGT    TCC    GAC
TTG    TCT    CTG    TGA    GCA    GCA    AGG    CTG
天冬    丝    丙    组    丙    苯丙    缬    组
TCT    GCT    CAT    GCA    TTT    GTC    CAC    TCT
AGA    CGA    GTA    CGT    AAA    CAG    GTG    AGA
丝    苏    蛋    精    天冬酰    组    天冬    天冬酰
TCT    ACT    ATG    AGA    AAC    CAC    GAC    AAC
AGA    TGA    TAC    TCT    TTG    GTG    CTG    TTG
亮    酪    亮    异亮    半胱    天冬酰    苏    赖
TTG    TAC    TTG    ATC    TGT    AAC    ACG    AAG
AAC    ATG    AAC    TAG    ACA    TTG    TGC    TTC
缬    天冬    赖    异亮    异亮    缬    谷    天冬
GTC    GAC    AAA    ATT    ATT    GTC    GAA    GAC
CAG    CTG    TAA    TAA    TAA    CAG    CTT    CTG
甘    精    丙    丙    丙    缬    精    苏
GGA    AGA    GCT    GCT    GCT    GTT    AGA    ACC
CCT    TCT    CGA    CGA    CGA    CAA    TCT    TGG
缬    脯    丝    赖    脯亮    天冬酰    脯
GTT    CCA    AGC    AAG    CCT    TTG    AAC    CCA
CAA    GGT    TCG    TTC    GCA    AAC    TTG    GGT
赖    赖    脯    丝    组    赖    异亮    酪
AAG    AAG    CCA    AGT    CTC    AAG    ATC    TAC
TTC    TTC    GGT    TCA    GTG    TTC    TAG    ATG
精    丙    精    赖    谷酰    异亮    苯丙    亮
CGT    GCT    AGA    AAG    CAA    ATC    TTT    TTG
GCA    CGA    TCT    TTC    GTT    TAG    AAA    AAC
丝    半胱    甘    苏    异亮    丝    丝    脯
TCT    TGT    GGT    ACC    ATC    TCC    TCT    CCA
AGA    ACA    CCA    TGG    TAG    AGG    AGA    GGT
亮    缬    亮    谷酰    精    丝    甘    苯丙
TTG    GTT    TTG    CAA    AGA    TCC    GGT    TTT
AAC    CAA    AAC    GTT    TCT    AGG    CCA    AAA
甘    天冬    脯    异亮    赖    亮    精    丙
GGT    GAC    CCA    ATC    AAG    TTG    AGA    GCC
CCA    CTG    GGT    TAG    TTC    AAC    TCT    CGG
丙    甘    缬    赖    脯    亮    缬    天冬酰
GCT    GGT    GTT    AAG    CCT    TTG    GTC    AAC
CGA    CCA    CAA    TTC    GGA    AAC    CAG    TTG
亮    脯    甘    缬    甘    精    天冬酰    苯丙
TTG    CCA    GGT    GTC    GGA    AGA    AAC    TTC
AAC    GGT    CCA    CAG    CCT    TCT    TTG    AAG
谷酰    天冬    组    酪    半胱    苯丙    苯丙    丝
CAA    GAC    CAT    TAT    TGT    TTC    TTC    AGT
GTT    CTG    GTA    ATA    ACA    AAG    AAG    TCA
脯    酪    精    异亮    赖    脯    谷酰    酪
CCT    TAC    AGA    ATC    AAG    CCT    CAG    TAC
GGA    ATG    TCT    TAG    TTC    GCA    GTC    ATG
谷    丝    苯丙    天冬    天冬    苯丙    缬    精
GAG    TCT    TTC    GAT    GAC    TTC    GTC    CGT
CTC    AGA    AAG    CTA    CTG    AAG    CAG    GCA
甘    天冬    丙    谷    异亮    谷酰    赖    精
GGT    GAT    GCT    GAG    ATT    CAA    AAG    AAG
CCA    CTA    CGA    CTC    TAA    GTT    TTC    TCT
缬    缬    天冬    谷酰    色    酪    丙    天冬酰
GTC    GTT    GAC    CAA    TGG    TAC    GCC    AAT
CAG    CAA    CTG    GTT    ACC    ATG    CGG    TTA
甘    苏    甘    脯    亮    丙    苏    天冬酰
GGT    ACT    GGT    CCT    CTT    GCC    ACT    AAC
CCA    TGA    TCA    GGA    GAA    CGG    TGA    TTG
甘    异亮    谷    丙    甘    缬    赖    异亮
GGT    ATC    GAA    GCT    GCT    GTC    AAG    ATC
CCA    TAG    CGA    CGA    CCA    CAG    TTC    TAG
精    脯    苏    脯    谷    谷    亮    丝
AGA    CCA    ACA    CCA    GAA    GAA    CTC    TCT
TCT    GGT    TGT    GGT    CTT    CTT    GAG    AGA
谷酰    蛋    天冬    谷    丝    苯丙    谷酰    谷
CAA    ATG    GAC    GAA    TCC    TTC    CAG    GAG
GTT    TAC    CTG    CTT    AGG    AAG    GTC    CTC
甘    酪    精    谷    酪    苯丙    谷    天冬
GGT    TAC    AGA    GAA    TAC    TTC    GAA    GAC
CCA    ATG    TCT    CTT    ATG    AAG    CTT    CTG
赖    脯    天冬    赖    脯    缬    蛋    组
AAG    CCA    GAC    AAG    CCA    GTT    ATG    CAC
TTC    GGT    CTG    TTC    GGT    CAA    TAC    GTG
酪    丝    异亮    异亮    丙    甘    苯丙    苯丙
TAC    TCC    ATC    ATT    GCT    GGT    TTC    TTC
ATG    AGG    TAG    TAA    CGA    CCA    AAG    AAG
甘    天冬    组    苏    赖    异亮    脯    脯
GGT    GAC    CAC    ACC    AAG    ATT    CCT    CCT
CCA    CTG    GTG    TGG    TTC    TAA    GGA    GGA
甘    赖    酪    蛋    苏    蛋    苯丙    组
GGA    AAG    TAC    ATG    ACT    ATG    TTC    CAC
CCT    TTC    ATG    TAC    TGA    TAC    AAG    GTG
苯丙    亮    谷    酪    脯    苯丙    丝    精
TTC    TTG    GAA    TAC    CCA    TTC    TCC    AGA
AAG    AAC    CTT    ATG    GGT    AAG    AGG    TCT
甘    丝    异亮    组    异亮    苏    丝    脯
GGT    TCC    ATT    CAT    ATT    ACC    TCC    CCA
CCA    AGG    TAA    GTG    TAA    TGG    AGG    GGT
天冬    脯    酪    丙    丙    脯    天冬    苯丙
GAC    CCA    TAC    GCA    GCT    CCA    GAC    TTC
CTG    GGT    ATG    CGT    CGA    GGT    CTG    AAG
天冬    精    甘    苯丙    蛋    天冬酰    天冬    谷
GAC    CGA    GGT    TTC    ATG    AAC    GAT    GAA
CTG    GCT    CCA    AAG    TAC    TTG    CTA    CTT
精    天冬    蛋    丙    脯    蛋    缬    色
AGA    GAC    ATG    GCT    CCT    ATG    GAA    TGG
TCT    CTG    TAC    CGA    GGA    TAC    CTT    ACC
丙    酪    赖    丝    丝    精    谷    苏
GCT    TAC    AAG    TCT    TCT    AGA    GAA    ACC
CGA    ATG    TTC    TTC    AGA    TCT    CTT    TGG
丙    精    精    丝    天冬    组    苯丙    丙
GCT    AGA    AGA    AGT    GAC    CAC    TTT    GCC
CGA    TCT    TCT    TCA    CTG    GTG    AAA    CGG
甘    谷    缬    苏    丝    组    脯    亮
GGT    GAG    GTC    ACT    TCT    CAC    CCT    CTG
CCA    CTC    CAG    TGA    AGA    GTG    GGA    GAC
苯丙    脯    酪    组    丝    丝    谷    丙
TTC    CCA    TAC    CAC    TCA    TCC    GAG    GCC
AAG    GGT    ATG    GTG    AGT    AGG    CTC    CGG
精    丙    亮    谷    蛋    天冬    亮    谷
AGA    GCC    TTG    GAA    ATG    GAT    TTG    GAG
TCT    CGG    AAC    CTT    TAC    CTA    AAC    CTC
苏    丝    天冬酰    丙    苏    甘    甘    脯
ACC    TCT    AAT    GCC    TAC    GGT    GGA    CCT
TGG    AGA    TTA    CGG    ATG    CCA    CCT    GGA
亮    天冬酰    亮    丝    丙    甘    亮    丙
TTG    AAC    TTG    TCT    GCT    GGT    CTT    GCT
AAC    TTG    AAC    AGA    CGA    CCA    GAA    CGA
组    甘    丝    色    苏    谷酰    脯    亮
CTC    GGT    TCT    TGG    ACT    CAA    CCT    TTG
GTG    CCA    AGA    ACC    TGA    GTT    GGA    AAC
赖    赖    脯    苏    丙    赖    天冬酰    谷
AAG    AAG    CCA    ACT    GCA    AAG    AAC    GAA
TTC    TTC    GGT    TGA    CGT    TTC    TTG    CTT
甘    组    缬    苏    丝    天冬酰    谷酰    缬
GGC    CAC    GIT    ACT    TCG    AAC    CAG    GTC
CCG    GTG    CAA    TGA    AGC    TTG    GTC    CAG
谷    亮    组    脯    天冬    异亮    谷    酪
GAG    CTT    CAT    CCA    GAC    ATC    GAG    TAC
CTC    GAA    GTA    GGT    CTG    TAG    CTC    ATG
天冬    谷    谷    天冬    天冬    赖    丙    异亮
GAT    GAG    GAG    GAT    GAC    AAG    GCC    ATT
CTA    CTC    CTC    CTA    CTG    TTC    CGG    TAA
谷    天冬酰    酪    异亮    精    谷    组    苏
GAG    ACC    TAC    ATT    CGT    GAG    CAC    ACT
CTC    TTG    ATG    TAA    GCA    CTC    GTG    TGA
谷    苏    苏    色    组    半胱    亮    甘
GAG    ACC    ACA    TGG    CAC    TGT    CTG    GGA
CTC    TGG    TGT    ACC    GTG    ACA    CCA    GGT
苏    半胱    丝    异亮    甘    脯    精    谷
ACC    TGT    TCC    ATC    GGT    CCA    AGA    GAA
TGG    ACA    AGG    TAG    CCA    GGT    TCT    CTT
甘    丝    赖    异亮    缬    赖    色    甘
GGT    TCC    AAG    ATC    GTC    AAA    TGG    GGT
CCA    AGG    TTC    TAG    CAG    TTT    ACC    CCA
甘    缬    亮    天冬    组    精    丝    天冬酰
GGT    GTT    TIG    GAC    CAC    AGA    TCC    AAC
CCA    CAA    AAC    CTG    GTG    TCT    AGG    TTG
缬    酪    甘    缬    赖    甘    亮    赖
GTT    TAC    GGA    GTC    AAG    GGC    TIG    AAG
CAA    ATG    CAG    CAG    TTC    CCG    AAC    TTC
缬    甘    天冬    亮    丝    缬    半胱    脯
GTT    GGT    GAC    TTG    TCC    GTG    TGC    CCA
CAA    CCA    CTG    AAC    AGG    CAC    ACG    GGT
天冬    天冬酰    缬    甘    半胱    天冬酰    苏    酪
GAC    AAT    GTT    GGT    TGT    AAC    ACC    TAC
CTG    TTA    CAA    CCA    ACA    TTG    TGG    ATG
苏    苏    丙    亮    亮    异亮    甘    谷
ACC    ACC    GCT    CTT    TTG    ATC    GGT    GAA
TGG    TGG    CGA    GAA    AAC    TAG    CCA    CTT
赖    苏    丙    苏    亮    缬    甘    谷
AAG    ACT    GCC    ACT    TTG    GTT    GGA    GAA
TTC    TGA    CGG    TGA    AAC    CAA    CCT    CTT
天冬    亮    甘    酪    丝    甘    甘    丙
CAT    TTA    GGA    TAC    TCT    GGT    GAG    GCC
CTA    AAT    CCT    ATG    AGA    CCA    CTC    CGG
亮    天冬    蛋    苏    缬    脯    谷酰    苯丙
TTA    GAC    ATG    ACT    GTT    CCT    CAG    TTC
AAT    CTG    TAC    TGA    CAA    GGA    GTC    AAG
赖    亮    甘    苏    酪    谷    赖    苏
AAG    TTG    GGC    ACT    TAC    GAG    AAG    ACC
TTC    AAC    CCG    TGA    ATG    CTC    TTC    TGG
甘    亮    丙    精    苯    终止
GGT    CTT    GCT    AGA    TTC    TAA-3′
CCA    GAA    CGA    TCT    AAG    ATT-5′
（顺序B′）
把上面的核苷酸顺序与已发表的（Lodeboer等人）Hansenula    Polymorpha的醇氧化酶的核苷酸顺序及予测的氨基酸顺序比较，有一些明显的不同，基因大小（及编码蛋白大小）及所用编码等方面也有差异。
P76基因的头51个核苷酸顺序已用标准技术测定，从它推测出的P76蛋白氨基末端的氨基酸顺序如下：
氨基酸顺序：蛋    丙    精    异亮    脯    赖
核甘酸顺序：5′-ATG    GCT    AGA    ATT    CCA    AAA
3′-TAC    CGA    TCT    TAA    GGA    TTT
脯    缬    丝    苏    谷酰    天冬    天冬    异亮
CCA    GTA    TCG    ACA    CAA    GAT    GAC    ATT
GGT    CAT    AGC    TGT    GTT    CTA    CTG    TAA
组    甘    亮
CAT    GAA    TTG-3′
GTA    CTT    AAC-5′
可把这个蛋白P76的顺序与已发表的Hansenula    Polymorpha（ManoWicz等人）的二羟基丙酮合成酶（DHAS）的氨基酸顺序比较。虽有些差别，但仍可看出两个蛋白间的相似性：
Pichia    DHAS：蛋-丙    精-异亮-脯-赖-脯-缬-丝
Hansenula    DHAS：蛋-丝-蛋-精-异亮-脯-赖-丙-丝-丝-苏-谷酰-天冬-天冬-天冬-异亮-组-谷-    -亮-    -缬-天冬酰-天冬-天冬-谷-谷酰-组-谷酰-精-异亮-
根据其明显的同质程度和相似的蛋白大小（大约76000道尔顿），P76被推测为Pichia的DHAS。
如上分析醇氧化酶基因的方法，把Pichia    DHAS蛋白的头51个编码核苷酸与已发表的Hansenula    DHAS的编码核苷酸比较，说明在遗传密码，予测的氨基酸顺序及基因的大小诸方面均可差异。
本发明的5′端调节区的限制酶切图示在图4、5和6。控制多肽P76表达的5′端调节区位于图4a所绘的DNA片段内。如下面详述，清楚地表明大约2.9千对碱基的HindⅢ-XhoⅠ片段含有调节功能。图为CDNA克隆PPC15.0不是一个完全的CDNA拷贝，但似乎它至少是图4a所示包括P76肽编码基因，DNA片段的一部分。因此，人们相信调节功能区位于图4b所示约1300个碱基对的HindⅢ-ECORⅠ片段中。新的含重组部分的β-半乳糖苷酶基因将在下面详细讨论以支持上面的说明。
控制P72肽（醇氧化醇）表达的5′端调节区位于图5所示的大约2000个碱基对的EcokⅠ-BamHⅠ    DNA片段内。下面讨论的含有重组部分的新的β-半乳糖苷酶基因将说明这个DNA片段的可调节的本质。
图6提供一个大约3千对碱基的BamHⅠ-SalⅠ    DNA片段的限制酶切图，该片段包括控制产生P40肽的5′端调节区。该片段与图4、5中详述的5′端调节区在限制酶切点种类与分布上明显的不同。
图10、2a和11分别提供了肽P76，P72（醇氧化酶）和P40的调节区和结构基因的限制酶切资料。然而图10提供控制和为P76肽编码的Pichia    Pastoirs基因组DNA中3.8千对碱基的HindⅢ-PstⅠ片段的详图。图2a提供控制和编码合成P72肽（醇氧化酶）的Pichia    Pastoris基因组DNA的40千对碱基的EcoRⅠ-PruⅡ片段的详图。图11表示控制和编肽合成肽P40的3.7千对碱基的BamHⅠ-EcoRⅡ片段。
基因组克隆PPC6.0，PPG4.0和PPG4.8也都用限制酶切图定性了。克隆PPG6.0在图1a中详述。DNA片段的5′端被认为是起始点。克隆PPC6.0是一个Pichia    Pastoris染色体DNA和HindⅢ片段，大约6千对碱基长，被不同的限制酶如下切割：
限制酶    切点数    距起始点距离（碱基对）
HincⅡ    5    1070，1740，1890
EcoRⅠ    2    3320，5520
XhoⅠ    1    2860
PstⅠ    2    3820，4200
PruⅡ    1    4120
PruⅠ    1    4950
在图2a中详示了克隆PPG4.0，该克隆是染色体DNA的一个EcoRⅠ-HindⅢ片段，大约4千对碱基长。把该克隆的5′端作为起始点，下面是对PPG4.0的内切酶切割资料：
限制酶    切点数    距起始点距离（碱基对）
HindⅢ    3    400，600，1840
PstⅠ    1    850
BamHⅠ    2    1960，1970
SalⅠ    1    2620
BglⅡ    2    1040，2700
KPnⅠ    2    500，2730
XbaⅠ    1    3330
StuⅠ    1    3880
NdeⅠ    1    420
HincⅡ    2    870，2430
SstⅠ    1    1200
BclⅠ    2    1710，4080
AsuⅡ    2    1900，2300
EcoRⅤ    1    1930
PVuⅡ    1    4120
图3a详示了克隆PPG4.8。它是具有下列限制酶切点的Pichia    Pastoris染色体DNA的一个4.8千对碱基的BamHⅠ-EcoRⅠ片段。
限制酶    切点数    距起始点距离（碱基对）
ClaⅠ    1    410
KPnⅠ    3    500，3890，4280
PvuⅠ    1    1120
SalⅠ    1    2900
PruⅡ    1    4135
EcoRⅤ    2    3690，3890
BglⅡ    1    4500
XmaⅠ    1    4800
地基因组克隆PPG6.0，PPG4.0和PPG4.8分别插入大肠杆菌PBR322质粒中。克隆PPG6.0是一个HindⅢ片段，可按常规克隆到PBR322的HindⅢ切点中去。克隆PPC4.0克隆到PBR322的EcoRⅠ-PruⅡ切点间而克隆PPG4.8克隆到PPR322的EcoRⅠ-BanaHⅠ切点间（见例Ⅵ）。用这些质粒转化的大肠杆菌菌株已贮藏在北部地区研究中心（Peoria，Illinois），以保证在本专利申请公开时公众可以取用。贮存号如下：
基因组    实验室命名    贮存号
PPG6.0    LE392-PPG6.0    NRRL    B-15867
PPG4.0    LE392-PPG4.0    NRRL    B-15868
PPG4.8    LE392-PPG4.8    NRRL    B-15869
图7、8和9分别提供了肽P76，P72（醇氧化酶）和P40的3′末端调节区限制酶切图。3′末端调节区是用于控制为上述核苷酸顺序编码的mRNA的转录的结束和聚腺苷酰化以及转译的结束。因而肽P76基因的3′末端调节区，图7所示一个2.7千对碱基的EcoRI-HindⅢ片段用于控制为肽P76或其它从3′端调节区上游插入基因衍生的mRNA转录的结束和聚腺苷酰化以及转译的结束。图8a详示的P72基因的0.2千对碱基StuⅠ-PvuⅡ片段，图8b详示的P72基因的0.3千对碱基的StuⅠ-HiudⅢ片段，图8a详示的P72基因的3.2千对SalⅠ-EcoRⅠ片段及图9详示的P40基因的1.9千对碱基的Pvu-Ⅱ-EcoRⅠ片段不仅对它们的结构基因，也对野生型Pichia    Pastoris有关基因及任何插入3′端调节区上游的外源（即异质）基因具有相似的实用性。
因为在PPG4.0中的醇氧化酶基因结束在AO基因转录结束点的几百个碱基对内，图8c中详示的附加3′顺序按下述步骤得到。第一步是用Eco-RⅠ和SalⅠ酶解Pichia染色体DNA，然后一个2.0千对碱基的32P标记的Ao基因BamHI-HindⅢ片段用Southern吸印法与酶解的DNA杂交。与Ao基因杂交的Pichia EcoRⅠ-SalⅠ酶解片段中，一个3.2千对碱基的片段为Ao基因的3′末端及3′末端侧部的顺序编码。
通过凝胶洗脱回收EcoRⅠ-SalⅠ切割的大约3.2千对碱基的Pichia    DNA片段克隆3′    Ao基因片段，把它插入到用EcoRⅠ和SalⅠ酶解的PBR322质粒中。最后通过用标记的Ao基因片段作为探针进行菌落杂交来鉴定含3′Ao基因片段的重组质粒PPG3.2。用PPG3.2质粒转化大肠杆菌的一个菌株，它已被贮存在北部地区研究中心（NRRC）。贮存号为NRRL    B-15999。图8c表示PPG3.2中的Pichia    DNA片段的限制酶切点图。该片段含1.5千对碱基为3′AO部分从切点SalⅠ到HindⅢ段的编码区和大约1.7千对碱基的AO基因的3′端顺序。也用限制酶切图为Pichia    Pas-toris可调节基因的CDNA克隆定性。在图12详示了一个1.1千对碱基的P76CDNA片段。引用该DNA的5′末端为起始点，限制酶XhoⅠ在距起始点500对碱基处切P76    CDNA，HincⅡ从距起始点950对碱基处切割，EcoRⅠ从1050-1000对处切CDNA。图12所示CDNA克隆以及在图13和14中所示CDNA克隆都具有PstⅠ的末端切点。这些是人为制造的切点，首先是用互补DNA通过G-C尾端配对得到的，从而有利于把DNA片段克隆到PBR322中去。基于Northern杂交及肽产物大小的研究，估计CDNA克隆PPC15.0是P76mRNA的一个不完全的拷贝，只代表整个mRNA的一半。
在图13中，是一个由重叠克隆PPC8.3和PPC8.0建立的P72（醇氧化酶）CDNA的限制酶切图。如上述，DNA的5′端作为起始点，用不同的限制酶处理的醇氧化酶CDNA得到如下大小的片段：
AsuⅡ    2    20，420
EcoRⅤ    1    50
BamHⅠ    2    80，90
HincⅡ    1    550
SalⅠ    1    820
KPnⅠ    1    1850
XbaⅠ    1    1450
RsaⅠ    1    1760
StuⅠ    1    2000
PPC8.0和PPC8.3克隆中的醇氧化酶基因3′末端的限制酶切图揭示了克隆PPC8.3的CDNA失去了大约醇氧化酶mRNA顺序的250个核苷酸（图2）。醇氧化酶mRNA    3′端顺序是在与PPC8.3重叠大约500个核苷酸的PPC80克隆中。
图14是肽P40的一个1.2千对碱基的CDNA的限制酶切图。以其5′端为起始点，PPG克隆被SalⅠ（和HincⅢ）从起点切割大约1000个碱基。
把每个CDNA片段都克隆到PBR322中去，用它们转化大肠杆菌。转化菌株已贮存在NRRC使专利申请公开时公众可以得到。其贮藏号为：
CDNA克隆    实验室编号    贮存号
PPC15.0    LE392-PPC15.0    NRRL    B-15870
PPC8.3    LE392-PPC8.3    NRRL    B-15871
PPC8.0    MM294-PPC8.0    NRRL    B-15873
PPC6.7    LE392-PPC6.7    NRRL    B-15872
上述每个CDNA克隆都用作探针，鉴定和分离对以甲醇为碳源和能源的酵母特有的一些肽编码的染色体DNA。因此，当P.Pastoris生长在甲醇上时，可用这些克隆鉴定含为其特有肽编码的调节或结构顺序的染色体DNA片段。以相似的方式，这些CDNA克隆也作为探针鉴定和分离从其它同化甲醇的酵母得来的等同基因，例如：Torulopsis    molischiana，
Hansenula    Capsu    latum，
H，nonfer    mantons等酵母（见例ⅩⅦ）
克隆PPG4.0的5′端调节区进一步通过测定其5′端上游的核苷酸顺序来定性，这是P72（醇氧化酶）结构基因区。其RNA转译起始点（ATG码）前的250个核苷酸是：
5′-ATGCTTCCAA    GATTCTGGTG    GGAATACTGC    TGATAGCCTA
ACGTTCATGA    TCAAAATTTA    ACTGTTCTAA    CCCCTACTTG
GACAGGCAAT    ATATAAACAG    AAGGAAGCTG    CCCTGTCTTA
AACCTTTTTT    TTTATCATCA    TTATTAGCTT    ACTTTCATAA
TTGCGACTGG    TTCCAATTGA    CAAGCTTTTG    ACTTTAACGA
CTTTTAACGA    CAACTTGAGA    AGATCAAAAA    ACAACTAATT
ATTCGAACG-3′
（顺序C）
克隆PPG4.0启动作用看来是包含在这个核苷酸碱基顺序中。
为更充分叙述这个新DNA，上面顺序C上游的附加301个核苷酸也已测定。这样其mRNA转译起点前的头551个核苷酸为：
5′    AATGGCCCAAA    ACTGACAGTTT    AAACGCTGTC    TTGGAACCTA
ATATGACAAA    AGCGTGATCT    CATCCAAGAT    GAACTAAGTT
TGGTTCGTTG    AAATCCTAAC    GGCCAGTTGG    TCAAAAAGAA
ACTTCCAAA    GTCGCCATAC    CGTTTGTCTT    GTTTGGTATT
GATTGACGAA    TGCTCAAAAA    TAATCTCATT    AATGCTTAGC
GCAGTCTCTC    TATCGCTTCT    GAACCCGGTG    GCACCTGTGC
CGAAACGCAA    ATGGGGAAAC    AACCCGCTTT    TTGGATGATT
ATGCATTGTC    TGATAGCCTA    ACGTTCATGA    TCAAAATTTA
ACTGTTCTAA    CCCTGTCTTA    AACCTTTTTT    TTTATCATCA
AAGGAAGCTG    CCCTGCTTA    AACCTTTTTT    TTTATCATCA
TTATTAGCTT    ACTTTCATAA    TTGCGACTGG    TTCCAATTGA
CAAGCTTTTG    ATTTTAACGA    CTTTTAACGA    CAACTTGAGA
AGATCAAAAA    ACAACTAATT    ATTCGAACG-3′（顺序D）
包含在顺序D中的额外的核苷酸（与顺序C比较）被认为是一个不知道的机制，给顺序C中的启动予以附加的调节功能。必须认识到顺序D只代表例ⅩⅣ和ⅩⅤ中所示1.1千对碱基的DNA片段的一部分顺序，能在酵母中控制基因表达。在1.1千对碱基是DNA片段的附加的控制机能在顺序D中详述。
为进一步叙述这新的1.1千对碱基的DNA片段，完全地叙述了例ⅩⅣ或ⅩⅤ所示整个1.1千对碱基的DNA片段的顺序以指出这能控制酵母基因表达的附加顺序。该核苷酸顺序为如下的顺序D′：
5′-AGATCTAA    CATCCAAAGA
CGAAAGGTTG    AATGAAACCT    TTTTGCCATC    CGACATCCAC
AGGTCCATTC    ACACACATAA    GTGCCAAACG    CAACAGGAGG
GGATACACTA    GCAGCAGAGG    TTGCAACGC    AGGACTCATC
CTCTTCTCTA    ACACCATTTT    GCATGAAAAC    AGCCAGTTAT
GGGCTTGATG    GAGCTCGCTC    ATTCCAATTC    CTTCTATTAG
GCTACTAACA    CCATGACTTT    ATTAGCCCTGT    CTATCCTGGC
CCCCCTGGCG    AGGTCATGTT    TGTTTATTTC    CGAATGCAAC
AAGCTCCGCA    TTACACCGA    ACATCACTCC    AGATGAGGC
TTTCTGAGTG    TGGGGTCAAA    TAGTTTCATG    TTCCCAAATG
GCCCAAAACT    GACAGTTTAA    ACGCTGTCTT    GGAACCTAAT
ATGACAAAAG    CGTGATCTCA    TCCAAGATGA    ACTAAGTTTG
GTTCGTTGAA    ATCCTAACGG    CCAGTTGGTC    AAAAGAAAC
TTCCAAAAGT    CGCCATACCG    TTTGTCTTGT    TTGGTATTGA
TTGACGAATG    CTCAAAAATA    ATCTCATTAA    TGCTTAGCGC
AGTCTCTCTA    TCGCTTCTGA    ACCCGGTGGC    ACCTGTGCCG
AAACGCAAAT    GGGGAAACAA    CCCGCTTTTT    GGATGATTAT
GCATTGTCCT    CCACATTGTA    TGCTTCCAAG    ATTCTGGTGG
GAATACTGCT    GATAGCCTAA    CGTTCATGAT    CAAATTTAA
CTGTTCTAAC    CCCTGTCTTAA    ACAGGCAATA    TATAAACAGA
AGGAAGCTGC    CCTGTCTTAA    ACCTTTTTTT    TTATCATCAT
TATTAGCTTA    CTTTCATAAT    TGCGACTGGT    TCCAATTGAC
AAGCTTTTGA    TTTTAACGAC    TTTTAACGAC    AACTTGAGAA
GATCAAAAAA    CAACTAATTA    TTCGAAACG-3′（顺序D′）
与顺序C和D相比，它们上游（即5′端方向）的顺序D′为控制机能区编码。为确定醇氧化酶RNA转录从哪儿开始，比较基因组CDNA克隆PPC4.0和PPC8.3的这个基因5′末端附近的DNA顺序。CDNA克隆PPC8.3含有醇氧化酶基因非转译区5′端的大约100个核苷酸。基于这个顺序，一个15个碱基的寡核苷酸（5′-CTTCTCAAGTTGTCG-3′）与从-29到-43个核苷酸互补，其中转译起点A（编码为ATG）被命名为+1，而5′端的G被命名为-1。合成该寡核苷酸（见例K），并用它作为合成醇氧化酶到5′端的mRNA的引子。从这个引子扩展试验得到的CDNA顺序揭示了三个不同的Pichia    Pastoris醇氧化酶mRNA转录起始点。大的转录子起始于从转录起始密码开始的114个核苷酸。两个小的转录子开始于醇氧化酶AUG密码上游5′端的117和111核苷酸。
55个在醇氧化酶mRNA起始点前的核苷酸含一个推定的Goldberg-Hogness    box（TATAA    box）结构。TATAAA顺序是发生在醇氧化酶mRNA主要转录于5′末端的-40位，即从该蛋白起始密码上游的165个核苷酸。
醇氧化酶的3′端调节区通过测定其上游的约120核苷酸的顺序而定性，该顺序作为顺序D″表示如下：
5′-TCAAGAGGAT    GTCAGAATGG    CATTTGCCTG
AGAGATGCAG    GCTTCATTTT    TGATACTTTT
TTATTTGTAA    CCTATATAGT    ATAGGATTTT
TTTTGTCAAA    AAAAAAAAAA    AAAAAAAAAA-3′
（顺序D″）
通过测定给P76编码的结构基因克隆的5′端上游的核苷酸顺序进一步为克隆PPG6.0的5′端调节区定性。该mRNA转录起点编码为ATG前的头622个核苷酸被认为是：
5′-TT    CACCCATACA    ACTATAAACC    TTAGCAATTG
AAATAACCCC    AATTCATTGT    TCCGAGTTTA    ATATACTTGC
CCCTATAAGA    AACCAAGGGA    TTTCAGCTTC    CTTACCCCAT
GAACAGAATC    TTCCATTTAC    CCCCCACTGG    AGAGATCCGC
CCAAACGAAC    AGATAATAGA    AAAAAACAAT    TCGGACAAAT
AGAACACTTT    CTCAGCCAAT    TAAAGTCATT    CCATGCACTC
CCTTTAGCTG    CCGTTCCATC    CCTTTGTTGA    GCAACACCAT
CGTTAGCCAG    TACGAAAGAG    GAAACTTAAC    CGATACCTTG
GAGAAATCTA    AGGCGCGAAT    GAGTTTAGCC    TAGATATCCT
TAGTGAAGGG    TGTCCGATAC    TTCTCCACAT    TCAGTCATAG
ATGGGCAGCT    TGTATCATGA    AGAGACGGAA    ACGGGCATAA
GGGTAACCGC    CAAATTATAT    AAAGACAACA    TGCCCCAGTT
TAAAGTTTTT    CTTTCCTATT    CTTGTATCCT    GAGTGACCGT
TGTGTTTAAT    ATAAAAGTT    CGTTTTAACT    TAAGACCAAA
ACCAGTTACA    ACAAATTATA    ACCCCTCTAA    ACACTAAAGT
TCACTCTTAT    CAAACTTCA    AACATCAAAA-3′（顺序D′″）
虽然本领域专业人员都知道调节区在朝向5′端的上游而不在顺序D′″中，但克隆PPG的启动部分含在这个顺序之中。
通过测定P76结构基因的3′端下游的约180个核苷酸顺序进一步给克隆PPG6.0    3′端调节区定性。该顺序作为顺序D″″示如下：
5′-GTCAGCAGTG    TTTCCTGCCA    AAGCCATCAA    GAGGACGTAC
ATGCTCTCAT    TTTTTGGTTT    TCACTGTCCG    ACGGGGTTCG
TAAACTGGCT    TCCTCCTTTT    CCTTTCCTGT    TGCATTTTAT
TTGGTCAAAC    AAAACTAGGG    TCTTTTCCTA    AAACCTTATG
TCAATGGACC    TACCACATAG-3′（顺序D″″）
本发明的上述质粒用于转化酵母。通过把转化的微生物置于碳源缺乏的培养条件可用本发明新的DNA片段调节酵母中基因的表达。酵母在各种被可分解产物和不可分解产物抑制的碳素上生长后，碳源缺乏诱导的基因表达将持续在本发明调节区的控制下。使转化了的酵母的适当种属表达所需基因产物的另一方法是将其置于甲醇上生长。还有另一种诱导所需基因表达的方法是使转化的酵母生长在含被不可分解产物抑制的碳源的基质上。
由于本发明的调节区显示可在不同条件下被诱导，因而它们可用于所有酵母菌株的表达。能生长在甲醇或抑制碳源的可分解产物上的酵母可诱导产生外源产物，即直接产生异质肽，而能生长在抑制碳源的可分解产物上的酵母可通过把它置于碳素缺乏条件下诱导产生外源肽。
本发明优选的转化酵母包括下列属：
白色念株菌属（Candida），（Kloeckera），酵母属（Saccharomyces），裂殖酵母属（Schisosaccharomyces），红色球拟酵母（Rhodotorula），Hansenula，球拟酵母cToru    lopsis），Pichia和Kluyrromyces。选择这些属是因为用它们在生长条件，操作等方面较安全并在先有技术中已知。在本发明的实施例中特别选用能生长在甲醇上以它为碳源和能源的酵母菌株。能在甲醇上生长的酵母属包括：
白色念株菌属（Candida），Kloeckera，酵母属（Saccharomyces），红色球拟酵母（Rhodotomla），Hansenula，球拟酵母（Torulopsis）和Pichia。
通过使酵母生长在抑制碳源的不可分解产物上及生长在碳素缺乏基质上以诱导本发明调节区。酵母能生长在诸如下述的非甲醇产物：葡萄糖、乙酯、甘油、乙醇、乳糖、半乳糖、果糖、蔗糖等。它们两种或多种混合物也用于本发明的实例。通过使宿主微生物生长在一个适当的能抑制诸如甘油或半乳糖的非甲醇碳源的不可分解产物，或使其生长在一个适当的能抑制碳源的诸如乙醇，葡萄糖和果糖等碳源的可分解产物，再使宿主处于碳素缺乏状态，本发明调节区控制下的基因产物即可表达。
此外，本发明调节区处于不同生长条件时即能诱导也可能抑制表达，因此调节一个基因产物的表达要在本发明的调节区控制下才能完成。例如：细胞生长在仅能低水平诱导外源基因的碳源上，然后转到甲醇上，它即可强烈地诱导基因表达。另外，还可用诱导/抑制喂料的混合物使调节基因表达，例如：甲醇-葡萄糖混合物。另一方面，酵母生长在甲醇上高的表达水平可通过加入诸如葡萄糖或乙醇等抑制碳源的生长介质而降低。当然，本领域的技术人员会认识到改变喂料混合物及喂入次序可以在很大程度上控制本发明调节区的基因表达水平。
一个特别优选的宿主菌株是突变菌株Pichia Pastoris Gs115，它是一个不能制造组氨酸的突变，它的命名是由于它具有突变基因型his4。Gs115是从Pichia Pastoris NRRLY-11430衍生的，被贮存在Peoria Illinoss的美国农业部北部区研究中心。贮存号为NRRL Y-15851，贮存日为1984年8月31日。这个特别的宿主被用作不能合成组氨酸的异养突变株。用含HIS4基因的质粒转化宿主很容易得到转化宿主。
由于本发明的调节区是用于调节酵母属菌株异质基因的表达，该属已有大量异养突变菌株人所共知，附加优选的宿主酶母包括ATCC24653（一个trP1    ade1    his2    leu1    gal1    ura1突变），ATCC24684（一个trP1    ade1    his7    gal1    ura1突变），ATCC32810（一个trP5    arg4    his5    lys1    ade2    gal2突变），ATCC34182（一个ade3    his    lys    ura突变），ATCC34352（一个ura2突变），ATCC34353（一个ura2突变），ATCC38523（一个arg1    thr1突变），ATCC38628Laleu2    his4突变），ATCC38660（一个his4    leu2    thr4突变），ATCC42243（一个ura3突变），ATCC    42336（一个ade1    his4    thr4突变），ATCC42403（一个arg4    lys7突变），ATCC42404（一个ade1    his4    leu2突变），ATCC42564（一个ura1    his6突变），ATCC42596（一个his4    leu2    lys1突变），ATCC42957（一个his4    lea2    htr4    trP5突变），ATCC42950（一个ade突变），ATCC42951（一个ade    leu突变），ATCC444069（一个ura1突变），ATCC44070（一个leu2    his4突变），ATCC44222（一个his4突变），ATCC44376（一个his4    ade2突变），ATCC44377（一个his4    Leu1突变），等都是本领域技术人员可得到的。
本领域技术人员会认识到，有用的宿主菌株不限于异养突变。用正选择标记诸如：抗菌素抗性基因，转化原养菌株也提供了鉴定和分离转化菌株的有用工具。
大肠杆菌也是本发明质粒适用的宿主。先有技术已知很多大肠杆菌的菌株是适用的宿主，本发明用的一些菌株总结如下：
菌株命名    贮存号
MC1061    未知
LE392    ATCC＃33572
MM294    ATCC＃33625
上面已经叙述了Pichia    Pastoris转化，下面详述Pichia    Pastoris转化的实验步骤（例Ⅻ），为发展一个P.Pastoris转化系统，分离和鉴定出没有组氨酸脱氢酶活性的不能合成组氨酸的异养突变GS115（NRRL    Y-15851）。
按下述步骤GS115（NRRL    Y-15851）：先酶解细胞壁得到原生质，然后将其与转化DNA混合，再加钙离子和聚乙二醇保温孵育，然后在缺少组氨酸的选择性培养基中再生。转化DNAHIS4基因，只有转化了的细胞才残留在所用的选择性培养基上。
HIS4基因是从P·Pastoris NRRL Y-11430菌株通过用Sau 3A部分酶解总体染色体DNA，再用蔗糖梯度离心分离的。（见例ⅩⅢ），把得到的5到20千对碱基的片段克隆到酿酒酵母一大肠杆菌穿梭载体YEPB（ATCC37115，图33）的BamHⅠ切点中去。结合大约50，000个菌落，然后萃取总体质粒DNA一个his4 ABC突变的酿酒酵母（S·Cerevisiae）菌株5799-4D（NRRL Y-15859）的原生质与大约1微克的YEPB Pichia DNA文库通过Hinnen等人（1978年）的方法混合，使其在缺少组氨酸基质中再生。从5×107总的可再生原生质中得到1×103原养酵母菌落被转化。对照没与质粒DNA混合孵育的没有菌落。从20个His+菌落中萃取总体酵母DNA，转化大肠杆菌。17个酵母DNA样品产生了抗氨苄青霉素的菌落。这些克隆片段进一步用限制酶测其大小及酶切图，并用例ⅩⅢ的§G所述方法测定其与标记酿酒酵母的HIS4片段低紧缩地交叉杂交的能力（杂交后用2×SSC在55℃下洗涤）。每个含HIS4的质粒都包含一个或多个与酿酒酵母HIS4基因杂交的片段。一个这样的含HIS4的质粒被再克隆，得到一个图25所示命名为PYJ8的含HIS4的质粒。它含有PBR325顺序，包括抗氯霉素和氨苄青霉素基因及Pichia HIS4基因。
从类似的程序从P·Pastoris NRRL Y-11430分离的ARG4基因和Arg-的酿酒酵母菌株S2072A基因（一个从Berkely CA的酵母遗传资源中心得到的arg+leu2，trP1 gal2基因）。
本领域的专业人员会认识到Pichia的其它标记基因都可以上述相似的方法用酿酒酵母适当的缺陷型菌株分离。
本发明另外有用的载体是既能增强GS1151    NRRL    Y-15851）转化频率又能保持质粒为稳定的染色体外成分的Pichia衍生的自主复制顺序（PARS）。
为寻找Pichia ARSs，用TaqⅠ部分酶解Pichia Pastoris GS115 DNA，分离出10千对碱基的片段，并把它克隆到PYJ8△CLa唯一的CLaⅠ切点。（见图26）从大约10000个His+Pichia菌落回收质粒DNA，用来转化大肠杆菌。从大约10，000个抗氨基苄青霉素菌落分离质粒，再转化回到GS115。把从40个亚文库转化得到的His+酵母菌落分别划线接种到选择培养基，并分别培养。从每种培养基中选择40个培养物提取酵母总体DNA，并用其转化大肠杆菌。其制备的酵母DNA产生大部分抗氨基苄大肠杆菌菌落的PYA63（PARS1）和PYA10（PARS2）质粒选作进一步分析。这两种质粒以不同频率转化Piehia Pastoris GS115（NRRL Y-15851），每种均含有一个外源DNA插入体。
为衡量ARSS对保持质粒在Pichia中作为自主成分的能力，把用每种质粒转化的酵母培养在选择培养基中，并定期取样。通过把没酶切的酵母DNA与放射标记的PBR325 Sonthern杂交来测定细胞中质粒的顺序状态。在选择培养基中质粒PYA63和PYA90在Pichia内至少保持了10代150代则与染色体DNA结合。
把一个欲测的Pichia自主复制顺序（PARSI）克隆到几个其它Pichia载体用以检验维持转化DNA作为自主成分的能力。经过在选择基质（HiS-）上生长20代后质粒PYJ30（图27中）和PBPf1（图34中）仍以自主成分存在，而且每个细胞内出现多个拷贝。把PYJ30转化的细胞用Sou them吸印法分析显示每个细胞大约有10个拷贝。
为测定含有分别由PYJ30和PBPf1得来的PARS1的质粒PSAOH5（见图18）和PT76H4（见图22b）展示对由衍生它们的质粒的稳定性，把含有生长在选择条件下生长50代的这些载体置于有葡萄糖存在的选择条件下（His-）生长。然后将其转移到非选择性条件（His+）生长，监测其原养性的消失。将这些质粒与移到非选择性基质迅速失去原养性的PYJ38比较其稳定性。人们相信用含有自主复制顺序的质粒PARS1试验，提供了自主的质粒DNA基因表达的结果。
为说明本发明的调节区控制合成蛋白的能力，制备新的DNA。从而，控制为肽P72（醇氧化酶）或P76编码基因的调节区，把大肠杆菌LacZ基因植入一些质粒中。例ⅩⅣ中叙述了制备质粒PsAoH1    PSAOH5    PSAOH10    PTAFH85    PT76H1    PT76H2    PT76H3和PT76H4的过程。
虽然把本发明的调节区-β-半乳糖苷酶基因融合引入酶母细胞是用质粒作用载体，本领域的专业人员会认识到并不需要通过质粒把调节区-基因工程产物引入细胞。因此，可应用能在酵母中保持的任何分子。然而，本发明的调节区-结构基因工程产物可通过除质粒外的其它载体繁殖，还可结合到宿主酵母细胞的染色体上。
本领域专业人员也会认识到本发明范围不限于这里揭示的调节区调节下生产β-半乳糖苷酶。本发明调节区调节下生产肽的种类只限于读者的想象内。制备为所需各种肽编码的DNA顺序所需的许多程序都已存在。例如：不同长度的寡核苷酸可用已知程序合成，一些这样的寡核苷酸又可结合起来，根据其特异性的碱基配对加长，形成双键分子。组成这双键分子的寡核苷酸通过DNA连接酶连接。另一方面，含所需编码顺序的DNA分子还可通过用反向转录酶，以所需肽的信息RNA为模板合成之。另一种可能是克隆基因组DNA片段和观察所需产物是否直接表达。
可以通过不同方法修饰为所肽编码的DNA顺序以制备调节区一结构基因工程产物。例如：上述把制备的DNA末端用连接酶连接到含为特异的限制酶识别的核苷酸顺序的短双键DNA分子上，称之为连接分子。用特异限制酶酶解这些分子，然后连接在制备的DNA顺序末端与限制酶识别切点相对应的末端。
本发明制备的三个特异的调节区-β-半乳糖苷酶基因工程产物已根据在图15和16中的限制酶切图叙述了。图15中限制酶切图说明了一个包含从PPG6.0和大肠杆菌的LacZ基因调节区5′端衍生的一个0.85千对碱基HindⅢ-BamHⅠ部分的工程产物（表示3.6千对碱基BamHⅠ-NruⅠ片段）分别存在于质粒PTAFH85，PT76H1和PT76H2中的这个相同工程产物下面已详述（见例ⅩⅣ）。图15b中的限制酶切图叙述了一个含从PPG6.6和大肠杆菌LacZ基因调节区5′端衍生的1.3千对碱基的HindⅢ-EcoRⅠ部分的工程产物（表示3.6千对碱基BumHⅠ-NruⅠ片段）。分别存在于质粒PTAFH85，PT76H1和PT76H2中的这个相同的工程产物下面详述（见例ⅩⅣ）。图15b中的限制酶切图叙述了一个含从PPG6.0和大肠杆菌LacZ基因调节区5′端衍生物的1.3千对碱基的HindⅢ-EcoRⅠ部分的工程产物。分别存在于质粒PT7601，PT76H3和PT6H4中的这个相同工程产物下面已详述（见例ⅩⅣ）。
图16是一个含从PPG4.0和大肠杆菌LacZ基因调节区5′端衍生的1.1千对碱基EcoRⅠ-RamHⅠ片段的工程产物的限制酶切图。分别存在于质粒PSAOH1，PSAOH分别和PSAOH10中的这个工程产物下面已详述（见例ⅩⅣ）。
图17中图解了质粒PSAOH1，除了含有图16中详示的调节区β半乳糖苷酶基因融合物外，质粒还含有;
（a）包含氨基苄青霉抗性（AmPR）基因的PBR322顺序：
（b）Pichia Pastoris HIS4基因;
（c）酿酒酵母2μ环状DNA;和
（d）酿酒酵母的切断的URA3基因。
然而质粒具有在大肠杆菌和酵母宿主中转化和复制的能力。无论在大肠杆菌还是酵母中可选择的标记都用于基因工程。
图18图示质粒PSAOH5。该质粒与上述的PSHOH1相似，只是缺乏了酿酒酵母2μ环状DNA及一些Pichia    Pastoris    HIS4基因的侧部DNA，同时加上了一个Pichia    Pastoris
自主复制顺序（PYA6的PARS1）。
图19图示了质粒PSAOH10，该质粒含有：
（a）调节基因-β-半乳糖苷酶基因融合物;
（b）包括提供四环素抗性，氯霉素抗性和氨苄青霉素抗性基因的PBR326顺序。
（c）酿酒酵母HIS4基因（如上述从质粒PYA2得到）。
质粒PTAFH85，PT76H1和PT76H2是与上述三个质粒类似的，只是所用的调节区-β-半乳糖苷酶基因融合物是图15a叙述的（而不是图16所述融合物）。
质粒PT76H3和PT76H4分别与PSAOH1和PSAOH5相似，只是所用的调节区-β-半乳糖苷酶基因融合物是图15b所述的（不是图16所述的）。
质粒PTAFH85示在图20，包含：
（a）图15a所示的调节区-β-半乳糖苷酶基因;
（b）包含氨基苄青霉素抗性基因的PBR322顺序;
（c）Pichia Pastoris HIS4基因;
（d）酿酒酵母2μ环状基因;和
（e）酿酒酵母的切断的URA3基因。
质粒PT76H1示在图21中，包含;
（a）图15a所示调节区-β-半乳糖苷酶基因融合物;
（b）包含氨苄青霉素抗性基因的PBR    322顺序;和
（c）Pichia Pastoris HIS4基因和自主复制顺序（PARS1）。质粒PT76H2示在图22，含有;
（a）图15a所示调节区-β-半乳糖苷酶基因融合物。
（b）含有提供四环素抗性，氯霉素抗性和氨苄青霉素抗基因的PBR 325;和（c）酿酒酵母HIS4基因。
质粒PT76H3示在图22（a），包含：
（a）图15a示调节区-β-半乳糖苷酶融合物;
（b）包含氨基苄青霉素抗性的PBR322顺序;
（c）P·Pastoris HIS4基因。
（d）酿酒酵母2μ环状DNA;和
（e）酿酒酵母的切断的URA3基因。
质粒PT76H4示在图22b中，包含：
（a）图15b所示调节区-β-半乳糖苷酶基因融合物;
（b）含有氨苄青霉素抗性基因的PBR    322;
（c）P·Pastoris HIS4基因;和
（d）P·Pastoris自主复制顺序（PARS1）
用含上述遗传工程产物的新β-半乳糖苷基因转化P·Pastoris    GS115（NRRL    Y-15851），得到的一些转化酵母菌株已贮存在美国农业部北部区研究中心，贮藏号如下：
宿主    质粒    转化菌株贮存号
GS115    PSAOH1    NRRL    Y-15852
GS115    PSAOH5    NRRL    Y-15853
GS115    PSAOH10    NRRL    Y-15854
GS115    PTAFH85    NRRL    Y-15855
GS115    PT76H1    NRRL    Y-15856
GS115    PT76H2    NRRL    Y-15857
含工程产物的新β-半乳糖苷酶基因也用于转化大肠杆菌。转化的菌株也贮存在NRRC，以保证专利公开后为公众索取。转化菌株贮藏号如下：
宿主    质粒    转化菌株贮存号
MC1061    PSAOH1    NRRL    B-15861
MC1061    PSAOH5    NRRL    B-15862
MC1061    PSAOH10    NRRL    B-15863
MC1061    PTAFH85    NRRL    B-15864
MC1061    PT76H1    NRRL    B-15865
MC1061    PT76H2    NRRL    B-15866
MC1061    PTAOI3    NRRL    B-15875
MC1061    PT76H3    NRRL    B-18000
MC1061    PT76H4    NRRL    B-18001
MC1061    PT76U1    NRRL    B-18002
把上述本发明含醇氧化酶和P76调节区-LacZ基因融合物的头八个质粒分别转化的P·Pastoris    GS115（NRRL    Y-15851）置于补加了生物素及葡萄糖的基本培养基作为碳源的固定期上生长。一旦细胞达到固定相就将其转移到补加生物素和甲醇作为碳源的基本培养基上。细胞在30℃下生长3～5代后，将其转移到补加生物素的新鲜基本培养基上，然后再在以葡萄糖或甲醇为碳源的培养基上生长。不同的时间取样用例Ⅶ和ⅩⅤ方法分析醇氧化酶和β-半乳糖苷酶的存在。
发现细胞在以葡萄糖为碳源的基质上生长没观察到β-半乳糖苷酶或醇氧化酶。而以甲醇为唯一碳源时，醇氧化酶和β-半乳糖苷酶却在有意义的水平表达。还发现在葡萄糖上生长的细胞再放在碳源缺乏条件下也能表达出可测量到的醇氧化酶和β-半乳糖苷酶。因此，很清楚，本发明的调节区在甲醇存在或碳源缺乏时才起作用。
已证明本发明的调节区是当生长在抑制碳源的不能分解物上生长在碳素缺乏条件下才起作用，含醇氧化酶调节区的质粒PTAOB和含P76调节区的PT76U1都用可转化一种利用非甲醇碳源的酵母菌株-酿酒酵母。实验室命名为SEY2102-PTAOB的转化菌株贮存在NRRC，以供公众索取。贮存号为NRRLY-15858。酿酒酵母NRRLY-15858和SEY2102-PT76U1先生长在葡萄糖、果糖、乙醇、甘油和半乳糖上大约五代，再置于碳源缺乏的条件。五代后用常规方法测定β-半乳糖苷酶（见例ⅩⅤ）表明在甘油和半乳糖上生长的细胞产生大量β-半乳糖苷酶，而在葡萄糖和果糖上生长的细胞基本上没有β-半乳糖苷酶。在置于硫源缺乏下生长6小时后测量β-半乳糖苷酶，观察到生长在葡萄糖及果糖上转化细胞生产中等量的该酶，而生长在甘油和半乳糖的细胞生产了大量的该酶。因此，本发明的调节区可控制在遗传上非常不同的酵母宿主中生产蛋白产品，而且不局限于用在利用甲醇菌株。
实例
下面例子中所用缓冲液和溶液的组成如下：
1M    Tris（三羟甲基甲氨）缓冲液：
把1.21克Tris碱溶剂到800毫升水中，加35%盐酸溶液调节PH至所需值，室温冷却，调至PH到最后值，稀释到终体积1升。
S-缓冲液：
把1.5M山梨醇醇溶在0.04M磷酸钠、PH调至6.6PK缓冲液：
把0.14M氯化钠，1%SDS（十二烷基磺酸钠），0.01M    EDTA（乙二胺四乙酸），置于0.05M（PH8.4）的Tris缓冲液。
ETS缓冲液：
把10mMHDTA，0.2%SDS置于0.01M（PH7.4）的Tris缓冲液。
TE缓冲液：
把0.1mMEDTA置于0.01M（PH7.4）Tris缓冲液。
SSC：
含0.15M氯化钠及15mM柠檬酸钠用氢氧化钠调PH至7。
TAE：
将40mM乙酸，5mMEDTA置于0.02M（PH8.3）的Tris缓冲液。
PBC（碳酸缓冲盐溶液）：
含10mM磷酸钠（PH7.0）及0.15M氯化钠。
Laemmli负载缓冲液：
含62.5mM    Tris-Hcl（PH6.8），2%    SDS，10%甘油，5%2-硫基乙醇，0.01%溴酚兰。
RIPA缓冲液：
PBS中含1%NP40（Sigma公司出品），1%Sodium    deoxycholate，0.1%    SDS：
20X    SSPE：
含20mMEDTA，0.16M氢氧化钠，0.2M含水磷酸二氢钠，3.6M氯化钠，用氢氧化钠调PH至7.0。Denhardts
氏溶液（50X）：
把5g    Ficoll，5g聚乙烯吡咯烷酮，5g牛血清蛋白（Pentaxv部分）加水使总体积为500ml。
予杂交缓冲液：
含5X    SSPE，5XDenhardt氏溶液，50%去离子甲酰胺，0.2%    SDS，200μg/ml剪碎与变性的腓鱼精子DNA。
LB培养基：
把5g    Bacto-trgPtone（商品名），5g    Bacto-酵母萃取物，2.5g氯化钠加入水使之终体积为1升，用氢氧化钠调PH至7.5。
YPD基质：
含1%  Bacto-酵母萃取物，2%细菌蛋白栋（Bac+0-PePton），2%右旋糖（Dextrose）。
SD介质：
把6.75克不含氨基酸的酵母含氮碱DIFCO，2%右旋糖加水到1升。
SED含1M山梨醇，25mMEDTA，50mMDTT。
SCE缓冲液：含9.1g山梨醇，1.47g柠檬酸钠0.168g    EDTA，加水至50ml，用Hcl调PH至5.8。
CaS：含1M山梨醇，10mM氯化钙用于消毒过滤。PEG溶液：
含20%聚乙二醇-3350，10mM氯化钙，10mM    Tri-Hcl（PH7.4）于消毒过滤。
SOS：含1M山梨醇，0.3XYPD介质，10mM氯化钙，甲酰胺染料混合液;0.1%二甲苯CyLeno1FF，0.2%溴酚兰，10mMEDTA，95%去离子甲酰胺。
顶层凝胶（ToPgel）：76.8g尿素，24ml丙烯酰胺母液，8ml    10XTBE，加水最终体积为160ml。
丙烯酰胺母液：38克丙烯酰胺，2克N-N′-亚甲双丙烯酰胺，加水使最终体积达100ml。
低层凝胶（BOttmgel）：14.4克尿素，3.0克蔗糖，7.5毫升10×TBE，4.5毫升丙烯酰胺母液，0.3ml溴酚兰液（0.01克/ml），加水至30ml。
杂交选择用予杂交缓冲液：
50%甲酰胺，0.75%氯化钠，0.1MTris（PH7.4），0.008    MEDTA，0.5%SDS，200μg/ml兔肝tRNA（西格马公司）。
0.5M    NETS缓冲液：
0.5M氯化钠，10mMEDTA，10mMTris（PH7.4），0.2%SDS。
10XRT缓冲液：
500mM氯化钠，340mM    Tris（PH8.3），60mM氯化镁，50mM二硫苏糖醇（DTT）。
dilRT液：
x4ul水，1ul    10×RT缓冲液，5ul反向转录酶15单位/ul
（Life    Scienccs公司出品）
dideoxy：（二脱氧三磷酸核苷）
二脱氧ATP    0.49mM，二脱氧CTP    0.1165mM，二脱氧GTP0.369mM，二脱氧TTP0.82mM。
dNTP混合液：
0.625mM脱氧GTP，0.625mM脱氧ATP，0.625mMTTP，
Chase溶液：
1×RT缓冲液中含1.125mM脱氧ATP，1.125mM脱氧CTP，1.125mM脱氧GTP，1.125mMTTP。
除了特别说明的外，上述溶液都代表Ⅸ的基本浓度。例中所用不同浓度的上述溶液用量为1×浓度的倍数。
下面用例中的缩写的含义的：
EDTA    乙二胺四乙酸
TEMED    N，N，N′，N′-二甲基乙二胺
DTT    二硫苏糖醇
BSA    牛血清蛋白
EtBr    溴化乙锭
Ci    居里
dATP    脱氧腺苷三磷酸
dGTP    脱氧烏苷三磷酸
TTP    胸苷三磷酸
dCTP    脱氧胞苷三磷酸
dXTP    一般的脱氧三磷酸核苷酸
（OligacdT）12-18来源于联合研究公司（Collaborative    Research    Inc）
酵解酶Zymolyase    60，000来源于：Miles实验室
根据标准程序的所用常规方法，将在这里详述。离心时间和速度以离心液澄清为准。对酵母细胞需以1500g转速离心至少5分钟。
用苯酚/氯仿/异戌醇萃取核酸包括把含核酸溶液混入等体积的50∶48∶2的上述混和液。再用等体积的氯仿/异戌醇（48∶2）混合液处理。凝胶或滤纸冲洗或浸泡在某一特定溶液时，把整个凝胶滤纸浸在其中（在盆、盘或试管中）使整个凝胶或滤纸等与感兴趣的溶液充分接触。
用乙醇沉淀核酸包括首先调整含核酸溶的盐含量。然后使溶液与二体积冷乙醇混合。
例1：酵母细胞的生长和制备
使Pichia Pastoris NRRL Y-11430生长在含甲醇或乙醇为唯一碳源的Wegner美国专利4，414，329叙述的IMI盐基本培养基上，在30℃下连续培养。IM1基本培养基每升含36mM KH2PO4，23mM（NH4）2SO4，2mM MgSO46.7mMKCe，0.7mMCace2，0.2uMCaSO45H2O，1.25uMKI，4.5uM MnSO4，2uM Na2MOO4，0.75uMH3BO3，17.5uMZnSO4，44.5uMFecl2和1.6uM生物素。生长在甲醇上细胞密度在孵育X时间为12小时后达到140g/l（干重）。生长在乙醇上的经过11.5小时的孵育密度达90g/l。把甲醇或乙醇喂入发酵器时，分别用20%和45%的酵母液。
把Pichia Pastoris细胞发酵产物用离心法收集。再以108细胞/ml悬在含1%2-巯基乙醇的0.1MTris（PH8.0）。把这些细胞孵育在37℃下5到10分钟，再离心收集。沉淀用30ml的S-缓冲液洗一次，再以5ml/g细胞悬在30ml的S-缓冲液中。把酵解酶（来自Miles生化公司）加到细胞悬液使其最终浓度达500从g/ml。将细胞在37℃孵育20分钟，再离心。除去上清液，收集细胞沉淀。将这沉淀冷冻在液氮中贮存在-70℃备用。
例Ⅱ：分离酵母DNA
用研缽磨碎例Ⅰ中制备的冷冻沉淀，再在Waring    Blender搅拌器用与液态混合，进一步磨碎冷冻沉淀2-5分钟，然后以每克细胞加7.5ml的浓度加PK缓冲液，再加蛋白酶K，使悬液蛋白酶K终浓度为400ug/ml，然后将其置室温下孵育10分钟。用苯酚/氯仿/异戌醇混合液萃取RNA，再用氯仿/异戌醇混合物萃取。将水相调至含0.25M氯化钠再加乙醇沉淀核酸。将得到的沉淀悬在尽可能小体积的ETS缓冲液，即加入的体积足够溶解核酸即可。一般大约每ml缓冲液可溶100ug到1mg核酸，可用苯酚/氯仿/异戌醇重新萃取）再用氯仿/异戌醇萃取，最后用乙醇沉淀之。
把核酸再溶在尽量小体积的TE缓冲液中。将该溶液中的RNA通过4ml氯化铯垫所用缓冲液含1克氯化铯/ml，1mM    EDTA，10mMTrisPH7.4）离心沉淀，或在2M氯化锂溶液中于4.8℃
下放置过夜，然后再通过离心收集，从而富集了RNA。通过在寡胸腺苷（oligadT）纤维素柱亲和层析从溶液中选出PolyA+RNA（聚腺苷RNA）。一般5到10毫克总体RNA需0.25克oligadT纤维素，3型（来自Collaboratire Research）用作层析。把0.25克OligdT纤维素混入2mlETS缓冲液中，搅拌并将其倒入一个小的硅化玻璃柱内。用10ml 0.1M NaoH从上部分层洗柱，使洗液能流过oliga纤维素基质。然后以同样方式用10ml ETS缓冲液洗，最后用10ml的0.5MNETS缓冲液洗。
把总体RNA（5到10毫克）重悬在ETS缓冲液中，使其浓度低于约10mg/ml，置65℃水浴中2分钟，然后立即移至冰中。然后置于室温下并加5M Nacl液使RNA溶液的最终Nacl浓度为0.5M。将该RNA液装入oligadT纤维素柱，使其以1滴/5秒的速度缓慢流过柱，流出的材料收集在管中，再重新装入柱顶部，从底部收集材料再经二将装入柱顶，RNA溶液三次通过柱，然后收集并标上PolyA-的标签，即不是PolyA+-RNA。然后用30ml 0.5M NETS洗脱，最后装5ml ETS缓冲液进柱使其缓慢流过柱以洗脱出PolyA+RNA，然后以5ml的小份从柱底收集Poly+RNA。假设PolyA+RNA中设Nacl，将它的Nacl浓度调至0.25M，然后用乙醇沉淀该RNA。
例Ⅲ：建立CDNA文库
互补DNA（CDNA）克隆合成如下：把10ug例Ⅱ制备的Poly+RNA重悬在7ul水中，使CH3HgoH终浓度为2.7mM，然后置于室温孵育5分钟。在一个含50mM Tris（PH8.3），
10mM Mgcl2，30mM2-巯基乙醇，70mM Kcl，500μM的dATP dGTP和TTP，200μM的cdcTP，25μg/ml寡（dT），60μg/ml的放射菌素D，25单位的RNasin25μ居里α-32P dcTP（22.5PM）和120个单位的反向转录酶的溶液中，42℃下孵育15分钟，第一个CDNA链被合成。把该反应混合液在37℃再孵育15分钟，通过加入2μl的0.5MEDTA和0.5μl 20%SDS结束反应。再将其NaoH浓度调至0.3M，在65℃下孵育30分钟。加10μl的1MTris（PH7.4）以中和反应混合液，再把其Hcl浓度调至0.21M。然后用苯酚/氯仿/异戌醇混合液萃取反应液，然后用氯仿/异戌醇萃取，最后通过用TE缓冲液平衡的Sepha dexG 50柱层析。把具放射标记的单链CDNA合在一起，用丁醇萃取或真空离心浓缩使体积为100μl。再用乙醇沉淀浓缩单链CDNA液，离心收集，再重悬在100μl水中。
把上述单链CDNA水溶液调至含2.5M醋酸铵，然后用乙醇再沉淀，离心收集，重悬到20μl的水中。然后用含5mM Mgcl21mM2-巯基乙醇250μM的dATP，dGTP和TTP，125μMdCTP，25μ居里的X-32P dcT（32.5PM）和8个单位Klenow DAN POLI片段的50mM磷酸钾缓冲液（PH7.4）将其终体积调至50μl。把上述混合液在37℃下孵育1小时以合成互补的第二条DNA链。加入2μl的0.5MEDTA结束反应。用苯酚/氯仿/异戌醇萃取双链DNA，再用氯仿/异戌醇萃取，然后通过一个用TE缓冲液平衡的SePhadeXGO柱层析。将收集的双链CDNA合併，浓缩，再如上述用于单链CDNA
方法沉淀之。
乙醇沉淀后离心收集双链CDNA，沉淀重悬在20.25μl水中。然后用含10mM Mgcl2，30mM巯基乙醇，70mMKcl，500μm dXTP和150个单位的反向转录酶的50mMTris（42℃下PH8∶3）将终体积调至50μl，把得到溶液在42℃下孵育15分钟以完成第二个CDNA链的合成。加2μl的0.5MEDTA结束反应，浓缩并如上用于沉淀单链CDN方法沉淀之。
把双链CDNA沉淀重悬在42μl水中，加入含2.8M Nacl200mM NaoAc（醋酸钠）和45mM ZnSO4的5μl母液使其终体积为47μl。再用Hcl在22℃下调PH至4.5。为酶解发夹环，用三个不同浓度的S1核酸酶（Sigma公司）进行三个分离反应。在50μl上述混合液中分别加入1单位，10单位或100单位的S1核酸酶，于22℃下孵育30分钟。加6μg兔肝tRNA为载体，然后浓缩混合液，如上述沉淀之，只是DNA沉淀重悬在TE缓冲液而不是在水中。重悬在20μlTE缓冲液后，用含10PM的CX-32P-dCTP，2μMdaTP和21个单位的末端转移酶（RatLiff生化公司产品）的末端转移酶缓冲液（BRL）把终体积调至50μl。所得溶液在37℃下孵育30分钟以把一个Polyd（c）尾加到双链CDNA的3′-OH端。加5μl 0.5MEDTA结束反应。萃取，层析得到乙醇沉淀贮存起来。
将有dcc）尾巴的双链CDNA或直接重退火到PstⅠ位点打开的含Polgd（G）尾巴的质粒PBR322上或与从SePharose    CL4B-200柱上洗脱的最大部分（25μl）混合退火。把每个
25μl层析后部分与50μl含125mg    POlgd（G）尾退的PBR322退火，退火混合液终体如上。退火反应在65℃下进行3分钟。然后置42℃下2小时，再缓冲冷却到室温。
退火了的CDNA文库转化到具药性的大肠杆菌LE932（ATCC 3357），方法如下：把LE392接种到2×LB基质，37℃下培养过夜，取5ml接种到200ml新解2×LB介质中，并在37℃下生长到细胞浓度为oD600＝0.2～0.3。将其置于冰中10分钟，在4℃下离心收集细胞。然后将其重悬到80ml冰冷却的0.1M Cacl2中，于4℃下孵育25分钟。4℃下离心收集细胞。再将其重悬2ml冷0.1M Cacl2中，用之前在℃下孵育至少2小时。然后，每50μl退火混合使用200μl有耐药性细胞转化之。将耐药细胞与DNA结合，在约4℃下孵育10分钟，再在37℃下孵育5分钟，最后置于冰中10分钟。把等体积的2×LB介质加到转化混合液，再在37℃下孵育45分钟。将转化细胞以250μl/培养皿置于含15μg/ml四环素的150mm2×LB的培养皿中。将培养皿置于37℃孵化24小时，贮存在4℃。
将硝酸纤维滤纸盖到滤出培养器中菌落的滤纸上得到复制滤纸，将这些复制滤纸置于2×LB-Tet（含15μg/ml四环素）培养皿上孵育。为制备滤纸上的探测菌落，通过把这些滤纸转移到含200μg/ml氯霉素的2×LB-Tet培养皿，在37℃孵育至少12小时，然后将其浸在含1.5MNacl和0.5M    NaoH溶液池中10分钟以溶解菌落。然后将其浸在含1.5M    Nacl和0.5M    Tris（PH7.4）的溶液池15分钟以中和滤纸，重复这个中和步骤。然后风干滤纸，最后在70℃，真空下干燥2小时。
例Ⅵ：菌落杂交
将上例制备含CDNA文库的真空干燥的硝酸纤维滤纸在予杂交缓冲液中于42℃下予交5小时，取出滤纸，用带手套的手在5×SSPE液中轻擦滤纸以除去细胞残留物。然后将滤纸置于杂交缓冲液（除1×Denhardt氏外，其余成分与予杂交缓冲液相同）。用32P标记的单链CDNA（106cPm/ml）或用尾端标记的PoLYA+RNA与上述滤纸在42℃杂交17小时。然后用2×SSPE液于22℃下洗滤纸，再用0.1×SSPE于65℃下洗两次，每次洗10分钟。
为标记PolyA+mRNA加到含50mM Tris（PH9.5）的50μl溶液中，三分钟内加热到100℃，然后迅速在冰中冷却。将该RNA溶液稀释到200μl，调至Tris为50mM（PH1.5）Mgcl2为10mM，DDT5mM，32P-α-ATP为50PM，再加10个单位T4多聚核苷酸激酶，将混合液于37℃孵育1小时。加入10ml的0.5MEDTA以结束激化反应，再用苯酚/氯仿/异戌醇萃取之，再通过SePhadeXG50层析以除去未结合的放射性标记。
例Ⅴ：Nathern杂交
把2-5μg的PoLYA+mRNA在含50%甲酰胺，2.2M甲醇和0.5mM EDTA的10mM磷酸钠缓冲液（PH7.4）中于65℃下加热5分钟。然后置于室温冷却之。加入适当量的5X样品缓冲液（一般为被处理样品体积的0.2倍，该缓冲液含0.5% SDS，0.025%溴酚兰，25%甘油和25mMEDTA）。再将样品置于1.5%
琼脂糖凝胶上（该凝胶在含1.1M甲醛的10mM磷酸缓冲液中制备），然后在同样缓冲液中电泳。凝胶用溶在10mM磷酸钠缓冲液（PH7.4）的吖啶橙133μg/ml染色，通过浸泡在同样缓冲液10分钟，浸泡在10×SSPE中至少10分钟来脱色。RNA如例Ⅵ所述方法转到硝酸纤维滤纸上。
例Ⅵ：分离基因组DNA和克隆
用例Ⅱ中分离Pichia    RNA方法分离它的基因组DNA。把核酸沉淀重悬在尽量小体积的TE缓冲液中，加20μg/ml核酸酶A在37℃下孵育30分钟。然后加Nacl使溶液中Nacl浓度为0.14M，然后用20μg/ml的蛋白酶K在22℃下处理15分钟。用苯酚/氯仿/异戌醇萃取，再用氯仿/异戌醇萃取，然后用乙醇沉淀之。把DNA沉淀重悬在尽量小体积的TE缓冲液中，离心澄清DNA溶液。
把上述制备的Pichia基因组DNA    10μg用不同的限制酶（在BRL缓冲液中）酶解，再在含TAE的1%琼脂糖凝胶上走电泳。将含DNA片段的凝胶浸在1.5M    Nacl，0.5MNaoH中20分钟使DNA变性。再浸在1.5M    Nacl，0.5M    Tris（PH7.4）中20分钟以中和。转移前再把凝胶浸在10×SSPE中至少5分钟。把硝酸纤维纸切成凝胶一样大小，用水湿润再浸在10×SSPE中，将该滤纸铺在凝胶上面，将反面置于一块玻璃纸上，将一张Whatman滤纸和一叠手纸置于硝酸纤维纸上面以将DNA从凝胶中吸出并移入硝酸纤维纸。用一块有份量的物体压在纸上以利于DNA转移。以此方法至少要转移3小时。然后将滤纸浸入5×SSPE中，风干，再在真空条件，70℃下干燥2小时，通过用例Ⅳ中所述予杂交，杂交和洗脱缓冲液缺口翻译的CDNA克隆PPC8.0，PPC6.4和PPC15.0杂交来鉴定互补基因组片段。
将200ng的CDNA克隆在含50mM Tris-Hcl（PH7.4），10mM MgSO4，10μMDTT，50μg/ml BsA，20μM和dGTP，TTP和dATP，31.25PM32P-α-dcTP（3200居里/mM，NEN），2个单位的大肠杆菌DNA Poly-Ⅰ（在BRL缓冲液中）和0.02ng的脱氧核糖核酸Ⅰ的30μl的混合液中，于14℃下缺口转译90分钟。加1μl的0.5MEDTA和1μl的20%SDS结束反应。把标记了DNA溶液加NaoH，使NaoH浓度为0.3M，然后将其置于沸水中3分钟，将此混合液在一个SePhadex G50柱上层析。将收集的各部分标记DNA合併在一起，测定其比活性，用于杂交实验的探针。
分离与CDNA探针杂交的基因组片段是通过用不同限制酶酶解200μg的Pichia基因组DNA，然后将其置于TAE液配制的1%琼脂糖凝胶上走电泳。从凝胶切下适当大小的带，用电泳洗脱其中的DNA，再将其通过一个ELutiP柱Lscheicher和Schuell（方法），再用乙醇沉淀之。
把上述得到的片段重悬在水中，把200ng片段与在适当限制酶切点切割，必要时去磷酸化的PBR322 500ng连接。连接反应在含6.6mM Mgcl2，10mM DTT，0.4m MATP，25μg/ml BSA和4.0-8.0个单位的T4DNA连接酶的300μl 6.6mM Tris（PH7.4）缓冲液中进行。然后在4℃下孵育24小时。把连接混合液直接转到有耐药性的LE392大肠杆菌细菌内。细胞产生耐药性，转化如例Ⅲ完成了。用10，40和100ng的PBK322（加上插入体）进行三个转化，每转化都在100μl耐药细胞中进行。细胞如例Ⅲ方法被涂在培养器中，只是抗菌素选择是用50μg/ml的氨基苄青霉素。将所得克隆转到硝酸纤维纸上，如例Ⅲ所述的方法准备杂交。滤纸用合适的缺口转译的CDNA片段探测。条件纯化的杂交正菌落用于制备附加质粒如下。
把携带质粒的LE392大肠杆菌在含50μg/ml氨苄青霉素的1×LB介质中生长到D600＝1，再加氯霉素终浓度达200μg/ml，放置过夜似扩大培养，在0.8%Nacl，20mM    Tris（PH8.0），200mM    EDTA混合液中洗细胞，然后将在25%蔗糖50mM    Tris（PH7.4）和20mM    EDTA中加溶酶体450μg/ml溶酶体以处理溶酶体。混合细胞及处理过的溶酶体，加5M    Nacl，使混合混的Nacl达2.0M，再加等体积的0.2%    Triton    X-100和40mMEDTA溶解细胞。将其在20，000转/分离心45分钟以澄清溶液。然后将上清液用苯酚/氯仿/异戌醇萃取。再用氯仿/异戌醇萃取，乙醇沉淀。沉淀重悬在TE缓冲液中，用核糖酸酶处理，苯酚/氯仿/异戌醇萃取，再用氯仿/异戌醇萃取，加CScl使溶液Cscl浓度达800μg/ml，再加溴化乙锭，使其终浓度为1mg/ml。在20℃下用Vit50转头，以49，000转/分离心18-20小时。
质粒带在UV荧光下可见。用针和针管从离心后的试管中抽出质粒带。用正-丁醇萃取四次。然后用乙醇在-20℃沉淀质粒。
重悬成溶液再沉淀反复至少两次以除去所有Csol，将其贮存在-20℃下。
例Ⅶ：纯化醇氧化酶
从生长在用醇培养基上的Pichia    Postoris细胞得到的蛋白样品如例Ⅰ所述通过溶解酵母细胞，然后离心以除去细胞残渣制备，方法如下：把发酵器中流出的一部分排出，用氢氧化铵调PH至7.5，然后将其置于0.6升均质杯在KDL型DYno-MiLL上在30℃下用组合3号带以每小时流入20～30ml速率连续均质。磨中装进直径为0.3～0.5mm游离的玻璃株。所得均质液在5℃下以20，000Xg速度离心30分钟以得到不含细胞的上清液。
将六个130ml的上清液分别装醋酸纤维透析袋，在5℃下于8升的蒸馏水中透析。4天后除去每袋中水相。残留的固体含两类固体。将上面白色的一个薄层除去。下面的黄褐色部分是结晶醇氧化酶，取其中一部分溶于蒸馏水中（用10倍于固体体积的蒸馏水），用过氧化酶染色法测定显示94EU/ml的醇氧化酶活性意味着含每毫克蛋白含10.4EU的该酶。
上述结晶沉淀悬液再在0.05M磷酸钾缓冲液（PH7.5）中透析，再在同样缓冲液平衡的2×200cm的SePhacrgl200（Pharmacia公司）柱上层析。以10ml/小时速度以每份3.5ml收集产物，测定醇氧化酶活性。
醇氧化酶与甲醇反应的活性通过下列方法（过氧化酶染色法）测定，把0.1ml    1%（重量比）的邻联（二）茴香胺溶液与12ml的充气的0.1M磷酸钠缓冲液（PH7.5）混合制备染料缓冲液。把2.5ml染料-缓冲液，15μl甲醇，10μl过氧化酶溶液（含1mg辣根过氧化酶-SigmaⅡ型）和25μl的醇氧化酶溶液混合制备试验混合液。把试验混合液装在一个4×1×1cm比色杯中，2到4分钟记录由于染料导致的在460mM处消光率的增加。酶活性通过下式计算：
活性（μm/分/ml或酶单位/ml）＝ (消光率增加)/(分钟) ×11.5
其中11.5是基于标准比色杯中装入已知量H2O2测得的一个系数，△A（消化率增加）是在试验时间间隔内消光率的变化。
从每份样品中取出总蛋白为0.1μg的小部分用SDS聚丙烯酰胺（12%）电泳进行醇氧化酶含量试验。
例Ⅷ：DNA和蛋白的氨基酸顺序
用噬菌体MB二脱氧链加长法（Sanger等人方法，1980年）或化学修饰法（MaXam等人，1980年）测定DNA顺序。相对于醇氧化酶基因5′端的DNA片段插入到MBmP8和MBmP9载体中，或用该顺序区限制酶切点的化学修饰方法标记末端。
用HindⅢ酶解33μg质粒把PPG4.0的710千对碱基HindⅢ/salⅠ片段末端标记得MaXam-Gihert顺序。反应混合液用苯酚/氯仿/异戌醇萃取，再用氯仿/异戌醇萃取，然后用乙醇沉淀。离心收集沉淀，再重悬在31μl水中，把100μ居里32P-α-dcTP（3200居里/克分子）和二个单位的Klenow POlⅠDNA片段加到混合液中以得到终体积为50μl含400μMdTAP，
400μM dGTP，50mM Tris（PH7.4），10mH Mgso4和1mMDTT的溶液。将基置于37℃下孵育1小时，加2μl0.5 EDTA中止反应。然后用苯酚/氯仿/异戌醇萃取，再用氯仿/异戌醇萃取，然后在SePhadeX G50柱上层析，将收集的各部分标记了的核酸合併，再用乙醇沉淀。离心后，将DNA沉淀重悬在水中，用SalⅠ酶解。在用TAE缓冲液配制的1%琼脂糖凝胶上跑电泳。然后将710千对碱基的带从凝胶上切下，用电泳法洗脱DNA，再用丁醇萃取，乙醇沉淀。然后将其重悬在100μl的TE缓冲液调节醋酸铵至2.5M，再用乙醇沉淀。得到的DNA片段再悬在TE缓冲液中得50，000cPm/μl的溶液。
四个修饰碱基的反应如下进行：（a）烏嘌呤反应：把含1μl（50，000CPM）的标记DNA，4μl水，200μl的50mM二甲胂酸钠（PH8.0）：0.1mM EDTA（在DMS（缓冲液中）和1μl二甲基磺酸盐溶液与烏嘌呤溶液共同孵育在22℃下8分钟。加入含1.5M乙酸钠（PH7.0）1M2-巯基乙醇和100μg/ml tRNA的DMS缓冲液中止反应，再加750μl乙醇，置反应混合液于-70℃至少15分钟（b）烏嘌呤/腺嘌呤反应：把含2μl（100，000CPm）的标记的DNA片段，8μl水和30μl甲醇混合液与烏嘌呤/腺嘌呤共同在22℃下孵育10分钟。如200μl H2缓冲液（0.3M醋酸钠，PH5.5，0.1MEDTA和25μg/ml tRNA）中止反应。然后加750μl乙醇，置于-70℃至少15分钟，（c）胸腺嘧啶/胞嘧啶反应：将含2μl（100，000CPm）标记的DNA片段，10μl水和30μl肼混合液在与胸腺嘧啶/胞嘧啶混合液22℃下孵育10分钟。同（b）方法中止反应。（d）胞嘧啶反应：将含1μl（50，000CPm）标记了的DNA片段，4μl水，15μl    5M    Nacl和30μl的肼混合液与胞嘧啶混合在22℃下孵育10分钟，用与（b）相同方法中止反应。
离心收集DNA沉淀，重悬到2.50μl    0.3M醋酸钠（PH5.5），用750μl    95%乙醇沉淀之。再离心收集，在真空下干燥5分钟，通过将沉淀悬在100μl稀释。10倍的六氢吡啶溶液切割DNA。将其孵育在90℃下30分钟，加500μl    78%乙醇，60mM醋酸钠（PH5.5）和10μg/ml    tRNA中止反应。然后置于冷冰/乙醇浴（约-70℃）中5分钟，离心收集。将沉淀重悬50μl0.3M醋酸钠（PH5.5），用乙醇沉淀几次，再用95%乙醇洗，离心时真空浓缩。再把沉淀重悬在10μl80%甲酰胺，10mM    NaoH，1mMEDTA，0.1%二甲苯氰醇，0.1%溴酚兰混合液中，取2-3μl置于0.4m厚TBE缓冲液配制的10%聚丙烯酰胺凝胶上电泳。
醇氧化酶氨基酸顺序由Seguemat公司用2mg纯化的Pichia    Pastoris醇氧化醇测定。成熟蛋白的头17个氨基酸为：
丙-异亮-脯-谷-谷-苯丙-天冬-异亮-亮-缬-亮-甘-甘-甘-丝-甘-丝。
例Ⅸ：测定醇氧化酶转录起始点
为测定醇氧化酶mRNA转录起点，头一个试验是以醇氧化酶基因5′端DNA顺序的一个合成寡核苷酸拷贝作为引子，以10μg PolgA+Pichia Pastoris mRNA作为模板。将10μg PolgA+mRNA与3ng引子（5′-CTT CTC AAG TTG TCG-3′）混合在一个9.3μl终体积含43mM Nacl，29.2mM Tris （PH8.3），5.2mM Mgcl2和4.3mMDTT的缓冲液中，置70℃将其变性5分钟。再置22℃使其缓慢冷却再退火。把退火混合液中倒入含4μl dNTP混合液及0.8μl RT缓冲液和1μl32P-α-dcTP（800居里/毫克分子）的试管中。将3μl的该混合液分别加到1μl四种相应的ddNTP。取每种混合液3μl加到1μl水中。加1μldil RT缓冲液开始反应，置42℃下孵育15分钟。用3μl Chase RT溶液在42℃下孵育15分钟以加长核酸链，再加7.5μl甲酰胺-涂料混合液中止反应，取4～5μl反应液置于0.4mm厚1×TBE缓冲液配制的梯度凝胶电泳，然后用含10%甲醇的10%乙酸液固定凝胶，真空下干燥之，使XARX射线胶片放射自显影。
梯度凝胶制备如下：将300μl    10%过硫酸铵，14μlTEMED，加入30ml顶部凝胶，将10%过硫酸铵和3.5μl    TEMED加入7ml的底部凝胶，用移液管先吸6ml顶部凝胶液，再吸6ml底部凝胶液，然后将其放入凝胶板间，然后倒22ml顶部凝胶。
例Ⅹ：mRNA杂交-选择和体外翻译
正杂交-翻译试验是用不同限制酶酶解20μg线状克隆的Pichia基因组DNA（如上述例Ⅵ）。加0.3M    NaOH使其变性。于65℃孵育10分钟。含变性DNA的溶液被迅速置于冰中冷却，再通过用0.5MTris-Hcl调pH至7.4中和之。在DNA结合到硝酸纤维素滤纸前立即把等体积的20×SSPE加入变性DNA。将DNA转到滤纸前（Schleicher和SchuellBA83，9mm直径滤纸）将其用水湿润，然后煮沸10分钟，用10×SSPE冲洗三次。把10μgDNA结合到每张滤纸，风干，然后在真空条件下，70℃干燥2小时。
予杂交前，将结合上DNA的滤纸置于1ml的无菌水中，在100℃下加热1分钟，再在冰中冷却，用VorteXing（一种转动搅拌装置）在1ml无菌水中冲洗，再用1ml予杂交缓冲液冲洗。将滤纸置于1ml予杂交缓冲液中予杂交：然后将40μg（2μg/ml ETS）的PolgA+mRNA直接加入予杂交缓冲液，将其置65℃加热10分钟，再在42℃下孵育24小时。
杂交后滤纸在含0.5%SDS的1×SSPE中22℃下洗2次，在含0.5%SDS的1×SSPE中，50℃下洗7次，每次洗5分钟;再在0.1×SSPE中50℃下洗3次，每次5分钟;最后在0.1×SSPE中65℃下洗10分钟。将滤纸在含15μg兔肝tRNA的300μlH2O中煮沸，1分钟以洗脱RNA。然后将其迅速在干冰乙醇浴中冷却。然后让其升到室温，除去滤纸。将混合液的醋酸铵浓度调至2.5M沉淀，再用乙醇沉淀两次，最后重悬在100μlH2O中，再冷冻干燥。
转译是根据本领域专业人员共和的标准技术进行，例如：用New    England    Nucleae体外兔内织网溶解物转译系统。蛋白产物置于含4.5%叠加凝胶的8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳。
例Ⅺ：抗血清的制备及兔疫测定：
用标准程序制备兔的P76肽和P72（醇氧化酶）的Pichia Pastoris细胞萃取液的抗血清。注射前将萃取液在PBS中透析。在八周内，给每个兔注射三次，每次用量内含1mg全蛋白的0.1ml萃取液和0.2ml Freuuds完全佐剂。在兔的6-10处皮下注射。八周末给兔放射，根据Outherlony双融和法用抗血清测定纯化的Pichia Pa Storis醇氧化酶。
将粗血清通过一个与CNBr偶联的P72-P76    SePharosc    4B柱（Pharmaeia的产品）亲和层析纯化兔抗P72和P76蛋白的抗体。将1克CNBr活化的凝胶置于200ml的1mM的Hcl中，以水合凝胶，再在50ml偶联缓冲液（含0.1M碳酸钠PH7.0·5M    Nacl洗三次。将6mg/ml    P72-P76溶液Sml加入凝胶，在4℃下轻轻搅拌。用50ml偶联缓冲液洗三次以除去未结合的蛋白。再在1M乙醇胺（PH8）中孵育2小时以消除残留的活性基团。用5ml含2M硫氰化钠的PBS液洗凝胶以除去未共价结合的材料。抗血清层析前，将凝胶用50ml    PBS液最后洗三次，把5ml澄清的抗P72-P76血清与凝胶混合，在4℃及搅拌条件下孵育2小时。然后将血清-凝胶混合液用移液管装到1×8cm的柱上，用150ml    PSS洗柱。用6ml含2M硫氰化钠的PBS将纯化的抗原从柱上洗脱下来。再在含0.02%叠氮化钠的PBS中进一步透析。
将亲合纯化的抗血清加入含1%    NP40的PBS体外翻译混合液，4℃下孵育过夜。用Pansorbin（Calbiochem公司产品）在冰浴上沉淀抗体-抗原复合物2小时。Pansorbin要在RIPA缓冲液中洗，并溶在Laemmli负载缓冲液再进行电泳。
例Ⅻ：Pichia    Pastoris转化程序
A、细胞培养
1.将一个Pichia    Pastoris    GS115（NRRL    Y-15851）菌落接种到大约10ml    YPD介质里，在30℃下摇动培养12-20小时。
2.将细胞稀释到OD600为0.001-0.1，使细胞持续在YDD介质中以对数线生长6～8小时。
3.取0.5ml    OD600为0.1（或相当量的）种子培养液接种到100ml的YDD介质。
4.当OD600为0.2～0.3时（大约16～20小时）以1500×g速度离心5分钟收集培养物。
B、制备原生质
1.用10ml无菌水洗细胞一次。（在1-5步所有离心都在1500×g和5分钟条件下;
2.用10ml新配制的SED液洗一次细胞;
3.在10ml无菌1M山梨醇中洗细胞两次;
4.将细胞重悬在10ml    SCE缓冲液;
5.加5～10μl，4mg/ml的Zymolyase    60，000（MiLes实验室制品）。将混合混置30℃孵育30～60分钟。
由于原生质制备是转化的关键步骤，必须按下面方法监测原生质形成，加Zymol    yase后或稍前时刻，及在孵育的不同时刻    把100μl细胞加入900μl  5%    SDS和900μl    1M山梨醇。当细胞在SDS中溶解而不在山梨醇中溶解时（通常30～60分钟）停止孵育;
6.通过1000×g速度离心5～10分钟在10ml无菌1M山梨醇洗原生质两次。（离心时间和速度可以变化，以足以沉淀原生质又使其不致破碎为度）;
7.在10ml无菌CaS中洗一次;
8.重悬在0.6ml无菌Cas中。
C、转化：
1.把DNA样品（高达20μl体积）加到12×7.5mm的无菌聚丙烯管中。CDNA必须在水或TE缓冲液中，为用少量DNA可得到最大转化频率，建议每个样品加大约1μl的5mg/ml超声处理的大肠杆菌DNA）;
2.每个样品中加100μl的原生质，在室温下孵育约20分钟;
3.每个样品中加1ml聚乙二醇溶液，在室温下孵育约15分钟;
4.在1000×g下离心5～10分钟，除去PEG溶液;
5.把样品重悬在150μl    SOS液中，室温下孵育30分钟;
6.加850μl无菌的1M山梨醇，如下述涂样品。
D、再生原生质：
1.再生琼脂介质配方。
a、琼脂-山梨醇：9g    Bacta琼脂，54.6g山梨醇，240ml水，高压灭菌。
b、10×葡萄糖液：20g葡萄糖，100ml水，高压灭菌。
c、10×SC：6.75g含氮碱不含氨基酸的酵母（Yeast    Nitrogen    Base）100ml水，高压灭菌。（在高压灭菌前或后可加任何所需氨基酸或核酸使其浓度达200μg/ml。
d、把30ml    10×葡萄糖液和30ml    10×SC加溶融的琼脂-山梨醇溶液。加0.6ml    0.2mg/ml的生物素及20μg/ml其它所需氨基酸或核酸。在65～60℃下溶融再生琼脂。
2.涂置转化样品：
转化样品准备好前至少30分钟，向每培养皿倾注10ml再生琼脂。把10ml再生琼脂在45～50℃水浴中加入装有悬在SOS溶液中转化样品的试管中。将试管中样品及琼脂倒入准备好的琼脂培养皿中。
3.测定原生质质量：
取出10μl样品，加990μl1M的山梨醇稀释到100倍。再取10μl稀释液，再加990μl1M山梨醇再稀释100倍，将两种稀释液各取100μl涂散在YPD琼脂介质上以测定残留的未脱膜的细胞。在每种100μl的稀释液中加10ml补加40μg/ml组氨酸的再生琼脂。转化试验的较好值为含1-3×107总再生原生质/ml和1×103克完整细胞/ml。
4.把涂皿置于30℃下孵育3～5天。
例ⅩⅢ：分离Pichia Pateris HIS4基因及自主复制顺序。
A、菌株：所用菌株包括：
（a）Pichia    Pastoris菌株    NRRL    Y-11430;
（b）Pichia    Pastoris    GS115（his4;NRRL    Y-15851）
（c）酿酒酵母（S·Cere Viside）菌株5799-4DCαhis4-260 his4-39;NRRLY-15859）;和
（d）大肠杆菌菌株848CF-met，thi gal·TiR80ShsdR-，hsdM+）。
B、质粒：
PYA2（见图23，由酿酒酵母在9.3千对碱基Pst1片段上HIS4基因插入到PBR325的PSTⅠ点组成，是酿酒酵母HIS4基因片段，它被贮存在大肠杆菌宿主中，贮存号为B-15874。
YEP13从ATCC可以得到，在那儿的贮藏号为ATCC37115。
C、基质
Pichia    Pastoris生长在YPD（富营养型）或IMG（基本型）基质。IMG组成如下：
（1）IM，盐的终浓度是含36.7mM KH2PO4，22.7mM（NH4）2SO42.0mM MgSO47H2O，6.7mM Kcl 0.7mM Cacl2·2H2O，要制备成10倍母液，并高压灭菌。
（2）稀有金属盐，其终浓度含0.2μM CaSO4·5H2O，1.25μMKI，4.5μM MnSO4·H2O，2.0μM NaMoO4，0.75μM H3BO3，17.5μM ZnSO4·7H2O，44.5μM FeCL3·6H2O，制备成400倍母液，然后过滤灭菌。
（3）0.4μg/ml生物素;和
（4）2%葡萄糖：
大肠杆菌生长在补加100mg/ml色氨酸和0.2%酪蛋白氨基酸的LB基质或2B基质（含0.2%NH4PO4，1.2% Na2HPO4，0.013% MgSO4·7H2O，0.074% Cacl2·2H2O，μg/ml硫胺素和0.4%葡萄糖）。
D、分离DNA：
（1）大规模制备酵母DNA：
将Pichia    Pastoris和酿酒酵母细胞分别置于100ml基本培养基中生长直到A600为1-2，再用2000×g速度离心5分钟以收集细胞。用水洗一次细胞，再在SED中洗一次，在1M山梨醇中洗一次，然后悬在5ml的1M山梨醇的0.1M    Tris-Hcl（PH7.0）中。把细胞与50～100μl的4mg/ml    Zymolase    60，000（Miles实验室产品）混合，在30℃下孵育1小时以溶解细胞壁。然后在1000×g下离心5-10分钟收集原生质，再将其悬在溶胞缓冲液（0.1%SDS，10mM    Tris-Hcl    PH7.4，6mMEDTA和50mM    Nacl）。加蛋白酶K（Boeringer    Mannheim产品）和核糖核酸酶使其浓度为1.00μg/ml，将得到混合液在37℃下孵育30分钟。加等体积的氯仿/异戍醇（24/1，V/V）使DNA温和地去蛋白，以12，000×g速度离心20分钟以分离两液相。把上面水相吸出移到一个干净试管，用等体积的酚/氯仿/异戍醇萃取之。如前离心分离两相，将上面
水相置于含2～3倍体积的冷100%乙醇的试管中。样品与乙醇轻轻地混和，用一塑料棒缠搅收集DNA，然后将其立即溶在1ml的TE缓冲液中，在100倍体积的TE缓冲液中4℃下透析一夜。
（2）小规模酵母DNA制备：
取在基本培养基中生长到A600达1-5的酵母培养液5ml，在2000×g下离心5分钟收集细胞。将其悬在1ml的SED中，转移到一个1.5ml微离心管中，用1M山梨酵次一次，重悬在含1M山梨醇的0.5ml 0.1M tris-Hcl（PH7.4）中，加酵解酶60，000使其浓度为10μl 4mg/ml，在30℃孵育30～60分钟。将其离心1分钟，悬在溶胞缓冲液中在65～70℃下孵育。15分钟后，将样品与100μl 5M醋酸钾混合，置于冰浴中15分钟，再离心5分钟。将上清液倒入含1ml 100%的乙醇的干净的微离心管中，混合，离心10秒，将得到的DNA沉淀风干10～15分钟，溶在5μl的TE缓冲液中。
（3）大规模大肠杆菌DNA的分离：
为大规模制备（0.5～1升）质粒，将大肠杆菌在37℃下摇动培养在补加如上述物质及适当抗生素的2B基质中。为得到含PBK322衍生质粒的细胞，使细菌培养生长到A550约0.7时加氯霉素使其浓度达100μg/ml大约15小时后收集细胞。把含PBR32.5衍生质粒的菌株在A550达0.01～0.05时接种到含补加物质的2B基质中，在37℃下摇动孵育20～24小时，然后收集之。
（4）小规模大肠杆菌DNA的分离：
为小规模迅速地分离质粒，将生长在含补加物质和抗生素的2B基质中的培养物2l于37℃下摇动培养一夜。移至1.5ml微离心管中离心收集之。用Birnboim和Doly（1979年）所述方法，碱水解从各制备液中分离质粒。
E、限制酶切DNA和其片段的分离：
从New    Eng    Land    Biolabs和Bethesda    Research    Laboratories得到限制酶，用常规技术酶解。比较有插入DNA与元插入DNA平行酶解的质粒绘制限制酶切图。通过电泳洗脱提纯酶切片段。将其从琼脂糖凝胶转移到衬在透析管上的Whatman    3MM纸条。从滤纸上回收DNA片段用含0.1M    Nacl，50mM    Tris-Hcl（PH8.0）和1mM    EDTA的溶液0.1-0.2ml洗3～4次，最后用苯酚/氯仿/异戍醇萃取，再用乙醇沉淀，将离心得到的沉淀重溶在小体积的TE缓冲液中。
F、在大肠杆菌中建立P·Pasteris基因文库：
为建立Pichia    Pastoris    DNA-YEPB文库，将100μg的YEPB用BamHI完全酶解并用小牛肠道碱性磷酸脂酶处理以从DNA除去5′端磷酸酯。取Pichia    Pastoris（NRRL    Y-11430）得到的野生型Pichia    Pastoris    DNA    100μg用10单位Sau3AI部分水解，总体积为1ml，在37℃下孵育5分钟。用5～20%蔗糖梯度离心选择5～10千对碱基的片段。将1μg载体和2μg的Pichia    Sau3AI片段与20个单位的T4DNA连接在总体积200μl中，于4℃下孵育一夜。为用连接后的DNA转化大肠杆菌，把全部连接反应混合液加到
2ml有耐药性的大肠杆菌848细胞，在0℃下孵育15分钟。5分钟内将混合液加热到37℃，然后加40ml的LB基质，继续在37℃下孵化1小时。加入氨苄青霉素，使其浓度为100μg/ml，再孵育1个小时。最后在30，000Xg下离心细胞10分钟，将沉淀重悬在1ml新配制的CB基质，将等量悬液涂散在含100μg/ml氨苄青霉素的10LB琼脂平器上。将得到的约50，000个菌落从平器取出，在A550约0.1时其中一部分接种到500ml含补加物质的2B基质。培养物长成后用上述方法萃取质粒。取出菌落用来建立文库。96%菌落为四环素敏感的7/10菌落含有具插入DNA的质粒。
为建立Pichia    Pastoris    DNA-PYJ8△eLa文库，用CLaI使其完全水解，再用小牛肠道碱性磷酸酯酶处理以从DNA除去5′末端磷酸酯。用20个单位的TaqI以总体积1ml在65℃下孵化5分钟以部分水解100μg    Pichia    Pastoris（NRRL    Y-15851）DNA。电泳从0.5%琼脂糖凝胶中洗脱出5到10千对碱基不同大小的片段（见例Ⅱ，E部分），将1μg载体，2μg    Pichia    TaqI片段与20个单位T4    DNA连接酶混合总体积为200μl，在4℃下孵育一夜。为用连接后DNA转化大肠杆菌，将全部连接反应混合液与2ml耐药的大肠杆菌848细胞，在0℃下孵育15分钟。将混合液在5分钟内加热到37℃，加入40ml    LB基质，于37℃下连续孵化1小时。加入氨苄青霉素，使其浓度达100μg/ml，再孵化一小时。最后以3000×g离心10分钟，重悬在1ml的新配制的LB基质。将等量的悬浮涂在含100μg/ml氨苄青霉素要来的10LB琼脂平皿。将得到的约10，000菌落从平皿取出，将其中一部分在A550约0.1时接种到500ml含补加物质的2B基质。培养物长好后按上述方法萃取质粒。
G、Southen杂交：
为把大的或超螺旋DNA分子转移到硝酸纤维素，将琼脂糖凝胶浸在0.25MHcl 10分钟，然后用碱使其变性，从而DNA被部分水解。在含50%甲酰胺，6×SSC，5×Denharolt氏液，0.1%SDS，1mM EDTA和100μg/ml的变性鲱鱼精子DNA的混合液中将酿酒标记的酵母HIS4基因片段与Pichia Pastoris DNA在42℃下杂交。然后在1×SSC，1mM EDTA，0.1%SDS和1%焦磷酸钠混合液中于65℃下洗杂交DNA。32P标记是用例Ⅳ的方法。
H、测定DNA顺序：
用Sangu等人的二脱氧核苷酸链中断方法测DNA顺序。
Ⅰ、转化酵母：
用Hinnen等人（1978年）制备原生质的方法来转化酿酒酵母。
用下述程序转化Pichia    Pastoris。
J、分析Pichia    Pastoris转化体：
按下述程序测定每种质粒作为自主成分在Pichia    Pastoris细胞内维持的能力;从再生琼脂平器上取一个转化菌落，将其接种到含SD基质的琼脂平器上再接种到IMG液体培养基中，SD平器置于30℃孵育三天，然后取一个菌落在划痕接种到第二个SD平器和第二个IMG培养并中。再重复一次这个步骤。然后将三个在1MG并中的培养物于30℃下摇动培养到A600达约1-2，再离心收集。用上述方法萃取酵母DNA，再置0.8%琼脂糖凝胶上以30伏、30毫安条件电泳10～15小时，转移到硝酸纤维纸上，与32P-标记的PBR322或PBR325杂交。用一个含10ng大肠杆菌质粒的样品和一个含1-2μg未转化Pichia Pastoris GS115 DNA的样品作为对照与被测样品平行电泳。
K、分离Pichia    DNA顺序：
根据对酿酒酵母his4菌株互补能力从Pichia DNA文库中分离出含Pichia HIS4的DNA片段。该文库由插入到酿酒酵母-大肠杆菌穿梭载体YEPB的BanHⅠ切点的野生型Pichia DNA部分酶解的5-20千对碱基的片段组成，将用Hinnen等人（1978年）的技术得到的酿酒酵母NRRL Y-15859（5799-4D;一个his4 ABC菌株原生质与Pichia DNA文库混合，再在缺乏组氨酸的介质中再生。从5×107个可再生原生质得到的转化原养型酵母菌落1×103个。从20个His+菌落萃取酵母总体DNA，转化到大肠杆菌中。有17个酵母DNA制备物产生氨苄青霉素抗性菌落，而且每菌落都含有包括YEPB和插入DNA的质粒。为证明His+转化质粒含有Pichia HIS4基因而不含一个具有抑制活性的DNA片段，将质粒的限制酶切片段与含酿酒HIS4基因大部分的标记DNA片段杂交，在低紧密控制下洗之。每个与his4酿酒酵母菌株互补的质粒都含与酿酒酵母HIS4基因杂交的顺序。
为探取含Pichia ARS活性的DNA片段，用TagI部分水解Pichia Pastoris GS115（NRRL Y-15851）DNA，分离出5到10千对碱基的片段，将其克隆到PYJ8△Cla的唯一的ClaI切点。从大约10，000个His+Pichia菌落回收质粒DNA以用作转化大肠杆菌。分离出约10，000个抗氨苄青霉素质粒然后再回过头来转化GS115。40个来自亚文库转化的His+酵母菌落分别被接种到选择培养基，从40个培养物中分别萃取酵母DNA，转化大肠杆菌。二个含能使大肠杆菌产生氨苄青霉素抗性酵母DNA的质粒PYA63（PARS1）和PYA90（PARS2）用作进一步分析。这两种质粒都高频地转化Pichia Pastoris GG115（NRRL Y-15851，并且都含有一个外源DNA的插入体。
例：ⅪⅤ：建立调节区-LacE基因融合
A、P72（醇氧化酶）调节区工程产物：
用PSE1酶切含4千对碱基Pichia Pastoris EcoRⅠ-PVaⅡ基因组DNA片段的质粒PPG4.0和PBR322，再用S1核酸酶在切点上制造一个平整末端，然后再用BamH1酶切，得到一个含醇氧化酶调节区和为其头15个氨基酸编码的1·12千对碱基的DNA。它的核酸顺序如下：
1·12千对碱基
S1核酸酶……CTA GGT GGT G
处理端……GAT CCA CCA CCT AG↑ B
醇氧化酶 亮11甘12甘13
这个11·2千对碱基片段连接到大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒PSEY    101（Douglas等人1984年）的EcoRⅠ/SmaⅠ/Ba-mHⅠ连接体（LinKer）（用BamHⅠ和SmaⅠ酶切）。载体PSEY101含有大肠杆菌LacZ基因和一个具有下列碱基顺序的多聚连接物L    PolglinKer）：
R′    Sm    B
↓  ↓  ↓
…GGAATTCCC    GGG    G    ATCCC    GTC    GTT…
CTTAAGGG    GCC    C    TAGGG    CAG    CAA…
↑  ↑  ↑    缬10
R1Sm B 缬9 β-半乳糖苷酶
得到了杂种质粒PTAO11（见图29）
由于调节区-LacZ基因与PTAOH的融合在顺序E中所示为β-半乳糖苷酶编码区之外：
R1顺序E
↓    1·12千对碱基
…GAATTCCC……GTA    GGT    GGT    GGA    TCC    GGT
…CTTAAGGG……GAT    CCA    CCA    CCT    AGG    GCT
↑ 亮11甘12甘13甘14丝15精
CGT    T…
GCA    A…
精
载体PTAO11在唯一的BamHI被酶切，下面是插入的SmaI连接体：
Sm
↓
GATCACCCC    GGGT
TG    GG↑CCCACTAG
Sm
因而产生的杂种质粒PTAO12与调节区-LacZ融合体具下列顺序：
R1顺序F
↓    1·12千对碱基
…G    AATTCCC……CTA    GGT    GGT    GGA    TCA    CCC
…C    TTAAGGG……GAT    CCA    CCA    CCT    AGT    GGG
↑ 亮11甘12甘13甘14丝15脯
R1
Sm
↓    GGG    TGA    TCC    CGT    CGT…
CCC    ACT    AGG    GCA    GCA…
↑
Sm    终止信号    丝    精    精
而这样PTA012与调节区-LacZ融合物仍在LacZ读码之外。为了把醇氧化酶结构基因编码区N-末端带进一个具LacZ结构基因的打开的读码中，用EcoRⅠ-SmaⅠ处理PT012，所得的DNA片段被连接到用EcoRⅠ和SmI同样处理的PSEY101，产生了杂种质粒PTAOB（见图30和下面的核苷酸顺序）：
R11·12千对碱基
↓
…G    AAATTCCC……CTA    GGT    GGT    GGA    TCA
C    TTTAAGGG……GAT    CCA    CCA    CCT    AGT
↑ 亮11甘12甘13甘14丝15
R1
Sm    B
↓    ↓
CCC    GGG    GAT    CCC    GTC    GTT…
GGG    CCC    CTA    GGG    CAG    CAA…
↑    ↑
Sm    B
脯 甘 天冬 脯 缬9缬10… β-半乳糖苷酶
然后载体PTAO13被用于转化酿酒酵母SEY2102以供例ⅩⅤ中的进一步研究。
用PstI或PstI-NruI酶切载体PTAO13，包括在上述酶切片段的调节区-LacZ融合体分别与穿梭载体PTAFH1（见图28）PYJ30（见图27）或PYA2（见图23）的含HIS4基因的片段连接，得到质粒PSAOH1，PSAOH5和PSAOH10。
P    TAO13与下面质粒连接    得到的质粒
PTAFH1    PSAOH1
PYJ30    PSAOH5
PYA2    PSAOH10
B、P76调节区工程产物：
用P76调节区制备的调节区-LacZ基因融合物如下程序得到：
1.用PPG6.5的全部5′端部分：
把PPG6.0的一个1.35千对碱基EcoRⅠ片段克隆到一个大肠杆菌-酿酒酵母的穿梭载体PSEY8的唯一ECORI切点。PSEY8在邻近Pichia DNA插入点ECoRI也有一个唯一的SalI切点，从而得到质粒PTAOI（见图31）。用SalI酶切PTAO1，再用Bal31外切酶制造一些不同长度的肽P76调节区的具平整末端的片段。将这些片段与用ECORI酶切的残留的质粒PSEY8，将得到的DNA片段克隆到PSEY101的EceRI-SmaI连接体，得到质粒PTAF85（见图32）。PTAF·85与图29所示的PTAO11类同，只是它具有P76调节区而不是P72（醇氧化酶）调节区。
用上述处理载体PTAO13一样方法处理PTAF85，分别得到质粒PTAFH·85，PT76H1和PT76H2。从而把下列载体酶切再连接：
PTAF·85与下面质粒连接    得到的质粒
PTAFH1    PTAFH·85
PYJ30    PT76H1
PYA2    PT76H2
例ⅩⅤ：在Pichia    Pastoris中生产β-半乳糖苷酶的调节：
研究了生长在不同碳源上和处于不同条件下一些Pichia    Pastoris    GS115（NRRL    Y-15851）转化体生产β-半乳糖苷酶。把转化菌株置于含0.5μg/ml生物素，0.1%葡萄糖的培养基上，在30℃下培养直到得到满意的培养物为止。离心收集细胞，把其转到含0.5μg/ml生物素和0.5%甲醇的基本培养基上，于30℃下生长大约3-5代。在甲醇上开始生长后，将细胞离心收集，并转移到含6.5μg/ml生物素及0.1%葡萄糖或0.3%甲醇为碳源的新配制的基本培养基上。在30℃下生长80小时，定期取样以测定醇氧化酶和β-半乳糖苷酶的水平。20～50小时后，除掉碳源，使细胞处于缺乏碳素状态，结果总结在表Ⅰ。
表Ⅰ
Pichia    Pastoris    NRRL    Y-15851
转化体    半乳糖苷酶和醇氧化酶（单位数/OD600）的最高值（孵育时间以小时计）
β-半乳糖苷酶α醇氧化酶α
质粒    1%    缺乏    0.3%    1%    缺乏    0.3%
葡萄糖    葡萄糖    甲醇    葡萄糖    葡萄糖    甲醇
PSAOH1    0    660（20）    1361（0）    0    35    530
PSAOH5    0.1-0.2    567（20）    1168（0）    0    60    550
PSAOH10    0    886（20）    1559（0）    0    167    425
PTAFH·85    0    0.17（80）    0.5    0    未测    未测
PT76H1    0    3.20（80）    0    0    未测    未测
PT76H2    0    未测    未测    0    未测    未测
PT76H3    0    20    781    0    未测    未测
PT76H4    0.3-0.6    40（80）    3100    0    未测    未测
a、在不同时间间隔取样，两种酶测定方法如文所述。
醇氧化酶用上述染料-过氧化酶法测定（见例Ⅶ），β-半乳糖苷酶如下述测定：
A、所需药剂：    终液度
Z缓冲液：
Na2HPO4·7H2O 16.1g 0.06M
NHH2PO45.5g 0.04M
Kcl    0.75g    0.01M
MgSO4·7H2O 0.246g 0.001M
2-巯基乙醇    2.7ml    0.05M
加水使体积为1升，PH应当是7
O-硝基苯基-β-D-半乳糖苷（ONPG）：
将400mg    ONPG（来自Sigma公司代号N-1127），溶到100ml蒸馏水中，制得一个4mg/ml的ONPG溶液。
B、测定程序：
1.取出部分培养物（含酵母细胞0.1-0.5OD600）离心收集，用水洗细胞。
2.把1mlZ缓冲液加入细胞沉淀，再加30μl氯仿，30μl的0.1%SDS，在Vortex振盪混匀，30℃下孵育5分钟。
3.加0.2ml    ONPG（4mg/ml），在VorteX振盪混匀开始反应。
4.在适当的时刻（A420＜1时）中止反应。
5.测上清液在420nm的消光度。
C、计算β-半乳糖苷酶活性单位：
（1单位）U＝30℃下，PH＝7时每分钟生成1纳摩尔的邻硝基苯（ONP）。1纳摩尔ONP在420nm处，1cm光道长度下消光度（A420）为0.0045;因此在420nm处消光度1代表222纳摩尔ONP/ml，或378纳摩尔/1.7ml，因为分析用上清液的总体积为1.7ml。所以表中的单位数按下式计算：
单位（U）＝ (消光度（A420）)/(时间（分钟）) ×378
表1的结果说明酵母的外源蛋白，即β-半乳糖苷酶可以在基质中有甲醇调节的Pichia    Pastoris中产生，也可在先生长在抑制碳源的可分解产物后再转到缺乏碳素的条件调节的Pichia    Pastoris产生。
例ⅩⅥ：在酿酒酵母中β-半乳糖苷酶生产的调节：
用质粒PTAO13和PT76U1转化需要尿嘧啶亮氨酸和组氨酸为补充物的酿酒酵母菌体SEY2102可以很容易的分离转化了的菌株。分离出的转化菌株分别以SEY2102-PTAO13，SEY2102-PT76U1作为实验室命名。SEY2102-PTAO13于1984年8月31日贮存在NRRC。贮存号为NRRL-Y-15858。
将含20μg/ml组氨酸和亮氨酸及5%葡萄糖的基本培养基上将NRRL-Y-15858和SEY2102-P576U1在30℃下孵育3-4代。离心收集，再将其转移到含表Ⅱ所示碳源的3%的YP基质，在30℃下生长约5代。再在缺乏碳源条件下再孵育50小时。然后定期取样测定β-半乳糖苷酶。结果总结在表Ⅱ。
表Ⅱ
用酿酒酵母生产β-半乳糖苷酶（单位/OD600）
A、（用醇氧化酶调节区（＜PTAO137）缺乏碳源
碳源3%    5代后
6小时    20小时    50小时
葡萄糖    0.2    105    66    未测
果糖    0.3    30    31    28
乙酵    23    137    115    77
甘油    640    806    656    788
半乳糖    982    960    651    766
B、（用P76调节区〔PT76U1〕）缺乏碳源
碳源35%    5代后    12小时    25小时    30小时
葡萄糖    2.3    254    815    803
甘油    470    未测    未测    未测
这些结果说明在先将P72（醇氧化酶）和P76调节区调节的酿酒酵母生长在抑制碳源的可分解产物再置于缺乏碳素条件或将转化的酿酒酵母生长在诸如甘油或半乳糖等抑制碳源的相对不能分解的产物上都可以生产如：β-半乳糖苷酶的酵母外源蛋白。
用本发明调节区控制的在酿酒酵母中β-半乳糖苷酶的表达水平可与用其它酿酒酵母调节启动子调节的可能表达水平比较。
启动子    碳源    β-半乳糖苷酶
单位/OD    600
细胞色素C-LacZ    棉子糖（3%）    460
融合体（CYCI）    半乳糖（2%）
半乳糖苷酶-LacZ    450
融合体（GAL2）
转化酶-LacZ    葡萄糖（0.1%）    160
融合体（SUC2）
可以看到本发明调节区令人吃惊地发现至少与酿酒酵母启动子一样有效，或比它更有效。
例ⅩⅦ：用酵母基因组DNA进行Southern杂交
把9个不同的能同化甲醇的酵母和一个不能同化甲醇的酵母分别置于加0.75%甲醇或1%葡萄糖的基本基本培养基（IM1，见例1）。如例Ⅵ所述分离总体染色体DNA，也就是先分离总体核酸，再用核糖核酸酶A处理之，用苯酚/氯仿/异戍醇萃取，再用氯仿/异戍醇萃取，最后用乙醇沉淀。将沉淀的DNA重悬在尽量小体积的TE缓冲液中，离心以澄清DNA溶液。
如：例Ⅵ所述方法制备Sontern杂交滤纸，即用过量的HindⅢ酶解各种酵母菌的总体DNA10μg，电泳，DNA变性，中和凝胶，将DNA转到硝酸纤维滤纸上。在下面条件下予杂交;用50%去离子甲酰胺，6×SSC，5×Denhard氏液，1mM    EDTA，0.1%    SDS和100μg/ml变性鲑鱼精子DNA混
合液中于42℃，孵育过夜，用上述同样条件，加32P-缺口-翻译探针，使其终浓度为106CPm/ml，探针包括真克隆PPC8.3，PPC15.0和PPC6.7的CDNA插入体（PSTⅠ片段）及含P·Pastoris HIS4基因的一个2.7千对碱基的BalⅡ DNA片段。每种探针分别用于滤纸杂交，于42℃杂交持续24小时，然后在室温下洗滤纸2次，每次15分钟，再在65℃下洗3次每次15分钟用于洗滤纸的缓冲液含2×SSC，1mMEDTA，0.1% SDS和0.1%焦磷酸钠。再在低紧缩条件下即55℃和42℃下洗之。为证实杂交结果，将滤纸进行的放射自显影72小时，结果总结在表Ⅲ。
表Ⅲ
P·Pastoris基因与不同酵母染色体基因杂交
P·Pastoris
HIS4PPC8.3 PPC15.0 PPC6.7
1、P·Pastoris    +    +    +    +
NRRL    Y-11430
2、P·Pastoris    +    +    +    +
NRRL    Y-1603
3、Hansenula    +    +    +    +
CaPsulatum
4、H·henricii    +    +    （+）    +
5、Hnonfermentans    +    +    +    +
6、H·PolymorPha    （+）    +    （+）    +
7、H·WicKerhamii    +    +    +    +
8、拟球酵母属
molischiana    +    +    +    +
9、酿酒酵母    （+）    -    -    -
10、P·Pastoris
NRRL    Y-15851    +    +    +    +
说明：+杂交    （+）弱杂交    -在所用条件下未观察到杂交
表Ⅲ所示结果说明与P76，P72和P40类似的肽的编码基因出现在所有同化甲醇的酵母中。很明显，不同化甲醇酵母酿酒酵母DNA的杂交试验证实它不含这三个基团，但P·Pastoris HIS4基因与酿酒酵母的HIS4基因的同质性是一目了然的。
本说明书提供的例子纯为说明本发明的实施，但不限制本发明范围及权利要求。没离开本发明思想和本质的合理改变和修饰都将在本发明专利保护的范围之内。
参考书目
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143卷    161-178页
补正    85109718
文件名称    页    行    补正前    补正后
权项    1    7    存在抑制碳源的    存在除甲醇以外抑制碳源的
10～11    缺乏状态的培养基    缺乏状态的培养基上。该调
上。    节区在mRNA位于它编码
的DNA5′末端时，能控
制该DNA及其突变体的转录。
12    自酵母中衍生物    从酵母中衍生的。
20    醇氧化醇    醇氧化酶
9    18    编码区里为肽P40    编码区是为肽P40
12    5    其生长在    再生长在
15    20    TCT    TCA    TCA    TCT    TGT    TCA    CTG
CTG
22    8    （E.Cole    NRRL    （E.coli    NRRL
23    12    （E.Coli    RRRL    （E.Coli    NRRL
补正    85109718
文件名称    页    行    补正前    补正后
说明书    6    13    氧化磷酸化磷位于    氧化磷酸化位于
7    6    真的宿主/载体系统    真核的宿主/载体系统
12    13    负责着至少下列情况    关系着至少下列情况
22    11    TCN（第4码）    GCT
12    ACN（第4码）    CGA
30    10    均可差异    均有差异
44    6～7    被可分解产物和不可    抑制碳源的可分解产物
分解产物抑制的碳素    和不可分解产物上生长
上生长后，    后，
20    白色念株菌属    白色念珠菌属
45    8    同上    同上
47    5    宿主酶母    宿主酵母
5115～16    10代（50代则与    10代（50代则与染
染色体DNA结合。    色体DNA结合）。
52    6    由衍生它们的质粒    衍生它们的质粒
53    1    融合引入酶母细胞是    融合引入酶母细胞是用
用质粒作用载体    质粒作载体
54    1    修饰为所肽编码    修饰为所需肽编码
14～15    这个相同工程产物下    这个相同工程产物，下
面已详述    面已详述
57    16    苄青霉素抗基因的    苄青霉素抗性基因的
61    11    山梨醇醇溶在0.4M    山梨醇溶在0.04M
66 6 （Oligac
Figure 85109718_IMG5
T）12～18 （OligadT）12～18
18    调整含核酸溶解、的    调整核酸含溶解的盐
盐含量    含量。
70    5    放射菌素D，    放线菌素D，
72    17    尾退的PBR322退火，    尾的PBR322退火，
20    具药性的大肠杆    具耐药性的大肠杆
74 16 为标记PolyA+mRNA 标记Poly+mRNA
18    调至Tris为    调Tris为
75    4    Nathern    Nothern
补正    85109718
文件名称    页    行    补正前    补正后
说明书    77    16～17    一个Elutip柱（Sch    一个Elutip柱（Sch
eicher和Schuell    eicher和Schuell
（方法）    方法），
78    15    放置过夜似扩大培养，    放置过夜以扩大培养
19    混合混的Nacl达2.0M    混合液的Nacl达2.0M
79    8    质粒带在UV荧光下可见    质粒带在UV荧光下可见
15    残渣制备，方法如下，    残渣，制备方法如下：
80    2    分别装醋酸纤维透析袋    分别装入醋酸纤维透
析袋
81    1    2到4分钟纪录由于    2到4分钟内纪录由于
82    2    含400μmdTAP    含400μMdATP
3    将基置于37℃下    将其置于37℃下
4    加2μ10.5    EDTA    加2μ10.5MEDTA
84    6    醇氧化醇    醇氧化酶
86    1    专业人员共和的    专业人员共知的
11    入周末给兔放射    八周末给兔放血
87    20    以对数线生长    以对数曲线生长
88    12    将混合混    将混合液
92 15 NH4PO4NH4H2PO4
93    8    6mMEDTA    5mMEDTA
94    4    用1M山梨酵次一次    用1M山梨醇洗一次
5    加酵解酶60，000使其    加10μl酵解醇60，000
浓度为10μl    使其浓度为
17    使细菌培养生长    使培养细菌生长
97    16    氨苄青霉素要来的    氨苄青霉素的
101    19    连接物    连接体
106    18    终液度    终浓度
109    15    乙酵    乙醇

Claims (113)

1、一个含有调节区的DNA片段，其中所述调节区至少要满足下列一组条件之一：
(1)含该DNA片段的宿主微生物生长的培养基中存在甲醇。
(2)含该DNA片段的宿主微生物生长的培养基中存在抑制碳源的不能分解产物。
(3)含该DNA片段的宿主微生物生长在抑制碳源和能源的可分解产物后，再生长在处于碳素缺乏状态的培养基上。
2、根据权利要求1所述的DNA片段，其中所述的调节区是自酵母中衍生物。
3、根据权利要求2所述的DNA片段，其中所述的酵母菌是从Pichia属中送出的。
4、根据权利要求3所述的DNA片段，其中所述的酵母菌是Pichia  Pastoris种的一员。
5、根据权利要求4所述DNA片段，其中所述酵母是Pichia  Pastoris  NRRL  Y-11430。
6、根据权利要求5所述DNA片段，其中所述的调节区控制为醇氧化醇编码的信息RNA的转录。
7、根据权利要求5所述DNA片段，其中所述调节区控制为肽P76编码的信息RNA转录。
8、根据权利要求5所述DNA片段，其中所述调节区控制为肽P40编码的信息RNA转录。
9、根据权利要求6所述DNA片段，进一步包含为醇氧化酶编码DNA下游的3′末端顺序。
10、根据权利要求7所述DNA片段，进一步包含为肽P76编码DNA下游的3′末端顺序。
11、根据权利要求8所述DNA片段，进一步包含为肽P40编码DNA下游的3′末端顺序。
12、根据权利要求1所述DNA片段，其中所述信息RNA为异质肽编码。
13、根据权利要求6所述DNA片段，该片段如图5所示用限制酶切图定性。
14、根据权利要求13所述DNA片段，进一步包含一个在图8中所示用限制酶切图定性了的一组片段中选出的一个附加片段。
15、根据权利要求7所述DNA片段，该片段是从在图中所示用限制酶切图定性的一组片段中选出的。
16、根据权利要求15所述DNA片段，进一步包含在图7中用限制酶切图定性的附加片段。
17、根据权利要求8所述DNA片段，该片段在图6中用限制酶切图定性。
18、根据权利要求17所述DNA片段，进一步包含图9中用限制酶切图定性的附加片段。
19、根据权利要求6所述DNA片段，该片段具有下列核苷酸顺序：
S′-ATGCTTCCAA  GATTCTGGTG  GGAATACTGC  TGATAGCCTA
ACGTTCATGA  TCAAAATTTA  ACTGTTCTAA  CCCCTACCTG
GACAGGCAAT  ATATAAACAG  AAGGAAGCTG  CCCTGTCTTA
AACCTTTTTT  TTTATCATCA  TTATTAGCTT  ACTTTCATAA
TTGCGACTGG  TTCCAATTGA  CAAGCTTTTG  ATTTTAACGA
CTTTTAACGA  CAACTTGAGA  AGATCAAAAA  ACAACTAATT
ATTCGAAACG-3′
20、根据权利要求书19所述DNA片段，进而包含位于为信息RNA编码的DNA3′端的附加片段，其中该附加片段是从图8中用限制酶切图定性的一组片段中选择的。
21、根据权利要求书6所述DNA片段，该片段具有下列核苷酸顺序：
5′-AATGGCCCAAA CTGACAGTTT AAACGCTGTC TTGGAACCTA
ATATGACAAA  AGCGTGATCT  CATCCAAGAT  GAACTAAGTT
TGGTTGGTTG  AAATCCTAAC  GGCCAGTTGG  TCAAAAAGAA
ACTTCCAAAA  GTCGGCATAC  CGTTTGTCTT  GTTTGGTATT
GATTGACGAA  TGCTCAAAAA  TAATCTCATT  AATGCTTAGC
GCAGTCTCTC  TATCGCTTCT  GAACCCGGTG  GCACCTGTGC
CGAAACGCAA  ATGGGGAAAC  AACCCGCTTT  TTGGATGATT
ATGCATTGTC  TCCACATTGT  ATGCTTCCAA  GATTCTGGTG
GGAATACTGC  TGATAGCCTA  AGGTTGATGA  TCAAAATTTA
ACTGTTCTAA  CCCCTACTTG  GACAGGCAAT  ATATAAACAG
AAGGAAGCTG  CCCTGTCTTA  AACCTTTTTT  TTTATCATCA
TTATTAGCTT  ACTTTCATAA  TTGCGACTGG  TTCCAATTGA
CAAGCTTTTG  ATTTTAACGA  CTTTTAACGA  CAACTTGAGA
AGATCAAAAA  ACAACTAATT  ATTCGAAACG-3′
22、根据权利要求6所述DNA片段，该片段具有下列核苷酸顺序：
5′-AGATCTAA CATCCAAAGA
CGAAAGGTTG  AATGAAACCT  TTTTGCCATC  CGACATCCAC
AGGTCCATTC  TCACACATAA  GTGCCAAACG  CAACAGGAGG
GGATACACTA  GCAGCAGACG  TTGCAAACGC  AGGACTCATC
CTCTTCTCTA  ACACCATTTT  GCATGAAAAC  AGCCAGTTAT
GGGCTTGATG  GAGCTCGCTC  ATTCCAATTC  CTTCTATTAG
GCTACTAACA  CCATGACTTT  ATTAGCCTGT  CTATCCTGGC
CCCCCTGGCG  AGGTCATGTT  TGTTTATTTC  CGAATGCAAC
AAGCTCCGCA  TTACACCCGA  ACATCACTCC  AGATGAGGGC
TTTCTGAGTG  TGGGGTCAAA  TAGTTTCATG  TTCCCAAATG
GCCCAAAACT  GACAGTTTAA  AGGCTGTCTT  GGAACCTAAT
ATGACAAAAG  CGTGATCTCA  TCCAAGATGA  ACTAAGTTTG
GTTGGTTGAA  ATCCTAACGG  CCAGTTGGTC  AAAAAGAAAC
TTCCAAAAGT  CGGCATACCG  TTTGTCTTGT  TTGGTATTGA
TTGACGAATG  CTCAAAAATA  ATCTCATTAA  TGCTTAGCGC
AGTCTCTCTA  TCGCTTCTGA  ACCCGGTGGC  ACCTGTGCCG
AAACGCAAAT  GGGGAAACAA  CCCGCTTTTT  GGATGATTAT
GCATTGTCCT  CCACATTGTA  TGCTTCCAAG  ATTCTGGTGG
GAATACTGCT  GATAGCCTAA  CGTTCATGAT  CAAAATTTAA
CTGTTCTAAC  CCCTACTTGG  ACAGGCAATA  TATAAACAGA
AGGAAGCTGC  CCTGTCTTAA  ACCTTTTTTT  TTATCATGAT
TATTAGCTTA  CTTTCATAAT  TGCGACTGGT  TCCAATTGAC
AAGCTTTTGA  TTTTAACGAC  TTTTAACGAC  AACTTGAGAA
GATCAAAAAA CAACTAATTA TTCGAAACG-3′
23、根据权利要求7所述DNA片段，该片段具有下列核苷酸顺序：
5′-TT
CACCCATACA  ACTATAAACC  TTAGCAATTG  AAATAACCCC
AATTCATTGT  TCCGAGTTTA  ATATACTTGC  CCCTATAAGA
AACCAAGGGA  TTTCAGCTTC  CTTACCCCAT  GAACAGAATC
TTCCATTTAC  CCCCCACTGG  AGAGATCCGC  CCAAACGAAC
AGATAATAGA  AAAAAACAAT  TCGGACAAAT  AGAACACTTT
CTCAGCCAAT  TAAAGTCATT  CCATGCACTC  CCTTTAGCTG
CCGTTCCATC  CCTTTGTTGA  GCAACACCAT  CGTTAGCCAG
TACGAAAGAG  GAAACTTAAC  CGATACCTTG  GAGAAATCTA
AGGCGCGAAT  GAGTTTAGCC  TAGATATCCT  TAGTGAAGGG
TGTCCGATAC  TTCTCCACAT  TCAGTCATAG  ATGGGCAGCT
TGTATCATGA  AGAGCGGAA  ACGGGCATAA  GGGTAACCGC
CAAATTATAT  AAAGACAACA  TGCCCAGTT  TAAAGTTTTT
CTTTCCTATT  CTTGTATCCT  GAGTGACCGT  TGTGTTTAAT
ATAAAAAGTT  CGTTTTAACT  TAAGACCAAA  ACCAGTTACA
ACAAATTATA  ACCCCTCTAA  ACACTAAAGT  TCACTCTTAT
CAAACTATCA AACATCAAAA-3′
24、根据权利要求1所述DNA片段，进而包括：
一个  编码区，其中所述调节区位于肽编码区5′端。
25、根据权利要求24所述DNA片段，其中所述肽编码区是为醇氧化酶编码的。
26、根据权利要求25所述DNA片段，该片段具下列核苷酸顺序：
Figure 85109718_IMG1
TCT  TCT  CGG  TAG  CAA  GGT  ACA  CGA  TTG  CAG  AAC  CCA
GGT  GGT  TCT  TCT  ATC  AAC  TTC  ATG  ATG  TAC  ACC  AGA
CCA  CCA  AGA  AGA  TAG  TTG  AAG  TAC  TAC  ATG  TGG  TCT
GGT  TCT  GCT  TCT  GAT  TCT  GAT  GAC  TTA  CAA  GCC  GAG
CCA  AGA  CGA  AGA  CTA  AGA  CTA  CTG  AAA  GTT  CGG  CTC
GGC  TCG  AAA  ACA  GAG  GAC  TTG  CTT  CAA  TTG  ATG  AAA
CCG  AGC  TTT  TGT  CTC  CTG  AAC  GAA  GGT  AAC  TAC  TTT
AAG  ACT  GAG  ACC  TAC  CAA  AGA  GCT  TGN  CAA  CNA  TAC
TTC  TGA  CTC  TGG  ATG  GTT  TCT  CGA  ACN  GTT  GNT  ATG
CCT  GAC  ATT  CAC  GGT  TTC  GAA  GGT  CCA  ATC  AAG  GTT
GGA  CTG  TAA  GTG  CCA  AAG  CTT  CCA  GGT  TAG  TTC  CAA
TCT  TTC  GGT  AAC  TAC  ACC  TAC  CCA  GTT  TGC  CAG  GAC
AGA  AAG  CCA  TTG  ATG  TGG  ATG  GGT  CAA  ACG  GTC  CTG
TTC  TTG  AGG  GCT  TCT  GAG  TCC  CAA  GGT  ATT  CCA  TAC
AAG  AAC  TCC  CGA  AGA  CTC  AGG  GTT  CCA  TAA  CGT  ATG
GTT  GAC  GAT  CTG  GAA  GAC  TTG  GTA  CTG  ACT  CAC  GGT
CAA  CTG  CTA  GAC  CTT  CTG  AAC  CAT  GCA  TGA  GTG  CCA
GCT  GAA  CAC  TGG  TTG  AAG  TGG  ATC  AAC  AGA  GAC  ACT
CGA  CTT  GTG  ACC  AAC  TTC  ACC  TAG  TTG  TCT  CTG  TGA
CGT  CGT  TCC  GAC  TCT  GCT  CAT  GCA  TTT  GTC  ACA  TCT
GCA  GCA  AGG  CTG  AGA  CGA  GTA  CGT  AAA  CAG  GTG  AGA
TCT  ACT  ATG  AGA  AAC  CAC  GAC  AAC  TTG  TAC  TTG  AGA
AGA  TGA  TAC  TCT  TTG  GTG  CTG  TTG  AAC  ATG  AAC  TAG
TGT  AAC  ACG  AAG  GTC  GAC  AAA  ATT  ATT  GTC  GAA  GAC
ACA  TTG  TGC  TTC  CAG  CTG  TTT  TAA  TAA  CAG  OTT  CTG
GGA  AGA  GCT  GCT  GCT  GTT  AGA  ACC  GTT  CCA  AGC  AAG
CCT  TCT  CGA  CGA  CGA  CAA  TCT  TGG  CAA  GGT  TCG  TTC
CCT  TTG  AAC  CCA  AAG  AAG  CCA  AGT  CAC  AAG  ATC  TAC
GCA  AAC  TTG  GGT  TTC  TTC  GGT  TCA  GTG  TTC  TAG  ATG
CGT  GCT  AGA  AAG  CAA  ATC  TTT  TTG  TCT  TGT  GGT  ACC
GCA  CGA  TCT  TTC  GTT  TAG  AAA  AAC  AGA  ACA  CCA  TGG
ATC  TCC  TCT  CCA  TTG  GTT  TTG  CAA  AGT  TCC  GCT  TTT
TAG  AGG  AGA  GGT  AAC  CAA  AAC  GTT  TCT  AGG  CCA  AAA
GGT  GAC  CCA  ATC  AAG  AGA  GCC  GCT  GGT  GTT  TTG  AAG
CCA  CTG  GGT  TAG  TTC  TCT  CGG  CGA  CCA  CAA  AAC  TTC
CCT  TTG  GTC  AAC  TTG  CCA  GGT  GTC  GGA  AGA  AAC  TTC
GGA  AAC  CAG  TTG  AAC  GGT  CCA  CAG  CCT  TOT  TTG  AAG
CAA  GAC  CAT  TAT  TGT  TTC  AGT  CCT  TAC  AGA  TTC  ATC
GTT  CTG  GTA  ATA  ACA  AAG  TCA  GGA  ATG  TCT  AAG  TAG
AAG  CCT  CAG  TAC  GAG  TCT  TTC  GAT  GAC  TTC  GTC  CGT
TTC  GCA  CTC  ATG  CTG  AGA  AAG  CTA  CTG  AAG  CAG  GCA
GGT  GAT  GCT  GAG  ATT  CAA  AAG  AGA  GTC  GTT  GAC  CAA
CCA  CTA  CGA  CTC  TAA  GTT  TTC  TCT  CTG  CAA  CTG  GTT
TGG  TAC  GCC  AAT  GGT  ACT  GGT  CCT  CTT  GCC  ACT  AAC
ACC  ATG  CGG  TTA  CCA  TGA  CCA  GGA  GAA  CGG  TGA  TTG
GGT  ATC  GAA  GCA  GGT  TCA  GTC  AAG  ATC  AGA  CCA  ACA  CCA
CCA  TAG  CTT  CGA  CCA  CAG  TTC  TAG  TCT  GGT  TGT  GGT
GAA  GAA  CTC  TCT  CAA  ATG  GAC  GAA  TCC  TCC  CAG  GAG
CTT  CTT  GAG  AGA  GTT  TAC  CTG  CTT  AGG  AAG  GTC  CTC
GTT  TAC  AGA  GAA  TAC  TTC  GAA  GAC  AAG  CCA  GAC  AAG
CCA  ATG  TCT  CTT  ATG  AAG  CTT  CTG  TTC  GGT  CTG  TTC
ACT  ATG  TTC  CAC  TTC  TTG  GAA  TAC  CCA  TTC  TCC  AGA
TGA  TAC  AAG  GTG  AAG  AAC  CTT  ATG  GGT  AAG  AGG  TCT
GGT  TCC  ATT  CAC  ATT  ACC  TCC  CCA  GAC  CCA  TAC  GCA
CCA  AGG  TAA  TGT  TAA  TGG  AGG  GGT  CTG  GGT  ATG  CGT
GCT  CCA  GAC  TTC  GAC  CGA  GGT  TTC  ATG  AAC  GAT  GAA
CGA  GGT  CTG  AAG  CTG  GCT  CCA  AAC  TAC  TTG  CTA  CTT
AGA  GAC  ATG  GCT  CCT  ATG  GTT  TGG  GCT  TAC  AAG  TCT
TCT  CTG  TAC  CGA  GGA  TAC  CAA  ACC  CGA  ATG  TTC  TTC
TCT  AGA  GAA  ACC  GCT  AGA  AGA  AGT  GAC  CAC  TTT  CCC
AGA  TCT  CTT  TGG  CGA  TCT  TCT  TCA  CTG  GTG  AAA  CGG
GGT  GAG  GTC  ACT  TCT  CAC  CAC  CCT  CTG  TTG  CCA  TAC
CCA  CTC  CAG  TGA  AGA  GTG  GTG  GGA  GAC  AAG  GGT  ATG
TCA  TCC  GAG  GCC  AGA  GCC  TTG  GAA  ATG  GAT  TTG  GAG
AGT  AGG  CTC  CGG  TCT  CGG  AAC  CTT  TAC  CTA  AAC  CTC
ACC  TCT  AAT  GCC  TAC  GGT  GGA  CCT  TTG  AAC  TTG  TCT
TGG  AGA  TTA  CGG  ATG  CCA  CCT  GGA  AAC  TTG  AAC  AGA
GCT  GGT  CTT  GCT  CAC  GGT  TCT  TTG  ACT  CAA  CTT  TTG
CGA  CCA  GAA  CGA  GTG  CCA  AGA  ACC  TGA  GTT  GGA  AAC
AAG  AAG  CCA  ACT  GCA  AAG  AAC  GAA  GGC  CAC  GTT  ACT
TTC  TTC  GGT  TGA  CGT  TTC  TTG  CTT  CCG  GTG  CAA  TGA
TCG  AAC  CAG  GTC  GAG  CTT  CAT  CCA  GAC  ATC  GAG  TAC
AGC  TTG  GTC  CAG  CTC  GAA  GTA  GGT  CTG  TAG  CTC  ATG
GAT  GAG  GAG  GAT  GAC  AAG  GCC  ATT  GAG  ACC  TAC  ATT
CTA  CTC  CTC  CTA  CTG  TTC  CGG  TAA  CTC  TTG  ATG  TAA
CGT  GAG  CAC  ACT  GAG  ACC  ACA  TGG  CAC  TGT  CTG  GGA
GCA  CTC  GTG  TGA  CTC  TGG  TGT  ACC  GTG  ACA  CCA  GGT
ACC  TGT  TCC  ATC  GGT  CCA  AGA  GAA  GGT  TCC  AAG  ATC
TGG  ACA  AGG  TAG  CCA  GGT  TCT  CTT  CCA  AGG  TTC  TAG
GTC  AAA  TGG  GGT  GGT  GTT  TIG  GAC  CAC  AGA  TCC  ACC
CAG  TTT  ACC  CCA  CCA  CAA  AAC  CTG  GTG  TCT  AGG  TTG
Figure 85109718_IMG2
27、根据权利要求24所述DNA片段，其中所述肽编码区是为肽P76编码的。
28、根据权利要求24所述DNA片段，其中所述肽编码区里为肽P40编码的。
29、根据权利要求24所述DNA片段，其中所述肽编码区是为异质肽编码的。
30、根据权利要求29所述DNA片段，其中所述异质肽为β-半乳糖苷酶。
31、根据权利要求30所述DNA片段，其中所述DNA片段是从图15中用限制酶切图定性的一组片段中选出的。
32、根据权利要求30所述DNA片段，其中所述DNA片段是用图16中的限制性酶切图定性的。
33、根据权利要求25所述DNA片段，其中所述DNA片段是由图2的限制性酶切图定性的。
34、根据权利要求27所述DNA片段，该片段是由图10的限制性酶切图定性的。
35、根据权利要求28所述DNA片段，该片段是由图11的限制性酶切图定性的。
36、根据权利要求24所述DNA片段，进而包含肽编码区DNA下游3′端顺序，其中所述3′顺序以控制转录的聚腺苷酰化及洁来，并控制为该肽编码的信息RNA转译洁来。
37、根据权利要求24所述DNA片段，该片段进而包含一个或多个由下述DNA之一衍化来的附加DNA顺序：
细菌质粒DNA，噬菌体DNA，醇母质粒DNA，和醇母染色体DNA。
38、根据权利要求37所述DNA片段，其中所述醇母染色体包含一个自主复制的DNA顺序和一个标记基因。
39、根据权利要求36所述DNA片段，该片段进一步包含一个或多个由下述DNA之一衍化来的DNA顺序：
细菌质粒DNA，噬菌体DNA，醇母质粒DNA和醇母染色体DNA。
40、根据权利要求39所述DNA片段，其中所述醇母染色体DNA包含一个自主复制DNA顺序和标记基因。
41、包含一个调节区的DNA片段，其中所述调节区当位于肽编码区3′端时能控制信息RNA的聚腺苷酰化和转录结来及其转译结来;其中所说信息RNA的转录和转译是由第二调节区控制的;其中所说第二调节区至少满足下述条件之一：
（1）含该DNA片段的宿主微生物生长在含甲醇的培养基中，和
（2）含该DNA片段的宿主微生物生长在含抑制除甲醇以外碳源的不能分解的产物。
（3）含该DNA片段的宿主微生物生长在抑制碳源和能源的可分解产物后，其生长在处于碳源缺乏状态的培养基上。
其中所述调节区当位于mRNA编码区或其突变的5′端时能控制信息RNA的转录。
42、根据权利要求41所述的DNA片段，该片段已在图7的限制酶切图中定性。
43、根据权利要求41所述的DNA片段，其中所述DNA片段是从在图8的限制酶切图中定性的一组片段中选择的。
44、根据权利要求41所述的DNA片段，该片段已在图9的限制酶切图中被定性。
45、一个为醇氧化酶的编码的基因或其亚单位，或一个该基因或亚单位的等同物。
46、根据权利要求45所述的基因，该基团已用图13的限制酶切图定性。
47、根据权利要求47所述的基因，其核苷酸顺序为：
5′-ATG  GCT  ATC  CCC  GAA  GAG  TTT
3′-TAC  CGA  TAG  GGG  CTT  CTC  AAA
GAT  ATC  CTA  GTT  CTA  GGT  GGT  GGA  TTC  AGT  GGA  TCC
CTA  TAG  GAT  CAA  GAT  CCA  CCA  CCT  AGG  TCA  CCT  AGG
TGT  ATT  TCC  GGA  AGA  TTG  GCA  AAC  TTG  GAC  CAC  TCC
ACA  TAA  AGG  CCT  TCT  AAC  CGT  TTG  AAC  CTG  GTG  AGG
TTG  AAA  GTT  GTT  CTT  ATC  GAA  GCA  GGT  GAG  AAC  CAA
AAC  TTT  CAA  CAA  GAA  TAG  CTT  CGT  CCA  CTC  TTG  GTT
CCT  CAA  CAA  CCC  ATG  GGT  CTA  CCT  TCC  AGG  TAT  TTA
GGA  GTT  GTT  GGG  TAC  CCA  GAT  GGA  AGG  TCC  ATA  AAT
CCC  AAG  AAA  CAG  AAG  TTG  GAC  TCC  AAG  ACT  GCT  TCC
GGG  TTC  TTT  GTC  TTC  AAC  CTG  AGG  TCC  TGA  CGA  AGG
TTC  TAC  ACT  TCT  AAC  CCA  TCT  CCT  CAC  TTG  AAT  GGT
AAG  ATG  TGA  GAG  TTG  GGT  AGA  GGA  GTG  AAC  TTA  CCA
AGA  AGA  GCC  ATC  GTT  CCA  TGT  GCT  AAC  GTC  TTG  GGT
TCT  TCT  CGG  TAG  CAA  GTT  ACA  CGA  TTG  CAG  AAC  CCA
GGT  GGT  TCT  TCT  ATC  AAC  TTC  ATG  ATG  TAC  ACC  AGA
CCA  CCA  AGA  AGA  TAG  TTG  AAG  TAC  TAC  ATG  TGG  TCT
GGT  TCT  GCT  TCT  GAT  TCT  GAT  GAC  TTN  CAA  GCC  GAG
CCA  AGA  CGA  AGA  CTA  AGA  CTA  CTG  AAN  GTT  CGG  CTC
GGC  TCG  AAA  ACA  GAG  GAC  TTG  CTT  CCA  TTG  ATG  AAA
CCG  AGC  TTT  TGT  CTC  CTG  AAC  GAA  GGT  AAC  TAC  TTT
AAG  ACT  GAG  ACC  TAC  CAA  AGA  GCT  TGN  CAA  CNA  TAC
TTC  TGA  CTC  TGG  ATG  GTT  TCT  CGA  ACN  GTT  GNT  ATG
CCT  GAC  ATT  CAC  GGT  TTC  GAA  GGT  CCA  ATC  AAG  GTT
GGA  CTG  TAA  GTG  CCA  AAG  CTT  CCA  GGT  TAG  TTC  CAA
TCT  TTC  GGT  AAC  TAC  ACC  TAC  CCA  GTT  TGC  CAG  GAC
AGA  AAG  CCA  TTG  ATG  TGG  ATG  GGT  CAA  ACG  GTC  CTG
TCC  TTG  AGG  GCT  TCT  GAG  TCC  CAA  GGT  ATT  CCA  TAC
AAG  AAC  TCC  CGA  AGA  CTC  AGG  GTT  CCA  TAA  CGT  ATG
GTT  GAC  GAT  CTG  CAA  GAC  TTG  GTA  CTG  ACT  CAC  GGT
CAA  CTG  CTA  GAC  CTT  CTG  AAC  CAT  GAC  TGA  GTG  CCA
GCT  GAA  CAC  TGG  TTG  AAG  TGG  ATC  AAC  AGA  GAC  ACT
CGA  CTT  GTG  ACC  AAC  TTC  ACC  TAG  TTG  TCT  CTG  TGA
CGT  CGT  TCC  GAC  TCT  GCT  CAT  GCA  TTT  GTC  CAC  TCT
GCA  GCA  AGG  CTG  AGA  CGA  GTA  CGT  AAA  CAG  GTG  AGA
TCT  ACT  ATG  AGA  AAC  CAC  GAC  AAC  TTG  TAC  TTG  ATC
AGA  TGA  TAC  TCT  TTG  GTG  CTG  TTG  AAC  ATG  AAC  TAG
TGT  AAC  ACG  AAG  GTC  GAC  AAA  ATT  ATT  GTC  GAA  GAC
ACA  TTG  TGC  TTC  CAG  CTG  TTT  TAA  TAA  CAG  CTT  CTG
GGA  AGA  GCT  GCT  GCT  GTT  AGA  ACC  GTT  CCA  AGC  AAG
CCT  TCT  CGA  CGA  CGA  CAA  TCT  TGG  CAA  GGT  TCG  TTC
CCT  TTG  AAC  CCA  AAG  AAG  CCA  AGT  CAC  AAG  ATC  TAC
GCA  AAC  TTG  GGT  TTC  TTC  GGT  TCA  GTG  TTC  TAG  ATG
CGT  GCT  AGA  AAG  CAA  ATC  TTT  TTG  TCT  TGT  GGT  ACC
GCA  CGA  TCT  TTC  GTT  TAG  AAA  AAC  AGA  ACA  CCA  TGG
ATC  TCC  TCT  CCA  TTG  GTT  TTG  CAA  AGA  TCC  GGT  TTT
TAG  AGG  AGA  GGT  AAC  CAA  AAC  GTT  TCT  AGG  CCA  AAA
GGT  GAC  CCA  ATC  AAG  TTG  AGA  GCC  GCT  GGT  GTT  AAG
CCA  CTG  GGT  TAG  TTC  AAC  TCT  CGG  CGA  CCA  CAA  TTC
CCT  TTG  GTC  AAC  TTG  CCA  GGT  GTC  GGA  AGA  AAC  TTC
GAA  AAC  CAG  TTG  AAC  GCT  CCA  CAG  CCT  TCT  TTG  AAG
CAA  GAC  CAT  TAT  TGT  TTC  TTC  AGT  CCT  TAC  AGA  ATC
GTT  CTG  CTA  TAT  ACA  AAG  AAG  TCA  GGA  ATG  TCT  TAG
AAG  CCT  CAG  TAC  GAG  TCT  TTC  GAT  GAC  TTC  GTC  CGT
TTC  GCA  GTC  ATG  CTC  AGA  AAG  CTA  CTG  AAG  CAG  GCA
GGT  GAT  GCT  GAG  ATT  CAA  AAG  GAC  GTC  GTT  GAC  CAA
CCA  CTA  CGA  CTC  TAA  GTT  TTC  TCT  CAG  CAA  CTG  GTT
TGG  TAC  GCC  AAT  GGT  ACT  GGT  CCT  CTT  GCC  ACT  AAC
ACC  ATG  CGG  TTA  CCA  TGA  CCA  GGA  GAA  CGG  TGA  TTG
GGT  ATC  GAA  GCT  GGT  GTC  AAG  ATC  AGA  CCA  ACA  CCA
CCA  TAG  CTT  CGA  CCA  CAG  TTC  TAG  TCT  GGT  TGT  GGT
GAA  GAA  CTC  TCT  CAA  ATG  GAC  GAA  TCC  TTC  CAG  GAG
CTT  CTT  GAG  AGA  GTT  TAC  CTG  CTT  AGG  AAG  GTC  CTC
GGT  TAC  AGA  GAA  TAC  TTC  GAA  GAC  AAG  CCA  GAC  AAG
CCA  ATG  TCT  CTT  ATG  AAG  CTT  CTG  TTC  GGT  CTG  TTC
CCA  GTT  ATG  CAC  TAC  TCC  ATC  ATT  GCT  GGT  TTC  TTC
GGT  CAA  TAC  GTG  ATG  AGG  TAG  TAA  CGA  CCA  AAG  AAG
GGT  GAC  CAC  ACC  AAG  ATT  CCT  CCT  GGA  AAG  TAC  ATG
CCA  CTG  GTG  TGG  TCC  TAA  GGA  GGA  CCT  TTC  ATG  TAC
ACT  ATG  TTC  CAC  TTC  TTG  GAA  TAC  CCA  TTC  TCC  AGA
TGA  TAC  AAG  GTG  AAG  AAC  CTT  ATG  GGT  AAG  AGG  TCT
GGT  TCC  ATT  CAC  ATT  ACC  TCC  CCA  GAC  CCA  TAC  GCA
CCA  AGG  TAA  GAG  TAA  TGG  AGG  GGT  CTG  GGT  ATG  CGT
GCT  CCA  GAC  TTC  GAC  CGA  GGT  TTC  ATG  AAC  GAT  GAA
CGA  GGT  CTG  AAG  CTG  GCT  CCA  AAG  TAC  TTG  CTA  CTT
AGA  GAC  ATG  GCT  CCT  ATG  GTT  TGG  GCT  TAC  AAG  TCT
TCT  CTG  TAC  CGA  GGA  TAC  CAA  ACC  CGA  ATG  TTC  TTC
TCT  AGA  GAA  ACC  GCT  AGA  AGA  AGT  GAC  CAC  TTT  GCC
AGA  TCT  CTT  TGG  CGA  TCT  TCA  TCA  CTG  GTG  AAA  CGG
GGT  GAG  GTC  ACT  TCT  CAC  CAC  CCT  CTG  TTC  CCA  TAC
CCA  CTC  CAG  TGA  AGA  GTG  GTG  GGA  GAC  AAG  GGT  ATG
TCA  TCC  GAG  GCC  AGA  GCC  TTG  GAA  ATG  GAT  TTG  GAG
AGT  AGG  CTC  CGG  TCT  CGG  AAC  CTT  TAC  CTA  AAC  CTC
ACC  TCT  AAT  GCC  TAC  GGT  GGA  CCT  TTG  AAC  TTG  TCT
TGG  AGA  TTA  CGG  ATG  CCA  CCT  GGA  AAC  TTG  AAC  AGA
GCT  GGT  CTT  GCT  CAC  GGT  TCT  TGG  ACT  CAA  CCT  TTG
CGA  CCA  GAA  CGA  GTG  CCA  AGA  ACC  TGA  GTT  GGA  AAC
AAG  AAG  CCA  ACT  GCA  AAG  AAC  GAA  GGC  CAC  GIT  ACT
TTC  TTC  GGT  TGA  CGT  TTC  TTG  CTT  CCG  GTG  CAA  TGA
TCG  AAC  CAG  GTC  GAG  CTT  CAT  CCA  GAC  ATC  GAG  TAC
AGC  TTG  GTC  CAG  CTC  GAA  GTA  GGT  CTG  TAG  CTC  ATG
GAT  GAG  GAG  GAT  GAC  AAG  GCC  ATT  GAG  ACC  TAC  ATT
CTA  CTC  CTC  CTA  CTG  TTC  CGG  TAA  CTC  TTG  ATG  TAA
CGT  GAG  CAC  ACT  GAG  ACC  ACA  TGG  CAC  TGT  CTG  GGA
GCA  CTC  GTG  TGA  CTC  TGG  TGT  ACC  GTG  ACA  CCA  GGT
ACC  TGT  TCC  ATC  GGT  CCA  AGA  GAA  GGT  TCC  AAG  ATC
TGG  ACA  AGG  TAG  CCA  GGT  CTT  CTT  CCA  AGG  TTC  TAG
GTC  AAA  TGG  GGT  GGT  GGT  TIG  GAC  CAC  AGA  TCC  AAC
CAG  TTT  ACC  CCA  CCA  CAA  AAC  CTG  GTG  TCT  AGG  TTG
GTT  TAC  GGA  GTC  AAG  GGC  TIG  AAG  GTT  GGT  GAC  TTG
48、根据权利要求45所述基因，进而包括图2a的限制酶切图中定性的染色体DNA侧部区。
49、一个为肽P76编码的基因或其亚单位，或该基因及其亚单位的等同物。
50、根据权利要求49所述基因，该基因在图12的限制酶切图中被定性。
51、根据权利要求49所述基因，进而包括图1a的限制酶切图定性的染色体DNA侧部区。
52、一个为肽P40编码的基因或其亚单位，或该基因及其亚单位的等同物。
53、根据权利要求52所述的基因，该基因在图14的限制酶切图中被定性。
54、根据权利要求52所述的基因，进而包括图3a中限制酶切图定性的染色体DNA的侧部区。
55、根据权利要求39所述的DNA片段，该片段是以一个闭合环状杂交质粒的形式。
56、根据权利要求55所述的杂交质粒，其中的非细菌插入体具图2a所示的限制酶切图（pPG4.0）。
57、根据权利要求55所述杂交质粒，其中的非细菌插入体具有图3a所示的限制酶切图（pPG4.5）。
58、根据权利要求55所述杂交质粒，其中的非细菌插入体具有图16所示的限制酶切图（pPC15.0）。
59、根据权利要求55所述杂交质粒，其中的非细菌插入体具有图26所示的限制酶切图（pPC8.3）。
60、根据权利要求55所述杂交质粒，其中的非细菌插入体具有图2C所示的限制酶切图（pPC8.0）。
61、根据权利要求55所述杂交质粒，其中的非细菌插入体具有图3b所示的限制酶切图（pPC6.7）。
62、根据权利要求55所述杂交质粒，该质粒具有图17所示限制酶切图（PSAOH1）。
63、根据权利要求55所述杂交质粒，该质粒具有图18所示限制酶切图（PSAOH5）。
64、根据权利要求55所述杂交质粒，该质粒具有图19所示限制酶切图（PSAOH10）。
65、根据权利要求55所述杂交质粒，该质粒具有图20所示限制酶切图（PTAFH85）。
66、根据权利要求55所述杂交质粒，该质粒具有图21所示限制酶切图（PT76H1）。
67、根据权利要求55所述杂交质粒，该质粒具有图22所示限制酶切图（PT76H2）。
68、根据权利要求55所述杂交质粒，该质粒具有图22a所示限制酶切图（PT76H3）。
69、根据权利要求55所述杂交质粒，该质粒具有图22b所示限制酶切图（PT76H4）。
70、根据权利要求55所述杂交质粒，该质粒具有图30所示限制酶切图（PTA013）。
71、根据权利要求55所述杂交质粒，该质粒具有图30a所示限制酶切图（PT76U1）。
72、一个转化了的酵母菌株，该菌株含重组DNA材料;其中所述重组DNA材料包括：
（1）一个DNA片段;和
（2）一个肽编码区;
其中所述DNA片段必须满足下列条件之一：
（1）含该DNA片段的宿主微生物生长在含甲醇的培养基中，和
（2）含该DNA片段的宿主微生物生长在含抑制除甲醇以外碳源的不能分解的产物。
（3）含该DNA片段的宿主微生物生长在除甲醇外的碳源和能源上后再生长在处于碳源缺乏状态的培养基上。
其中所说的调节区位于肽编码区的5′端，所说的转化酵母菌株能通过肽编码区表达该肽。
73、根据权利要求73所述转化的酵母菌株，该菌株能以甲醇为碳源和能源生长。
74、根据权利要求66所述转化的酵母菌株，该菌株选自下面几个属：
白色念珠菌属（Candida），Kloeckera，酵母属（Saccharomyces），红色球状酵母（Rhodotorula），Haustnula属，球拟酵母属（Torulapsis）和Pichia属。
75、根据权利要求75所述转化酵母，该酵母选自Pichia属。
76、根据权利要求73所述转化酵母菌株，其中所述重组DNA材料进而包含一个第二DNA片段;该第二DNA片段当位于生产mRNA肽编码区的3′样时能控制mRNA的聚腺苷酰化，转录结来和转译结来。
77、根据权利要求73所述转化酵母菌株。该菌株能以下面物质中选出的至少一种为碳源的能源生长：甲醇、葡萄糖、乙酸脂、乙醇、甘油、蔗糖、乳糖、果糖和半乳糖。
78、根据权利要求78所转化醇母菌株，该菌株是从下列属中选出的：
白色念珠菌属，Kleoeckera属，酵母菌，红色球状酵母属，Hansenula属，球状酵母属，Pichia属，裂殖酵母属（Schizosaccharomyces），Klyveromyees属。
79、根据权利要求70所述转化酵母菌株，该菌株选自酵母属（Sacharomyces）。
80、根据权利要求65所述转化酵母菌株，该菌株是Pichia  Pastoris  NRRL  Y-15852（GS115-PSAOH1）。
81、根据权利要求65所述转化酵母菌株，该菌株是Pichia  Pastoris  NRRL  Y-15853（GS115-PSAOH5）。
82、根据权利要求65所述转化酵母菌株，该菌株是Pichia  Pastoris  NRRL  Y-15855（GS115-PSAOH10）。
83、根据权利要求65所述转化酵母菌株，该菌株是Pichia  Pastoris  NRRL  Y-15855（GS115-PTAFA.85）。
84、根据权利要求65所述转化酵母菌株，该菌株是Pichia  Pastoris  NRRL  Y-15856（GS115-PT76H1）。
85、根据权利要求65所述转化酵母菌株，该菌株是Pichia  Pastoris  NRRL  Y-15857（GS115-PT76H2）。
86、根据权利要求65所述转化酵母菌株，该菌株是酿酒酵母（Saccharomgces  cereisias）NRRL  Y-15856（S  Y2102-PTA013）。
87、一个携带权利要求63所述杂种质粒的大肠杆菌基本上纯的培养物。CE·coli  NRRL  B-15861;MC1061-PSAOH1）。
88、一个携带权利要求64所述杂种质粒的大肠杆菌基本上纯的培养物（E·coli  NRRL  B-15862;MC1061-PSAOH5）。
89、一个携带权利要求65所述杂种质粒的大肠杆菌基本上纯的培养物（E·cole  NRRL  B-15863，MC1061-PSAOH10）。
90、一个携带权利要求66所述杂种质粒的大肠杆菌基本上纯的培养物（E·coli  NRRL  B-15864，MC1061-PTAFH.85）。
91、一个携带权利要求67所述杂种质粒的大肠杆菌基本上纯的培养物（E·coli  NRRL  B-15865，MC1061-PT76H1）。
92、一个携带权利要求68所述杂种质粒的大肠杆菌基本上纯的培养物（E·coli  NRRL·B-15866;MC1060-PT76H2）。
93、一个携带权利要求69所述杂种质粒的大肠杆菌基本上纯的培养物（E·coli  NRRL  B-18000;MC1061-PT76H3）。
94、一个携带权利要求70所述杂种质粒的大肠杆菌基本上纯的培养物（E·coli  NRRL  B-18001;MC1061-PY76H4）。
95、一个携带权利要求71所述杂种质粒的大肠杆菌基本上纯的培养物（E·coli  NRRL  B-15875;MC1601-PTA013）。
96、一个携带权利要求72所述杂种质粒的大肠杆菌基本上纯的培养物（E·coli  NRRL  B-18002;MC1061-PT76U1）。
97、一个携带权利要求56所述杂种质粒的大肠杆菌基本上纯的培养物（E·coli  RRRL·B-15867;LE392-pPG6.0）。
98、一个携带权利要求57所述杂种质粒的大肠杆菌基本上纯的培养物（E·coli  NRRL·B-15868.LE392-pPG4.0）。
99、一个携带权利要求58所述杂种质粒的大肠杆菌基本上纯的培养物（E·coli·NRRL  B-15869;LE392-pPG4.8）。
100、一个携带权利要求59所述杂种质粒的大肠杆菌基本上纯的培养物（E·coli  NRRL  B-15870;LE392-pPC15.0）。
101、一个携带权利要求60所述杂种质粒的大肠杆菌基本上纯的培养物（E  coli  NRRL  B-15871;LE392-pPC8.3）。
102、一个携带权利要求61所述杂种质粒的大肠杆菌基本上纯的培养物（E·coli  NRRL  B-15873;MM392-pPC8.0）。
103、一个携带权利要求62所述杂种质粒的大肠杆菌基本上纯的培养物（E·coli  NRRL  B-15872;LE392-pPC6.7）。
104、制备肽的方法，包括把一个转化酵母菌株在含甲醇的培养基上培养，其中所说的转化酵母菌株能表达一个由重组DNA材料衍化的插入的肽编码顺序，其中所述重组DNA包括（1）一个与甲醇代谢有关的DNA片段和（2）一个肽编码区;其中所述与甲醇代谢有关的DNA片段位于该肽键编码区的5′端。
105、根据权利要求105所述的方法，进而包括分离和提纯所述肽的步骤。
106、根据权利要求105所述的方法，其中所用的转化酵母菌株是以下面各属中选择的：
白色念珠菌属;Kloeckeva属，酵母属，红色球状酵母菌，Hanoenula属，球拟酵母属和Pichia属。
107、制备肽的方法，包括把一个转化的酵母菌株培养在至少包括一种不抑制碳源的可分解产物的培养基上;其中所述的转化酵母菌株能表达从重组DNA材料衍化的。一个插入肽的编码顺序，其中所述重组DNA材料包括：（1）一个与转化酵母生长的培养基中出现不抑制碳源的可分解产物有关，和（2）一个肽编码区;其中所述DNA片段位于肽编码区的5′末端。
108、根据权利要求108所述方法，其中所述不抑制碳源的可分解产物选自甘油和半乳糖。
109、根据权利要求108所述方法，其中转化酵母菌株选自：
白色念珠菌属，Kloeckera属，酵母属，红色球状酵母属，Hansenula属，拟球酵母属，Pichia属。
110、制备肽的方法，包括：
（a）将转化的一个酵母菌株在含有至少一种碳源和能源的培养基上生长;其中所述转化酵母菌株能表达重组DNA材料衍化的一个插入的肽编码顺序;其中所述重组DNA材料包括：
（1）一个调节区，和
（2）一个肽编码区;
其中所述调节区关系到转化酵母菌株在至少一种上述抑制碳源和能源的可分解产物上生长后再在碳素缺乏的基质上生长。调节区位于所述肽编码区的5′端时，
（b）将步骤（a）的产物置于碳素缺乏的条件下。
111、根据权利要求111所述的方法，其中所述至少一种抑制碳源和能源的可分解产物选自：葡萄糖、乙醇和果糖。
112、根据权利要求111所述的方法，其中所述抑制碳源和能源的可分解产物是葡萄糖。
113、根据权利要求111所述的方法，其中所述转化的酵母菌株选自下面属：
白色念珠菌属，Kloeckera属，酵母属，红色球状酵母属，拟球酵母属，Pichia属，裂殖酵母属。
Kluyverromyces属和Hansenula属。
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