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Patents

  1. Advanced Patent Search
Publication numberCN85109013 A
Publication typeApplication
Application numberCN 85109013
Publication date30 Jul 1986
Filing date8 Nov 1985
Priority date12 Nov 1984
Also published asCN1014429B, DE186271T1, DE3584957D1, EP0186271A1, EP0186271B1, US5413908, WO1986002948A1
Publication number85109013.3, CN 85109013, CN 85109013 A, CN 85109013A, CN-A-85109013, CN85109013, CN85109013 A, CN85109013.3, CN85109013A
Inventors亚历克·约翰·杰弗里斯
Applicant利斯特预防剂研究所
Export CitationBiBTeX, EndNote, RefMan
External Links: SIPO, Espacenet
多核苷酸探针
CN 85109013 A
Abstract
用于制备DNA探针的多核苷酸,包含这种多核苷酸的探针,及制备和使用这种探针的方法。这种多核苷酸包含DNA的“核心”区域,该区域能与人类或动物DNA的多态区杂交(结合),并因之能制成能够对人类或动物比如:从血液、精子、发根等进行精确的身份鉴别的DNA“指纹图谱”。
Claims(34)
1.制备具有下式多核苷酸的方法,其特征是该多核苷酸按5′→3′的方向译读,H.(J.Core.(核心).K)n·L  (1)式中:“核心”(“core”)表示了具有至少6个连续的核苷酸的顺序,它是选自下列顺序中之一,并按相同的方向译读:GGAGGTGGGCAGGAXG     (2)AGAGGTGGGCAGGTGG     (3)GGAGGYGGGCAGGAGG     (4)T(C)mGGAGGAXGG(G)PC  (5A)T(C)mGGAGGA(A)qGGGC  (5B)其中:X是A或G,Y是C或T,T是T或U,m是0,1或2,P是0或1,q是0或1,n至少是3;J和K一起表示0--15个的在重复的单位内的添加核苷酸;H和L各自表示0或至少是1的位于一些重复的单位两侧的添加核苷酸,并以下为条件:(ⅰ)“核心”和J和K不需有相同的顺序或长度(在每个(J·core·K)重复的单位中);(ⅱ)“核心”也能表示变种核心顺序;(ⅲ)在所有n重复的单位中的总实际核心顺序,至少有70%与总的“真的”核心顺序是同系的,它是如上述的有同一个数n的重复的单位的式2到5所限定的,以及上述的互补顺序的多核苷酸,其方法选自如下:(a)直接合成(b)通过离体的和无性繁植的材料,经微生物方法的处理得以繁植。
2.据权利要求1的方法,其中存在于每个(J.core.K)重复的顺序的核苷酸的总数不超过25。
3.据权利要求1的方法,其中核心有16核苷酸的最大值。
4.据权利要求1的方法,其中核心表示至少7个上述连续核苷酸的顺序。
5.据权利要求1的方法,其中核心表示至少12个上述连续核苷酸的顺序。
6.据权利要求1的方法,其中核心表示14-16个上述选自式(2)、(3)或(4)顺序的连续核苷酸的顺序。
7.据前述的任何一个权利要求的方法,其中实际核心顺序至少有80%与真核心顺序是同系的。
8.据权利要求7的方法,其中J是0或1,K是0或1。
9.据前述的任何一个权利要求的方法,其中存在于每个(J.core.K)重复的单位的核苷酸的总数不超过20。
10.根据权利要求1的方法,其特征是该多核苷酸按5′→3′的方向译读:H.(J.core(核心).K.)n.L  (1)式中:“核心”表示有6-16个的连续的核苷酸,按相同的方向译读,并选自(1)第一的人类或动物型随体(minisatellite)的共用核心区(common  core  region),该随体是用探查物对人类或动物基因组DNA进行探查而得的,其中含有肌红蛋白纵列重复的顺序,其中每个重复的单位是近似33nt,(2)第二的人类或动物小型随体的共用核心区,该随体是用探查物对人类或动物DNA进行探查而得的,其中含有如(1)的纵列重复的顺序,(3)第三的人类或动物小型随体的共用核心区,该随体是用探查物对人类或动物基因组DNA进行探查而得到的,其中含有如(2)的纵列重复的顺序,每个上述的纵列重复的顺序,至少是3个单位的重复,以及上述的互补顺序的多核苷酸。
11.根据权利要求1的方法,其特征是该多核苷酸按5′→3′方向译读,H.(J.core.K)n·L  (1)式中:“核心”表示任何一个有至少6个连续的核苷酸的顺序,它是选自具有复数的人类或动物的表示至少75%的同感的基因组DNA的共同核心区,在每个重复的单位中,“核心”不需要有相同的顺序,而所有其他的符号已在权利要求1中限定,以及上述的互补顺序的多核苷酸。
12.根据权利要求1的方法,其特征是具有至少三个3-12nt的顺序的重复的多核苷酸,其中含有连续的(5′→3′)核心顺序,它是选自:(5′)GPGGGCWGGWXG(3′)  (6)其中:P不等于G,W等于A或T或U,X等于A或G,或是它们的变种,假设在所有重复中的总的实际核心顺序,至少有70%是与在同样数目重复下的式(6)所限定的总的“真的”核心顺序是同系的,以及上述的互补顺序的多核苷酸。
13.据权利要求12的方法,其中多核苷酸中的每个重复或变种重复,包含了式(6)的顺序。
14.据前述的任一个权利要求的方法,其中连续(5′→3′)的顺序:PGGGCWG  (7)是存在于所有的重复的单位中,P和W具有与权利要求12中的同样含义。
15.据前述的任一个权利要求的方法,其中连续(5′→3′)的顺序:TGGGCA  (8)是存在于所有的重复的单位里,T是等于T或U。
16.据权利要求12-15的任一个方法,其中P是T或U。
17.据权利要求12-16的任一个方法,其中W是A。
18.据权利要求12-17的任一个方法,其中背诵(recited)连续核心顺序或保存(conserved)顺序与重复的顺序是相同的。
19.其特征是具有至少三个重复的方法,其中含有连续的(5′→3′)核心顺序,GGPGGGCWGGWXG  (7)式中:P不等于G,W等于A或T或U,而X等于A或G,或是它们的变种,假设在所有重复中的总的实际核心顺序至少有70%是与在同样数目重复下的式(7)所限定的总的“真的”核心顺序是同系的,以及上述的互补顺序的多核苷酸。
20.据权利要求19的方法,其中在5′端的W是A,而在3′端的W是T或U。
21.具有多形体的小随体-长度-特殊结合的特性的多核苷酸的制备方法,其特征是(ⅰ)鉴定DNA中天然纵列重复顺序,它能对其他的多形体DNA区限制杂交(ⅱ)鉴定假定对这样的结合负责的重复顺序的天然同感核心顺序(ⅲ)分离或人为地建筑一个完整的或不完整的纵列重复顺序,它是由具有小随体结合性质的天然同感核心顺序衍生的,其中显示了比天然重复的顺序更低的基因组-地点(locus)-特异性和更高的多形体片段吸收率。
22.据权利要求21的方法,其中的多核苷酸是由1-20的任一个权利要求所限定。
23.一个用于人类或动物的含有DNA样品的遗传起源的测定(genetic  origin  determinations)的多核苷酸探查物,其中包括标记的或标记物组分,含有顺序的至少三个纵列重复(包括变种)的多核苷酸,该顺序以一定的程度保持与人类或动物基因组的小随体区同系,以使探查物能对相应的用限制性核酸内切酶片段样品DNA的片段进行杂交,其特征在于:a).每个重复含有至少与从不同的基因组地点的复数的小随体中,长度相似的同感核心地区有70%同系的核心。b).这核心是6-16多核苷酸长c).在重复单位中,并不有助于这核心的多核苷酸的总数是不超过15个。
24.据权利要求23的探查物,其中这核心包含5′→3′的连续的顺序:PGGGCWG  (7)或TGGGCA  (8)式中:P不等于G;W等于A或T或U
25.据权利要求23的探查物,其中多核苷酸,是据权利要求1-20中的一个多苷酸,至少其重复单位是单链形式。
26.多核苷酸探查物,其中是据权利要求1-20中所限定的任一个标记的多核苷酸,并至少其重复单位是单链形式。
27.据权利要求23-26的任一个探查物,都是单链形式。
28.用于人类或动物的含有DNA样品的遗传起源测定的探查物的制备方法,其特征是包括了把标记或标记物导入到据权利要求1-20的任一个或由权利要求21中方法所制备的多核苷酸。
29.对人类或动物的基因组的DNA的样品的鉴定的方法,其特征是包括了据权利要求23-27的任一个权利要求,用探查物探查该DNA,并又检测该DNA的杂交片段。
30.据权利要求29的方法,其中检测的片段是通过把样品DNA用限制性内切酶进行分裂而制得的,其中不能对它们的纵列重复的顺序造成破坏性的分裂。
31.据权利要求29或30的方法,其中由所得的正片段的模式进行比较,至少采用两个据权利要求23-27中任一个权项中的不同的探查物。
32.其特征是具有人类或动物的,其中与遗传疾病,变态或遗传特性(trait)相关连的,并由该疾病中分离所得的基因组的小随体区的地点特异的探查物,变态或与遗传特性相关联的区带是通过对一个家庭中,每个人的由1个或更多的依据权利要求23-29中任一个权利要求中的探查物生成的模式的比较,或进行家史分析而观察到的。
33.其特征是由使用据权利要求23-27中的任一个权利要求中的1个或更多探查物所制得的指纹区带所衍生的探查物,且观察到与染色体或与癌症相关的DNA变态是有关联的。
34.据权利要求中23-27,33任一个探查物的修饰,其中至少一对(J.core.K)的纵列重复是被一个不含有核心的顺序,从至少两个重复中分离出来。其中n不需要等于3,其他的约束仍然如故。
Description

本发明涉及用于探查人类或动物基因组的可标记的多核苷酸探针,以及用该探针

定基因组DNA的方法。这些

定法在父系和母系检验、法医学、遗传疾病以及癌症的诊断方面是有用的。

以前

定基因组DNA中遗传变异的主要方法是检测限制性片段长度多态性(RFLP)。如

定引起Huntington氏午蹈病DNA缺陷的部位(见J.F.Gusella等,Nature 306,234-238,1983);以及对成视网膜细胞瘤的前因素的分析(见W.K.Cavanee等,Nature 305,779-784,1983)。

大多数RFLP是由于DNA中小范围改变,通常是由于硷基置换引起的,造成或破坏了特异限制性内切酶位点所致。因为人类DNA的平均杂合性较低(每个碱基对大约0.001),故在一个已给定的部位很少能由限制性内切酶确定一个PFLP。即使进行了此项测定,由于大多数RFLP就杂合性来说只是二态性的(有或没有限制性核酸内切酶位点),其所取决的等位频度也绝大超过50%,而通常还要低些,因此不管考查的个体是否为纯合子,所有这些RFLP对于谱系分析均没有意义(不能提供所需要的信息)。

对于表现出多等位基因变异,而具有高杂合性的DNA,如得到该高变异区域的探针,则可大大简化其遗传分析程序。第一个这样的区域是由A.R.Wyman等人由人DNA的随机片段文库中得到的(见Proc.Nat.Acad.Sci.USA    77,67546758,1980)。在这个区域上多等位基因变异的结构基础尚不明了。继之,也是出于偶然,在靠近人胰岛素基因处(G.I.Bell等,Nature    295,31-35,1982),和靠近β-珠蛋白基因处(N.J.Proudfood等,Cell    31,553-563,1982;S,E,Y.Goodbourn等,Proc.Nat.Acad.Sei.USA    80,5022-5026,1983);以及在靠近C-Ha-ras-l致癌基因处(D,J.Capon等,Nature    302,33-37,1983)又发现了其它几个高可变区。在这种情况下,可变区均包括短序列〔“微小随体(minisatellite)〕的串联重复。多态性起因于等位基因在重复数目上的差异,可能是由有丝分裂或有丝分裂的不均等交换或由复制期间DNA滑动所引起的。可使用任何不裂解重复单位的限制性内切酶确定所得微小随体长度的变异。

本发明人及同事先前曾描述了一种人肌红蛋白基因内含子中的,由四个33bp序列串联重复组成的短的微小随体(见P.Weller等,EMBO    J.3,439-446,1984)。值得注意的是,33bp重复序列上表现出与前述其它人类微小随体有“微弱的”相似性。该文推测,微小随体区域可能是因转位而出现的。如果人肌红蛋白基因中33bp重复是可转位的,则其可能提供一个人基因组的串联重复区域的探针,该基因组常常与重复数目不同而导致的多等位基团多态性有关。

用肌红蛋白基团中33bp的串联重复序列DNA探针探查人类基因组DNA。在3个个体(父,母和女儿)的基因组DNA中的几个不同区域观察到了多态变异。这种变异出现于较大的片段中(2-6Kb),与一个以上微小随体区域的长度变异所致的稳定遗传之多态性相对应。

进一步的研究揭示,为了显现微小随体或高可变区中的变异性,用以下方法探查基因组DNA,比用肌红蛋白基因33bp重复片段探针更为有效。

本发明是基于以下发现:即人类或动物基因组DNA中许多微小随体含有一个DNA区域,该区域在不同微小随体间具有高度均一性。此共同核心区为长约16碱基对的短序列。现已发现,以串联重复的核心核苷酸序列作为其基本成分的探针,至少须重复三次才可用于测定基因组DNA中的各种不同微小随体区,并且有能参照这些区域DNA的变异,对个体样品作出

定或作出指纹图谱的精确程度。所得结果之好,完全超出预测,因为以前制得的探针只是能检定基因组DNA中的单一微小随体区。这些探针的

别程序要比由RFLP所给出的好,但却不能提供就个体而言实质上是唯一的指纹。值得指出的是,本文所提出的核心探针能够根据一个以上的微小随体区域或高可变区来区分DNA,正是这一发现,导致了一个不易察觉的且又并非一般水平的发明活动,而使本发明具有基础科学的新颖性和重要性。

根据对核心序列的了解,被制得的DNA探针可具有与基因组中不同区域之微小随体区杂交的性质。但是对于制取一个可操纵的探针本身,仅仅识别或

定特别核心序列是不够的。还必须制得含有核心序列之串联重复体的多核苷酸或其衍生物。这样的探针可作为微小随体从人或动物DNA中分离出来,或者可通过合成进行技术构建。另外,建立其它致使杂交成功的强制条件也是很重要的。这包括要了解保守核心的可耐受的同源程度,以及任何含有或不含有重复序列的非核心DNA,作为一个整体单位的可耐受的长度。

因此,本发明包括要认识和发现:(1)了解能以这种方式应用的任何一个核心序列。它包括进一步 别;

(2)经研究基因组中不同的高可变区,可发现有必须之相符程度的不同核心序列;

(3)可积聚一簇DNA探针,其将识别多态性的不同谱系;

(4)用某探针比另外一个探针可更为成功地完成特殊的遗传分类;

(5)在任一个分类中使用一个以上的探针,可扩大定的可能性;

(6)通过进一步研究成功之探针的第一代,可产生更简单和更成功的探针,如借助于合成。

因此,根据本发明的第一个方面,是提供一种制取多态微小随体长度-特异结合特征的多核苷酸之方法,其包括:(ⅰ) 定DNA的天然串联重复序列,其能够与其它多形DNA区域进行有限杂交;

(ⅱ) 别假定引起这种结合的天然之保守核心序列;以及(ⅲ)分离和人工建造一个完善的或不完善的串联重复序列,该序列得自这样的天然保守核心序列,它们与微小随体结合的性质表现为比天然重复序列较低的基因组区域特殊性和较高的多态片段接受性。

探针的核心组成可以基于同样的基本原则,以各种方式确定。最重要的基本原则是,探针的重复序列应含有或包括共同核心区域的核苷酸序列,与人类或动物基因组DNA的微小随体区域有共同序列。共同的核心区域是在展示高度一致的意义上的“共同的”,即一个微小随体与另一个微小随体之间至少有80%相符。例如,这些微小随体可用肌红蛋白基因33bp重复序列探查基因组DNA片段来测定,以产生本文称之为“λ33阳性”片段的杂交片段。这些片段和肌红蛋白基因的33bp重复序列含有约16bp的共同核心序列。λ33阳性片段本身可用作基因组DNA的探针,以产生也有共同核心序列的另外片段,虽然可能有某些小的变异。

另一个原则是核心核苷酸序列不能短到不能有效地与样品DNA的微小随体区域相杂交的程度,而且不能长到不能测定多态性的程度,这样就变得太象肌红蛋白基因中的33bp串联重复序列了。一般说来,核心应具有六个核苷酸,乃至具有微小随体之共同核心中的核苷酸,即大约16个。探针的重复序列不必完全由核心组成,在核心序列的某一端可含有少量端侧核苷酸。重复单位在核苷酸数目或种类上,以及在重复单位的核心或非核心成分方面,不一定是准确的重复。然而,本文为方便起见,把它们作为重复单位进行描述或定义,尽管这是一个不十分确切的术语。n个重复单位的组,可与任何核苷酸序列相邻,其范围和种类一般是不相干的。

本发明中的,多核苷酸是指以下列方式定义的核苷酸:第一定义:即具有下列通式的多核苷酸,依5′→3′方向读码H.(J.core.K)n.L    (1)

这里:“Core”代表至少有6个连续核苷酸的序列,该序列选自下列以同样方向读码的序列:GGAGGTGGGCAGGAXG    (2)AGAGGTGGGCAGGTGG    (3)GCAGGYGGGCAGGAGG    (4)T(C)mGGAGGAXGG(G)pC    (5A)T(C)mGGAGGA(A)qGGGC    (5B)其中:X是A或G,Y是C或T,m是0、1或2,P是0或1,q是0或1,n是至少3;

J和K一起代表重复单位中0至15个另外的核苷酸;且H或L各代表0或至少1个邻接重复单位的其它核苷酸,且条件是:(ⅰ)在每个重复单位中,“core”和J及K(J.core    K),并不一定有同样的序列或长度;

(ⅱ)“core”也能代表一个有变异的核心序列;

(ⅲ)在所有n个重复单位中,总的实际核心序列与上述的式(2)至(5)所定义的总的“真正的”核心序列(有同样    数目n的重复单位)至少有70%同源性;

以及与上述序列互补的多核苷酸。

第二定义:具有通式H.(J.core.K.)n.L    (1)

的多核苷酸,其中:“core”代表有6至16个连续核苷酸的序列,同样以5′→3′方向续码,选自(1)用含有每个重复单位约33个核苷酸(nt)的肌红蛋白串联重复序列的探针DNA探查人或动物基因组DNA所得到的第一个人或动物微小随体的5′→3′共同核心区域;(2)用包含第一个微小随体之共同核心区的串联的探针DNA,探查人类或动物DNA所得到的第二个人类或动物微小随体的5′→3′共同核心区,以及(3)用包含第二个微小随体的共同核心区的,含有串联重复序列的探针DNA,探查人类或动物基因组DNA所得到的第三个人类或动物微小随体的5′→3′共同核心区,(上述每个串联重复序列都至少是3个单位的重复);

以及互补于上述序列的多核苷酸。

第三定义:有通式H.(J.core.K.)n.L    (1)的多核苷酸,其中:“core”代表有至少6个连续核苷酸的任何序列,得自人类或动物基因组DNA的微小随体的共同核心区内,其显示至少70%,最好80%的保守程度;

在各重复单位,“core”并不一定有同样的序列,而所有其它符号的意义如上所述;

以及互补于上述序列的多核苷酸。

第四定义:有至少3个6至36个核苷酸序列重复的多核苷酸,该序列包括链索的(5′→3′)核心序列,选自:(5′)GPGGGCWGGWXG(3′)    (6)其中:P不等于G;W=A或T,X=A或G;

或其变异体,条件是在所述重复中总的实际核心序列,就有同样数目重复片段的结构(6)来说,与总的“真正”核心序列至少有70%的同源性;

以及与上述序列互补的多核苷酸。

所有上述结构式和整个序列中,均按常用的5′→3′方向表示。

本发明包括DNA、RNA以及任何其它可与DNA杂交的多核苷酸。上面所限定的多核苷酸是未被标记的,且可以双股(ds)或单股(ss)形式存在。

本发明包括ss形式的标记的多核苷酸,作为探针以及它们的标记的ds前体,由此可得到ss探针。

其最好是用任何惯用方法,以32P放射标记的,但也可用杂交技术中已知的其它方法进行放射标记,按照1981年3月15-20日在Keystone,Colorade召开的使用纯化基因的发育生物学1981 ICN-UCLA讨论会的论文集(Vol.XXⅢ1981,PP 647-658,Aoademie Press,Editor Donald D.Brown et al)中,由D.C.Ward等人所述的方法,用生物素或相似的标记物标记,或者可依照A.D.B.Maloolm等人〔Abstraets of the 604 the Biochemical Society Meeting,Cambridge,England (meeting of l July,1983)〕的方法,用酶标记。

由此,根据本发明的另一个方面,这里提供一种用于对含有人或动物DNA的样品进行遗传起源测定的多核苷酸探针,其包括一个标记的或标志成分,一个含有至少3个串联重复序列(包括变异体的)的多核苷酸,其与人类或动物基因组最小随体区的同源程度达到能使探针与使用限制性内切酶切断的相应DNA片段相杂交。

其特征在于:a)重复序列各含有一个核心,其与来自不同基因组区的大多数微小随体所具有的相似长度完全一致的核心区域,有至少70%是同源的;

b)核心长度为6至16个核苷酸;

c)重复单位内,非核心的核苷酸总数不超过15。

本发明还包括一种 定人类或动物基因组DNA样品的方法,包括用本发明的探针探查DNA,并确定DNA的己杂交片段。

本发明的这个方面包括:用限制性内切酶切断细胞材料的总DNA,用上述探针对高可变的DNA片段进行杂交,该探针除含有标记或标志成分外,还含有一个重复的核心部分,以及检测结合于不同长度之DNA片段上的,或者更常用地是结合于不同分子大小之带上的标记或标志物的浓度。

普通作法是根据链长度筛选或分离切断的DNA,即在杂交前用电泳方法完成,查出标志物的浓度,以得到一个特征化的图谱,其个别的谱带是特异性遗传起源的。

定义下列定义用于本发明。而上述的说明可能亦有帮助。

高可变区:

人类或动物DNA在一个被识别位点或部位上的区域,如果就其长度或序列来说,是有许多不同形式的,则称为高可变的。

限制性片段长度多态性(RFLP):是人或动物DNA片段在电泳分离和经探针检测后,其图谱上所表现的遗传变异。

微小随体:是由短DNA序列的串联重复片段组成的人或动物DNA的一个区域。所有的重复单位可不必完全一致。(本发明的探针包含多态的微小随体)。

多态(性)的:一个DNA的基因或其它片段,在个体之间表现变异性,即称为是多态(性)的。

核心(序列):原来是用于完全相符的(保守的)核心序列的意思,现已扩展为由其衍生的任何重复的或变异的序列。

保守核心(序列):在不同原点或部位的两个或多个微小随体的重复单位之间的,能被 定为实质上的或完全匹配的序列。

重复(序列):一个给定的核心序列或含有该核心序列的完全地或不完全地重复的序列。

限定核心(序列):在其自身长度内,与式(2)至(8)中的一个序列呈现完全一致性的(保守的)序列。

变异的(核心序列):

一个与限定的核心序列不同到一个较小程度(>50%同源性)的实际的核心序列。

完善的重复(序列):一个给定之核心序列或含该核心序列之片段的精确地串联重复的序列。

不完善的重复(序列):一个序列,其中至少一个单位在碱基置换中和/或长度上不同于至少一个其它单位。(在一个探针序列中普通地至少有三个串联重复,其中一般至少会有一个限定的核心序列,并且至少有一个变异体)。

%同源性:在比较有同样长度的两个序列时,序列的碱基对(bp)数目减去其中被置换的数目后,占序列bp数目的百分数。

核苷酸(nt)和碱基对(bp)在使用上是同义的。两者均可指DNA或RNA。缩写字头C、A、G、T,习惯上用于代表(脱氧)胞嘧啶核苷、(脱氧)腺嘌呤核苷、(脱氧) 嘌呤核苷,以及脱氧胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶核苷。

串联重复序列(人工合成的或天然分离的)可以是完善的重复,但最好是不完善的重复。较好地是至少两个重复序列是保守核心序列的不完善的重复。在探针序列中,至少有三个重复较好,更好是至少有七个重复。

探针的产生可包括用克隆化方法分离天然的微小随体,并用DNA序列分析法 定之。也可包括切出所需要的核心并继之将其转化为首尾相接的重复序列,或者引起与不同起源的核心片段的不相等交换。还可包括多核苷酸的克隆化。

另一方面,构建步骤可包括已

定的保守的核心序列或其片段。保守的核心序列最好不少于6bp,且最好含有16个以上的bp。之后构建合成之核心的串联重复序列。

自然,多核苷酸可以是一系列不同次数的成功或部分成功的中间体克隆操作的产物,可包括天然或合成起源的片段,从而最终的多核苷酸可携带很少类似于亲代微小随体的序列。

本发明的探针用于以下领域:1、人类的父系或母系检验。

2、在移居争议及继承争议等中的家系团体变异。

3、孪生子的杂合性试验。

4、对人类近亲成婚的检验。

5、人类的一般谱系分析。

6、对人类遗传疾病的座位的

定,从而能够构建特异的探针,以检定遗传缺陷。

7、法医学(a)对得自强奸受害者身上的精液样品的指纹法分析;

(b)对得自被沾染的衣服的血液、头发和精液的指纹法分析;

(c)人类尸体的

定。

8、细胞嵌合性研究。如骨髓移植后继之产生的供体抗受体细胞。

9、家畜养殖和谱系分析/认证。(这可能包括例行控制和纯种动物的核查,以及赛马及狗的繁育等诉讼案例中进行谱系核实)。还提供遗传标志,其可显示与有经济意义的遗传特征有关。

10、对培养的动物细胞系进行常规质量控制,检查纯细胞系的污染和进行常规

定工作。

11、进行肿瘤细胞和肿瘤之分子异常的分析。

12、预测由植物得到的多核苷酸或探针在植物培养中所具有的潜在应用价值。

对附图的简要说明:图1是图解表示制备肌红蛋白基因的33bp重复序列的过程,包括将其插入质粒中并使之克隆化。

图2是与各种DNA探针杂交的基因组DNA片段的放射自显影照片影印件,也显示相关个体的谱系,这些个体的DNA是以两个放射自显影图谱

定的。

图3显示用本发明的三个不同探针探查的3个非亲属个体之DNA样品的放射自显影图谱。

图4显示用本发明之探针探查的9个个体之DNA样品的放射自显影图谱,9个个体中有的有亲缘关系,并且,其中有两个是同卵双生的。

图5显示用本发明之探针探查的2份人的和17份动物的DNA试样的放射自显影图谱。

图6显示一系列依据本发明之方法探查的,卷入移居争议的Chanaian家系成员之DNA试样的放射自显影图谱。

图7显示受种经纤维瘤影响的具血缘关系个体的DNA试样的放射自显影图谱。

图8显示Gujerati谱系之DNA的放射自显影图谱,用以检查微小随体片段的可能的共遗传和胎儿血红蛋白(HPFH)的遗传稳定性。

图9a和9b是一个大谱系中HPFH的遗传和各种微小随体遗传的遗传学图解。

图10为图解说明人造微小随体的克隆和制备。

图11显示一系列用本发明之探针探查的两个非血缘关系胎盘的DNA样品的放射自显影图谱。

图12显示一大家系中一系列具血缘关系个体的DNA试样的放射自显影图谱。

图13显示用两种不同探针检测双生个体得到的各种DNA条带的放射自显影。

图14为用双股和单股探针得到的放射自显影图谱。

图15和图15A是得自法医试样的DNA指纹图的放射自显影图谱。

图16显示得自一个狗家系的DNA指纹图的放射自显影图谱。

图17显示得自一个短毛家猫家系的DNA指纹图的放射自显影图谱。

图18显示用两个不同探针得到的各种羊的DNA指纹图的放射自显影。

图19显示三个不同的猪的DNA试样的指纹图的放射自显影。

图20显示一个乳牛家系和非该系的牛的DNA指纹图的放射自显影。

图21相似于图20,为使用一种不同探针的放射自显影图谱。

通过与肌红蛋白33bp重复探针“PAV33.7”杂交,筛选在噬菌体λL47。1中克隆的人类的DNA之10-20kb Sau3A部分的人类基因组文库。在3×10’个重组体文库中,至少

别出40个强弱不等的杂交噬斑。随意选择8个阳性噬斑进行纯化(λ33.1-15),并使用噬菌体DNA的Southern法印迹分析表明,各重组体中的杂交DNA定位在重组体的一个独特的短(0.2-2kb)区内。序列分析表明,8个重组体均各含有一个3-39串联拷贝的重复序列组成的微小随体,其长度范围从λ33.15的16bp,到λ33.4的64bp。大多数微小随体含有整数的重复。在λ33.6,37bp重复本身是由基本的12bp单位的衍生的三聚体构成的。正如由每个微小随体两侧的克隆特异性DNA序列所判定的,每个λ33重组体代表人类基因组的一个不同的区域。

8个克隆化的微小随体区定位在0.5-2.2kb    Hinfl    IDNA片段之内,比多态的2-6kb    DNA片段小,后者可由PAV33.7在HinfI降解的人DNA中测得。为了确定是否任何克隆化的微小随体区也是多态的,可由每个微小随体的适当的M13亚克隆制备32P标记的单股DNA探针,并在高特异条件下与14个无血缘关系的高加索血缘英国人DNA    HinfI降解物杂交。典型的杂交图谱显示,在这些杂交条件下,每个探针决定一个人类基因组的独特区域,且其中的三个是高多态性的。

上述制备程序的细节将在实施例中给出。

现参照上面所给出的多核苷酸的定义,将其确定为通式H.(J.C.K.)n.L    (8)

其中C代表核心序列,其它符号的定义如前。在所有这些定义中,一个单位的核心序列与下一个可以是相同的或不相同的。例如,与作为整体应用于重复单位的完全符合序列相比,其可含有一个或两个额外的核苷酸,缺少一个或两个核苷酸,或者有1至4个核苷酸有差异。

可以用各种方式限定核心。参照能使核心序列被

定的方法,可得到一般定义。基因组DNA的微小随体与序列GCAGGTGGGCAGGAXG    (2)差不多。将取自表现出与某一个X核苷酸有最大同源性的最小随体的X核苷酸长序列作为核心序列,后者则是选自所有可能的含有式(2)的X核苷酸长序列的。当然,这就表明,核心的定义是很窄的,并应得到1个或几个具6核苷酸长度的核心,1个或几个具7核苷酸长度以至达到16核苷酸长度的核心,(这里说“几个”是因为在有些情况下,会有1个以上的最大的,即有100%同源性的序列)。为了反映如此限定的核心序列中的变异被发现的可能性,即假定所有n个重复单位与上面所定义的核心相比,平均至少有70%同源性。任何邻侧序列,即J和K,在重复单位中都不计入同源性,只作核心间的单独的比较。所限定的核心可有不同的长度,并可能是“混合的”,即有些重复单位与所说的式(2)的GGGCAGGAXG是同源的,而别的则与所说的式(3)的GGGCAGGTGG是同源的。因此,变异体应从与(core)n同源,而不一定与“core”本身同源的意义上来考虑。

前面所限定的“第一”定义是由上述考虑得的,但在式(2)至式(5)的情况下,如将核心限定为由6至最大12-16bp的任何长度的序列,则可以简化。对于变异体亦有相似规定。

“第二”定义是从连续杂交步骤之角度来限定核心,其中每一步骤都能产生额外的微小随体片段。可以很容易地看出,对人基因组DNA的完全文库进行足够数目的杂交,检定足够数目的杂交片段,由其制备的探针用来再次探查基因组,如此下去,理论上可进行无数次、应能在微小随体DNA中广泛表现的保守核心序列的范围上达到。实际上,不可能期望使这些操作极大规模地进行许多次,以得到足够广泛的保守核心区,因而在该定义中,只包括三次探查操作。

在“第三”定义中,W代表核心并顾及了一广泛分割的保守核心区的可能性,其中变异不超过25%(即16个核苷酸中有4个变异)。按此定义,具有约16核苷酸的核心区,可能的变异达25%,则核心W即被核定为在该区域内至少有6个连续式核苷酸的序列。

“第四”定义中包括再次限定由研究合成的多核苷酸所得到的保守核心序列通式(6)。

这些研究导致进一步限定较短的核心序列。

较完善的是这样的连续(5′→3′)序列:PGGGCWG    (7)保留在所有的重复单位中,P和W具有在上述第四定义中所给定的意义。P最好是T,W最好是A。

另外,连续(5′→3′)序列TGGGCA    (8)

被保留在所有重复序列中为较好。

根据本发明的另一个方面,本发明提供了包括连续的5′→3′核心序列GGPGGGCWGGWXG    (9)或其变异体的至少3个重复序列的多核苷酸(式中P不等于G,W=A或T,X=A或G),条件是在所有重复中,总的实际核心序列与有同样重复数目的序列(7)所限定的总的“真正”核心序列,至少有70%同源性。

以及互补于上述序列的多核苷酸。

在上述所有定义中,核心至少为6个核苷酸长,较好是至少有7或8个核苷酸,最好是12个或更长些,如14或16个核苷酸。式(2)的序列GGGCAGGAXG(该末端10个核苷酸在3′端)是一个高度保守的序列,并且看来是特别有应用前途的。该序列较好是至少包含6个核苷酸,最好是包含所有的10个核苷酸。

变异体核心较好地是至少有75%同源性,更好是至少有80%或85%的同源性。

各重复单位内的两侧序列J和K最好在每侧删去或保留短的即0、1或2个核苷酸,并且J和K合在一起不应超过20,最好是15个核苷酸。在一个重复单位内的J+core+K的核苷酸总数不超过36,较好地是不超过31,最好不超过25。

重复单位n的数目至少为10,通常是10-40,但原则上n可以是任何数目,至少可达到10,000。

两侧序列H和L是无关紧要的,可以删去或可以任何核苷酸数目存在,如可达20,000个核苷酸,但用这样一个长探针工作,一般不会是很敏感的。即使当重复序列是SS-DNA时,它们亦可含有ds-DNA。

可使用任何已知的探查技术进行

定,其中最常用的是,采用不切断串联重复序列的限制性内切酶(一种或多种)切断试样DNA,或者只切断到并不影响其被探查的程度。

下述实施例将进一步阐明本发明。所有温度均为℃表示。

实施例1(1)含有人肌红蛋白基因的长的串联重复序列的探针的构建这个探针的构建包括在图1中,用图解形式已作了说明。图中构建过程分为5个步骤,分别表示为(a)至(e)。P.Weller等人首次对肌红蛋白基因(a)进行了描述(EMBO,J.3,439-446,1984)。文章中讲到,此基因在它的第一个内含子上有一个区域,其内含子由以几乎完全相同的9个核苷酸序列(在图1中用r表示)为两侧的33个核苷酸序列的四次重复序列组成。上述的这个区域以169    bp    HinfⅠ片段(b)形式分离得到,然后进行末端修复,再克隆到Pue    13质粒上进行扩增(见J.Vieira等人,Gene    19,259-269,1982)。用限制性内切酶Ava    Ⅱ(A)对第三个或第四个重复进行切割分离,得到单体。(在第一和第二个重复中,单个核苷酸的取代消除了这个酶切位点,进而产生了一个新的DdeⅠ(D)位点)。将33个核苷酸的单体通过不相同的AvaⅡ粘性末端连接,产生首尾相连的多聚体(d),其重复单位的数目(n)是未知的。通过琼脂糖凝胶电泳(制备电泳),分离到至少含有10个重复的多聚体,再进行末端修复,连接到Puc 13的Sma Ⅰ切点,在大肠杆菌JM83中进行克隆(参见J.Vieira等人,文献同上述)。所得到的质粒定名为PAV 33.7(e)。其中的多聚体DNA插入结构通过下述方法加以证实:用BamHⅠ和Eoo RⅠ在多点接头处把插入片段切除,再用α-32P-dCTP在Bam HⅠ位点填入进行标记,用Ava Ⅱ部分酶切。在2%的琼脂糖凝胶上电泳,可以分辨出被标记的部分酶解产物。结果发现PAV33.7中的767bp BamHⅠ-Eoo RⅠ片段上含有33bp单体的23个重复的序列(见图中(e))。

(2)用肌红蛋白的33bp重复序列作探针,筛选得到的人类基因组中微小随体区域的序列分析克隆噬菌体λL47.1中的10-20Kb人DNA片段的基因库(参见P.Weller等人,文献同上;W.A.M.Loenen等人,Gene 20,249-259,1980),并用体外32P标记的方法(P.Weller等人,文献同上),标记已与上述步骤(1)中所述的767bp PAV 33.7插入片段杂交而筛选的噬斑。纯化筛选得到的8个阳性噬斑,产生的重组体分别命名为λ33.1-15。每个这样的噬菌体DNA用单一的酶HinfⅠ或HaeⅢ进行酶切,通过1.5%琼脂糖凝胶电泳,用PAV33.7 DNA进行Sauthern法印迹杂交,检测33bp重复相关序列。每一个重组体均可检测出单个的“λ33-阳性”HinfⅠ和HaeⅢ片段,但λ33.4和11则例外,它们没有可检出的阳性HaeⅢ片段(因为这些重组体中HaeⅢ位点存在于重复区域中)。用凝胶制备电泳分离λ-33阳性的Hinf    Ⅰ和Hae    Ⅲ片段,如必要时再作末端修复,平头连接到双链DNA    M13mp8的Sma    Ⅰ位点上(J.Messing等人,Gene    19,269-276,1982)。通过转化到大肠杆菌JM    101中分离出正的单链M13重组体,再用双脱氧核苷酸末端终止法测定序列。所有λ33阳性的片段都含有一个串联的重复区域。在某些情况下,这些区域能够直接进行序列分析。在另外一些情况下,重复区域离开作序列分析的引物位点太远,需要用限制性内切酶酶切缩短M13上的插入片段后再进行序列分析。

λ33阳性的片段结构用下面8个图的形式表示,并分别定名为λ33.1,33.3,33.4,33.5,33.6,33.10,33.11和33.15。实际上所用的限制性内切酶和片段的核苷酸长度是:λ33.1:Hae    Ⅳ,2000;33.3:Hinf    Ⅰ,456;33.4:Hinf    Ⅰ,2000;33.5:Hinf    Ⅰ,1600;33.6:Hae    Ⅳ,720;33.10:Hae    Ⅲ,700;33.11:Hinf    Ⅰ,1020;λ33.15:Hinf    Ⅰ,1220。每个图在它的方框的上方用大写字母显示了碱基的重复顺序。“重复”在碱基的数目上并不是固定不变的,碱基的取代会使有些重复不一样。因而,在方框的    上部所显示重复序列是一个保守序列(con),它与已知的大部分序列是一致的。方框内表示了重复顺序和保守序列的不同之外。方框中空白部分意味着两者是一致的。方框中碱基符号A、C、G、T表示在保守序列中它上面所显示的碱基被那个碱基所取代。X为A或G,Y为C或T,一为与保守序列比较后所缺失的核苷酸。>>><<<(人字形)符号表示它的序列还没有作出,虽然从序列胶的放射自显影中可以很清楚地看出,这样的序列是保守顺序的“重复”(当然用“重复”这个术语,按上述的同样近似方式使用的)。片段λ33.3、33.10、33.11、和33.15的全部序列已被测出,其它的还只是部分测出。在方框的左边“con”底下所列的数目,是这些序列的重复序数。这一排底部的数目是重复的次数。由此,λ33.1就含有62个核苷酸(nt)序列(如方框上方大写字母所述)的26次重复。每一个图的顶部和底部所示的序列是分别相应于重复区域的5′和3′端的两侧序列,它们是不重复的。换句话说,这个结构类似于随机的共聚体的结构,由两侧的序列代表,其中出现其多聚体区域单位,则由串联重复序列代表。

(3)由每一个λ33阳性片段的重复序列所共有的并位于其内部的一个共同的短“核心”序列的发现和 定每一个区域的重复序列与PAV33.7中肌红蛋白33bp的重复序列比较,再用点基质分析法与它的反向互补序列进行比较。很明显,在肌红蛋白33bp重复序列和λ33阳性片段的保守重复序列之间有一个序列很相似的单一的很小的明确区域。所有8个λ33片段的重复序列中都具有同样的这个区域。这一区域即称为“共同核心”。下列图表即是对此所进行的比较。

共同核心区域长度为16个核苷酸,在方框上部以大写字母示出。

λ33.5gagctaatgtttcgggggctgcactgggtcatgtgagtaatcatgagggccon    YGGGCAGG-AGGGGGAGG

ccagtatcctgggaattcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaa

λ33.15ggtggttttoaagaaagctttoatgcaatttgctttaaatgttaggaaacon    GAGGTGGGCAGGTGGA

aatacctacagatgaggtgtgtgcttattctctgtgoaagatttcagagt

图表中显示了上述步骤Ⅱ中所确定的每个保守序列的全序列。这些是从人基因组DNA中分离到的肌红蛋白33bp探针和λ33-阳性片段内串联重复的部分。图表中再次显示的X是A或G,Y是C或T,一为缺少一个核苷酸。可以看出这16个核苷酸的大部分是一致的,其中几个是完全一致的(100%);第9个“X”符合A或G的变动范围。这9个核苷酸在其底部划了一条线,以显示为共同核心区域的那些核苷酸。共同核心区域的两侧是以小写字母表示的串联重复序列之残基。每一个保守的重复序列的起点和终点由符号 ,重复序列中的核苷酸数目是不完整的,因而用不同的符号

来表示这些分开的重复序列的起点和终点。也可以想象到,只有通过复杂的分析方法才可能定出共同的核心区域,因为它们经常不是以完整的形式存在于λ33一阳性片段的一个单一的保守序列内。而是可能横跨肌红蛋白基因33bp重复的两个连续序列。

为了说明本发明中所表示的多聚核苷酸的成分,下表列出了有关的各种决定因子。

(4)用独立的λ33一阳性片段为探针进行杂交,可检定多态性的人类基因组DNA片段参见图Ⅱ,由白细胞中制备DNA,所用白细胞是取自高加索血统的英国人(1-6)的随机样品以及一个大的亚洲后裔英国人家系之某些成员(7-18)。为了方便起见,家系 中用 方块 代表 男性,用园圈代表女性,用线条表示他们之间的姻缘关系,配偶之间的双线表示第一个第一代堂(表)兄弟姊妹之间的两个有血缘关系之成员的婚姻。用Hinf Ⅰ降解10μg DNA样品,经过20cm长的琼脂糖凝胶电泳,原位变性,印迹转移到硝酸纤维滤膜(Sartorius产品)上。从含有微小随体(串联重复)区域的M13重组体制备单链32P标记的杂交探针。下文将述及所用的精确之探针。试验程序如下:将大约0.4μg M13单链DNA与4ng17-mer序列分析引物进行复性(M.L.Duckworth等人,Nucleic Acids Res.9,1691-1706,1981)。反应于60℃下,在10μl 10mM Mg Cl2,10mM Tris-Hel(pH8.0)中进行30分钟。再加16μl 80μMd ATP,80μMd GTP,80μM dTTP,10mM Tris-HCl(pH8.0),0.1mMEDTA加3μl(30μCi)α-32P-dCTP(3000Ci mmole1)和1μl(5单位/μl)Klenow片段(Boehringer产品),于37℃保温15分钟以延长引物。加25μl 0.5mMd CTP,再于37℃保温15分钟,以追补完成延长引物的过程。(“追补”的意思是添加dNTP的混合物,以完成M13单链DNA模板的双链DNA环)。在插入片段或在远离插入片段的M13多点接头上的某个合适的限制性内切酶位点切断DNA,再加十分之一体积的15MNaOH,0.1MEDTA以使之变性,通过1.5%低熔点琼脂糖凝胶(Sea Plague产品)电泳回收从引物延长的32P标记的单股DNA片段。切割下来的条带(比活>104cpm/μg DNA)在加入1mg碱降解的人胎盘DNA载体(在0.3MNaOH,20mMEDTA中,于100℃剪接处理5分钟,之后用HCl中和)后,于100℃熔化,再直接加到杂交袋中。其中载体DNA的作用也是遏止其与共同重复的DNA序列进行任何次级杂交。

所用的精密探针是:(A)33.1,为含有微小的随体(为62个核苷酸顺序的26次重复,即等于1612个核苷酸)加上大约350个核苷酸的两侧翼人DNA的大约2000nt    Hae    Ⅲ亚克隆片段;(B)33.4,为含在一个2015nt    Hinf    Ⅰ片段内的微小随体之近邻引物侧上的659nt非微小随体EcoRⅠ片段;(C,D,E)33.15,为592nt的亚克隆片段,其含有λ33.15微小随体序列(16nt序列的29次重复,如上所显示的,平均有二个核苷酸与共同核心区域不同)和128nt的边缘的人DNA。

按照A.J.Jeffreys等人(Cell    21,555-564,1980)的方法进行杂交,所不同的只是用6%(W/V)PEGC(聚乙二醇)6000代替硫酸葡聚糖,以减少背景标记。滤膜A和B在0.5×SSC中于65℃杂交过夜,再于65℃,在0.2×SSC中洗涤。滤膜C-E在1×SSC中于65℃杂交,并洗涤。使用一种快速有效的增感屏,在-80℃F使滤膜自显影1-3天。

图Ⅱ还显示重复的核心探针33.15,确定了在用Hinf    Ⅰ降解后的人DNA中杂交片段的一个极为复杂的分布图。从中只能很好地分辨出最大(4-20Knt)的HinfⅠ片段,从杂交结果产生单个探针专一的DNA“指印”这一点来说,这些片段是具有极端多态性的。

家系分析肯定了这种极端多态性的变异。其变异大到使所有个体、即使在第一代堂(表)兄弟(姊妹)间结婚后的单个血缘亲属内也能得以区分(图Ⅱ中16-18)。图Ⅱ中(D,E)的家系显示大部分HinfⅠ大片段均能由每个亲代传给某些后代。因而可认为这些片段中的大部分是以杂合状态存在的,这些大的高可变片段的杂合性可能接近100%。相反地,子代中的所有这些片段都能够在这个或那个亲代中追索到(只有一个例外),因而提供了一系列可稳定遗传的遗传标记。没有一条带是专一地由父亲传给儿子或由父亲传给女儿的(见图Ⅱ中滤膜D)。这还要分别排除Y和X连接,并且意味着这些微小随体片段从起源上看主要是来自常染色体的。现在还不知道这些DNA片段在常染色体系统中的来源,它们并不是从一个常染色体的简单的特定区域来的。代之的是能够鉴定出在子代中分立的一些亲代片段对(见图Ⅱ中滤膜D),更确切地说,即如果至少有一个AB或-后代,则在一个亲代(且不存在可另一个亲代)中的一对AB带不能是等位的:A-或B-重组体子代的存在,进一步确证了A和B之间缺乏紧密链锁。仔细检查一下图ⅡD中    所示的家系之原始自显影胶片,按这些标准看,其中至少有10条可分辨的带是在母亲中,而其中的8条带是母系非等位基因的,并且是非紧密链锁的。而另外的两条带则可能是与8条非链锁片段之一等位的。在分析的有限数目的后代中,只观察到了A-和B-后代,虽然这样一个小的样本数不足以证明这些成对的片段是某个位点的等位基因。结论是:核心探针至少能同时在几个间隔很远的非链锁的高可变位点上给出非常有用的信息。这个结论将在实施例8中作更详细地检验。

相反地,另外两个探针(图Ⅱ,滤膜A和B)与本发明是不一致的,只给出一条或二条带,很显然不能同时检测出许多不同的多态性区域,因而也就不具有一般的诊断价值。

实施例2使用探针中附加的、改变后的变异体(核心)来探测人DNA中新的超可变区按实施例1第四步骤的相似方法制备由克隆的λ33阳性片段衍生的另外两个探针,即λ33.5和λ33.6。33.5探针是由在M13mp8和克隆的308nt    DNA片段组成的,并包含如前所述之保守序列的14次重复,亦即为共同核心序列的17nt长变异体,连同70nt的两侧翼人DNA。33.6探针则包括37nt的18个重复序列,而后者本身又是由共同核心序列被缩短了大约12nt的3次重复加上在其5′末端的一个附加的TC所组成的。18×37nt重复部分由95nt人DNA加在两侧。37nt序列的结构可表示为:TGG    AGG    AGG    GGCTGG    AGG    A-G    GGC(或TGG    AGG    AGG    G-C)TCCGG    AGG    AGG    GGC该探针同样被克隆在M13mp8上。

下面描述该探针的11个核苷酸的保守序列AGGGCTGGAGG。

两个探针均按照实施例1中第四步骤的方法进行32P标记,对一组14个不相关的高加索人的DNA作杂交。两个探针均检测到了一系列复杂的杂交片段,其中有许多显现出极端的多态性变化。其中有几个片段是以前用33.15所未能检测到的,而在这里用33.5检测到的。而用33.6探针则检测到了一系列几乎完全新的微小随体。这些微小随体的正确遗传已经被谱系分析所证实(见实施例8)。

下述实施例将进一步阐明并例证本发明。

用识别核苷酸之4个碱基对的限制性内切酶可较好地完成样品DNA的降解。业已发现,最长的高可变片段的DNA指纹型与所用的识别4bp的限制性内切酶无关。这便有力地说明了这些大片段并不是由较长的微小随体来的,但提示每个大片段都含有一个完整的长的同源微小随体,其中没有限制性内切酶酶切位点,而两侧接有含正常高密度4bp裂解位点的人DNA序列。这与前面几个实施例中所得出的结果是一致的,而且实施例8中表明,大部分这些大的微小随体片段是非链锁的,在谱系中是独立分离的。

一个特别体现本发明的实例是在分别产生两个不同的指纹图谱的杂交中,使用两个不同的探针,使DNA的样品呈现为“双指纹的”,例如可使用得自λ33.15和33.6的探针。借助这一方法,可进一步降低本来已很低的两个不相关个体间出现同样指纹图的可能性。例如,实施例4表明,忽略掉其长度短于4bp的不能完全分辨的杂交DNA片段,这种可能性可低至10-9。

本发明还包括一个父系检验方法。子代中的多态性微小随体约一半是来自父亲的,而这些父系片段则可通过比较父亲和子代的DNA指纹图来

定。所有这些父系片段通常存在于父亲的DNA中。可以作以下估计:如使用探针33.15和长度至少为4Kb的DNA片段,假如父亲的凑巧具有所有6个在子代中典型鉴定的父系专一性DNA片段,则这一可能性(几率)为10-5数量级,而使用两个探针,即33.6和33.15,则这种可能性降低为10-8数量级。当然,精确的几率将取决于精细的分辨率和所得出的DNA型式的复杂性。如果再对另外的小于4Kb的父系片段进行分析或者使用第三个探针,这一几率会得到进一步改善。

可从一洲人血中迅速地分离出足够作DNA指纹分析的DNA(0.5-5μg)。从而,可以从随机的一个个体小组中产生DNA指纹图型,该小组包括两个其DNA已作过指纹分析的人,加上两个姐妹。两个前已定性的个体必须能很容易且很清楚地根据其DNA指纹图比较

定出来,正如两个共同占有一样多的微小随体片段的姐妹一样。

可由一个特定个体的不同的细胞中提取DNA,而得到同样的指纹图型。因而精子和血液的DNA指纹图是不可区分的,这正如得自同合子双胞胎的指纹图。再者,这种指纹型可被稳定地保留在培养的细胞中,这可通过比较血液的DNA指纹型和同一个体来的类原淋巴细胞株转化的Epstein-Barr病者DNA的指纹型而得到证明。

本发明可应用于动物,其中包括大多数哺乳动物,鸟类、两栖类以及鱼类。例如鸡、仓鼠、兔、小鼠、麻雀、茶隼、蛙、蝾螈和鱼。就鸡来说,可产生一个很复杂的、连成一片的DNA杂交片段部分。用Hae    Ⅲ降解即可消除这个成片的杂交现象,而得到一个“清晰”的指纹图。可见,鸡DNA中很可能也含有一个长的含有核心序列的随体,其重复单位中含有一个或多个HaeⅢ酶切位点。因而也可用HaeⅢ切断之,使之缩小成一些非常小的DNA片段,以致在DNA电泳时可以迁移到凝胶底部以外。在其它的一些动物中,有时也可能出现这种连成片的条带,如用一些能切断较长片段的适当的酶来降解DNA,也能够分辨出这些条带。

以下列举的另一个实施例中,所用温度也以℃表示。

实施例3按照A.J.Jeffreys所述的方法(Cell 18,1-101979)由新鲜的人胎盘组织中分离DNA。这里所用的3个个体的胎盘标号为1-3。将8μg DNA样品用Hinf Ⅰ和/或Sau3A酶进行酶切,在反应体系中加入4mM三氯亚精胺可使酶切更为彻底;之后用苯酚抽提,乙醇沉淀并回收,在20cm长的0.6%琼脂糖凝胶中电泳24小时(电压为30Ⅴ),直到小于1.5Kb的DNA片段全部泳出凝胶为止。之后通过吸印法将DNA转移到Sartorius硝酸纤维素滤膜上。按实施例1之步骤4中所述的方法制备高比活(109cpm32P/μg DNA)单股M13DNA探针。所用的精确探针是:(a)包含220nt HaeⅢ DNA片段的33.5探针。该片段是由33.5微小随体(即17nt×14次重复)的绝大部分加上大约60nt的两侧翼人DNA所组成。该探针亚克隆在M13mp8的Sma Ⅰ位点上;(b)亚克隆于M13mp8的SmaⅠ位点的33.6探针。这一探针由一个720nt的HaeⅢ片段组成。该HaeⅢ片段包括微小随体加上邻近的50nt的人DNA;(c)与实施例1之第4步骤中所述相同的33.15探针,为一个592nt的PstⅠ-AhaⅣ片段,其包含微小随体加上128nt的两侧人DNA,亚克隆到经PstⅠ和SmaⅠ双酶切的M13mp19DNA中。有关Southern印迹杂交和滤膜于65℃在1×SSC中进行洗涤的方法,已在实施例1之步骤4中述及。滤膜在室温条件下放射自显影4天,不必使用增感屏。

每个探针产生一种不同的片段图形(模式),图形的复杂变化并不依赖于用识别四核苷酸的限制性核酸内切酶。图3显示所得到的图形。可以采用HinfⅠ加Sau    3A进行双酶切的方法来分辨小于4000bp长的多态性片段,这种本底杂交的消除大概是由于相对分叉和恒定不变的HinfⅠ微小随体片段在一个或多个重复单位中积聚了Sau3A酶切点。在双酶解中,探针33.15测出的每一样品中可分辨的多态性片段数,可由大约15增加到大约23,代价是要损失大约20%的长的单酶切微小随体片段,而推测在大部分或全部重复单位中都带有Sau3A酶切点。

实施例4由20个不相关联的高加索后裔英国人中随机抽样,取其血细胞DNA样品8微克,用HinfⅠ酶切,之后用微小随体探针33.6或33.5按实施例3中所述的方法作Southern印迹杂交。每一DNA印迹(个体A)与相邻凝胶泳道中的图形(个体B)相比较。记录那些在A中存在而在B中显然不存在的条带数目,加上那些在B中有着大致相似放射自显影强度的共迁对应条带的数目。下表中给出所有各对比较结果的平均数。有一小部分(约6%)在A中有微弱杂交的附加片段,在B中亦有强杂交的片段与之相对应。在这种情况下,由于不能确定这些条带是否在A和B中均存在,因此将这些片段忽略不计。如果A和B中共迁移区带总是表现为同一随体位点上的相同等位基因,那么一个等位基因在A中存在同时也在B中存在的平均几率×即与平均的等位基因频率(纯合性) q×X=2q-q2(q=1-(1-X)1/2)有关。但是实际上,A和B中的共迁移条带的(未知)比例会受到来自微小随体之那一位点的偶然性控制,因而对平均等位基因频率和纯合性的估计是最大值的,并且取决于微小随体片段的电泳分离情况。

表2中所显示的几率与所示DNA的不同片段之长度相关联。欲得到对应于指纹图中最清楚部分的总的几率,即所有大于4Kb的DNA的总几率,则必须将3个图结合起来分析。例如,用探针33.15在个体A同时也在个体B中所检测到的所有片段的平均几率为0.082.9×0.205.1×0.276.7=3×10-11。而以探针33.15和33.6两者检测,在A也在B中存在的所有片段的几率为5×10-19。

实施例5本实施例说明DNA指纹的体细胞稳定性和它们在父系试验中的应用。

用EB病毒转化的类淋巴母细胞株于液氮中储存,两年后于液体培养条件下重新建株。用生理盐水将这些培养的淋巴细胞洗两次,按A.J.Jeffreys的方法(Cell    18,1-10,1979)制备淋巴细胞和白细胞的DNA。以相似方法制备精子DNA,不同的只是从精液中收集的精子在用SDS溶解之前先用1M2-巯基乙醇溶液于室温下处理5分钟。按实施例3中所述的方法制备DNA指纹图谱,以5μg    DNA样品经用HinfⅠ酶切后与探针33.6(a)或33.15(b)杂交。

实施例6本实施例具体阐明用于检测各种脊椎动物DNA中高多态性区域之新探针的使用方法。

分别由鸡、麻雀和茶隼的血中、兔和小鼠的肝脏,人的胎盘,以及青蛙和鱼的尸体中制取DNA样品。每份DNA样品各取8μg以HinfⅠ酶切,但鸡的DNA则用HaeⅣ酶切。将限制性内切酶的降解产物用0.6%琼脂糖凝胶电泳分离并作变性处理,之后转移到Sartorius硝酸纤维素滤膜上,按前述方法与人微小随体探针33.15杂交。杂交后于65℃在1×SSC溶液中清洗。图5中显示用下列样品所作杂交的结果:1,2:无关联的人类胎盘DNA。

3:兔DNA,为得自Alaska和Vienna白兔的第一杂交子代。

4:兔DNA,Alaska种。

5,6:小鼠DNA,取自两个希腊野生鼠。

7:小鼠DNA,来自近亲繁殖种DNA-2。

8:小鼠DNA,来自近亲繁殖种C57/BL10。

9,10:鸡DNA,用HaeⅣ消化。

11,12:麻雀DNA。

13,14,15:茶隼DNA。

16,17:蛙(Xenopus    tropicalis)DNA。

18,19:鳞鱼类DNA。

正如从图中可以看出的,几乎所有受试脊椎动物样品均得到了清晰可见的DNA指纹图谱,这一结果与人类DNA指纹图谱一样,虽然是多信息的。

虽然杂交强度较小,但用HinfⅠ酶切的鸡DNA也能产生一个很复杂的但条带不清的杂交结果(未显示出)。然而,当用HaeⅢ酶切时即可消除这种条带间的混杂现象,从而得到非常清楚的多态性指纹图形。

与野生鼠相比,两个纯系鼠的指纹图谱则较简单些,对此,是前已预计到的,因为在野生鼠中大多数高可变微小随体位点是杂合性的而在纯系小鼠中则是纯合性的,所以纯系鼠中杂交DNA片段的数目要减半。

下面的实施例将进一步阐明上述特殊探针的应用。

实施例7本实施例述及DNA指纹图分析技术在解决移民问题诉讼案中的应用,如用常规的遗传学方法来解决这方面的问题,虽有可能,但也是十分困难的。

案例涉及一个生于英国的加纳男孩,这个孩子后来移居加纳与父亲团聚,之后又单独返回英国与他的母亲,兄弟和两个姐姐在一起生活。然而,有证据表明他可能是一个冒名顶替的无亲缘关系的孩子,或者住在加纳的某一个姨妈的儿子。结果,当时不允许这个孩子在英国定居。在家庭律师的要求下,对其进行了指纹图谱分析,以确定该男孩的母亲是谁。由于既不可能对其父亲,也不可能对其母亲的姐妹作出指纹图分析,这就使问题变得很复杂。甚至当认定了母亲,即认定这个男孩是她的儿子时,她也无法确定孩子的父亲是谁。因此,只能对这一家庭中在英国的成员(即母亲M,兄弟B,两个姐姐S1和S2,以及这个有疑问的男孩X)进行血细胞DNA样品的指纹图分析。用前面介绍的33.6和33.15这两个微小随体探针作Southern印迹杂交,每一个探针可检测人DNA中的一系列不同的高可变微小随体。

将从母亲(M),有疑问男孩(X),他的兄弟(B),姐姐(S1,S2)和另一个无关个体(u)的血细胞中制备的DNA各取8μg,用HinfⅠ酶切,作0.7%琼脂糖凝胶电泳并与两种探针作Southern印迹杂交。图6中给出了所作放射自显影的结果。存在于母亲(M)的DNA指纹图中的片段用短平线表示;在M中不存在,但至少存在于一个确认的亲属中的父系片段用长线表示。用小点标示已遗传给X的那些母系和父系片段。X的DNA指纹图中不包含任何外加的酶切片段。记录下来自不同暴光时间的原始放射自显影胶片上的全部条带。对那些部分酶解的微弱杂交的条带,特别是那些走到凝胶底部而不能可靠记录下来的条带,则忽略不计。

第一步是从高可变片段的杂交图形中确定出X的父系。虽然无法检测男孩父亲的DNA,但至少可以通过对三个已确认亲属(B,S1S2)中某一个的检测,重现出母系(M)中所没有的父系特异的DNA片段的指纹图。发现39条父系条带中差不多有一半存在于X的DNA指纹图中。因为这些DNA条带在无关个体的DNA指纹图中(见图6,个体u)几乎均不出现,这便有力地证明了X和B、S1及S2有同一个父亲。除掉这些父系特异的条带之后,X还有40条指纹带,而这40条带均存在于M中,这就反过来证明了M是X的母亲。因此,X、B、S1和S2确为同胞兄弟姊妹。

前面已经谈到,对于北欧人来说,一个个体的DNA指纹的某一片段在另一个随机选择个体中出现的平均几率大约是0.2,那么,对这个父亲和M的相应估计应是0.26,这就确定了加纳人和北欧人之间在DNA指纹图的变异性上没有明显的差别。在下面的几率估算中,只是做最保守的推算,即所有条带均具有同一的几率0.26(有关定量分析如下)。

第一个问题是,是否X与这个家族有亲缘关系。X的DNA指纹图中包含了61条可记录的片段,所有这些片段也可见于M和/或父亲的样品中。如果X是与他们无亲缘关系的,那么他的每一条片段在该双亲中出现的几率是1-(1-0.26)2=0.45;从而M和/或这个父亲凑巧能够具有X的所有61条带的几率则是0.4561=7×10-22。显然X是这个家庭的亲属。

第二个问题是,是否有这种可能:即有一位不相干的妇女(但不是M)是X的母亲。在X的DNA指纹图中有40条带是“母系”片段。我们推测,在这40条“母系”片段中约有25条是由母亲特异遗传的,余下的片段则可能是来自母亲也可能是来自父亲,而不能作为M的母系证据。在X中的所有25条母系专一性片段也均存在于M中。因此,M与X无关但偶然地带有这全部25条片段的几率为0.2625=2×10-15。从而可见X和M一定是有亲缘关系的。

最后一个问题,也是最难的一个问题,即是否M的某个姐妹(这里对她不可能作出DNA指纹分析)是X的母亲(当然,X的父亲还应是M的丈夫)。如果一条带在任意两个人的样品中都出现的平均几率是0.26,那么一个个体的某一条带也出现于他的一个亲属中的对应几率便是0.62。因而假定M是X的真正母亲的姐妹,而且凑巧带有所有25条X的母系专一性条带这种可能性便是0.6225=3×10-6。因此,我们得出结论:M无凝是X的生身母亲。将这一研究证据提供给移民局之后,他们撤销了原先对X不利的判决,允许他定居英国,认定他是这个家庭的成员。

这一棘手的案例证明即使是在关键的家庭成员不在的情况下,DNA指纹图分析方法是如何提供有关家庭成员间血亲关系的明确而积极的证据的。在本案例中,由于X和他的兄弟姐妹有同一个父亲,并且这位父亲并没有将自己的任何DNA条带单独地遗传给X(平均起来,父系条带的1/16会被传递下去),问题便因这一事实而得以简化。这种X独有的片段,虽然明显地削弱了X和M之间的血缘关系的证据可信性,但实际上仍不会使DNA指纹分析毫无意义。除了25条母系特异的片段之外,X不大可能具有5条以上的这种父系片段。倘若X和M之间没有亲缘关系,或者M是X的姨妈,则30条特异带中至少有25条是未配对的,其凑巧在X和M之间配对的几率将分别是9×103和8×1011。在大多数类似的情况下,这一DNA指纹分析法可对血缘关系方面所遇到的疑难问题提供明确有力的支持或反对的证据。当然,一般说来,对于父系不清的案例,或者是那些想想通过移居重新团聚而遇上麻烦的家庭,所有家庭亲属都需接受DNA指纹分析:DNA指纹分析方法对这类问题差不多都能解决。

DNA指纹图的定量分析在M中可记录下61条DNA片段,与之对照,由父亲特异地遗传的片段是39条。父亲的杂合DNA片段中,有1/8是不能传给B、S1和S2的,这样一来对父系特异的片段数目的准确估计应是39×8/7=45。因为M和父亲的DNA指纹图中片段的总数应大致相等,那么在M中存在,同时父亲也具有的片段数目应是~(61-45)=16。因此,在M和父亲中共有的条带的平均几率(×)是16/16=0.26,这与以前对北欧人作随机抽样分析所估算出来的几率(X=0.2,参见实施例2)是一致的。

正如对杂合的条带所预期的那样,45条父系带中大约有一半可遗传给B、S1和S2(分别是18、24和18条)。M的61条带中有多于半数的带传给了B、S1和S2(分别是32、38、和39条,平均为36.3条),这也与预计的结果相同。因为M的条带中有些是父亲也有的,因此可传递给大多数或全部的子女。如果M的DNA指纹图含有几条传给所有子女的共有条带,加上(61-n)条只传给半数子女的杂合条带,则n+0.5(61-n)=36.3(其中n=12),这与M和父亲两者有共同的16条带的估计结果是相一致的(见前述)。

X的DNA指纹图谱是由21条父系专一性遗传条带加上40条与M共有的遗传条带组成的。有两种方法可以估算出母系专一性条带所占的比例,而这些条带是父亲所没有的。首先第一种方法,母系专一的条带数目与父亲专一条带的数目相等,即45/2=22.5。其次第二种方法,即40条母系带中(在X的DNA指纹图中的),将有几条(~12)见于母系/父系带中,剩下的28条是母系专一的带。因此,X由他的母亲专一获得的条带便是大约25条。共有条带的几率:某具个体中的一个片段能与另一随机个体中某一具体相似电泳纤维率和放射馛显影强度的条带相匹配,这将种几率定为X(X=0.2-0.26,见前述)。大的随体片段则很少是共有的,这可能是因为具有较低的等位基因频率和较好的电泳分离行为之故。因此,共有这一片段的几率是与杂合行政性干预相关联的。因为几乎所有片段的遗传都是相互独立的,所以合部几个片段在一个个体中存在同时也在另一随机个体中存在的最大几率是Xn;而X中的任何异源性都会使这一几率减小。血缘关系成员间所共有的条带:如果共有条带部是代表同一高可位点的同一某位基因,则X是与平均等位基因频率q×X=Zq-q2相关的。由此可做如下表示,即某一个体的一条确定的带也存在他(或她)的亲属中的这种几率为(4+5q+6q2+q3)/4(2-q)。

如果X=0.26,则q为0.4,则存在于第一亲属也存在感动第二亲属中的条带的预期比例是0.62。如果假定由随机个体的占有的条带绝不是完全相同的等位基因,即是说如果假主定许多微小随体均具有相同大小等位基因,则这一几率要稍为降低。

DNA指纹图须遗传疾病之分析中的应用为了确定使用DNA指纹图进行人类链锁分析,特别是研究大谱系中与疾病位点共分离的高可变DNA片段的应用可行笥,而对两个大家秒的DNA指纹图进行了研究,一个是估季有关神经纤维瘤好的基础分离研究,一个另做了有关儿血红蛋白的遗传保守性的研究,后者显然是由不与β珠蛋白基因簇链销的一个常染色体显性基历所决定的。

实施例8受神经纤维瘤感染的家系成员之DNA指纹图中高可变微小随体片段的分离用HinfⅠ酶切后的血细胞DNA样品经35cm长的0.7%琼脂糖凝胶电泳分离,之后与微小随体探针33.6和33.15进行Southern印迹发交。图7中显示了未受感染的父亲(F)、五个儿子(S)和六个女儿(D)的DNA指纹图形,对受感染的母亲则未能进行研究。受多性神经纤维瘤影响的后代指定为(+);其余的子代成员没有神经纤维瘤的特征。也拽明了已分辨出的父系(0)和母系(0)杂合DNA片段,直接由用短,中和长时间曝光的原始放射逢显影胶片记录它们分离到子代中的片段数目,结果只记录了各各子代中位置和相对强度与亲代中的相匹配的这些DNA片段。将分离AB或一一到子代中的DNA片段的链锁对AB用一条实线相连;而分离成A-和B-的等位基因而以虚线相连。在与神经纤维瘤的偶合中,显示出链锁证据的一个母系片段用星号标记;所有六个受影响的子代都继承了这个片段,五个未受影响的孩子中有四个没有这条带,因而这条带和神经纤维瘤的遗传之间有10/11的一致性。

材料和方法DNA分离用等体积1×SSC(SSC,柠檬酸盐水,0.15MNaCl15mM柠檬酸三钠,PH7.0)稀释新鲜血液,在Histpoaque-1077(Sigma产品)上铺层并离子收集有核细胞。亦可将冷冻的血液在2倍体积1×SSC中融化,以10,000g离心15分钟,沉淀出有核细胞和细胞核。依Jeffreys,A.S.所述的方法,(Cell    18,1-10,1979)制备高分子量DNA。

Southern印迹分析于37℃将5μg人DNA样品用20单位HinfⅠ降解2小时(降解过程须在有4mM三氯亚精胺的条件下进行)。用酚提取法和乙醇沉淀法回收被酰解的DNA。将用限制性内切酶酶切的产物溶于16μl H2O和4μl凝胶上样液(12.5%ficoll 400,0.2%溴酚兰,0.2MTris乙酸盐,0.1M乙酸钠,1mMEDTA,PH8.2)及2μl浓度为5mg/ml的溴乙锭混合物中,并加于水平琼糖凝胶(0.7%Sigma Ⅰ型琼脂糖,溶于40MTMns乙酸盐,20mM乙酸钠,0.2mMEDTA,0.5μg/ml溴乙锭(PH8.3)中,凝胶厚0.7cm,长20cm或35cm)上。平衡10分钟后,以2V/cm的电压电泳24-48小时,直到所有小于1.5Kb的DNA片段均泳出凝胶为止。将DNA吸印转移到硝酸纤维素滤膜(Sartorccs产品,孔径大小为0.45μm)上。由人的微小随体M13重组体33.6和33.15制备32P标记的单股DNA探针,按常方法于65℃在1×SSC中进行Southern印迹杂交,并做放射自显影。

在BBC    B型微机上进行分离数据的存储和链锁分析。

表3总结了一种    经纤维瘤家系中的微小随体标志。

已记下的不同的位点数(c)是由n-a-b得到的。完整的DNA指纹图谱(包括未分辨出的,因而也是未印记下来的片段)是由N个杂合子位点(2N片段)得到的。假定已印记的(n-b)个不同片段是DDA指纹图谱中2N个条带的随机样,则是由已知探针检测而估计出的高可变区域总数,并与下列公式算得的等位基因对数目有关:N= 1/(2′) 〔 ((n-b)(n-b-1))/(2a) +1〕

为了研究超可变片段的传递频率(图7),将探针33.6和33.15检测到的片段数(其为印记的几个中的,其为被精确地转移到11上有亲缘关系个体中的r个儿童者),与通过密定有50%传递的二项式分布式 (11Cr.)/211 n得出的数目相比较(见表4)。存在于所有儿童中的可能来自纯合子位点的片段则可忽略不计,不能传递到到任何儿童的母系片段是不能被印记的,这是因为毒母系DNA不能得以利用。表4中也列出了平均传递频率(±S、E、M)。

片段AB对之间的链锁关系,是通过印记对AB(AB或-)一致的子代数目来研究的,使用父系或母系片段的所有可能的配对比较。这些片段是首先排除了等位基因和有链锁关系的条带(即分离各亲代中的C位点,参见表3,给出 (C(C-1))/2 个配对比较)。落入零或11个儿童类别中的片段对,分别代表等位基因可紧密锁销的基因对;根据定义,没有那一对会同时列入这两个类中。将观察到的分布与推算的分布作了比较,假如所有的C位点都是非链锁的,在此情况下,确切给出了r个(AB或-)后代的配对比较的数目,可由二项分布式 (11Cr.)/(211) · (C(C-1))/2 得出。该分布与假定C位点是均一成簇的并且有均一间隔的推算数进行比较,则上述C位眯也是被重组频率θ(10,20或30cM分离)分离的相邻位点。因此,该簇将散布于(C-1)φ个图谱单位,其中φ-1/2|n(1-2θ)。对于C位点(随机地从一个或另一个等位基因取样的),可由下列公式给出11个有亲缘关系的r(AB或-)个子代的配对比较数:Σi = c - 1i = 1( C - i ) · C r11〔X i11 - r( 1 - X i )r+ Xr1( 1 - Xi )11 - r2〕]]>

其中X是两个相隔i个基因图谱单位的基因位点间的重组分数;X则是由基因图说函数算得的:Xi= 1/2 (1-e-2iφ)结果DNA指纹探针该项研究中所用的两个微小随体杂交探针已在某主要应用方面作了充分的描述。探针33.15含有各为16bp的核心序列变异体26次重片段的克隆的人微小随体。探针33.6中微小随体的重复单位是重复序列之最保守的11bp3′端分出的聚体,并且重复18次。该核心和探针重复单位的序列是:A核心    GGAGGTGGGCAGGAGG33.15    AGAGGTGGGCAGGTGG33.16    AGGGCTGGAGG探针33.6和33.15在序列和重复长度上的差异导致在检测人DNA    HinfⅠ酶切下段中长的高可变微小随体时呈出不同的图形。在DNA片段链同小的两侧DNA中,通过稀释长的串联重复的微小随体,这个4bp限制性内切酶使可见微小随体的分辨率增至最大限度。

大的亲缘关系群体中的DNA指纹图分析为了研究个体微小随体DNA片段的分离,对包括11个英国人个体的大的亲缘关系家系进行了关于神经纤维瘤(Von    Recklinghausen氏病)的分离研究。神经纤维瘤是一种与梢和中枢神经敏度肿瘤有磁的常染色体显性疾病,目前尚没有找到与这种疾病相联系的遗传标记。

将使用探针33.6和33.15检测的11(6个有受影响的,5个未受影响的)血细胞DNA指纹图与他们未受最广泛的父亲DNA指纹图进行比较(见图7)。通过在长度为35CM琼脂凝胶中电泳分离,使得对微小随体DNA片段的分辨达到最大程度。

因为许多高可变微小随体特别是最大的DNA片段具有低等位基因频率,并且如所预测其很少为无亲缘关系的人体所共有,所以,在神经纤维瘤家系成员中许多宁瓣片段是以杂呈状态存在的,并且只伟给某些后代。尽管受影响的母亲与DNA是不可得到的,但母系所和到的微小随全片段呆以很容易作为存在一某些子代但不是来自父系的片段得以被

定。使用探针33.6和33.15,有可能分离出这个亲缘关系群体中的41个父系和32个母系的DNA片段(见图7,表30。还存在有大量的在其它多态性片段,但这些都是电泳时跑出凝胶之外的,或者是未被完全分辨的,以及因此百不容易被印记下来的。

杂合子父系DNA片段中平均有53%传给了子代。相似地,母系片段则显示48%传递,这再次表明与1∶1分离相符(表4)。再得,接受了每种片段的孩子的数遵循二项式分布,其中传递到11个有亲缘关系的r个孩子的父系片段的比例是 (11Cr)/(211) (表4)。从而得出结论:对亲代条带的印记,特别是对那些较小的并且分辨不太好的片段的钱记,并不会受到两个或多个迭加带的分离这种可能情况的显著影响,后无中生有可给出一个明显的≥75%的传递频率。所有亲属中正确的父子和母子关系也是通过这些DNA指纹图谱确证的。

通过宽大的亲缘有关系家系所有父系和母系DNA片段的分离图形的配对比较,有可能

出片段的等位基因对和在偶联中显出紧密链锁关系的对(在该亲缘关系中已知条带对的共分离的可能性为1/1024)。可用两种探针检测父系和母系片段之几个等位基因对(图7)。探针33.6也检测了父系和母系中片段的一个链锁对。在一个第二谱系中发现了一个相似的链锁(见下述),这就提出至少有一个杂交到探针33.6上的高可变区是长的微小随体/随体,其中含有HinfⅠ的酶切位点(S),然而酶解产生了作为谱秒中微小随体“单倍型”的共分离的两个或多个片段。使用探针33.15所印记的,多态性DNA片段没有一个存在于上探针33.6检测的一组片段中;任何与两种探针相杂交的这种片段都能有相等大小的条带被检测到,这些片段是由同一亲代传给同一孩子的(即为“链锁的”)。因而,这两种探针基本上呆以与完全不同的人类微小隋体的亚组相杂交。

通过排除等位基因和链锁片段,可以得出如下结论:即在父亲和母亲的DNA指纹图谱中分别印记了34和25个不同的位点(表3)。对于~80%的位点,只分辨出两个等位基因中的而且第二个等位基因有可能定位在较短微小随体片段的分辨很差之复合体中。这一点就暗示了微小随体等位基因长度上一定存在着很大的差异,这可能是由于等位基因对并没有真正地显示出明显的长度差异。根据能配对到等位基因中的条带的比例,可以估计到由探针33.6和33.15所测到的整个DNA指纹图中存在的杂合子位点的总数,大约为43-66,其中的大约一半可以父亲和母亲指纹图中被印记(表3)。确定这个家系中父系和母系片段之产的等位性是不可能的。

所印记的所有父系位点都是常染色体的,并且没有显示专一地传给女儿(X链锁)或儿子(Y链锁)。此外,父系DNA片段的所有的对AB显然是独自地分离到子代中的,以得到平均直等数目的(AB,-和A-,-B)后代;精确的数目可由无链锁位点的二项式分布估算出来(表4)。母系DNA片段也具有相似的行动。更为详细的分析结果提示,这些位点间最小的位点对位点间隔一定是≥30cM(46个基因图谱单位);任何更紧密间隔都会产生很大数目的倾向共分离的(偶联链锁)或作为假等位分离的(相斥链锁)片段对(表4)。因此可分辨的最小随体位点一定至少伸展到3000cM长人基因组一半,而一定散布到许多或全部的人常染色体。

在与神经纤维瘤的联系中,一个母系微小随体片段(图7)表现出很弱的关系,有10/11孩子的这个片段和疾病是相符合的(θ=10cM,P=0.006)。然而,因为印记了25个不同的母系位点,便存在这样一种可能有性:即这些位点中至少一个    上的等位基因凑巧显示出偶联或相斥链锁,而其被观察到的程度很高(P=0.24)。

实施例9一个扩散谱系的DNA指纹图谱:可能的HPFH的链锁关系对DNA指纹图谱的分析扩散到于个Gujerati亚洲人的四代四系,该家谱按照β-地中悔贫血症和胎儿血红蛋白(HPFH)的遗传稳定性分离。

图8A和8B中显示出的标志分离图形的放射自显影是按下述方法制备的。

用HinfⅠ酶切的10μg血细胞DNA的样品,按照图7中所述的方法,使用探针33.6(A)或33.15(B)制得DNA指纹图谱。在相对短(20cm)的琼脂糖米凝毅然中完成电泳分析。个体这间的关联如图9中所示。A,高可变片段a、b和c是密切链锁的,并且整个的存在或不存在于该家系的每个个体中。B,条带g和HPFH(H)共分离。个体Ⅳ7和Ⅳ8是完全相同的双胞胎并且个有不能区分的DNA指纹图谱。

材料和方法如实施例8中所述。

图9A和9B中显示出共分离分析的结果。

在图9A中,筛选出分离到子代Ⅲ1-11中的业自Ⅱ4的30个高可变片段和来自Ⅱ5的27个片段。其可能有亲代片段的对B的链锁关系;再进一步在其它亲属中检测显示至少的6/7(AB-)子代有链锁关系的例子。结果表明有两个最清楚的有链锁关系的例子(a-f,片段a-f存在于一个个体中;,片段不存在)。片段a-c和e、f各自显示了完好的共分离;片段e则趋向与a-c共分离,但亲属Ⅳ1-4是非信息的,而完全相同的双胞胎Ⅳ7,8是重组的,并遗传给了a-c但未遗传给d。B,β-地中悔贫血特征(

)、HPFH(H)和微小随体片段g的遗传性。每个个体如果表现出>1%的HbF(正常)或>3%的HbF(β-地中悔贫血特征),则作为有HPFH被印记下来。HPFH和β-地中悔贫血特征独自地分离在Ⅲ1-11和Ⅳ5-8中,且通过非链锁的位点来确定。在被检测的个体中片段g很好地与HPFH共分离。

结果如图9A中所示,HbF的升高是β-地中悔贫血特征的独立传递,并且很显然是由不与β-珠蛋白基因簇的一个常染色体显性位点决定的。Gianni等人(EMBO    J.2,921-925,1983)报告了一个相似的萨丁尼亚岛人的家系。

图8A和8B中,在祖父(Ⅱ4)中印记了30个可变片段,在祖母(Ⅱ5)中印记了27个片段。对他们七个子代的研究表明,这些片段来自至少22个不同的非链锁的父系和18个母系常染色体位点,本例使用了描述神经纤维瘤家系时所用的标准。其余的DNA片段显示了等位性或与其它片段相链锁的证据,但还不能给出这个小的血缘关系的证据(一个给定的亲代DNA片段的对具有1/64偶然被传递的机会,其为互相链锁的或是作为等位基因)。在该家系的其它成员中找到了链锁关系的进一步证据,图8和9中显示出两个最强的链锁的实全。探针33.6检测到的片段a、b年c以很好的来自Ⅱ4的关系被传递传递给孩子(Ⅲ1-11)并进而传递给孙子(Ⅳ1-8);在14个提供信息的后代中没有看到重组体(三条共分离带的P=4×10-9)。正如上面所讨论的,这一发现提示:片段a-c代表得自一个单一高可变区的微小随体“单倍型”。由探针33.15所检测出的条带d也显示与条带a-c相链锁的证据;然而,因为双亲均携带片段d,所以一线亲缘关系具体裁(Ⅳ1-4)是非信息的,而另一组(Ⅳ5-8)则含有一个重组体(完全相同的双胞胎Ⅳ7,8)。因此条带d和a-c簇之间链锁的迹象是不明显的(θ=10cM,P=0.01)。母系条带e(由33.6测得)和f(由33.15测得)也显示了在Ⅱ4和Ⅱ5的后裔及其它相关亲属Ⅲ15-20和Ⅳ17-22中的密切链锁关系(20个携带信息的后代,没有重组体,θ=0cM,P=10-6)。在为探针33.6和33.15决定不同组的微小随体并且不对片段e和f产生交叉杂交,因此这些片段代表两个不同的常染色体微小随体区域之间的确切之链锁关系。最后,两个链锁群(片段a-c和e-f)并不是同一区域的等位基因。体Ⅲ1是一个携带供销系统a-c族和素养和母系e-f对的复合的杂合子,这两个片段族均传给它的四个孩子中的两个,从而确定它们不是作为等基因分离的,而一定是由两个非链锁的高可变区域衍生的。

没有任何母系(Ⅱ5)微小随体片段显示对β-地中悔贫血特征的显著链锁关系,因而也就与染色体11上β-珠蛋白基因簇没有紧密联系。相反地,在七个子代和孙子的三个携带信息之亲属中有一个长度为8.6Kb的母系片段与HPFH共分离(图9)。在12个后代中没有看到重组体,提示有密切链锁关系(θ=0cM,P=2×10-4)。根据是研究了Ⅱ5中的17个位点,这种链锁仍是明显的印记的17个位点中至少一个的等位基因碰巧与HPFH共分离的几率是0.004)。进一步核对发现Ⅱ5中的片段g是一个单一的微小随体等位基因,并且用Sau 3A代替用HinfⅠ酶切,研究了图9中所示的所有个体的DNA指纹图谱,其中没有看到迭加的分离DNA片段;每个阳性(正的)指纹图谱都含有一个大小相似于片段g的相应的Sau 3A片段(8.2Kb对8.6Kb),这正是所预料的单一微小随体片段的长率。

讨论人类家系分析显示,由微小随体探针检测的DNA指纹图谱即使在对家系中的一个或另一个亲代不能进行研究的情况下,亦可很可靠地用于研究多杂合性DNA片段的分离。使用两种这类探针有可能分析同时存在于一个单一个体中的多达34个高可变区,在人类遗传学中,这种方法怕得到的各代遗传标志的比率远远高于用常规方法,包括PFLP所获得的比率。正如通过分析两个家系中所发现的链锁关系的实例所表明的,利用可变微小随体片段的稳定遗传性加上个体片段的低群体频率,即可使之非常适于作链锁分析。我们应强调指出,虽然这些高可变微小随体可能是重组热点,但估计出现在长微小随体上的不均等交换的比率并不足以明显地扰乱微小随体位点和邻近基(如疾病位点)之间的链锁。

估计由微小随体探针33.6和33.15一同检测到的高可变区域的数目在约是60个。在一个给定的DNA指纹图谱中,至少可分辨出在约半数这些区域中的两个等位基因之一,因而可认为存不同的DNA指纹图谱中,所检测的位点的谱并不是完全相同的。这些区域中的大多数或所有的遗传学上都是非链锁的,因此必须是散布在人基因组的绝大部分。尚不明瞭它们的精确定位,而必须等到克隆和对个体的高可变微小隋体位点进行区域性定位后才能知道。令人不好理解的是,就所研究的谱系来说,在X或Y染色体上还没有找到微小随体。我们估计在神经纤维瘤家系的父亲中,以及在HPFH家系中的个体Ⅱ4所印记的大约43个不同位点可能属于性链锁的。因为X和Y染色体一同构成男性基因组的~5%,那么43个随机散布的位点均不留在这些染色体上的几率便是(0.95)43=0.1;因此明显地缺乏性联微小随体是并不重要的。

正如前面关于神经纤维瘤和HPFH的链锁的例子中所显示的,这些散布的高可变微小随体区域很适于寻找与疾病位点相联系的标记。与常规的单一位点遗传学分析方法不同,不能将无关的小家系之间的链锁关系数据集中在一起,因为一个不同的微小随体等位基不可能与各家系中的疾病位点相关联。因此,DNA指纹图谱只地研究一个扩展的家系以及更可靠的是在一个单一大家族中的显性遗传病的链锁关系。

至此,在一俱个体中已印记了用探针33.6和33.15检测的多达34个常染色体高可变区。假定微小随体的随机散布遍及3000cM长的人类链锁有关系图谱,则这些位点中至少一个与一种已知疾病位点(在10cM以内)密切相闻的或然性为20%。对于扩展的家纱如HPFH家系来说,因为大多数位点中只有一个等位基因是可印记的,所以这一几率降低为~10%,而且对于检测链锁关系,这具等位基因必须是以偶联式与疾病位点和连续。为了提高这些几率至50%以上,则需要在单一大的亲缘关联中印记出>104个高可变位点,而在扩散的谱系中则须印记出>208个位点。这些数目实际上已超过了迄今所用的两种微小随体探针所检测一的位点总数。然而,探针33.6和33.15基本上是检测总体上不同的两组主可变区,这就提示含有各种核心序列变体的人类微小随体的总数可能是很大的。

在使用限定的单一位点标记进行的常规人族谱系分析中,一个标记和一种疾病之间的链锁证据通常是直据给出疾病基因的大致的基因组定位,并且可通过分析外加的谱系来进一步证实。对DNA指纹图谱来说反题是正确的。对于一个高呆变DNA片段与一疾病之间的呆能的链锁关系,可通过用制备凝胶电泳和克隆化分离该片段来进一步分析。之后可由分离出的微小随体设计位点特异必杂交探针,可使用直接连有端侧微小随体的独特序列DNA片段,或乾在高度严格杂交中使用整个微小随体。在扩展其它家系中链锁关系数据,以及定位人基因组内的微小随体,可以使用这种位点特异性探针。这一探索性研究目前已通过克隆显然与Gujerati家系中HPFH位点相联的8.2Kb    Sau    3A微小随体片段得到进一步证实。

如上所述,探针33.5,33.6和33.15,每个都包含一个人类微小随体,而各微小随体又由核心序列的不同变异体所组成,故可制得出不同的DNA图谱,进而用于检测人类和其它脊椎动物DNA中的不同组的高可变微小随体区域。特别是,由于每种探针中所存在的重复核心的长订及准确序列上的差异,合得探针33.6和33.15可检测到很大的或者完全不同的两组笛小随体(参见第三项应用及A.J.jeffreys,V.Wilson,S.I.Thein;D.J.Weatherall和B.A.J.Ponder等人的“DNA‘fingerprints’and    linkage    analysis    in    human    pedigrees”)。

为了使用核心序列其它变体的串联重复来检测处鉫高可变区域的可行性,而制备了一系列合成的微小随体。

人造微小随体的合成和克隆图10中概括了制备多核心探针的研究,图解说明了制备大肠杆菌的热点超始因子序列(Chi,GCTGGTGG)的克隆化的串联重复。步骤中包括使用标准DNA技术制备多聚-Chi探针,这些步骤是:1.按照H.w.d.mATTHEG等人(EMBO    J.3,810-805,1984)以及D.G.Brenner与W.V.Shaw(EMBO    J.4,561-568,1985)的方法制备含串联重复请勿    合成的寡聚核苷酸,中联重复为长8个核苷孜的Chi序列。同时还合成了含有Chi的互补序列二聚体的第二个寡聚核苷酸。

2.于37℃,在10mM MgCl2,10mM Tris-HCI(PH8.0)中命名这两种寡聚核苷酸一直退火,以产生一个短的单股DNA片段。选择第二个寡聚核苷酸的序列,以产生出在5′端最低点出长度为3个核苷酸的退火的分子,以适用于头对尾连接。

3.用T4多核苷酸激酶加上ATP,使5′末端磷酸化。

4.用T4DNA连接酶加上ATP,使退火的DNA片段以头对尾的方式连在一起,以产生一个重复的Chi多聚体。

5.通过1.5%琼脂糖凝胶电泳,按大小分离连接好的多聚体,并于DE81滤纸上经电泳分离长度大于150碱基对的多聚体(Dretzen,G.,Bellad,M.,Sassone-Corri,P.&Chambon,P.,Anal.Biochem.112,295-298,1981)。

6.使用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段通过填补修复使回收的长多聚体成为平头,并且连接到M    13mp    19F    DNA的Sam    Ⅰ位点中(J.Messing    &    J.Vieira,Gene    19,269-276,1982)。将连接的DNA转化的大肠杆菌JM101中并由个别的白斑中分离单股噬菌体DNA。

7.使用二脱氧(核苷酸方法(M.D.Biggin,T.J.Gibson    &    H.F.Hong,Proc.Nat.Acad.Sic.USA    80,3963-3965,1983)对每个克隆的分离体的DNA插入片段进行序列分析,以确定多聚插入部分的长度、定向和序列。结果找到一个重组的M13噬菌体,定名为M13.core    A,它包含了在单M股DNA中定向为5′→3′的Chi序列的50次串联重复〔即是说插入片段是多聚(Chi),而不是多聚(Chi的互补序列)〕。

8.通过引物伸展方法制备32P标记的单股杂交探针,……实施例11至15五个进一步的新的人工小随体的制备使用上述技术,合成了五个核心序列的进一步的变体,并象M13中的多核心重组体一样进行克隆,得到了M13。核A-F的重组体。选择这些核心变体,是基于它们与核心的长度和负序列两方面都不同。表5根据了M13.核心A-F克隆的重复序列,并与核心序列和记述在前机实施中已使用过的探针33.5,33.6和33.15作了比较。核心序列中最不易变异的碱基在下面用横线标出。载体M13mp13中的每个插入定向也已给出(→,插入为多体(核);←,插入多体(核)的互补序列)。用小写字母给出的碱基表明它与核心序列不同。每个序列的简要特性被概括在“评注”中。

实施例16M13.核A-F与用HinfⅠ降解的人类DNA的杂交在最初的筛选中,用探针33.15和M13.核A-F中的每一个探针与两个非相关个体的DNA降解物杂交。按照主要实施中所描述的方法,将来自于两个非相关胎盘的8微克DNA样品用HinfⅠ降解,通过0.7%的琼脂糖产胶电泳,用Southern法转移印渍,并与第一个用32P标记的探针杂交。放射自显影结果见图11。所有探针从每个个体中都检测出了多DNA断片。

结果探针B、C和D三者都检测出了在两个个体之间是实质区别的DNA断片指纹图谱;虽然某些断片为被断片被不止一个的探针检出,并在某种程序上与探针33.15所松江出的高可变断片系列相覆盖,探针与探针之间的指纹图谱还是有差异。我们由引认为探针B至D都适用于DNA指纹图谱法,并且,它们将一起扩展    能从人类和其它脊椎动物中检出的高可变随体的数目。此处的意义在于,用核C获得的成功的指纹图谱,仅包含了核心序列中心部位最为保守的7碱基对片段。

核心的进一步截短产生了具6碱基对重复的核#,它完全改变了

DNA指纹图型,揭示出在试验的两个个体中最具共性的一套断片(即:这些断片不呈现极端多形态变异)。因此。核E作为DNA指纹图谱分析的探针,不大可能有会象前面用过的探针33.5,33.6和33.15有用。这也表明对于一般的成功的DNA指纹图谱分析来说,实际可行的最小量要求是核心序列的7个碳原子碱基对。核心中心部位最保守区域的分裂(M13.核F),也似乎降低了DNA指纹图型的复杂性和变异性。

M13.核A(poly    Chi)首开了一个新的和高密度型的杂交DNA断片。这些断片中的许多都很大(大于15,000碱基)和难于溶解,并很可能从偶然含有HinfⅠ切割点的常规的长随体序列中衍生出来的。有些DNA断片呈现出个体可变异性。

实施例17核A的进一步检测M13.核A的生成型在受神经纤维瘤感染的家族中进行了进一步分析,该家族用探针33.6和33.15也表现了广泛的特征(参见实施例8和图7)。图12中给出了父亲(父),六个女儿(女)和五个儿子(儿)的DNA    HinfⅠ的降解物的DNA指纹图谱。受到神经纤维瘤-一种常染色体显性遗传性癌症-感染的个体以“+”标记;受感染母亲的DNA不能得到。父系的(·)和母系的(o)分离谱带在图中标明。由实线连接的谱带是相联系的。由虚线瓣谱带为等位基因的分离。用(×)标记的谱带已在前面用探针33.15检出过。

结果与用探针33.6和33.15所获得的DNA指纹图谱不同,变异水平相对较低,许多断片被遗传给所有的后代(即:这些断片在人类中很常见,并不稀少,它们常以纯合了状态存在)。父系的6个杂合子和母系的9个杂合子分离谱带可在11个其血缘关系的子女中得到。父系中的一个谱带和母系中的一个等位基因对的谱带前面已用探针33.15检出过。排除等位基因和联系对的谱带后,与前面得到的34个父系和25个母系位占相比较,剩下父系中2个新位点和母系中6个新位点我们在前面既没有用探针33.6、也没有用探针33.15得到过。因此,探针poly    Chi在人类基因分析中的应用是有限的。

实施例16和17的结果证实了前面18页上的主要实施中讨论过,并在表5中最上一行用横线标出的九个优势核苷酸的重要性。它们对于证实主要实施中做出的预测也极有帮助:即对于一个成功垢探针核,六个核苷酸最小序列是必需的。因此,核E具最小实用体的典型性,并且,它们的六核苷酸序列也有可能会勉强显示出改地的实用性,如后面讨论的TGGGCA序列。在我们的研究主体中,上升至七个核苷酸是极引人注目的。

在定义有用核心序列的实质的尝试中,上述用以表明两种可选择核    酸的变异子X和Y,可被有益地扩展到如下述的完全符合逻辑的一组:X=A或G    P=非GY=C或T    (Q=非A)W=A或T    (R=非C)V=C或G    (S=非T)(O=任何一个)()=没有利用下面的讨论中。

用这种符号标志,本发明的一个方面呆说是包括了一个含有下列重复核序列的多核苷酸:GPGGGCWGGXG    (6)就好然指明了最具代表性的十二核苷酸序列。然而,已经表明,七核苷酸的核C也有极大的实用性,为包括这个来自于上列十二核序列的有“允许的”变异是子的七核苷酸,一个方面可说是还包括了一个含有下列七核序列重复的多核苷酸:PGGGCWG    (7)当然,P象在核C中一样等于T更为可取。另一最有益的可能性可以是A。

为清楚明晰之故,表3中还指出了百分同性度。至少本实施中的人工探针,应当注意的是,重复都是严格的重复,所以小随体的同性度总的来说能够用核心序列的同性度表示。对一丧面在括号中已指明同性度的探针33.6,33.15和33.5,这并不是必需严格的。这是由于变异是发生于重复之间。核F也许表示了对于实用来说同性度的最小百分数。然而,这种同质性的缺乏也许被存在于核心中的中心组TGGGCA的断裂所夸大。值得注意,丰组存在于最为成功的探针B、C和D之中,而且在所有不及上述成功的探针A、E和F中被打断。因此可期望,也许能够得到具式(6)结构的,在全部同性度中最少有70%同性度的更为成功的探针。

值得注意,式(8)中的中心六多核苷酸组TGGGCA在核E中也被打断。尽管从六个到七个核苷酸的长度增加可能证明是一个更具优势的特征,但也许可以期望,上示的六核苷酸的核心序列可能更为成功。

因此,本发明的一个能够说是包括一个含有核心序列TGGGCA重复的多核苷酸。

更一般地说,本发明能够说是包括这样一个方面,一种根据上述“首次”定义的,序列TGGGCA存在于所有重复序列中的多核苷酸。

从另一方面看起来,本发明能够说是包括一种对于上述“首次”定义的我核苷酸的修饰,该多核苷酸中“核心”代表一个从式(2)给出的序列中选择出来的的,以同样的5′→3′方向阅读的至少六个连续核苷酸的序列;即命名所有的单位都包含序列TGGGCA,“核心”在每一个重复单位中并不必需具有相同的序列。

最好每个单位的剩余基因团,在整个单位长度的范围内,具有与式(6)(或最好是式(2)的顺序的至少70%的同系性。

分娩中双胞胎接合性的测定对双胞胎接合性的测定是十分重要的,不仅仅是用在流行病学,遗传学和产科医学的研究方面,而且也用于区别单合子双生儿和双合子双生儿的预测上,单合子双生儿或同卵双生儿一般与双合子双生儿相比较,是诞生时体重更轻此,更易患上并发症,其死亡率也较高些。在白种人的新生双胞中有30%左右是异性的,因此,也就是双合子双胞,对肋膜的检查发现在20%的案例是单卵膜的,而这些正是单合子的,剩余的50%,总是在人口当保持不变的比较,有同性的,具有以羊膜双卵壳的胎盘,而有可能或是单合子或双合子的。在地案例中,人们已经采用了各种各样的方法骈测定接合性。其中包括对一般外貌的说价,指纹鉴别,皮肤移植,味觉试验和测定遗传标志物。后者方法是最可靠的方法,并具有95-98%的准确率。由于大多数蛋白质和抗原变种的较低的平均异型接合性,因此,就需要对上述的标志物进行大量的调研。

在下列实例中,用上述的小随体DNA探查物,对十二组新生双胞胎的DNA进行检验,从所取得的DNA“指纹图谱”显示了在个体之间的这样变异性,即只有单合子双生儿才显出相同的模式。在七组之案例中,其中用性别观测或胎盘检查的手段增测定接合性,DNA结果与上述的测定结果是一致的。在其余的五对双生子中,用两组的三联体DNA分析能够很快测定其接受性。因此,据本发明的DNA探查物能够提供一个基因试验,对所有的多产怀怀孕情况进行接合性的正测定。

例18用单链DNA探查物33.6和33.15对十二组新生双胞胎进行接合性的测定,其结果在表6详述。

表    6例妊娠时间性别*胎盘形式*DNA模式1    38周    女女    单卵壳    相同2    38周    男女    双卵壳    非等同3    30周    男男    双卵壳    相同4    33周    女女    单卵壳    相同5    40周    女女    双卵壳    非等同6    37周    男女    双卵壳    非等同7    32周    女女    双卵壳    相同8    34周    男女    双卵壳    非等同9    39周    男男    双卵壳    非等同10    38周    男女    双卵壳    非等同11    27周    男男    双卵壳    相同12    35周    女男    双卵壳    非等同*所有的膙盘都是双羊膜的把分娩以时抽以的脐带生命维持线的血样或是在产生从每个婴儿身上抽取的周缘血样(0.5-1.0毫升),用于DNA提取法中检查胎盘以测定它们是单羊膜或是双羊膜的,以及卵壳。用标准的方法(Old,J.M.,higgs,D.R.Gene    analgsis.In:D.J.Weatherall,ed,The    Thalassaemias.methods    in    Haematology,Churchill    Livingstone,1983)去提取DNA,并把10-15微克用Hinf    Ⅰ去消化。把样品通过一个22厘米长的0.6%琼脂糖凝毅然,在45伏下经受~36个小时的电泳,一直到在<1.5Kb长的DNA片段已电泳出这凝胶。通过在硝化纤维素过滤器中吸干,转移出DNA,并在真空中80℃温度下烘干两个小时。这单链的DNA探查物,33.15和33.6,用前面已述的32p标记。

其结果在图13中表示。

在图13中,线1,2显示了在案例1中每个双生子的DNA带模式,其中采用了33.6单锭小随体探查物。线3-19显示了用单链33.15探查物所得的“指纹图谱”:案例1,线3,4;案例2,线5,6;案例3,线7,8;案例4,线9,10;案例5,线11,12;案例6,线13,14;案例7,线15,16。线17-19是雌(女)性-雄(男)和雌(女)性的三个三胞胎。把线1和线2与线3和线4进行比较,显示出即两个探查的,33.6和33.15,检测不同组的小随体带,其中的标志物大小用干碱基表示。

在7个案例中(请阅表6),通过对双生儿的性别和胎盘膜的检查,能够容易地测定出其接合性,所有具有单卵膜的(或单羊膜的)胎盘(例如,案例1)都是单合子的,虽然只有大约50%的单合子的双生子具有单卵膜胎盘(2)。因此,案例1中的双胞胎必须是单命了,而且用33.15和33.6探查物时却显示出相同的DNA模式(图1)。在5个案例中,双胞胎具有不同的性别,而且用33.15和33.6探查物时显示出不同的区带模式。在案例3,5,7,9和11中,双胞胎具有相同性别,并有双卵膜的胎盘,因此,它们可能或是单合子或是双合子,通过DNA分析了两组双胞胎(案例5和9)有不同的区带模式,而且,因此是双合子的,然而在另外的三组双胞胎中(案例3,7和11)则有相同的区带模式,且显示了单合子。

对两组新生的三胞胎进行了类似的研究,在这两个案例中,母亲服了致育药物,以有益于受精怀孕,而每组三胞胎显示了单一的区带模式(例如,线17-19,图13)。

试验结果在图14中表示,图中的线1和2显示了采用单链33.15的结果,而线3和4显示了采用双链33.15的结果。

例19虽然单链的探查物或双链的探查物足于做出自己的诊断,然而更多的区带是通过更有放射活性的单链探查物进行区别的(图14)。

作为这些单链探查物的替代物,我们已经调查出采用相应的双链探查物的可能性,它们在大多数的实验室中被人们所熟悉的。被人们采用的双链DNA探查物有ⅰ)、双链600bp Pst I-Aha Ⅲ片段,它含有自λ33.15的“核心”小随体和ⅱ)、双链720 bp Hae Ⅲ片段,它含有自λ33.6的“核心”小随体。这些都被制品转译(nick-trans(ation)标记为特殊活性0.5-1.0×109Cpm32p/ug DNA。予杂交和杂交条件如上述的已知的标准方法中所讲述的一样,只是在这双链探查物的杂匀缓冲液中,采用了1×SSC和10%葡聚糖硫酸盐。在65℃温度的1×SSC中洗涤这些滤器,并用增感屏在-70℃温度下射线自显影1-3天。

对例18和19的探讨在7个案例中,人们可以独立地测定出接合性,其中DNA结果和用观察性别以及检查胎盘的方法,所得到的结果是一致的。在另外的5对中,可以用小随体探查物明确测定出接合性,同样地,对两组三胞胎的研究也显示出三合子。

在50%的案例中,不能和不同性别(双合子)或单卵膜胎盘(单合子)去测定出接合性,因此,必须采用基因分析法,这种试验所提供的资料一调硬中在基因地点(genetic loci)上的变开质的范围成正经的,并也与试验的地点的数目成正比。用多红细胞抗原和酶能够以95-98%的精确玆测定出接合怀,但这必须事先知道人口中的有关等位基因频率。(Nylander,P.P.S.The Phenomenon of twinning.In:Barron,S.L.,Thomson,A.M.eds.Obstetrical Epidemiology.London Academic press,1983:143-165)。同样地,用几种不同的DNA探查物进行对多方限制内切酶部位多形质的分析,能出现值得注意的百分比例的单接受性的“假阳性”诊断。(Derom,C,Bakker,E.,Vlitineck,R.,Derom,R.,Van der Berghe,H.,Thiery,M.,Pearson,P.Zygosity determination in newborn twins using DNA Variants.J.Med.Genet.1985,22:279-282)。据本发明的小随体物解决了这个问题,这是因为检测到超可变DNA片段的大量的变异性。正如前述在,在任意选择的个体之间,很少能共同具有杂交的小随体片段(也与图13中的无关联的个体比较)。上述显示了即用两个能检测出不同组的超击中要害变地点的探查物33.6和33.15显示相同DNA指纹图的两个不相关联的个体之差异是极大的(P<<10-18,见例4)。在共同享有大约它们一半片段的亲族中,遗传一致性的这样“假阳性”诊断的可能性是<10-8因此,联用单链杂交探查物33.6和33.15能提供比前述的基因试验更大为精确的结果。甚至使用不能与一些由单链探查物检测的更虚弱的区带杂交的更常规的双链小随体探查物(图14),能从DNA指纹图谱取得足够的情报以降低“假单接合性”率到<10-4。

这种测定接合性方法的另一个优点是在分析时只需用少量的样品。半毫各式的周缘血或脐带血总能提供足够用的DNA。用这种可能的简单方法,对新生的和出生后生长着的双胞胎和三胞进行接合性测定,使得更精确的对不同类型的多产怀孕的决定因素和作用的流行病学的研究成为可能。

在下列实例中,在射线自显影中没有给出标志物分子量,但另一方面,其有效范围是1.5~20Kb。

在法医学上应用DNA指纹图谱用小随体探查物33.6和33.15能测定出DNA指纹图谱的个体的特性,因此,在法医学上它是呆适用于个体鉴别的理想的方法。问题的颖难点在于DNA是否以完全没有退化的形式生存于,例如在干血或精液污斑中,以便能够分析DNA指纹图谱分析。为了对法医学分析样品的可能性测定的研究,已由在Aldermaston的内政部中心研究机构的peter    Gill博士进行有关DNA样品的小型研究。

例20在Gill博士进行DNA提取以前,把沾有干凝血和精液污斑的布,在室温下存放几个不同的时间(上述DNA提取是在1摩尔DNA存在下用SDS溶胞,接着用苯酚提取并用乙醇沉淀)。同样地,可从新鲜头发根中提取DNA,而且从性交前和后所取的阴道化验标本液中提取DNA,用Hinf    Ⅰ消化DNA样品,用0.8%葡聚糖凝胶进行电泳并用硝化纤维素滤器进行处理,使用我们上述的标准技术把标记32p的单链探查物33.15地行杂交。

进行电泳的样品是:1.40微各式精液污斑布在布料上,4周时间。

2.40微升新鲜清液。

3.60微升新鲜血液。

4.60微升血斑在布料上,4周时间。

5.60微升血斑在布料上,2年时间。

6.15毛发根NB、1-6从同一个人中取的。

7.60微升血斑在布料上,男的,新鲜的。

8.从11抽取的阴道化验标本液,与7性交后一个小时。

9.如同8,但是在性交后7个小时。

10.从11抽取的阴道化验标本液。

11.60微升血斑在布料上,女的,新鲜的。

所取得的DNA指纹图谱在图15中表示。从每个样品中提取足够用于分析的DNA(~0.5~3微克)。保存直至2年的干血斑和保存直至1年的干精液斑中的DNA并没有退化。它的DNA指纹图谱与同一个人体中的新鲜血液和新鲜精淮所取得的DNA指纹图谱是相同的。同样地,能从少至15根头发根中取得DNA指纹图谱。

从性交后扣帽子取的阴道化验标本液中也同样提供了没有退化的DNA指纹图谱。然而,化验标本模式主要是与妇女的血模式相匹配,面不是与男的血模式相匹配,这一点说明即从化验标本中收集到的大多数DNA是来自抽取标本时剥离下来的阴道上皮细胞中,而不是亚点和面精液中。然而在性交后的样品中也能检测到三个另外的非女性区带。这些区带与这男人的血的基本区带是相匹配的,而且肯定是从精淮中衍生出来的。这样的区带有从性交后7个小时的样品中检测出来。

讨论:这些初不的结果表明了,在各种的法医学的样品中DNA是能保持原样地保存下来。因此,用于鉴别用途的DNA指纹图谱至少在某些法医学样品中是可取的。例如,从受害者衣服上的精液污斑的分析,可以对强奸犯进行正鉴别。由于阴道内DNA的污染,因此,从强奸受害者中扣帽子取的阴道化验标本的分析情况也不那么肯定了;然而,在用2-DTT或疏基乙醇作为媒介对精子进行用于分离精子DNA的还原以前,用sds溶胞作用除掉这女的DNA,将形成清晰的精子DNA指纹图谱分析将能鉴别出强奸犯。

从Gill博士最近的研究结果进一步证实了,采用前述的基本分离技术,能从性交后抽了的阴道化验标本中取得清晰的精子DNA的“指纹图谱”。

图15A显示了从两个性交后6.5个小时抽取的阴道化验标本中取得的DNA指纹图谱(线3),其中线1显示了从男配偶的血样品中取得的指纹图谱,线2显示了从女配偶的血中取得的DNA指纹图谱,阴道化验样本中女的细胞核在基本保温的SDS/蛋白酶K混合物中完全溶胞。精子核是不受这种处理的影响的,因此,能通过离心作用从女的组分中分离出来。然后把精子核用SDS/蛋白酶K/DTT混合物,进行溶胞处理。

这种分离过程显然是完全成功的。从含有精液的阴道化验样本中取得的精子DNA指纹图谱,与从男配偶身中取得的指纹图谱是完全吻合的。

使用人类小随体探查物取得有重要经济价值动物的DNA指纹图谱实例21-25:从狗,猫,羊,猪,马和牛的血中制取DNA样品,用适当的限制核酸内切酶(Hinf    Ⅰ,除非另外指出)消化8微克的样品,在用苯酚提取后,用乙醇沉淀重新取得限制消化液,用水再次溶解这限制消化液,在0.7%葡聚糖弹簧胶中电泳,进行变性,转移到Schleicher-Schuell硝化纤维素滤器中,然后如前述,用32p标记的人类小随体探查物33.6或33.15进行杂交。

例21.狗用探查拖把33.6所取得的狗科的DNA指纹图谱是表示图16中,电泳过的样品是:线1:比哥(Beagle)父狗线2:灵提(Greyhound)母狗线3,4,5:是以上两条狗配偶所生的“Greagle”后代幼犬(雌,雄,雌)象从人类的DNA衍生出来的复杂的DNA指纹图谱那样,从每条狗所取得的DNA指纹图谱图谱也是复杂的。与从父狗和母狗所取得的模式相比较(线1,2),这些DNA指纹图谱是有实制裁性的变异性。所有这三条幼犬有不同的DNA指纹图谱,但每种案例都有能追溯到父狗和/或母狗的区带。因此,这些DNA指纹图谱就象用在人类上一样,能适用于狗的父性鉴别化验和谱系分析。

在样品1-3中的DNA是稍有退化,由此最好是降低最大区带的强度(最慢地移动),尽管有这样的退化,但仍然能容易地测出从父体和母体的幼犬的区带的传导。

例22    猫图17显示了用探查物33.6(左)和探查物33.15(右)测定的短毛家猫科的DNA指纹图谱。

线1:母猫线2:父猫线3:猫仔探查物33.6和33.15都了信息的DNA指纹图谱。猫仔的大多数区带,能从匀系或母系中获得,因此,这些DNA指纹图谱是适用于谱系分析以及对猫的个别鉴别。

例23    羊用探查物33.6(左)和探查物33.15(右)能从各种的羊中取得DNA指纹图谱,并于图18中表示,样品有:线1:杂产繁育雌羊线2:杂产繁育雌羊线3:多尔塞特(Dorset)雌羊线4:汉普夏(Hampshire)×多尔塞特(Dorset)雌羊线5:多尔塞特雄羊可以用两种探查物从每个头号中取得它的DNA指纹图谱,这些DNA指纹图谱比人类的DNA指纹图谱更虚弱些,而且没有那么复杂,但仍然可适用地鉴别和遗传方面的用途。用探查物33.6除了比较虚弱的芡带以外,还检测每只头号中的1个或2个比较强的多形的区带,这些区带是从单个的小随体地点衍生出来的,而这个地点偶而显示了对探查物33.6的高程度的同系性。

例24    猪和马图19显示了从三个不同的猪(线1-3)和三个不同的马(线4-6)〔性别和品牌没有具体说明〕的DNA指纹图谱。对于每个种类来说,探查物33.6和33.15能生成具有人体-特性的DNA指纹图谱。这些DNA指纹图谱,特别是采用探查物33.15的,与人类的DNA指纹图谱相比较,就显得虚弱而且更少的区带。但是,尽管如此,联用这两种探查物仍然适用于个体的鉴别工作。

例25    牛图20显示了从奶牛科和其他牛种。用探查物33.6所取得的Hinf    Ⅰ    DNA消化淮的DNA指纹图谱,样品如下:〔线1    人类〕线2    母牛线3    父牛线4    1和2的小牛线5    安格斯(Angus)公牛线6    弗雷希安(Fresina)公牛正角用羊,猪和马的情况一样,从上述每个动物中所取得的DNA指纹图谱是相当简单的,但却有其个体特性的。

图21显示了把探查物33.15用在相同的牛中,DNA的结果,个体的曲线如下标注:1.母牛

2.父牛(公)3.1和2生下的小牛4.安格斯公牛5.弗雷希安公牛〔6    人类〕用探查物33.15生成了Hinf    Ⅰ消化的牛的DNA    的强烈的和复杂的杂交DNA区带的模式,在一个Bg|Ⅱ消化液中,这强烈信号主要是由很大的DNA片段所限制,比如,这信号是从成群的顺序或区,很可能是常规的随体DNA中衍生出来的。对这Hinf    Ⅰ消化淮的短射线自显影暴露,显示了指几凝胶底部的区带的“阶梯”,而每梯级之间的周期性是45-50碱基对(没有显示数据),因而这强烈的信号,很可能是从其重复的单位是45-50三基对长的随体中衍生出来的。这种强烈信号在用PVV    Ⅱ,Dde    Ⅰ或Alu    Ⅰ消化的奶牛的DNA中大量受到破坏。比如这随体DNA重复的单位,对于每个限制核酸内切桥头含有1个或更多的部位,但不是对于Hinf    Ⅰ或Bgl    Ⅱ而言的。这些正是1.720奶牛随体的性质(E.Poschl和R.E.Streek“Profotype    sequence    of    bovine    1.720    Satellite    DNA”J.Mol.Biol.143,147-153;1980),这随体是由46碱基对重复的单位的100,000纵列重复组成的。把这1.720重复的单位和33.6探查物重复的单位以及探查物33.15重复的单位进行比较,情况如下:

上此能见到,1.720随体重复的单位包含核心重复的3′区的较完善的复制(上式用*表示),在1.720重复中的这个区与33.15的重复单位相匹配,但对于33.6来说则匹配的不佳,这点就能说明了为什么1.720随体DNA能由探查物33.15所检测,而不是上探查物33.6所检测(图20),这1.720本重复单位(象肌红蛋白λ33小随体的重复单位)在核心的每一边上,含有太多的核苷酸(在式(1)中的H+J>15>担当据本发明的多地点探查物的作用。

为了检测与探查物33.15杂交的奶牛小随体,把奶牛DNA用Alv    Ⅰ或Dde    Ⅰ进行消化,命名1.720随体还原成将从凝胶底部电泳掉的46碱基对的单体,图21显示了从小牛DNA(第3号)中为这些限制内切酶取得了消除的DNA指纹图谱,然而,几乎所有这些区带是从1.720随体DNA的变种阻断中衍生出来的,并嵌入到正常1.720DNA,其中在每个重复中已经丧失了Alv    Ⅰ和Dde    Ⅰ(约许是用上述的用划底线表示的一个或其他的突变,它将破坏Alv    Ⅰ和Dde    Ⅰ部位的重迭)。这将由下列事实来说明:a.事实上用Alv    Ⅰ和Dde    Ⅰ能取得相同的小牛DNA指纹图谱。

b.最大的片段部是比更小的片段具有更强烈的杂交(因为了们含有相应的更多的1.720随体重复的单元;最大的小牛DNA片段含有这些单位中的440个)。在人体中,区带强度不是连续地随着大小高增加的。

c.几乎所有的小牛DNA指纹图谱片段被Hha    Ⅰ所切断,它在1.720重复的单位中一次切断(请见上述,没有显示数据)。

d.这父牛(第2号)在Alv    Ⅰ消化淮中几乎没有杂交片段,这揭示了含有这些变种重复阻断的1.720随体DNA的区己在这动物中缺失了。

e.这母牛(第1号)和小牛(第3号)的DNA指纹图谱是近似相同,这母牛对缺失可能是杂合的,这缺失与在公(父)牛中所看到的是一样的,而且已偶而地把这非缺失的染色体(即所有的区带)传导到这小上,因崦,所有这些区带是相连接的,不能象在人体中所发生的那样,自由地传导到下一代中。

然而,所有五条进行试验的牛显示了不同的“随体”DNA指纹图谱模式,而且,这些异乎寻常型别的指纹图谱可以用于个体鉴别方面,虽然并不是用于提供多地点标志物信息。

人们可以成功地操作使用某些探查物,其中在式(1)中n不需要等于3。在这样的探查物中,至少有一对(J.核心(Core).K)的重复能够从至少两个含有核心的DNA顺序的其他重复中分离。因此,能够构成足够长的探查物,其中被“非核心”DNA顺序所分离的(J.Core.K)顺序成对地排列。

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CN104004710B *9 May 200129 Sep 2017Xy有限责任公司具有高纯度x-染色体和y-染色体的精子群
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30 Jul 1986C06Publication
2 Mar 1988C10Request of examination as to substance
23 Oct 1991C13Decision
12 May 1993C20Patent right deemed to be abandoned