CN1977167A - 酶检测技术 - Google Patents
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Abstract
提供一种用于检测酶或酶抑制剂的存在或数量的诊断试验试剂盒。所述诊断试剂盒利用反应性复合物来方便酶或酶抑制剂的检测。所述反应性复合物包括与(例如,共价键合、物理吸附,等等)报道分子和特异性结合构件连接的底物。在一个实施方案中,例如,将肽、蛋白或糖蛋白底物连接到报道分子(例如染色的胶乳颗粒)和特异性结合构件(例如,生物素化的化合物)上。在这个实施方案中,底物为蛋白水解酶提供裂解目标。具体地,接触反应性复合物时,蛋白水解酶裂解底物并释放出报道分子和/或特异性结合构件。由释放的报道分子所显示的信号可用来指示试验样品内酶或酶抑制剂的存在或数量。
Description
发明背景
常常需要确定试验样品内特定的酶的存在或数量。在一些情况中,仅仅是酶的存在就可以,例如,指示组织或器官损伤的存在。同样地,异常的酶浓度也可指示其它病症,如细菌或病毒的感染。举例来说,认为蛋白酶(例如,天冬氨酸蛋白酶)和金属肽酶会增加白色念珠菌的致病性,白色念珠菌是可以引起念珠菌性阴道炎(“酵母菌感染”)的微生物。试验样品中酶的存在或浓度还可以作为一些类型的癌症和其它病症的诊断标志。举例来说,前列腺-特异性的抗原(PSA)是一种公知的前列腺癌的标志。其它诊断标志的例子包括组织蛋白酶B(癌症)、组织蛋白酶G(肺气肿、类风湿性关节炎、炎症)、纤溶酶原激活物(血栓形成、慢性炎症、癌症)和尿激酶(癌症)。
一种用于检测酶的存在的常规方法描述于Braach-Maksvvtis等人的美国专利No.6,348,319。Braach-Maksvvtis等人通过检测由酶消化的底物而发挥作用。例如,Braach-Maksvvtis等人的图1说明了包括第一区域11和第二区域12的装置10。第一区域11具有聚合物珠粒13(载体),它经由肽接头15与链霉抗生物素蛋白14(报道分子)相连,该肽接头15可被蛋白酶16裂解。当加入蛋白酶16时,链霉抗生物素蛋白14被释放出来并传到第二区域12,第二区域12包括生物传感器膜17,它通过膜阻抗的变化来检测链霉抗生物素蛋白的存在(第5栏,II.25-30)。可是,不幸地,由Braach-Maksvvtis等人描述的技术极其复杂并且对于一些类型的应用成本过高,例如需要通过患者(自诊断或借助于医务人员)的相对快速的诊断。
因而,目前需要存在一种简单和便宜的技术来精确地检测试验样品内酶的存在。
发明概述
根据本发明的一个实施方案,公开了一种用于检测试验样品内的酶或其抑制剂的诊断试剂盒。所述试剂盒包含许多种反应性复合物,每种反应性复合物包含与报道分子和特异性结合构件连接的底物。所述底物可被酶(例如,水解酶)裂解。在一个实施方案中,例如,所述报道分子包括用可检测的物质标记的颗粒。该试剂盒还包含层析介质(例如,多孔膜),它能被置于与试验样品连通中。层析介质限定第一检测区域,在该第一检测区域内能够俘获所述的特异性结合构件。能够在第一检测区域内产生第一检测信号,例如通过固定在其中的报道分子来产生第一检测信号。所述第一检测信号的强度可以与试验样品内酶的数量成反比,并且也可以与试验样品内酶抑制剂的数量成正比。
在某些实施方案中,层析介质还可以包含第二检测区域,在该第二检测区域能够俘获报道分子。例如,在一个实施方案中,在对报道分子具有亲和性的第二检测区域内接收材料。能够在第二检测区域内第二检测信号,例如通过固定在其中的报道分子来产生。第二检测信号的强度可以与试验样品内酶的数量成正比,并且也可以与试验样品内酶抑制剂的数量成反比。
根据本发明的另一实施方案,公开了一种用于检测试验样品内的酶或其抑制剂的方法。所述方法包括试验样品与许多种反应性复合物接触以形成培养混合物,每种反应性复合物包含与报道分子和特异性结合构件连接的底物。所述底物可被酶裂解以释放所述报道分子和特异性结合构件,所述报道分子能够直接或间接地产生检测信号。所述方法还包括向层析介质施加培养混合物,该层析介质限定第一检测区域,在该第一检测区域内能够俘获特异性结合构件。确定在第一检测区域内检测信号的存在或强度。以下更详细地论述本发明的其它特征和方面。
附图简述
在本说明书的剩余部分中引用以下附图,对本领域的普通技术人员更具体地阐述本发明的全部和能够公开的内容,包括其最佳方式:
图1是一个可用于本发明的诊断试验试剂盒的测定装置的实施方案的透视图;
图2是一个对于报道分子共价键合到底物上的实施方案的图解说明;和
图3是一种可用于本发明的一个实施方案来检测试验样品内酶的存在或数量的测定技术的简图。
在本说明书和附图中引用符号的重复使用意在表示本发明的相同或相似的特征或元件。
代表性实施方案的详细说明
定义
如在此使用,术语“试验样品”泛指怀疑包含酶和/或酶抑制剂的材料。例如,所述试验样品可以得到或来源于生物来源,例如生理性液体,包括血液、组织液、唾液、眼睛晶状体、脑脊液、汗、尿、乳汁、腹水液、粘液、滑液、腹膜液、阴道液、羊水,等等。除生理性液体之外,还可以使用其它液体样品(例如,水、食品、等等)用于环境或食品生产的测定。此外,固体材料可用作试验样品。所述试验样品可以以从来源获得的方式直接使用或在修饰样品特性的预处理之后使用。例如,此类预处理可包括从血液制备的血浆、稀释的粘性流体,等等。预处理的方法还可包括过滤、沉淀、稀释、蒸馏、混合、浓缩、干扰组分的失活、试剂的加入,等等。而且,还可以有益地修饰固体试验样品以形成液体介质、释放酶和/或酶抑制剂,等等。
详细说明
现在将详细地参照本发明的多种实施方案,在下文中阐述其中的一个或多个实施例。提供各个实施例作为本发明的说明,但不是对本发明的限制。事实上,显然本领域技术人员可以对本发明作出不脱离本发明的范围或精神的各种修饰和改变。举例来说,说明或描述为一个实施方案的一部分的特征可以用在另一实施方案中以产生更进一步的实施方案。因此,本发明意在包括这样的改进和变更,并将它们归入所附的权利要求和它们的同等物的范围之内。
本发明通常涉及用于检测酶或酶抑制剂的存在或数量的诊断试验试剂盒。所述诊断试剂盒利用反应性复合物来方便酶或酶抑制剂的检测。所述反应性复合物包括与报道分子和特异性结合构件连接(例如,共价键合、物理吸附,等等)的底物。在一个实施方案中,例如,肽、蛋白质或糖蛋白底物与报道分子(例如,染色胶乳颗粒)和特异性结合构件(例如,生物素化的化合物)连接起来。在此实施方案中,底物为蛋白水解酶提供裂解目标。具体地,在与反应性复合物接触时,蛋白水解酶裂解底物并释放报道分子和/或特异性结合构件。然后可以将由释放的报道分子直接或间接地产生的信号来显示试验样品内酶或酶抑制剂的存在或数量。
可根据本发明检测各种类型的酶。例如,可以检测转移酶、水解酶、裂合酶,等等。在一些实施方案中,研究的酶是“水解酶”或“水解作用酶”,其是指促进水解反应的酶。此类水解酶的例子包括,但不限于蛋白酶、肽酶、脂肪酶、核酸酶、同-或杂-低聚糖酶、同-或杂-多糖酶、磷酸酯酶、硫酸酯酶、神经氨酸苷酶和酯酶。在一个实施方案中,例如,可以检测肽酶。“肽酶”是裂解存在于短肽中的肽键的水解酶。肽酶的例子包括,但不限于金属肽酶、二肽基肽酶I、II或IV;等等。在另一实施方案中,可以检测蛋白酶。“蛋白酶”是裂解比较长的肽和蛋白质中的肽键的水解酶。可根据本发明检测的蛋白酶的例子包括,但不限于丝氨酸蛋白酶(例如,胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、PSA,等等)、天冬氨酸蛋白酶(例如,胃蛋白酶)、巯基蛋白酶(例如,促激素巯基蛋白酶)、金属蛋白酶、酸性蛋白酶和碱性蛋白酶。还有其它的酶描述于Bronstein等人的美国专利No.6,243,980和Yue等人的2004/0081971,在此以它们的全部内容引入作为参考用于所有目的。
同样地,也可以根据本发明检测任何各种已知的酶抑制剂。例如,已知的水解酶抑制剂包括,但不限于蛋白酶、肽酶、脂肪酶、核酸酶、同-或杂-低聚糖酶、同-或杂-多糖酶、磷酸酯酶、硫酸酯酶、神经氨酸苷酶和酯酶的抑制剂。蛋白酶抑制剂可以包括,例如,天冬氨酸蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂,酸性或碱性蛋白酶抑制剂,等等。一些具体的蛋白酶抑制剂的例子包括benzamideine、吲哚、胃蛋白酶抑制剂、卵巨球蛋白、氟哌啶醇、过渡态模拟物,等等。
如上所述,将反应性复合物用于本发明来检测酶或酶抑制剂的存在或数量。所述反应性复合物包括与报道分子和特异性结合构件连接的底物。术语“底物”泛指通过酶在其上的化学作用以形成产物的物质。所述底物可以是天然存在或是合成的。一些合适的水解酶的底物包括,例如,酯、酰胺、肽、醚或其它具有可被酶水解的键的化合物。酶催化水解反应可以,例如,产生作为主产物的羟基或胺化合物和作为副产物的游离磷酸盐、乙酸盐,等等。具体的底物类型可以包括,例如,蛋白质或糖蛋白、肽、核酸(例如,DNA和RNA)、碳水化合物、脂类、酯、其衍生物,等等。举例来说,一些合适的肽酶和/或蛋白酶的底物可以包括肽、蛋白质和/或糖蛋白,例如酪蛋白(例如,β-酪蛋白、偶氮酪蛋白,等等)、白蛋白(例如,牛血清白蛋白(BSA))、血红蛋白、肌红蛋白、角蛋白、明胶、胰岛素、蛋白聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原、弹性蛋白,等等。还有其它合适的底物描述于Simonsson等人的美国专利No.4,748,116;Diamond等人的美国专利No.5,786.137;Rao等人的美国专利No.6,197,537;和Henderson等人的美国专利No.6,235,464;Nemori等人的美国专利No.6,485,926,在此以它们的全部内容引入作为参考用于所有目的。
特异性结合构件通常可以是任何特异性的结合对的单元,即两个不同的分子,其中一个分子化学和/或物理地与第二个分子结合起来。举例来说,免疫活性的特异性结合构件可以包括抗原、半抗原、抗体(初级或次级)及其复合物,包括由重组DNA方法或肽合成形成的抗原、半抗原、抗体(初级或次级)及其复合物。抗体可以是单克隆或多克隆抗体、重组蛋白质或其混合物或片段,以及抗体和其它特异性结合单元的混合物。此类抗体的制备方法和它们用作特异性结合构件的适合性的详细情况是本领域技术人员所熟知的。其它常见的特异性结合构件包括,但不限于生物素和抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白(neutravidin)、captavidin、或抗生物素抗体;蛋白A和G;碳水化合物和植物凝血素、互补的核苷酸序列(包括用于检测目标核苷酸序列的DNA杂交试验的探针和俘获的核苷酸序列);互补的肽序列包括由重组方法形成的肽序列;效应物和受体分子;激素和激素结合蛋白;酶辅助因子和酶、酶抑制剂和酶;其衍生物,等等。此外,特异性的结合对可以包括所述原始的特异性结合构件的类似物、衍生物和/或片段。
除了被连接到特异性结合构件外,如上面描述,底物还连接到报道分子以形成所述的反应性复合物。所述报道分子可包含任何能直接或间接地产生可检测信号的物质。合适的可检测的物质可包括,例如,色原;发光的化合物(例如,荧光,磷光,等等);放射性化合物;可见的化合物(例如,胶乳或金属的颗粒,如金);脂质体或其它含有产生信号的物质的囊泡;酶和/或底物,等等。例如,一些适于用作可检测的物质的酶描述于Litman等人的美国专利No.4,275,149,在此以其全部内容引入作为参考用于所有目的。酶/底物体系的一个例子是酶是碱性磷酸酯酶并且底物是硝基蓝四唑-5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯或其衍生物或类似物,或底物是4-甲基伞形花基(umbelliferyl)-磷酸酯。其它合适的报道分子描述于Jou等人的美国专利No.5,670,381和Tarcha等人的No.5,252,459,在此以它们的全部内容引入作为参考用于所有目的。
在一些实施方案中,报道分子可含有产生光学上可检测信号的发光化合物。所述发光化合物可以是分子、聚合物、树枝状物、颗粒,等等。例如,合适的荧光分子可包括,但不限于荧光素、铕螯合物、藻胆蛋白、若丹明和它们的衍生物和类似物。其它合适的荧光化合物是通常被称为“量子点”的半导体纳米晶体。例如,此类纳米晶体可含有通式CdX的核,其中X是Se、Te、S,等。所述纳米晶体还可以用通式YZ的覆盖壳钝化,其中Y是Cd或Zn,和Z是S或Se。其它合适的半导体纳米晶体的例子还描述于Barbera-Guillem等人的美国专利No.6,261,779和Dapprich等人的No.6,585,939,在此以它们的全部内容引入作为参考用于所有目的。
此外,合适的发磷光的化合物可包括一种或多种金属的金属复合物,所述一种或多种金属为例如钌、锇、铼、铱、铑,铂、铟、钯、钼、锝、铜、铁、铬、钨、锌,等等。特别优选的是钌、铼、锇、铂和钯。所述金属配合物可含有一个或多个促进复合物在水溶液或非水环境中的溶解度的配体。例如,一些合适的配体的例子包括,但不限于吡啶;吡嗪;异烟酰胺;咪唑;联吡啶;三联吡啶;菲咯啉;联吡啶并吩嗪;卟啉、卟吩,及其衍生物。此类配体可以,例如,被烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、羧酸酯、醛、羧酰胺、氰基、氨基、羟基、亚氨基、羟羰基、氨羰基、脒、胍盐、酰脲、含硫基团、含磷基团,和N-羟基-琥珀酰亚胺的羧酸酯所取代。
卟啉和卟吩金属复合物含有与亚甲桥偶联在一起的吡咯基团以形成带有金属螯合内腔的环状结构。这些分子中有许多分子都在室温下在合适的溶剂中(例如,水)和无氧环境下表现出强烈的磷光性质。一些合适的能显示出磷光性质的卟啉复合物包括,但不限于铂(II)粪卟啉-I和III、钯(II)粪卟啉、钌粪卟啉、锌(II)-粪卟啉-I,其衍生物,等等。类似地,一些合适的能显示出磷光性质的卟吩复合物包括,但不限于铂(II)四-内消旋-氟苯基卟吩和钯(II)四-内消旋-氟苯基卟吩。还有其它合适的卟啉和/或卟吩复合物描述于Schmidt等人的美国专利No.4,614,723;Hendrix的No.5,464,741;Soini的No.5,518,883;Ewart等人的No.5,922,537;Saqner等人的No.6,004,530;和Ponomarev等人的No.6,582,930,在此以它们的全部内容引入作为参考用于所有目的。
联吡啶金属复合物也可被用作发磷光的化合物。一些合适的联吡啶复合物的例子包括,但不限于二[(4,4′-甲氧甲酰)-2,2′-联吡啶]2-[3-(4-甲基-2,2′-联吡啶-4-基)丙基]-1,3-二氧戊环钌(II);双(2,2′-联吡啶)[4-(丁-1-醛)-4′-甲基-2,2′-联吡啶]钌(II);二(2,2′-联吡啶)[4-(4′-甲基-2,2′-联吡啶]-4′-基)-丁酸]钌(II);三(2,2′-联吡啶)钌(II);(2,2′-联吡啶)[二-二(1,2-二苯基膦基)亚乙基]2-[3-(4-甲基-2,2′-联吡啶-4′-基)丙基]-1,3-二氧戊环锇(II);二(2,2′-联吡啶)[4-(4′-甲基-2,2′-联吡啶)-丁胺]钌(II);二(2,2′-联吡啶)[1-溴-4(4′-甲基-2,2′-联吡啶-4-基)丁烷]钌(II);二(2,2′-联吡啶)马来酰亚胺己酸,4-甲基-2,2′-联吡啶-4′-丁酰胺钌(II),等等。还有其它合适的可以显示出磷光性质的金属复合物描述于Richter等人的美国专利No.6,613,583;Massev等人的No.6,468,741;Meade等人的No.6,444,423;Massev等人的No.6,362,011;Bard等人的No.5,731,147;和Massev等人的No.5,591,581,以它们的全部内容在此引入作为参考用于所有目的。
在一些情况中,利用“时间-分辨的”发光检测技术。时间-分辨的检测包括用一个或多个光的短脉冲激发发光化合物,然后在测量剩余发光信号前的激发之后通常等待一定的时间(例如,大约1-100微秒之间)。用这样的方式除去任何短暂的磷光或荧光本底信号以及分散的激发辐射。这种除去许多种本底信号的能力可导致敏感性比常规的荧光或磷光大2-4个数量级。因此,通过利用某些发光材料的特征,将时间-分辨的检测用来减少来自发射源或散射作用(由激发辐射的散射所产生)的本底信号。
为了有效地作用,时间-分辨的技术通常需要相对长的发射持续时间用于发光化合物。这就期望所述化合物在任何短暂的本底信号消散以后发射它的信号。此外,长的荧光持续时间使采用廉价的电路用于时间门测定成为可能。例如,所述可检测的化合物可以有大于大约1微秒的荧光持续时间,在一些实施方案中大于大约10微秒,在一些实施方案中大于大约50微秒,以及在一些实施方案中从大约100微秒到大约1000微秒。此外,所述化合物还可以具有相对大的“斯托克斯频移”。术语“斯托克斯频移”通常被定义为与激发线或带相比,发光辐射到比较长的发射波长的谱线或带的位移。相对大的斯托克斯频移让发光化合物的激发波长与它的发射波长保持很远并且是合乎需要的,因为激发和发射波长之间的巨大差异使除去来自发射信号的反射激发辐射变得容易。此外,巨大的斯托克斯频移还能最小化来自样品中的发光分子和/或由于蛋白质或胶体的光散射的干扰,所述蛋白质或胶体与一些体液(例如,血液)一起存在。另外,巨大的斯托克斯频移还能将对于为除去本底干扰的昂贵、高精度的过滤器的需求最小化。例如,在一些实施方案中,所述发光化合物具有大于大约50纳米的斯托克斯频移,在一些实施方案中大于大约100纳米,以及在一些实施方案中从大约100到大约350纳米。
例如,一种合适的用于时间-分辨的检测技术的荧光化合物类型包括钐(Sm(III))、镝(Dy(III))、铕(Eu(III))和铽(Tb(III))的镧系元素螯合物。在所述螯合物在基本上较短的波长的激发之后,此类螯合物可以显示出强烈地红外移动、窄带、长期的发射。通常,由于位于分子中镧系元素附近的发色团,所述螯合物具有强烈的紫外激发带。在通过所述发色团的激发之后,激发能量可以从激发的发色团转到镧系元素。这遵循镧系元素荧光发射特性。例如,与荧光素的仅仅大约28纳米相比,铕螯合物具有大约250到大约350纳米的特别大的斯托克斯频移。并且,与其它荧光化合物的大约1到大约100毫微秒相比,铕螯合物的荧光是长期的,具有大约100大约1000微秒的持续时间。此外,这些螯合物具有窄的发射光谱,通常在大约50%发射时具有小于大约10纳米的带宽。一种合适的铕螯合物是N-(对-异硫氰酰苄基)-二亚乙基三胺四乙酸-Eu+3。
另外,还可将在水溶液或悬浮液中惰性、稳定和固有地荧光的镧系元素螯合物用于本发明以取消对分子团-形成试剂的需要,分子团-形成试剂常常用于保护具有有限溶解度和在水溶液或悬浮液中有猝灭问题的螯合物。一个此类螯合物的例子是4-[2-(4-异硫氰酰苯基)乙炔基]-2,6-二{[N,N-二(羧甲基)氨基]甲基}-吡啶[参考:Lovgren,T.等人,Clin.Chem.42,1196-1201(1996)]。一些镧系元素螯合物还显示出特别高的信噪比。例如,一种此类螯合物是四配位基的β-二酮酯-铕螯合物[参考:Yuan,J.和Matsumoto,K.;Anal.Chem.70,596-601(1998)]。除了上面描述的荧光化合物之外,其它适用于本发明的化合物描述于Mullinax等人的美国专利No.6,030,840;Davidson的No.5,585,279;Singer等人的No.5,573,909;Wieder等人的No.6,242,268;和Hemmila等人的No.5,637,509,在此以它们的全部内容引入作为参考用于所有目的。
按照规定,在本发明的一些实施方案中报道分子可间接地产生可检测信号。在这种情况中,报道分子可以不必特异性地含有可检测的物质,而是反而能对可检测的物质有影响以产生检测信号。例如,在一些实施方案中,报道分子可以是特异性的结合对的一个单元,例如上面描述的。例如,可以将作为特异性结合对的一个单元的报道分子放入并与探针接触,所述探针与特异性结合对的另一个单元共轭。因此,释放的报道分子将与共轭的探针结合起来,然后使用本领域的技术人员所熟知的技术容易地检测(直接或间接地)。在下文将更详细解释,当报道分子含有特异性结合构件时,通常期望特异性结合构件不同于连接到底物的另一个特异性结合构件并且对另一个特异性结合构件没有特定的结合亲和性。
不管报道分子是直接或是间接地产生信号,它可能含有颗粒(有时称为“珠”或“微珠”。尤其是,颗粒提高了报道分子穿过层析介质并且固定在检测区域内的能力,例如如下所述。例如,可以使用天然存在的颗粒,如核、支原体、质粒、质体、哺乳动物细胞(例如,红细胞影)、单细胞的微生物(例如,细菌)、多糖(例如,琼脂糖),等等。此外,也可以利用合成的颗粒。例如,在一个实施方案中,用荧光或有色染料标记的胶乳粒子。虽然可以使用任何的胶乳颗粒,但是胶乳粒子通常是由聚苯乙烯、丁二烯苯乙烯、苯乙烯丙烯酸-乙烯基三元共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚乙酸乙烯基酯、聚乙烯基吡啶、聚二乙烯基苯、聚对苯二甲酸亚丁基酯、丙烯腈、乙烯氯丙烯酸酯等,或其醛、羧基、氨基、羟基或酰肼衍生物形成的。其它合适的颗粒描述于Jou等人的美国专利No.5,670,381和Tarcha等人的No.5,252,459。市场上可买到的合适的荧光颗粒的例子包括由Molecular Probes,Inc.以商品名“FluoSphere”(Red 580/605)和“TransfluoSphere”(543/620)出售的荧光羧化物微球,以及也是由Eugene,Oregon.的MolecularProbes,Inc.出售的“Texas Red”和5-和6-羧四甲基若丹明。另外,市场上可买到的合适的染色胶乳微粒的例子包括由Fishers,Indiana的Bangs Laboratories,Inc.出售的羧基胶乳珠。
使用时,所述颗粒的形状常常可以变化。举例来说,在一个具体的实施方案中,颗粒是球形的。但是,应当清楚其它形状也是本发明所考虑的,如板、棒、圆片、条、管、不规则的形状,等等。此外,所述颗粒的尺寸也可以变化。例如,所述颗粒的平均尺寸(例如,直径)可以从大约0.1纳米到大约1,000微米,在一些实施方案中,从大约0.1纳米到大约100微米,以及在一些实施方案中,从大约1纳米到大约10微米。例如,“微米级”的颗粒是通常所期望的。使用时,此类“微米级”的颗粒可具有大约索梅微米到大约1,000微米的平均尺寸,在一些实施方案中,从大约1微米到大约100微米,以及在一些实施方案中,从大约1微米到大约10微米。同样地,也可以使用“纳米级”的颗粒。此类“纳米级”的颗粒可具有大约0.1纳米到大约10纳米的平均尺寸,在一些实施方案中,从大约0.1纳米到大约5纳米,以及在一些实施方案中,从大约1纳米到大约5纳米。
使用任何各种公知的技术,通常将所述的特异性结合构件与报道分子连接于所述底物。例如,可以使用羧基、氨基、醛、溴乙酰基、碘乙酰基、巯基、环氧和其它活性官能团来实现特异性结合构件和/或报道分子到底物的共价连接,以及通过残余的游离基和自由基的偶合反应可以实现。表面官能团也可以作为官能化的共同单体被引入,因为所述报道分子的表面可含有比较高的极性基团表面浓度。在某些情况下,所述特异性结合构件和/或报道分子能直接共价键合到底物,而不需要进一步的修饰。同样应该理解,除了共价键合以外,其它的连接技术(如物理吸附)也可以用于本发明。还有其它的非共价键合技术可使用抗体和/或抗原,如次级抗体(例如,抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白和/或生物素)。
现在将更详细地描述一种具体的用于将报道分子和特异性结合构件共价键合到底物的技术。在这个具体实施方案中,底物是β-酪蛋白,报道分子是染色颗粒,而特异性结合构件是生物素衍生物。例如,报道分子可以是从Molecular Probes,Inc.中获得的名为“FiuoSphere”的红色羧基胶乳颗粒。同样地,特异性结合构件可以是磺酸基琥珀酰亚胺基-6-(生物素-酰胺基)己酸酯,其是从Rockford,Illinois的Pierce Biotechnology,Inc.得到的,名为EZ-Link磺酸基-NHS-LC-生物素。认为用于制备此类NHS-活化的生物素的技术描述于Bremmer等人的美国专利No.5,872,261,以其全部内容在此引入作为参考用于所有目的。
对于与β-酪蛋白共价结合的染色颗粒,用碳化二亚胺(例如,乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC))首次活化颗粒表面上的羧基,如图2所示。因为蛋白和糖蛋白底物(例如,β-酪蛋白)通常具有伯胺基团(NH2),例如在赖氨酸(K)残余物的侧链和/或各个多肽的N-末端,然后所述活化的羧基可与底物的伯胺(-NH2)基团反应以形成酰胺键。这个反应可以在缓冲液,如磷酸缓冲盐水(PBS)(例如,pH值7.2)、2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)(例如,pH值5.3)或硼酸盐缓冲液(例如,pH值8.5)中发生。如果需要,然后可将产生的反应性复合物用乙醇胺保护,例如,来保护任何其余的活性部位。
在有些相似的方法中,基于生物素的特异性结合构件也可以被共价键合到β-酪蛋白。例如,NHS-活化的生物素可以与底物上存在的伯胺基团(任选地在缓冲液的存在下)形成共价酰胺键。将一个此类反应的例子显示在下面:
一旦形成,使用者可以让试验样品与反应性复合物一起培养一段时间。例如,本领域的技术人员依靠所研究的酶的活性能容易地确定出用于酶-催化反应的培养时间,其依次部分地取决于温度、pH值、底物浓度、抑制剂(竞争性的(与酶结合)、无竞争性的(与酶-底物复合物结合)或非竞争性的(与酶和/或酶-底物复合物结合))的存在。可根据需要有选择地控制这些因素以增加或减少培养时间。例如,培养时间可以大于大约1分钟,在一些实施方案中从大约5分钟到大约50分钟,在一些实施方案中从大约10分钟到大约25分钟。同样地,可以有选择地控制pH值以促进酶的活性。例如,试验样品内碱性物质的高水平会导致pH值对于一些酶的最佳活性而言过高,例如大于8。具体地,酶可在pH值从大约3到大约8的水平具有最佳活性,以及在一些实施方案中,pH值从大约4到大约7。因此,如果需要,可以使用缓冲液或其它的改变pH值的化合物来保持所需要的pH值。
在培养之后,试验样品内存在的任何酶通常将裂解至少一部分反应性复合物的底物。结果,可以形成各种物种,包括释放的报道分子、释放的特异性结合构件、部分裂解的复合物(例如,酶-报道分子-底物-特异性结合构件),以及未反应的复合物(例如,报道分子-底物-特异性结合构件)。较长的培养时间和较大的酶浓度可导致得到的培养混合物中释放的报道分子和特异性结合构件的浓度更大。此外,应当清楚,根据底物和酶的性质,“释放的”报道分子和特异性结合构件可以含有或可不必含有复合物的片段。例如,当使用较长链的底物(例如,蛋白质)时,释放的报道分子和特异性结合构件可含有来自蛋白质底物的肽片段。相反,当使用较短链的底物(例如,肽)时,释放的报道分子和特异性结合构件相对地不含这样的片段。
根据本发明,诊断试验试剂盒还包含用于指示报道分子的存在或缺少的测定装置。所述测定装置使用层析介质用于从培养混合物内存在的其它物种中化学分离释放的报道分子。与其它分离技术(如,离心)对比,本发明人发现层析介质可简化并降低产生的众多消费者应用的诊断试验试剂盒的成本,所述诊断试验试剂盒包括所需的一次性试剂盒。
参照图1,例如,现在将更详细地描述根据本发明的测定装置20的一个实施方案,测定装置20可以用来指示酶的存在或数量。如图所示,测定装置20包含任选地由载体21支持的层析介质23。层析介质23可由任何种类的液体能够通过的材料制成,例如流体性的通道、多孔膜,等等。例如,层析介质23可以是由以下材料形成的多孔膜,所述材料例如是,但不限于天然的、合成的或合成修饰的天然存在材料,例如多糖(例如,纤维素材料(如,纸)和纤维素衍生物(如,醋酸纤维素和硝化纤维素));聚醚砜;聚乙烯;尼龙;聚偏二氟乙烯(PVDF);聚酯;聚丙烯;硅石;无机材料,例如减活矾土、硅藻土、MgSO4或其它的与聚合物(如,氯乙烯、氯乙烯-丙烯共聚物和氯乙烯-醋酸乙烯基酯共聚物)一起均匀地分散在多孔聚合物基质中的无机的精细粉碎的材料;布、天然存在的(例如,棉花)和合成的(例如,尼龙或人造丝);多孔的凝胶,如硅胶、琼脂糖、葡聚糖和明胶;聚合膜,如聚丙烯酰胺;等等。在一个具体的实施方案中,层析介质由硝化纤维素和/或聚醚砜材料形成。应该理解术语“硝化纤维素”是指纤维素的硝酸酯,其可以是单独的硝化纤维素,或硝酸和其它酸的混合酯,其它酸例如是具有1-7个碳原子的脂肪族羧酸。
所述载体21可以由任何能够支持层析介质23的材料形成。虽然不要求,但载体21可以是透明的,以便光能容易地从中穿过。另外,通常期望载体21是液体-不能渗透的,以便流过介质的液体不会渗漏过载体21。用于载体的合适的材料的例子包括,但不限于玻璃;聚合材料,如聚苯乙烯、聚丙烯、聚酯(例如,Mylar膜)、聚丁二烯、聚氯乙烯、聚酰胺、聚碳酸酯、环氧化物、甲基丙烯酸酯和聚三聚氰胺;等等。如本领域所熟知的,可将层析介质23浇铸到载体21上,将其中产生的薄片模切成所需的大小和形状。或者,可将层析介质23简单地用例如粘合剂层压到载体21上。在一些实施方案中,将硝化纤维素或尼龙多孔膜粘附到Mylar膜上。粘合剂用于将多孔膜粘合到Mylar膜上,例如是压敏粘合剂。认为这种类型的片状结构是可以从Millipore Corp.(Bedford,Massachusetts)购买到的。其它合适的片状结构的例子描述于Durlev,III等人的美国专利No.5,075,077,以它的全部内容在此引入作为参考用于所有目的。
测定装置20还可以利用吸收性材料28。吸收性材料28常常接收从整个层析介质23流过的液体。如本领域所熟知的,吸收性材料28可以帮助促进毛细管作用和液体流过介质23。
以上描述的培养方法可在试验样品施加到层析介质23之前进行,或作为测定步骤的一部分引入(即,在施加试验样品之后进行培养,例如将试验样品施加到培养孔内)。例如,可将培养混合物直接施加到部分层析介质上,培养混合物可沿着图1中箭头“L”说明的方向通过层析介质23。或者,可将混合物首先施加到样品衬垫22或其它与层析介质23液体连通的材料上。一些合适的可以用于形成样品衬垫22的材料包括,但不限于硝化纤维素、纤维素、多孔聚乙烯衬垫和玻璃纤维过滤纸。如果需要,样品衬垫22还可以包含一种或多种扩散或非扩散地附在其上的测定预处理试剂。
无论如何,层析介质23限定第一检测区域31,在第一检测区域31内能够俘获和检测(例如,间接地)特异性结合构件。例如,在一个实施方案中,将第一接收材料固定在第一检测区域31内,作为用于释放特异性结合构件的固定结合位点,特异性结合构件存在于未反应的复合物上,或特异性结合构件存在于部分裂解的复合物上。例如,在一些实施方案中,第一接收材料可以是生物接收材料。此类生物接收材料是本领域所熟知的并且可以包括,但不限于抗体、抗原、半抗原、生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、captavidin、蛋白质A、蛋白质G、碳水化合物、植物凝血素、核苷酸序列、肽序列、效应物和受体分子、激素和激素结合蛋白、酶辅助因子和酶、酶抑制剂和酶以及其衍生物。当试验样品中酶的浓度开始增加时,释放出更多的报道分子,所述报道分子对在第一检测区域31的接收材料很少或没有特定的结合亲和性。减少的第一检测区域31内报道分子的数量导致信号强度下降。根据信号强度的减少,可以容易地确定酶的存在或浓度。例如,在一个实施方案中,酶的数量与第一检测区域31的信号强度I1成反比。如果需要,可以将信号强度I1对已知的酶浓度范围的酶浓度绘图,以产生强度曲线。根据该强度曲线可将信号强度转变为酶的浓度,以确定未知试验样品中酶的数量。
第一检测区域31通常提供许多不同的检测区域以便使用者能更好地确定试验样品内酶的浓度。每个区域可包含相同或不同的接收材料。例如,检测区域31可以包括两个或多个不同的检测区域(例如,线、点,等等)。使用两个或多个不同的检测区域可以提供一些好处,例如便于半定量和/或抑制由于反应性复合物或其它材料的超限造成的潜在的假阳性。所述检测区域可以以基本上垂直于试验样品流经层析介质23的方向线性排列。同样地,在一些实施方案中,所述检测区域可以以基本上平行于试验样品流经层析介质23的方向线性排列。应该理解第一检测区域31的一个或多个不同的区域可以显示出上述信号强度和酶浓度之间的关系;但是,每个不同的区域不必都显示出这样的关系。例如,在一些实施方案中,多个不同的区域中仅有一个区域显示出信号强度与酶的浓度成反比。其它不同区域的信号强度,例如那些用于减少假阳性的区域,则保持恒定,或显示出信号强度的增加和/或减少。只要检测区域31的至少一个不同的区域满足所述的反比关系,就认为由第一检测区域31显示的信号强度与酶的浓度成反比。
根据本发明,可以根据需要的应用有选择地控制对于所研究酶的检测灵敏度水平。一种具体的用于控制所述检测灵敏度的技术包括控制用于第一检测区域31的第一接收材料的数量。例如,当分析怀疑含有很大浓度的酶的试样时,第一接收材料的数量可以等于或大于需要俘获所用的全部反应性复合物的最小量。因此,如果没有酶存在于试验样品中,则所有反应性复合物将固定在检测区域31和所有报道分子将存在在第一检测区域31内。俘获所有反应性复合物需要的最小数量可以用实验方法来确定,并且通常取决于使用的反应性复合物的数量以及第一接收材料和特异性结合构件之间的结合亲和性。
在需要提高的检测灵敏度的应用(例如,低的怀疑的酶浓度或短的培养时间)中,第一接收材料的数量可以小于俘获所需要使用的全部反应性复合物的最小量。使用这样有限数量的第一接收材料可以提供许多好处,包括降低任何部分裂解的复合物在第一检测区域31被俘获的可能性,否则会导致测定的酶浓度略低于实际的浓度。也就是说,当酶浓度增加时,从反应性复合物释放出更多的特异性结合构件。由于它们的分子尺寸较小,这些释放的特异性结合构件通常比部分裂解的复合物和未反应的复合物更快地到达第一检测区域31,并且因此具有更高的有效结合位点的占据概率。此外,部分裂解的复合物通常还比完全未反应的复合物含有较少的特异性结合构件。这种特异性结合构件数量的减少在统计上减少了部分裂解的复合物与第一检测区域31结合的可能性。
正如以上的讨论,酶浓度和信号强度之间的反比关系可以与试验样品中的实际的酶浓度相关联。但是,因为并不总是需要使用酶浓度“增加”与信号强度“减少”相互关联的测定形式(例如,消费者应用),所以本发明还提供酶浓度“增加”与信号强度“增加”直接相关联的实施方案。在此类情况下,可以利用另外的检测区域。例如,再次参照图1,层析介质23还可限定位于第一检测区域31下游的第二检测区域35。第二检测区域35可以提供一个或多个不同的区域(例如,线、点,等等),并且可以位于任何相对于试验样品流动的方向。
在第二检测区域35内,可以俘获和检测任何在检测区域31没有与第一接收材料结合的释放的报道分子、部分裂解的复合物或未反应的复合物。俘获释放的报道分子的方法可取决于所用报道分子的性质。在一些实施方案中,可将第二接收材料固定在用于俘获报道分子的第二检测区域35内。例如,第二接收材料可以是生物接收材料,例如,但不限于抗体、抗原、半抗原、生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、captavidin、蛋白质A、蛋白质G、碳水化合物、植物凝血素、核苷酸序列、肽序列、效应物和受体分子、激素和激素结合蛋白、酶辅助因子和酶、酶抑制剂和酶,以及其衍生物。因为期望第二接收材料特定地结合到报道分子,所以第二接收材料通常不同于第一接收材料。
例如,释放的报道分子可以与选择的对第二检测区域35内的第二接收材料有亲和性的特异性结合构件结合。可以使用任何公知的技术将特异性结合构件结合到报道分子,例如通过如上所述的共价键合和/或物理吸附。在一个具体的实施方案中,将所述报道分子的羧基活化并与抗体的氨基反应形成酰胺键。在这种情况下,释放的报道分子可通过抗体和接收材料之间的结合而被固定在第二检测区域35内,以便检测由可检测的物质产生的信号。例如,第一接收材料可以是次级抗体(如抗生物素抗体,例如山羊抗小鼠IgG抗体)、抗生物素蛋白(高阳离子的66,000道尔顿糖蛋白)、链霉抗生物素蛋白(非糖基化的52,800道尔顿蛋白质)、中性抗生物素蛋白(去糖基的抗生物素蛋白衍生物)或captavidin(硝化的抗生物素蛋白衍生物)。在这个实施方案中,第一接收材料可以与生物素(小鼠IgG抗体)的特异性结合构件结合起来。例如,所述报道分子可以是与C反应蛋白结合的荧光染色颗粒,其可以与单克隆抗体第二接收材料(例如,抗C反应蛋白(CRP)单克隆抗体)结合起来。
当然,也可以使用任何其它的用于俘获和检测释放的报道分子的适用技术。例如,在一些实施方案中,可将非生物接收材料固定在用于俘获释放的报道分子的第二检测区域35内。此类非生物接收材料在俘获,例如包含标记颗粒的释放的报道分子中是特别有用的。例如,在一个实施方案中,所述接收材料是聚电解质。聚电解质可以有正或负电荷,以及通常为中性的净电荷。一些合适的具有净正电荷的聚电解质的例子包括,但不限于聚赖氨酸(可从Sigma-Aldrich ChemicalCo.Inc.(St.Louis,Missouri)购买到)、聚乙烯亚胺;环氧氯丙烷-官能化的聚胺和/或聚酰氨基胺,如(二甲胺-环氧氯丙烷)共聚物;聚二烯丙基二甲基-氯化铵;阳离子纤维素衍生物,如纤维素共聚物或用季铵水溶性单体接枝的纤维素衍生物;等等。在一个具体的实施方案中,可以利用CelQuatSC-230M或H-100(可从National Starch& Chemical,Inc.获得),它们是含有季铵水溶性单体的纤维素衍生物。此外,一些合适的具有净负电荷的聚电解质的例子包括,但不限于聚丙烯酸,如(乙烯-甲基丙烯酸钠盐)共聚物,等等。同样应该理解其它聚电解质也可以用于本发明,如两亲的聚电解质即,具有极性和非极性的部分)。例如,一些合适的两亲的聚电解质的例子包括,但不限于聚(苯乙烯基-嵌段-N-甲基2-乙烯基吡啶碘化物)和聚(苯乙烯基-嵌段-丙烯酸),二者都可从Polymer Souree,Inc.(Dorval,Canada)获得。其它的聚电解质的例子更详细地描述于Song等人的美国专利申请公布No.2003/0124739,以它全部内容在此引入作为参考用于所有目的。
虽然通常可以利用任何聚电解质,但是选择用于具体应用的聚电解质可以取决于释放的报道分子的性质而变化。特别地,聚电解质分布电荷让其结合到具有相反电荷的物质上。因此,例如,具有净正电荷的聚电解质常常会较好地与带阴电荷的释放的报道分子(例如,染色颗粒)结合,而具有净负电荷的聚电解质常常会较好地结合到带阳电荷的释放的报道分子。因此,在这种情况中,这些分子间的离子相互作用让所需要的结合发生在第二检测区域35内。然而,虽然主要是利用离子相互作用来达到所需要的结合,但是也发现聚电解质可以与具有相似电荷的报道分子结合。
除了使用接收材料之外,还可以利用其它的俘获技术。例如,在一个实施方案中,报道分子可以含有能够被磁性装置俘获的磁性物质。通常,如果材料受施加磁场的影响,例如,如果一种材料被吸引或排斥或者具有可检测的磁化率或感应,则认为该材料是“磁性的”或“有磁力感应的”。例如,一些合适的可以用来给予磁性的有磁力感应的物质的例子包括但不限于顺磁性物质、超顺磁性物质、铁磁体物质、亚铁磁性材料和变磁性材料。具体的例子是金属,例如铁、镍、钴、铬和锰;镧系元素,例如钕、铒;合金,例如铝、镍、钴或铜的磁性合金;氧化物,例如氧化铁(Fe3O4)、氧化亚铁(Fe2O3)、氧化铬(CrO2)、氧化钴(CoO),氧化镍(NiO2)或氧化锰(Mn2O3);复合材料,例如铁酸盐;以及固态溶液,例如带有氧化铁的磁铁矿。在一些实施方案中,报道分子含有用如上所述的可检测的物质染色的磁性颗粒。
在一个实施方案中,磁性装置靠近(例如,在下面)由层析介质23限定的第二检测区域35。用这样的方式,磁性装置可以将释放的报道分子,以及任何部分裂解的或未反应的复合物固定在第二检测区域35内。任何磁性装置可以用于本发明。例如,磁场发生器可以用来产生引起磁性物质反应的磁场。合适的磁场发生器包括,但不限于永磁体和电磁体。一些市场上可买到的合适的磁性分离装置的例子包括由Dynal,Inc.(Lake Success,New York)生产的Dynal M PC系列的分离器,其使用位于容纳试验介质的容器外部的永磁体。其它的磁性设备描述于Liberti等人的美国专利No.5,200,084;Tuunanen等人的美国专利No.5,647,994;Wang等人的美国专利No.5,795,470;以及Siddiqi的美国专利No.6,033,574,以它们的全部内容在此引入作为参考用于所有目的。
当报道分子含有直接可检测的物质时,由于释放的报道分子和/或部分裂解的复合物的存在,酶浓度的增加导致第二检测区域35的信号强度I2增加。根据信号强度的增加,可以容易地确定酶的存在或浓度。例如,在一个实施方案中,酶的数量与第二检测区域35的信号强度I2成正比,如果需要,可将信号强度I2对已知酶浓度范围的酶浓度绘图以产生强度曲线。根据该强度曲线可将信号强度转变为酶的浓度,以确定未知试验样品中酶的数量。应该理解,正如以上对于第一检测区域31的讨论,只要第二检测区域35的至少一个不同的区域满足所述正比关系,就认为由第二检测区域35显示的信号强度与酶的浓度成正比。
并且,在第一检测区域31的信号强度(I1)和第二检测区域35(I2)之间也可存在反比关系。例如,因为存在预定量的报道分子,所以在第二检测区域35俘获的数量与在第一检测区域31俘获的数量成反比。这种反比关系的结果是在一些情况中通过比较两个检测区域的信号强度可以在扩大范围更有效地测定酶的浓度。例如,在一个实施方案中,酶的数量正比于信号强度“I2”与信号强度“I1”的比值。基于该比值落入的范围,可以确定出酶的一般浓度范围。如果需要,可以将I2与I1的比值对已知范围酶浓度的酶浓度绘图,以产生强度曲线。根据该强度曲线可将信号强度比值转变为酶的浓度,以确定未知试验样品中酶的数量。应该注意到可将I1和I2之间的另一种数学关系对酶浓度绘图以产生强度曲线。例如,在一个实施方案中,可将I2/(I2+I1)的值对酶浓度绘图以产生强度曲线。
如上所述,本发明的某些实施方案可以利用不可直接检测的报道分子。因此,在释放时,通常期望报道分子与用于随后的检测的物质以一些方式相互作用。例如,可以使用能产生可检测信号的探针,将探针装配起来与释放的报道分子结合。例如,探针可以含有用可检测的物质标记或以别的方式施加的颗粒。在一些情况下,希望以一些方式来修饰探针。例如,可以用特异性结合构件来修饰探针以形成对释放的报道分子有特异性亲和性的结合的探针。通常可以使用任何公知的技术将特异性结合构件结合到探针,例如通过如上所述的共价键合和/或物理吸附。在一个具体的实施方案中,将在探针表面的羧基活化并与特异性结合构件的氨基反应形成酰胺键。在利用时,通常期望用于探针和报道分子的特异性结合对不同于用于第一接收材料和另一个连接到底物的特异性结合构件的特异性结合对。这有助于保证探针和报道分子基本上与上面描述的结合机理不抵触。
所述探针可以在酶探测过程的任何阶段与释放的报道分子接触。例如,在一些实施方案中,可将探针施加到位于期望检测的区域上游位置的测定装置20。例如,在一个实施方案中,可将探针施加到结合衬垫(未显示),所述衬垫位于检测区域31和35的上游,但在样品衬垫22的下游。
在此类实施方案中,各种测定形式可以用来检测所释放的报道分子。在一个实施方案中,例如,利用“三明治”测定形式,选择其中释放的报道分子来吸引结合探针的特异性结合构件。所述释放的报道分子(例如抗体、抗原,等等)通常具有两个或多个结合位点(例如,抗原表位)。通过结合探针的特异性结合构件来占据这些结合位点中的一个结合位点。但是,释放的报道分子的游离结合位点随后可以与固定在第二检测区域35内的接收材料结合以形成新的三重的三明治复合物。或者,可以使用直接或间接的“竞争性的”测定形式来检测释放的报道分子。在这种情况中,结合探针的特异性结合构件可以与释放的报道分子相同或是释放的报道分子的类似物。因此,在到达第二检测区域35时,结合的检测探针和释放的报道分子竞争固定接收材料的有效结合位点。当然,任何其它的测定形式也适用于本发明。
对于上面描述的实施方案,其中的报道分子是可间接地检测的,在试验样品内酶浓度的增加会导致释放出更许多种报道分子。因此,如果使用三明治测定形式,更多释放的报道分子与结合探针结合起来以使酶的数量与第二检测区域35的信号强度成正比。另一方面,如果使用竞争测定形式,酶的数量与第二检测区域35的信号强度成反比。在任何情况下,可以将信号强度对已知酶浓度范围的酶浓度绘图,以产生强度曲线。根据该强度曲线可将信号强度转变为酶的浓度,以确定未知试验样品中酶的数量。
参照图3,现在将更详细地描述使用荧光来检测蛋白酶存在的方法的一种具体实施方案。最初,将含有蛋白酶P的试验样品与反应性复合物41混合,每个反应性复合物41包括连接到底物47(例如,蛋白质或糖蛋白)的荧光颗粒43和特异性结合构件45(例如,生物素化物质)。让所述复合物41培养足够的时间以形成培养混合物(在图3中标明为数字65),所述培养混合物包括释放的荧光颗粒43和特异性结合构件45以及未反应的复合物41、部分裂解的复合物49、蛋白酶P和由酶-催化反应产生的任何产品(未显示)。将培养混合物65施加在样品衬垫22上,如图示的指向箭头所示,然后移动到第一检测区域31。由于它们的尺寸较小,释放的特异性结合构件45流动更快并且具有更高的被第一检测区域31内第一接收材料90俘获的概率。第一检测区域31内的有效结合位点也可以被一些未反应的复合物41和部分裂解的复合物49占据。但是,没有被第一检测区域31俘获的任何未反应的复合物41和部分裂解的复合物49移动到第二检测区域35并与含在其中的第二接收材料(未显示)结合起来。因为释放的荧光颗粒43对于第一接收材料90没有亲和性,所以它们也移动到第二检测区域35并与第二接收材料结合起来。
一旦被俘获,可以在第一检测区域31和/或第二检测区域35测量所述荧光颗粒43的信号强度。荧光检测通常利用波长过滤器以从激发光子中分离发射光子和利用检测器来记录发射光子并产生可记录的输出,通常以电信号或摄影图象的方式。一种合适的用于本发明的荧光检测器是由SPEX Industries,Inc.(Edison,New Jersey)出售的FluoroLog III分光荧光计。合适的荧光检测器的另一个例子描述于Song等人的美国专利申请公布No.2004/0043502,以它的全部内容在此引入作为参考用于所有目的。虽然在这个具体的实施方案中利用荧光,但是应该理解任何其它已知的检测技术也可以用在本发明中。例如,其它合适的光检测技术可以包括但不限于磷光、衍射、反射率、透光度,等等。光读出器能够发射光并且还能记录检测信号(例如,传送或反射的光、发射的荧光或磷光,等等)。例如,在一个实施方案中,可以利用反射分光光度计或读出器来检测报道分子的存在,所述报道分子显示可见的颜色(例如染色胶乳微粒)。一种合适的反射率读数器描述于Kaylor等人的美国专利申请公布No.2003/0119202,以它的全部内容在此引入作为参考用于所有目的。
与用于测定信号强度的技术无关,蛋白酶P的绝对量可以通过比较第一检测区域31的信号强度与第二检测区域35的信号强度来确定。例如,如上所述,蛋白酶P的数量可以通过I2/I1的比值并使用先前确定的强度曲线将这个比值转化成酶浓度来确定。或者,也可以独立地使用信号强度I1或I2以标明酶的存在或浓度。当然,本发明还预期定性的实施方案,在定性的实施方案中仅仅通过信号强度确认酶的存在,没有具体的相互关系来确定实际的酶浓度。
在酶的上下文中具体地描述了上述检测技术。但是,正如所描述的,本发明同样地适于检测试验样品内酶抑制剂的存在或数量。为了检测试验样品内酶抑制剂的存在,可以将预定量的相应的酶与所述试验样品混合并培养。在一定量的酶抑制剂存在下,酶-催化反应不能以可检测的速度进行。因此,酶抑制剂浓度和信号强度之间的关系将与酶浓度和信号强度之间的关系相反。作为例证,酶-催化反应不会在一定量抑制剂的存在下发生。因此,所有的反应性复合物会在检测区域31被俘获,产生它的最大信号强度。另一方面,当酶抑制剂的数量减少时,酶会引起报道分子从如上所述的反应性复合物释放。由于存在的释放的报道分子相应的减少,因此在检测区域31产生的信号强度开始减少。同样地,在一些实施方案中,在检测区域35产生的信号强度会由于存在的释放的报道分子的相应增多而开始增加。因此,在这个具体实施方案中,试验样品内酶抑制剂的数量与检测区域31的信号强度成反比以及与检测区域35的信号强度成正比。
现已发现本发明的诊断试验试剂盒提供了相对简单和有成本效益的方法以快速地进行酶或它们的抑制剂的现场测试。所述试验试剂盒提供可见的试验结果,以便由进行所述试验的人能以迅速的方式容易地观察,以及在试验条件下有助于导出高度可靠和一致的试验结果。所述诊断试验试剂盒还是一次性的,以便如果需要,可以在所述试验结束时废弃。
参考以下实施例可以更好地理解本发明。
实施例1
最初将β-酪蛋白轭合到荧光颗粒上。具体地,将2毫升红色羧化FluoroSphere颗粒(粒径为0.5微米,2%固体含量,Molecular Probes,Inc.(Eugene Oregon))用磷酸缓冲盐水(PBS)(Polysciences,Inc.(Warrington,Pennsylvania))洗涤一次,然后悬浮在1毫升PBS中。加入在1毫升PBS中的36毫克碳化二亚胺(Polysciences,Inc.)并将所得混合物摇动30分钟。将所述颗粒用硼酸盐缓冲液(Polysciences,Inc.)洗涤两次,然后悬浮在1毫升硼酸盐缓冲液中。加入1毫克β-酪蛋白(Sigma-Aldrich Chemical Co.Inc.(St.Louis,Missouri))并将混合物在室温下摇动过夜。将所述颗粒用硼酸盐缓冲液洗涤一次,然后再悬浮在500微升硼酸盐缓冲液中。将1毫升乙醇胺溶液(0.1摩尔,Polysciences Inc.)加入到颗粒中并摇动30分钟。然后将所述颗粒用水洗涤四次并悬浮在2毫升硼酸盐缓冲液中。
在形成后,将轭合的颗粒(以下称“FCM-酪蛋白”)生物素化。具体地,将在200微升硼酸盐缓冲液中的4毫克FCM-酪蛋白颗粒与200微升硼酸盐缓冲液中的1毫克EZ-Link磺基-NHS-LC-生物素(Pierce Biotechnology,Inc.(Rockford,Illinois))混合。将混合物摇动过夜,然后用水洗涤五次。将洗涤的颗粒悬浮在1毫升三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液中(pH值7.2,20毫摩尔)。将生物素化的轭合颗粒以下简称为“FCM-酪蛋白-B”。
实施例2
最初将β-酪蛋白轭合到染色颗粒上。具体地,将2毫升蓝色羧化的颗粒(粒径为0.3微米,Bangs Laboratories Inc.(Fisher,Indiana))用磷酸缓冲盐水(PBS,来自Polysciences,Inc.(Warrington,Pennsylvania))洗涤一次,然后悬浮在1毫升PBS中。加入在1毫升PBS中的36毫克碳化二亚胺(Polysciences,Inc.)并将混合物摇动30分钟。所述颗粒用硼酸盐缓冲液(Polysciences,Inc.)洗涤两次,然后悬浮在1毫升硼酸盐缓冲液中。加入1毫克β-酪蛋白(Sigma AldrichChemical Co.,Inc.(St.Louis,Missouri))并将混合物在室温下摇动过夜。将所述颗粒用硼酸盐缓冲液洗涤一次,然后再悬浮在500微升硼酸盐缓冲液中。将1毫升乙醇胺溶液(0.1摩尔,Polysciences Inc.)加入到所述颗粒中并摇动30分钟。然后将所述颗粒用水洗涤四次并悬浮在2毫升硼酸盐缓冲液中。
在形成后,将轭合的颗粒(以下称“BP-酪蛋白”)生物素化。具体地,将在200微升硼酸盐缓冲液中的4毫克BP-酪蛋白颗粒与200微升硼酸盐缓冲液中的1毫克EZ-Link磺基-NHS-LC-生物素(Pierce Biotechnology,Inc.(Rockford,Illinois))混合。将混合物摇动过夜,然后用水洗涤五次。将洗涤的颗粒悬浮在1毫升三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液中(pH值7.2,20毫摩尔)。将生物素化的轭合颗粒以下简称为“BP-酪蛋白-B”。
实施例3
证明根据本发明检测酶的存在或缺少的能力。最初,将硝化纤维素多孔膜(来自Millipore,Inc.(Bedford,Massachusetts)的HF12002)的一端与纤维素性的灯芯材料衬垫(Millipore,Inc.)层叠起来。将链霉抗生物素蛋白(1毫克/毫升,Sigma-Aldrich Chemical Co.,Inc.)成条纹状施加到所述的膜上以形成第一检测区域。将层状卡片在37℃干燥1小时,然后切成4毫米宽的测定装置。
向微孔板上的两个孔中各加入25微升实施例1中形成的“FCM-酪蛋白-B”(4毫克/毫升)和75微升三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液(pH值7.4)(一个样品孔和一个对照孔)。将5微升来自多粘芽胞杆菌的活性蛋白酶(20毫克/毫升)、可从Sigma-Aldrich Chemical Co.Inc.获得的金属酶加入样品孔。另外,将5微升减活的蛋白酶加入到对照孔。所述减活的蛋白酶是通过将活性蛋白酶煮沸5分钟而得到的。让每个孔中的混合物反应20分钟。然后将20微升各混合物转入含有20微升吐温20(2%,Sigma-Aldrich Chemical Co.,Inc.)的孔中。
然后将测定装置样品插入各自的孔中以开始所述试验。测定进行10分钟之后,观察各检测区域的颜色强度。具体地,在插入对照孔中的测定装置的检测区域观察到红线,而在插入样品孔中的测定装置上没有观察到红线。因此,通过检测区域显示的信号强度在酶存在时下降了。
实施例4
证明根据本发明检测酶的存在或缺少的能力。最初,将硝化纤维素多孔膜(HF12002,Millipore,Inc.)的一端与纤维素性的灯芯材料衬垫(Millipore,Inc.)层叠起来。将链霉抗生物素蛋白(1毫克/毫升,Sigma-Aldrich Chemical Co.,Inc.)成条纹状施加到所述的膜上以形成第一检测区域。通过使GoldlineTM膜(可从British Biocell International获得的聚赖氨酸溶液)成条状来形成第二检测区域。将层状卡片在37℃干燥1小时,然后切成4毫米宽的测定装置。
然后提供六个含有25微升实施例1中形成的“FCM-酪蛋白-B”(4毫克/毫升)样品(指定为样品1-6)。将每个样品用不同数量的来自多粘芽胞杆菌的活性蛋白酶(20毫克/毫升)和可从Sigma-AIdrich Chemical Co.,Inc获得的金属酶培养15分钟。具体地,样品1-6中活性蛋白酶的数量分别为0.0、0.2、1.0、2.0、10.0和20.0微克。对于样品1(对照样品),还加入20微克减活的蛋白酶(通过煮沸30分钟得到的)。在培养之后,然后将2微升各混合物转入含有40微升吐温20(1%,Sigma-Aldrich Chemical Co.,Inc.)的孔中。
然后将测定装置样品插入各自的孔中以开始所述试验。在测定进行10分钟之后,观察各检测区域的颜色强度。定性结果在下面的表1中显示。
表1:检测区域的定性颜色强度
样品 | 第一检测区域 | 第二检测区域 |
1 | 强 | 无 |
2 | 中 | 弱 |
3 | 中 | 强 |
4 | 弱 | 强 |
5 | 无 | 强 |
6 | 无 | 强 |
如所显示的,由第一检测区域显示的信号强度在酶的存在下减小了,而由第二检测区域显示的信号强度在酶的存在下增大了。
实施例5
证明根据本发明检测酶的存在或缺少的能力。最初,将硝化纤维素多孔膜(HF12002,Millipore,Inc.)的一端与纤维素性的灯芯材料衬垫(Millipore,Inc.)层叠起来。将链霉抗生物素蛋白(1毫克/毫升,Sigma-Aldrich Chemical Co.,Inc.)成条纹状施加到所述的膜上以形成第一检测区域。通过使GoldlineTM膜(可从British Biocell International获得的聚赖氨酸溶液)成条状来形成第二检测区域。将层状卡片在37℃干燥1小时,然后切成4毫米宽的测定装置。
然后提供六个含有50微克实施例2中形成的“BP-酪蛋白-B”的样品(指定为样品1-6)。将每个样品用不同数量的来自多粘芽胞杆菌的活性蛋白酶(20毫克/毫升)和可从Sigma-AIdrich Chemical Co.,Inc获得的金属酶培养10分钟。具体地,样品1-6中活性蛋白酶的数量分别为0、5、10、20、40和200纳克。对于样品1(对照样品),还加入20微克减活蛋白酶(通过煮沸30分钟得到的)。培养之后,然后将2微升各混合物转入含有40微升吐温20(1,Sigma-AldrichChemical Co.,Inc.)的孔中。
然后将测定装置样品插入各自的孔中以开始所述试验。在测定进行10分钟之后,使用反射率读数器测定各检测区域的反射率强度。定量结果在下面的表2中显示。
表2:检测区域的定量颜色强度
样品 | 第一检测区域的反射率强度(I1) | 第二检测区域的反射率强度(I2) | I2/I1的比值 |
1 | 2.061 | 0.023 | 0.011 |
2 | 1.449 | 0.832 | 0.574 |
3 | 1.357 | 1.090 | 0.803 |
4 | 1.402 | 1.399 | 0.998 |
5 | 1.004 | 1.469 | 1.463 |
6 | 0.538 | 0.992 | 1.844 |
如所显示的,由第一检测区域显示的信号强度在酶的存在下减小了,而由第二检测区域显示的信号强度在酶的存在下增大了。并且,I2/I1的比值在酶的存在下增加了。
实施例6
证明根据本发明检测酶的存在或缺少的能力。最初,将硝化纤维素多孔膜(HF 12002,Millipore,Inc.)的一端与纤维素性的灯芯材料衬垫(Millipore,Inc.)层叠起来。将两个不同的链霉抗生物素蛋白线条(1毫克/毫升,Sigma-Aldrich Chemical Co.,Inc.)成条纹状施加到所述的膜上以形成第一检测区域。通过使GoldlineTM膜(可从BritishBiocell International获得的聚赖氨酸溶液)成条状来形成第二检测区域。将层状卡片在37℃干燥1小时,然后切成4毫米宽的测定装置。
然后提供六个含有5微升实施例1中形成的“FCM-酪蛋白-B”(4毫克/毫升)的样品(指定为样品1-6)。将每个样品用不同数量的来自多粘芽胞杆菌的活性蛋白酶(20毫克/毫升)和可从Sigma-AIdrich Chemical Co.,Inc获得的金属酶培养10分钟。具体地,样品1-6中活性蛋白酶的数量分别为0.0、0.1、0.2、1.0、2.0和10.0微克。对于样品1(对照样品),还加入20微克减活蛋白酶(通过煮沸30分钟得到的)。在培养之后,然后将2微升各混合物转入含有40微升吐温20(1,Sigma-Aldrich Chemical Co.,Inc.)的孔中。
然后将测定装置样品插入各自的孔中以开始所述试验。在测定进行10分钟之后,观察各检测区域的颜色强度。定性结果在下面的表3中显示。
表3:检测区域的定性颜色强度
样品 | 第一检测区域(第一条线) | 第一检测区域(在第一条线下游的第二条线) | 第二检测区域 |
1 | 强 | 弱 | 无 |
2 | 强 | 中 | 无 |
3 | 中 | 中 | 中 |
4 | 中 | 中 | 中 |
5 | 弱 | 弱 | 强 |
6 | 无 | 无 | 强 |
如所显示的,由第一检测区域的第一条线显示的信号强度在酶的存在下减小了,而由第二检测区域显示的信号强度在酶的存在下增大了。虽然由第一检测区域的第二条线显示的信号强度在开始时增大了,但随后在酶的存在下减小了。
虽然已经参照具体的实施方案详细地描述了本发明,但是应该理解本领域的技术人员通过对上文的理解,可以容易地想到这些实施方案的变更、变化和同等的实施方案。因此,应将本发明的范围确定为所附的权利要求和其任何同等物。
Claims (20)
1.一种用于检测试验样品内的酶或其抑制剂的诊断试剂盒,所述试剂盒包括:
许多种反应性复合物,每种反应性复合物包括与报道分子和特异性结合构件连接的底物,所述底物可被酶裂解;以及
限定第一检测区域的层析介质,在该第一检测区域内能够俘获所述的特异性结合构件,其中能够在所述的第一检测区域内产生第一检测信号,其中从所述的第一检测信号可确定酶或其抑制剂的存在或数量。
2.一种用于检测试验样品内的酶或其抑制剂的方法,所述方法包括:
将试验样品与许多种反应性复合物接触以形成培养混合物,所述的反应性复合物各自包括与报道分子和特异性结合构件连接的底物,其中所述的底物可被酶裂解以释放出所述报道分子和所述特异性结合构件,所述报道分子能够直接或间接地产生检测信号;
将所述培养混合物施加在层析介质上,所述的层析介质限定第一检测区域,在该第一检测区域内能够俘获所述的特异性结合构件;以及
确定在所述第一检测区域内的检测信号的存在或强度。
3.权利要求1或2的诊断试验试剂盒或方法,其中所述的酶是水解酶。
4.权利要求3的诊断试验试剂盒或方法,其中所述的水解酶是蛋白酶或肽酶。
5.权利要求4的诊断试验试剂盒或方法,其中所述的水解酶是丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶、酸性蛋白酶或碱性蛋白酶。
6.前述权利要求中任意一项的诊断试验试剂盒或方法,其中所述的底物是蛋白质、糖蛋白、肽、核酸、碳水化合物、脂质、酯或其衍生物。
7.权利要求6的诊断试验试剂盒或方法,其中所述的底物是酪蛋白、白蛋白、血红蛋白、肌红蛋白、角蛋白、明胶、胰岛素、蛋白聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原、弹性蛋白或其衍生物。
8.前述权利要求中任意一项的诊断试验试剂盒或方法,其中所述的报道分子包括能够直接产生所述第一检测信号的可检测物质。
9.前述权利要求中任意一项的诊断试验试剂盒或方法,其中所述的报道分子包括特异性结合构件。
10.权利要求9的诊断试验试剂盒或方法,进一步地包括与特异性结合构件轭合的探针,所述探针还包括能够直接产生所述的检测信号的可检测物质。
11.权利要求10的诊断试验试剂盒或方法,其中所述探针的所述特异性结合构件对所述报道分子的所述特异性结合构件具有特异性的结合亲和性。
12.权利要求10的诊断试验试剂盒或方法,其中所述探针的所述特异性结合构件与所述报道分子的所述特异性结合构件相同或是所述报道分子的所述特异性结合构件的类似物。
13.前述权利要求中任意一项的诊断试验试剂盒或方法,其中在所述的第一检测区域内固定接收材料,所述第一检测区域对所述的特异性结合构件具有亲和性。
14.权利要求13的诊断试验试剂盒或方法,其中所述接收材料的总数小于结合到所述反应性复合物的总数上所需要的数量。
15.权利要求13的诊断试验试剂盒或方法,其中所述接收材料的总数等于或大于结合到所述反应性复合物的总数上所需要的数量。
16.前述权利要求中任意一项的诊断试验试剂盒或方法,其中所述的层析介质进一步地包括第二检测区域,在该第二检测区域内能够俘获所述报道分子以产生第二检测信号。
17.权利要求16的诊断试验试剂盒或方法,其中在所述的第二检测区域内固定第二接收材料,所述的第二接收材料对所述报道分子或其复合物具有亲和性。
18.前述权利要求中任意一项的诊断试验试剂盒或方法,其中在试验样品内酶的数量与所述第二检测信号的强度成正比。
19.前述权利要求中任意一项的诊断试验试剂盒或方法,其中在试验样品内酶的数量与所述第一检测信号的强度成反比。
20.前述权利要求中任意一项的诊断试验试剂盒或方法,其中在试验样品内酶抑制剂的数量与所述第一检测信号的强度成正比。
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