CN1973036B - 突变的葡萄糖脱氢酶 - Google Patents
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Abstract
通过用其它氨基酸残基取代具有SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的葡萄糖脱氢酶的第472位和第475位的氨基酸残基，改进了该酶对葡萄糖的底物特异性。
Description
技术领域
本发明涉及表现出改进的底物特异性的突变的葡萄糖脱氢酶。本发明的突变的葡萄糖脱氢酶可以合适地用于葡萄糖传感器、葡萄糖测定试剂盒等，并且在生物化学、临床医学等领域中有用。
背景技术
近年中，将多种酶用作生物传感器元件。已经将葡萄糖氧化酶(GODs)实际用作测量血糖水平的传感器元件，用于诊断糖尿病的目的。但是，GODs的问题是它们受到样品中溶解的氧的影响。因此，不受样品中溶解的氧影响的葡萄糖脱氢酶(GDHs)引起了注意，作为GODs的替代。
作为GDHs，报道了一种需要NAD(P)+作为辅酶(E.C.1.1.1.47)，一种需要pyroloquinoline quinone(PQQ)作为辅酶(PQQGDH；E.C.1.1.99.17)，等等。需要NAD(P)+作为辅酶的GDH的问题是作为传感器元件，需要在测定系统中加入NAD(P)+。相反，对于辅酶结合型GDHs，如PQQGDH，不需要在测定系统中加入辅酶。
此外，传感器元件需要表现出稳定性，当它们连续使用或保持在室温中时不丧失传感器的功能。
由于来源于在高温下生长的嗜热细菌的酶通常表现出高稳定性，并且在长期储存中甚至也表现出高稳定性，预期可以连续使用，并且因此可以将它们用作传感器元件。但是，尽管已经报道来源于嗜酸热原体和硫磺矿硫化叶菌的GDHs是来源于嗜热细菌的耐热GDHs，但两者都需要NAD(P)+作为辅酶。
另一方面，由一种中度嗜热的细菌，即洋葱伯克霍尔德氏菌产生的耐热GDH是FAD结合型GDH，并且其酶学特征如最优反应温度、热稳定性和底物特异性已经得到阐述(专利文件1)。这种GDH通常作为异寡聚物存在，由高度抗热的催化亚基(α-亚基)和电子转移亚基(β-亚基)，即细胞色素C和功能未知的γ-亚基组成，其最优反应温度是45℃。这些亚基被温度高于50℃的热处理解离，以释放最优反应温度为75℃的α-亚基单体。α-亚基单体是耐热的，甚至在60℃热处理30分钟后表现出80％或更多的残留活性。也已经分离了编码这些亚基的基因(专利文件1和2)。
但是，辅酶结合型GDHs通常表现出广泛的底物特异性，并且也与麦芽糖、半乳糖等，以及葡萄糖反应。当它们作为监测糖尿病患者的血糖水平的葡萄糖传感器施用，并且糖尿病患者具有严重症状以至于必须进行腹膜透析时，存在可能获得比真实血糖水平更高的值的可能，因为在透析物中含有大量的麦芽糖。来源于洋葱伯克霍尔德氏茵的GDH也表现出除葡萄糖之外，对麦芽糖和半乳糖的反应性。
通过导入氨基酸取代突变而改变GDH的底物特异性的技术是本领域公知的。例如，作为所述突变的GDHs，存在来源于大肠杆菌(专利文件3和4)、乙酸钙不动杆菌(乙酸钙葡糖杆菌)(专利文件5)和鲍氏不动杆菌(专利文件6-8)的公知的PQQGDHs，它们需要pyroloquinoline quinone作为辅酶。
[专利文件1]美国专利申请No.2004/0023330
[专利文件2]国际专利公开WO03/091430
[专利文件3]日本专利公开(Kokai)No.10-243786
[专利文件4]日本专利公开No.2001-197888
[专利文件5]日本专利公开No.2004-173538
[专利文件6]日本专利公开No.2004-313172
[专利文件7]日本专利公开No.2004-313180
[专利文件8]日本专利公开No.2004-344145
发明公开
本发明的一个目的是提供表现出对葡萄糖的改进的底物特异性的FAD结合型GDH。
本发明的发明人进行了多项研究，以获得上述目的。结果，他们发现通过在特定位点修饰来源于洋葱伯克霍尔德氏茵的FAD结合型GDH，可以降低其对除葡萄糖之外的糖类的反应性，同时保持对葡萄糖的反应性，因此完成了本发明。
也就是说，本发明提供了以下内容。
(1)表现出对葡萄糖的改进的底物特异性的突变的葡萄糖脱氢酶，其是具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列或包括在除以下列出的位置外的位置取代、缺失、插入或添加一个或多个氨基酸残基的SEQ IDNO：13的氨基酸序列，并且具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白，并且其具有以下列出的任意氨基酸取代突变(数字代表氨基酸序列中的位置，氨基酸残基代表在该位置取代后的氨基酸残基，“+”表示同时包括两种氨基酸取代)：
(A)472Arg，472Asn，472Asp，472Cys，472Glu，472Gly，472His，
472Ile，472Leu，472Met，472Phe，472Pro，472Ser，472Trp，472Tyr，
472Val，
(B)475Asp， 475Cys， 475Glu， 475Gly， 475His， 475Met， 475Phe，
475Ser，475Tyr，475Val，
(C)472Arg+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，
472Asn+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，
472Asp+475(His，Phe，Ser，Val)，
472Cys+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser)，
472Glu+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，
472Gly+475(Asp，Cys，Gly，Met，Phe，Ser，Tyr)，
472His+475(Cys，Glu，His，Met，Phe，Ser，Tyr)，
472Ile+475(Asp，Cys，Glu，Gly，His，Met，Phe，Ser，Tyr)，
472Leu+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，
472Met+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser)，
472Phe+475(Asp，Glu，Gly，His，Met，Phe，Ser，Tyr)，
472Pro+475His
472Ser+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser)，
472Trp+475(His，Phe，Ser)，
472Tyr+475(Asp，His，Phe，Ser)，
472Val+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser)。
(2)前述突变的葡萄糖脱氢酶，其具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列，前提是它包括前述(A)-(C)中列出的任意氨基酸取代突变。
(3)前述突变的葡萄糖脱氢酶，其具有选自以下突变的氨基酸取代突变：
(D)472Arg，472Asn，472Asp，472Glu，472Gly，472Phe，472Pro，
(E)475Asp，475Cys，475Glu，475Gly，475Met，475Phe
(F)472Arg+475(Asp，Gly，His，Phe)，
472Asn+475(Gly，His，Phe，Tyr)，
472Asp+475(His，Ser)，
472Cys+475(Gly，His，Phe)，
472Glu+475(Glu，His，Phe，Tyr)，
472Gly+475(Asp，Phe，Tyr)，
472His+475(His，Ser)，
472Ile+475(Asp，Glu，Gly，His，Ser)，
472Leu+475(Gly，His，Phe，Tyr)，
472Met+475(Asp，Gly，His，Phe)，
72Phe+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，
472Ser+475(Glu，Gly，His，Phe)，
472Trp+475(His，Phe)，
472Tyr+475His，
472Val+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe)。
(4)葡萄糖脱氢酶，其是具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列或包括在除以下列出的位置外的位置取代、缺失、插入或添加一个或多个氨基酸残基的SEQ ID NO：13的氨基酸序列，并且具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白，并且其中：
(i)SEQ ID NO：13的氨基酸序列中至少第472位的精氨酸残基或第475位的天冬酰胺残基被另一种氨基酸残基取代，并且
(ii)导入前述突变的葡萄糖脱氢酶对葡萄糖的比活性和对麦芽糖的比活性的比值((对麦芽糖的反应性/对葡萄糖的反应性)x100)与没有导入突变的葡萄糖脱氢酶的该比值相比减少了10％或更多。
(5)突变的葡萄糖脱氢酶复合物，至少包含前述突变的葡萄糖脱氢酶和电子转移亚基。
(6)编码前述突变的葡萄糖脱氢酶的DNA。
(7)具有前述DNA并且产生前述突变的葡萄糖脱氢酶或突变的葡萄糖脱氢酶复合物的微生物。
(8)葡萄糖测定试剂盒，包含前述突变的葡萄糖脱氢酶、突变的葡萄糖脱氢酶复合物或微生物。
(9)葡萄糖传感器，包含前述突变的葡萄糖脱氢酶、突变的葡萄糖脱氢酶复合物或微生物。
在本说明书中，尽管术语“突变的GDH”是指与突变的GDH复合物不同的内容中的突变的α-亚基，但突变的α-亚基和突变的GDH复合物也可以通称为“突变的GDH”。
附图简述
图1显示了DH5α/pTrc99A/γ+α对作为底物的葡萄糖和麦芽糖的脱氢酶活性。菱形代表对葡萄糖的活性，矩形代表对麦芽糖的活性(图2-5中也是如此)。
图2显示了DH5α/pTrcγαAsn475Asp对作为底物的葡萄糖和麦芽糖的脱氢酶活性。
图3显示了DH5α/pTrc99Aγαβ对作为底物的葡萄糖和麦芽糖的脱氢酶活性。
图4显示了DH5α/pTrcγαβAsn475Asp对作为底物的葡萄糖和麦芽糖的脱氢酶活性。
图5显示了DH5α/pTrcγαβAsn475Glu对作为底物的葡萄糖和麦芽糖的脱氢酶活性。
图6显示了用于对GDH α-亚基中第472和475位进行密码子取代的PCR引物的序列。
图7显示了突变的GDHs的SV图。
图8显示了突变的GDHs的SV图。
图9显示了葡萄糖传感器的结构。
图10显示了葡萄糖传感器的试剂部分。
图11显示了采用野生型GDH的葡萄糖传感器的葡萄糖反应性。
图12显示了采用472Glu475Tyr型GDH的葡萄糖传感器的葡萄糖反应性。
图13显示了采用472Asp475His型GDH的葡萄糖传感器的葡萄糖反应性。
图14显示了葡萄糖存在下，采用野生型GDH的葡萄糖传感器的麦芽糖反应性。
图15显示了葡萄糖存在下，采用472Glu475Tyr型GDH的葡萄糖传感器的麦芽糖反应性。
图16显示了葡萄糖存在下，采用472Asp475His型GDH的葡萄糖传感器的麦芽糖反应性。
图17显示通过采用野生型GDH和突变的GDH的葡萄糖传感器测量的表观血糖水平。
实施本发明的最佳方式
下文中将详细解释本发明。
本发明的突变的GDH是通过将特定突变导入野生型GDH而制备的。野生型GDH的实例包括由洋葱伯克霍尔德氏茵产生的GDHs。由洋葱伯克霍尔德氏菌产生的GDHs的实例包括由洋葱伯克霍尔德氏茵KS1、JCM2800和JCM2801菌株产生的GDHs。KS1菌株于2000年9月25日保藏于独立的管理机构，即国际专利生物保藏机构-通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(Tsukuba Central6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)，保藏号是FERM BP-7306。JCM2800和JCM2801菌株储存在独立的管理机构，即RIKEN，Bioresource Center，日本微生物保藏中心(JCM)。
含有KS1菌株的GDHα-亚基基因和部分β-亚基基因的染色体DNA片段的核苷酸序列示于SEQ ID NO：11(美国专利申请No.2004/0023330)。该核苷酸序列中存在3个可读框(ORF)，从5’末端侧开始的第二个和第三个ORFs分别编码α-亚基(SEQ ID NO：13)和β-亚基(SEQ ID NO：14)。此外，推定第一个ORF编码γ-亚基(SEQID NO：12)。此外，含有全长β-亚基基因的片段的核苷酸序列示于SEQID NO：15。此外，β-亚基的氨基酸序列示于SEQ ID NO：16。推定SEQ ID NO：16中的氨基酸1-22相应于信号肽。尽管SEQ ID NOS：15和16中的第一个氨基酸残基是Val，它们很可能是Met，并且可能在翻译后去除。
本发明的突变的GDH可以由单独的α-亚基、包含α-亚基和β-亚基的复合物，或包含α-亚基、β-亚基和γ-亚基的复合物组成。通过在任何情况下将特定突变导入α-亚基，并且可能在上述特定突变外具有保守突变，获得本发明的突变的GDH。此外，其它的亚基可以是野生型亚基或具有保守突变。术语“保守突变”表示不显著影响GDH活性的突变。
本发明的突变的α-亚基优选具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列，但是其包含下文描述的特定突变。此外，突变的α-亚基可以具有前述保守突变，只要它具有GDH活性。也就是说，它可以是具有除上述特定突变外，包含一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加的SEQ ID NO：13的氨基酸序列的蛋白。SEQ ID NO：13具有可以由SEQ ID NO：11的核苷酸序列编码的氨基酸序列。但是，在翻译后可以去除N-末端的甲硫氨酸残基。前述“一个或几个”优选表示1-10的数目，更优选1-5，特别优选1-3。
此外，β-亚基典型地具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列。但是，只要它作为GDH的β-亚基起作用，它可能是具有包括一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加的SEQ ID NO：16的氨基酸23-425的氨基酸序列的蛋白。前述术语“一个或几个”优选表示1-20的数目，更优选1-10，特别优选1-5。“作为GDH的β-亚基起作用”表示作为细胞色素C，而不降解GDH的酶活性。
野生型α-亚基基因的特定实例包括含有相应于SEQ ID NO：11的核苷酸764-2380的核苷酸序列的DNA。此外，α-亚基基因可以是具有相应于SEQ ID NO：11的核苷酸序列中的核苷酸764-2380的核苷酸序列的DNA，或在严格条件下可以与从该序列制备的探针杂交，并且编码具有GDH活性的蛋白的DNA。
此外，β-亚基基因的特定实例包括具有相应于SEQ ID NO：9的核苷酸187-1398的核苷酸序列的DNA。此外，β-亚基基因可以是具有相应于SEQ ID NO：9的核苷酸187-1398的核苷酸序列的DNA，或在严格条件下可以与从该序列制备的探针杂交，并且编码可以作为β-亚基起作用的蛋白的DNA。
前述严格条件的实例包括，例如，以下条件：具有70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，特别优选95％或更高同源性的DNAs彼此杂交，并且特定实例是60℃下1×SSC，0.1％SDS的条件。
可以通过例如采用洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株的染色体DNA作为模板的PCR获得α-亚基基因和β-亚基基因。可以基于前述核苷酸序列，通过化学合成制备PCR的引物。此外，也可以采用基于作为探针的前述序列制备的寡核苷酸，通过杂交从洋葱伯克霍尔德氏茵KS1茵株的染色体DNA获得引物。此外，也可以相似地从洋葱伯克霍尔德氏菌的其它菌株获得其变体。其它菌株的实例包括前述JCM2800和JCM2801菌株。由这些菌株产生的GDHs的α-亚基分别与KS1菌株的α-亚基具有95.4和93.7％的同源性。
此外，甚至可以将其它微生物产生的GDHs用于制备本发明的突变的GDH，只要它们具有与洋葱伯克霍尔德氏茵产生的GDH相似的结构和酶学特征。
在本发明的突变的GDH中，通过将特定突变导入前述野生型GDH而改进对葡萄糖的底物特异性。“改进对葡萄糖的底物特异性”是指对其它糖类，如单糖、二糖和寡糖，例如麦芽糖、半乳糖、木糖等的反应性降低，同时基本维持对葡萄糖的反应性，或与对其它糖类的反应性相比，对葡萄糖的反应性改进。例如，即使对葡萄糖的反应性降低，但如果对其它糖类的反应性降低更大的程度，则改进了对葡萄糖的底物特异性。此外，即使对其它糖类反应性升高，但如果对葡萄糖的底物特异性升高更大的程度，则改进了对葡萄糖的底物特异性。具体地，如果对葡萄糖的比活性与对其它糖类，如麦芽糖的比活性的比值((对另一种糖的反应性/对葡萄糖的反应性)×100)减少10％或更多，优选20％或更多，更优选50％或更多，则改进了对葡萄糖的底物特异性。
前述特定突变表示在SEQ ID NO：13的氨基酸序列中第472位的氨基酸取代、第475位的氨基酸取代，和第472和475位两者的氨基酸取代。突变的更特定的实例包括下文所述的氨基酸取代。示出的数字代表氨基酸序列中的位置，氨基酸残基代表对前述位置取代后的氨基酸残基，“+”表示同时包含了两个氨基酸取代。在以下氨基酸取代中，第472位的氨基酸取代列于(A)中，第475位的氨基酸取代列于(B)，第472和475位两者的氨基酸取代列于(C)。例如，“472Asn+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)”表示用Asn取代第472位的氨基酸残基(野生型中的Ala)，并且用Asp、Gly、His、Phe、Ser或Tyr取代第475位的氨基酸残基(野生型中的Asn)的突变。
(A)472Arg，472Asn，472Asp，472Cys，472Glu，472Gly，472His，
472Ile，472Leu，472Met，472Phe，472Pro，472Ser，472Trp，472Tyr，
472Val，
(B)475Asp，475Cys，475Glu，475Gly，475His，475Met，475Phe，
475Ser，475Tyr，475Val，
(C)472Arg+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，
472Asn+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，
472Asp+475(His，Phe，Ser，Val)，
472Cys+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser)，
472Glu+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，
472Gly+475(Asp，Cys，Gly，Met，Phe，Ser，Tyr)，
472His+475(Cys，Glu，His，Met，Phe，Ser，Tyr)，
472Ile+475(Asp，Cys，Glu，Gly，His，Met，Phe，Ser，Tyr)，
472Leu+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，
472Met+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser)，
472Phe+475(Asp，Glu，Gly，His，Met，Phe，Ser，Tyr)，
472Pro+475His
472Ser+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser)，
472Trp+475(His，Phe，Ser)，
472Tyr+475(Asp，His，Phe，Ser)，
472Val+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser)。
在前述的氨基酸取代中，优选取代如下：
(D)472Arg，472Asn，472Asp，472Glu，472Gly，472Phe，472Pro，
(E)475Asp，475Cys，475Glu，475Gly，475Met，475Phe
(F)472Arg+475(Asp，Gly，His，Phe)，
472Asn+475(Gly，His，Phe，Tyr)，
472Asp+475(His，Ser)，
472Cys+475(Gly，His，Phe)，
472Glu+475(Glu，His，Phe，Tyr)，
472Gly+475(Asp，Phe，Tyr)，
472His+475(His，Ser)，
472Ile+475(Asp，Glu，Gly，His，Ser)，
472Leu+475(Gly，His，Phe，Tyr)，
472Met+475(Asp，Gly，His，Phe)，
472Phe+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，
472Ser+475(Glu，Gly，His，Phe)，
472Trp+475(His， Phe)，
472Tyr+475His，
472Val+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe)。
前述氨基酸取代突变的位置是SEQ ID NO：13，即洋葱伯克霍尔德氏茵KS1菌株的野生型GDHα-亚基的氨基酸序列中的位置，以及GDHα-亚基同源物或变体中的位置，所述同源物或变体具有除前述特定突变外取代、缺失、插入或添加一个或多个氨基酸残基的SEQ IDNO：13的氨基酸序列，所述位置相应于通过于SEQ ID NO：13的氨基酸序列进行比对而确定的前述氨基酸取代的位置。例如，在1-471位的区域中缺失一个氨基酸残基的保守GDHα-亚基变体中，第472和475位代表变体中的第471和第474位。
本发明的发明人研究了葡萄糖脱氢酶中参与结合FAD的区域和附近区域作为导入改进底物特异性的突变的位置。作为参与结合FAD的区域，考虑了FAD附近的区(覆盖FAD的盖)或FAD结合域，具体是相应于SEQ ID NOS：1-4的氨基酸序列的区域。
术语“相应于氨基酸序列的区域”表示在具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株的GDHα-亚基中，具有SEQ ID NO：1、2或4的氨基酸序列的区域，即，SEQ ID NO：13的氨基酸88-92、57-61和470-504的区域。此外，在具有与SEQID NO：13的氨基酸序列同源的氨基酸序列的GDHα亚基中，这些区域是相应于通过与SEQ ID NO：13的氨基酸序列比对确定的前述洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株的GDHα-亚基中的氨基酸88-92、57-61或470-504的区域。
本发明的发明人比较了用FAD作为辅酶的GMC氧化还原酶家族酶、氧化葡糖杆菌的山梨糖醇脱氢酶(GenBank编码AB039821).草生欧文氏菌的2-酮戊二酸脱氢酶(GenBank编号AF068066)、Phanerochaete chrysosporium的纤维二糖脱氢酶(CDH)(J.Mol.Biol.，315(3)，421-34(2002))、链霉菌种的胆固醇氧化酶(COD)(J.Struct.Biol.116(2)，317-9(1996))和尼崎青霉的葡萄糖氧化酶(Eur.J.Biochem.252，90-99(1998))的氨基酸序列，发现了FAD结合域和覆盖FAD的盖保守的区域，和脯氨酸保守的区域，脯氨酸是参与蛋白折叠的氨基酸残基。然后，他们检验了通过修饰这些区域和其它区域之间的边界附近的序列而改进底物特异性的可能性。结果，他们证实了可以通过前述氨基酸残基的突变改进底物特异性。
可以通过定点诱变将相应于需要的氨基酸突变的核苷酸突变导入编码GDHα-亚基的DNA(α-亚基基因)，并且使用合适的表达系统表达获得的突变DNA，从而获得具有需要的突变的GDHα-亚基。此外，可以通过表达编码突变的GDHα-亚基的DNA以及编码β-亚基的DNA(β-亚基基因)或β-亚基基因和编码γ-亚基的DNA(γ-亚基基因)，获得突变的GDH复合物。为了将突变导入编码GDHα-亚基的DNA，也可以使用编码GDHα-亚基、γ-亚基和β-亚基(以此顺序)的多顺反子DNA片段。
可以通过以下方法确定导入突变的GDHα-亚基或GDH复合物对糖类的底物特异性：通过实施例中描述的方法检验对各种糖类的反应性，并且将其与野生型α-亚基或野生型GDH复合物的反应性进行比较。
可以通过例如采用洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株的染色体DNA作为模板和具有SEQ ID NOS：12和13的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物的PCR获得编码α-亚基、γ-亚基和β-亚基(以此顺序)的多顺反子DNA片段(参见下文描述的实施例)。
用于获得GDH亚基的基因、导入突变、表达基因等的载体的实例包括在埃希氏菌属细菌中起作用的载体，其特定实例包括pTrc99A，pBR322，pUC18，pUC118，pUC19，pUC119，pACYC184，pBBR122等。用于表达基因的启动子的实例包括lac，trp，tac，trc，PL，tet，PhoA等。此外，可以通过在含有启动子的表达载体中的合适位点插入α-亚基基因或其它亚基基因，以一个步骤进行这些基因在载体中的插入和启动子的连接。所述表达载体的实例包括pTrc99A，pBluescript，pKK223-3等。
此外，可以将α-亚基基因或其它亚基基因以可表达的形式掺入宿主微生物的染色体DNA。
用重组载体转化微生物的方法的实例包括，例如，采用钙处理的感受态细胞法、原生质体法、电穿孔等。
宿主微生物的实例包括芽孢杆菌属细菌，如枯草芽孢杆菌、酵母，如啤酒糖酵母，和丝状真菌，如黑曲霉。但是，宿主微生物不限于这些实例，并且可以使用适于产生外来蛋白的宿主微生物。
可以将本发明的突变的α-亚基、突变的GDH复合物和表达它们的微生物用作葡萄糖传感器的酶电极或葡萄糖测定试剂盒的成分。采用洋葱伯克霍尔德氏菌的野生型GDH的葡萄糖传感器和葡萄糖测定试剂盒描述于美国专利No.2004/0023330A1。本发明的突变的GDH也可以以相似的方式使用。
实施例
将参照以下实施例更具体解释本发明。但是，本发明的范围不限于这些实施例。
实施例1：表达洋葱伯克霍尔德氏菌的GDH的质粒
作为表达洋葱伯克霍尔德氏菌的GDH的质粒，制备了表达GDHα-亚基和γ-亚基的质粒和表达α-亚基、β-亚基和γ-亚基的质粒。
<1>表达GDHα-亚基和γ-亚基的质粒
作为表达α-亚基和γ-亚基的质粒，使用了描述于WO02/036779中的质粒pTrc99A/γ+α。该质粒是通过将按顺序含有分离自洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株(FERM BP-7306)的染色体DNA的GDH γ-亚基结构基因和α-亚基结构基因插入载体pTrc99A(Pharmacia)中作为克隆位点的NcoI/HindIII位点而获得的质粒。该质粒中的GDHγα基因受trc启动子的调节。pTrc99A/γ+α具有氨苄青霉素抗性基因。
<2>表达GDHα-亚基、β-亚基和γ-亚基的质粒
按照以下方法制备表达GDHα-亚基、β-亚基和γ-亚基的质粒。
(1)制备洋葱伯克霍尔德氏茵KS1菌株的染色体DNA。
以常规方法从洋葱伯克霍尔德氏茵KS1菌株制备染色体基因。也就是说，采用TL液体培养基(1L中含有10g聚蛋白胨，1g酵母提取物，5g NaCl，2gKH2PO4，5g葡萄糖，pH 7.2)，34℃下在培养基中振荡菌株细胞过夜。通过离心收集生长的细胞。将细胞悬浮在含有10mM NaCl，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA，0.5％SDS和100μg/ml蛋白酶K的溶液中，50℃下处理6小时。在混合物中加入等体积的苯酚-氯仿，在室温下将混合物搅拌10分钟。然后，通过离心收集上清液。在上清液中加入终浓度为0.3M的乙酸钠，覆盖2倍体积的乙醇，以便在中间层中沉淀染色体DNA。用玻璃棒收集DNA，用70％的乙醇洗涤，然后溶解于合适体积的TE缓冲液中，获得染色体DNA溶液。
(2)制备编码GDH γ-亚基、α-亚基和β-亚基的DNA片段。
采用前述染色体DNA作为模板，具有以下序列的寡核苷酸作为引物，通过PCR扩增编码GDH γ-亚基、α-亚基和β-亚基的DNA片段。
[正向引物]
5’-CATGCCATGGCACACAACGACAACAC-3’(SEQ ID NO：5)
[反向引物]
5’-GTCGACGATCTTCTTCCAGCCGAACATCAC-3’(SEQ ID NO：6)
对扩增的片段的C-末端侧进行平端化，用NcoI消化N-末端侧，将片段连接到相似处理的pTrc99A(Pharmacia)中。用获得的重组载体转化大肠杆菌DH5α，收集在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基上生长的菌落。在液体LB培养基上培养获得的转化体，提取质粒，分析插入质粒中的DNA片段。结果，证实了大约3.8kb的插入的片段。将该质粒命名为pTrc99Aγαβ。该质粒中GDH的结构基因受到trc启动子的调节。pTrc99Aγαβ具有氨苄青霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因。
实施例2：将突变导入GDHα-亚基基因
通过采用商购的定点诱变试剂盒(QuikChangeII Site-DirectedMutagenesis Kit，Stratagene)，用天冬氨酸的密码子(GAT)或谷氨酸的密码子(GAA)取代实施例1中描述的质粒pTrc99A/γ+α和pTrc99Aγαβ中含有的GDHα-亚基基因中第475位的天冬酰胺的密码子(AAT)。作为引物，使用了以下寡核苷酸。下文中，将用天冬氨酸残基取代第475位的天冬酰胺称作“Asn475Asp”，用谷氨酸残基取代第475位的天冬酰胺称作“Asn475Glu”。
Asn475Asp取代的引物
[正向引物]
5’-CGCGCCGAACGATCACATCACGGGC-3’(SEQ ID NO：7)
[反向引物]
5’-GCCCGTGATGTGATCGTTCGGCGCG-3’(SEQ ID NO：8)
Asn475Glu取代的引物
[正向引物]
5’-GAATTCGCGCCGAACGAACACATCACGGGCTCG-3’(SEQ ID
NO：9)
[反向引物]
5’-CGAGCCCGTGATGTGTTCGTTCGGCGCGAATTC-3’(SEQ ID
NO：10)
采用以下反应组成进行PCR。在95℃下反应30秒后，重复95℃下30秒，55℃下1分钟和68℃下8分钟的一轮反应15次。然后，在68℃下反应30分钟后，将反应混合物在4℃下维持。
[反应混合物组成]
模板DNA(5ng/μl) 2μl
(pTrc99A/γ+α和pTrc99Aγαβ)
10 x反应缓冲液 5μl
正向引物(100ng/μl) 1.25μl
反向引物(100ng/μl) 1.25μl
dNTP 1μl
蒸馏水 38.5μl
DNA聚合酶 1μl
总量 50μl
PCR后，在反应混合物中加入0.5μlDNA聚合酶I，将混合物在37℃温育1小时，以分解模板质粒。
用获得的反应混合物转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞(supE44，ΔlacU169(φ80lacZΔM15)，hsdR17，recAi，endA1，gyrA96，thi-1，relA1)。从在含有氨苄青霉素(50μg/ml)和卡那霉素(30μg/ml)的LB琼脂培养基(1％细菌用胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，1.5％琼脂)上生长的一些菌落制备质粒DNA，进行序列分析，证实目标突变已经被导入GDH α-亚基基因。将导入Asn475Asp突变的pTrc99A/γ+α和 pTrc99Aγαβ分别称作 pTrcγαAsn475Asp 和pTrcγαβAsn475Asp。此外，将导入Asn475Glu突变的pTrc99A/γ+α和pTrc99Aγαβ分别称作pTrcγαAsn475Glu和pTrcγαβAsn475Glu。
实施例3：突变的GDHs的底物特异性分析
采用实施例2中获得的表达突变的GDH的质粒制备突变的GDH，检验其底物特异性。
(1)培养
振荡下在L形试管中在37℃下在2mlLB培养基(含有50μg/ml氨苄青霉素和30μg/ml卡那霉素)中培养导入了pTrcγαAsn475Glu和pTrcγαβAsn475Glu的大肠杆菌DH5α菌株。将这些培养液接种在装在500-ml Sakaguchi烧瓶中的150mlLB培养基(含有50μg/ml氨苄青霉素和30μg/ml卡那霉素)中，在振荡下在37℃培养细胞。培养开始后3小时，加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，将细胞进一步培养2小时。
(2)制备酶样品
从按照上文的描述获得的每个培养液收集细胞，洗涤，然后悬浮于含有每0.3mg湿细胞1ml 0.2％Triton X-100的10mM磷酸钾缓冲液(PPB，pH 7.0)中，通过超声处理破碎。离心(10000rpm，10分钟，4℃)该悬浮液以除去残留物，然后超速离心(50,000r.p.m.，60分钟，4℃)上清液，将获得的上清液(水溶性级分)用作粗酶样品。进一步，通过常规的疏水层析(柱子：Octyl Sepharose，AmershamBiosciences)和离子交换层析(Q-Sepharose，Amersham Biosciences)纯化该样品，获得纯化的酶样品。通过采用GDH活性作为指标，确定目标酶级分。
(3)GDH活性的测量
在8μl前述纯化的酶样品中加入8μl用于测量活性的试剂(在12μl600mM甲基吩嗪硫酸二甲酯(PMS)和120μl6mM 2，6-二氯苯酚-靛酚(DCIP)中加入含有0.2％(w/v)Triton X-100的10mM PPB，达到480μl的总体积而获得的溶液)。采用铝块温度调节室，使该混合物在每个反应温度预温育1分钟，然后在混合物中迅速加入每个浓度的8μl底物(葡萄糖或麦芽糖)或蒸馏水，搅拌混合物。采用分光光度计测量作为DCIP-引起的吸收波长的600nm处的吸光度。试剂DCIP和PMS的终浓度分别是0.06和0.6mM。底物的终浓度是40，20，10和5mM。
结果示于表1和图1-5。
表1
从这些结果可以明确看出，所有突变的GDHs对麦芽糖的反应性都明显降低，而保持了对葡萄糖的反应性，即，改进了它们对葡萄糖的特异性。
实施例4：将突变导入GDHα-亚基基因
在实施例1中获得的pTrc99Aγαβ中所包含的GDHα-亚基基因中的第475位和邻近位置导入突变，并且评估突变的酶的底物特异性。按照与实施例2相同的方式导入突变。用于导入突变的引物按照如下方法制备。在图6中示出的基本引物(野生型)(正向引物：SEQ IDNO：17，反向引物：SEQ ID NO：18)中，在图6中提到的密码子改变表中所示的预定位置(第472位和第475位)改变密码子，以制备用于导入多种突变的引物。
实施例5：突变的GDHs的底物特异性分析
采用实施例4中获得的表达突变的GDH的质粒，通过与实施例3相同的方式制备突变的GDHs，并且检验其底物特异性。通过采用粗酶样品检验酶活性。每种突变的GDH对葡萄糖的比活性、对麦芽糖的比活性和反应比值(对麦芽糖的比活性/对葡萄糖的比活性，单位是U/ml)示于表2-7。当对葡萄糖的比活性是0.5U/ml或更低时，判断无活性，这种结果在表中以“-”表示。
结果，对于第475位，证实了除实施例2中进行的用天冬氨酸(GAT)或谷氨酸(GAA)取代天冬酰胺外的取代也具有改进底物特征的作用。此外，发现用另一种氨基酸取代第475位附近第472位的天冬酰胺(AAC)也改进了底物特性。此外，也发现第472位和第475位的氨基酸取代的组合可以协同改进底物特征。
表2
底物浓度：10mM
对葡萄糖的比活性(U/mi培养液)
表3
底物浓度：10mM
对麦芽糖的比活性(U/mi培养液)
表4
底物浓度：10mM
麦芽糖/葡萄糖(反应比值)
总共：60
表5
底物浓度：10mM
对葡萄糖的比活性(U/mi培养液)
表6
底物浓度：10mM
对麦芽糖的比活性(U/ml培养液)
表7
底物浓度：10mM
麦芽糖/葡萄糖(反应比值)
总共：60
实施例6：基于SV曲线评估纯化的酶
获得表现出实施例5中的改进的底物特异性的一些突变的GDHs的SV曲线。以与实施例3中相同的方式纯化每种突变的GDH。结果示于图7和8以及表8。
结果，证实纯化的酶的反应比值(对麦芽糖的比活性/对葡萄糖的比活性)也得到改进，并且低于所有检验的底物浓度下野生型的该比值。此外，由于结果基本与采用实施例5中的粗酶溶液获得的测量结果基本一致，可以证实采用粗酶进行的修饰的酶的筛选的足够可行性。此外，从这些候选物选择用于葡萄糖传感器的修饰的酶。为此目的，由于血麦芽糖水平最多升高到200mg/dl，特别注意了底物浓度180和90mg/dl时的反应比值。结果，选择472Asp475His作为候选物，其对葡萄糖的反应性没有像野生型那样降低，并且选择72Glu475Tyr作为候选物，其对葡萄糖的反应性降低，但几乎不与麦芽糖反应。
表8
酶特征的评估
实施例7：制备用于采用突变的GDHs测量血糖水平的比色传感器
采用472Asp+475His型突变GDH和472Glu+475Tyr型突变GDH制备用于测量血糖水平的比色传感器。
制备具有图9所示基本结构的葡萄糖传感器(1)。也就是说，前述葡萄糖传感器具有如下构造：通明盖(4)(材料：PET)通过间隔区(3)层压在透明的底板(2)上，通过元件(2)-(4)限定毛细管(5)。毛细管(5)的尺寸是1.3mm × 9mm × 50μm(图9)。透明的底板(2)和透明盖(4)是用厚度为250μm的PET制成，间隔区(3)是用黑色的双面胶带制成。
葡萄糖传感器具有图10所示的第一试剂部分(1)、第二试剂部分(2)和第三试剂部分(3)，每个部分的成分和涂布量示于表9。该表中，“Ru”代表六氨合钌复合物(Ru(NH3)6Cl3)，CHAPS代表3-[(3-胆胺基丙基)二甲基氨]丙磺酸，ACES代表N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸，MTT代表3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-溴化四唑。
表9
第一试剂部分
含有电子转移物质的试剂部分的材料溶液(溶剂是水)
| Ru | 涂布量 |
| 200mM | 0.2ul |
第二试剂部分
含有酶的试剂部分的材料溶液(溶剂是水)
| 酶 | 酶浓度 | CHAPS | 蔗糖单月桂酸酯 | ACES(pH7.5) | 涂布量 |
| 野生型 | 15KU/ml | 0.20％ | 0.05％ | 75mM | 0.1ul |
| 472D475H | 15KU/ml | 0.20％ | 0.05％ | 75mM | 0.1ul |
| 472E475Y | 15KU/ml | 0.20％ | 0.05％ | 75mM | 0.1ul |
第三试剂部分
含有显色剂的试剂部分的材料溶液(溶剂是水)
将测定样品加入前述葡萄糖传感器的毛细管，然后每0.1秒重复测量吸光度，以制备吸光度的时程。对于每次吸光度测量，沿着毛细管高度的方向用光照射第三试剂部分(3)，在照射后立即接收穿透葡萄糖传感器的光。通过用发光二极管以630nm的光照射，获得光照射。穿透的光用光电二极管接收。
用加入葡萄糖的血液作为测定样品。将加入浓度为0，100，200和400mg/dl葡萄糖的血细胞比容调节为42％的血样用于评估葡萄糖传感器的线性。结果示于图11(野生型)、12(472Glu475Tyr)和13(472Asp475His)。
此外，在血细胞比容调节为42％并且葡萄糖浓度调节为45mg/dl的血样中进一步加入浓度为0，100，200和300mg/dl的麦芽糖，并且用于评估麦芽糖的影响。结果示于图14(野生型)、15(472Glu475Tyr)和16(472Asp475His)。
当在45mg/dl的葡萄糖样品中加入麦芽糖时，对于野生型，吸光度以麦芽糖浓度依赖性方式增加，这表明与麦芽糖的强反应。另一方面，对于采用突变的酶的传感器，抑制了吸光度的麦芽糖浓度依赖性增加，表明麦芽糖的影响较小。通过将这些数据转化为表观血糖升高值而获得的结果示于图17。在采用野生型酶的传感器中，由于麦芽糖的污染，低血糖水平(45mg/dl葡萄糖)表面上显示为正常值(122mg/dl葡萄糖)。另一方面，当使用采用了修饰的GDHs的传感器时，甚至当样品被最多达300mg/dl麦芽糖污染时，表观血糖水平没有升高到正常范围。
从上述结果可以明确看出，在采用突变的GDHs的葡萄糖传感器中，即使线性保持到与野生型相似的程度，对麦芽糖的反应性仍然显著降低。如果采用这些使用突变的GDHs的葡萄糖传感器，对于在医院等施用时上限(200mg/dl)的麦芽糖血液浓度或更高浓度时，不会将低血糖值(50mg/dl或更低)判断为正常值或高血糖水平，因此可以进行安全的治疗性处理。此外，由于上文所述，GDHs不与溶解氧反应，通过提供采用这些突变的GDHs的传感器，可以进行糖尿病患者的准确诊断和治疗。
实施例8：证实第472位的氨基酸取代和除475位外的位置的氨基酸取代的组合的作用
在具有472Phe型取代的突变的GDH中，在邻近第475位的位置(第477-第479位)和从远离第475位的位置中随机选择的位置(第53-73位)中进一步导入苯丙氨酸的取代。
采用表达在第472位含有苯丙氨酸的取代的突变的GDH的pTrc99Aγαβ，按照与实施例2相同的方式导入突变。用于导入该突变的正向引物的序列示于表10和11。反向引物的序列与正向引物链完全互补。
表10
表11
结果示于表12和13。从这些结果可以明确看出，采用472Phe的氨基酸取代和除475位之外的其它位置的取代的组合，观察到了活性丧失、没有发生改变，或仅仅增加对麦芽糖的反应性的作用，因此，证实在任意位置导入突变并不必然获得改进作用。
表12
10mM 10mM
突变的位点 用于取代 葡萄糖 麦芽糖 麦芽糖/葡萄糖
的氨基酸 U/ml U/ml 反应比值
| 472F | None | 6.79 | 0.81 | 12％ | |
| 472F+ | 475 | F(Phe) | 0.75 | 0.07 | 8.7％ |
| 472F+ | 477 | F(Phe) | 0.11 | 0.16 | inactive |
| 472F+ | 478 | F(Phe) | 0.12 | 0.12 | inactive |
| 472F+ | 479 | F(Phe) | 0.21 | 0.21 | inactive |
| 472F+ | 480 | F(Phe) | 0.26 | 0.30 | inactive |
| 472F+ | 481 | F(Phe) | 0.10 | 0.08 | inactive |
| 472F+ | 482 | F(Phe) | 0.06 | 0.08 | inactive |
| 472F+ | 483 | F(Phe) | 4.32 | 0.68 | 15.6％ |
| 472F+ | 484 | F(Phe) | 0.10 | 0.10 | inactive |
| 472F+ | 485 | F(Phe) | 0.18 | 0.24 | inactive |
| 472F+ | 486 | F(Phe) | 1.26 | 0.40 | 32.0％ |
| 472F+ | 487 | F(Phe) | 0.22 | 0.23 | inactive |
| 472F+ | 488 | F(Phe) | 2.85 | 0.65 | 22.9％ |
| 472F+ | 489 | F(Phe) | 1.81 | 0.56 | 31.2％ |
| 472F+ | 490 | F(Phe) | 0.18 | 0.19 | inactive |
| 472F+ | 491 | F(Phe) | 0.23 | 0.23 | inactive |
| 472F+ | 492 | F(Phe) | 0.19 | 0.24 | inactive |
| 472F+ | 493 | F(Phe) | 0.15 | 0.15 | inactive |
| 472F+ | 494 | F(Phe) | 1.15 | 0.29 | 25.0％ |
| 472F+ | 495 | F(Phe) | 0.29 | 0.23 | inactive |
| 472F+ | 496 | F(Phe) | 0.16 | 0.18 | inactive |
| 472F+ | 497 | F(Phe) | 0.14 | 0.16 | inactive |
表13
10mM 10mM
突变的位点 用于取代 葡萄糖 麦芽糖 麦芽糖/葡萄糖
的氨基酸 U/ml U/ml 反应比值
| 472F | None | 6.79 | 0.81 | 11.9％ | |
| 472F+ | 475 | F(Phe) | 0.75 | 0.07 | 8.7％ |
| 472F+ | 53 | F(Phe) | 3.44 | 0.48 | 13.8％ |
| 472F+ | 54 | F(Phe) | 3.00 | 0.54 | 18.2％ |
| 472F+ | 55 | F(Phe) | 3.81 | 0.72 | 18.8％ |
| 472F+ | 56 | F(Phe) | 4.89 | 0.57 | 11.7％ |
| 472F+ | 57 | F(Phe) | 2.41 | 0.41 | 17.2％ |
| 472F+ | 58 | F(Phe) | 3.33 | 0.45 | 13.5％ |
| 472F+ | 59 | F(Phe) | 4.07 | 0.58 | 14.2％ |
| 472F+ | 60 | F(Phe) | 1.55 | 0.37 | 23.7％ |
| 472F+ | 62 | F(Phe) | 1.31 | 0.26 | 19.9％ |
| 472F+ | 63 | F(Phe) | 2.91 | 0.44 | 15.0％ |
| 472F+ | 64 | F(Phe) | 0.54 | 0.28 | 51.4％ |
| 472F+ | 65 | F(Phe) | 5.52 | 0.76 | 13.8％ |
| 472F+ | 66 | F(Phe) | 1.63 | 0.35 | 21.8％ |
| 472F+ | 67 | F(Phe) | 3.91 | 0.48 | 12.3％ |
| 472F+ | 68 | F(Phe) | 4.32 | 0.86 | 19.8％ |
| 472F+ | 69 | F(Phe) | 4.79 | 0.82 | 17.1％ |
| 472F+ | 70 | F(Phe) | 5.34 | 0.64 | 12.0％ |
| 472F+ | 71 | F(Phe) | 1.26 | 0.28 | 22.5％ |
| 472F+ | 72 | F(Phe) | 3.65 | 0.50 | 13.8％ |
| 472F+ | 73 | F(Phe) | 1.20 | 0.26 | 21.3％ |
工业实用性
本发明的突变的GDH对葡萄糖具有改进的底物特异性，并且可以合适地用于采用葡萄糖传感器等测量葡萄糖。
Claims (7)
1.表现出对葡萄糖的改进的底物特异性的突变的葡萄糖脱氢酶，其是由SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成，并且具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白，并且其氨基酸取代突变选自下列突变，其中数字代表氨基酸序列中的位置，氨基酸残基代表在该位置取代后的氨基酸残基，“+”表示同时包括两种氨基酸取代：
(A)472Arg，472Asn，472Asp，472Cys，472Glu，472Gly，472His，472Ile，472Leu，472Met，472Phe，472Pro，472Ser，472Trp，472Tyr，472Val，
(B)475Asp，475Cys，475Glu，475Gly，475Met，475Phe，
(C)472Arg+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，
472Asn+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，
472Asp+475(His，Phe，Ser)，
472Cys+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser)，
472Glu+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，
472Gly+475(Asp，Cys，Gly，Met，Phe，Tyr)，
472His+475(Cys，Glu，His，Met，Phe，Ser)，
472Ile+475(Asp，Cys，Glu，Gly，His，Met，Phe，Ser，Tyr)，
472Leu+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，
472Met+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser)，
472Phe+475(Asp，Glu，Gly，His，Met，Phe，Ser，Tyr)，
472Pro+475His
472Ser+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser)，
472Trp+475(His，Phe，Ser)，
472Tyr+475(Asp，His，Phe，Ser)，
472Val+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser)。
2.权利要求1的突变的葡萄糖脱氢酶，其氨基酸取代突变选自以下突变：
(D)472Arg，472Asn，472Asp，472Glu，472Gly，472Phe，472Pro，
(E)475Asp，475Cys，475Glu，475Gly，475Met，475Phe
(F)472Arg+475(Asp，Gly，His，Phe)，
472Asn+475(Gly，His，Phe，Tyr)，
472Asp+475(His，Ser)，
472Cys+475(Gly，His，Phe)，
472Glu+475(Glu，His，Phe，Tyr)，
472Gly+475(Asp，Phe，Tyr)，
472His+475(His，Ser)，
472Ile+475(Asp，Glu，Gly，His，Ser)，
472Leu+475(Gly，His，Phe，Tyr)，
472Met+475(Asp，Gly，His，Phe)，
472Phe+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，
472Ser+475(Glu，Gly，His，Phe)，
472Trp+475(His，Phe)，
472Tyr+475His，
472Val+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe)。
3.突变的葡萄糖脱氢酶复合物，至少包含权利要求1-2的任一项的突变的葡萄糖脱氢酶和电子转移亚基。
4.编码权利要求1-2的任一项的突变的葡萄糖脱氢酶的DNA。
5.具有权利要求4的DNA并且产生权利要求1-2的任一项的突变的葡萄糖脱氢酶或权利要求3的突变的葡萄糖脱氢酶复合物的微生物。
6.葡萄糖测定试剂盒，包含权利要求1-2的任一项的突变的葡萄糖脱氢酶、权利要求3的突变的葡萄糖脱氢酶复合物或权利要求5的微生物。
7.葡萄糖传感器，包含权利要求1-2的任一项的突变的葡萄糖脱氢酶、权利要求3的突变的葡萄糖脱氢酶复合物或权利要求5的微生物。
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