CN1960825A - 官能化胶态金属组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明包括用于制备官能化/反应性胶态金属组合物的方法和组合物及其用途。本发明包括用于试剂传递系统的组合物和方法，包括治疗化合物、药剂、药物、检测剂、核酸序列和生物因子。一般而言，这些媒介物组合物包括官能化/反应性胶态金属和试剂。本发明还包括治疗癌症的方法和组合物。

Description

官能化胶态金属组合物和方法
技术领域
本发明涉及胶态金属组合物和其制备及使用方法。一般而言，本发明涉及用于试剂全身性传递和将试剂传递到特殊部位的组合物和方法。
背景技术
一直以来，治疗的目标就是找到能够追踪需要治疗的部位并传递治疗应答而没有不适当的副作用的魔弹。为了实现这个目标，人们已经尝试了多种方法。治疗剂经设计以利用活性试剂的差异，比如治疗颗粒的疏水性或者亲水性、或者尺寸，来实现身体细胞的区别治疗。疗法在于通过原位注射将治疗剂传递到身体的特定片段或者特殊的细胞，并利用或者克服限制治疗剂传递的身体防御，比如血脑屏障。
一种已用来将治疗剂特异性靶向传递到特定组织或细胞的方法是基于下列组合的传递：即治疗剂与特殊受体的结合配偶体(bindingpartner)的组合。例如，治疗剂可以是有细胞毒性的或者放射性的，当和细胞受体的结合配偶体组合在一起时，一旦结合到目标细胞上就会导致细胞死亡或者干扰细胞活动的遗传控制。这种类型的传递器械需要对待治疗的细胞类型、受体的有效结合配偶体、和有效的治疗剂具有特异性的受体。分子遗传控制已经被用来克服这些问题中的一部分。
对于特异性试剂的传递而言，重要的、需要的目标是免疫系统。免疫系统是身体的复杂应答系统，涉及具有不同活性的不同种类的细胞。激活一部分免疫系统通常导致由于不需要地激活了该系统的其它相关部分而出现了各种应答。目前，在通过将免疫系统的特定部分作为靶向而产生特别需要的应答上，还没有令人满意的方法或组合物。
免疫系统是身体的复杂的相互作用系统，涉及各种组分，包括细胞和细胞因子，这些组分和来自身体内部和外部的刺激相互作用。除了直接作用以外，免疫系统的应答还受到身体其它系统的影响，所述其它系统包括神经系统、呼吸系统、循环系统和消化系统。
免疫系统较为公知的方面之一是能够对由于生物体入侵、身体内细胞变化、或者接种疫苗带来的外来抗原做出应答。对免疫系统的这种动作做出应答的第一类细胞的一部分是吞噬细胞和天然杀伤细胞。吞噬细胞包括单核细胞、巨嗜细胞、多成核嗜中性白细胞和其它细胞。这些细胞通常结合到外来抗原上，将其内化，并常常将其破坏掉。它们也产生可溶性的分子，这些分子对其它免疫应答比如炎症应答起到介导作用。天然杀伤细胞可以识别和破坏某些感染病毒的胚胎细胞和癌症细胞。免疫应答的其它因素包括补体途径，这些途径能够独立地对外来抗原做出应答或者与细胞或抗体合作作用。
免疫系统的对接种疫苗而言很重要的一个方面是其对特殊病原体或外来抗原的特异性应答。这种应答的一部分包括建立针对该外来抗原的“记忆”。当第二次暴露时，这种记忆功能使得可以对外来抗原做出更快、一般而言更大的应答。和其它细胞及因子合作作用的淋巴细胞在所述记忆功能和应答上都起着重要作用。
一般而言，认为对抗原的应答包括体液应答和细胞应答。体液免疫应答由细胞释放的非细胞因子介导，在血浆或者细胞内流体中可能或者不可能找到游离的所述非细胞因子。免疫系统的体液应答的主要部分是由B淋巴细胞产生的抗体介导的。细胞介导的免疫应答源自细胞(包括抗原呈递细胞、B淋巴细胞(B细胞)和T淋巴细胞(T细胞))的相互作用。
免疫应答能力被最常利用的方面之一是产生单克隆抗体。二十世纪70年代中期单克隆抗体(Mab)技术的发展提供了有价值的新型治疗和诊断工具。研究人员和临床医生第一次获得了能够结合到预定抗原部位并具有各种免疫效应器功能的无限量的均一抗体。目前，制备单克隆抗体的技术在本领域已经公知。
疫苗可以涉及来自另一生物体、变化后的细胞、或者产生外来属性的正常“自体”细胞中的任何外来抗原。外来抗原的给药路径能够有助于确定产生的免疫应答类型。例如，将抗原传递到粘膜表面，比如经口接种活的脊髓灰质炎病毒，刺激免疫系统在该粘膜表面上产生免疫应答。将抗原注射到肌肉组织中常常促进产生长效IgG应答。
一般而言，疫苗可以分成两种类型，全疫苗和亚单位疫苗。全疫苗可以从已经被失活或者减毒或者灭活的病毒或者微生物制备。活的减毒疫苗的优点在于对天然感染的模仿足以激发和对野生生物体的应答相似的免疫应答。这种疫苗一般提供高水平的保护，尤其在通过天然途径接种时，有些可能仅仅需要一个剂量来产生免疫。一些减毒疫苗的另一优点在于它们在人群的成员之间提供人到人的传递。但是，这些优点被一些缺点抵消了。有些减毒疫苗的使用期有限，不能在热带环境下储存。该疫苗还可能还原成该生物体的强致病野生型，从而引起有害的、甚至威胁生命的疾病。对于免疫缺乏状态比如AIDS和怀孕状态而言，减毒疫苗禁用。
灭活疫苗由于不能还原成强致病性状态而具有更高的安全性。一般而言，它们在运输和存储中更加稳定，可用于免疫受损的病人。但是，它们比减毒活疫苗的有效性差，通常要求不止一个剂量。另外，它们不能在人群的成员之间提供人到人的传递。
制备亚单位疫苗需要了解该疫苗应该针对的微生物或细胞的表位。在设计亚单位疫苗时的其它考虑是亚单位的大小以及该亚单位对微生物菌株或细胞的表达程度如何。目前，由于在制备全细菌疫苗时遇到的问题和与全细菌疫苗使用相关的副作用，研制细菌疫苗的关注点已经转向制备亚单位疫苗。这种疫苗包括基于Vi荚膜多糖的伤寒疫苗和针对流感嗜血杆菌的Hib疫苗。
由于使用减毒疫苗带来的安全性考虑和灭活疫苗的低效率，本领域需要能改善疫苗效力的组合物和方法。本领域还需要能改善免疫系统的组合物和方法，该组合物和方法刺激体液应答和细胞介导的应答。本领域还需要能够对免疫应答进行选择性调节并且控制免疫系统的不同组分以产生所需的应答。另外，需要能够使免疫应答加速和扩展从而得到更快的激活应答的方法和组合物。更需要具有用仅仅一个剂量就能提供保护的疫苗在人类和动物群体中进行免疫的能力。
需要的是将特定药剂靶向传递到仅仅目标细胞的组合物和方法。这种组合物和方法应该能够有效地将治疗试剂传递到目标细胞。同样需要的是在体内和体外系统中都可以使用的组合物和方法。
简而言之，目前还没有有效的传递系统用于将特定治疗剂传递到身体特定部位以治疗疾病或者病理学，或者检测所述部位。例如，目前对癌症的治疗包括给药化疗剂和其它生物活性因子比如生物因子和影响整个生物体的免疫因子。副作用包括器官受损、感觉比如味觉和触觉丧失、和掉发。这些疗法提供对病症的治疗，同时也需要许多辅助疗法来治疗副作用。
需要的是用于对所需细胞或部位起作用的试剂传递系统的组合物和方法。这些传递系统可用于将所有类型的药剂传递到特定细胞，所述药剂包括检测、治疗剂、预防和增效剂。需要的是在整个生物体中不产生不需要的副作用的传递系统。另外，需要的是在各种生理学状况(包括pH和存在盐)下稳定的组合物。
发明内容
本发明包括用于试剂传递系统的组合物和方法，所述试剂包括但不限于治疗化合物、药剂、药物、检测剂、核酸序列、抗原、酶和生物因子。一般而言，这些媒介物(vector)组合物包括官能化/反应性胶态金属溶胶，所述金属溶胶连接到待传递的药剂上。
在一个实施方案中，本发明的优选组合物包括媒介物，也可以包括一种或多种有助于媒介物特异性靶向或者具有治疗效果或者可以被检测的试剂，所述媒介物包括和衍生的-PEG，优选硫醇-PEG(PEG(SH)n)，或者衍生的聚-l-赖氨酸，优选聚-l-赖氨酸硫醇(PLL(SH)n)，相缔合的胶态金属溶胶，优选金金属溶胶。
在可替换的实施方案中，优选的组合物包括对试剂进行改性以结合游离的巯基/硫醇基团，随后连接到/结合到官能化/发应性的胶态金属溶胶中。试剂、胶态金属或者两者可以经过改性以结合反应性基团，优选是促进键合的硫醇基团。
本发明还包括用于通过采用衍生的硫醇或者衍生的聚-l-赖氨酸作为还原剂制备官能化/反应性胶态金属溶胶的组合物和方法。采用衍生的硫醇或者衍生的聚-l-赖氨酸能够将硫醇基团结合到胶态金属的表面上。
在另一实施方案中，本发明包括采用衍生的PEG硫醇、衍生的聚-l-赖氨酸或者烷烃硫醇作为还原剂制备官能化/反应性胶态金属溶胶的方法。
本发明还包括通过已知方法比如注射或者经口给药本发明组合物的传递方法，其中所述组合物被传递到特定细胞或器官。本发明的一个方面在于给药途径对于有效传递组合物而言并不重要。预期本领域普通技术人员要能够建立合适的给药途径来实现所需目标。由于胶态金属共轭物在尺寸上和大分子相似，所以它们在检测和成像程序以及作为药物释放或药物传递的长期载体上特别有用。在一个实施方案，本发明包括通过给药本发明的、含有已知能治疗某些疾病的试剂的组合物来治疗疾病的方法，其中所述疾病包括但不限于癌症或实体瘤。另一实施方案包括媒介物组合物，所述媒介物组合物包括和官能化/反应性胶态金属颗粒缔合的衍生PEG、TNF(肿瘤坏死因子)和抗癌剂。另一实施方案包括和胶态金属颗粒缔合的衍生的聚-l-赖氨酸和治疗剂。在另一实施方案中，本发明包括通过给药本发明的、含有用于基因治疗的试剂进行基因治疗的方法，其中所述用于基因治疗的试剂比如低聚核苷酸、反义(antiSense)低聚核苷酸、媒介物、核糖酶、DNA、RNA、有义低聚核苷酸、干扰RNA(RNAi)和核酸。
本发明还包括适于冻干的方法和组合物，以使得所述组合物具有长的保存期限并能够容易地运输。
附图说明：
图1是用烷烃硫醇对胶态金纳米颗粒表面进行改性的示意图。
图2是采用双功能还原剂形成官能化胶态金颗粒的示意图。
图3A是4-臂PEG-THIOL(PEG(SH)4)的示意图。
图3B是用2-亚氨基硫杂环衍生物(2-iminothiolane)使聚-l-赖氨酸硫醇化的方法。
图4是用2ml(A)或者1ml(B)的4-臂PEG-THIOL部分合成官能化胶态金纳米颗粒的颗粒尺寸表征图。
图5用含有5mol(A)或者2mol(B)过量硫醇的聚-l-赖氨酸硫醇盐聚合物合成的官能化胶态金纳米颗粒的颗粒尺寸表征图。
图6是结合质粒DNA的PLL(SH)5官能化胶态金的凝胶。
图7是用于将试剂和官能化胶态金属颗粒结合的装置的示意图。
图8是在官能化胶态金属和试剂两者上的代表性官能基团的表。
具体实施方式
参考包括在文中的对特定实施方案的下列详细描述，将更容易理解本发明。虽然是参考本发明的某些实施方案的具体细节对本发明进行的描述，但是并不意在这些细节应该被认为是对本发明范围的限制。文中提到的对比文件的文本在此全文引入作为参考，包括美国临时申请系列No.60/540075。
本发明包括改进的方法，该改进方法包括采用还原剂制备官能化胶态金属溶胶。在一个实施方案中，本发明包括采用衍生的硫醇或者衍生的聚-氨基酸作为还原剂制备官能化胶态金属溶胶的组合物和方法，从而在形成过程中将硫醇基团结合到胶态金属颗粒中。本发明还考虑采用聚乙二醇(PEG)-硫醇或者硫醇化的聚-l-赖氨酸作为还原剂制备官能化胶态金属溶胶。本领域技术人员公知的其它还原剂也在本
发明的范围之内。
本发明还包括制备所述组合物以及体内和体外给药所述组合物的方法。一般而言，本发明考虑包括和下列组分的任一或者全部、单独或者组合缔合的金属溶胶颗粒：生理活性剂、治疗剂、药剂、药物、检测剂、核酸序列、靶向分子(targeting molecule)、整合分子(integrating molecule)、生物因子、和以下物质的一种或多种：聚乙二醇(PEG)、衍生的PEG、聚-l-赖氨酸、或者衍生的聚-l-赖氨酸。另外，所述试剂可以改性，例如通过结合游离的巯基/硫醇基团改性，随后再连接到/结合到胶态金属溶胶中。
本文所用的术语“胶态金属”、“官能化/反应性胶态金属颗粒”、“官能化纳米颗粒”或者“反应性金属溶胶”可以互换使用，以限定当暴露到还原剂下时形成的官能化/反应性胶态金属颗粒，所述还原剂包括衍生的硫醇、衍生的聚-氨基酸和本领域普通技术人员确定的类似物。除非有明确说明，或者除非上下文有另外说明，这些术语不表示采用柠檬酸钠作为还原剂形成的纳米颗粒(即，Frens方法)。
对本领域技术人员而言，显而易见的是官能化/反应性胶态金属颗粒可以包括在其表面上或者连接到其表面上的另外的官能或者反应性基团。同样，这些另外的反应性或者官能基团可以充当试剂连接的位点。图8给出了可以在官能化胶态金属或者试剂上的或者和其连接的官能团的示例性、非限制性代表的列表。另外，该表提供了代表性的杂双官能连接剂，该连接剂包括至少两个针对两个不同官能团选择的反应性基团。
本发明预期本领域普通技术人员能够使还原剂改性，以使得另外的官能团或者反应基团可以施加到或者连接到官能化/反应性胶态颗粒的表面。预计另外的官能团可以通过还原剂的调制而结合到或者连接到官能化/反应性胶态金属颗粒上。还预计本领域普通技术人员可以调制包括聚合物的还原剂的功能。例如，硫醇化的聚氨基酸，比如聚-l-赖氨酸或者聚-谷氨酸，可以用作还原剂，以将特定类型的官能团加到官能化/反应性胶态金属颗粒上。
在本发明的一个实施方案中，含有游离硫醇基团和聚合物的衍生硫醇可用来形成官能化/反应性金属颗粒。在另一实施方案中，可以改变上述聚合物的官能性以将其它官能团结合到官能化/反应性胶态颗粒上，所述官能团包括但不限于在图8中给出的官能团。在本发明的另一实施方案中，羧基、羟基和胺基可以结合到或者连接到官能化胶态金属颗粒上。
试剂、胶态金属溶胶或者两者可以经过改性以结合反应性基团，比如在图8中示出的那些。在有些情况下，硫醇基团可用来促进结合。
本发明的官能化胶态金属溶胶可用来传递用于检测或者治疗特定细胞或组织的试剂。试剂传递也可用来治疗生理状况，包括但不限于慢性和急性疾病、维护和控制免疫系统和其它生理系统、传染病、接种疫苗、激素维护和控制、癌症、实体瘤和血管原性状态。所述传递可以以允许将一种或多种试剂以无毒方式传递的方法，靶向特定细胞或细胞类型，或者以较弱特异性提供到全身。在下列文献中教导了金属溶胶组合物的说明和使用：美国专利No.6274552、6407218、6528051；和相关的专利申请，即美国专利申请No.09/808809、09/189657、10/135886、10325485、10672144、 11/004623和09/803123；和美国临时专利申请60/287363，所有上述文献在此全文引入作为参考。
本发明的组合物优选包括胶态金属溶胶、衍生的化合物、和一种或多种试剂或改性的试剂。该试剂可以包括可用于治疗用途的生理活性剂或者可用于检测和/或成像方法的试剂。在另外的实施方案中，一种或多种试剂与胶态金属直接或间接混合、缔合、或者结合。混合、缔合和结合包括共价键和离子键，以及其它使得衍生的PEG或者衍生的聚-l-赖氨酸、试剂和其它组分可以互相以及与金属溶胶颗粒长期或者短期缔合的更弱或者更强的缔合。
在另一实施方案中，组合物可以任选地含有与胶态金属混合、缔合或者结合的一种或多种靶向分子。靶向分子可以直接或者间接结合到金属颗粒上。间接结合包括通过分子比如整合分子的结合，或者与同时结合到靶向分子和选自下列物质之一的分子的缔合：金属溶胶或者结合到金属溶胶上的另一分子。
特别关注的是检测剂，比如用于观察或者检测螯合的胶态金属媒介物的染料、分子标记分子或者放射性材料。荧光材料、化学发光材料、热敏材料、不透明材料、小球、磁性材料和振动材料也被考虑用作和本发明组合物中的胶态金属缔合或者结合的检测剂。
任何金属盐都可用于本发明。本文所用的术语“金属”包括水溶胶、金属溶胶、或者任何分散在液体或者水中的水不溶性金属颗粒或者金属化合物。其盐可用于本发明的金属的例子包括但不限于周期表IA、IB、IIB和IIIB族中的金属，以及过渡金属，尤其是VIII族的金属。优选的金属盐包括金、银、铝、钌、锌、铁、镍和钙。其它合适的金属盐也包括下列以其全部氧化态存在的金属：锂、钠、镁、钾、钪、钛、钒、铬、锰、钴、铜、镓、锶、铌、钼、钯、铟、锡、钨、铼、铂和钆。金属盐优选以源自合适金属化合物的离子形式提供，例如Al3+、Ru3+、Zn2+、Fe3+、Ni2+和Ca2+离子。
另一种优选的金属盐是金，尤其是Au3+形式。胶体金的特别优选形式是HAuCl4(OmniCorp，South Plainfield，NJ)。胶体金包括Au0的纳米颗粒，该纳米颗粒通过固有的负表面电荷使颗粒互相排斥从而保持在悬浮体中。1857年，Michael Faraday通过用柠檬酸钠还原氯化金第一次制备了纳米尺度的Au0颗粒。(Faraday，Philos.Trans.R.Soc.London 14：1145，1857)。Frens(Frens，Nature Phys.Sci.241：20-22，1972)和Horisberger(Biol.Cellulaire 36：253-258，1979)对Faraday的发现进行了深化研究，证实纳米颗粒的尺寸由金和柠檬酸根的比控制。在另一实施方案中，衍生的硫醇或者衍生的聚-氨基酸可用作还原剂。在优选实施方案中，PEG-硫醇或者硫醇化的聚-l-赖氨酸可用作还原剂。
胶体是颗粒在溶液中的均匀分散体，不会轻易地从溶液中沉降或者沉淀析出。胶体的稳定源自通过吸附的离子产生的表面电荷。表面电荷导致颗粒互相排斥。通常观察到纳米颗粒通过三步骤过程形成：成核、颗粒生长和絮凝。
成核是核的形成，在所述核上能够进行颗粒生长。通过氧化还原反应成核。在历史上，这个过程依赖于柠檬酸盐离子的氧化以产生金的还原剂，即丙酮二羧酸。发生一种类型的聚合，即“络合”，其中金离子核丙酮二羧酸形成配位而结合在一起。当所述“聚合物”或者络合物达到临界质量时，即刚刚大于其热力学稳定值时，发生向金属金的还原，从而成核。
颗粒生长是在已有核上加入更多的金。当所有的金都被消耗时，这个过程停止。形成更大的金颗粒要求多个核的凝聚。如同Frens和Horisberger所报导的那样，调节柠檬酸钠和金的比例导致形成了不同尺寸的颗粒。因此，在制备过程中对凝聚过程的控制确定了颗粒的尺寸、结构和尺寸分布。当金颗粒制备完成时，由于不存在凝聚现象而确保了它的稳定性。
在一个实施方案中，胶态金颗粒在大约中性pH下具有负电荷。认为这种负电荷防止了其它带负电荷分子的吸引和附着。相反，带正电荷的分子被吸引并且结合到胶态金颗粒上。胶态金固有的负表面电荷使颗粒保持为溶胶状态。但是，通常在盐溶液中存在的阳离子中和这种电荷，导致颗粒团聚并从溶胶中沉淀。另外，生物分子，比如吸附到颗粒表面的蛋白质，也会使颗粒表面电荷变成相反符号。在本发明中，通过改性附着的试剂或者胶态金属溶胶，优选是胶态金溶胶，克服了团聚和沉淀问题。在对附着的试剂进行改性时，衍生物比如硫醇基团添加到试剂上导致试剂和胶态金溶胶形成配价键(dactive bond)。在对胶态金颗粒表面进行改性时，在颗粒合成的过程中采用了烷烃硫醇以在胶态颗粒和试剂之间形成双官能交联剂，这是因为硫醇基团起到将烷烃硫醇连接到颗粒表面的作用，而且同时该反应性基团充当供试剂附着的受体分子(参见图1)。
形成官能化金纳米颗粒的可替换方法是本领域公知的。简而言之，在颗粒形成过程中加入了含有游离硫醇基团的官能化聚合物。但是，仍然会通过上述Frens方法形成颗粒，并且该颗粒形成需要通过单独的试剂比如NaBH4使氯化金还原。因此，颗粒还原剂和用于使金颗粒官能化的试剂是不同的实体。
在本发明的一个实施方案中，可以采用衍生硫醇或者衍生的聚-l-赖氨酸作为还原剂制备金颗粒(参见图2)。衍生硫醇或者衍生的聚-l-赖氨酸的使用使得硫醇基团被结合到胶态金颗粒中。尽管并不想受到下列理论的束缚，但是目前的理论是硫醇基团的存在通过将氯化金还原成金核而启动了颗粒形成。和传统的通过Frens方法形成胶态金溶胶不同，这些溶胶当暴露到盐中时完全稳定。
Frens/Horisberger方法经过明显不同的阶段形成胶态金纳米颗粒。加入柠檬酸钠后，立刻启动颗粒成核，观察到氯化金溶液的颜色从黄色变成近乎澄清的溶液。在成核后，颗粒生长的程度和凝聚导致发生一系列进一步的颜色变化。有相当的文献记载纳米颗粒溶液经历变黑、变棕、和最终变成红色。这个过程代表了大量的破裂反应，这些破裂反应导致形成越来越小的颗粒。黑色溶液可以表明是超聚集体，继而变成棕色溶液表明是大颗粒，而单分散的或者单个的胶体金颗粒看起来是红色溶液。
令人感兴趣的是，本发明并没有复制上述反应。和Frens制备过程相似，氯化金溶液在暴露到双官能还原剂中时发生颜色变化，从黄色变成澄清溶液。这些数据表明，和Frens制备过程相似，本发明的官能化/反应性金颗粒通过成核反应形成。但是，接着成核步骤的颗粒生长看起来是源自不同的机制。和Frens描述的黑色/棕色/红色不同，本发明的溶液在成核后首先看起来是淡红色/桔黄色。随着时间的流逝，颜色浓度加深，并且变得稳定。这种观察结果表明Frens纳米颗粒和本发明纳米颗粒的形成之间存在着潜在的差异。尽管不想受到下列理论的束缚，但是目前的理论是成核后观察到的红色支持了如下解释：即，单独的金核是通过双官能还原剂形成的，而且这些金核在颗粒生长过程中保持单分散状态，因而防止了在Frens方法中观察到的颗粒团聚和凝聚。
本申请描述了采用双官能还原剂形成官能化/反应性胶态金属颗粒。本发明的有利方面是在胶态金属颗粒表面上的官能团可以用作连接位点，以附着通常不会结合到所述官能化/反应性胶态金属颗粒上的试剂。在下列非限制性实施例中，所公开的方法提到的是胶态金，这仅仅是出于解释目的。简而言之，双官能还原剂被用以形成金颗粒并将官能团置于金颗粒表面上。在这种情况下，还原剂包含直链或支链构造的核心分子/聚合物。还原剂进一步包含游离的硫醇基团和反应性基团。硫醇基团起到供电子的作用从而将氯金酸(cholorauric acid)还原成金原子簇。这些金核充当颗粒可以生长的平台。尽管不想受到下列理论的束缚，但是目前的理论是随着金颗粒尺寸变大，所述核心分子/聚合物嵌入到金颗粒的结构中。在金颗粒表面上存在的核心分子/聚合物起到使金颗粒稳定而不发生盐沉淀的作用。另外，官能化/反应性胶态金颗粒使得通常不会直接结合到金颗粒上的试剂可以结合。
胶态金以溶胶形式采用，含有颗粒尺寸范围为约1-约100纳米的金颗粒。在另一实施方案中，颗粒尺寸包含约1纳米-约60纳米，但是优选尺寸为大约20-40纳米的颗粒尺寸。这种金属离子可以单独在溶胶中存在，或者和其它无机离子一起存在。
另一种优选的金属盐是银，尤其是在硼酸钠缓冲液中的银，浓度为大约0.1％-0.01％，最优选大约为0.01％溶液。优选的，这种胶态银溶液的颜色是黄色，胶态颗粒的尺寸为1-100nm。在另一实施方案中，颗粒尺寸包括大约1nm-大约60nm，但是优选颗粒尺寸为大约20-40nm。这种金属离子可以以络合物形式单独存在，或者和其它无机离子同时存在。胶态银可以类似地通过加入硫醇基团进行改性。
本发明的试剂可以是任何化合物、化学物质、治疗剂、药用剂、药物、生物因子、酶、抗原、生物分子片段比如抗体、蛋白质、脂质、核酸或者碳水化合物；核酸、抗体、蛋白质、脂质、营养物、辅因子、滋补药(nutriceutical)、麻醉剂、检测剂或者在身体内有效果的试剂。所述检测剂和治疗剂以及其活性是本领域普通技术人员公知的。另外，试剂可以经过改性以包括游离巯基/硫醇基团。在硫醇化对药物功能有负面影响的情况下，需要用于将试剂连接到胶体颗粒上的二级方法。本发明通过将官能团结合到胶体颗粒表面上以便药物附着到颗粒上解决了这个问题，所述官能团包括但不限于烷烃硫醇。
下面是可用于本发明的一些试剂的非限制性例子。可用于本发明的一种类型的试剂包括生物因子，所述生物因子包括但不限于细胞因子、生长因子、具有治疗活性的较大分子的片段、神经化学物质、和细胞通讯分子。这种试剂的例子包括但不限于白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-3(“IL-3”)、白细胞介素-4(“IL-4”)、白细胞介素-5(“IL-5”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、白细胞介素-7(“IL-7”)、白细胞介素-8(“IL-8”)、白细胞介素-10(“IL-10”)、白细胞介素-11(“IL-11”)、白细胞介素-12(“IL-12”)、白细胞介素-13(“IL-13”)、白细胞介素-15(“IL-15”)、白细胞介素-16(“IL-16”)、白细胞介素-17(“IL-17”)、白细胞介素-18(“IL-18”)、脂质A、磷酯酶A2、内毒素、葡萄球菌肠毒素B和其它毒素、I型干扰素、II型干扰素、肿瘤坏死因子(“TNFα或β”)、转化生长因子-α(“TGF-α”)、淋巴毒素、迁移抑制因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“CSF”)、单核细胞-巨噬细胞CSF、粒细胞CSF、血管上皮生长因子、血管生成素、转化生长因子-β(“TGF-β”)、血型的碳水化合物部分、Rh因子、成纤维细胞生长因子、和其它的炎症和免疫调节蛋白质、核苷酸、DNA、RNA、mRNA、有义(sense)、反义、癌症细胞特异性抗原；比如MART、MAGE、BAGE、和热休克蛋白(HSP)；突变体p53；酪氨酸酶；粘蛋白，比如Muc-1、PSA、TSH、自身免疫抗原；免疫治疗药，比如AZT；和生血管药物和抗生血管药物，比如制管张素、内皮抑制素、碱性成纤维细胞生长因子、和血管内皮生长因子、前列腺特异性抗原和促甲状腺素、GABA、乙酰胆碱、CD40配体、B7族共刺激因子、Anti-CTLA4、和BLYS。
另一种类型的试剂包括激素。这种激素的例子包括但不限于生长激素、胰岛素、胰高血糖素、甲状旁腺激素、黄体生成素、促卵泡激素、黄体生成素释放激素、雌激素、睾丸素、二氢睾丸素、雌二醇、prosterol、黄体酮、孕酮、雌酮、其它性激素、以及激素的衍生物和类似物。
另一类型的试剂包括药剂。在本发明中可以采用任何类型的药剂。例如，在本发明中可以采用消炎剂比如类固醇和非类固醇消炎剂、可溶性的受体、抗体、抗生素、止痛剂、血管生成剂和抗血管生成剂、和COX-2抑制剂。本发明特别关注的是化疗剂。这种试剂的非限制性例子包括红豆杉醇、紫杉醇、紫杉烷、长春碱、长春新碱、阿霉素、无环鸟苷、顺铂氨甲蝶呤、光辉霉素、苯丙氨酸和他克林。
免疫治疗剂也是本发明特别关注的。免疫治疗剂的非限制性例子包括炎症剂、生物因子、免疫调节蛋白质、和免疫治疗药物，比如AZT和其它衍生的或者改性的核苷酸。小分子也可以用作本发明的试剂。
另一种类型的试剂包括基于核酸的材料。这种材料的例子包括但不限于核酸、核苷酸、核苷酸类似物、DNA、RNA、tRNA、mRNA、有义核酸、反义核酸、干扰RNA(RNAi)、核糖酶、DNA、酶、蛋白质/核酸组合物、SNP、低聚核苷酸、媒介物、病毒、质粒、转座子、和其它本领域技术人员公知的核酸构建体(nucleic acid construct)。
可用于本发明的其它试剂包括但不限于配体、细胞表面受体、抗体、放射性金属或分子、检测剂、酶和酶辅助因子。
特别关注的是可用来观察或者检测螯合的胶态金属媒介物的可检测试剂，比如染料或者放射性材料。荧光材料、化学发光材料、热敏材料、不透明材料、小球、磁性材料和振动材料，也被考虑用作和本发明组合物中的官能化/反应性胶态金属缔合或者结合的可检测试剂。
这些试剂可以单独采用或者组合采用。可以以游离态或者络合态使用，比如和胶态金属的组合。
靶向分子也是本发明组合物的组分。一种或多种靶向分子可以和所述官能化/反应性胶态金属直接或者间接附着、结合或者缔合。这些靶向分子可以指向特殊的细胞或者细胞类型、源自特定胚胎组织、器官或者组织的细胞。所述靶向分子包括能够选择性结合到特定细胞或细胞类型上的任何分子。一般而言，所述靶向分子是结合对的一个成员，并因而选择性地结合到另一个成员上。可以通过结合到在细胞上发现的天然结构来获得所述选择性，所述天然结构比如在细胞膜上、核膜上找到的受体或者与DNA缔合的受体。结合对成员也可以以合成方式引入到细胞、细胞类型、组织或器官上。靶向分子也包括可以结合到在细胞膜中出现的分子或者在细胞膜外的分子上的受体或者受体部分、配体、抗体、抗体片段、酶、辅助固子、底物、和本领域技术人员公知的其它结合对成员。靶向分子也能够结合到多种类型的结合配偶体上。例如，靶向分子可以结合到一类或者一族受体或者其它结合配偶体上。靶向分子也可以是酶底物或者能够结合多种酶或者多种类型酶的辅助因子。
靶向分子的具体例子包括但不限于白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-3(“IL-3”)、白细胞介素-4(“IL-4”)、白细胞介素-5(“IL-5”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、白细胞介素-7(“IL-7”)、白细胞介素-8(“IL-8”)、白细胞介素-10(“IL-10”)、白细胞介素-11(“IL-11”)、白细胞介素-12(“IL-12”)、白细胞介素-13(“IL-13”)、白细胞介素-15(“IL-15”)、白细胞介素-16(“IL-16”)、白细胞介素-17(“IL-17”)、白细胞介素-18(“IL-18”)、CD40配体、BLYS、B7、脂质A、磷酯酶A2、内毒素、葡萄球菌肠毒素B和其它毒素、I型干扰素、II型干扰素、肿瘤坏死因子(“TNFα”)、转化生长因子-α(“TGF-α”)、EGF、热休克蛋白质、淋巴毒素、迁移抑制因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“CSF”)、单核细胞-巨噬细胞CSF、粒细胞CSF、血管上皮生长因子、血管生成素、转化生长因子-β(“TGF-β”)、血型的碳水化合物部分、Rh因子、成纤维细胞生长因子、和其它的炎症和免疫调节蛋白质、激素，比如生长激素、胰岛素、胰高血糖素、甲状旁腺激素、黄体生成素、促卵泡激素、黄体生成素释放激素、细胞表面受体、抗体、核酸、核苷酸、DNA、RNA、有义核酸、反义核酸、癌症细胞特异性抗原、MART、MAGE、BAGE、和热休克蛋白(HSP)、突变体p53；酪氨酸酶；自身免疫抗原；免疫治疗药，比如AZT、和生血管药物和抗生血管药物，比如制管张素、内皮抑制素、血管内皮生长因子(VEGF)、前列腺特异性抗原、促甲状腺素、受体蛋白质、葡萄糖、糖原、磷脂、和单克隆和/或多克隆抗体、碱性成纤维生长因子、酶、辅助因子和酶底物。
可用于本发明的助剂包括但不限于热灭活的奶油分枝杆菌(M.butyricum)和结核分枝杆菌(m.tuberculosis)。核苷酸的非限制性例子是DNA、RNA、mRNA、有义和反义。免疫原性蛋白的例子包括但不限于KLH(匙孔血红蛋白)、甲状腺球蛋白、CpG模体、毒素比如破伤风类毒素、琼脂糖、葡聚糖和二氧化硅、BCG、和融合蛋白，这些物质具有助剂和编码在基因中的抗原部分。
用于本发明的整合分子或者可以是特异性结合整合分子，比如结合对的成员，或者可以是结合时特异性较弱的非特异性结合整合分子。本发明的组合物可以含有一种或多种整合分子。本文定义的整合分子是结合到细胞表面受体并结合到胶态金颗粒表面的分子。这和用作还原剂以形成官能化/反应性胶态金颗粒的聚-1-赖氨酸不同。在颗粒形成过程中，衍生的聚-l-赖氨酸的“还原”端部被捕获到胶态金颗粒的内核中，留下聚-l-赖氨酸自由摆动以充当自身可以充当整合分子或者充当治疗剂的试剂的附着位点。
特异性结合-整合分子包括可用于本发明的结合对的任何成员。所述结合对是本领域技术人员公知的，包括但不限于抗体-抗原对、酶-底物对、受体-配体对、和链霉抗生物素-生物素。除了这种已知的结合对以外，可以特别设计新型的结合对。结合对的特点是结合对两个成员之间的结合。结合对的另一所需特点是该对的一个成员能够结合到或者被结合到一种或多种试剂或者靶向分子上，而该对的另一成员能够结合到金属颗粒上。
蛋白质通过三种机制的一种结合到胶态金颗粒表面上。这些机制中的两种，即离子结合和疏水结合，是较弱的相互作用，通常导致形成质量较差的媒介物。第三种方法涉及在生物分子的游离巯基/硫醇和颗粒表面上的金原子之间形成配价键(配位共价键)。配价键非常稳定，具有和共价键等同的能量，只会被强的还原剂比如二硫醇苏糖醇或者β巯基乙醇中断。通过形成配价键结合到官能化/反应性胶态金纳米颗粒上的蛋白质非常稳定，并保留了其生物活性。
本发明组合物的另一组分包括二醇化合物，优选聚乙二醇(PEG)，更优选衍生的PEG。图3A示出了这种类型分子的例子的示意图，由聚乙二醇的10kD聚合物的4个亚单元组成。本发明包括组合物，该组合物包括衍生的PEG，其中PEG的分子量为500-100000MW。在本发明的一个实施方案中，衍生的PEG的分子量是5000-80000。在可替换的实施方案中，衍生的PEG的分子量大约是5000-60000。在又一实施方案中，衍生的PEG的分子量是10000-40000。在优选实施方案中，衍生的PEG的分子量是5000-30000。衍生的PEG化合物可以购自比如Shearwater Corpoartion，Huntsville，AL或者Sunbio Inc.。PEG化合物可以是双官能的或者单官能的，比如甲氧基-PEG(mPEG)。本发明考虑采用具有任何衍生基团的任何尺寸的PEG，但是优选的衍生PEG包括mPEG-OPSS/2000、mPEG-OPSS/5000、mPEG-OPSS/10000、mPEG-OPSS/12000、mPEG-OPSS/20000、mPEG-OP(SS)2/2000、mPEG-OP(SS)2/3400、mPEG-OP(SS)2/8000、mPEG-OP(SS)2/10000、硫醇-PEG-硫醇/2000、mPEG-硫醇5000、和mPEG硫醇10000、mPEG硫醇12000、mPEG硫醇20000、30000、40000(Sun-BIO，Inc.)。直链和支链PEG的活化衍生物可以具有各种分子量。本文所用的术语“衍生的PEG”或者“PEG衍生物”是指通过官能团、化学实体的加成或者其它PEG基团的加成而由直链分子提供支链的任何聚乙二醇分子。所述衍生的PEG可用于和生物活性化合物共轭、制备聚合物接枝、或者由该衍生分子提供的其它功能。
一种类型的PEG衍生物是在一个或两个末端具有伯氨基的聚乙二醇分子。优选的分子是在一个末端具有氨基的甲氧基PEG。另一种类型的PEG衍生物包括亲电活化的PEG。这些PEG用于使PEG或者甲氧基PEG(mPEG)附着到蛋白质、脂质体、可溶性和不溶性聚合物和各种分子上。亲电活化PEG衍生物包括PEG丙酸的琥珀酰亚胺、PEG丁酸的琥珀酰亚胺、附着到羟基琥珀酰亚胺或者醛上的多个PEG、mPEG双酯(mPEG-CM-HBA-NHS)、mPEG苯并三唑碳酸酯、和mPEG丙醛、mPEG乙醛二乙基乙缩醛。
优选类型的衍生PEG包括硫醇衍生的PEG或者巯基选择性PEG。带支链的、分叉的或者线性的PEG可以用作分子量为5000-40000mw的PEG骨架。优选的硫醇衍生PEG包括具有马来酰亚胺官能团的PEG，硫醇基团可以和所述马来酰亚胺官能团共轭。优选的硫醇-PEG是其中PEG mw为5000-40000的甲氧基-PEG-马来酰亚胺。
本发明也考虑采用杂官能化PEG作为衍生的PEG。PEG的杂官能衍生物具有通式结构X-PEG-Y。当X和Y是提供共轭能力的官能团时，在PEG分子的末端之一或者全部上可以结合许多不同的实体。例如，X可以是乙烯基砜或者马来酰亚胺，Y可以是NHS酯。对于检测方法而言，X和/或Y可以是荧光分子、放射性分子、发光分子或者其它可检测的标记物。杂官能化PEG或者单官能化PEG可用于和结合对的一个成员共轭，所述结合对比如PEG-生物素、PEG-抗体、PEG-抗原、PEG-受体、PEG-酶或者PEG-酶底物。PEG也可以和脂质共轭，比如PEG-磷脂。
本发明组合物的另一组分包括二醇化合物，优选聚-l-赖氨酸组合物，更优选衍生的聚-l-赖氨酸组合物。图3B给出了这种分子的例子的示意图。为了制备聚-l-赖氨酸，采用合适的还原剂比如2-亚氨基硫杂环衍生物使该聚合物在其多个游离氨基上进行硫醇化。
本文所用的术语“衍生的聚-l-赖氨酸”或者“聚-l-赖氨酸衍生物”是指已经通过官能团、化学实体的加成或者其它聚-l-赖氨酸基团的加成而发生改变以从直链分子变成支链分子的任何聚-l-赖氨酸。所述衍生的聚-l-赖氨酸基团可用于和生物活性化合物共轭、制备聚合物接枝、或者提供由该衍生分子提供的其它功能。
硫醇化的烷烃被用于对胶态金属纳米颗粒表面进行改性。烷烃硫醇充当金颗粒和试剂之间的双官能交联剂，这是因为硫醇基团起到使烷烃硫醇连接到颗粒表面上的作用，而反应性基团充当供试剂附着的受体分子。
本发明组合物的一种或多种试剂可以直接结合到官能化/反应性胶态金属颗粒上，或者可以通过一个或者多个整合分子间接结合到胶态金属上。制备本发明胶态金属溶胶的一种方法采用了Horisberger描述的方法(Biol.Cellulaire 36：253-258，1979)，该文献在此全文引入作为参考。在采用了整合分子的实施方案中，整合分子和金属溶胶结合、混合或者缔合。试剂可以在整合分子和金属结合、混合或者缔合之前与所述整合分子结合、混合或者缔合，或者可以在整合分子和金属结合之后进行结合、混合或者缔合。
用于将试剂结合到金属溶胶上的一般方法包括下列步骤。在缓冲液或者溶剂，比如去离子水(diH2O)中，形成试剂溶液。合适的缓冲液或者溶剂取决于待结合的试剂。为给定溶剂确定合适的缓冲液或者溶剂是普通技术人员掌握的知识水平。对本领域技术人员而言，确定将最佳量的试剂结合到金属溶胶所需的pH也是公知的。可以通过确定蛋白质、治疗剂或者检测剂的定量方法，比如ELISA或者分光光度法，来确定结合的试剂量。
将试剂结合到官能化/反应性金属溶胶，比如硫醇化的金属溶胶，上的方法包括下列步骤，本文公开的方法涉及的是将单一试剂(TNF)结合到硫醇化的金属溶胶(胶态金)上，但这仅仅是出于解释目的。采用了使得硫醇化的胶态金溶胶颗粒可以和蛋白质溶液中的TNF发生相互作用的装置。图7给出了该装置的示意图。该装置通过缩小混合室的体积，使得硫醇化的胶态金颗粒和待结合蛋白质(TNF)的相互作用达到最大化。该装置使得可以在小体积的T形连接器中发生大量金溶胶和大量TNF的相互作用。相反，将少量蛋白质加到大量硫醇化的胶态金颗粒中并不是确保蛋白质和金颗粒互相之间均匀结合的优选方法。相反方法，即将少量硫醇化的胶态金加到大量蛋白质中，也不是优选方法。从物理上而言，利用单个将硫醇化的胶态金颗粒和TNF蛋白质从两个大容器中抽吸出来的蠕动泵，迫使所述硫醇化的胶态金颗粒和蛋白质TNF进入T形连接器。为了进一步确保混合适当，在T形连接器的下游最近处设置了在线混合器。该混合器强力混合硫醇化的胶态金颗粒和TNF，金颗粒和TNF都以大约1L/min的优选速率流过连接器。
在和试剂混合之前，采用1N NaOH将金溶胶的pH调至pH8-9。调节金溶胶pH的优选方法是采用100mM的TRIS将硫醇化胶态金溶胶的pH调至pH6。将高度纯化的、冷冻干燥的重组人类TNF在3mMTris中重构和稀释，并用0.25X的标准磷酸盐缓冲盐溶液(77.25毫渗摩/kg)稀释，使TNF的最终浓度为0.5μg/ml。在将溶胶或者TNF加到各自的容器中之前，用夹子关闭连接所述容器和T形连接器的管道。将等体积的硫醇化胶态金溶胶和TNF溶液加到合适容器中。在一个实施方案中，试剂在溶液中的浓度为大约1ng/ml-50μg/ml。(是否这个范围太宽或者可以接受)。试剂在溶液中的优选浓度是大约0.01-15μg/ml，可以根据试剂和金属溶胶颗粒的比值发生变化。TNF在溶液中的优选浓度是0.5-4μg/ml，就TNF-胶态金组合物而言，最优选的TNF浓度是0.5μg/ml。本发明认为本领域技术人员可以获知将和硫醇化的金属溶胶结合、混合或者缔合的每种试剂的合适或者优选浓度。
一旦溶液被正确加入其各自的容器中，则打开蠕动泵，将试剂溶液和硫醇化的胶态金溶液吸入T形连接器，并通过在线混合器、蠕动泵进入收集瓶。混合溶液在收集瓶中另外搅拌1小时以进行培养。
在要求另外的PEG(衍生的或者非衍生的)的硫醇化金属溶胶组合物中，制备所述组合物的方法包括下列步骤，本文中公开的方法涉及的是将PEG或者PEG硫醇加到硫醇化的金属溶胶组合物中，但这仅仅出于解释目的。采用下列步骤可以制备任何PEG，即衍生的PEG组合物或者任何尺寸的PEG组合物或者含有多种不同PEG的组合物。在上述1小时的培养之后，将PEG或者硫醇衍生的聚乙二醇(PEG)溶液加入胶态金/TNF溶胶中。本发明考虑采用具有任何衍生基团的任何尺寸的PEG，但是优选的衍生PEG包括mPEG-OPSS/5000、硫醇-PEG-硫醇/3400、mPEG-硫醇5000、和mPEG硫醇20000(Shearwater Polymers，Inc.)。优选的PEG是在水中浓度为150μg/ml的mPEG-硫醇5000，pH为5-8。因此，将PEG的10体积％溶液加到胶态金-TNF溶液中。金/TNF/PEG溶液另外培养1小时。
在可替换的实施方案中，TNF和PEG-硫醇部分同时结合到硫醇化的胶态金纳米颗粒上。在这种方法中，采用100nM TRIS碱将胶态金纳米颗粒的pH调至6.0。类似地，采用所述100mM TRIS溶液将水的pH调至6.0。在后一溶液中，分别将TNF和PEG-硫醇(20000)稀释到5和15μg/ml的最终浓度。将硫醇化的胶态金纳米颗粒和TNF/PEG-硫醇溶液都加入到各自的容器中，采用蠕动泵通过T形连接器吸取每种溶液使其通过所述T形连接器和在线混合器而结合。在结合进行15分钟后，在硫醇化的胶态金/TNF/PEG-硫醇溶液中加入人血清白蛋白(200μg/ml，在水中)，并培养另外15分钟。
胶态金/TNF/PEG溶液随后通过50K MWCO透滤盒进行超滤。用ELISA测量所述50K滞留物和渗透物的TNF浓度，以确定结合到金颗粒上的TNF量。
在透滤后，加入防冻剂(20mg/ml)和/或人血清白蛋白(5mg/ml)，并在-80℃使试样冷冻，所述防冻剂包括但不限于甘露醇组合物。试样经冷冻干燥、真空密封、随后进行重构，和可以分析该重构试样中的游离TNF量和胶态金结合TNF的量，或者直接采用。
本发明的组合物可以给药到体外系统和体内系统。体内给药可以包括直接施加到靶细胞，或者施加到包括但不限于下列的给药途径：适于经口给药、直肠给药、经皮给药、眼给药(包括玻璃体内或者前房内)、鼻给药、局部给药(包括口腔给药和舌下给药)、阴道给药或者不经肠给药(包括皮下给药、肌肉给药、静脉给药、皮内给药、气管内给药和硬膜外给药)的制剂。优选的方法包括经口或者注射路径给药有效量的含有本发明媒介物的组合物。
该制剂可以方便地以单位剂量形式提供，并可以通过常规制药技术制备。通过将金属溶胶媒介物和药用载体或者赋型剂结合在一起，制备药剂组合物。一般而言，通过将所述组合物和液体载体或者细分散的固体载体或者两者均匀而紧密的结合在一起，并在需要时使制品成型，来制备制剂。
使用本发明组合物的优选方法包括将媒介物靶向肿瘤。优选的媒介物组合物包括官能化/反应性金属颗粒、试剂和PEG、衍生的PEG、聚-l-赖氨酸、或者衍生的聚-l-赖氨酸组合物，用以传递到肿瘤部位而在所述肿瘤或生物体上实现治疗效应或者肿瘤检测。所述媒介物组合物可以进一步包括靶向分子和/或整合分子。其它优选的媒介物组合物包括官能化/反应性金属颗粒、放射性试剂或者细胞毒性试剂、和PEG、衍生的PEG、聚-l-赖氨酸、或者衍生的聚-l-赖氨酸组合物，用以将放射治疗药物传递到肿瘤部位。历史上，放射性胶态金用作癌症治疗药物，由于预期肝脏细胞会摄入胶态金，所以主要用于治疗肝脏。本发明的优选组合物含有衍生PEG、优选PEG硫醇(PEG(SH)n)和放射性官能化胶态金属颗粒的组合，用于治疗或鉴别肿瘤。可替换地，含有衍生的聚-l-赖氨酸，优选聚-l-赖氨酸硫醇(PLL(SH)n)，和放射性胶态金属颗粒的组合的组合物也可用于治疗或鉴别肿瘤。可替换地，含有连接到结合在胶态金属上的蛋白质的放射性部分、并进一步含有衍生PEG(优选PEG-硫醇)或者衍生的聚-l-赖氨酸(优选聚-l-赖氨酸硫醇)的媒介物组合物，形成了放射性媒介物，可用于治疗肿瘤。本发明的放射性媒介物组合物经静脉注射并流通到肿瘤部位，不会明显地被肝脏吸收。在两种组合物中，相信PEG硫醇或者聚-l-赖氨酸硫醇将放射性治疗集中在肿瘤中的能力提高了治疗效力，同时减少了治疗的副作用。认为本发明的组合物尤其适于实体瘤的治疗、检测和成像。在优选实施方案中，本发明的组合物用于治疗实体瘤。
本发明包括在用于将外源核酸或者遗传材料传递到细胞的方法中的组合物。可以采用能够识别特定细胞的靶向分子将外源遗传材料靶向特定细胞，或者采用包含PEG、衍生PEG、聚-l-赖氨酸或者衍生聚-l-赖氨酸的组合物将外源遗传材料特定地靶向肿瘤。例如，靶向分子是细胞上的特定受体的结合配偶体，在结合后，整个组合物可以内化到细胞中。媒介物组合物的结合可以激活改变细胞状态的细胞机制，比如激活细胞中的二级信使分子。因此，在不同细胞类型的混合物中，外源核酸被传递到具有所选受体的细胞中，没有这种受体的细胞不受影响。
本发明包括用于在体内或者体外使特定细胞转染、用于插入或者施加试剂的组合物和方法。这种组合物的一个实施方案包括结合到聚阳离子上的核酸，所述聚阳离子结合到胶态金属上。本发明的优选实施方案包括胶态金作为能够结合靶向分子和核酸剂的平台，以形成靶向的基因传递媒介物，所述媒介物采用了受体介导的细胞内吞作用以实现转染。在更优选的实施方案中，靶向分子是细胞因子，试剂是遗传材料比如DNA或RNA。该实施方案也可以含有结合或者缔合有所述遗传材料的整合分子。
在本发明中，方法包括制备基因传递媒介物和将所述靶向的基因传递媒介物传递到细胞，从而实现转染或治疗。在本发明中认为组合物的核酸可以被内化并用作检测剂或者产生遗传治疗效果，或者所述核酸可以由细胞翻译和表达。表达产物可以是本领域技术人员公知的任何结果，包括但不限于蛋白质行使功能、产生细胞产物、酶促活动、输出细胞产物、形成细胞膜组分或者核组分。向靶向细胞传递的方法可以是比如体外技术(比如细胞培养)采用的方法，或者体内给药采用的方法。体内给药可以包括直接施加给细胞，或者用于人体、动物或其它生物体的给药途径，优选是静脉给药或者经口给药。本发明还考虑了用本发明组合物改变的细胞以及通过体外或者体内方法将所述细胞给药到其它细胞、组织或生物体。
本发明包括用于如下目的的组合物和方法：即采用涉及特定免疫部分的组合物通过同时或者顺序靶向特定免疫细胞而改善免疫应答并提高疫苗效力。该组合物也可用于免疫细胞的成像或检测方法。这些方法包括媒介物组合物，所述组合物包括官能化/反应性胶态金属颗粒和至少一种能够影响免疫系统的试剂。在一个实施方案中，该组合物包括和下列组分的至少之一相缔合的官能化/反应性胶态金属：靶向分子、试剂、整合分子、以及下列的一种或多种：PEG、衍生PEG、聚-l-赖氨酸或者衍生的聚-l-赖氨酸。媒介物组合物也可以包含特定免疫组分，比如细胞，包括但不限于抗原呈递细胞(APC)，比如巨噬细胞和树状细胞、和淋巴细胞，比如B细胞和T细胞，这些细胞已经或者单独受到一种或多种组分特异性免疫刺激剂的影响。
组分特异性免疫刺激分子的例子包括但不限于白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-3(“IL-3”)、白细胞介素-4(“IL-4”)、白细胞介素-5(“IL-5”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、白细胞介素-7(“IL-7”)、白细胞介素-8(“IL-8”)、白细胞介素-10(“IL-10”)、白细胞介素-11(“IL-11”)、白细胞介素-12(“IL-12”)、白细胞介素-13(“IL-13”)、脂质A、磷酯酶A2、内毒素、葡萄球菌肠毒素B和其它毒素、I型干扰素、II型干扰素、肿瘤坏死因子(“TNF-α”)、转化生长因子-β(“TGF-β”)、淋巴毒素、迁移抑制因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“CSF”)、单核细胞-巨噬细胞CSF、粒细胞CSF、血管上皮生长因子、血管生成素、转化生长因子(“TGF-α”)、热休克蛋白、血型的碳水化合物部分、Rh因子、成纤维细胞生长因子、和其它的炎症和免疫调节蛋白质、核苷酸、DNA、RNA、mRNA、有义、反义、癌症细胞特异性抗原；比如MART、MAGE、BAGE；flt3配体/受体系统；B7家族的分子和受体；CD40配体/受体；免疫治疗药，比如AZT；和生血管药物和抗生血管药物，比如制管张素、内皮抑制素、和碱性成纤维细胞生长因子或者血管内皮生长因子(“VEGF”)。
尤其优选的实施方案提供了采用媒介物组合物激活免疫应答的方法，所述媒介物组合物包含官能化/反应性胶态金属颗粒和至少一种试剂，其中所述试剂包括特异性抗原和组分特异性免疫刺激试剂的组合。所述方法有效，并可以体内或体外使用。本文所用的组分特异性免疫刺激试剂是指对免疫系统的组分，比如B或T细胞，具有特异性并且能够影响该组分，使得该组分在免疫应答方面具有活性的试剂。组分特异性免疫刺激试剂可以能够影响免疫系统的多个不同组分，这种能力可以用于本发明的方法和组合物中。该试剂可以是天然的，或者可以是通过分子生物技术或者蛋白质受体操作形成或者改性的。
在免疫应答中活化该组分可能造成对所述免疫应答中的其它组分的刺激或抑制，从而导致对所述免疫应答的整体刺激或抑制。为了表述方便，本文描述的是免疫组分的刺激，但是应该理解术语“刺激”考虑到了免疫组分的所有应答，包括但不限于刺激、抑制、排斥和反馈活性。
受到影响的免疫组分可以具有多种活性，导致发生抑制和反馈机制的刺激或者启动或者抑制。本发明不受本文描述的免疫应答实施例的限制，而应理解成在免疫系统所有方面的组分特异性效果。
免疫系统的每个组分的活化可以是同时的、顺序的或者其组合。在本发明方法的一个实施方案中，同时给药多种组分特异性的免疫刺激剂。在该方法中，用多个单独的制剂同时刺激免疫系统，其中每种制剂含有媒介物组合物，而所述媒介物组合物含有组分特异性的免疫刺激试剂。优选地，媒介物组合物含有和官能化/反应性胶态金属缔合的组分特异性免疫刺激试剂。更优选地，组合物含有和一种尺寸或者多种尺寸颗粒的官能化/反应性胶态金属相缔合的组分特异性免疫刺激试剂、以及抗原。更优选地，组合物含有和一种尺寸或者多种尺寸颗粒的官能化/反应性胶态金属相缔合的组分特异性免疫刺激试剂、抗原和PEG、衍生PEG、聚-l-赖氨酸或者衍生地聚-氨基酸，比如聚-l-赖氨酸。
组分特异性免疫刺激试剂对单独的免疫组分具有特异性的刺激(增量调节)效果。例如，白细胞介素-1β(IL-1β)特定刺激巨噬细胞，而TNF-α(肿瘤坏死因子α)和Flt-3配体特定刺激树状细胞。热灭活的奶油分枝杆菌和白细胞介素-6(IL-6)是B细胞的特异性刺激物，而白细胞介素-2(IL-2)是T细胞的特异性刺激物。含有所述组分特异性免疫刺激试剂的媒介物组合物提供了分别对巨噬细胞、树状细胞、B细胞和T细胞的特异性激活。例如，当给药含有组分特异性免疫刺激试剂IL-1β的媒介物组合物时，激活巨噬细胞。优选的组合物是和官能化/反应性胶态金属缔合的IL-1β，最优选的组合物是和官能化/反应性胶态金属以及抗原相缔合的IL-1β以提供对所述抗原的特异性巨噬细胞应答。媒介物组合物可以进一步包含靶向分子、整合分子、PEG、衍生PEG、聚-l-赖氨酸或者衍生的聚-氨基酸，比如聚-l-赖氨酸。
为了对抗原做出有效的免疫应答，可能需要免疫应答的许多元素。同时刺激方法的实施方案是给药四种单独的制剂，所述制剂是组分特异性免疫刺激试剂的组合物的制剂，包括1)用于巨噬细胞的IL-1β，2)用于树状细胞的TNF-α和Flt-3配体，3)用于B细胞的IL-6，和4)用于T细胞的IL-2。每种组分特异性免疫刺激试剂媒介物组合物都可以通过本领域技术人员公知的任何途径给药，并且所有的都可以采用相同途径或者不同途径，具体取决于所需的免疫应答。
在本发明方法和组合物的另一种实施方案中，顺序激活单独的免疫组分。例如，所述顺序激活可以分成两个阶段，初步阶段和免疫阶段。初步阶段包括刺激APC，优选巨噬细胞和树状细胞，而免疫阶段包括刺激淋巴细胞，优选B细胞和T细胞。在两个阶段的每一阶段中，可以同时或者顺序激活单独的免疫组分。对于顺序激活而言，优选的激活方法是给药如下媒介物组合物：所述媒介物组合物激活巨噬细胞，随后激活树状细胞，随后激活B细胞，最后激活T细胞。最优选的方法是组合的顺序激活，包括给药如下媒介物组合物：所述媒介物组合物导致巨噬细胞和树状细胞同时被激活，随后B细胞和T细胞被同时激活。这是多种途径启动免疫系统的多种组分特异性免疫刺激试剂的组合物和方法的例子。
本发明的方法和组合物可用于改善任何类型疫苗的效果。本方法通过靶向特定免疫组分以便激活，从而提高了疫苗的有效性。至少含有和官能化/反应性胶态金属相缔合的组分特异性免疫刺激试剂以及抗原的媒介物组合物，用于加强抗原和特异性免疫组分比如巨噬细胞、B细胞或T细胞之间的接触。其疫苗当前可得的疾病的例子包括但不限于霍乱、白喉、嗜血杆菌属、甲型肝炎、乙型肝炎、流感、麻疹、脑膜炎、腮腺炎、百日咳、天花、肺炎球菌肺炎、小儿麻痹症、狂犬病、风疹、破伤风、肺结核、伤寒症、水痘带状疱疹、百日咳、和黄热病。
将给药途径和用于将抗原传递到免疫系统的媒介物组合物组合起来，用于获得所需的免疫应答。本发明还包括含有各种封装体系组合物的方法和组合物，所述封装体系组合物比如脂质体、微胶囊或者微球，可以提供免疫刺激媒介物组合物的长期释放。这些封装体系充当内部库，用以容纳抗原和缓慢释放抗原，所述抗原用于激活免疫系统。例如，可以用媒介物组合物填充脂质体，所述媒介物组合物含有结合或者缔合到官能化/反应性胶态金属上的抗原和组分特异性免疫刺激试剂。另外的组合是官能化/反应性胶态金颗粒和试剂的连接，所述试剂比如病毒颗粒，所述病毒颗粒是活性疫苗候选物或者被封装起来用以容纳DNA(作为推定的疫苗)。媒介物也可以含有一种或多种靶向分子，比如细胞因子、整合分子、PEG衍生物或者聚-l-赖氨酸衍生物，媒介物随后用于将病毒靶向特定的细胞。另外，可以采用融合蛋白质疫苗，该疫苗的靶子是两种或多种潜在的疫苗候选物；也可以提供媒介物组合物疫苗，该疫苗提供抗两种或多种感染性微生物的保护。组合物也可以包括免疫原，其通过添加聚乙二醇进行了化学改性，可以缓慢地释放材料。
可以将包含官能化/反应性金属颗粒和试剂的组合物封装在脂质体或者生物可降解的聚合物中，其中所述试剂含有一种或多种抗原、一种或多种组分特异性免疫刺激试剂、一种或多种整合和靶向分子、和PEG或者PEG衍生物或者聚-l-赖氨酸或者聚-l-赖氨酸衍生物。媒介物组合物从脂质体或者生物可降解聚合物中缓慢释放并被免疫系统识别为外来物质，而组分特异性免疫刺激试剂所针对的特定组分激活或者抑制免疫系统。例如，由于组分特异性免疫刺激试剂的存在，级联免疫应答被更快的激活，并且所述免疫应答形成更快、特异性更强。
本发明考虑的其它方法和组合物包括采用官能化/反应性金属颗粒和试剂的组合物，所述试剂包含抗原和组分特异性免疫刺激试剂，该组合物也可以含有整合和靶向分子，其中所述官能化/反应性胶态金属颗粒具有不同尺寸。该组合物可以进一步含有PEG、PEG衍生物、聚-l-赖氨酸或者聚-l-赖氨酸衍生物。通过采用不同尺寸的官能化/反应性胶态金属颗粒，可以在一个剂量给药中实现组分特异性免疫刺激试剂的顺序给药。一个剂量要包括多种独立的组分特异性免疫刺激试剂和抗原，所述组合可以和不同尺寸的或者相同尺寸的官能化/反应性胶态金属颗粒缔合。因此，同时给药会提供对免疫组分的顺序激活，从而获得更有效的疫苗以及对种群的更大保护。通过将不同尺寸或者相同尺寸官能化/反应性胶态金属媒介物组合物和脂质体或者生物可降解聚合物组合起来，或者用不同尺寸或者相同尺寸的官能化/反应性胶态金属媒介物组合物填充脂质体或者生物可降解的聚合物，能够获得其它类型的所述具有顺序激活能力的单剂量给药。
对于提供可以在一个剂量中给药的疫苗而言，采用上述的接种疫苗系统是很重要的。一剂量给药在治疗动物种群比如家畜或者野生动物种群上很重要。在对很少能接受卫生保健的种群，比如穷人、无家可归者、乡村居民或者在卫生保健不足的发展中国家中的居民，的治疗中，一剂量给药极其重要。在所有国家里，许多人并没有接受预防性的卫生保健，比如接种疫苗。传染性疾病比如肺结核的重新出现，使得对能够一次给药但仍旧提供长期有效保护的疫苗的需求增加。本发明的组合物和方法提供了这种有效的保护。
除了癌症以外，许多疾病都受免疫系统的介导，本发明包括通过给药有效量的组合物治疗这种疾病的方法，其中所述组合物包括能够刺激免疫系统和其组分的官能化/反应性胶态金属媒介物。本发明的方法和组合物也可以用来治疗发生免疫应答的疾病，即通过刺激或者抑制作为免疫应答一部分的组分。这种疾病的例子包括但不限于阿狄森病、克隆氏病、肠炎、成人呼吸窘迫综合征、手足口病、过敏、过敏症、Bruton综合症、癌症，包括实体瘤和血源肿瘤(blood borne tumor)、湿疹、桥本甲状腺炎、多肌炎、皮肌炎、1型糖尿病、获得性免疫缺陷综合症、移植排斥，比如肾脏、心脏、胰腺、肺、骨骼、和肝脏移植、Grave病、多内分泌自身免疫病、肝炎、微观多动脉炎、结节性多动脉炎、天疱疮、原发性胆汁性肝硬变、恶性贫血、腹部疾病、抗体介导的肾炎、肾小球肾炎、风湿性疾病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、血清阴性脊柱关节病(seronegative spondylarthritides)、鼻炎、口腔干燥-风湿性关节炎综合征、全身性硬化症、硬化性胆管炎、韦格纳肉芽肿病、疱疹样皮炎、牛皮癣、白癜风、多发性硬化、脑脊髓炎、传染性神经元炎、重症肌无力、朗-伊二氏综合征、巩膜、巩膜外层、眼色素层炎、慢性皮肤粘膜念珠菌病、荨麻疹、婴儿一过性低丙种球蛋白血症、骨髓瘤、X性联遗传过度IgM症候群、维-奥二氏综合征、运动失调性毛细血管扩张症、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、自体免疫白血球低下症、特发性巨球蛋白血、淀粉样变性病、慢性淋巴细胞性白血病、和非何杰金氏淋巴瘤。
媒介物组合物的优选实施方案包括这样的试剂，所述试剂包括和官能化/反应性胶态金属缔合的组分特异性免疫刺激试剂。更优选的实施方案包括组合物，所述组合物包括和官能化/反应性胶态金属缔合的一种或多种抗原和组分特异性免疫刺激试剂、以及下列的至少一种：PEG或者PEG衍生物、聚-l-赖氨酸或者聚-l-赖氨酸衍生物、用于使所述组分特异性免疫刺激试剂的效果产生特异性靶向的整合分子和靶向分子，包括但不限于抗原、受体分子、核酸、药物、化疗剂、和载体。本发明的组合物可以任何方式传递到免疫组分。在一个实施方案中，试剂(包括抗原和组分特异性免疫刺激试剂)结合到官能化/反应性胶态金属上的方式使得官能化/反应性胶态金属颗粒和所述抗原和所述免疫刺激试剂都缔合。
本发明包括以各种不同的传递平台或者载体组合提供试剂，比如抗原和组分特异性免疫刺激试剂。例如，优选的实施方案包括给药在脂质体或者生物可降解聚合物载体中的媒介物组合物，所述媒介物组合物包括结合到试剂比如抗原和组分特异性免疫刺激试剂上的官能化/反应性金属胶态颗粒。其它组合是官能化/反应性胶态金颗粒和试剂比如病毒颗粒缔合，所述病毒颗粒是疫苗抗原或者含有为疫苗产生抗原的核酸的可行病毒颗粒。媒介物组合物也可以含有靶向分子，比如细胞因子或者选中的用来将病毒靶向特定细胞的结合对成员，还包括本文教导的其它元素，比如整合分子或者PEG、PEG衍生物、聚-l-赖氨酸或者聚-氨基酸衍生物比如聚-l-赖氨酸。这些实施方案提供了向免疫系统缓慢释放抗原从而长期应答的疫苗制剂。这种类型的疫苗尤其有利于疫苗的一次给药。所有类型的载体，包括但不限于脂质体和微胶囊，都在本发明的范围之内。
毒性减弱和疫苗给药
本发明包括用于给药各因子的组合物和方法，所述因子当含量高于正常浓度时对人类或者动物有毒。一般而言，本发明的组合物包括媒介物组合物，所述组合物是官能化/反应性胶态金属和试剂的混合物，所述试剂在含量大于正常浓度、或者处于活性比处于保护形式的活性大的未保护形式时、或者在正常不会出现的部位出现时，对人类或动物有害。当媒介物组合物被给药到人类或动物时，所述试剂对人类或者动物而言比不用所述官能化/反应性胶态金属媒介物组合物而单独提供时危害小、或者毒性小或者没有毒性。该组合物任选地包括药用可接受的载体，比如水溶液、或者赋型剂、缓冲液、抗原稳定剂、或者灭菌的载体。同样，油类比如石蜡油可以任选地包括在组合物中。媒介物组合物可以进一步包括PEG、PEG衍生物、聚-l-赖氨酸或者聚-l-赖氨酸衍生物。
本发明的组合物可用于用在注射时有毒的试剂来为人类或动物接种疫苗。另外，本发明可用于通过给药含有试剂比如细胞因子或者生长因子的组合物，用细胞因子或者生长因子治疗某些疾病。通过在将试剂给药到人体或动物之前将其和官能化/反应性胶态金属混合，减弱或者消除了试剂的毒性，从而使得该因子可以发挥其治疗效果。在媒介物组合物中官能化/反应性胶态金属和所述试剂的组合，在减弱毒性的同时维持或者改进了治疗结果，从而由于可以给药更高浓度的试剂或者通过使用不同试剂的组合而提高了效力。所以，在媒介物组合物中采用官能化/反应性胶态金属和试剂的组合，允许向人类或者动物给药比正常浓度高的试剂或者给药正常情况下由于具有毒性而不能使用的试剂。优选地，媒介物组合物进一步包括一种或多种类型或尺寸的PEG、PEG衍生物、聚-l-赖氨酸或者聚-氨基酸的衍生物比如聚-l-赖氨酸。
本发明的一个实施方案包括用于采用媒介物组合物作为疫苗制剂的方法，所述媒介物组合物包含和官能化/反应性胶态金属相缔合的试剂。这种疫苗的许多优点之一是使正常情况下有毒性的试剂的毒性减弱。可以通过任何方法制备用作试剂疫苗的媒介物组合物。例如，试剂和官能化/反应性胶态金属的混合物的媒介物组合物优选注射到合适的动物中。由于根据本发明给药时试剂无毒，所以可以将优化量的所述可用作抗原的试剂给药到所述动物。本发明的媒介物组合物可以以单剂量给药，或者可以以多剂量、以合适的时间间隔给药。在形成二级免疫响应方面，多剂量有用。例如，通过每月一次加强给药，维持了抗体的效价。
由于在冷冻干燥的组合物中可以传递大量试剂，所以本发明对疫苗制剂而言是有利的。冷冻干燥的组合物比非冷冻干燥的组合物的使用期限长，而且更容易运输。
疫苗组合物可以进一步含有药用可接受的助剂，包括但不限于Freund全助剂、Freund非全助剂、脂多糖、单磷酰脂质A、胞壁酰二肽、含脂质A的脂质体、明矾、胞壁酰基三肽磷脂酰基乙醇胺、钥孔虫戚血兰素。用于动物的优选助剂是Freund非全助剂，用于人类的优选是明矾，该助剂优选用含有官能化/反应性胶体金属和活性试剂的组合物以1∶1稀释。
使用本发明组合物的优选方法包括向人类或动物给药有效量的媒介物组合物，所述媒介物组合物含有和至少一种试剂混合的官能化/反应性胶态金属，其中，和该试剂单独给药或者以不含官能化/反应性胶态金属的组合物形式给药相比，所述组合物当给药到人类或者动物时毒性较弱或者没有毒性、副作用更少或者较不严重。本发明的媒介物组合物可以以针对正常情况下有毒的物质的疫苗形式给药，或者可以是治疗剂，其中所述正常情况下有毒的试剂的毒性被减弱，从而允许在更长时间里给药更高数量的试剂。
在实施这些实施方案时，组合物的给药路径并不重要。根据本发明，该组合物可以给药的途径包括公知的给药途径，包括但不限于皮下、肌内、腹膜内、经口、和静脉途径。优选的给药途径是静脉给药。另一种优选的给药途径是肌内给药。
例如，已知白细胞介素-2(IL-2)在治疗肾脏癌症上显示出了明显的治疗效果。但是，给药IL-2的毒副作用导致大量病人死亡。
本发明包括通过给药媒介物组合物治疗疾病的方法，所述媒介物组合物包含一种或多种试剂和宫能化/反应性胶态金属。媒介物组合物可以进一步包括PEG、PEG衍生物、聚-l-赖氨酸或者聚-l-赖氨酸衍生物。本发明预期试剂可以任选地从官能化/反应性胶态金属中释放。虽然不想受到任何理论的束缚，但是相信这种释放并非简单地是循环时间的函数，而是受到平衡动力学和身体内是否存在其它离子和还原剂的控制。就此而言，本发明预期采用触发剂(trigger)以在需要时启动从所述官能化/反应性胶态金属颗粒释放试剂。在一个实施方案中，在所述官能化/反应性胶态金属媒介物组合物给药后，可以向某部位、细胞或位置给药有效量的还原剂。在另一实施方案中，可以通过加入试剂，比如能够使将试剂结合到官能化/反应性胶态金属颗粒上的硫醇键还原的分子或化合物，实现试剂(比如活性药物)从官能化/反应性胶态金颗粒的释放。
从理论上讲，由于该组合物在体内被血液和细胞外流体连续稀释，所以通过向病人给药比以前给药方法更少的试剂剂量能够获得同样的治疗效果。
因此，本领域技术人员可以通过改变初始结合到胶态金属上的试剂量和用以还原硫醇键的还原剂的给药量，控制所传递的试剂量，其中所述硫醇键用以将试剂结合到官能化/反应性胶态金属颗粒上。
本发明的组合物可用于治疗许多疾病，包括但不限于癌症，包括实体瘤和血源癌症，比如非白血性白血病；自体免疫疾病，比如类风湿性关节炎；激素缺乏疾病，比如骨质疏松症；由于分泌过多导致的激素异常，比如肢端肥大症；传染病，比如败血症性休克；遗传病，比如酶缺乏病(例如，不能代谢苯丙氨酸导致的phenylketanuria)；和免疫缺乏病，比如AIDS。
本发明的方法除了目前采用的治疗方案以外还包括给药所述媒介物组合物。优选方法包括在给药媒介物组合物的同时给药用于治疗急性和慢性病尤其是治疗癌症的治疗剂。例如，在用已知的抗癌剂比如抗血管原性蛋白比如内皮他丁和血管他丁、沙利度胺、红豆杉醇、美法仑、紫杉醇、紫杉烷、长春碱、长春新碱、阿霉素、阿昔洛维、顺铂和他克林进行化疗之前、期间或之后，给药含有试剂TNF的媒介物组合物。在本发明的方法中考虑了所有目前已知的癌症治疗方法，媒介物组合物可以按照有效治疗癌症所需的在治疗计划表中的不同时间给药。
优选方法包括治疗抗药性肿瘤、癌症或者赘瘤。这些肿瘤对已知的抗癌药物和治疗具有抵抗性，即使增加这种试剂的剂量，对肿瘤的尺寸或生长也几乎没有或者没有影响。在癌症治疗中已观察到了如下现象：将所述抗药性肿瘤细胞暴露到TNF下，恢复了这些细胞对这些化疗药剂的抗癌效果的敏感性。已经有出版的证据表明TNF和拓扑异构酶H靶向的嵌入剂(比如阿霉素)的协同作用，其恢复了阿霉素的致肿瘤细胞死亡性。同样，已知干扰素(IFN)和5-氟尿嘧啶的协同作用提高了5-氟尿嘧啶的化疗活性。本发明可用于治疗所述抗药性肿瘤。优选方法包括给药含有TNF和官能化/反应性胶态金的媒介物组合物。在采用亚临床剂量的TNF-cAu-PT对病人进行预治疗的条件下，肿瘤和TNF媒介物螯合，使得细胞对后续的系统性化疗剂敏感。这种化疗剂包括但不限于阿霉素、其它的嵌入性化疗剂、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、mitaxantrone、VM-16、依托泊苷、VM-26、替尼泊苷、和其它的非嵌入性化疗剂。可替换地，另一种优选方法包括给药含有TNF和至少一种对癌症治疗有效的其它试剂的上述媒介物组合物。例如，对患有抗药性肿瘤或者癌症的病人给药PT-cAU(TNF)阿霉素媒介物。给药的量取决于待治疗的肿瘤和病人状况。媒介物组合物使得可以给药更大量的化疗剂，媒介物也缓解了所述肿瘤的抗药性。
通过下列实施例对本发明进行了进一步的举例说明，绝不应认为这些实施例是对本发明范围的限制。相反，显然应该知道，可以允许各种其它实施方案、修改和其等同物存在，在阅读了本说明书后，这些实施方案、修改和等同物对本领域技术人员而言是显而易见的，不会偏离本发明的精神和/或所附权利要求的范围。
                      实施例
                      实施例1
                制备胶态金溶胶的方法
用试剂比如柠檬酸钠将氯金酸(Au+3，HAuCl4)还原成中性金(Au0)，以制备胶态金。采用Horisberger(1979)描述的方法制备34nm的胶态金颗粒。该方法提供了用于制备胶态金的简单、规模可变的程序。简而言之，制备氯化金在去离子水(DIH2O)中的4％溶液(23.03％母液；dmc2，South Plainfield，NJ)和柠檬酸钠在去离子水中的1％溶液(wt/wt；J.T.Baker Company；Paris，KY)。将3.75ml的氯化金溶液加到1.5mL的DIH2O中。剧烈搅拌溶液，使溶液在回流下变成翻滚沸腾状态。加入60ml的柠檬酸钠，引发34nm胶态金颗粒的形成。如下所述，在整个颗粒形成和生长期间，溶液连续沸腾和搅拌。
柠檬酸钠加入氯化金中引发了一系列的还原反应，表征为初始氯化金溶液颜色的变化。随着柠檬酸钠的加入，氯化金溶液的颜色从金黄色变清澈，然后变成介于黑色/棕色之间的中间色。溶胶颜色最终从棕色/黑色变成樱桃红，表明反应完成。在最终变色后，溶液在回流下连续搅拌和沸腾另外45分钟。随后，将溶胶冷却至室温，通过0.22μ硝酸纤维素过滤器过滤，并储存在室温下直至使用。
胶态金颗粒的形成分三个阶段：成核、颗粒生长和凝聚。通过柠檬酸钠将Au+3还原成Au0，引发颗粒成核。这个步骤的标志在于氯化金溶液从明黄色变成黑色。游离Au+3连续叠层到Au0核上，驱动第二阶段即颗粒生长的进行。颗粒尺寸和在氯化金溶液中加入的柠檬酸盐的量成负相关：在固定量的氯化金中提高柠檬酸钠的量，导致形成的颗粒更小，而减少加入到金溶液中的柠檬酸盐的量导致形成较大的颗粒。
和成核反应相似，胶态金颗粒的形成也关系到溶液颜色的变化。但是，和初始反应不同，这种二次颜色变化直接和颗粒尺寸相关。当形成小颗粒(即，12-17nm)时，溶胶颜色为桔黄色至红色；当形成中等尺寸的颗粒(即，20-40nm)时，溶胶颜色为红色至勃艮第深酒红，当形成大颗粒(即，64-97nm)时，溶胶颜色看起来是棕色。反应物的剧烈搅拌对颗粒成核和生长都很重要。在该过程的任何步骤搅拌不当，都会导致形成直径比预期大的不均匀颗粒。
胶态金制剂的TEM(透射电子显微镜)和双角光散射查询结果表明，胶态金制剂中的颗粒尺寸非常接近其理论尺寸34nm。颗粒尺寸均匀，平均粒径为34-36nm，多分散性测量的平均值为0.11。在这种状态下，胶态金颗粒由于每个颗粒表面上具有负电荷，所以通过其相互的静电斥力保持悬浮态。将这些裸露颗粒暴露到盐溶液(即，最终浓度为1体积％的NaCl)下，会导致这些颗粒聚集并最终从溶液中沉淀出来。这个过程通过在颗粒表面结合蛋白质(例如，TNF)或者其它试剂而被阻止或者抑制。
                         实施例2
                  制备衍生的聚-L-赖氨酸
采用硫醇化剂，2-亚氨基硫杂环衍生物，将聚-l-赖氨酸(PLL)聚合物骨架的赖氨酸残基上的自由氨基硫醇化，制备衍生的聚-l-赖氨酸。为了制备所述试剂，将94mg的聚-l-赖氨酸(MW＝14600)在10ml的50mM硼酸钠缓冲液中稀释。随后，将2-亚氨基硫杂环衍生物在硼酸盐缓冲液稀释成10mg/ml，并以下列比例加入到5ml的PLL中：
浓度为10mg/ml  加入的2-亚氨基硫杂环   预计的2-亚氨基硫
的PLL的ml      衍生物(10mg/ml)的ml    杂环衍生物∶PLL比
5              0.22                   5∶1
5              0.09                   2∶1
硫醇化反应在室温进行45分钟。用硼酸盐缓冲液透析硫醇化的聚-赖氨酸试剂(PLL(SH)n)，其中每两小时换两次缓冲液。
                        实施例3
         采用PEG硫醇制备表面改性的胶态金纳米颗粒
采用Horisberger(1979)描述的方法制备不同尺寸的胶态金颗粒。制备氯化金(23.03％母液；OMG，South Plainfield，NJ)在去离子水(DIH2O)的2％溶液250ml，并在回流下加热至翻滚沸腾。将PEG(SH)n在硼酸盐缓冲液中重构成50mg/ml的浓度。在沸腾的氯化金溶液中加入1或2ml的PEG(SH)n。溶液另外沸腾45分钟，冷却，通过0.22μ过滤器过滤。将溶胶在室温下保存直至使用。
                        实施例4
采用聚-L-赖氨酸硫醇制备表面改性的胶态金纳米颗粒
采用Horisberger(1979)描述的方法制备不同尺寸的胶态金颗粒。制备氯化金(23.03％母液；OMG，South Plainfield，NJ)在去离子水(DIH2O)的2％溶液250ml，并在回流下加热至翻滚沸腾。将透析的PLL(SH)n试剂直接加到金溶液中，无需进一步稀释。溶液另外沸腾45分钟，冷却，通过0.22μ过滤器过滤。将溶胶在室温下保存直至使用。
                        实施例5
                 确定结合的最佳pH值
已知蛋白质和胶态金的结合依赖于胶态金和蛋白质溶液的pH。根据经验确定TNF和胶态金溶胶结合的最佳pH值。最佳pH定义为使得TNF可以和胶态金颗粒结合但阻止颗粒发生盐诱导(被NaCl)沉淀的pH值。裸露的胶态金颗粒由于其表面上的净负电荷产生的静电相互排斥而保持为悬浮状态。盐溶液中的阳离子使得正常情况下互相排斥的带负电荷的胶态金颗粒吸引到一起。这种聚集/沉淀的标志就是胶态金溶液的颜色变化，从红色变成紫色(随着颗粒吸引到一起)，最终变成黑色，此时颗粒形成大聚集体，最终从溶液中落下来。蛋白质或者其它稳定剂结合到颗粒表面上，阻挡了胶态金颗粒的盐诱导沉淀。
采用每等份2ml的34nm胶态金溶胶确定TNF结合到胶态金上的最佳pH值，其中所述胶态金溶胶的pH采用1N NaOH从5调至11(采用pH试条确定)。TNF(Knoll Pharmaceuticals；纯化至均匀)在去离子水中重构至1mg/ml的浓度，并在3mM的TRIS碱中进一步稀释成100μg/ml。为了确定TNF结合的最佳pH值，在pH经过调节的胶态金的各个等份中加入100μl的100μg/ml TNF原料。TNF用所述胶体培养15分钟。随后，在每个等份中加入100μl的10％NaCl溶液，以引发颗粒沉淀。最佳结合pH定义为使得TNF可以和胶态金颗粒结合但阻止颗粒由于盐而沉淀的pH值。尽管本说明书公开的方法采用了Frens制备方法确定结合的最佳pH值。但通过本发明可以理解，该方法也适用于确定官能化/反应性胶态金属颗粒的结合最佳pH值。
                      实施例6
                      颗粒表征
采用DCS(即盘式离心机，CPS Instruments，Inc.)通过差动离心沉降确定颗粒尺寸。这种技术通过确定胶态金颗粒通过在盘式离心机中形成的蔗糖密度梯度所需的时间来测量颗粒尺寸。DCS方法采用校准的颗粒参照标准来估计胶态金制剂的尺寸。
通过在氯化金溶液中加入的柠檬酸盐的量，确定通过Frens反应(Frens，Nature Phys.Sci.，241：20-221972)形成的胶态金纳米颗粒的尺寸。随着在金溶液中加入的柠檬酸盐量的增加，形成了更多的金核，结果颗粒生长能用的游离金变少。结果，提高柠檬酸盐的量，导致形成了更大量的直径更小的颗粒。相反，减少柠檬酸盐的加入量，导致形成的金核更少，这些金核经过颗粒生长形成较大的颗粒。
图4和5所示的颗粒尺寸数据表明随着还原剂量的增加，最终颗粒的尺寸变小。硫醇的加入量通过两种机制操控。第一，改变加入的、用于制备颗粒的官能还原剂的物理质量。这种类型的操控在本文中通过代表性的还原剂PEG(SH)4试剂实施，结果表明将加入到氯化金溶液中的硫醇基团数目增加一倍，使得颗粒尺寸从42nm下降到16nm(图4)。采用有代表性的还原剂PLL(SH)5还原剂获得了类似的关系。但是，和基于PEG的试剂不同，通过改变单一聚合物分子携带的硫醇基团数，操控用来还原氯化金的硫醇基团的量。因此，如图5所示，虽然加到两个反应中的PLL(SH)5量相同，但是还原剂的量明显不同。实际上，这些数据表明随着硫醇基团/单元聚合物的数量增加，形成的胶态金颗粒的尺寸变小。
                        实施例7
                  官能化颗粒的结合性质
将分别通过硫醇化的聚-l-赖氨酸和PEG-硫醇还原制备的PLL(SH)n和PEG(SH)n官能化/反应性颗粒的TNF结合性质，和通过Frens方法(柠檬酸钠还原)制备的纳米颗粒进行比较。以前的研究表明当溶胶的pH调至8-9时，TNF和Frens颗粒的结合最优(Paciotti等，Drug Delivery，11：169-183，2004)。因此，为了这些研究，采用NaOH将1ml等份的Frens，PLL(SH)n或PEG(SH)n官能化/反应性颗粒的pH调至8。随后，向制剂中加入0.5-1.0μg的TNF。试样培养15分钟，使得TNF可以结合到颗粒上。为了将颗粒结合的TNF和游离TNF分离，将制剂以7500rmp离心15分钟。在离心后，收集上清液试样，在测定缓冲液中稀释。去除剩余的上清液，将胶态金丸粒重新在测定缓冲液中悬浮以恢复胶态金的初始体积。所述丸粒和上清液试样经过系列稀释，并通过EIA分析(CytELISA TNF，CytImmuneSciences，Inc.)。
用PLL(SH)n和PEG(SH)n官能化/反应性金颗粒进行了两次结合研究。令人惊奇的是，尽管PLL(SH)n和PEG(SH)n官能化金颗粒都很稳定并抗盐诱导沉淀，但是它们在TNF结合方面不同。和Frens制剂相似，由于上清液中几乎没有、甚至没有细胞因子，所以PEG(SH)n官能化/反应性金颗粒和加入的大多数TNF结合。该数据表明PEG(SH)n聚合物并没有覆盖颗粒的全部表面，因此使得可以结合TNF。该数据还表明颗粒表面的未覆盖部分在本质上和Frens制备方法中的颗粒表面相似。(参见表1)。
                                  表1
            在Frens和PLLSH官能化胶态金纳米颗粒上的TNF结合
  上清液   丸粒   总数   游离TNF的百分比
  PLL(SH)n官能化的PEG(SH)n官能化的Frens   836100.01   13316900   849326900   98.43.20.0
                        实施例8
                聚-l-赖氨酸颗粒的DNA结合
通过确定PLL(SH)n官能化/反应性制剂结合质粒DNA的能力，对其官能性进行了检验。以前的工作表明天然PLL和盐溶液相似，使Frens制剂快速团聚。但是，PLL(SH)n官能化颗粒上的PLL起到在盐存在下使颗粒稳定的作用。
为了确定硫醇化是否可以使氨基上的正电荷变号，测试了硫醇化的聚-l-赖氨酸聚合物结合DNA的能力。用12或4μg(分别是2-4道)的β半乳糖苷酶质粒DNA培养PLL(SH)n官能化/反应性胶态金纳米颗粒。采用天然DNA作为对照。在培养15分钟后，采用1％凝胶通过琼脂糖凝胶电泳来分级试样。通过在白光和紫外光下拍摄所述凝胶，记录了PLL(SH)n颗粒和DNA的共同迁移(图6)。
这些数据表明聚-l-赖氨酸覆盖了颗粒表面的一部分，以防止发生盐诱导沉淀。
尽管不想受到任何理论的束缚，但从理论上认为，在和TNF结合方面，PEG(SH)n和PLL(SH)n官能化/反应性胶态颗粒之间的不同应答源于其表面电荷。假定带有不同电荷的纳米颗粒会影响结合其它带电试剂的能力。相信带有中性或者负电荷的PEG(SH)n颗粒不会抑制其对TNF的吸引和结合。相反，从理论上认为，PLL(SH)n官能化/反应性胶态颗粒的正电荷会排斥、抑制或者防止TNF直接结合到颗粒表面上。不过，发现硫醇化的聚-l-赖氨酸颗粒结合了质粒DNA：不会直接结合到典型胶态金颗粒(例如Frens制剂)上的分子。
                         实施例9
    用于向肿瘤靶向传递抗血管原性药物的PEG-硫醇媒介物
这些试验采用PT-cAU-TNF-内皮他丁媒介物，即含有两种试剂的媒介物。认为TNF提供了用于将治疗剂，内皮他丁(END)，传递到肿瘤的靶向功能。同样从理论上认为，一旦位于靶部位，两种试剂都可以提供治疗效果。媒介物组合物的一个方面是靶向分子、治疗分子和PEG的比例。在同一胶态金颗粒中，存在所有三种实体。
PT-cAu(TNF)-END分三个步骤制备。首先，在极低的亚饱和质量的TNF下，TNF和金颗粒缔合。和在TNF浓度为0.5μg/ml下制备的PT-cAu-TNF媒介物不同，这种媒介物用浓度为0.05μg/ml的TNF制备。TNF(在3mM CAPS缓冲液中稀释，pH＝10)以0.1μg/ml的浓度加入到装置的试剂瓶中。用pH为10的等体积胶态金填充装置的第二个瓶子。通过启动如前所述的蠕动泵，将TNF结合到胶态金颗粒上。胶态金-TNF溶液培养15分钟，随后放回到装置的金容器中。然后，用等体积的内皮他丁(在浓度为0.15-0.3μg/ml的CAP缓冲液中稀释)填充试剂瓶。在可替换的实施方案中，通过采用试剂比如n-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯加入硫基团，可以对内皮他丁进行化学改性，以辅助结合到金颗粒上。
启动蠕动泵，以将胶态金结合的TNF和内皮他丁溶液吸入T连接器中。在溶液相互作用完全后，将混合物在收集瓶中培养另外15分钟。通过在此阶段盐具有使颗粒沉淀的能力，证实存在着另外的用于PEG-硫醇结合的位点。在培养15分钟后，将5K PEG-硫醇加到cAu(TNF)-END媒介物中，如前所述通过透滤进行浓缩。
将两种蛋白质结合到同一金颗粒上的可替换方法包括将试剂同时加到金上。将TNF和END置于结合装置的试剂室中。每种蛋白质的浓度是0.25μg/ml，结果，1ml溶液含有0.5μg的总蛋白质。在将所述双试剂组合物结合到金颗粒上后，该胶态金制剂在盐存在下也发生沉淀，表明也有另外的用于结合PEG-硫醇的自由结合位点。在培养15分钟后，将5K PEG-硫醇加到cAu(TNF)_END媒介物中，随后如上所述进行处理。
在透滤后，对保留物进行测量，测量TNF和END在各自EIA中的浓度。为了证实在同一胶态金颗粒上存在着END和TNF，设计和采用了交叉抗体捕获和检测测定法。
向涂有或者捕获TNF的抗体或者捕获END的抗体的EIA板中，加入PT-cAu(TNF)-END媒介物试样。试样用所述捕获性抗体培养3小时。在培养后，清洗和吸干所述EIA板。为了结合在其中TNF被捕获的试样上存在的任何END，向小孔中加入生物素化的兔抗内皮他丁多克隆抗体。培养30分钟后，清洗所述板，用抗生蛋白链菌素共轭的碱性磷酸酶检测是否存在所述生物素化的抗体。内皮他丁检测系统形成的阳性颜色信号表明被检抗体结合到了以前由TNF单克隆抗体捕获的嵌入媒介物上。通过捕获性抗体和检测抗体的互换以及采用合适的二次检测系统，将所述测定法用于检测捕获END的颗粒上是否存在着TNFα。
表II给出了这些研究的数据。从表II可见，媒介物试样的保留物具有17μg/ml的TNF和22μg/ml的END。这些相同试样在交叉抗体测定中也形成了阳性信号，表明在同一胶态金颗粒上同时存在着TNF和内皮他丁。
尽管本说明书公开了由其将两种试剂结合到Frens方法制备的胶态金属颗粒上的媒介物和方法。但是，由本发明可以理解，这种方法也适于制备其中胶态金属颗粒是官能化/反应性胶态金属颗粒的媒介物组合物。在另一实施方案中，考虑的是所述官能化/反应性胶态金属颗粒通过还原剂，比如PEG(SH)n或者PLL(SH)n，形成。所得的官能化/反应性胶态金属颗粒随后用于上述方法以形成结合了两种试剂的官能化/反应性胶态金属颗粒
                       表II
在PT-cAu(TNF)-END载体的保留物中存在的TNF和内皮他丁浓度
  试样   测试的分析物   浓度
  PT-cAu(TNF)-END   TNF   17μg/ml
  END   22μg/ml
必须注意的是，在本说明书和权利要求中所用的单数形式“某”、“某个”和“该”包括复数表示，除非另有明确说明。因此，例如，谈到含有“某试剂”的媒介物组合物是指摩尔量的所述试剂。
上面引用的所有专利、出版物和摘要在此全文引入作为参考。2004年1月28日提交的美国临时申请No.60/540075在此引入作为参考。应该理解，本发明不限于本文公开的特殊组合、方法和材料，因此所述组合、方法和材料可以发生某种程度的变化。还应该理解的是，本文采用的术语仅仅用于描述特殊实施方案，并不用于限制。

Claims (23)

1.制备官能化纳米颗粒的方法，包括：
将金属盐溶液和还原剂混合以形成反应混合物；
将所述反应混合物培养足量时间以形成官能化纳米颗粒。
2.权利要求1的方法，其中所述金属盐包括金、银、铝、钌、锌、铁、镍或钙。
3.权利要求1的方法，其中所述还原剂包括衍生的聚乙二醇、衍生的聚-氨基酸、衍生的聚-1-赖氨酸、PEG(SH)n或硫醇化的聚-1-赖氨酸。
4.权利要求1的方法，其中所述官能化纳米颗粒还包括化学物、治疗剂、药用剂、药物、生物因子、酶、抗原、抗体、蛋白质、脂质、核酸、碳水化合物、核酸、蛋白质、脂质、营养物、辅因子、滋补药、麻醉剂或检测剂。
5.权利要求1的方法，其中所述官能化纳米颗粒的大小包括大约1nm-大约100nm的直径。
6.制备媒介物组合物的方法，包括：
将金属盐和还原剂混合以形成第一反应混合物；
将所述第一反应混合物培养足量时间以形成官能化的纳米颗粒；和
将所述官能化的纳米颗粒和至少一种第二试剂混合以形成第二反应混合物；
将所述第二反应混合物培养足量时间以使得所述官能化纳米颗粒可以结合至少一种第二试剂以形成媒介物组合物；和
将所述媒介物组合物和第二反应化合物分离。
7.权利要求6的方法，其中所述金属盐包括金、银、铝、钌、锌、铁、镍或钙。
8.权利要求6的方法，其中所述还原剂包括衍生的聚乙二醇、衍生的聚-氨基酸、衍生的聚-1-赖氨酸、PEG(SH)n或硫醇化的聚-1-赖氨酸。
9.权利要求6的方法，其中所述第二试剂还包括化学试剂、治疗剂、药用剂、药物、生物因子、酶、抗原、抗体、蛋白质、脂质、核酸、碳水化合物、核酸、蛋白质、脂质、营养物、辅因子、滋补药、麻醉剂或检测剂。
10.权利要求6的方法，其中所述官能化纳米颗粒的大小包括大约1nm-大约100nm的直径。
11.权利要求6的方法，其中所述金属盐包括金，其中所述还原剂包括PEG(SH)n，其中所述第二试剂包括肿瘤坏死因子。
12.权利要求6的方法，其中所述媒介物组合物用于治疗疾病。
13.权利要求12的方法，其中向人或者动物给药治疗有效量的所述媒介物组合物，和其中所述疾病包括癌症、实体瘤、克隆氏病、乳腺癌、牛皮癣、肠炎、成人呼吸窘迫综合征、过敏、鼻炎、湿疹、荨麻疹、过敏症、移植排斥、风湿病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、血清阴性脊柱关节病、口腔干燥-风湿性关节炎综合征、全身性硬化症、多肌炎、皮肌炎、1型糖尿病、获得性免疫缺陷综合症、桥本甲状腺炎、Grave病、阿狄森病、多内分泌自身免疫病、肝炎、硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬变、恶性贫血、腹部疾病、抗体介导的肾炎、肾小球肾炎、韦格纳肉芽肿病、微观多动脉炎、结节性多动脉炎、天疱疮、疱疹样皮炎、牛皮癣、白癜风、多发性硬化、脑脊髓炎、传染性神经元炎、重症肌无力、朗-伊二氏综合征、巩膜、巩膜外层、眼色素层炎、慢性皮肤粘膜念珠菌病、Bruton’s综合症、婴儿一过性低丙种球蛋白血症、骨髓瘤、X性联遗传过度IgM症候群、维-奥二氏综合征、运动失调性毛细血管扩张症、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、自体免疫白血球低下症、特发性巨球蛋白血、淀粉样变性病、慢性淋巴细胞性白血病、和非何杰金氏淋巴瘤。
14.权利要求12的方法，其中所述官能化纳米颗粒包括胶态金，其中所述第二试剂包括肿瘤坏死因子，其中所述疾病包括癌症。
15.制备官能化纳米颗粒的方法，包括：
将金属盐和还原剂混合以形成改性的胶态金属溶胶；
将至少一种试剂和还原剂混合以形成改性的试剂；
用所述改性的试剂培养所述改性的胶态金属溶胶足量时间以使得所述改性的胶态金属溶胶可以结合到所述改性的试剂，从而形成官能化纳米颗粒。
16.权利要求12的方法，其中所述还原剂包括衍生的聚乙二醇、衍生的聚-氨基酸、衍生的聚-1-赖氨酸、PEG(SH)n或硫醇化的聚-1-赖氨酸。
17.权利要求12的方法，其中所述第二试剂还包括化学试剂、治疗剂、药用剂、药物、生物因子、酶、抗原、抗体、蛋白质、脂质、核酸、碳水化合物、核酸、蛋白质、脂质、营养物、辅因子、滋补药、麻醉剂或检测剂。
18.媒介物组合物，含有通过如下方法制备的官能化纳米颗粒：
将金属盐溶液和还原剂混合以形成反应混合物；
培养所述反应混合物足量时间以形成官能化纳米颗粒。
19.权利要求18的媒介物组合物，还包括至少一种试剂。
20.权利要求18的媒介物组合物，其中所述还原剂包括PEG衍生物或者聚-1-赖氨酸衍生物。
21.权利要求19的媒介物组合物，其中所述至少一种试剂是肿瘤坏死因子。
22.权利要求19的媒介物组合物，还包括靶向分子、整合分子、组分特异性免疫刺激分子、化学试剂、治疗剂、药用剂、药物、生物因子、酶、抗原、抗体、蛋白质、脂质、核酸、碳水化合物、核酸、蛋白质、脂质、营养物、辅因子、滋补药、麻醉剂或检测剂。
23.权利要求22的媒介物组合物，其中所述组分特异性免疫刺激分子包括白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-3(“IL-3”)、白细胞介素-4(“IL-4”)、白细胞介素-5(“IL-5”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、白细胞介素-7(“IL-7”)、白细胞介素-8(“IL-8”)、白细胞介素-10(“IL-10”)、白细胞介素-11(“IL-11”)、白细胞介素-12(“IL-12”)、白细胞介素-13(“IL-13”)、脂质A、磷酯酶A2、内毒素、葡萄球菌肠毒素B和其它毒素、I型干扰素、II型干扰素、肿瘤坏死因子(“TNF-α”)、转化生长因子-β(“TGF-β”)、淋巴毒素、迁移抑制因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“CSF”)、单核细胞-巨噬细胞CSF、粒细胞CSF、血管上皮生长因子、血管生成素、转化生长因子(“TGF-α”)、热休克蛋白、血型的碳水化合物部分、Rh因子、成纤维细胞生长因子、炎症和免疫调节蛋白质、核苷酸、DNA、RNA、mRNA、有义、反义、癌症细胞特异性抗原；flt3配体/受体系统；B7家族的分子和受体；CD40配体/受体；免疫治疗药；和生血管药物和抗生血管药物、碱性成纤维细胞生长因子或者血管内皮生长因子(“VEGF”)。
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