CN1946741B

CN1946741B - 金结合蛋白及其用途

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Publication number: CN1946741B
Application number: CN2005800105197A
Authority: CN
Inventors: 盐塚秀则; 今村刚士; 熊谷泉
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2004-03-31
Filing date: 2005-03-31
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2025-03-31
Also published as: US7807391B2; CN1946741A; KR100924044B1; US20070178522A1; KR20070010041A; US7833731B2; KR100940138B1; EP2267033A2; EP2267034A2; US7871614B2; US20090281284A1; EP2267033A3; KR20080006022A; KR20080006021A; JP2008167756A; JP4208942B2; CN101921340A; KR100923828B1; CN101921338A; US20090311806A1

Abstract

构建了一种利用抗金抗体和作为抗金抗体一部分的金结合侧面的蛋白质。该蛋白质能够与金特异性结合。该蛋白质或含有该蛋白质的复合蛋白能够用于检测靶物质。

Description

金结合蛋白及其用途

技术领域

本发明涉及金结合蛋白，含有该金结合蛋白的复合蛋白，和其在检测其靶物质中的应用。

背景技术

随着最近半导体微加工技术的进展，通过使设备小型化使得半导体工业显著发展。以光刻法为代表的微加工技术最近已经达到了几百纳米的精加工精度。上述技术使用的材料和设备能够有效地用于许多方面，并且预期用于光通信、电通信等以及生物技术和能量等许多领域。但是，当考虑在100纳米或更小的规格上加工作为现有微加工技术的扩展时，除技术挑战以外，工业应用还面临许多挑战，包括与加工有关的时间和费用。随着适用领域的增多，强烈需要制造精细结构的新技术作为以上技术的替代。

在此情况下，已经利用产生在原子或分子水平上控制的所需结构和性质的自下而上方法代替常规自上而下加工技术对新材料积极进行了研究和开发。生产精细结构的自下而上技术的例子包括其中在金属表面上控制分子排列的分子装置的研发，并且已经研究了利用物质自装配的方法的应用作为一种这样的分子排列控制技术。该研究的最近的一个例子是，Lindsay等(Science，300：p.1413，2003)利用自装配单层检测了分子转换功能，在该单层中在其各自分子末端具有硫醇基的链烷硫醇和链烷二硫醇定位在金基板上。

众所周知，以核酸和蛋白质为代表的生物分子在原子水平控制下构建为精确的结构而发挥其功能。这些生物分子的性质的应用也已经研究，以将这些生物分子应用于多种装置，在该装置中生物分子排列在金属、金属氧化物或半导体基板上。生产基板上排列有生物分子的精细结构的技术对于开发这种装置的第一步是至关重要的。例如，当考虑在金基板上固定脱氧核糖核酸(DNA)或在上面固定具有各种功能的具有氨基酸序列的肽时，普遍地知道能够化学合成该DNA或肽，并且用硫醇基(-SH)化学修饰这些物质的末端，从而利用S-Au表面吸附将这些物质设置在金基板上。利用这个事实，已经对在金上固定有DNA或肽的实验系统及其向装置的转化进行了研究。

另一方面，作为酶、抗体等起作用的蛋白质具有高分子量。因此，化学合成这些具有高分子量的化合物以形成高级结构而同时保持发挥其功能的能力是非常困难的。尽管当前进行了许多研究，但事实是同时具有高级结构和所需功能的功能性蛋白质在大多数情况下仍然未能合成(Science，302：p.1364，2003)。当功能性蛋白质被固定在基板材料上时，与基板的结合通常如下进行：用以硅烷偶联剂为代表的多种表面处理剂处理该基板，向该蛋白质中引入能够与经受表面处理的该基板的表面结合的官能团(Proteomics，3：p.254，2003)。然而已经指出，这种将反应性官能团引入功能性蛋白质中通常通过化学修饰进行，并且非选择性地确定引入位点。因此，该功能性蛋白质以功能性较低的形状被固定在基板上，并且可能由于该功能性蛋白质的功能表达位点的修饰而使最终活性降低。

也可以通过基因工程方法向蛋白质中引入结合位点以产生融合蛋白。作为一个例子，已知这样一种方法，其中通过基因工程将所有位点或已知与低分子化合物生物素结合的(链霉)亲和素的生物素结合位点引入所需蛋白质的N-或C-末端，然后该所需蛋白质表达为融合蛋白，随后通过排列在所需基板表面上的生物素固定。

另外，最近公开了另一技术。在该技术中，由5个或更多氨基酸组成的肽能够与用于固定的基板材料结合。该肽可以与所需蛋白质融合产生融合蛋白，从而在基板上结合并固定所需蛋白质。Belcher等披露了一种通过噬菌体展示方法由12个氨基酸组成的肽，该肽能够特异性识别含有GaAs的某些晶体表面(Nature，405：p.665，2000)，从而产生了利用生物材料自装配的能力研究装置的新的可能性。另外，Belcher等公开了用于其他半导体(PbS，CdS)的由7-14个氨基酸组成的肽的氨基酸序列(WO 03/029431)。Brown等披露了具有重复结构的肽的一些例子，该结构具有由14个残基组成的氨基酸序列的单元，显示金亲和力(Nature Biotechnology，15：p.269，1997)。迄今通过上述噬菌体展示方法已经获得了具有对金属(Au、Pt、Pd、Ag)、金属氧化物(SiO₂、ZnO、Cr₂O₃、Fe₂O₃)或半导体的亲和力的许多其他肽。

通过对基板材料具有亲和力的这种肽将需要的生物分子固定在基板上，由于生物分子之间或与不同基板之间的相互作用，也可以以自装配方式构建循环地具有所需功能和形状的结构。例如，Belcher等披露了一种技术，其中展示与ZnS颗粒结合的ZnS-亲和性肽的M13噬菌体通过自装配排列，从而产生液晶样膜(Science，296：892，2002)。

另外，一些实例显示通过如上所述的基因工程产生了与基板结合位点融合的所需功能性蛋白质，从而使该功能性蛋白质可以固定在基板上功能性位点之外的所需位点。但是，当对基板材料具有亲和力的肽直接或通过由几个氨基酸组成的接头连接到功能性蛋白质末端，然后与固相(例如基板)结合而实现蛋白质固定时，该功能性蛋白质的活性位点(例如构成抗体的抗原结合位点的几个氨基酸残基)靠近基板并且与基板表面发生某些相互作用(例如静电作用)，引起结构改变等，导致可能不能充分发挥所需功能。甚至当接头设计为更长时，在分子运动方面具有高自由度的作为接头的肽仍然可能排列靠近功能性位点，其功能可能受到抑制。

由于上述问题，本发明人具有了一个想法，即上面固定有功能性聚合材料包括功能性蛋白质接头的基板结合位点需要具有功能性部分(支架)作为与基板保持一定距离而不抑制所固定的蛋白质的所需活性的间隔区，以及与基板结合的位点。

作为具有这种支架的分子识别分子，最众所周知的是抗体。抗体是在自身防御机制中起作用的一类蛋白质，其特异性识别并结合侵入动物体液中的外源物质表面上的多种结构，这些外源物质然后被免疫系统解毒。抗体的多样性(用于结合多种外源物质的具有不同氨基酸序列的抗体数)据估计为每只动物有10⁷至10⁸个不同种类。其结构是由具有两个长链和两个短链的多肽链形成的，长多肽链(重链)和短多肽链(轻链)分别被称为重链和轻链。

这些重链和轻链各自具有可变区和恒定区。轻链是由一个可变区(VL)和一个恒定区(CL)的两个结构域组成的多肽链，而重链是由一个可变区(VH)和三个恒定区(CH1-CH3)的四个结构域组成的多肽链。上述每个结构域具有由大约110个氨基酸组成的圆柱形结构，并且形成反向平行排列的β片层的层结构，这种层结构通过一个SS键结合，形成高度稳定的结构。而且，众所周知，抗体与多种抗原种的结合是由上述每个可变区(VH或VL)的三个互补决定区(CDR)中氨基酸序列的多样性引起的。CDR，三个为VH的，三个为VL的，被构架区分开排列，并且识别目标识别位点中官能团的空间结构，从而允许高特异性的分子识别。

上述CDR的多样性归因于当骨髓干细胞分化为作为抗体产生细胞的B淋巴细胞时在抗体基因座中发生的DNA重排。众所周知，重链中由VH、D和JH基因片段组成的部分，和轻链中由Vλ或Vκ和Jλ或Jκ基因片段组成的部分，经历DNA重排，从而产生抗体。这种DNA重排在每个B细胞中独立地发生，一个B细胞只产生一种抗体。但是，个体中的全体B细胞可以产生各种各样的抗体。

迄今已经利用抗体形成机制在动物免疫系统中人工产生了能够与上述特定物质结合的抗体，并且已经应用于多个工业领域。产生方法的一个例子是这样一种方法，其中以固定间隔用目标抗原性物质与佐剂一起免疫动物(例如兔、山羊或小鼠)，收集其血清中存在的抗体。如上获得的抗体是几种抗体的混合物，它识别免疫中所用抗原性物质表面上的多种结构。含有与一种抗原结合的几种抗体的血清被称为多克隆抗体。

另一方面，所要免疫的动物的脾脏中存在产生可与目标抗原结合的抗体的多种B淋巴细胞。将这种抗体形成B淋巴细胞与建立的肿瘤细胞融合，从而产生杂交瘤细胞。如上所述，一个B淋巴细胞产生一种抗体，并且建立了一个系统，它能够传代培养产生一种抗体的B淋巴细胞作为杂交瘤。如上所述产生的抗体被称为单克隆抗体。

作为使用抗体的上述结构作为锚的分子识别结构，JP 05-055534A公开了识别两种不同抗原的多结合抗体，和用其形成多层的方法。根据这种技术，能够获得识别第一抗原和第二抗原的融合抗体。另外，第一抗原、融合抗原和第二抗原连续排列在基板表面，从而允许不经化学修饰而形成多层。但是，为了获得其公开的融合蛋白，必须使用动物细胞，这就面临关于成本效率和操作复杂性的问题。除此之外，当形成多层时，必须包括将可被融合蛋白识别的抗体排列在基板表面上的步骤。

已知通过用某种蛋白水解酶处理上述抗体获得的抗体片段，Fab、Fab’或F(ab’)₂，具有类似于亲本抗体的结合抗原的能力。

同样，对于上述VH、VL或作为其复合物的Fv，甚至由VH或VL组成的复合物，具有通过由几个氨基酸组成的肽连接的一个区的羧基末端和另一个区的氨基末端的单链Fv(scFv)，或其类似物，已知具有类似于亲本抗体的结合抗原的能力。

Skerra和Better披露了一种方法，其中当大肠杆菌表达抗体基因时产生Fab-型和Fv-型抗体片段，该抗体片段的N末端通过基因工程方法添加了分泌信号序列(Science，240：P.1038，1988；Science，240：p.1041，1988)。另外，JP 07-501451 A公开了一种多价抗原结合抗体及其产生方法，JP 08-504100 A公开了一种多价、多结合抗体及其产生方法。这两种技术揭示了结合蛋白是含有与一种或多种抗原结合的抗体可变区部分(VH和/或VL)的蛋白质。JP 07-501451公开了识别泛癌抗原TAG-72和荧光素的结合蛋白和识别它们两者的一种双特异性抗体的结构和氨基酸序列，以及编码它们的碱基序列。JP 08-504100 A在实施例中公开了一种二价双特异性结合蛋白，它由针对已知蛋白质(细胞膜蛋白，癌抗原CEA，FcR_Y1等)或低分子化合物的抗体片段复合物组成。

然而，在上述公开内容中，没有公开关于直接识别和结合以无机物质为代表的基板材料表面的结合蛋白的技术。因此，当生产在基板上排列结合蛋白的结构时，必须通过公知的方法进行这种排列，例如，包括化学修饰基板或上述结合蛋白以将该结合蛋白通过共价键排列在该基板上的方法。类似地，当结合蛋白与金属或半导体物质的细粒结合时，也必须化学修饰将要结合的颗粒或结合蛋白。这种化学修饰通常针对在蛋白质分子中大量含有的氨基残基或羧基，参与该反应的位点是非选择性的。因此，发挥所需活性的位点可以是基板结合的或标记的位点，结果，蛋白质的所需活性可能降低。而且，这个问题可能不仅存在于向微装置转化的技术中，而且也存在于传感元件如生物传感器的生产中。因此，重要的是在基板上固定捕获靶物质的分子如抗体，而同时保持足以发挥其捕获功能的分子定向。

正在进行研究，其中向具有类似于上述抗体的构架的蛋白质增加识别多样性分子的能力。其例子包括anticolin(MolecularBiotechnology，74：p.257，2001中的综述)和III型纤连蛋白结构域(J.Mol.Biol，284：p.1141，1998)。Anticolin是在脂笼蛋白(lipocalin)的基础上改变的捕获蛋白。脂笼蛋白是由160至180个氨基酸残基组成的蛋白质，其在转运和贮存具有低水溶性的物质方面起作用。关于结构，脂笼蛋白是由8个β片层组成的桶状结构。脂笼蛋白能够通过连接8个β片层的4个环结构识别和结合目标物质。纤连蛋白通常是由不超过100个残基的氨基酸组成的蛋白质，它在细胞与胞外基质的连接或细胞连接中起关键作用。如同上述两种蛋白质一样，纤连蛋白是具有β片层结构并且通过β片层之间的环结构识别靶物质的蛋白质。通过将随机氨基酸序列导入上述anticolin或纤连蛋白的β片层之间的环结构中，构建了新的结合蛋白。因为这些分子除分子识别位点外还具有由β片层组成的强分子结构，所以这些分子通过与希望的功能性聚合材料融合而特异性识别和结合基板，从而使该聚合材料固定在该基板上。另外，预计这些分子也具有与基板保持一定距离，而不抑制所固定的聚合材料的所需活性的间隔区功能。但是还没有关于以上述抗体为代表的具有组成稳定的构架的分子识别蛋白特异性识别和结合以金属或半导体材料为代表的无机物质的报道。

另一方面，在多种物质(靶物质)的检测领域中，迄今为止已经建立了几种对靶物质的检测和/或定量等方法，特别是对于蛋白质如抗原和抗体，以及糖，凝集素，和核酸。例如，众所周知，标记剂与特异性识别和结合作为靶物质的糖或凝集素的抗体结合，从而允许通过该标记剂检测或定量该靶物质。通常，由金属如金或有机材料如乳胶组成的细粒，被某个波长区的激发光激发荧光的荧光物质，或以荧光物质作为反应产物的酶(例如HRP)，用作标记剂。标记蛋白质如抗体的方法包括物理吸附法和化学键法，在化学键法中将反应性官能团引入标记剂或待标记的物质中，用作形成化学键的交联点。

在下文中，将以检测中使用的抗体作为例子描述现有技术。JP03-108115 B公开了通过将金细粒物理吸附到抗体上用金标记该抗体的方法的实施例。根据该方法，将单克隆抗体加入到预先调节的金胶体的分散体中，将整体进行离心沉淀，以除去上清液，将得到的溶液洗涤几次，产生金标记的抗体。

然后将描述通过化学键法标记抗体的方法。抗体具有蛋白质的氨基或SH基。预先在标记剂中提供可与这些基团反应的官能团，从而使标记剂如荧光物质与待标记物质如抗体之间形成化学键。该方法的一个例子包括这样一种方法，该方法包括引入具有可与氨基反应的N-羟基琥珀酰亚胺基、异硫氰酸酯基、硝基芳基卤基或酰基氯基的标记剂。广泛用作标记蛋白质的交联剂的N-羟基琥珀酰亚胺已知在pH 7或更高pH下可有效地与氨基反应，并且形成高度稳定的酰胺键(Biochemistry，Vol.11，pp.2291，1972)。蛋白质上赖氨酸侧链的α位和ε位的氨基在反应中可以被琥珀酰亚胺基靶向。特别是，ε位的氨基被认为是琥珀酰亚胺的普通靶标。例如，当作为标记剂的金细粒与蛋白质如抗体化学结合时，首先用一种化合物修饰金细粒，该化合物在一端具有至少一个SH基，而在另一端具有与蛋白质的上述侧链残基高度反应性的官能团。然后，该蛋白质可以与该反应性官能团交联，与它们结合。但是，由于具有赖氨酸或游离α-氨基酸的残基非选择性地成为这些方法的反应中的目标物，将要标记的蛋白质如抗体的功能可能受到抑制。尽管已知FITC也是具有异硫氰酸酯基团的荧光物质，但是类似于琥珀酰亚胺，将要标记的蛋白质的所需性质可能由于与氨基的非特异性反应而减少。

此外，-SH基也可以作为交联点。利用SH基的方法大致被分为马来酰亚胺法和二硫吡啶法。马来酰亚胺法是利用具有马来酰亚胺作为与SH基选择性反应的基团的交联剂的方法，已知其允许在温和条件下选择性交联。例如，当所要结合的对象是抗体时，切割抗体分子铰链区中二硫键的SH基与抗原识别部分无关，因此该抗体的特异性预计不受影响，即使SH基被修饰。该SH基用作交联点，从而允许标记剂结合而不削弱所需的功能。然而，一个抗体在整个分子内具有16个SS键，包括用于保持具有互补决定区(CDR)作为抗原识别部分的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的结构的SS键。因此如果SS键的还原不是位点特异性进行的，其功能可能被削弱。

JP 04-070320 B公开了利用金属硫蛋白或其片段的蛋白质标记技术，金属硫蛋白是能够与多种金属离子高亲和力螯合的低分子量蛋白质。在该申请中公开了一种技术，其中金属硫蛋白在巯基部分与作为标记剂的金属离子结合，并且在作为交联点的另一官能团如胺基、羟基或羧基处与抗体等结合。尽管与金属离子和与待标记物质结合的位点在金属硫蛋白中有区别，并且能够与将要结合的相应物质结合，但是待标记的物质的结合位点如其他交联方法一样不确定，并且如上所述的问题可能仍然存在。

此外，对于由于如上所述通过化学交联的标记剂固定方法所引起的非选择性修饰，解决的手段包括通过基因工程的修饰方法。也能够产生融合蛋白，其中通过基因工程方法向蛋白质中引入结合位点。已知的一个例子是这样一种方法，其中通过化学法将低分子化合物生物素引入标记剂如荧光物质的末端，并且通过基因工程将已知与上述生物素结合的完整(链霉)亲和素或生物素结合位点引入所需蛋白质的N末端或C末端，随后表达为融合蛋白并且通过生物素-亲和素键与标记剂结合。因此，低分子化合物被引入标记剂如荧光物质中，并且通过基因工程产生了融合蛋白，在该融合蛋白中能够识别和结合该低分子化合物的蛋白质被引入所需蛋白质中，从而引入了选择性结合位点。

然而，上述公开的技术没有公开任何关于选择性识别和结合以无机物或标记剂为代表的基板材料表面的结合蛋白分子的技术。因此，当生产结合蛋白或复合蛋白排列在基板上的结构时，必须用公知方法进行这种排列，例如，包括化学修饰基板或上述结合蛋白以将该结合蛋白通过共价键排列在基板上的方法。类似地，当结合蛋白与金属或半导体物质的细粒和标记剂结合时，也必须化学修饰将要结合的细粒或结合蛋白。这种化学修饰通常针对蛋白质分子中大量包含的氨基残基或羧基，并且参与该反应的位点是非选择性的。因此，发挥所需活性的位点可以是基板结合的或标记的位点，结果，蛋白质的所需活性可能降低。

而且，这个问题可能不仅存在于向微装置转化的技术中，而且也存在于传感元件如生物传感器的生产中。因此，重要的是将捕获靶物质的分子如抗体固定在基板上，而同时保持充分发挥其捕获功能的分子定向。

发明内容

根据本发明的能够与金结合的蛋白质是具有金亲和力的蛋白质，其特征在于包含金结合位点，该金结合位点含有金抗体的至少一部分。

根据本发明的一个方面，提供了一种金结合复合蛋白，包含：

(1)第一结构域，其含有具有金亲和力的蛋白质；和

(2)第二结构域，其含有具有对某些物质的结合位点的蛋白质。

根据本发明的另一方面，提供了一种包含基板和蛋白质的结构，其中该基板在其表面的至少一部分中含有金，该蛋白质是具有上述构造的金结合复合蛋白。

根据本发明的另一方面，提供了一种编码具有上述构造的金结合复合蛋白的核酸。根据本发明的另一方面，提供了含有所述核酸的载体。

根据本发明的另一方面，提供了生产具有上述构造的结构的方法，包括以下步骤：

(1)制备所述基板；

(2)生产所述金结合复合蛋白；和

(3)将该金结合复合蛋白排列在该基板上。

根据本发明的另一方面，提供了用于检测靶物质的试剂盒，包括用于形成具有上述构造的结构的基板和金结合复合蛋白，和用于检测靶物质与该结构结合的检测工具。

根据本发明的另一方面，提供了用于用标记剂标记靶物质的连接体，包括：

一个或多个与靶物质结合的位点，和一个或多个与标记剂结合的位点，其中：

与靶物质结合的位点和与标记剂结合的位点各自独立地与将要结合的物质结合；且

与标记剂结合的位点和与靶物质结合的位点中的至少一个含有具有上述构造的蛋白质。

根据本发明的另一方面，提供了一种检测靶物质的方法，其中靶物质与标记剂结合并且被其标记，以检测与该标记剂结合的靶物质，包括以下步骤：

将标记剂通过具有上述构造的连接体与靶物质结合。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于检测靶物质的试剂盒，包括：标记剂；具有上述构造的连接体；和用于检测该标记剂与靶物质通过该连接体结合的状态的检测工具。

根据本发明的金结合复合蛋白包括金结合位点和结构部分。因此，当与金结合蛋白连接和结合的功能性物质被固定在金基板表面时，这种固定不影响该功能性物质的原始功能。而且，因为在固定中未使用试剂，该功能性物质未经受任何影响其功能的化学反应。此外，通过与金基板保持距离，该功能性物质不会与基板发生影响其功能的相互作用。

另外，本发明的金结合复合蛋白包括至少与金和某些物质结合的几个结合位点。这允许一种结构形成至少由以下部分组成的分层体：(i)在其表面至少一部分中含有金的基板，(ii)本发明的金结合复合蛋白，和(iii)能够与本发明的金结合复合蛋白结合的某种物质。在这种情况下，因为本发明的金结合复合蛋白具有空间稳定的抗体可变区结构域的β片层结构，在金基板和该某种物质之间能够保持间距，而与金或金以外的物质(例如标记剂)结合的金结合蛋白的结构域(例如第二结构域)不会与含金基板发生某些相互作用，并且能够保持结合能力。而且，这允许形成极薄且精细的分层结构。利用本发明的金结合蛋白的这些特性，可以获得一种检测装置。例如，在薄金层中提供能够与所需物质结合的本发明的金结合复合蛋白，并且能够制造用于所需物质的传感元件。其检测方法能够提供光学手段，例如，应用表面等离振子共振的手段。

另一方面，当提供含金物质作为标记剂时，可以使用本发明的金结合蛋白作为连接体，用于将含金标记剂与靶物质结合。根据作为连接体的这种形式，可以获得以下所述的典型效果。

第一个效果是，金结合蛋白具有一个或多个各自与靶物质和标记剂结合的位点，每个结合位点彼此独立地与将要结合的物质结合，从而提供一种极佳的连接体，该连接体能够标记靶物质，并且不显示所标记的物质与靶物质结合的能力降低，这种降低被认为是常规标记方法中由标记剂结合引起的问题。第二个效果是，连接体是生物聚合物，更特别的是蛋白质，因此预期具有高亲和力，这是由于靶物质表面与蛋白质的几个氨基残基相互作用而引起的。第三个效果是，连接体是抗体可变区，预期具有结合特异性，因为在由高级结构确定的构造中限定了结合位点。第四个效果是，标记剂是含有金的物质，从而不仅能够测定样品的散射光的量，而且除了应用增强拉曼或局部等离振子原理的光学测量以外还能够利用其电学性质进行电测定。第五个效果是，使用本发明的连接体，可以提供同时或任选地增加有靶物质/连接体/标记剂的检测方法和检测试剂盒。

附图说明

图1是一张示意图，显示本发明的复合蛋白的一个实施例中一种结构的构造。

图2A和2B是示意图，分别显示本发明的复合蛋白的一个实施例中一种结构的构造。

图3是一张示意图，显示本发明的复合蛋白的一个实施例中一种结构的构造。

图4A和4B是示意图，分别显示本发明的复合蛋白的一个实施例中一种结构的构造。

图5是一张示意图，显示本发明的复合蛋白的一个实施例中一种结构的构造。

图6是一张示意图，显示本发明的复合蛋白的一个实施例中一种结构的构造。

图7是一张示意图，显示本发明的复合蛋白的一个实施例中一种结构的构造。

图8是一张示意图，显示本发明的复合蛋白的一个实施例中一种结构的构造。

图9是显示SPR评价本发明获得的VL的一个实施例的图。

图10是显示SPR评价本发明获得的VH的一个实施例的图。

图11是用于说明本发明实施例的载体的示意图。

图12A和12B是用于说明本发明实施例的载体的示意图。

图13是用于说明本发明实施例的载体的示意图。

图14是用于说明本发明实施例的载体的示意图。

图15是用于说明本发明实施例的载体的示意图。

图16是用于说明本发明实施例的载体的示意图。

图17是显示SPR评价本发明获得的scFv的一个实施例的图。

图18是实施例21中的SPR图。

图19是实施例31中的GPC图。

图20是实施例32中的SPR图。

图21是实施例34中的SPR图。

图22是实施例36中的SPR图。

图23是实施例37中的GPC图。

图24是实施例38中的SPR图。

图25是实施例40中的GPC图。

图26是实施例42中含有金细粒的溶液的吸附曲线。

图27是比较实施例3中的SPR图。

图28是比较实施例4中的SPR图。

发明最佳实施方式

在下文中将描述根据本发明的金结合蛋白，应用该金结合蛋白的复合蛋白，及其应用。

(1)金结合蛋白

抗体

本发明的金结合蛋白包括抗体的至少一部分。如本发明所示用于结合金的抗体的例子包括所有脊椎动物的淋巴细胞产生的具有金亲和力的抗体，和一种蛋白质，该蛋白质具有在该抗体的氨基酸序列中含有一个或几个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列，并且在结构和功能上与该抗体具有关系，即，保持需要的金亲和力。尽管抗体根据其性质(免疫或物理)的分类分为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，但是该分类中的任何抗体都可以在本发明中使用。而且，这些抗体可以形成多聚体。例如，IgA形成二聚体，IgM形成五聚体，只要它们是能够与金结合的形状就没有问题。金结合抗体的获得。另外，抗体也可以是IgW和IgY，只要它们用于体外应用。

作为获得本发明的金结合抗体的方法，可以适当地选择和进行制备抗血清的技术和通过细胞融合产生单克隆抗体的技术，这些技术已经常规进行。例如，用本发明中所要结合的金细粒对适于免疫的动物进行免疫，在证实抗体效价升高后，从血清中收集抗体。上述免疫通常用如下的方法进行，其中将作为抗原的金细粒用适当的溶剂如生理盐水溶液稀释至合适的浓度，将该溶液，必要时与弗氏完全佐剂一起，静脉内或腹膜内施用于动物，共3至4次，间隔为1至2周。这样免疫的动物在最后一次免疫3天后解剖，使用从切下的脾脏中获得的脾细胞作为免疫细胞。用于免疫的金细粒的大小优选为10nm或更小，更优选2nm或更小。另外，更优选地，金细粒与蛋白质如血清白蛋白共价连接，使其成为半抗原。至此，预计难以产生免疫反应的抗原也作为某种蛋白质抗原的一部分被识别，并且通过该抗原与蛋白质抗原之间形成复合物诱导它的产生。

获得的抗体可以是多克隆的，但是，也可以作为单克隆抗体提供，从而允许选择对金具有高特异性的克隆。单克隆抗体可以通过克隆产生它的细胞而获得。通常，免疫球蛋白形成细胞，例如从接受免疫的动物中采集的脾细胞，与肿瘤细胞融合，从而形成杂交瘤(Gulfre G.，Nature 266.550-552，1977)。例如，肿瘤细胞包括骨髓瘤细胞，如小鼠来源的骨髓瘤P3/X63-AG8.653(ATCC No.CRL-1580)、P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)、P3/X63-Ag8.U1(P3U1)、SP2/0-Ag14(Sp2/0，Sp2)、NS0、PAI、F0或BW5147，大鼠来源的骨髓瘤210RCY3-Ag.2.3.，和人源骨髓瘤U-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM-AGR、DIR11或CEM-T15。

在筛选产生单克隆抗体的细胞时，该细胞在滴定板中培养，在观察到增殖的孔中培养上清液与上述金细粒的反应性可以通过例如酶免疫试验来测定，如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫溶剂测定(ELISA)或免疫沉淀。或者，也可以用表面等离振子共振(SPR)装置定量测定金亲和力。

抗体片段

本发明所述的抗体片段是指单克隆抗体的一部分的区域，其具体例子包括F(ab′)2、Fab’、Fab、Fd、抗体的可变片段(Fv)、单链Fv(scFv)、二硫键稳定的Fv(dsFv)和由重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)组成的单结构域抗体(dAv)。

此处所用的“F(ab′)2”和“Fab′”可以通过用例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶作为蛋白水解酶处理抗体获得。它们是指通过在抗体铰链区中两个重链(H链)之间存在的二硫键附近消化而产生的抗体片段。例如，当用木瓜蛋白酶处理IgG时，该IgG在铰链区中两个H链之间存在的二硫键的上游被切开，产生两个同源片段，其中由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的轻链(L链)和由重链可变区(VH)和重链恒定区1(CH1)组成的重链(H链)通过位于C末端区的二硫键结合在一起。这两个同源抗体片段中的每一个被称为Fab’。另外，当用胃蛋白酶处理IgG时，该IgG在铰链区中两个H链之间存在的二硫键的下游切开，从而产生在铰链区中连接的比上述两个Fab’略大的抗体片段。该抗体片段被称为F(ab′)2。

本发明的金结合蛋白可以是上述的Fab’或F(ab′)2。该金结合蛋白也可以是Fd片段，其中VH和上述CH1结合在一起。

另外，该金结合蛋白可以是抗体的可变片段(Fv)或其部分，例如，构成Fv的重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)或其部分。另一方面，对于由上述VH或VL组成的复合物，可以使用一个区的羧基末端和另一个区的氨基末端通过由几个氨基酸组成的肽连接在一起的单链Fv(scFv)。优选地，由上述scFv构成的VH/VL(没有具体顺序)具有由一个或多个氨基酸组成的接头。重要的是将氨基酸接头的残基长度设计为没有抑制形成抗原与VH或VL结合所必需的结构的结合力。作为一个具体例子，氨基酸接头的长度通常为5-18个残基，更广泛地使用和研究15个残基。这些片段可以通过基因工程方法获得。

另外，尽管VH和VL中的任一个都可以是单结构域dAb，但是该单结构域结构通常不稳定，因此可以通过化学修饰如PEG修饰来稳定。另外也可以使用camelid重链的可变区VHH(J.Mol.Biol，311：p123，2001)和铰口鲨(Nurse Shark)的免疫球蛋白样分子IgNAR的可变区，IgNAR在体内存在并且能够作为只含重链的抗体起作用。另外，当使用以人和小鼠抗体为代表的由重链和轻链组成的抗体VH或VL作为如图1至4所示的结构域单元时，也可以利用仅含重链抗体的等同物引入VH/VL或类似的界面，以提高稳定性。

金结合位点可包括选自下组的至少一个：(1)抗体重链可变区(VH)，变体，及其一部分，和(2)抗体轻链可变区(VL)，变体，及其一部分。抗体重链可变区(VH)的优选例子包括具有SEQ ID NO.：1至48的氨基酸序列中至少一个的蛋白质，抗体轻链可变区(VL)的优选例子包括具有SEQ ID NO.：49至57的氨基酸序列中至少一个的蛋白质。可以同样使用具有金亲和力并且含有一个或多个氨基酸序列的蛋白质，该氨基酸序列在SEQ ID NO.：1至57的氨基酸序列每一个中具有一个或几个氨基酸的缺失、取代或添加。

具有金亲和力的抗体片段的获得

通过酶处理获得

上述抗体用某些酶处理，以获得一定程度地具有该抗体的抗原结合位点和抗原结合能力的抗体片段。例如，Fab片段或其类似物可以通过用木瓜蛋白酶处理所获得的抗体而获得。F(ab’)₂片段或其类似物可以通过用胃蛋白酶处理所获得的抗体而获得。除上述酶法以外，也可以通过化学降解法产生上述抗体片段。该抗体片段可以没有问题地使用，只要它具有与金结合的能力。

获得根据本发明的VH或VL的上述Fab’、Fv或dAb的方法也可以是利用基因工程方法获得。一个例子是这样一种方法，在该方法中产生VH或VL的基因文库，将其广泛表达为蛋白质，以根据对金或靶物质的亲和力选择相应基因。基因文库可以获自，例如，脐带血、扁桃体、骨髓或外周血细胞或脾细胞。例如，从人外周血细胞中提取mRNA，并合成cDNA。然后，利用编码人VH或VL的序列作为探针，产生人VH或VL的cDNA文库。例如，能够广泛扩增人VH家族(VH1至7)的引物以及能够扩增人VL的引物在本领域中已知。通过将引物与该VH或VL的每一个组合进行RT-PCR，得到编码该VH或VL的基因。或者，也能够采用噬菌体展示法。在噬菌体展示法中，编码VH、VL或含有它们的复合物(例如Fab、scFv)的基因文库与编码噬菌体外壳蛋白的基因结合，产生噬菌粒文库，该噬菌粒文库随后转化到大肠杆菌内，表达为具有多种VH或VL作为外壳蛋白一部分的噬菌体。这些噬菌体用于如上所述根据对金或靶物质的亲和力进行选择。编码由噬菌体展示为融合蛋白的VH或VL的基因由该噬菌体中的噬菌粒编码，因此能够通过DNA测序来鉴定。

本发明还包括编码上述金结合蛋白的核酸。本发明进一步包括由核酸组成的组分，其作为将要表达为蛋白质的基因载体提供，用于转化宿主细胞(例如来源于大肠杆菌、酵母、小鼠或人的公知的蛋白质表达细胞)，以允许上述金结合蛋白的表达。能够由一种表达载体表达的本发明的金结合蛋白可以从整个抗体分子或其抗体片段F(ab’)2、Fab、Fv(scFV)、VH或VL或其复合物来选择和设计。当一个表达载体编码多个上述抗体片段时，每个抗体片段可以独立地表达为单个多肽链。也可能构建将这些抗体片段表达为一条多肽链的载体，该多肽链中结构域连续地或者通过氨基酸连接。

在用于表达本发明的金结合蛋白的载体的结构中，可以根据所选择的宿主细胞，通过整合入表达转基因所必需的结构例如已知的启动子，来设计和构建该载体。可以根据所选择的宿主细胞按照已知启动子等结构来构建该载体。当使用大肠杆菌等作为宿主细胞时，本发明的金结合蛋白或其组分作为外源基因产物被直接排出到细胞质外部，从而减少了蛋白酶降解。而且，众所周知，即使该外源基因产物对细菌有毒性，通过将该外源基因产物分泌到细菌外部也可以减轻它的作用。大多数穿过已知的胞质膜或内膜分泌的蛋白质通常在其前体的N末端具有信号肽，在分泌过程中该信号肽被信号肽酶切下，使前体成为成熟蛋白质。大多数信号肽具有碱性氨基酸、疏水性氨基酸和信号肽酶切割位点，它们位于N末端。

通过将编码以pelB为代表的公知信号肽的核酸定位于编码本发明的金结合蛋白的核酸的5’侧，可以分泌并表达该金结合蛋白。

本发明的几种金结合蛋白或由多个抗体片段组成的几种多肽链也可以各自独立地插入一个载体中。在此情况中，编码pelB的核酸可以位于每个结构域或者编码该多肽链的核酸的5’侧，以利于分泌。或者，当金结合蛋白表达为由一个或多个结构域组成的多肽链时，编码pelB的核酸可以位于该多肽链的5’侧，从而如上所述有利于分泌。其中如上所述在其N末端融合有信号肽的本发明的金结合蛋白可以从周质部分和培养基上清液中纯化。

为了方便纯化表达的蛋白质的程序，可以通过基因工程将用于纯化的标签排列在由抗体分子形成的多肽链、或者每个独立的抗体片段、或连续连接的几个抗体片段的N或C末端。上述用于纯化的标签的例子包括由六个连续组氨酸残基组成的组氨酸标签(下文称为HisX6)和谷胱甘肽-S-转移酶的谷胱甘肽结合位点。引入标签的方法的例子包括：将编码用于纯化的标签的核酸插入上述表达载体中编码金结合蛋白的核酸的5’或3’末端的方法；以及使用商业上可获得的载体引入用于纯化的标签。

下文将描述利用上述表达载体产生本发明的金结合蛋白的方法。用一种用于表达金结合蛋白的载体转化公知的表达蛋白质的宿主细胞，该载体根据宿主细胞设计，从而利用该宿主细胞中的蛋白质合成系统将本发明的金结合蛋白或作为其成分的多肽链合成到该宿主细胞中。然后，可以从细胞内部或细胞培养上清液中纯化并由此获得积累或分泌到宿主细胞外部或内部的所需蛋白质。例如，当使用大肠杆菌作为宿主细胞时，可以通过将编码以pelB为代表的公知信号肽的核酸定位于编码本发明金结合蛋白的核酸的5’侧来构建大肠杆菌，以利于向细胞质外分泌和表达。

当构成本发明的金结合蛋白的几个多肽链在本发明的一种表达载体中表达时，编码pelB的核酸可以位于编码每个多肽链的核酸的5’侧，从而有利于其表达时向细胞质外的分泌。其中如上所述在其N末端融合有信号肽的本发明的金结合蛋白，可以从周质部分和培养基上清液中纯化。在一种纯化方法中，当用于纯化的标签是His-标签时，可以使用镍柱纯化，当用于纯化的标签是GST时，可以使用固定的谷胱甘肽柱纯化。

在细菌中表达的本发明的金结合蛋白也可以用不溶性颗粒获得。在这种情况中，可以从细胞匀浆溶液中离心不溶性颗粒，在该溶液中从培养液中获得的细菌用弗氏压碎器或超声波进行匀浆。获得的不溶性颗粒部分可以用含有含尿素和盐酸胍的公知变性剂的缓冲溶液溶解，然后在变性条件下用如上所述的柱纯化。对于获得的柱洗脱级分，变性剂的清除和活性结构的重建可以通过重折叠程序进行。可以适当地使用任何公知方法作为重折叠程序。更具体而言，根据所需蛋白质可以使用分步透析法或稀释法。

本发明的金结合蛋白的每个结构域或每个多肽链可以在相同的细胞中表达，或者可以在用另一种宿主细胞表达后彼此共存地复合。

另外，使用编码本发明的金结合蛋白的载体，也可以利用细胞提取溶液在体外表达该蛋白质。优选使用的细胞提取溶液的例子包括大肠杆菌、麦胚和兔网织红细胞。但是，用细胞提取溶液合成蛋白质通常在还原条件下进行。因此，更优选的是进行一些处理用于在抗体片段中形成二硫键。

在存在0.1％Tween 20的缓冲液条件下，本发明的金结合蛋白的优选解离常数(K_D)为10^-6M或更低，更优选10^-8M或更低。本发明人已经通过研究证实，在上述条件下，蛋白质材料不能附着于金上，甚至对金具有较大非特异性附着的蛋白质材料如BSA也是如此。如果K_D 值为10^-6或更低，如上所述的非特异性粘附蛋白质的附着行为完全能够被区别开。另外，当K_D值为10^-8或更低时，金结合蛋白完全可以作为用于固定的锚分子。

抗体片段蛋白质的表达

金结合蛋白用需要的限制性内切酶切割，例如在上述情况中用NcoI/NheI切割，得到编码金结合抗体片段的DNA。可以将其导入公知的用于在宿主细胞中表达蛋白质的质粒中，从而得到抗体片段。例如，当使用大肠杆菌作为宿主细胞并且从胞外表达或周质部分中收集所需的抗体片段时，可以在编码上述抗体片段的基因的上游引入公知的信号肽。信号肽包括pelB。为了在表达后容易地从培养上清液或细菌部分中纯化需要的蛋白质，可以融合公知的用于纯化的标签。更具体而言，可以引入6个组氨酸残基(HisX6)或谷胱甘肽-S-转移酶的谷胱甘肽结合位点，得到融合蛋白。对于His-标签的情况，该融合蛋白可以用金属螯合柱如镍容易地纯化。对于GST标签的情况，可以用具有上面固定有谷胱甘肽的载体如Sepharose的柱进行纯化。

或者，当在细菌中表达的所需蛋白质不能用不溶性颗粒获得时，该不溶性颗粒可以用含有尿素和盐酸胍的公知缓冲溶液溶解，然后重折叠。可以适当地使用任何公知方法作为重折叠方法。更具体而言，根据所需蛋白质可以使用分步透析法或稀释法。

如上所述获得的抗体及其片段，例如Fab、(Fab’)2、Fc、VH或VL，或其复合物，甚至在其氨基酸序列中具有一个或几个氨基酸的缺失、取代或添加的，只要具有金亲和力就没有脱离本发明的范围。

在存在0.1％Tween 20的缓冲液条件下，本发明的金结合蛋白的优选解离常数(K_D)为10^-6M或更低，更优选10^-8M或更低。本发明人已经通过研究证实，在上述条件下，蛋白质材料不能附着于金上，甚至对金具有较大非特异性附着的蛋白质材料如BSA也是如此。

如果K_D值为10^-6或更低，非特异性粘附蛋白质的附着行为完全能够被区别开。另外，当K_D值为10^-8或更低时，金结合蛋白完全可以作为用于固定的锚分子。

含有金的待结合物质

可以从在其表面的至少一部分中含有金的多种物质中选择并且使用含有金的待结合物质。当通过免疫、淘选等选择金结合蛋白时，待结合物质的表面仅由金组成，用于排除清除与金以外的物质附着的蛋白质的污染。用于除表面以外的内核基板的材料可以选择并且使用(当然)金，以及多种其他已知材料。而且，待结合物质优选以颗粒形式提供，更优选为1-100μmφ的细粒，从而使参与结合的比表面积增加，并且允许在淘选结束时通过离心容易地收集。另外，如下所述，待结合物质可以是通过将金蒸发到多种商业上可获得的塑料板中的任一种例如培养皿或96孔滴定板上而获得的。在这种情况中，考虑金表面的湿润区域和搅拌引起的分子扩散效应，优选地确定孔的大小和数目。

待结合物质的形状可以适当地选择及使用本领域所知的形状，如扁平、球形、针状或多孔的形状。成型方法可以适当地选自物理或化学蒸汽淀积法或使用氯化金的化学生产方法。获得的含金表面可以预先用酸性溶液、碱性溶液、有机溶剂等洗涤，以便清除杂质如氧化物层、副产物和污染物，并且具有需要的金暴露条件。

基板

可以在多种应用中使用的结构能够由金结合蛋白和在其表面至少一部分上形成金的基板获得。可以使用具有任意形状和材料的基板，只要它在其表面至少一部分上含有金并且能够形成本发明的结构。本发明中使用的基板的材料可以是能够形成本发明结构的任何材料，包括选自下组的任何一种或多种或其复合物：金属，金属氧化物，无机半导体，有机半导体，玻璃，陶瓷，天然聚合物，合成聚合物，塑料。本发明使用的基板的形状可以是能够形成本发明结构的任何形状，包括选自以下形状的任何一种或多种：板、颗粒、多孔体样、突出、纤丝、圆柱和网状形状。

用于形成基板的有机聚合化合物的例子包括通过选自下组的可聚合单体聚合而生产的有机聚合化合物：苯乙烯可聚合单体，如苯乙烯、α-甲基苯乙烯、β-甲基苯乙烯、邻甲基苯乙烯、间甲基苯乙烯，对甲基苯乙烯、2，4-二甲基苯乙烯，对-正-丁基苯乙烯、对-叔丁基苯乙烯、对-正-己基苯乙烯、对-正-辛基苯乙烯、对-正-壬基苯乙烯、对-正-癸基苯乙烯、对-正-十二烷基苯乙烯、对甲氧基苯乙烯、和对苯基苯乙烯；丙烯酸酯可聚合单体，如丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丙酯、丙烯酸异丙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸异丁酯、丙烯酸叔丁酯、丙烯酸正戊酯、丙烯酸正己酯、丙烯酸2-乙基己基酯、丙烯酸正辛酯、丙烯酸正壬酯、丙烯酸环己酯、丙烯酸苄酯、磷酸二甲酯丙烯酸乙酯、磷酸二乙酯丙烯酸乙酯、磷酸二丁酯丙烯酸乙酯、和2-苯甲酰氧基丙烯酸乙酯；甲基丙烯酸酯可聚合单体，如甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸正丙酯、甲基丙烯酸异丙酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸异丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸正戊酯、甲基丙烯酸正己酯、甲基丙烯酸2-乙基己基酯、甲基丙烯酸正辛酯、甲基丙烯酸正壬酯、磷酸二乙酯甲基丙烯酸乙酯、和磷酸二丁酯丙烯酸乙酯；亚甲基脂肪族一元羧酸酯；乙烯基酯，如乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、苯甲酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、苯甲酸乙烯酯、和甲酸乙烯酯；乙烯基醚，如甲基乙烯基醚、乙基乙烯基醚、和异丁基乙烯基醚；和乙烯基可聚合单体，包括乙烯基酮，如甲基乙烯基酮、己基乙烯基酮和异丙基乙烯基酮。

此外，无机固体的例子可以包括但是当然不限于：粘土矿物，如高岭土、膨润土、滑石和云母；金属氧化物，如氧化铝、二氧化钛、氧化锌、磁铁矿、铁氧体、NbTa复合氧化物、WO₃、In₂O₃、MoO₃、V₂O₅和SnO₂；不溶性无机盐，如硅胶、羟基磷灰石和磷酸钙凝胶；金属，如金、银、铂和铜；半导体化合物，如GaAs、GaP、ZnS、CdS和CdSe；玻璃；硅；及其复合物。

可以用于形成本发明基板的膜和片的例子包括但当然不限于：由塑料组成的膜，如聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、二醋酸酯、三醋酸酯、玻璃纸、赛璐珞、聚碳酸酯、聚酰亚胺、聚氯乙烯、聚偏氯乙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯和聚酯；由如下成分组成的多孔聚合物膜：聚氯乙烯、聚乙烯醇、乙酰纤维素、聚碳酸酯、尼龙、聚丙烯、聚乙烯和特氟纶；木制板；玻璃板；硅基板；织物，如棉花、人造丝、丙烯酸树脂、丝和聚脂；纸，如优质纸、中质纸、铜版纸、证券纸、再生纸、钡白纸、高光泽印刷纸、瓦楞纸、和树脂印相纸。注意这些膜和片的材料也可以是光滑的或不平的。

基板的例子包括：由硅、二氧化硅、玻璃、石英玻璃等制成的基板，通过光刻、蚀刻和喷砂在基板中形成的微流通道和孔，或者具有在上面形成金、银和铂薄膜的表面的基板；由聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯对苯二甲酸酯(PET)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)等制成的基板，和通过模制技术在其中形成的微流通道和孔；碳纳米管；碳纳米孔(nanohones)、富勒烯(fullerenes)、金刚石或其聚集物；由铝、碳、富勒烯、ZnO等构成的纳米晶须；中孔性薄膜、细粒、和由SiO₂、铝硅酸盐、其他金属硅酸盐、TiO₂、SnO₂、Ta₂O₅等制成的单块(monolith)结构构件；金、银、铜、铂等的细粒；磁铁矿、铁氧体、赤铁矿、gammna赤铁矿、磁赤铁矿等的三氧化二铁细粒；铝/硅混合物膜和利用阳极氧化由其获得的氧化硅纳米结构构件；多孔氧化铝薄膜；氧化铝纳米孔结构；和硅纳米丝，但不限于这些。

另外，可以根据预期用途不同地选择本发明的基板的尺寸。

·靶物质检测试剂盒

用于检测靶物质的试剂盒可以用增加了对靶物质的亲和力的本发明金结合蛋白的构造获得。例如，用于检测靶物质的试剂盒可以由以下成分构成：用于形成上述结构构件的基板和金结合复合蛋白；和用于检测靶物质与该结构构件结合的检测组件。例如，能够检测含有金结合蛋白的蛋白质与靶物质的结合，使得金或含金的标记剂以与含金结合蛋白的蛋白质结合的状态加入靶物质中，然后进行物理或化学方法，以检测金或靶物质。此外，当靶物质含有金时，利用金结合蛋白对金的亲和力使金结合蛋白与含金标记剂结合，然后检测其结合状态。在这种情况下，使用的标记可以是下面将在连接体的描述中描述的那些。而且，例如，可以根据物理值的变化，如光、电或热的变化，检测标记剂与金结合蛋白的结合。

另外，增加了对标记剂的亲和力的结构优选地可以是利用下面所述金结合复合蛋白或金结合蛋白作为靶物质与标记剂之间的结合体的结构。

·表面等离振子共振装置

另外，含有金结合蛋白的蛋白质与金的结合可以利用例如常规已知的表面等离振子共振测定装置进行定量测定。总的来说，表面等离振子共振是一种测量玻璃基板上形成的金薄膜上折射率变化的方法，这种折射率变化是由金薄膜上自由电子之间的共振产生的共振角的变化以及入射光从玻璃一侧以不超过总反射角的入射角在玻璃与金之间的边界表面上产生的隐失波引起的。可以将测量的折射率的变化转化为目标蛋白质相对于金的量，然后评价。

·解离常数(K_D)

术语“解离常数(K_D)”是指通过将“结合率(Ka)”除以“解离率(kd)”值获得的数值。这些速率可以用作表示单克隆抗体或其片段对金的亲和力的指标。这些速率可以用各种方法中的任一种分析。然而在本发明中，使用测量仪器Biacore2000(Amersham PharmaciaBiotech，Co.，Ltd.)，根据安装在该仪器上的分析软件，由标准曲线确定这些速率。

(2)金结合复合蛋白

本发明的金结合复合蛋白包含两个或多个结构域。在这些结构域中，至少一个结构域含有如上所述构建的金结合蛋白。复合蛋白的例子包括如下所述构建的复合蛋白。

(a)一种复合蛋白，包括含如上所述构建的金结合蛋白的第一结构域1和含具有特定物质特异性结合位点的蛋白质的第二结构域2。

(b)一种复合蛋白，除了第一结构域和第二结构域之外，还包括与第一结构域形成复合物的第三结构域3和与第二结构域形成复合物的第四结构域4中的至少一个。

另外，第二至第四结构域中的至少一个可以含有至少一个具有金亲和力的蛋白质。在该情况下，这些结构域中的每一个可以通过引入如上所述构建的金结合蛋白而构建。而且，第一至第四结构域也可以具有对目标结合物质的亲和力，它们的亲和力可以在结构域之间独立地调节。或者，两个或多个结构域可以具有相似的亲和力。这些结构域可以由具有不同亲和力的结构域构建。

此外，选自第一至第四结构域中的至少两个也可以包含于同一多肽链中。金结合复合蛋白的这种构造的例子包括下列结构。

(1)其中第一结构域和第二结构域形成一条多肽链的结构。

(2)其中第一结构域和第二结构域通过一个或多个氨基酸结合的结构。

(3)其中第三结构域和第四结构域形成一条多肽链的结构。

(4)其中第三结构域和第四结构域通过一个或多个氨基酸结合的结构。

(5)由含第一结构域和第二结构域的第一多肽链和含第三结构域和第四结构域的第二多肽链组成的结构。

(6)由含第一结构域和第二结构域的第一多肽链和含第三结构域和第二结构域的第三多肽链组成的结构。

(7)由含第一结构域和第二结构域的第一多肽链和含第一结构域和第四结构域的第四多肽链组成的结构。

(8)由至少含第一结构域、第二结构域和第三结构域的一条多肽链组成的结构。

(9)由至少含第一结构域、第二结构域和第四结构域的一条多肽链组成的结构。

(10)由含第一至第四结构域的一条多肽链组成的结构。

·金结合复合蛋白

作为金结合复合蛋白的组分提供的蛋白质是指含有至少一条多肽链的分子，该多肽链是通过使至少两个氨基酸结合在一起而形成的，其中该多肽链能够折叠为特定的三维结构以发挥其内在的功能(例如，转换和分子识别)。另外，本发明的金结合复合蛋白是含有至少一个金结合位点以及至少一个对金或金以外其他物质的结合位点的复合蛋白，因而显示多价的亲和力或多特异性。例如，该复合蛋白优选地可包括具有金结合位点并且含有抗体轻链可变区(VL)或重链可变区(VH)至少一部分的第一结构域，和具有对特定物质(在下文中称为靶物质)的结合位点并且含有VH或VL至少一部分的第二结构域。在下文中，与金结合的VH和VL分别称为VH(G)和VL(G)。与靶物质结合的VH和VL分别称为VH(T)和VL(T)。

抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)是分别属于抗体重链和抗体轻链的可变区。通常，抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)中的每一个都是管状结构，并且由大约110个氨基酸组成，然后与以相反方向排列的β片层组形成分层结构，而该层结构利用单S-S键连接，形成极稳定的结构。另外，众所周知可变区(VH或VL)是决定抗体与多种抗原结合的互补决定区(CDR)。VH和VL中各有三个CDR，它们彼此被具有多样性较低的氨基酸序列的构架区隔开，从而识别靶识别位点的官能团的空间排列，使得更高级地识别特定分子。

下文中将描述本发明的金结合复合蛋白的一个实施例。如图1所示，金结合复合蛋白的最小单元包括第一结构域和第二结构域。结构域组合的例子包括如(a)所示的VH(G)-VH(T)、如(b)所示的VH(G)-VL(T)，如(c)所示的VL(G)-VH(T)和如(d)所示的VL(G)-VL(T)。在该实施例中，独立地，第一结构域与金结合，第二结构域与靶物质结合，在第一和第二结构域之间不形成互补的结合位点。第一和第二结构域可以是分别独立的多肽链，或者它们可以连续地相互对齐和连接。为了简化生产过程和功能表达，更优选的实施方案是通过连续地连接多肽链而形成多肽链。对于通过连续连接第一结构域和第二结构域制备的多肽链，第一结构域和第二结构域可以直接彼此连接，或者可以通过由一个或多个氨基酸构成的接头5连接。由氨基酸组成的接头优选地是由1-10个氨基酸组成的，更优选是由1-5个氨基酸组成的。当接头具有11-15个氨基酸的长度时，第一结构域和第二结构域之间的互补结合(成为scFv)可以形成，因为这些结构域由于排列而具有极少的限制。为了防止在VH和VL之间形成互补复合物，众所周知通过缩短接头的长度而在结构域之间施加结构限制是有效的。理想的是，当第一和第二结构域中的每一个与靶物质结合时造成的结构改变不会影响所需的与靶物质结合的能力。因此，有可能设置由第二种结构如α-螺旋组成的接头或插入与需要的结合特性无关的多肽，只要它们不显著影响需要的特性或生产能力。

此外，本发明的金结合复合蛋白与第一结构域形成复合物。它可包括含有VH或VL至少一部分的第三结构域和/或含有VL或VH至少一部分的第四结构域，该第四结构域与第二结构域形成复合物。更希望的是使第三结构域与第一结构域形成复合物，从而与第一结构域形成互补的金结合位点。

例如，当第一结构域是如图2A和2B所示的VH(G)时，第三结构域优选的是能够与第一结构域形成FV的VL，更优选的是形成一种结构，使得通过连接第一结构域和第三结构域形成金结合位点。

如上所述，第一结构域和第三结构域形成Fv，以获得结构稳定性并且预期防止由于结构改变引起的功能减弱。此外，当第三结构域通过与第一结构域连接形成金结合位点时，能够预期结合能力进一步提高(例如，结合速率提高和解离速率受到抑制)。

此外，如图2A所示，第一结构域和第三结构域可以分别作为独立的多肽链提供，或者可以彼此连接形成多肽链(例如，第三结构域-第一结构域-第二结构域，如图2B的示意图所示，可以适当地确定结构，以便对金和靶标发挥结合能力)。此外，作为另一个实施例，如图3的示意图所示的结构可以允许。换句话说，它是由第一结构域和第二结构域组成的多肽链以及第三结构域和第二结构域组成的多肽链构成的复合物。在该情况下，通过由第一和第三结构域形成的Fv或Fv样复合物实现与金的结合，然后第一结构域作为通过第二结构域与靶物质结合的锚。

此外，本发明的金结合蛋白可以包括由VH或VL的至少一部分组成的第四结构域，它与第二结构域形成复合物。希望的是以互补的方式与第二结构域一起形成对靶物质的结合位点。例如，如图4A的示意图所示，当第二结构域是VL时，第四结构域优选的是能够与第二结构域形成Fv的VH。更优选地，第二结构域和第四结构域连接在一起，形成针对靶物质的结合位点。此外，如图4B的示意图所示，可以通过将第一、第二和第四结构域连接在一起形成多肽链。

特别是如果蛋白质通过第一结构域表面的至少一部分与金基板结合，而同时通过第二和第四结构域与靶物质结合，并且当第一结构域与该基板结合时发生不可逆的结构改变，则通过设置接头有可能使得对第二和第四结构域的结合能力的影响最小化。

而且，本发明的金结合蛋白可以如图5的示意图所示构建。即，它是由第一结构域和第二结构域组成的多肽链以及第一结构域和第四结构域组成的多肽链构建的复合物。在此情况中，该复合物通过由第二结构域和第四结构域组成的Fv或Fv样复合物与靶物质结合，使第一结构域作为锚，用于上述两条多肽链与金结合。

此外，本发明的金结合蛋白可以包括第三和第四结构域作为组成材料。如图6的示意图所示，第三和第四结构域可以是分别独立的多肽链。或者，如图7的示意图所示，它可以是通过在多肽链间连接而获得的多肽链。当金结合蛋白作为连接的多肽链提供时，第三结构域和第四结构域可以直接连接在一起，或者可以如图7所示通过由一个或多个氨基酸组成的接头连接。接头的长度可以限定为，如上所述，由氨基酸组成的接头具有优选1至10个氨基酸，更优选1至5个氨基酸的氨基酸长度。

此外，如图8的示意图所示，第一至第四结构域可以在一条多肽链中连接在一起。在这种情况中，这些结构域的排列使得第一结构域和第三结构域能够形成复合物，然后该复合物能够与金结合，同时第二结构域和第四结构域能够形成复合物，然后该复合物能够与金和金以外的其他物质结合。因此，接头优选地设置在结构域之间。例如，1至5个氨基酸位于第一和第二结构域之间或第三和第四结构域之间。另外，15至25个氨基酸位于氨基酸的第二和第四结构域之间。在类似的结构中，第一和第二结构域以及第三和第四结构域中的每一个或两个可以相互取代。

根据需要的金结合蛋白的性质，如对金或靶标的亲和力和长期稳定性，可以适当地选择并且限定一条多肽链中每个结构域的序列。

第一结构域是，例如，含有选自SEQ ID No：1至SEQ ID No：57的至少一个氨基酸序列的结构域。在这些氨基酸序列的每一个中，只要该氨基酸保持其金亲和力，即使该氨基酸序列具有一个或几个氨基酸的缺失、取代或添加，也没有问题。此外，只要它显示金亲和力，即使该氨基酸序列为氨基酸序列的一个构成部分，或者为其复合物，它也可以没有任何问题地用作本发明的金结合蛋白。具有SEQ ID No：1至SEQ ID No：57的本发明VH的具体例子在SEQ ID No：58至SEQ ID No：74中表示。另外，本发明的VL的具体例子在SEQ IDNo：75至SEQ ID No：77中表示。

优选地，第三结构域含有选自SEQ ID No：1至SEQ ID No：57的一个或多个氨基酸。此外，第三结构域更优选地通过根据第一结构域从SEQ ID No：58至SEQ ID No：77中适当地选择而限定。

本发明还包括编码上述金结合复合蛋白的核酸。另外，本发明还包括由核酸组成的构建体，作为载体用于转化宿主细胞(例如来自大肠杆菌、酵母、小鼠、人等的公知的蛋白质表达细胞)。编码能够构成本发明金结合蛋白的第一和第三结构域的示例性核酸序列在SEQ ID No：98至SEQ ID No：116中表示。

能够由上述一种表达载体表达的本发明金结合蛋白的每个结构域可以通过从1至4中选择而设计。当一种表达载体由本发明的金结合蛋白的多个结构域编码时，每个结构域可以表达为独立的多肽链。另外，可以获得表达为一条多肽链的载体结构，其中结构域直接或者通过氨基酸结合。此外，可以根据所选择的宿主细胞，通过向表达所需结构中引入转基因，如已知的启动子，设计和构建用于本发明金结合蛋白的表达载体的结构。可以根据所选择的宿主细胞，参照已知启动子等的结构来构建载体的结构。而且，当使用大肠杆菌等作为宿主细胞时，本发明的金结合蛋白是外来基因产物，被快速清除到细胞质外，从而减少了蛋白酶的分解。此外，当基因产物可能对细菌细胞有毒时，通过分泌到细胞体外有可能减弱其作用。通常，大多数穿过已知细胞膜或内膜分泌的蛋白质在其N末端上具有肽酶的信号肽。在分泌步骤中，信号肽酶切割该蛋白质，使其成为成熟蛋白质。许多信号肽在其N末端具有碱性氨基酸、疏水性氨基酸和信号肽酶的酶切位点。

通过将编码以单肽pelB为代表的公知信号肽的核酸排列在编码本发明金结合复合蛋白的核酸的5’末端上，可以表达并分泌该肽链。另外，构成本发明的金结合复合蛋白的每个结构域或由两个或多个结构域构成的多肽链可以独立地插入一个载体中。在这种情况下，将编码pelB的核酸排列在编码每个结构域或多肽链的核酸的5’末端上，以促进分泌。为了将该多肽链表达为由一个或多个结构域组成的多肽链，同样，通过将编码pelB的核酸排列在该多肽链的5’末端上可以促进这种多肽链的分泌。这样，在其N末端融合有信号肽的本发明的金结合蛋白，或者作为其组分的结构域，可以从周质部分和培养物的上清液中纯化。另外，鉴于在纯化表达的蛋白质时易于进行，可以通过基因工程方法将纯化标签排列在每个独立结构域上或通过组合两个或多个结构域形成的多肽链的N或C末端上。该纯化标签可以是由连续排列的6个组氨酸残基组成的组氨酸标签(在下文中称为His x 6)、谷胱甘肽-S-转移酶的谷胱甘肽结合位点，等等。作为引入该标签的方法，例如，这样一种方法，其中将编码纯化标签的核酸插入表达载体中编码金结合蛋白的核酸的5’或3’末端，或者利用商业上可获得的载体引入纯化标签的方法。

下文将描述利用上述表达载体产生本发明的金结合复合蛋白的方法。

本发明的金结合复合蛋白或作为其组分提供的多肽链如下合成：将根据宿主细胞设计的用于表达金结合复合蛋白的载体转化到用于表达常规已知蛋白质的宿主细胞中；利用该宿主细胞中的蛋白质合成系统在该宿主细胞中产生需要的蛋白质。之后，从细胞内部或细胞培养上清液中纯化积累或分泌到宿主细胞内部或外部的目标蛋白质。

例如，在使用大肠杆菌作为宿主细胞的情况下，将编码以pelB为代表的常规已知信号肽的核酸排列在编码本发明金结合复合蛋白的核酸的5’末端，从而有利于分泌型表达。为了利用一种表达载体表达两个或多个多肽链以获得组成本发明的金结合复合蛋白的每个结构域，将编码pelB的核酸排列在编码每个多肽链的核酸的5’末端，以利于向细胞质外的分泌。这样，可以从周质部分和培养上清液中纯化本发明的金结合蛋白，其中单一肽在其N末端融合。作为一种纯化方法，当纯化标签是His标签，并且当柱是镍螯合柱或GST时，可以利用谷胱甘肽固定柱进行纯化。

另外，在细菌细胞中表达的本发明的金结合复合蛋白可以以不溶性颗粒的形式获得。在此情况下，从培养基中获得的细菌细胞可以用弗氏压碎器或超声波破碎，然后从细胞匀浆溶液中离心不溶性颗粒。将获得的不溶性颗粒部分溶解在含有公知变性剂包括尿素和盐酸胍的缓冲液中，然后在如上所述的变性条件下过柱纯化。获得的柱洗脱级分可以进行重折叠，以除去变性剂，并重新构建活性结构。使用的重折叠方法可以从本领域公知的任何方法中适当地选择。特别是，根据目标蛋白质，可以使用系列稀释法、稀释法等。

本发明的金结合蛋白的每个结构域或每个多肽链可以在同一宿主细胞中表达，然后复合，或者用其他宿主细胞表达，并使其共存，从而形成复合物。

此外，使用编码本发明的金结合蛋白的载体，可以从细胞提取物中体外表达蛋白质。在此适当使用的细胞提取物包括大肠杆菌、麦胚和兔网织红细胞。但是，在上述无细胞提取物中的蛋白质合成一般在还原条件下进行。因此，更优选的是进行任何一种处理，以在抗体片段中形成二硫键。

在存在0.1％Tween 20的缓冲液条件下，本发明的金结合复合蛋白具有10^-6M或更低，更优选10^-8M或更低的解离常数(K_D)。在上述条件下，本发明人已经研究并证实被认为显示与金具有较高吸附的蛋白质材料均不能吸附到金上。当Kd值为10^-6M或更低时，它与具有非特异性吸附性的蛋白质的吸附行为完全能够区别开。此外，10^-8M或更低允许完全能够作为用于固定的锚分子。

作为获得具有与含金靶物质结合能力的本发明抗体重链可变区(VH)或抗体轻链可变区(VL)的一种方法，有这样一种方法，包括：制备上述VH或VL的基因文库；将其广泛地表达为蛋白质；在蛋白质与基因之间建立对应关系，以根据对金或靶物质的亲和力选择一个。上述基因文库可以从脐带血、扁桃体、骨髓、外周血细胞、脾细胞等获得。例如，从人外周血细胞中提取mRNA以制备cDNA。然后，利用人VH-或VL-编码序列作为探针，制备人VH或VL的cDNA文库。例如，能够广泛扩增每一家族的人VH家族(VH1-7)的引物和能够扩增人VL的引物在本领域中公知。将每个VH或CL、引物组合在一起进行RT-PCR，以获得VH-或VL-编码基因。或者，可以使用噬菌体展示方法。噬菌体展示方法包括：将用于编码VH、VL或含有VH或VL的复合物(例如Fab、scFv)的基因文库与编码噬菌体外壳蛋白的基因相组合；制备噬菌粒文库；将该噬菌粒文库转化入大肠杆菌；表达为含有不同VH或VL作为外壳蛋白的部分的噬菌体。使用这些噬菌体，以及上述描述，能够根据对金或靶物质的亲和力进行选择。在噬菌体中表达为融合蛋白的编码VH或VL的基因在该噬菌体的噬菌粒中编码。因此，它可以通过DNA序列分析详细说明。

此外，从用金或靶物质免疫的动物中采集产生目标抗体的细胞，然后可以使用如上所述相同的引物测定VH或VL的碱基序列或氨基酸序列。

此外，可以根据已知抗体或其片段中可变区的氨基酸序列针对靶物质设计本发明的第三和第四结构域。另外，当没有获得针对靶物质的抗体或其片段时，通过在获得其抗体后分析氨基酸序列如上所述进行设计是可能的。第三结构域和第四结构域可以是构成本发明的金结合蛋白的那些结构域。这样，用如此获得的VH或VL碱基序列制备本发明的金结合复合蛋白。

·含金的结合物

作为用于通过免疫、淘选等选择金结合蛋白的结合物，可以使用前面在金结合蛋白情况中举例说明的那些。

·基板

本发明的金结合复合蛋白可以与基板组合，以提供能够在多种用途中使用的结构。能够用于这些用途的基板是前面对于金结合蛋白举例说明的那些。

·靶物质

本发明的金结合复合蛋白由具有金亲和力的结构域和具有靶物质亲和力的结构域构成，因此利用蛋白质作为复合蛋白检测靶物质是可能的。作为检测对象提供的靶物质可以是在使用抗原/抗体反应的相应程序中作为抗原提供的任何分子。例如，靶物质可以大致分类为非生物物质和生物物质。

具有高工业应用价值的非生物材料的例子包括PCB和二噁英，它们是具有不同氯取代数目和位置的环境污染物，和破坏内分泌的物质，即所谓的环境激素(例如六氯苯、五氯酚、2，4，5-三氯乙酸、2，4-二氯苯氧代乙酸、氨基连三唑、阿特拉津、甲草胺、六氯环己烷、对硫磷、氯丹、氧氯丹(oxychlordane)、九氯(nanochlor)、1，2-二溴-3-氯丙烷、DDT、开乐散、艾氏剂、异狄氏剂、狄氏剂、硫丹(benzoepin)、七氯、七氯环氧化物、马拉硫磷、灭多虫、甲氧氯、灭蚁灵、除草醚、毒杀芬、氟乐灵、烷基酚(碳原子数为5-9)、壬基苯酚、辛基壬基苯酚(octynonylphenol)、4-辛基苯酚、双酚A、二-2-乙基己基邻苯二甲酸酯、丁基苯基邻苯二甲酸酯、邻苯二甲酸二正丁基酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二乙酯、苯并芘、2，4-二氯苯酚、二-2-乙基己基已二酸酯、二苯甲酮、4-硝基甲苯、八氯苯乙烯、涕灭威、苯菌灵、开蓬(十氯酮)、manzeb(代森锰锌)、代森锰、代森联、赛克津、氯氰菊酯、顺式氰戊菊酯(esfenvalerate)、氰戊菊酯、扑灭司林、乙烯菌核利(vinclozolin)、代森锌、福美锌、邻苯二甲酸二戊酯、邻苯二甲酸二己酯和邻苯二甲酸二丙酯)。

生物材料包括选自核酸、蛋白质、糖链、脂质和其复合物的生物材料，更特别地包括选自核酸、蛋白质、糖链和脂质的生物材料。特别地，本发明可以应用含有选自下组任一物质的任何材料：DNA、RNA、适配子(aptamer)、基因、染色体、细胞膜、病毒、抗原、抗体、凝集素、半抗原、激素、受体、酶、肽、神经鞘糖脂和鞘脂。另外，产生上述“生物物质”的细菌或细胞本身也可以是作为本发明中目标“生物物质”的靶物质。

蛋白质的具体例子包括所谓的疾病标志。其例子包括：α-胎蛋白(AFP)，作为肝细胞癌(原发性肝癌)、肝母细胞瘤、转移性肝癌和卵黄囊瘤的标志，它是胎儿期肝细胞产生的并且存在于胎儿血中的酸性糖蛋白；PIVKA-II，它是在肝实质疾病过程中出现的异常凝血酶原，并且发现在肝细胞癌中特异性出现；BCA225，为原发性晚期乳腺癌和再发及转移性乳腺癌的标志，它是对于乳腺癌免疫组化特异的抗原糖蛋白；碱性胎儿蛋白(BFP)，为卵巢癌、睾丸肿瘤、前列腺癌、胰腺癌、胆管癌、肝细胞癌、肾癌、肺癌、胃癌、膀胱癌和结肠癌的标志，它是在人胎儿血清、肠和脑细胞提取物中发现的碱性胎儿蛋白；CA15-3，为进行性乳腺癌、再发性乳腺癌、原发性乳腺癌和卵巢癌的标志，它是一种糖链抗原；CA19-9，为胰腺癌、胆管癌、胃癌、肝癌、结肠癌和卵巢癌的标志，它是一种糖链抗原；CA72-4，为卵巢癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌和胰腺癌的标志，它是一种糖链抗原；CA125，为卵巢癌(特别是浆液性囊腺癌)、子宫体腺癌、输卵管癌、子宫颈腺癌、胰腺癌、肺癌和结肠癌的标志，它是一种糖链抗原；CA130，为上皮卵巢癌、输卵管癌、肺癌、肝细胞癌和胰腺癌的标志，它是一种糖蛋白；CA602，为卵巢癌(特别是浆液性囊腺癌)、子宫体腺癌和子宫颈腺癌的标志，它是一种核心蛋白抗原；CA54/61(CA546)，为卵巢癌(特别是粘浆液性囊腺癌)、子宫体腺癌和子宫颈腺癌的标志，它是一种母细胞核糖链相关抗原；目前最广泛地用于辅助癌症诊断的癌胚抗原(CEA)，目前作为肿瘤相关标志抗原最广泛地用于辅助诊断癌症，如结肠癌、胃癌、直肠癌、胆管癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、子宫癌和泌尿系统癌；DUPAN-2，为胰腺癌、胆管癌、肝细胞癌、胃癌、卵巢癌和结肠癌的标志，它是一种糖链抗原；弹性蛋白酶1，为胰腺癌、胰池(pancreaticcisterna)和胆管癌的标志，它是存在于胰脏中的外分泌胰蛋白水解酶，它特异性水解结缔组织的弹性纤维弹性蛋白(构成动脉壁、肌腱等)；免疫抑制酸性蛋白(IAP)，为肺癌、白血病、食管癌、胰腺癌、卵巢癌、肾癌、胆管瘤、胃癌、膀胱癌、结肠癌、甲状腺癌和恶性淋巴瘤的标志，它是以高浓度存在于人类癌症患者腹脾水或血清中的糖蛋白；NCC-ST-439，为胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、结肠癌、肝细胞癌、肺腺癌、和胃癌的标志，它是一种糖链抗原；γ-精浆蛋白(γ-Sm)，为前列腺癌的标志，它是一种糖蛋白；前列腺特异性抗原(PSA)，它是从人类前列腺组织中提取的一种糖蛋白质，并且仅存在于前列腺组织中，因此是前列腺癌的标志；前列腺酸性磷酸酶(PAP)，用作前列腺癌的肿瘤标志，它是在酸性pH下水解由前列腺分泌的磷酸盐的酶；神经元特异性烯醇酶(NSE)，为肺癌(特别是肺小细胞癌)、神经母细胞瘤、神经系统肿瘤、胰岛癌、咽喉小细胞癌、胃癌、肾癌和乳腺癌的标志，它是在神经组织和神经内分泌细胞中特异性存在的糖酵解酶；鳞状细胞癌相关抗原(SCC抗原)，为子宫癌(子宫颈鳞癌)、肺癌、食管癌、头颈癌和皮肤癌的标志，它是从子宫颈鳞癌的肝转移灶中提取并纯化的蛋白质；唾液酰Le^X-i抗原(SLX)，为肺腺癌、食管癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、卵巢癌和子宫癌的标志，它是一种糖链抗原；SPan-1，为胰腺癌、胆管癌、肝癌、胃癌和结肠癌的标志，它是一种糖链抗原；组织多肽链抗原(TPA)，为食管癌、胃癌、结肠直肠癌、乳腺癌、肝细胞癌、胆管癌、胰腺癌、肺癌和子宫癌的标志，它是单链多肽链，与其他肿瘤标志结合尤其可用于估计进行性癌症和再发的预测/治疗进程观察；唾液酰Tn抗原(STN)，为卵巢癌、转移性卵巢癌、胃癌、结肠癌、胆道系统癌、胰腺癌和肺癌的标志，它是一种母细胞核碳水化合物抗原；细胞角蛋白(CYFRA)，为一种有效的肿瘤标志，用于检测肺非小细胞癌，特别是肺鳞状细胞癌；胃蛋白酶原(PG)，为胃溃疡(特别是低位胃溃疡)、十二指肠溃疡(特别是再发的和难治性病例)、布伦纳腺瘤(Brunner′s gland oma)、Dzo ringer Ellison综合征和急性胃炎的标志，它是作为蛋白水解酶分泌到胃液中的两种胃蛋白酶(PG I，PG II)的无活性前体，作为分泌到胃液中的蛋白水解酶；C-反应蛋白(CRP)，它是组织损伤和感染引起的在血浆中改变的急性期反应物，当由于急性心肌梗塞等在心肌中发生坏死时显示高水平；血清淀粉样蛋白A蛋白(SAA)，它是组织损伤和感染引起的在血浆中改变的急性期反应物；肌红蛋白，为急性心肌梗塞、肌营养不良、多肌炎攻和皮肌炎的标志，它是分子量约为17,500的血红素蛋白，主要存在于心肌和骨骼肌中；肌酸激酶(CK)(3种同工酶，来源于骨骼肌的CK-MM型，来源于脑和平滑肌的CK-BB型，和来源于心肌的CK-MB型，和线粒体同工酶或免疫球蛋白结合型CK(macroCK))，为急性心肌梗塞、甲状腺机能减退、进行性肌营养不良和多肌炎的标志，它是主要存在于骨骼肌或心肌的可溶性部分中的一种酶，由于细胞损伤而迁移到血液中；肌钙蛋白T，为横纹肌溶解、心肌炎、心肌梗塞和肾衰竭的标志，它是分子量为39,000的蛋白质，与横纹肌细肌丝上的肌钙蛋白I和C形成肌钙蛋白复合物，并且参与肌肉收缩的调节；心室肌肌球蛋白轻链I，为急性心肌梗塞、肌营养不良和肾衰竭的标志，它是在骨骼肌和心肌中均含有的蛋白质，其测量值的升高意味着骨骼肌和心肌的疾病或坏死；或者作为应激标记最近受到越来越多关注的嗜铬粒蛋白A、硫氧还蛋白和8-0hdG。

用于检测靶物质的试剂盒

本发明的金结合复合蛋白可以用于组成检测靶物质的试剂盒。例如，用于检测靶物质的试剂盒可以这样构成，其包括：在第二结构域和任选使用的第四结构域中利用特异性结合靶物质的抗体及其变体的金结合复合蛋白，具有含金表面的基板；和用于检测通过金结合复合蛋白固定在基板上的靶物质的检测工具。通过金结合复合蛋白固定在金基板上的靶物质可以用上述表面等离振子共振装置检测。可以使用这样一种方法，其中使用在其一部分中含有金的基板作为标记剂来检测靶物质。上述金结合复合蛋白可以用作介导这种金基板、标记剂和靶物质的物质。使用识别和结合靶物质的抗体片段形成的金结合复合蛋白能够在本发明中使用。

实施例

下面将要详细描述作为本发明一个实例的能够与金结合的蛋白质的获得和评价。但是，本发明不限于“实施例”中所述的内容。

实施例1(抗体重链可变区VH文库的制备)

使用来源于成人外周血B淋巴细胞的Fab文库作为模板，利用下列引物，按照PCR推荐方法(TAKARA BIO INC，LA试剂盒)，将VH编码基因进行DNA复制。引物如下。

·反向引物

(SEQ ID No：78)

5′-TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG-3′

(SEQ ID No：79)

5′-TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGRTYCAGCTGGTGCAGTCTGG-3′

(SEQ ID No：80)

5′-TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGSTRCAGCTGCAGSAGTCRGG-3′

(SEQ ID No：81)

5′-TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCSARGTGCAGKTGGTGGAGTCTGG-3′

(SEQ ID No：82)

5′-TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGG-3′

(SEQ ID No：83)

5′-TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTACAGSAGTGGGG-3′

·正向引物

(SEQ ID No：84)

5′-ATTCTCGACTGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC-3′

(SEQ ID No：85)

5′-ATTCTCGACTGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC-3′

(SEQ ID No：86)

5′-ATTCTCGACTGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC-3′

(SEQ ID No：87)

5′-ATTCTCGACTGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC-3′

(1)用Fab文库作为模板，用引物通过PCR扩增VH编码基因。PCR条件：95℃×10min(94℃×1min，60℃×2min，72℃×2min)×35个循环，72℃×6min。

(2)制备如图11所示通过改进pLUCK(Biochem Biophys ResCommun.218，pp682，1996)的多克隆位点而获得的质粒pRA-XX作为蛋白质表达载体。(在HindIII后排列有编码pelB的核苷酸序列作为信号肽。然后在NcoI和EcoRI之间以NheI/SacII/SpeI的顺序排列限制性内切酶位点。编码His×6的核苷酸序列设置于SacII/SpeI之间。另外，氨苄青霉素抗性基因、T7启动子、lac操纵子和T7终止序列与pluck相同)。

(3)按照推荐方法用限制性内切酶在NcoI/NheI(均获自NewEngland Biolabs)之间切割PCR产物和质粒。

用限制性内切酶切割的质粒的溶液过自旋柱400HR(AmashamScience)。

(4)用限制性内切酶切割的PCR片段的溶液利用商业上可获得的凝胶纯化试剂盒(SV Gel and PCR Clean-up系统：Promega)纯化。

(5)应用商业上可获得的T4连接酶试剂盒(Roche)按照供应商推荐的方法将上述两条片段混合，然后连接。结果获得如图12A所示的VH编码基因插入载体。

(6)用该连接产物通过电穿孔转化大肠杆菌DS12S株。大规模制备质粒。

(7)系列稀释这些质粒溶液，每份溶液都通过电穿孔转化大肠杆菌BL21(DE3)。向溶液中加入700μL LB培养基，整体在37℃下振荡培养1小时。培养溶液以6,000rpm离心5分钟，然后弃去650μL上清液。

(8)将剩余的上清液和沉淀部分悬浮，将该悬浮液接种于LB/Amp平板上。然后整个置于37℃过夜。结果最终获得含有约5×10⁵个克隆的抗体VH文库。

(9)然后，从三个10³倍稀释平板上任意选择1,000个菌落，根据以下步骤制备蛋白质粗提物。每个菌落在3mL LB/amp液体培养基中传代培养，整体在28℃下振荡培养6小时。然后，加入IPTG至终浓度为1mM，整体再振荡培养12小时。

(10)接着，通过离心(10,500rpm×5min)获得培养物部分和上清液细菌部分。

(11)将得到的细菌部分加至在冰中冷却的200μL渗透溶液(0.5M蔗糖，1M Tris-HCl(pH 8.0)，0.5mM EDTA)中并悬浮，整体置于冰中10分钟。然后加入1mL冷却的无菌水，整体置于冰中1小时。将产物离心(6,000rpm×30min)后，将上清液置于透析袋(MWCO 10,000)中，使用Tris+0.1％Tween 20溶液(20mM Tris，500mM NaCl)作为外部溶液透析18小时，每6小时更换一次外部溶液。

用上述步骤中获得的透析内部溶液作为模板用于筛选金结合抗体重链可变区(VH)。

实施例2(金结合抗体重链可变区(VH)的筛选)

制备沉积有金(厚度为100nm)的96孔滴定板作为筛选金结合抗体重链可变区(VH)的基板。将250μL实施例1中获得的1,000份样品溶液分配到各孔中，该滴定板轻轻振荡1小时。弃去上清液后，倒置该滴定板并在纸巾上轻拍10次除去水。进行洗涤步骤，包括：向每孔加入200μL Tris+0.1％Tween 20；轻轻振荡滴定板10分钟。该操作重复3次。将200μL通过用Tris+0.1％Tween 20溶液以1∶10,000稀释HRP结合的抗-His抗体(Invitrogen)而制备的抗体溶液分配到各孔中，轻轻振荡滴定板1小时。然后进行与洗涤步骤相同的操作。将各100μL HRP底物和作为显色剂的检测试剂1和2(Amasham Science)分配到各孔中，轻轻振荡滴定板1小时。检测鲁米诺化学发光水平。

如上所述观察到化学发光的15个样品菌落在1.5mL LB/amp.中传代培养，整体在37℃下振荡培养过夜。利用SV MiniPrep DNA纯化系统(Promega)从得到的细菌中纯化质粒。如上所述获得的17个展示VH的噬菌粒的DNA序列按照下列方法测定。测序引物设置于表达载体的VH编码基因上游的pelB序列部分。测序引物如下。

pelB-back

(SEQ ID No：88)5′-ccgct ggatt gttat tactc gc-3′

用上述引物和测序反应试剂盒和供应商推荐的反应溶液组合物进行BigDye-PCR反应。温度循环为96℃×3min→(94℃×1min→50℃×1min→68℃×4min)×30个循环。然后，利用测序仪(377，ABI制造)测定通过乙醇沉淀纯化的PCR产物的碱基序列。结果获得SEQ ID No.：58至74的每个序列。

实施例3(抗体轻链可变区VL文库的制备)

按照与实施例1中相同的方法，由人外周血细胞Fab文库制备VL基因文库。引物如下。

·反向引物

(SEQ ID No：89)

5′-TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGMCATYCAGWTGACCCAGTCTCC-3′

(SEQ ID No：90)

5′-TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGATRTTGTGATGACYCAGWCTCC-3′

(SEQ ID No：91)

5′-TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAATTGTGWTGACGCAGTCTCC-3′

(SEQ ID No：92)

5′-TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGACATCGWGHTGACCCAGTCTCC-3′

·正向引物

(SEQ ID No：93)

5′-TTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATTTCCACCTT GGTCCC-3′

(SEQ ID No：94)

5′-TTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC-3′

(SEQ ID No：95)

5′-TTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATATCCACTTT GGTCCC-3′

(SEQ ID No：96)

5′-TTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCACCTT GGTCCC-3′

(SEQ ID No：97)

5′-TTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTAATCTCCAGTCG TGTCCC-3′

另外，类似地制备将要使用的质粒，不同之处在于在如实施例1的(2)中制备用于蛋白质表达的质粒时将NcoI/SacII之间的NheI改变为NotI。另外，用实施例1步骤(11)结束时获得的VL蛋白透析内部溶液作为模板用于筛选金结合抗体轻链可变区(VL)。

实施例4(金结合抗体轻链可变区(VL)的筛选)

金结合的VL的筛选以与实施例2相同的方法进行，不同之处在于用实施例3中获得的样品作为筛选样品。结果，获得SEQ ID No.：75至77的每个序列。

在下文中，从实施例1的人外周血细胞Fab基因文库中制备噬菌粒，并筛选金结合的VL或VH。

实施例5(展示VL的亲金噬菌体组的筛选)

按照下列方法制备展示VL的噬菌体文库，并且选择能够与金结合的噬菌体组。

(1)用于VL展示的噬菌粒

利用来源于成人外周血B淋巴细胞的Fab文库作为模板，利用SEQ ID No.89至97的引物复制VL编码基因。此外，用作M13噬菌体外壳蛋白的PIII蛋白的N末端的部分缺失，并且使用以使得VL蛋白融合并表达的方式制备的展示VL的噬菌粒文库(图12B)(Biochem Biophys Res Commun.1996，218，pp 682)。

(2)展示VL片段的噬菌体文库的制备

1)转化

通过电穿孔(外加电压：1.5KV，电阻：186Ω，电容：50μF)用1μL VL编码基因文库(350ng/μL)转化40μL大肠杆菌DH12S。然后按照下列程序制备展示VL的噬菌体文库。

2)培养

(i)转化后将800μL LB培养基加至DH12S溶液中，整体在37℃下振荡培养1小时(140rpm)。

(ii)将20mL培养溶液加至LB培养基+终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素(LB/amp.)中，整体在37℃下培养3-4小时。

(iii)加入40μL M13K07作为辅助噬菌体，整体在100rpm振荡下再培养1小时。

(iv)加入50mg/mL卡那霉素溶液，至终浓度为50μg/mL，整体在37℃下振荡培养(100rpm)。

3)展示VL的噬菌体文库的收集

(i)将5mL 20％PEG/500mM NaCl加入培养溶液中，整体置于冰中1小时或数小时。

(ii)通过离心(6,500rpm×35min)小心除去上清液。

(iii)将沉淀物悬浮在500μL PBS缓冲液中，制备展示VL的噬菌体溶液。

4)展示VL的噬菌体文库的滴度评价

(i)将10μL JM109甘油贮存液加至LB中，整体在37℃下振荡培养。

(ii)用LB培养基系列稀释3)中制备的展示VL的噬菌体溶液。

(iii)将10μL系列稀释的(×10^-6至10^-10)溶液加到750μL(a)OD₆₀₀约为0.5的培养溶液中，整体在37℃下振荡培养1小时。

(iv)离心(6,000rpm×5min)除去700μL培养上清液。

(v)通过移液稀释剩余的培养上清液和沉淀物。然后将该悬浮液接种于LB/amp.平板上，整体置于37℃下过夜。

(vi)计数具有100个或更少菌落的稀释浓度平板上出现的菌落数，将其定义为展示VL的噬菌体文库的滴度值。

得到的展示VL的噬菌体文库溶液：5×10⁹cfu/μL

(3)使用金细粒的VL淘选

用如上所述制备的噬菌体文库溶液和金细粒(1.5μmФ：Sigma-Aldrich制造)重复根据下列方法的淘选操作5轮，用于选择展示金结合VL的噬菌体组。

1)结合实验

(i)将10μL金细粒溶液(50mg/PBS 1ml)和PBS+0.1％Tween20(PBST)加至无菌Eppendorf管(1.5mL)中的噬菌体溶液(体积为使该溶液中的噬菌体总数为1,010cfu)，使得总体积为1,000μL，获得的产物作为结合反应溶液。

(ii)该结合反应溶液在室温下保持30分钟，同时轻轻旋转。

(iii)离心(10,000rpm×5min)(ii)中获得的产物，小心弃去培养上清液。

2)洗涤(非特异性吸附物的洗涤)

(i)将500μL PBST加入Eppendorf管中的金细粒中，整体在室温下保持10分钟，同时轻轻旋转。

(ii)进行离心(10,000rpm×5min)，小心除去洗涤上清液。

(iii)上述(i)和(ii)均重复10次。

3)酸洗脱和酸洗脱级分的滴度评价

吸附到2)中获得的金细粒上的噬菌体的滴度按照下列程序评价。

3)-1酸洗脱

(i)将115μL 0.2M Gly-HCl(pH 2.2)加入洗涤后的金细粒中，整体在垂直旋转的同时保持1分钟。

(ii)进行离心(10,000rpm×5min)，收集上清液作为酸洗脱级分。

(iii)加入15μL 1M Tris-HCl以中和收集的酸洗脱级分。

(iv)系列稀释中和后的1μL酸洗脱溶液，按照滴度评价方法测定滴度值。

(v)剩余的酸洗脱级分与金细粒级分快速混合，再次悬浮该混合物。

3)-2滴度评价

以与(2)-3)、4)相同的方法进行滴度评价，获得下列结果。

第1轮：9.8×10²cfu

第2轮：1.0×10³cfu

第3轮：7.8×10²cfu

第4轮：1.3×10³cfu

第5轮：1.1×10⁴cfu

4)再感染和噬菌体扩增

直到第4轮，用吸附到3)中获得的金细粒上的噬菌体组再感染大肠杆菌，以扩增噬菌体的数目，用于制备噬菌体溶液，以备随后的淘选。

(i)大肠杆菌JM109在20mL LB培养基中37℃(140rpm)振荡培养，用于再感染和噬菌体扩增。

(ii)将3)中获得的金细粒的悬浮液加至OD₆₀₀为0.3至0.5的(a)中的大肠杆菌培养溶液中，整体在37℃下振荡培养1小时(140rpm)。

(iii)加入氨苄青霉素至终浓度为100μg/mL，整体在37℃下振荡培养2小时。

(iv)加入40μL辅助噬菌体M13K07，整体在37℃下培养1小时，振荡速度降至100rpm。

(v)加入卡那霉素至终浓度为50μg/mL，整体在37℃下振荡培养过夜。

(vi)通过与(2)-3)、4)相同的操作收集培养上清液中的噬菌体，以制备噬菌体溶液。此外，评价该噬菌体溶液的滴度值，以证实噬菌体已经扩增。

扩增后获得的滴度值显示如下。

第1轮：2.4×10⁹cfu

第2轮：8.1×10⁸cfu

第3轮：1.8×10⁹cfu

第4轮：1.1×101⁰cfu

(4)噬菌体ELISA

1)用于ELISA的金沉积基板的制备

使用与实施例2相同的沉积有金(厚度为100nm)的96孔滴定板(BD，聚苯乙烯)作为噬菌体ELISA的基板。

2)展示VL的噬菌体单克隆的制备

按照下列程序，从在(3)-4)第5轮滴度评价中10⁴倍稀释平板上表达的11个菌落中收集噬菌粒。

(i)每一菌落用20mL LB/amp在37℃下培养。

(ii)加入40μL辅助噬菌体M13K07，整体在37℃下培养1小时，振荡速度降至100rpm。

(iii)加入卡那霉素至终浓度为50μg/mL，整体在37℃下振荡培养过夜。

(iv)通过与(2)-3)、4)相同的操作收集培养上清液中的噬菌体，以制备噬菌体溶液。此外，评价该噬菌体溶液的滴度值，以证实噬菌体已经扩增。

扩增后获得的滴度值显示如下。

No.1：3.8×10⁹cfu

No.2：9.0×10⁸cfu

No.3：2.4×10⁹cfu

No.4：1.0×10⁹cfu

No.5：9.7×10⁷cfu

No.6：4.4×10⁸cfu

No.7：6.2×10⁹cfu

No.8：8.9×10⁷cfu

No.9：1.4×10⁹cfu

No.10：1.1×10¹⁰cfu

No.11：4.9×10⁹cfu

3)噬菌体溶液的制备

用2)中获得的每种噬菌体溶液制备各200μL稀释系列，其中根据下列组成，滴度值从10⁹cfu以10倍连续降低。

展示VL的噬菌体溶液：x μL

Super封闭缓冲液(PIERCE)：20μL

0.5％Tween 20/PBS：x/5μL

PBS：180-(6x/5)μL

4)ELISA

(i)将各80μL系列稀释的展示VL的噬菌体溶液分配到金沉积的滴定板上，该滴定板在振荡器上轻轻振荡1小时。

(ii)除去噬菌体溶液，向每孔中分配90μL PBST，整体搅拌10分钟，然后除去洗涤上清液。该操作重复3次。

(iii)向各孔中分配75μl HRP-抗M13免疫球蛋白/SBB/PBS 溶液(1/1,000∶1∶10)，该滴定板在振荡器上轻轻振荡1小时。

(iv)弃去免疫球蛋白溶液的上清液。然后，以90μL/孔的体积分配PBST，整体搅拌10分钟。该洗涤操作重复3次。

(v)检测试剂1和2(Amasham BIOSCIENCE)分别以35μL/孔的体积分配，使整体反应，同时轻轻搅拌1分钟。

(vi)测量鲁米诺的发光强度。提供具有高发光强度的No.1、No.2和No.3作为金结合的展示VL的噬菌体克隆。

为了阐明金结合VL的碱基和氨基酸序列，从上述4个噬菌体克隆中分离噬菌粒。然后，制备表达载体来表达蛋白质，从而在表面等离振子共振(SPR)金基板上证实结合亲和力。

实施例6(亲金VL蛋白的获得)

(1)噬菌粒的收集

按照下列程序，从与实施例5之(3)-4)第5轮滴度评价中10⁴ 倍稀释平板上表达的No.7相对应的菌落中收集噬菌粒。

(i)每个菌落使用1.6mL LB/amp.在37℃下培养过夜。

(ii)使用MiniPrep SV plus DNA纯化系统(promega)按照供应商推荐的方法收集噬菌粒。

(2)表达载体的制备

根据下列结构构建表达上述3种VL蛋白的表达载体。实施例1的图11所示的pRA-XX和(1)中获得的噬菌粒分别使用NcoI和NotI通过限制性内切酶反应切割。将得到的VL片段插入pRA-XX中制备质粒pRA-VLNo，n(n：克隆编号)，该质粒将VL编码核酸表达为融合蛋白(图13)。

(3)蛋白质的表达和纯化

如上所述获得的用于表达VL蛋白的3种载体用来表达VL蛋白。

1)转化

用上述表达载体转化40μL BL21(DE3)感受态细胞。转化在这样的条件下进行：在冰中→42℃×90sec→冰中进行热休克。将750μL LB培养基加入通过热休克转化的BL21溶液中，整体在37℃ 下振荡培养1小时。之后，以6,000rpm离心5分钟，弃去650μL培养上清液。将剩余的培养上清液和作为沉淀物的细胞部分搅拌并且接种于LB/amp.平板上，整体置于37℃过夜。

2)预培养

随机选择平板上的菌落，在3.0mL LB/amp.培养基中28℃振荡培养过夜。

3)主培养

预培养液在750ML 2×YT培养基中传代培养，在28℃下继续培养。当OD₆₀₀大于0.8时，加入IPTG至终浓度为1mM，在28℃下进一步培养过夜。

4)纯化

(i)硫酸铵沉淀

将3)中获得的培养液以6,000rpm离心30min获得培养上清液。称量得到的培养上清液的重量。然后逐渐加入重量为培养上清液重量60％的硫酸铵。然后将产物在4℃下搅拌过夜。

(ii)脱盐

将(i)中获得的溶液以8,000rpm离心20min，弃去上清液。向得到的沉淀物加入并且浸没在15mL 20mM Tris/500mM NaCl(下文中称为Tris溶液)中4℃过夜进行溶解。然后将得到的溶液加至用于透析的纤维素管中(Sanko Junyaku Co.，Ltd.生产)，用Tris溶液作为外部溶液在4℃下透析进行脱盐(外部溶液每6小时更换一次)。

(iii)金属螯合柱

使用His-Bind(Novagen生产)作为金属螯合柱载体。柱的调整、加样和洗涤步骤都按照供应商推荐的方法在4℃下进行。作为目标的His标签融合的VL蛋白的洗脱用500mM咪唑/Tris溶液进行。

洗脱液的SDS-PAGE(丙烯酰胺15％)证实该洗脱液具有一条带，并且被纯化。用Tris溶液作为外部溶液再次透析该洗脱液，以除去该洗脱液中的咪唑。此外，通过将外部溶液更换为磷酸盐缓冲液(下文称为PBS)进行缓冲液的替换，以制备用于SPR的VL蛋白溶液。

实施例7(SPR测定)

实施例6获得的VL蛋白的金结合亲和力利用SPR测定。BIAcore2000(BIAcore制造)用作SPR测定装置。同一家公司的金沉积的玻璃基板SIA-kit Au用作与该蛋白质结合的金基板。

测定在下列条件下进行。

运行缓冲液：PBST

温度：25℃

流速：20μL/min

样品：VL蛋白/PBST

注射量：20μL

获得证实结合亲和力的结合曲线(图9)。

实施例8(VL蛋白的碱基和氨基酸序列的测定)

按照下列方法测定如上所述获得的VL No.7的DNA序列。

测序引物设置在VL编码基因上游的pelB序列部分。测序引物如下。

pelB-back

(SEQ ID No：88)

5′-ccgct ggatt gttat tactc gc-3′

以与实施例2相同的方法使用上述引物和测序反应试剂盒和供应商推荐的反应溶液组合物进行BigDye-PCR反应。温度循环为96℃×3min→(94℃×1min→50℃×1min→68℃×4min)×30个循环→4℃。然后利用测序仪(377，ABI制造)测定通过乙醇沉淀纯化的PCR产物的碱基序列。获得如下结果。No.7具有与实施例12的SEQ ID No：76相同的碱基序列。

实施例9(亲金VH-展示噬菌体组的筛选)

根据下列方法制备VH-展示噬菌体文库，以选择具有金结合亲和力的噬菌体组。

(1)用于展示VH的噬菌粒

以与实施例1相同的方法，使用来源于成人外周血B淋巴细胞的Fab文库作为模板，以与实施例1相同的方法使用SEQ ID No.80至89的引物。这样，VH编码基因被复制。而且，用作M13噬菌体外壳蛋白的PIII蛋白的N末端部分缺失，并且使用以使得VH蛋白融合并且表达的方式制备的展示VH的噬菌粒文库(图12A)。

(2)展示VH的噬菌体文库的制备

除了使用(1)中获得的产物以外，展示VH的噬菌体文库以与实施例5之(2)相同的方法制备。得到的展示VH的噬菌体文库溶液：1×10⁹cfu/μL。

(3)使用金细粒的VH淘选

除了使用以上(2)中制备的噬菌体文库溶液以外，用于选择展示金结合VH的噬菌体组的淘选以与实施例5之(3)相同的方法进行。

1)结合实验

下面进行了类似于实施例5之2)的洗涤和之3)的酸洗脱和滴度评价。

第1轮：9.8×10²cfu

第2轮：1.0×10³cfu

第3轮：7.8×10²cfu

4)再感染和噬菌体扩增

再感染和噬菌体扩增以与实施例5相同的方法进行。扩增后获得的滴度值如下所示。

第1轮：2.4×10⁹cfu

第2轮：8.1×10⁸cfu

(4)噬菌体ELISA

1)用于ELISA的金沉积基板的制备

使用与实施例5相同的基板作为用于噬菌体ELISA的基板。

2)展示VL的噬菌体单克隆的制备

按照与实施例1相同的方法从VH淘选操作第3轮滴度评价中10⁴ 倍稀释平板上表达的20个菌落中收集噬菌粒。得到的展示VH的噬菌体单克隆溶液的滴度值如下所示。

No.1：3.8×10⁹cfu

No.2：9.0×10⁸cfu

No.3：2.4×10⁹cfu

No.4：1.0×10⁹cfu

No.5：9.7×10⁷cfu

No.6：4.4×10⁸cfu

No.7：6.2×10⁹cfu

No.8：8.9×10⁷cfu

No.9：1.4×10⁹c fu

No.10：1.1×10¹⁰cfu

No.11：4.9×10⁹cfu

No.12：9.0×10⁸cfu

No.13：2.4×10⁹cfu

No.14：1.0×10⁹cfu

No.15：9.7×10⁷cfu

No.16：4.4×10⁸cfu

No.17：6.2×10⁹cfu

No.18：8.9×10⁷cfu

No.19：1.4×10⁹cfu

No.20：1.1×10¹⁰cfu

3)噬菌体溶液的制备

使用2)中获得的每种噬菌体溶液制备各200μL稀释系列，其中根据下列组成将滴度值从10⁹cfu以10倍连续降低。

展示VL的噬菌体溶液：x μL

可溶性VL溶液(50ng)：x μL

Super封闭缓冲液(PIERCE)：20μL

0.5％Tween 20/PBS：x/5μL

PBS：179-(6x/5)μL

4)噬菌体ELISA

噬菌体ELISA通过与实施例1相同的操作进行。提供发光强度均高于用于比较的VH文库溶液的3个克隆作为金结合的展示VH的噬菌体克隆(Nos.2、4和6)。

实施例10(亲金VH蛋白的获得)

从上述三个噬菌体克隆中分离噬菌粒，然后制备其表达载体以表达蛋白质，从而在表面等离振子共振(SPR)金基板上证实结合亲和力。此外，阐明了这些金结合VH的各自的碱基和氨基酸序列。

(1)噬菌粒的收集

根据如下程序从对应于第三轮滴度评价中在10⁴倍稀释平板上表达的15个克隆的菌落中收集噬菌粒。

(a)每个菌落在1.6mL LB/amp.中37℃培养过夜。

(b)利用MiniPreps SV plus DNA纯化系统(promega)，根据供应商推荐的方法收集噬菌粒。

(2)表达载体的制备

表达上述3种VL蛋白的表达载体根据下列结构构建。

通过改变PET-15b(Novagen)的多克隆位点制备pUT-XX。pUT-XX和以上(1)中获得的噬菌粒各自使用NcoI和NotI通过限制性内切酶反应切割。将得到的VH片段插入pUT-XX中制备质粒pRA-7sn(n：上述噬菌体克隆编号)，该质粒将VH编码核酸表达为融合蛋白(图14)。

(3)蛋白质的表达和纯化

通过进行上述程序(在各系统中在下面所述的蛋白质表达和纯化步骤中处理表达载体)获得3种VH(7s2、7s4和7s6)。

1)转化

用上述2种表达载体转化40μL不同的BL21(DE3)感受态细胞溶液。在如下条件下进行转化：在冰中→42℃×90sec→在冰中进行热休克。将750μL LB培养基加入通过热休克转化的BL21溶液中，整体在37℃下振荡培养1小时。之后以6,000rpm离心5min，弃去650μL培养上清液。将剩余的培养上清液和作为沉淀物的细胞部分搅拌并且接种到LB/amp.平板上，整体置于37℃过夜。

2)预培养

随机选择平板上的菌落，用3.0mL LB/amp.培养基28℃振荡培养过夜。

3)主培养

预培养液在750ML 2×YT培养基中传代培养，在28℃下继续培养。当OD₆₀₀大于0.8时，加入IPTG至终浓度为1mM，在28℃下培养过夜。

4)纯化

通过下列步骤从不溶性颗粒部分中纯化目标多肽链。

(i)不溶性颗粒的收集

以上3)中获得的培养液以6,000rpm离心30min，以获得沉淀物作为细菌部分。将产物悬浮于冰中的Tris溶液(20mM Tris/500mMNaCl)中。得到的悬浮液用弗氏压碎器匀浆，以获得匀浆溶液。然后，以12,000rpm离心匀浆溶液15min，除去上清液获得沉淀物作为不溶性颗粒部分。

(ii)不溶性颗粒部分的溶解

向(i)中获得的不溶性部分加入并且浸没在10mL 6M盐酸胍/Tris溶液中过夜。然后产物以12,000rpm离心10min以获得上清液作为溶解的溶液。

(iii)金属螯合柱

使用His-Bind(Novagen生产)作为金属螯合柱载体。柱的调整、加样和洗涤步骤都按照供应商推荐的方法在室温(20℃)下进行。作为目标的His标签融合的VL蛋白的洗脱用60mM咪唑/Tris溶液进行。洗脱液的SDS-PAGE(丙烯酰胺15％)证实该洗脱液具有一条带，并且被纯化。

(iv)透析

使用6M盐酸胍/Tris溶液作为外部溶液在4℃下透析上述洗脱液，以除去洗脱液中的咪唑，从而获得上述多肽链溶液。

(v)重折叠

按照与上述相同的方法，VHg-VLh和VHh-VLg的多肽链溶液分别按照下列用于除去盐酸胍的步骤透析(4℃)，以进行蛋白质的重折叠。

a)根据每种多肽链的摩尔吸收系数和ΔO.D.(280nm-320nm)水平，使用6M盐酸胍/Tris溶液制备浓度为7.5μM的样品(稀释后的体积为10ml)。然后加入β-巯基乙醇(还原剂)至终浓度为375μM(50-倍蛋白质浓缩)，用于在暗室中在室温下还原4小时。将样品溶液加入透析袋(MWCO：14,000)中，提供作为用于透析的样品。

b)将用于透析的样品浸没在作为外部溶液的6M盐酸胍/Tris溶液中，在轻轻搅拌下透析6小时。

c)以分步方式将外部溶液的盐酸胍溶液浓度减至3M，然后减至2M。样品在每一浓度的外部溶液中透析6小时。

d)向Tris溶液中加入终浓度为375μM的氧化型谷胱甘肽(GSSG)和终浓度为0.4M的L-Arg，然后加入以上3)中的2M透析外部溶液，使盐酸胍浓度为1M。样品在pH已经用NaOH调节为8.0(4℃)的外部溶液中在轻轻搅拌下透析12小时。

e)通过与d)相同的操作制备盐酸胍浓度为0.5M的L-Arg Tris溶液，并且再透析12小时。

f)最后，在Tris溶液中透析12小时。透析7)完成后，以10,000rpm离心约20分钟，以分离聚集物和上清液。

通过将外部溶液改变为磷酸缓冲液(下文中称为PBS)将如上所述获得的3种VH溶液进行缓冲液更换，以制备用于SPR的VH蛋白溶液。

实施例11(SPR测定)

实施例10中获得的VH蛋白的金结合亲和力以与实施例7相同的方法利用SPR测定。对于7s2、7s4和7s6获得证实结合亲和力的结合曲线。图10显示代表性实施例。通过曲线拟合获得下列K_D。

7s2：K_D＝5.0×10M^-8

7s4：K_D＝8.0×10M^-9

7s6：K_D＝3.0×10M^-7

实施例12(VH蛋白的碱基和氨基酸序列的测定)

如上所述获得的3个展示VH的噬菌粒各自的DNA序列通过与实施例2相同的方法测定。测序引物设置于位于VH编码基因上游的pelB序列部分。使用实施例2的测序引物，并且根据相同的程序进行透析，获得三种不同的序列。实施例10中获得的那些序列对应于SEQ ID No.：59至61。

实施例13(利用SPR对VH/VL复合物进行的金结合实验)

制备PBST溶液，其中含有各50nM实施例6中获得的VL克隆No.7和实施例10中获得的VH克隆：7s2，并且在4℃下保持一天。SPR测定按照与实施例7相同的方法用混合溶液进行。结果，在比实施例7或实施例11更低的浓度下证实有金结合亲和力。该结果提示克隆的混合形成复合物(Fv)，由于其稳定的结构而提高了结合亲和力(图3)。

实施例14(金结合scFv的获得)

按照如下程序制备由实施例6中获得的VL克隆：No.7和实施例10中获得的VH克隆：7s2组成的scFv。

(1)表达载体的制备

能够表达融合蛋白的表达载体，能够由VL(No.7)编码基因、接头(GGGGS)×3、VH(7s4)编码基因和His×6(下文称为His标签)连续翻译。

一种具体制备方法在图15中显示。

使用下列引物。

scFv-B(SEQ ID No：117)

5′-NNNNNCCATGGCCGGGGGCGGGGGCAGCGGGGGCGGGGGCAGCGGGGGCGGGGGCAGCCAGGTGCAGTTGGTGGAGTCT-3′

scFv-F(SEQ ID No：118)

5′-NNNNNCCGCGGA ACCATTCAG ATCCTCTTCT-3′

(2)蛋白质的表达和纯化

下面使用如上所述获得的用于表达scFv蛋白的载体表达和纯化scFv蛋白。

1)蛋白质表达

用上述表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，使用2xYT培养基在28℃下进行培养。在O.D.₆₀₀＝约0.8时用终浓度为1mM的IPTG诱导表达，产物振荡培养过夜。细菌体以6,000rpm离心20min获得培养上清液部分和细菌部分。这些样品根据公知的方法电穿孔，利用SDS-PAGE证实目标蛋白质的表达量。结果表明向培养上清液部分中的分泌极少。鉴于此，为了从细菌部分中纯化目标蛋白，按照下列程序制备样品。首先，将细菌体重悬浮于15mL PBS中，向该悬浮液中进一步添加25mL PBS，利用弗氏压碎器将该混合物匀浆。得到的匀浆溶液以12,000rpm离心15min获得作为不溶性颗粒的沉淀部分。将得到的不溶性颗粒浸入6M盐酸胍/Tris溶液中过夜，并且溶解，获得用于金属螯合柱的样品。

2)通过金属螯合柱纯化

用6M盐酸胍/5mM咪唑/Tris溶液作为运行缓冲液，以与实施例2相同的方法进行纯化，不同之处为：洗脱时的咪唑浓度设置为100mM；展开温度设置为室温(20℃)。

3)透析

将2)中获得的洗脱级分加到用于透析的纤维素管中(SankoJunyaku Co.，Ltd.制造)，使用6M盐酸胍/1mM EDTA/Tris溶液作为外部溶液在4℃下透析(每6小时更换一次外部溶液)。

4)蛋白质的重建

用Tris溶液将3)中获得的scFv溶液调节为7.5μM，提供作为模板。重建scFv结构，同时通过相对于上述溶液减少外部溶液中的盐酸甘氨酸浓度逐渐降低内部溶液中的盐酸胍浓度。

(a)使用6M盐酸胍/Tris溶液制备浓度为7.5μM的样品，其摩尔吸收系数和O.D.(280nm)根据目标蛋白质的氨基酸序列估计。

(b)然后加入β-巯基乙醇(还原剂)至终浓度为375μM，然后在暗室中在室温下还原4小时。

(c)将样品装入如上所述相同的透析袋中，整体置于外部溶液(6M盐酸胍/Tris溶液)中，4℃透析约6小时。

(d)之后每6小时更换外部溶液，共两次。更换时，在样品透析的同时，以分步方式将外部溶液的盐酸胍溶液浓度减至3M，然后减至2M。

(e)然后向Tris溶液中加入氧化型谷胱甘肽(GSSG)至终浓度为375μM以及L-Arg至终浓度为0.4M，然后添加以上(d)中的透析外部溶液(2M)至盐酸胍浓度为1M。样品在pH已经用NaOH调节为8.0(4℃)的外部溶液中透析约12小时。

(f)按照与(e)相同的操作制备0.5M盐酸胍/Tris溶液，并且在4℃下透析约12小时。

(g)最后，在4℃下透析约12小时，同时将外部溶液换为Tris溶液。

(h)透析完成后，产物以10,000rpm离心约20min，以分离聚集部分和上清液部分。该上清液部分进行SDS-PAGE电泳，以证实目标蛋白质在上清液部分中为可溶的。结果获得了具有VL No.7克隆和VH 7s2的scFv。

实施例15(利用SPR评价scFv的金结合亲和力)

实施例14中获得的scFv蛋白的金结合亲和力利用SPR按照与实施例8相同的方法测定。获得显示金结合亲和力的结合曲线(图17)。

实施例16(Au特异性的证实)

证实了实施例15中获得的scFv蛋白的金特异性。将金以大小为70μmφ(厚度为50nm)的环形模式沉积在大小为3mm×5mm的硅基板上作为确证基板。基板表面依次浸在异丙醇、丙酮和盐酸中，每种溶液10分钟，进行表面清洗(每次更换溶液时，表面用去离子水清洗并且干燥)。基板浸没在通过将实施例6中获得的scFv溶液调节至1μM而制备的溶液中1小时。然后，在PBST中轻轻搅拌10分钟清洗基板。该操作重复3次，然后弃去洗涤溶液。然后将基板浸没在100nM抗-His标签抗体/PBST溶液中，同时在该溶液中轻轻搅拌1小时。然后，在PBST中轻轻搅拌10分钟清洗基板。该操作重复3次，然后弃去洗涤溶液。此外，将基板浸没在100μM视紫红质结合的抗-IGg抗体/PBST溶液中，同时在该溶液中轻轻搅拌1小时。然后在PBST中轻轻搅拌10分钟清洗基板。该操作重复3次，然后弃去洗涤溶液。之后，用荧光显微镜观察该基板。结果，在沉积有金的环形部分观察到荧光，而在硅部分没有观察到荧光。因此，实施例15中获得的scFv的金特异性得到证实。

比较实施例1

金沉积的硅基板按照与实施例16相同的操作进行处理，不同之处在于该基板用1μM scFv处理。用荧光显微镜观察该基板，结果在硅部分和沉积有金的环形部分都没有观察到荧光。

实施例17(亲氧化硅肽融合的金结合蛋白的制备)

在上述实施例的scFv的C末端具有亲氧化硅肽IPHVHHKHPHV的蛋白质按照下列步骤制备。

(1)表达载体的制备

(a)以上述实施例(实施例14)中获得的pUT-scFv(VL#No，7×7s4)作为模板，利用下列引物进行PCR。

SiscFv-B(SEQ ID No：119)

5′-NNNNNCCATGGCCCAGGTGCAGTTGGTGGAGT-3′

SiscFv-F(SEQ ID No：120)

5′-NNNNNCCGCGGCACGTGGGGGTGCTTGTGGTGCACGTGCATGGGGATAACCATTCAGATCCTCTTCT-3′

利用商业上可获得的PCR试剂盒(TAKARA BIO INC，LA-标签试剂盒)按照供应商推荐的方案进行PCR。

(b)得到的PCR产物进行2％琼脂糖电泳。然后，应用凝胶提取试剂盒(Promega)通过粗纯化从凝胶中获得约400bp的PCR片段。序列证实该片段具有目标碱基序列。

(c)pUT-scFv(7s4)和以上(b)中获得的PCR片段用NotI/SacII酶切。然后进行琼脂糖电泳以纯化载体侧和插入侧的目标片段。

(d)将以上(c)中获得的纯化的核酸片段以载体∶插入片段＝1∶5的比例混合，然后以与实施例1相同的方法进行连接反应。

下面，通过与实施例6相同的方法进行转化、质粒的收集和插入片段的证实。

(3)蛋白质的表达和纯化

蛋白质的表达和纯化使用如上所述获得的用于表达的质粒通过与实施例10相同的方法进行，从而获得目标蛋白质。

实施例18(金-和HEL-结合蛋白的获得)

(1)金结合VH编码核酸片段的调节

使用下列引物

gVH-B(SEQ ID No：121)

5′-NNNNN CCATGG CCGAC CAGG TGCAG TTGGT GGAGT CT-3′

gVH-F(SEQ ID No：122)

5′NNNNN GCTAG C GGAGA CGG TGACCAGGGT-3′

制备金结合的VH(下文称为VHg)，用于引入一种载体，该载体在金结合的VH(SEQ ID No：61)的5’末端侧排列有限制性内切酶NcoI酶切位点，在其3′末端侧排列有限制性内切酶NheI酶切位点。然后，按照供应商推荐的比例使用商业上可获得的PCR试剂盒进行PCR，获得约350bp的碱基对。使用商业上可获得的测序反应试剂盒和反应溶液组合物，利用上述VHB-F进行BigDye-PCR反应。温度循环设置为96℃×3min→(94℃×1min→50℃×1min→68℃×4min)×30个循环→4℃，以证实获得了含有编码目标VH的碱基序列的片段。

(2)金结合VL编码核酸片段的调节

按照与(1)相同的方法获得核酸片段，不同之处在于使用下列引物

gVL-B(SEQ ID No：123)

NNNNN GCTAGC GGTGGCGGTGGCTCT GAAATTGTGTT GACGCAGTCT，和

gVL-F(SEQ ID No：124)

NNNNN CCGCG GCACG TTTAA TCTCC AGTCG TGT

制备金结合的VL(下文称为VLg)(SEQ ID No：99)，用于插入一种载体，该载体在金结合的VL(SEQ ID No：76)的5′末端侧排列有限制性内切酶NheI酶切位点和编码接头(GGGGS)的核酸，并且在其3′末端侧排列有His×6和限制性内切酶SacII酶切位点，从而证实获得了具有目标VL的碱基序列的片段。

(3)HEL-结合VH编码核酸片段的调节

hVH-B(SEQ ID No：126)

5′-NNNNN CCATGG CCGAC GATATCCAGCTGCAGGAGTCGGGCCC-3′，和

hVH-F(SEQ ID No：127)

5′NNNNN GCTAG C GGAGA CGG TGACGTCTGT-3

制备HEL-结合的VH(下文称为VHh)，用于引入一种载体，该载体在HEL-结合的VH(SEQ ID No：125)的5′末端侧排列有限制性内切酶NcoI酶切位点，并且在其3′末端侧排列有限制性内切酶NheI酶切位点，从而证实该片段具有目标VL的碱基序列。

(4)HEL-结合VL编码核酸片段的调节

hVL-B(SEQ ID No：129)

NNNNNGCTAGCGGTGGCGGTGGCTCTGATATCGTCCTGACCCAGAG，和

hVL-F(SEQ ID No：130)

NNNNN CCGCG GCCTT GATCT CCAGC TTGGT GC

制备HEL-结合的VL(下文称为VLh)，用于引入一种载体，该载体在HEL-结合的VL(SEQ ID No：128)的5′末端侧排列有限制性内切酶 NheI酶切位点和编码接头(GGGGS)的核酸，并且在其3′末端侧排列有His×6和限制性内切酶SacII酶切位点，从而证实该片段具有目标VL的碱基序列。

实施例19(表达载体的制备)

使用以上4种核酸片段根据下列结构构建2种表达载体。

(1)用于表达VHg-VLh的载体(pGHEL)的制备(图15)

(i)VHg的插入

质粒pUT-XX用限制性内切酶NcoI/NheI(均由New EnglandBiolabs生产)切割，并且经过自旋柱400HR(Amasham Science)。然后用限制性内切酶NcoI/NheI类似地切割VHg，酶切片段用商业上可获得的凝胶纯化试剂盒(SV Gel and PCR Clean-up系统：Promega)纯化。上述2个片段用商业上可获得的T4连接酶试剂盒(Roche)按照供应商推荐的方法混合，然后连接。

用连接溶液通过热休克转化40μL JM109感受态细胞(Promega)。将产物接种在LB/氨苄青霉素(amp.)平板上，整体置于37℃过夜。

然后将平板上的任一菌落在3mL液体培养基中传代培养，整体在37℃下振荡培养过夜。之后，利用商业上可获得的MiniPreps试剂盒(Plus Minipreps DNA纯化系统：Promega)收集质粒。

使用gVH-F通过测序方法证实得到的质粒的碱基序列。这样证实了目标片段已经插入。

(ii)VLH的插入

以上1)中获得的质粒pUT-VHg用限制性内切酶NheI/SacII切割，并且过自旋柱400HR(Amasham Science)。然后，类似地用限制性内切酶NheI/SacII切割VLh。然后按照与以上(a)相同的方法进行连接，证实获得了用于表达VHg-VLH的质粒(用于证实的引物为hVL-F)。

(2)用于表达VHh-VLg的载体(pHGOLD)的制备(图16)

(iii)VHh的插入

按照与以上(i)相同的方法将VHh插入质粒pUT中，证实得到的质粒为目标质粒(用于证实的引物为hVH-F)。

(iv)VLg的插入

按照与以上(b)相同的方法将VLg插入以上(iii)获得的质粒中，通过与1)相同的方式证实得到的质粒为用于表达VHH-VLg的目标载体pHGOLD(用于证实的引物为gVL-F)。

实施例20(蛋白质的表达和纯化)

用于表达实施例19之(ii)中获得的VHg-VLh和实施例19之(iv)中获得的VHh-VLg的多肽链的表达载体在各自的系统中通过下面所述的表达和纯化蛋白质的步骤进行处理，获得为多肽链VHg-VLh和VHh-VLg。

1)转化

用上述表达载体转化不同的40μL BL21(DE3)感受态细胞溶液。在如下条件下进行转化：在冰中→42℃×90sec→冰中进行热休克。将750μL LB培养基加入通过热休克转化的BL21溶液中，整体在37℃下振荡培养1小时。之后，以6,000rpm离心5min，弃去650μL培养上清液。剩余的培养上清液和作为沉淀物的细胞部分进行搅拌并且接种到LB/amp.平板上，整体置于37℃过夜。

2)预培养

3)主培养

4)纯化

通过以下步骤从不溶性颗粒部分中纯化目标多肽链。

(i)不溶性颗粒的收集

将以上3)中获得的培养液以6,000rpm离心30min获得沉淀物作为细菌部分。将产物悬浮在置于冰中的15ml Tris溶液(20mMTris/500mM NaCl)中。得到的悬浮液用弗氏压碎器匀浆，获得细菌匀浆溶液。然后将细菌匀浆溶液以12,000rpm离心15min，除去上清液，获得沉淀物作为不溶性颗粒部分。

(ii)不溶性颗粒部分的溶解

向以上(i)中获得的不溶性部分加入并且浸没在10mL 6M盐酸胍/Tris溶液中过夜。然后产物以12,000rpm离心10min，获得上清液作为溶解的溶液。

(iii)金属螯合柱

使用His-Bind(Novagen生产)作为金属螯合柱载体。柱的调整、加样和洗涤步骤都按照供应商推荐的方法在室温(20℃)下进行。作为目标的His标签融合多肽链的洗脱用60mM咪唑/Tris溶液进行。洗脱液的SDS-PAGE(丙烯酰胺15％)证实该洗脱液具有一条带，并且被纯化。

(iv)透析

使用6M盐酸胍/Tris溶液作为外部溶液在4℃下透析上述洗脱液，以除去洗脱液中的咪唑，从而获得上述各个多肽链溶液。

(v)重折叠

按照与上述相同的方法，VHg-VLh和VHh-VLg的多肽链溶液分别按照下列步骤使用脱氯化氢的胍透析(4℃)，进行蛋白质的重折叠。

(a)根据每种多肽链的摩尔吸收系数和ΔO.D.(280nm-320nm)，使用6M盐酸胍/Tris溶液制备浓度为7.5μM的样品(稀释后的体积为10ml)。然后加入β-巯基乙醇(还原剂)至终浓度为375μM(50-倍蛋白质浓缩)，然后在暗室中在室温下还原4小时。将样品溶液加入透析袋(MWCO：14,000)中，提供作为用于透析的样品。

(b)将用于透析的样品浸没在作为外部溶液的6M盐酸胍/Tris溶液中，在轻轻搅拌下透析6小时。

(c)以分步方式将外部溶液的盐酸胍溶液浓度减至3M，然后减至2M。样品在每一浓度的外部溶液中透析6小时。

(d)向Tris溶液中加入终浓度为375μM的氧化型谷胱甘肽(GSSG)和终浓度为0.4M的L-Arg，然后加入以上(c)中的2M透析外部溶液，使盐酸胍浓度为1M。样品在pH已经用NaOH调节为8.0(4℃)的外部溶液中在轻轻搅拌下透析12小时。

(e)通过与(d)相同的操作制备盐酸胍浓度为0.5M的L-ArgTris溶液，并且再透析12小时。

(f)最后，在Tris溶液中透析12小时。

(g)透析完成后，以10,000rpm离心约20分钟，以分离聚集物和上清液。

(vi)二聚化级分的纯化

将以上(v)中获得的各5μM多肽链(VHg-VLh，VHh-VLg)溶液混合，并且置于4℃下过夜。然后获得在Sephadex 75柱(柱：缓冲液20mM Tris，500mM NaCl，流速：1ml/min)中二聚化的相当于60kDa的级分(从注射起约18分钟)。这提供了用于SPR测定的样品。

实施例21(通过SPR测定评价金结合亲和力)

实施例20中获得的二聚化蛋白质级分对于金的结合亲和力利用SPR测定。使用BIAcore 2000(BIAcore制造)作为SPR测定装置。使用同一公司的金沉积玻璃基板SIA-kit Au作为金基板(该级分结合到上面)。在下列条件下进行测定。使用500nM(如上所述根据吸光度计算)实施例15中获得的二聚化蛋白质级分作为样品。

运行缓冲液：0.1％Tween 20/Tris溶液：TBST

温度：25℃

流速：20μL/min

样品注射量：40μL

获得显示金结合亲和力的结合曲线(图18)。

实施例22(通过SPR测定评价对HEL的结合亲和力)

样品在实施例21中进行了金结合亲和力的SPR评价后，继续注射1μM HEL溶液，利用SPR测定金结合的二聚化蛋白质级分对HEL的结合亲和力。获得显示对于HEL的结合亲和力的结合曲线(图18)。

实施例23(Au特异性的证实)

实施例22中获得的，金结合蛋白和HEL已经结合到上面的SPR芯片的金基板，接着用来进行如下实验。向上述金基板注射1μM抗-HEL抗体/PBST溶液。之后，用该基板用PBST清洗。而且，向该基板注射1μM视紫红质结合的抗-IGg抗体/PBST溶液。之后，该基板用PBST洗涤。从SPR装置中取出上述SPR芯片，用荧光显微镜观察该基板。结果，在金基板上的SPR的流动通道上观察到荧光。

比较实施例2

使用未用过的金沉积基板进行与实施例23相同的操作。结果，在金基板上没有观察到荧光。

实施例24

制备通过实施例20之(i)至(v)的步骤获得的重旋的多肽链，获得5μM VHg-VLh/Tris溶液。

实施例25

实施例24中获得的VHg-VLh/Tris溶液用Tris溶液稀释至500nM，按照与实施例20相同的方法评价对金基板的结合亲和力。而且，继续注射1μM HEL溶液，以测定金结合的二聚化蛋白质级分对HEL的结合亲和力。获得显示对金和HEL的结合亲和力的结合曲线。

实施例26

在实施例25中，使0.5μM抗-HEL抗体VL/Tris溶液共存，整体静置过夜，制备样品。

实施例27

按照与实施例15相同的方法，通过SPR评价实施例26制备的样品对金基板的结合亲和力。而且，按照与实施例16相同的方法，继续注射1μM HEL，以便通过SPR测定对样品的结合亲和力。获得显示结合亲和力的结合曲线。

实施例28(HEL检测免疫色谱装置的准备)

用于检测HEL的免疫色谱装置如检测本发明方法的实施例所述准备。

1)用于免疫层析的、上面固定有抗-HEL抗体的多孔载体的制备

将硝酸纤维素片(BAS-85，Schleicher & Schuell生产)切成5mm×30mm的小片。在距小片末端10mm处以0.5mg/mL的量直线施加0.5mg/mL抗-HEL抗体溶液(Nippon Biotest Labo生产)，从而制备检测位点。将该小片置于室温下2小时，使液体干燥，由此将抗体固定在小片上。该小片在1％脱脂奶(Difco生产)/PBST溶液中振荡2小时，封闭。之后，将小片置于室温下，制备用于免疫层析的载体。

2)金标抗-HEL抗体片段和反载体(hold-back carrier)的制备

(i)金标抗-HEL抗体片段的制备

使用实施例20制备的金/HEL双特异性抗体片段，按照下列步骤制备如题所述的片段。

加入金细粒(粒径50nm，Tanaka Kikinzoku生产)分散体，与实施例20制备的金/HEL双特异性抗体片段充分混合，在室温下反应3小时。产物以12,000rpm离心5min，以除去未反应的金/HEL双特异性抗体片段，然后除去上清液，获得沉淀物。将得到的沉淀物悬浮于1.0mL PBST中。并且在上述条件下进行离心。将得到的沉淀物悬浮在1.0mL 1％BSA/PBST中。

(ii)金标抗-HEL抗体片段反载体的制备

使大小为5mm×5mm的Bemliese无纺布(Asahi KaseiCorporation制造)浸渍5μL金标抗-HEL抗体片段溶液和5μL各种碱基的10％水溶液，风干，制备金标抗-HEL抗体片段反载体。

3)试片(test piece)型免疫层析装置的准备

将以上2)(ii)中制备的金标抗-HEL抗体片段反载体与以上1)中制备的用于免疫层析的载体在距该用于免疫层析的载体一端可达2.5mm处重叠。并且，将用于浸渍液体样品的载体(526号滤纸，Advantec Toyo生产)与该抗体片段反载体重叠。另外，将用于浸渍过量样品部分的载体(526号滤纸)与用于免疫层析的载体在距该用于免疫层析的载体另一端可达5mm处重叠。最后，用胶带粘贴于后侧以稳定此整体，由此制成了试片型免疫层析装置。使用标准HEL溶液的测试证实抗-HEL抗体固定部分呈红色。

实施例29(电测量仪器的准备)

显示了使用金电极检测蛋白质的方法的一个实施例。

1)将2个金电极置于玻璃基板上。两个电极之间的距离设置为20μm。将20μL 0.1％聚-L-赖氨酸(Sigma-Aldrich)水溶液滴加至电极之间的空隙上，整体放置3小时。

然后，用水洗涤该基板。之后，该基板用乙醇洗涤3次并且干燥。

2)然后，根据Proteomics，3，pp254(2003)所述，将抗-HEL多克隆抗体(ROCKLAND)固定在以上(a)中获得的玻璃基板上，

3)使实施例20制备的金/HEL双特异性抗体片段的PBST溶液和20-nm金纳米颗粒(Tanaka Kikinzoku生产)相互反应(PBST溶液用于比较)。

4)向1)中获得的固定有抗-HEL抗体的基板上添加1μMHEL/PBS溶液。

5)然后，向3)中获得的产物中加入2)中获得的金结合蛋白溶液。

6)将4)中获得的基板用PBS溶液洗涤3次。之后，将该基板浸在银增强溶液(Sigma-Chemical)中5分钟，然后用水洗涤。证实与仅有PBST的对比样品相比，电极之间的电阻降低。

实施例30(用于在酵母中表达VHg-VHh蛋白的载体的制备)

(1)NheI-VHh-SacII片段的制备

用实施例19中制备的pHGold作为模板通过PCR制备在其末端具有NheI/SacII的VHh片段。

使用如下引物。

NheI-VHh_f(SEQ ID No：131)

NNNNNGCTAGCCAGGTGCAGTTGGTGGAGTCT

VHh-sacII_r(SEQ ID N o：132)

NNNNNCCCGCGGATGAGGAGACGGTGACCAGGGTT

按照供应商推荐的方法用上述引物进行pfu-turbo的PCR。得到的PCR反应溶液进行琼脂糖凝胶(2％)电泳，证实获得了约350bp的片段。

(2)VHg-VHh DNA片段的制备

将以上(1)中获得的VHh片段引入实施例19中制备的pGHEL的VLh部分中。

将(1)中获得的PCR片段和pGHEL用NheI/SacII(均由TAKARABIO INC.生产)切割。限制性内切酶反应按照本领域技术人员推荐的方法进行。将得到的反应溶液进行琼脂糖电泳，然后凝胶纯化(PCR片段：琼脂糖2％，pGHEL：琼脂糖1％)。凝胶纯化使用上述凝胶纯化试剂盒。

已经证实，如上所述在限制性内切酶反应后获得的PCR片段具有约350bp的PCR片段和3,000bp的质粒片段，下面按照与实施例19相同的方法获得一种新质粒。

利用测序仪测定得到的质粒的碱基序列，以证实其碱基序列为目标碱基序列(该质粒被命名为pHgHh)。

(3)酵母表达质粒的插入

按照供应商推荐的相同方法进行PCR。

用pPCIZαA(Invitrogen)作为酵母(巴斯德毕赤酵母(Pichiapastris))表达质粒。利用EcoRI和SacII在该质粒的多克隆位点处引入靶基因。

使用(2)中获得的pHgHh作为模板，通过PCR制备将要引入的基因。

引物为，

7s4-fW-EcoRls(SEQ ID No：133)

AAGCTGAATTCCAGGTGCAGTTGGTGGAGTCT

HELVH-SacII-r(SEQ ID No：134)

NNNNNCCGCGGAGACGGTGACGAGGGT

得到的PCR片段和pPCIZαA用EcoRI和SacII依次切割，通过凝胶纯化按照上述相同的方法获得每个目标片段。

按照上述方法进行连接。连接反应溶液按照与上述相同的方法转化，并且接种于琼脂平板上。在此情况下的琼脂平板为色氨酸10g/酵母提取物5g/NaCl 5g/琼脂15g/L中添加Zeocin至浓度为25μg/L。在此条件下选择的菌落在液体培养基(色氨酸10g/酵母提取物5g/NaCl 15g，Zeocin 25μg/L)中37℃培养过夜。收集质粒后，利用测序仪证实序列，获得表达VHg-VHh：VH-金接头(GGGGS)-VH_HEL的质粒作为该实施例的目标(提供为pPCIZ-αHH)。

实施例31(VHg-VHh蛋白的表达/纯化)

VHg-VHh的表达使用Easy select Pichia表达试剂盒Ver.G(Invitrogen)进行。转化子的制备和蛋白质的制备和纯化(金属螯合柱)均按照本领域技术人员推荐的方法进行。通过金属螯合柱获得的5mL 1M咪唑洗脱级分用Tris缓冲液(20mM Tris/200mM NaCl，1mM EGTA：pH 7.9)作为外部溶液在4℃下透析。每6小时更换一次外部溶液，总共更换3次。

随后使用Sephadex 75(Amasham Bioscience)，在4℃下通过凝胶过滤进行纯化(缓冲液条件：50mM Tris-HCl，200mM NaCl，1mM EDTA，pH 8.0，流速：0.7mL/min)。获得的级分浓缩后，使用SDS-PAGE(丙烯酰胺17.5％)和HRP-融合的抗-His抗体进行与上述相同的western印迹分析。从而指示了目标蛋白质的级分，并且纯化为单一条带。分级分离提示该级分为约25kDa的单体蛋白质的峰，然后进行如下的评价(图19)。

实施例32(利用SPR评价对金的结合亲和力)

实施例31中获得的蛋白质级分对金的结合亲和力利用SPR测定。使用BIAcore 2000(BIAcore制造)作为SPR测定装置。使用同一公司的金沉积玻璃基板SIA-kit Au作为结合该级分的金基板。在下列条件下进行测定。使用500nM(如上所述根据吸光度计算)实施例20中获得的蛋白质级分作为样品。该实施例的条件与实施例21相同。获得显示金结合亲和力的结合曲线(图20)。

实施例33(VHg-VHh蛋白变体-1的制备)

以实施例30中获得的质粒pPCIZ-α7s4作为模板，使用QC试剂盒(STRATAGENE生产)获得VHg变体(SEQ ID No：135或136)用作实施例30的金结合VH的V37L、G44E和L45R。使用如下引物通过3次操作获得目标质粒。连续地，每次操作向一个位点插入突变。

用于向第一位点插入突变的PCR引物

V37F-f(SEQ ID No：137)

TTACTGGATCAACTGGTTCCGCCAGATGCCCGG

V37F-r(SEQ ID No：138)

CCGGGCATCTGGCGGAACCAGTTGATCCAGTAA

用于向第二位点引入突变的PCR引物

G44E-f(SEQ ID No：139)

CAGATGCCCGGCAAAGAACTGGAATGGATGGGG

G44E-r(SEQ ID No：140)

CCCCATCCATTCCAGTTCTTTGCCGGGCATCTG

用于向第三位点引入突变的PCR引物

L45F-f(SEQ ID No：141)

GCCCGGCAAAGAAAGGGAATGGATGGGGATG

L45F-r(SEQ ID No：142)

CATCCCCATCCATTCCCTTTCTTTGCCGGGC

突变的插入根据序列证实。从转化到蛋白质表达的程序与实施例31相同。使用约25kDa的单体蛋白质峰进行如下的评价。

实施例34(利用SPR评价对金的结合亲和力)

实施例33中获得的蛋白质级分对金的结合亲和力利用SPR测定。使用BIAcore 2000(BIAcore制造)作为SPR测定装置。使用同一公司的金沉积玻璃基板SIA-kit Au作为结合该级分的金基板。在下列条件下进行测定。使用500nM(如上所述根据吸光度计算)实施例33中获得的蛋白质级分作为样品。该实施例的条件与实施例21相同。获得显示金结合亲和力的结合曲线(图21)。

实施例35(VHg-HEL scFv蛋白变体的制备)

进行替换，以获得与HEL结合的scFv(SEQ ID No：143或144)融合而不是与实施例31的HEL结合VH融合的蛋白质。使用Journalof Biological chemistry，2003，279，pp8979所示的已经引入HEL结合scFv编码基因的质粒作为模板，通过PCR获得编码HEL结合的scFv的DNA片段。PCR按照与本领域技术人员所推荐的相同的方法进行，并且使用下列引物。

scFv-f(SEQ ID No：145)

NNNNCCATGCCCGATATCGTCCTGACCCAG

scFv-r(SEQ ID No：146)

AGCTACCGCGGAGACGGTGACGAGGGT

限制性内切酶反应之后的程序与实施例30相同，由此获得目标质粒。

根据序列证实得到的质粒含有靶基因序列。从转化到蛋白质表达的程序与实施例31相同。这样获得了约39kDa的单体蛋白质。

实施例36(利用SPR评价对金和HEL的双结合亲和力)

实施例35中获得的蛋白质级分对金的结合亲和力利用SPR测定。使用BIAcore 2000(BIAcore制造)作为SPR测定装置。使用同一公司的金沉积玻璃基板SIA-kit Au作为结合该级分的金基板。在下列条件下进行测定。使用500nM(如上所述根据吸光度计算)实施例31中获得的蛋白质级分作为样品。该实施例的条件与实施例21和22相同。获得显示金结合亲和力的结合曲线(图22)。

实施例37(用于表达VHg变体-VLh的质粒的制备)

将由SEQ ID No：147和148表示的DNA序列引入实施例19中获得的表达质粒(pGHEL)的金结合VH编码序列中。一种插入方法包括使用上述Quick Change试剂盒(Stratagene)，并且用pGHEL作为模板。已经证实获得的质粒具有靶序列。然后，按照与实施例20相同的方法利用获得的质粒进行蛋白质的表达和纯化以及与VHh-VLg的二聚化。

分子量约为50kDa的蛋白质级分利用Sephadex G75分级分离(图23)。

A14P-f(SEQ ID No：147)

GAGCAGAGGTGAAAAAGCCAGGGGAGTCTCTGAAG

A14P-r(SEQ ID No：148)

CTTCAGAGACTCCCCTGGCTTTTTCACCTCTGCTC

实施例38(利用SPR评价对金和HEL的双结合亲和力)

实施例37中获得的蛋白质级分对金的结合亲和力利用SPR测定。使用BIAcore 2000(BIAcore制造)作为SPR测定装置。使用同一公司的金沉积玻璃基板SIA-kit Au作为结合该级分的金基板。在下列条件下进行测定。使用500nM(如上所述根据吸光度计算)实施例37中获得的蛋白质级分作为样品。该实施例的条件与实施例21相同。获得显示金结合亲和力的结合曲线(图24)。

实施例39(表达VHg-VLg四聚体的质粒的制备)

除了将实施例30的VHh更换为VHg编码基因片段以外，按照与实施例30相同的方法制备pPCIZ-αVHg²。

用实施例10中获得的pRA2-7s4作为模板用于制备在上述操作中使用的编码VHg的DNA片段，并且使用下列引物作为引物

VHg-f(SEQ ID No：149)

NNNNNGCTAGC GGCGGGGGCGGTAGC CAGGTGCAGTTGGTGGAGTCT

VHg-r(SEQ ID No：150)

NNNNNCCGCGGATGAGGAGACGGTGACCAGGGTT。

根据序列证实获得了目标质粒。

实施例40(VHg-VLg蛋白的制备)

靶蛋白通过与实施例31相同的步骤纯化。纯化由VHg-VHg二聚体组成的分子量约为25kDa的蛋白质(图25)。

实施例41(表达VHg-VLg四聚体的质粒的制备)

除了将用于连接实施例39的VHg-VHg的接头GGGGS更换为GS以外，按照与实施例30相同的方法制备pPCIZ-αVHg⁴。

实施例10中获得的pRA2-7s4作为模板用于制备在上述操作中使用的编码VHg的DNA片段，并且使用下列引物作为引物

VHg4-f(SEQ ID No：151)

NNNNNGCTAGC GGCAGC CAGGTGCAGTTGGTGGAGTCT

VHg4-r(SEQ ID No：152)

NNNNNCCGCGGATGAGGAGACGGTGACCAGGGTT。

根据序列证实获得了目标质粒。

实施例42(金细粒凝集反应)

在实施例40和44中获得的每种蛋白质的500μM/PBST溶液中，金细粒(20nmφ：Tanaka Kikinzoku生产)在室温下温育。无论使用哪种蛋白质都观察到金细粒的凝集。另外，还观察到金细粒/蛋白质混合物的光谱(λmax)随时间变化，观察到扩大半个带宽。获得的结果提示金细粒之间的距离缩短(图26)。

比较实施例3

使用500nM BSA代替500nM HEL进行与实施例36相同的操作。与BSA的结合未被证实。显示实施例35中获得的对于金的蛋白质以特异性方式与HEL结合(图27)。

比较实施例4

使用SPR测定法用抗-HEL抗体(Rockland生产)评价直接固定在金基板上的蛋白质的结合能力。

(1)在PBS中制备10μM HEL

(2)以1μl/min注射100μl在(1)中获得的溶液。吸附的抗体的信号为1907R.U.

(3)以与(2)相同的方式注射1％酪蛋白PBS溶液

(4)进而，以20μl/ml注射40μl 1％酪蛋白PBS溶液，并且证实金基板被封闭。

(5)随后以20μl/min注射40μl 1μM，获得图28所示的结果。

结果，键HEL分子的信号为11R.U.，而固定在金基板上的抗体的信号为1907R.U.。考虑到固定处的结构和假定一种抗体分子在基板上捕获一种抗体，抗体捕获靶物质的速度计算为约6％。

另一方面，上述实施例显示本发明的20-40％的蛋白质捕获抗原。而且，在上述实施例中捕获传感器分子的蛋白质的固定不需要任何特殊试剂或过程，暗示本发明的固定方法优于常规的物理吸附法。

工业实用性

本发明提供：具有一个或多个金结合位点和特定物质结合位点的金结合蛋白；包括上面固定有该金结合蛋白的金基板的结构；和使用它们的检测装置。

在由上面固定了应用本发明获得的金结合蛋白的结构组成的检测装置中，该蛋白质固定在特异性识别金的结合位点处作为基板。因此，识别特定物质(靶物质)的蛋白质的结合位点不固定在该基板上，而且该蛋白质被定位，同时确保距基板的距离。结果，靶物质结合位点使基板对其结合能力的影响最小化，由此该蛋白质有效且高定位地固定在该基板上。

即，提示本发明能够用于利用各种生物物质的功能改善产品的性能，该生物物质将有机物质如生物物质固定在基板表面，以利用该有机物质的各种生理功能，该产品的代表为生物传感器和生物反应器。

同时，本发明提供了一种用于标记靶物质的连接体，包括：一个或多个与靶物质结合的位点；和一个或多个与标记的物质结合的位点，其特征在于各自的结合位点彼此独立地与将要结合的物质结合。本发明的应用使得能够不使用常规化学交联方法而标记靶蛋白。结果，对各种蛋白质对靶物质的结合亲和力的影响，在标记时关心的影响，能够最小化，并且能够提高生产效率。即，本发明能够用于利用各种生物物质的功能改善产品的性能，该产品如生物传感器，其将连接体固定在基板表面上，并且利用该连接体的各种生理功能。

本申请要求2004年3月31日申请的日本专利申请2004-108388号的优先权，该日本申请在此引入作为参考。