CN1902221A - 基于中和表位的生长增强疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了来自蛋白GDF8的新的、特异性的抗原肽。本发明还提供了包含所述新肽的融合蛋白、根据所述新肽和/或融合蛋白的免疫原和疫苗、特异性结合GDF8的所述新肽的抗体和采用根据本发明的疫苗或抗体治疗动物以调整GDF8活性的方法。

Description

基于中和表位的生长增强疫苗

                相关申请的交叉引用

本申请是非临时申请，根据35U.S.C.§119(e)要求2003年12月31日提交的临时申请U.S.Serial No.60/533,719的优先权，在此通过引用将其全部内容合并。

                    发明领域

本发明涉及蛋白生长分化因子8，涉及生长分化因子8的抗原性肽片段，并涉及用以调整生长分化因子8的活性的免疫原、疫苗和治疗动物的方法。

                    发明背景

生长分化因子8是一种被分类为转化生长因子-β(“TGF-β”)超家族的蛋白。一般地，TGF-β超家族的蛋白最初被表达为前体(a/k/a激素原)，该前体在距前体蛋白C-末端约110-140个氨基酸的一簇碱性残基处经历蛋白水解性裂解。在每种情况下，活性的、或成熟的TGF-β种类被认为是裂解的前体蛋白C-末端区域的二硫化物连接的二聚体。

生长分化因子8，在下文中称GDF8，本领域中也称为GDF-8或myostatin。已经从大范围的有机体克隆了编码GDF8的前体(在下文中称“前体GDF8”)的基因。这些包括人和鼠的前体GDF8[Nestor etal.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.95：14938-43；美国专利No.5,827,733，在此通过引用将其全部内容合并]。还报道了的是，在人类骨骼肌中在1型和2型纤维中GDF8免疫反应性是可检测的。描述了检测GDF8的抗体和化验，例如，美国专利No.6,096,506。

进一步报道了，GDF8在下调或抑制骨骼肌的生长和发育中起到作用，这是通过敲除GDF8的小鼠证实的(McPherron et al.，1997，Nature387：83-90)。为此，已有一些先前的尝试，特别是在畜牧业方面，通过一些手段来调整动物中的GDF8活性，目标是下调GDF8活性来增强各种食用动物的生长和/或相对肌肉质量。

例如，美国专利No.6,399,312描述了前体GDF8基因启动子和化验，建议是用该化验来鉴定该启动子的理论性抑制物。美国专利No.6,656,475描述了通过用竞争GDF8受体的GDF8前结构域(prodomain)与细胞接触来抑制GDF8对细胞的影响的方法，并报道了成熟GDF8的C-末端可以变化。美国专利No.6,004,937描述了使用follistatin作为GDF8的潜在拮抗物。这些方法在畜牧业或临床应用(人类或者兽医学)领域都没有产生任何实际应用。

其他人也尝试了采用抗体和疫苗技术来下调GDF8功能。例如，美国专利No.6,369,201[在此通过引用将其全部内容合并]描述了肽，即，GDF8蛋白的片段，和用于引发抗GDF8抗体的疫苗。该专利还报道了在用某些所报道的GDF8肽片段免疫的啮齿动物中，与对照相比，有未指明程度的生长或体重增加。

也已经描述了GDF8的其他生理学作用。例如，美国专利No.6,368,597[在此通过引用将其全部内容合并]提示，抑制GDF8功能对于治疗II型糖尿病是有用的，例如，通过向具有这种状况的患者施用抗GDF8抗体或抗GDF8疫苗。

尽管如此，对于引发抗GDF8免疫反应的改进的抗原和免疫原，以及对于能够高特异性结合GDF8的改进的GDF8抗体，本领域中仍存在着长期的需求。

在此对任何参考文献的引用不应看作是认可这些参考文献作为本申请的“现有技术”。

                    发明概述

本发明通过提供包含GDF8特异性中和表位的GDF8肽(例如，50个残基或更小的GDF8的肽片段)来克服了本领域的这些和其他缺点。

在本发明的一个实施方式中，提供的GDF8肽包括，例如，包含天然的人类前体GDF8(SEQ ID NO：1)的约残基312到约残基361的分离的肽。优选的，本发明的GDF8肽包含天然的人类前体GDF8的约残基320到约残基350，更优选的包含约残基321到约残基346，最优选的包含约残基327到约残基346。以下说明例示的GDF8肽，在下文中标记为DJ5，为了方便起见，以单字母和三字母代码、连同基于SEQ ID NO：1的前体GDF8的残基编号的形式表示。

                                                                  DJ5(SEQ ID NO：8)

327	328	329	330	331	332	333	334	335	336	337	338	339	340	341	342	343	344	345	346
																				VVal	HHis	QGln	AAla	NAsn	PPro	RArg	GGly	SSer	AAla	GGly	PPro	CCys	CCys	TThr	PPro	TThr	KLys	MMet	SSer

在本发明的进一步的实施方式中，GDF8肽任选的包括保守的单个氨基酸替换。仅是举例来说，这些可以在肽内的一到至少五个氨基酸位置。在特定的实施方式中，在例如GDF8的残基327到346之间，有至少一个保守性氨基酸替换。在另一个实施方式中，GDF8肽包括在肽内的至多五个氨基酸位置上的保守性氨基酸替换。在再另一个实施方式中，在GDF8的残基327到346之间有两个保守性氨基酸替换。在又一个实施方式中，在GDF8的残基327到346之间有三个保守性氨基酸替换。在再另一个实施方式中，在GDF8的残基327到346之间有四个保守性氨基酸替换。

优选的，所述氨基酸残基替换处在相对天然的人类前体GDF8(SEQ ID NO：1)的一个或多个位置，所述位置由附图2的种间比对的氨基酸变异来标记。这些是在残基328、329、331、333和335，以及它们的组合，其中，

(a)氨基酸残基328是His、Leu或Asn；

(b)氨基酸残基329是Gln或Lys；

(c)氨基酸残基331是Asn或Ser；

(d)氨基酸残基333是Arg或Lys；和/或

(e)氨基酸残基335是Ser、Pro或Thr。

优选的，这种修饰的GDF8肽包含抗GDF8抗体的特异性中和作用表位，因而维持了与抗GDF8抗体特异性结合的性质，其中该抗体是mAb 788和/或山羊抗GDF8多克隆抗血清的IgG部分，如下文中所例示的。

在本发明的再进一步的实施方式中，提供了编码上述GDF8肽的核酸分子，即多核苷酸。

优选的，所述核酸分子包括天然发生的人类前体GDF8基因的部分，从(Genebank登记号NM_005259，人类GDF8基因；SEQ ID NO：2)的约核苷酸1112到约核苷酸1171。这个部分编码如上所述的肽DJ5。注意到NM_005259数据包括了侧翼于实际编码区的大量序列。技术人员将要理解，DJ5相应于GDF8激素原的实际编码区的核苷酸979-1038。

还提供了包含所述核酸分子的可复制克隆载体，和原核或真核宿主细胞，一同提供了生产GDF8肽的方法，包括步骤：培养所述宿主细胞，表达所述编码的肽，和回收所述肽。技术人员还要理解的是，发明的GDF8肽也可以通过任何标准的、本领域已知的化学合成方法容易地产生。

在本发明的又进一步的实施方式中，还提供了包含发明的GDF8肽(或其融合蛋白)的疫苗组合物，例如，其优选的包括一种或多种佐剂和基于肽或蛋白的疫苗组合物的其他技术上标准的成分。还提供了在动物中引发抗GDF8免疫反应的方法，包括向所述动物施用有效量的所述疫苗组合物。

在另一个进一步的实施方式中，提供了从多种抗体或抗体片段中挑选抗GDF8抗体或抗体片段的筛选方法，包括使所述肽与一种或多种抗体或抗体片段接触，和检测与所述肽选择性结合的抗体或抗体片段。

在又一个方面，本发明提供了在动物中下调GDF8活性的方法。在一个这样的实施方式中，所述方法包括以在动物中有效下调GDF8活性的一定数量和时间，向动物施用抗体或抗体片段，其中所述抗体特异性结合所述肽，或通过用在此描述的疫苗组合物免疫所述动物。所述动物优选的是脊椎动物，更优选的是哺乳动物、禽类或鱼类。优选的，所述哺乳动物是驯养的动物(例如，用于畜牧业的动物，或作为选择，是陪伴动物)，但任选的可以是需要这种GDF8下调作用的人类。

本发明还预期掺入了本发明的GDF8肽的融合蛋白。所述融合蛋白可以包括作为信号肽的结构域，用于增强所述GDF8融合蛋白的分泌或细胞表面表达，和/或用以允许使用选择性结合系统进行纯化。进一步的，预期所述融合蛋白将一种或多种GDF8肽连接在单个载体蛋白上，来增强所述GDF8肽结构域的免疫原性。在特定的实施方式中，本发明的融合蛋白包含由50个或更少的氨基酸残基组成的GDF8肽，所述氨基酸残基包含SEQ ID NO：1的氨基酸残基327到346。在这种类型的相关实施方式中，所述融合蛋白包含GDF8肽的抗原性亚片段，例如，包含来自DJ5(SEQ ID NO：8)的约10个连续氨基酸残基的GDF8肽。

                 附图的简要说明

附图1说明了在GDF8活性区(即，成熟GDF8)中的重叠肽DJ1到DJ7，所述GDF8活性区来自前体GDF8序列的残基266-375。

附图2说明了人类DJ5肽序列(SEQ ID NO：8)与相似的20残基肽进行比较的比对，所述相似的20残基肽位于所列其他动物物种的前体GDF8蛋白中。氨基酸残基位置321到347基于人类前体GDF8。Genebank登记号(通过引用合并在此)确定了这些物种的完全公开的蛋白序列。

比对的肽具有以下的SEQ ID NOs。

Anas platyrhynchos(鸭)AAL35275Anser anser(鹅)AAL35276Anser anser(鹅)AAR18246Bos taurus(牛)AAB86687Canis familiaris(狗)AAR14343	(SEQ ID NO：11)(SEQ ID NO：12)(SEQ ID NO：13)(SEQ ID NO：14)(SEQ ID NO：15)
		Capra hircus(山羊)AAR12161Columba livia(鸽子)AAL35277Coturnix chinensis(鹌鹑)AAL35278Danio rerio(斑马鱼)AAB86693Equus caballus(马)BAB16046	(SEQ ID NO：16)(SEQ ID NO：17)(SEQ ID NO：18)(SEQ ID NO：19)(SEQ ID NO：20)
Gallus gallus(鸡)AAK18000Gallus gallus(鸡)AAR18244Homo sapiens(人类)NP-005250I.punctatus(鲶鱼)AAK84666Lepus capensis(野兔)AAN87890	(SEQ ID NO：21)(SEQ ID NO：22)(SEQ ID NO：8)(SEQ ID NO：23)(SEQ ID NO：24)
		Macaca fascicularis(猴)AAL17640Meleagris gallopavo(火鸡)AAB86692Morone chrysops(白鲈)AAK28707Mus musculus(家鼠)AAC53167O.mykiss(鳟鱼)AAK71707	(SEQ ID NO：25)(SEQ ID NO：26)(SEQ ID NO：27)(SEQ ID NO：28)(SEQ ID NO：29)
Ovis aries(绵羊)AAB86689Papio hamadryas(狒狒)AAB86686Rattus norvegicus(大鼠)AAB86691Salmo salar(鲑鱼)CAC19541Sparus aurata(海鲷)AAL05943	(SEQ ID NO：30)(SEQ ID NO：31)(SEQ ID NO：32)(SEQ ID NO：33)(SEQ ID NO：34)
		Sus scrofa(猪)AAC08035Sus scrofa(猪)AAR18245	(SEQ ID NO：35)(SEQ ID NO：36)

                    发明的详细说明

因此，本发明鉴定了GDF8结构域，其充当了多克隆抗GDF8山羊抗血清和其他某些特异性抗GDF8抗体的特异性中和表位。这些表位也用来提供GDF8蛋白的片段，其对于引发针对GDF8蛋白的活性和特异性免疫反应是有用的，例如，用于体外检测GDF8蛋白，和体内下调GDF8活性。这些片段在此一般称作GDF8肽或肽片段。这些GDF8肽的实用性包括用作在动物中引发抗GDF8免疫反应的免疫原，和用作GDF8相关的化验中的高特异性抗体结合靶标。

通过用抗GDF8抗血清与一组重叠的GDF8肽接触，并测定所述肽和所述抗血清IgG抗体之间的结合活性的程度，来鉴定出GDF8的特异性结合表位。从用前体GDF8蛋白免疫的山羊获得抗GDF8抗血清，所述前体GDF8蛋白具有根据表达和抗原性进行优化的结构。

为了更完整地理解本发明，给出以下定义。在说明书中为了方便起见使用单数的术语，决不意指这样进行限制。因而，例如，提及包含“多肽”的组合物包括了提及一种或多种这样的多肽。

如在此使用的，术语“大约”与术语“约”可互换地使用，表示某一值在指定值的百分之二十之内，即，含有“大约”50个氨基酸残基的肽可含有40到60个之间的氨基酸残基。

还需要理解的是，本发明不限于在此公开的特定的结构、处理步骤和材料，因为这些结构、处理步骤和材料可以有些改变。还需要理解的是，在此使用的专有名词仅用于描述特定实施方式的目的，不意味着限制，因为本发明的范围仅由附随的权利要求和其等同物限定。

如在此使用的，术语“多肽”与术语“蛋白”可互换地使用，表示包含通过肽键连接的两个或多个氨基酸的多聚体。优选的，在此除非另有说明，在大小或链长度方面，术语多肽不同于在此使用的术语“肽”，其中“肽”是指约50个或更少氨基酸的聚合体链，多肽或蛋白是指包含超过约五十个氨基酸的聚合体链。任选的，肽或多肽可以缺少某些由基因或由mRNA编码的氨基酸残基。例如，基因或mRNA分子可能编码多肽的N-末端的氨基酸残基序列(即，信号序列)，其将从最终的蛋白裂解下来，因而不是最终的蛋白的一部分。

根据本发明的“GDF8肽”是来自GDF8蛋白的相对短的片段。甚至这种肽的亚片段也可以称为GDF8肽。尽管不打算限制根据本发明的GDF8肽的最大大小，优选的是，所述肽的最大大小是约50个残基，更优选的所述最大大小是约40个残基，再更优选的所述最大大小是约30个残基，再更优选的所述最大大小是约25个残基。更一般地，所述GDF8肽的大小在长度上优选的在约10到约50个氨基酸残基的范围内，更优选的约15到约30个氨基酸残基，特别地，是长度约20个氨基酸残基。作为本发明的其他GDF8肽的更小的亚片段的GDF8肽，例如，包含来自DJ5(SEQ ID NO：8)的约10个连续氨基酸残基的GDF8肽，优选地包含来自更大GDF8肽的抗原性部分(例如，表位)。

在特定的实施方式中，GDF8肽包含肽结构域，所述肽结构域具有与天然发生的人类GDF8前体(SEQ ID NO：1)的残基编号327-346(SEQ ID NO：8)定义的肽约50％到100％同源性的同源性程度。在上述同源性中的改变优选的是保守性替换和/或保持了发明的抗原结构的改变，所述抗原结构由某些特异性抗GDF8抗体特异性地识别。这些保守替换代表由种间同源性比较(例如，参见附图2)显示的，保存了GDF8功能的残基替换，和/或代表在有相似的化学(例如，物理)和电学结构的氨基酸之间的残基替换，因而保存和/或优化了发明的GDF8肽的抗体结合特异性。这种保守性氨基酸替换的实例包括：用一个疏水残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、或甲硫氨酸替换另一个；或用相等电荷的一个极性残基替换另一个，例如，精氨酸替换赖氨酸，谷氨酸替换天冬氨酸，或谷氨酰胺替换天冬酰胺。

特别地，根据本发明的GDF8肽还包括抗GDF8抗体的特异性中和表位，即，将与以下的实施例描述的PGA抗GDF8IgG多克隆抗体特异性结合的，和/或与商业上可获得的大鼠单克隆抗体(“mAb”)Cat.No.MAB788(R & D Systems Inc.，Minneapolis，MN)特异性结合的表位或抗原性结构域。

如在此使用的术语“纯化的”或“分离的”是指在减少或消除了不相关材料，即，污染物，包括天然材料的情况下分离的材料，所述材料从所述天然材料获得。例如，纯化的或分离的蛋白优选的不含可在细胞中与该蛋白一同找到的其他蛋白或核酸。纯化的材料可含有少于约50％，优选的少于约75％，最优选的少于约90％的最初与之相结合的细胞成分。可以通过层析、凝胶电泳、免疫测定、组成分析、生物测定、和本领域已知的其他方法评估纯度。根据功能性的方面，根据本发明的分离的GDF8肽是与其他材料，包括前体GDF8蛋白和/或成熟GDF8蛋白充分分离的肽，从而能够引发特异于GDF8肽的免疫反应。

纯化方法是本领域公知的。例如，可以通过沉淀、层析、超速离心法和其他手段纯化核酸。可以通过各种方法，包括而不限于，制备性圆盘凝胶电泳、等电聚焦、HPLC、反相HPLC、凝胶过滤、离子交换和分配层析、沉淀和盐析层析、萃取和逆流分布，来纯化蛋白和多肽以及肽。对于某些目的，优选的是在重组系统中生产多肽，其中蛋白含有便于纯化的额外序列，例如，但不限于，聚组氨酸序列或与抗体特异性结合的序列，例如FLAG^和GST。然后可以在适合的固相基质上通过层析从宿主细胞的粗溶胞产物中纯化多肽。做为选择，针对所述多肽产生的抗体或其结合片段可以用作纯化试剂。

术语“基本上纯”是指使用本领域已知的常规纯化技术可达到的最高纯度，意味着核酸、多肽、肽或其他材料不含来源于原始来源有机体或重组DNA表达系统的其他污染蛋白、核酸和其他生物物质。可以通过标准方法化验实际上的纯度，一般地超过至少约75％、优选的至少约90％、更优选的至少约95％，最优选的至少约99％的纯度。可以在质量或摩尔基础上进行纯度评估。

“多核苷酸”或“核酸分子”是包含核苷酸的分子，包括但不限于，RNA、cDNA、基因组DNA和甚至是合成的DNA序列。还预期该术语涵盖包括任何本领域已知的DNA和RNA碱基类似物的核酸分子。

“载体”或“复制载体”是一种复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒，另一个DNA片段可以连接或掺入其中，从而引起所述连接的片段的复制。该术语还包括复制子，所述复制子包括掺入的或连接的目标DNA片段。

可用于本发明的载体包括微生物质粒、病毒、噬菌体、可整合DNA片段和其他能促进核酸整合到宿主基因组中的运载体(vehicle)。质粒是最常用的载体形式，但提供了等同功能并且是本领域已知的或成为已知的所有其他载体形式都适合于在此使用。参见，例如，Pouwelset al.，Cloning Vectors：A Laboratory Manual，1985和Supplements，Elsevier，N.Y.和Rodriguez et al.(eds.)，Vectors：A Survey of MolecularCloning Vctors and Their Uses，1988，Buttersworth，Boston，MA。

当DNA和载体的末端都包含相容的限制性位点时，将编码发明的GDF8肽的DNA插入到载体中很容易实现。如果这不能实现，有必要通过消化由限制性内切酶裂解产生的主干单链DNA突出来产生平末端，来修饰DNA和/或载体的末端，或通过用适合的DNA聚合酶填充单链末端来实现相同的结果。做为选择，例如，通过将核苷酸序列(接头)连接到末端上来产生期望的位点。这种接头可以包含定义期望的限制性位点的特定寡核苷酸序列。限制性位点也可以通过使用聚合酶链式反应(PCR)来产生。参见，例如，Saiki et al.，Science 239：487(1988)。如果需要，也可以通过同聚物加尾来修饰裂解的载体和DNA片段。

用于本发明的重组表达载体一般是自我复制的DNA或RNA构建体，其包含编码发明的GDF8肽之一的核酸，通常与适合的遗传控制元件可操作连接，所述遗传控制元件能调节相容的宿主细胞中所述核酸的表达。遗传控制元件可包括原核启动子系统或真核启动子表达控制系统，一般包括转录启动子、任选的操纵子以控制转录的开始，转录增强子以提高mRNA表达水平，编码适合的核糖体结合位点的序列，和终止转录和翻译的序列。表达载体也可含有复制起点，所述复制起点容许载体独立于宿主细胞进行复制。

编码发明的GDF8肽的核酸的表达可以在原核或真核细胞中以常规方法进行。

DNA“编码序列”或“编码”特定蛋白或肽的“序列”，是指一种DNA序列，当置于适合的调节元件的控制下时在体外或体内被转录和翻译为多肽。编码序列的边界由5′-末端的起始密码子和3′-末端的翻译终止密码子决定。编码序列可以包括，但不限于，原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列，和甚至是合成的DNA序列。转录终止序列通常位于编码序列的3′。

如在此使用的，术语“融合蛋白”和“融合肽”可互换地使用，涵盖“嵌合蛋白和/或嵌合肽”和融合“内含蛋白/肽”。融合蛋白包含通过肽键与另一个蛋白的至少一部分连接的本发明的GDF8肽的至少一部分。例如，融合蛋白可以包含标记蛋白或肽，或有助本发明的GDF8肽的分离和/或纯化和/或抗原性的蛋白质或肽。GDF8融合蛋白可包含通过肽键与GDF8多肽的至少一部分连接的非GDF8蛋白的至少一部分。在优选的实施方式中，GDF8的一部分是功能性的，即，保持了它的抗原性。非GDF8序列可以是GDF8序列的氨基或羧基末端。

编码这种融合蛋白的重组DNA分子包含按阅读框与GDF8编码序列连接的编码非GDF8蛋白的至少一部分的序列，并可编码特异性蛋白酶，例如凝血酶或因子Xa的裂解位点，优选的位于或接近于GDF8序列和非GDF8序列之间的连接点。在特定的实施方式中，所述融合蛋白在CHO细胞中表达。通过使用特异于融合到GDF8肽的蛋白和/或标记的亲和层析柱，这种融合蛋白可用于分离本发明的GDF8肽。例如，然后可以通过使用蛋白水解酶和裂解位点，例如上文已经提及的，从融合蛋白上释放纯化的GDF8肽。

在一个这种实施方式中，可以制备嵌合的GDF8肽，例如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白，麦芽糖结合蛋白(MBP)融合蛋白，或聚组氨酸标记的融合蛋白，用于在任何细胞中表达，或作为选择在无细胞系统中表达。例如，GST结合与固相支持基质缀合的谷胱甘肽，MBP结合麦芽糖基质，聚组氨酸与Ni-螯合支持基质螯合。可以用合适的缓冲液将融合蛋白从特定基质洗脱下来，或通过用特异于裂解位点或如上所述的聚组氨酸的蛋白酶处理，所述裂解位点通常被工程化到GDF8肽与如下例示的融合配偶体(例如，GST、BMP、FLAG)或上述多聚His之间。

如在此使用的“异源核苷酸序列”是指通过重组方法添加到本发明的核苷酸序列的核苷酸序列，来形成在自然中不会天然形成的核酸。这样的核酸可以编码融合(例如，嵌合的)蛋白。因而异源核苷酸序列可以编码含有调节和/或结构性质的肽和/或蛋白。在另一个这样的实施方式中，异源核苷酸序列可以编码一种蛋白或肽，在重组核酸表达之后，所述蛋白或肽作为检测由本发明的核苷酸序列编码的蛋白或肽的手段起作用。在再另一个实施方式中，异源核苷酸序列可以作为检测本发明的核苷酸序列的手段起作用。异源核苷酸序列可以包含非编码序列，所述非编码序列包括限制性位点、调节位点、启动子等等。

“宿主细胞”是短暂地或永久地含有外源核酸分子，或能够含有并表达外源核酸分子的细胞。当外源DNA被导入细胞膜内时，则细胞被这种外源DNA“转化”。外源DNA可以或可以不整合(共价连接)到构成细胞的基因组的染色体DNA中。例如，在原核生物和酵母中，外源DNA可以被维持在游离的元件，例如质粒上。对于真核细胞，稳定转化的细胞是其中外源DNA已经整合到染色体中的细胞，从而外源DNA通过染色体复制被子代细胞继承。通过真核细胞建立细胞系或克隆的能力来证明这种稳定性，所述细胞系或克隆包括含外源DNA的子代细胞群体。

原核生物包括革兰氏阴性和阳性有机体，例如，E.coli和B.subtilis。高等真核生物包括从动物细胞建立的组织培养细胞系，是非哺乳动物来源的，例如，昆虫细胞和鸟类，和哺乳动物来源的，例如，人类、灵长类和啮齿动物。

原核的宿主-载体系统包括用于许多不同物种的各种载体。如在此使用的，一般地使用E.coli和它的载体来包括用于其他原核生物的等同载体。用于扩增DNA的代表性载体是pBR322或它的许多衍生物。可用于表达GDF8、和/或GDF8肽的载体包括但不限于，含有lac启动子(pUC系列)；trp启动子(pBR322-trp)；lpp启动子(pIN-系列)；lambda-pP或pR启动子(pOTS)；或杂交启动子例如ptac(pDR540)的那些。参见Brosius et al.，″Expression Vectors EmployingLambda-，trp-，lac-，and Ipp-derived Promoters″，in Rodriguez andDenhardt(eds.)Vectors：A Survey of Molecular Cloning Vectors and TheirUses，1988，Buttersworth，Boston，pp.205-236。

酵母，以及高等真核组织培养细胞是重组生产发明的GDF8肽、和/或抗GDF8抗体和/或这些抗体的片断的优选的宿主。尽管可以使用任何高等真核组织培养细胞系，包括昆虫杆状病毒表达系统，哺乳动物细胞是优选的。这种细胞的转化或转染和增殖已经成为常规的程序。有用细胞系的实例包括HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、婴儿大鼠肾(BRK)细胞系、昆虫细胞系、鸟细胞系和猴(COS)细胞系。

用于这种细胞系的表达载体通常包括，例如，复制起点、启动子、翻译起始位点、RNA剪接位点(如果使用基因组DNA)、多聚腺苷酸位点和转录终止位点。这些载体通常还含有选择基因或扩增基因。适合的表达载体可以是质粒、病毒或逆转录病毒，携带例如来自这种来源，如腺病毒、SV40、细小病毒、牛痘病毒或巨细胞病毒的启动子。适合的表达载体的代表性实例包括pCR^3.1、pCDNA1、pCD[Okayamaet al.，Mol.Cell Biol.5：1136(1985)]、pMC1 neo Poly-A[Thomas et al.，Cell 51：503(1987)]、pUC19、pREP8、pSVSPORT和其衍生物，和杆状病毒载体，例如pAC 373或pAC 610。

一般使用的原核表达控制序列包括启动子，包括来源于β-内酰胺酶和乳糖启动子系统[Chang et al.，Nature，198：1056(1977)]、色氨酸(trp)启动子系统[Goeddel et al.，Nucleic Acids Res.8：4057(1980)]、lambda P_L启动子系统[Shimatake et al.，Nature，292：128(1981)]和tac启动子[De Boer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 292：128(1983)]的那些。含有这种控制序列的许多表达载体是本领域已知的和商业上可获得的。

“可操作连接”是指元件的排列，其中如此描述的成分被配置以进行它们的普通功能。因而，与编码序列可操作连接的控制元件能够影响编码序列的表达。所述控制元件不必是与编码序列连续的，只要它们起作用来指导编码序列的表达。因而，例如，非翻译但转录的插入序列可以位于启动子和编码序列之间，而启动子仍被认为是与编码序列“可操作连接的”。

本发明还包括与发明的GDF8肽特异性结合的多克隆和单克隆的(mAb)抗体。如在此使用的，术语“抗体”是指免疫球蛋白和/或其片段。天然发生的免疫球蛋白由一种或多种基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成。公认的免疫球蛋白基因包括kappa、lambda、α、gamma、delta、epsilon和mu恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。根据本发明的抗体还涵盖抗体片段，即，抗原结合片段，例如，Fv、Fab和F(ab′)₂，工程化的单链结合蛋白(例如，Hustonet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85，5879-5883(1988)和Bird et al.，Science，242，423-426(1988)，据此通过引用完全地合并在此)，以及双功能杂交抗体(例如，Lanzavecchia et al.，Eur.J.Immunol.17，105(1987))。[一般地，参见，Hood et al.，Immunology，Benjamin，N.Y.，2nd ed.(1984)，Harlow and Lane， Antibodies.A Laboratorv Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)和Hunkapiller and Hood，Nature，323，15-16(1986)，它们的所有内容通过引用合并在此。]

例如，使用标准方法从用发明的GDF8肽免疫的动物产生的血清可以直接使用，或IgG部分可以使用标准方法从血清分离，例如血浆去除术或用IgG特异性吸附剂吸附层析，特异性吸附剂例如固定化的蛋白A或蛋白G。做为选择，可以制备单克隆抗体，任选的，来自这种mAbs的抗原结合片段或重组结合蛋白。这种MAbs或其片段任选的可以通过本领域已知的方法进行人源化。

通过公知的技术来产生杂交瘤，所述杂交瘤产生选择性结合本发明的GDF8肽的mAbs。通常，该过程包括永生细胞系与产生期望抗体的B-淋巴细胞融合。做为选择，可以使用产生永生抗体生产细胞系的非融合技术，例如，病毒诱导的转化[Casali et al.，Science 234：476(1986)]。永生细胞系通常是转化了的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人类来源的骨髓瘤细胞。最经常地，为了方便和可用性起见，使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。

从注射了抗原的哺乳动物获得抗体生产淋巴细胞的技术是公知的。一般地，如果采用的是人类来源的细胞，使用外周血淋巴细胞(PBL)，或使用来自非人类哺乳动物来源的脾脏或淋巴结细胞。用重复剂量的纯化抗原注射宿主动物(人类细胞在体外致敏)，在收获细胞用于与永生细胞系融合之前，允许动物产生期望的抗体生产细胞。融合的技术也是本领域公知的，一般地，包括将细胞与融合试剂，例如聚乙二醇混合。

通过标准程序选择杂交瘤，例如HAT(次黄嘌呤-氨蝶呤-胸腺嘧啶核苷)选择。使用标准的免疫测定，例如Western印迹、ELISA(酶联免疫吸附测定)、RIA(放射性免疫测定)等等，选择分泌期望的抗体的那些杂交瘤。使用标准的蛋白纯化技术从培养基回收抗体[Tijssen，Practice and Theory of Enzyme Immunoassays(Elsevier，Amsterdam，1985)]。

可以获得许多参考文献来提供使用上述技术的指导[Kohler et al.，Hybridoma Techniques(Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1980)；Tijssen，Practice and Theory of Enzyme Immunoassays(Elsevier，Amsterdam，1985)；Campbell，Monoclonal Antibody Technology(Elsevier，Amsterdam，1984)；Hurrell，Monoclonal HybridomaAntibodies：Techniques and Applications(CRC Press，Boca Raton，FL，1982)]。也可以使用公知的噬菌体文库系统来产生单克隆抗体。参见，例如，Huse，et al.，Science 246：1275(1989)；Ward，et al.，Nature，341：544(1989)。

可以使用如此产生的抗体，无论是多克隆的或单克隆的，例如，以通过公知方法与固相支持物结合的固定化形式，来通过免疫亲和层析纯化GDF8肽。

也可以使用针对GDF8肽的抗体，未标记的或通过标准方法标记的，作为进行免疫测定来检测或定量GDF8的基础。使用的特定标记将取决于免疫测定的种类。可以使用的标记物的实例包括，但不限于，放射性标记、例如³²P、¹²⁵I、³H和¹⁴C；荧光标记物，例如荧光素和其衍生物，罗丹明和其衍生物，丹磺酰和伞形酮；化学发光剂，例如荧光素和2，3-二氢酞嗪二酮(2，3-dihydrophthalazinediones)；和酶，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、溶菌酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。

可以通过已知方法用这种标记物来标记抗体。例如，可以使用偶联剂，例如醛、碳二亚胺、二马来酰亚胺、imidates、琥珀酰亚胺、bisdiazotized benzadine等等，来标记带有荧光、化学发光或酶标记物的抗体。涉及的一般方法是本领域公知的，在例如Immunoassay：APractical Guide，1987，Chan(Ed.)，Academic Press，Inc.，Orlando，FL中描述。例如，可以对受体的纯化期间获得的部分进行这种免疫测定。

本发明的抗体也可以用于鉴定表达克隆系统中表达GDF8相关多肽的特定cDNA克隆。也可以使用特异于受体的配体结合位点的中和抗体作为拮抗物(抑制物)来阻断或下调GDF8功能。可以通过常规实验容易地鉴定这样的中和抗体，如以下提供的实施例所例示的。

可以使用完全抗体分子，或公知的抗原结合片段，例如Fab、Fc、F(ab)₂和Fv片段实现对GDF8活性的拮抗。这种片段的定义可以在上文的描述中，或在Klein，Immunology(John Wiley，New York，1982)；Parham，Chapter 14，in Weir，ed.Immunochemistry，4th Ed.(BlackwellScientific Publishers，Oxford，1986)中找到。也已经描述了抗体片段的用途和产生，例如：Fab片段[Tijssen，Practice and Theory of EnzymeImmunoassays(Elsevier，Amsterdam，1985)]、Fv片段[Hochman et al.，Biochemistry 12：1130(1973)；Sharon et al.，Biochemistry 15：1591(1976)；Ehrlich et al.，美国专利No.4,355,023]和抗体半分子(Auditore-Hargreaves，美国专利No.4,470,925)。例如，由Moore等(美国专利No.4,642,334)和由Plückthun[Bio/Technology 9：545(1991)]，已经进一步描述了根据已知的抗体重链和轻链可变区序列制造重组Fv片段的方法。做为选择，它们可以通过标准方法化学地合成。

本发明还涵盖多克隆的和单克隆的抗独特型抗体，其是使用上述抗体作为抗原产生的。这些抗体是有用的，因为它们可能模拟了配体的结构。

                    肽合成

由于发明的GDF8肽，例如下文中例示的DJ5肽是相对短的(例如，优选的50个氨基酸残基或更少)，它们可以通过本领域已知的肽合成方法来制备。使用固相、液相或肽缩合技术、或它们的任意组合的公知技术制备的合成肽或多肽可以包括天然的和非天然的氨基酸。用于肽合成的氨基酸可以是根据Merrifield[J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2154(1963)]的原始固相程序的标准的保护、中和、偶联和洗涤方案的、标准的Boc(N_α-氨基保护的N_α-t-丁氧基羰基)氨基酸树脂，或是Carpino和Han[J.Org.Chem.，37：3403-3409(1972)]首先描述的碱不稳定N_α-氨基保护的9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)氨基酸。Fmoc和Boc N_α-氨基保护的氨基酸都可以从Fluka、Bachem、Advanced Chemtech、Sigma、Cambridge Research Biochemical、Bachem、或Peninsula Labs或本领域技术人员熟知的其他化学药品公司获得。此外，本发明的方法也可以运用本领域技术人员熟知的其他N_α-保护基团。固相肽合成可以通过本领域技术人员熟知的和在例如Stewart and Young， SOLID PHASE SYNTHESIS，Second Edition，Pierce Chemical Co.，Rockford，III.(1984)；Fields and Noble，Int.J.Pept.Protein Res.35：161-214(1990)中提供的技术来实现，或使用自动化合成仪，例如由ABS[Applied Biosystems，850 Lincoln Centre Drive，Foster City，CA 94404 USA]出售的自动化合成仪来实现。因而，本发明的GDF8肽可以包含D-氨基酸、D-和L-氨基酸的组合、和各种“设计师”氨基酸(例如，beta-甲基氨基酸、C_α-甲基氨基酸，和N_α-甲基氨基酸，等等)，来赋予特殊的性质。合成性氨基酸包括用于赖氨酸的鸟氨酸、用于苯丙氨酸的氟苯丙氨酸、和用于亮氨酸或异亮氨酸的正亮氨酸。另外，通过在特定的偶联步骤指定特定的氨基酸，可以产生α螺旋、β转角、β折叠、γ转角和环肽。

                    抗GDF8抗血清

本发明的方法包括针对多克隆抗GDF8抗血清筛选GDF8肽的过程。该过程鉴定了某些抗GDF8抗体以高度特异性方式结合的表位。通过用前体GDF8免疫动物获得抗GDF8抗血清。修饰前体GDF8基因以提供优化了表达和免疫原性的形式。例如，优化GDF8激素原的天然DNA序列(SEQ ID NO：2)用于在哺乳动物和病毒表达系统中表达。此外，进行改变以避免病毒宿主停止机制的消极影响。一般地，病毒宿主停止机制包括转录控制、RNA稳定性(剪接)等等。这些改变使得核酸更不像宿主而更象病毒。

进一步的，优选的设计DNA序列尽可能地异于哺乳动物核酸序列。例如，使用酵母偏爱的密码子将前体GDF8的氨基酸序列反向翻译。检查产生的序列中保持了与人类GDF8核酸序列的同源性的密码子。可能时，用编码相同氨基酸的次最优选的酵母密码子替换这些密码子。

产生的优化基因(SEQ ID NO：3)可以在任何适合的宿主系统中表达，包括，例如，本领域已知的昆虫、哺乳动物、细菌、病毒和酵母表达系统。例如，昆虫细胞表达系统，如杆状病毒系统，是本领域公知的，由例如Summers and Smith，Texas Agricultural ExperimentStation Bulletin No.1555(1987)描述了。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法是商业上可获得的，以试剂盒形式来自特别是Invitrogen，San Diego Calif.(“MaxBac”试剂盒)。类似地，细菌和哺乳动物细胞表达系统是本领域公知的，由例如Sambrook等描述了( MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL；DNACloning，Vols.l and II；D.N.Glover ed.)。酵母表达系统也是本领域已知的，由例如 YEAST GENETIC ENGINEERING(Barr et al.，eds.，1989)Butterworths，London描述了。许多其他这样的表达系统是本领域已知的，可以试剂盒的形式商业上获得。如在此例示的，修饰的前体GDF8基因(SEQ ID NO：3)在Flp-In^TM CHO表达系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)中表达，在以下的实施例1中更详细地描述。

前体GDF8蛋白以及成熟GDF8蛋白的肽可以掺入任何蛋白或肽兼容性疫苗组合物。这种疫苗组合物是本领域公知的，包括，例如，生理学相容的缓冲液和盐水等等，以及佐剂，如在下文中更详细描述的。使用包括前体GDF8蛋白的疫苗组合物来引发抗血清，用于筛选和鉴定抗GDF8抗体的特异性中和表位。

如在此例示的，由包含SEQ ID NO：3的载体表达的纯化的前体GDF8蛋白，在包括乳化入弗氏完全佐剂(CFA)的1g前体GDF8蛋白的疫苗组合物中，注射到山羊体内。疫苗组合物优选的皮下地(SC)注射到山羊的皮肤之下。随后的强化免疫是优选的。这可以以适合的其他间隔用相同或降低剂量的蛋白施用，例如，在初次注射后以2-5周的间隔。

根据需要，从初次注射后约两周后开始，但优选的在更长的时间之后开始，例如，三到十五周，或更长，从免疫的动物收集血清。然后通过常规的免疫球蛋白纯化步骤，例如蛋白A-Sepharose、蛋白G-琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或用适合的配体亲和层析，优选地将收集的血清纯化和/或分级。如在此例示的，在蛋白G琼脂糖柱上将血清的IgG部分进一步分级。

然后可获得抗GDF8抗血清IgG部分，用于针对成熟GDF8的肽范围进行筛选，在下文中实施例3更详细地描述。

                    GDF8结合表位

使适合的抗GDF8单克隆或多克隆抗体与GDF8蛋白接触，持续足够抗体选择性结合蛋白的时间。此后，GDF8生物测定证实，抗体中和了基本上所有的GDF8蛋白活性。虽然为此目的可以采用任何GDF8生物测定，如下文的实施例3中例示的，根据Thies等，2001，(GrowthFactors 18，251)的体外转录活性分析是优选的。

一般地，根据本发明作为抗原或结合表位有用的GDF8肽包括GDF8(SEQ ID NO：1)的约残基312到约残基361。特别地，根据本发明的肽包括GDF8(SEQ ID NO：1)的约残基320到约残基350。所述肽优选的包括GDF8(SEQ ID NO：1)的约残基327到约残基346。

技术人员将理解，可以容易地修改发明的GDF8肽，来包括至少一个保守性氨基酸替换，在任何位置。优选的，这种肽特异性结合大鼠单克隆抗体788，如在下文例示的。这种保守性替换可以包括，例如，在残基328、329和335的改变，和它们的组合，其中氨基酸残基328是His、Leu、Asn或Val；氨基酸残基329是Lys或Leu；和氨基酸残基335是Ser或Pro或Thr。如附图2所说明的，在物种之间，在GDF8蛋白序列内，前体GDF8残基328、329和335有不同，然而成熟的GDF8保持了功能。

附图1说明了在GDF8的前体蛋白的范围中，(形成成熟的蛋白的)GDF8活性区的图谱。在GDF8活性区的图谱之上是七个重叠肽的位置。设计这些重叠肽来提供鉴定抗体结合表位或GDF8表位的靶点。标记为DJ5的肽是用例示的山羊抗GDF8抗血清的IgG部分筛选鉴定出的，是对于例示的抗血清的唯一重要的GDF8结合表位。这个肽具有相应于前体GDF8(SEQ ID NO：1)的残基327到残基346的序列(SEQ ID NO：8)。

                    GDF8肽疫苗组合物

优选的将如上所述的GDF8肽配制成疫苗组合物。可以采用这些疫苗组合物来免疫动物，以引发高特异性抗GDF8免疫反应。免疫的结果将是在免疫的动物中下调GDF8的功能。这种疫苗组合物是本领域公知的，包括，例如，生理学相容的缓冲液、防腐剂和盐水等等，以及佐剂。

“佐剂”是非特异性提高针对特定抗原的免疫反应的试剂，因而降低了在任何给定疫苗中所需的抗原数量、和/或为产生针对目标抗原的充分免疫反应所需的注射次数。用于动物疫苗接种的适合的佐剂包括，但不限于，佐剂65(含有花生油、二缩甘露醇一油酸酯和单硬脂酸铝)；弗氏完全或不完全佐剂；矿物质凝胶，例如氢氧化铝、磷酸铝和明矾；表面活性剂，例如十六烷基胺、十八胺、溶血卵磷脂、溴化二甲基双十八烷基铵、N，N-双十八烷基-N′，N′-二(2-羟甲基)丙二胺、甲氧基十六烷基甘油和复合多元醇(pluronic polyols)；聚阴离子，例如吡喃、葡聚糖硫酸酯、poly IC、聚丙烯酸和卡波普；肽，例如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸和特夫素(tuftsin)；和油乳剂。也可以在掺入脂质体或其他微载运体(microcarriers)中之后施用蛋白或肽。例如，由P.Tijssen，Practice and Theory of Enzyme Immunoassays，3rdEdition，1987，Elsevier，New York系列地公开了关于佐剂和免疫测定的各个方面的信息，通过引用合并在此。

疫苗组合物包括足够数量的期望的免疫原，例如发明的GDF8肽，来引发免疫反应。相对于动物的质量而言，施用的数量可以从约0.0001g/kg到约1.0g/kg。可以容易地采用任何适合的脊椎动物来获得多克隆的抗血清。优选的，动物是哺乳动物，包括但不限于，啮齿动物，例如小鼠、大鼠、兔，马，犬，猫，牛，羊，例如，山羊和绵羊，灵长类，例如，猴，巨猿和人类，等等。

通过任何标准的途径容易地施用疫苗组合物，包括静脉内、肌内、皮下、腹膜内、卵内(特别对于家禽)、和/或口服，对于鱼类物种，施用疫苗组合物或免疫原性组合物的方法包括上述的，以及将鱼类浸入包含抗原性浓度的肽的水中，当鱼类暂时与水分离时喷洒抗原性浓度的肽，等等。技术人员将理解，优选的根据每种类型的接受者动物和给药途径适当地配制疫苗组合物。

合适的动物受试者可以包括那些野生的动物、家畜(例如，为了肉、奶、黄油、蛋、毛皮、皮革、羽毛和/或绒毛饲养的)、役畜、研究动物、陪伴动物，以及为/在动物园、野生栖息地和/或马戏团饲养的那些动物。在特定的实施方式中，动物是巨猿，例如大猩猩，或是人类。

在一个优选的实施方式中，所述动物是“食物生产”动物，免疫的结果是相对于未免疫的动物，在动物体重、特别是肌肉决上的增加。对于本发明的目的，术语“食物生产”动物应理解为包括所有为了人类和/或其他动物消费、或为了产生消费品例如蛋或奶而培育的动物。这种动物的非限制性列表包括禽类(例如，鸡、火鸡、鸭、鹅、鸵鸟)，牛(例如，菜牛/犊牛、奶牛、种牛、水牛)，猪(例如，肉猪或猪)，羊(例如，山羊或绵羊)，马类(例如，马)以及水族动物，包括贝类和鱼类，例如鳟鱼或鲑鱼，和其他用于人类消费而饲养或捕捞的物种。

对本发明来说，术语“鱼类”应理解为包括而不限于鱼类的Teleosti类群，即，硬骨鱼。Salmoniformes(鲑)目(包括Salmonidae科)和Perciformes(鲈形)目(包括Centrarchidae科)都包含在Teleosti类群中。

可能的鱼类接受者的实例包括Salmonidae科、Serranidae科、Sparidae科、Cichlidae科、Centrarchidae科、三横带髭鲷(three-LineGrunt，Parapristipoma trilineatum)，和Blue-Eyed Plecostomus(Plecostomus spp)。

                Salmonidae(鲑科)科

分类名                         常用名

Coregonus clupeaformis         Lake whitefish(欧白鲑)

Coregonus hoyi                 Bloater(鲱鱼)

Oncorhynchus keta              Chum salmon(大麻哈鱼)

Oncorhynchus gorbuscha         Pink salmon(细鳞大麻哈鱼)

Oncorhynchus kisutch           Coho salmon(silver salmon)(银

                              鲑(银大麻哈鱼))

Oncorhynchus masou            cherry salmon(masou salmon)(马

                              苏大麻哈鱼(马苏鲑鱼))

Oncorhynchus nerka            Sockeye salmon(红大麻哈鱼)

Oncorhynchus tshawytscha      (chinook salmon)(大鳞大麻哈

                              鱼)

Prosopium cylindraceum        Round whitefish(柱白鲑)

Oncorhynchuts clarki          Cutthroat trout(美洲鲑)

Oncorhynchus mykiss           Rainbow trout(虹鳟)

Salmo salar                   Atlantic salmon(大西洋鲑)

Salmo trutta                  Brown trout(褐鳟)

Salmo trutta X S.fontinalis   Tiger hybrid-trout(虎杂交鳟鱼)

Salvelinus alpinus            Arctic charr(北极嘉鱼)

Salvelinus confluentus        Bull trout(海鳟)

Salvelinus fontinalis         Brook trout(河鳟)

Salvelinus leucomaenis        Japanese charr(white spotted

                              charr)(日本嘉鱼(白斑嘉鱼))

Salvelinus malma              Dolly varden(Miyabe charr)

Salvelinus namaycush          Lake trout(湖鳟)

Thymallus thymallus           Grayling(河鳟)

            Serranidae科的某些成员

分类名                        常用名

Centropristis ocyurus         Bank sea bass(岸海鲈)

Centropristis philadelphicus  Rock sea bass(岩海鲈)

Centropristis striata         Black sea bass(黑海鲈)

Diplectrum bivittatum         Dwarf sandperch

Diplectrum formosum           Sand perch(黄尾石首鱼)

Epinephelus flavolimbatus     Yellowedge grouper(黄缘石斑

                              鱼)

Epinephelus morio             Red grouper(红石斑鱼)

Serranus phoebe               Tattler

Serranus tortugarum           Chalk bass

            Serranidae科的某些成员

分类名                        常用名

Archosargus probatocephalus   Sheepshead(红鲈)

Archosargus rhomboidalis      Sea bream(海鲷)

Calamus penna                 Sheepshead porgy(羊头原鲷)

Lagodon rhomboides            Pinfish

Pagrus Major                  Red Sea bream(红海鲷)

sparus aurata                 Gilthead Sea bream(金头海

                              鲷)

Stenotomus chrysops           Scup(尖口鲷)

            Cichlidae科的某些成员

分类名                        常用名

Aepuidens latifrons           Blue acara

Cichlisoma nigrofasciatum     Congo cichlid(刚果丽鱼)

Crenichichla sp.              Pike cichlid(尖头丽鱼)

Pterophyllum scalare          Angel fish(神仙鱼)

Tilapia mossambica            Mozambique mouth breeder(莫桑

                              比克口育鱼)

Oreochromis sp.               Tilapia

Sarotherodon aurea            Golden Tilapia

            Centrarchidae科的某些成员

分类名                        常用名

Ambloplites rupestris         Rock bass(岩鲈)

Centrarchus macropterus       Flier

Elassoma evergladei           Everglades pigmy sunfish(沼泽地

                              矮小太阳鱼)

Elassoma okefenokee           Okefenokee pigmy sunfish(奥克弗

                              诺基沼泽矮小太阳鱼)

Elassoma zonatum              Banded pigmy sunfish(条纹矮小太

                              阳鱼)

Enneacanthus gloriosus        Bluespotted sunfish(蓝点太阳鱼)

Enneacanthus obesus           Banded sunfish(条纹太阳鱼)

Lepomis auritus               Redbreast sunfish(红胸太阳鱼)

Lepomis cyanellus             Green sunfish(蓝绿鳞鳃太阳鱼)

Lepomis cyanellus X L.gibbous Green x pumpkinseed

Lepomis gibbous               Pumpkinseed

Lepomis gulosus               Warmouth

Lepomis humilis               Orange-spotted sunfish(橙点太阳

                              鱼)

Lepomis macrochirius          Bluegill(大翻车鱼)

Lepomis megalotis             Longear sunfish(长耳太阳鱼)

Micropterus coosae            Shoal bass(滩鲈)

Micropterus dolomieui         Smallmouth bass(小嘴鲈)

Micropterus punctulatus       Spotted bass(斑鲈)

Micropterus salmoides         Largemouth bass(黑鲈)

Pomoxis annulais              White crappie(白色大鳃鲈鱼)

Pomoxis nigromaculatus        Black crappie(黑色大鳃鲈鱼)

在进一步优选的实施方式中，动物是陪伴动物或人类，施用疫苗以提供长期的GDF8下调作用，用于任何对这种GDF8下调作用有反应的兽医学或医学目的。对本发明来说，术语“陪伴”动物应理解为包括所有动物—马类(马)、猫(猫科的)、狗(犬)、啮齿动物，(包括小鼠、大鼠、豚鼠)，兔类，和禽类，例如鸽子、鹦鹉等等。

接受这种疫苗接种或抗体的鸟类可以与商业的或非商业的鸟类饲养有关。这包括，例如，Anatidae(鸭科)，如天鹅，Columbidae(鸠鸽科)，例如，鸽和原鸽，例如家鸽，Phasianidae(雉科)，例如，鹧鸪和松鸡，Thesienidae，Psittacines，例如，长尾鹦鹉、金刚鹦鹉和鹦鹉，例如，由宠物或收藏市场饲养的，和Ratite(平胸类鸟)科的成员。

在另一个优选的实施方式中，免疫任何上述的动物(优选的非人类)来获得与发明的肽特异性结合的抗GDF8抗体，回收引发的抗体用于化验、和/或用于兽医或人类药物，例如，来提供GDF8的下调作用，用于对这种GDF8下调作用有反应的任何兽医学或医学目的。

参考以下非限制性实施例可以更好地理解本发明，所述实施例作为本发明的示范而提供。给出以下实施例是为了更完整地说明本发明的实施方式，决不能认为是限制本发明的宽广的范围。

                    实施例

                    实施例1

                   材料 & 方法

A.前体GDF8(GDF8激素原)的表达和纯化

优化前体GDF8或激素原的天然DNA序列(SEQ ID NO：2)用于在哺乳动物和病毒表达系统中表达。为了避免病毒宿主停止(shutoff)机制的消极影响，设计DNA序列尽可能地异于哺乳动物核酸序列。为了实现这一点，使用酵母偏爱的密码子将GDF8激素原的氨基酸序列反向翻译。检查产生的序列中保持了与人类GDF8核酸序列的同源性的密码子。可能时，用编码相同氨基酸的次最优选的酵母密码子替换这些密码子。商业上合成产生的核酸分子(SEQ ID NO：3)，用于掺入适合的表达载体。

使用Flp-In^TM CHO表达系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)来表达优化的GDF8激素原。简要地，通过将编码修饰的GDF8激素原的基因插入到质粒pCMVtag4B(Stratagene，San Diego，CA.)中来构建含有C-末端FLAG(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)表位融合物的GDF8激素原构建体。FLAG融合标记便于在抗FLAG凝胶柱上分离FLAG融合蛋白。然后将含有修饰的GDF8激素原-FLAG基因的PCR DNA片段克隆到质粒表达载体pcDNA5/FRT(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。通过用含有GDF8-FLAG基因的Flp-In^TM表达载体和Flp重组酶表达质粒POG44共转染Flp-In^TM CHO细胞系，来实现表达GDF8激素原-FLAG融合蛋白的Flp-In^TM CHO细胞系的产生。Flp重组酶通过位点特异性DNA重组来介导Flp-In表达盒插入到基因组中的整合FRT位点。施用匀霉素B选择来获得表达和分泌含有FLAG表位的GDF8激素原的稳定细胞系。

使用标准技术将表达含有FLAG标记的GDF8激素原的稳定CHO细胞系在无血清培养基中进行悬浮培养。使用WAVE生物反应器系统(WAVE Biotech LLC，Bridgewater，NJ)产生含有分泌的GDF8激素原的条件培养基。通过使用抗FLAGM2亲合性凝胶(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)的亲和层析实现FLAG标记的GDF8激素原的纯化。

B.DJ5特异性抗体纯化

通过亲和柱层析来纯化DJ5(SEQ ID NO：8；参见表2，下文)特异性抗体部分。通过将10mg DJ5合成肽偶联到0.8g溴化氰激活的琼脂糖4B(Sigma Genosys，Woodlands，TX)来制备亲和柱。用PBS洗涤和平衡柱。将约11ml山羊IgG部分(10mg/ml)添加到亲和柱，用25ml PBS洗涤。收集1.0ml的级分，监视280nm处的吸光率。用约10ml的0.2M甘氨酸(pH1.85)洗脱结合的材料。收集1.0ml的级分，用0.25ml 0.5M磷酸钠、0.75M NaCl pH7.4中和。针对约25μl等分量的未结合级分1-10和结合级分25-35分析对DJ5肽的ELISA反应性。发现未结合的级分对于DJ5反应性是阴性的。结合级分展现出对DJ5肽反应性的强峰值。将未结合级分1-11和结合级分26-34集中。浓缩集中的样品，如下指示的用磷酸盐缓冲盐水(PBS)交换它们的缓冲液。通过OD 280法( CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY.2.7.3，John Wiley & Sons，Inc.)测定样品浓度。将未结合样品调节到10mg/ml，将结合的样品调节到1mg/ml，用于随后使用。

                    实施例2

            山羊抗GDF8多克隆IgG血清

通过以下方法从免疫的山羊获得山羊抗前体GDF8 IgG。

A.山羊的免疫

用纯化的重组GDF8激素原(如实施例1的描述获得的，如上)免疫Saanen(产奶)山羊(大约2岁雄性)，如下。将半毫克蛋白乳化在弗氏完全佐剂(CFA)中，皮下(SC)注射到山羊的皮肤下。随后在三、六和十周SC施用的强化免疫含有乳化于弗氏不完全佐剂(IFA)中的0.3mg蛋白。用针筒和针从颈静脉收集血液，用真空瓶子和管采取血液。将血液收集在含抗凝剂的瓶中，在2500RPM离心20分钟除去红细胞。将血浆重钙化以产生血清。首次免疫15周后收集的血清样品用于进一步的分析。

B.山羊多克隆IgG的收集和纯化

15周后从山羊收集血清，从该血清中纯化IgG部分，如下。根据厂家的方案(Kirkegaard and Perry Laboratories，Inc.，Gaithersburg，MD)在蛋白G琼脂糖柱上纯化山羊血清的IgG部分。将洗脱的级分收集、浓缩、利用Centriprep离心过滤器(Centriprep YM-10，MilliporeCorporation，Billerica，MA)与磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行缓冲液交换。通过OD 280法(CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY.

Id.)测定样品浓度，调节到10mg/ml。

                    实施例3

                山羊抗血清的表征

上述实施例2提供的山羊抗血清被称为PGA。预期的是，PGA IgG部分含有针对GDF8激素原分子上各种表位的抗体。通过体外转录活性分析来表征PGA抗血清，如下。用来定量测量GDF8生物中和作用的体外转录活性分析基本上是Thies等(Growth Factors 18，251(2001))的。九十六孔组织培养处理的光度计ViewPlate^TM分析平板(PerkinElmer Life and Analytical Sciences，Inc.，Boston，MA)用1.0×10⁵细胞/孔的A204横纹肌肉瘤细胞(ATCC HTB-82)接种，在37℃、5％CO₂湿润的室中孵化。完全A204培养基由McCoy′s 5A培养基、10％胎牛血清、2％L-谷氨酰胺和1％Penn/Strep组成。在达到大于80％的汇合时，用质粒pDPC4-荧光素酶和HCMV IE-lacZ的混合物使用FUGENE转染试剂的厂家(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)推荐的方案瞬时地转染细胞，在37℃、5％CO2、湿润室中孵化16小时。质粒pDPC4-荧光素酶含有CAGA盒的四个拷贝，所述CAGA盒来源于人类纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)，其赋予GDF8对异源启动子报告构建体的反应性。

质粒HCMV IE-lacZ含有处在组成型人类巨细胞病毒即时早期启动子控制下的β-半乳糖苷酶基因。添加该基因作为对照来标准化转染效率。然后用100ng/孔的GDF8蛋白(R & D Systems Inc.，Minneapolis，MN)处理细胞，在37℃、5％CO2、湿润室中孵化额外的16小时。使用Dual-Light Luciferase Assay(Tropix，Applied Biosystems，FosterCity，CA)定量处理的细胞中的荧光素酶和β-半乳糖苷酶。

每个样品进行两份(2孔)。每个孔的信号计算为荧光素酶信号除以β-半乳糖苷酶信号乘以100。样品信号计算为两个孔的平均值。

为了测试抗体样品的生物中和作用活性，在处理细胞之前用各种浓度的纯化IgG部分与GDF8蛋白孵化(4℃大约16小时)。抑制百分比计算为100-(100×样品信号)/(单有GDF8的信号-不添加GDF8的信号)。体外转录活性分析的结果在表1中概述，如下。

                 表1

        山羊血清PGA的GDF8中和滴度

样品(μg IgG)	GDF8活性的抑制％
		山羊-正常(250)山羊-PGA(250)山羊-PGA(125)山羊-PGA(63)山羊-PGA(31)山羊-PGA(16)	0958662223

中和作用分析证实了，收获的山羊血清的IgG部分含有能够中和该活性分析中使用的至少95％GDF8的抗体。

                     实施例4

                山羊多克隆抗体定义

             GDF8蛋白的特异性中和表位

为了确定中和免疫反应的特异性，分析PGA IgG部分与一组七个重叠肽(DJ1-7，参见表2和附图1)的反应性，所述重叠肽横跨活性GDF8蛋白的完整编码区。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定了山羊PGA IgG与每个单独的肽的反应性。基本上如Protein Detector^TMELISA Kit HRP，ABTS System(Kirkegaard and Perry LaboratoriesInc.，Gaithersburg，MD)中的描述进行GDF8肽ELISA。在该分析中使用了以下的修改。合成肽DJ1-7(参见表2，下文)在我们的指导下由ProSci，Inc.(Poway，CA)进行常规合成。用500ng每孔的合成肽，和250ng每孔的纯化GDF8激素原包被平板。初级抗体是来自各种样品的IgG部分。次级抗体以1∶2000的稀释度使用。对于山羊初级抗体样品，次级抗体是抗山羊IgG的兔过氧化物酶标记的抗体。对于大鼠初级抗体样品，次级抗体是抗大鼠IgG的山羊过氧化物酶标记的抗体。用ELISA平板读取器在OD 405nm读取15分钟。ELISA反应性计算为OD 405每分钟乘以1000。

                            表2

                        GDF8活性区肽

名称	坐标*	氨基酸序列
			DJ1DJ2DJ3DJ4DJ5DJ6DJ7	267-286282-301297-316312-331327-346342-361357-375	DFGLDCDEHSTESRCCRYPL    SEQ ID NO：4CRYPLTVDFEAFGWDWIIAP    SEQ ID NO：5WIIAPKRYKANYCSGECEFV    SEQ ID NO：6ECEFVFLQKYPHTHLVHQAN    SEQ ID NO：7VHQANPRGSAGPCCTPTKMS    SEQ ID NO：8PTKMSPINMLYFNGKEQIIY    SEQ ID NO：9EQIIYGKIPAMVVDRCGCS     SEQ ID NO：10

^*相对于人类GDF8激素原(Genebank登记号NP_005250)

表3概述了ELISA的结果，如下。

                    表3

 PGA IgG(10mg/ml)对GDF8活性区肽的ELISA反应性

抗原	OD 405/分钟×1000
				1∶20	1∶40	1∶80
	DJ1*DJ2*DJ3*DJ4*DJ5*DJ6*DJ7*proGDF8**	23303121310194	1001003701196				10002700199

^*肽，^**激素原

PGA IgG部分特异性地与纯化GDF8激素原和DJ5肽都反应。在GDF8活性区肽之中，IgG部分特异性地和专一地与DJ5肽反应。这是强烈的指示，该血清的中和能力是针对DJ5肽定义的表位的。为了确认这个假定，纯化PGA IgG的DJ5特异性部分。通过如材料和方法中描述的亲和层析实现这一点。将PGA抗体分离成DJ5肽结合和不结合部分。分析两种部分对GDF8蛋白的中和作用活性。

表4中的结果显示，GDF8中和能力的大部分在于特异性结合DJ5肽的抗体。这清楚地证明了，DJ5肽定义了GDF8蛋白的中和表位。

                    表4

      DJ5特异性抗体的GDF8中和作用活性

样品(μg IgG)	GDF8活性的抑制％
		山羊-正常(250)**DJ5未结合的IgG(250)DJ5结合的IgG(25)	72690

**从未免疫的山羊血清(商业上购买的)纯化的正常山羊IgG是阴性对照。

好奇地，在初步实验中，当用与钥孔血蓝素缀合的人类DJ5抗原注射两只兔子时，没有获得中和GDF8抗体。可在附图2中看出，相应于DJ5的氨基酸序列对于兔和人类GDF8是相同的，而山羊DJ5的氨基酸序列是不同的。因此，鉴于以上提供的对于山羊的数据，兔的初步数据表明，使用包含与宿主动物GDF8的相应区域/部分不同的氨基酸序列的DJ5抗原可能是有益的。因而，在这种情况下，重组人类GDF8激素原在山羊中诱导生物中和抗体的能力可能至少在某种程度上由于这一事实，即使用的抗原包含了在GDF8的DJ5区域/部分中由单个氨基酸替换而不同于宿主序列的氨基酸序列[参见，附图2中的氨基酸残基333]。更特别的，如附图2所示，人类序列中Arg333被山羊序列中的Lys333残基替代。这个单独的保守性氨基酸替换可能构成一种改变，该改变对于引起蛋白“外源于”山羊免疫监视系统是足够显著的。

                    实施例5

            GDF8中和大鼠mAB 788定义

            GDF8蛋白的特异性中和表位

报告了大鼠单克隆抗体788能中和小鼠GDF8生物活性(R & DSystems Inc.，Cat.No.MAB788，Minneapolis，MN)。为了确认这个结果，我们分析了该单克隆抗体针对GDF8蛋白的中和活性。如上述实施例2描述的表征该抗体。这个分析的结果在表5中概述，如下。

                  表5

    单克隆抗体788的GDF8中和作用滴度

样品(μg IgG)	GDF8活性的抑制％
		MAB-788(12.5)MAB-788(6.3)MAB-788(3.1)MAB-788(1.8)MAB-788(0.1)	4717700

表5证实了这个抗体能够中和GDF8蛋白的活性。为了确定这个中和免疫反应的特异性，分析大鼠单克隆抗体与一组七个重叠肽(DJ1-7，参见表2和附图1)的反应性，这些重叠肽横跨活性GDF8蛋白的完整编码区。通过ELISA分析(参见材料和方法)测定了该单克隆抗体与每个单独的肽的反应性。

                   表6

大鼠MAB 788(10mg/ml)对GDF8活性区肽的ELISA反应性

抗原	OD 405/分钟×1000
				1∶20	1∶40	1∶80
	DJ1*DJ2*DJ3*DJ4*DJ5*DJ6*DJ7*proGDF8**	400013300132	000011800127				000010200132

^*肽，^**蛋白

大鼠单克隆抗体特异性地与纯化GDF8激素原和DJ5肽都反应。一般地，单克隆抗体具有对单个表位的单特异性。在GDF8活性区肽之中，这个单克隆抗体特异性地和专一地与DJ5肽反应。这个结果提供进一步的独立证据，DJ5肽定义了GDF8蛋白的中和表位。

可以进行对本发明的许多修改和变化而不背离它的精神和范围，这对于本领域的技术人员是显而易见的。在此描述的特定实施方式仅通过举例的方式来提供，本发明仅由附随的权利要求的用语、以及这些权利要求所享有的等同物的完全范围来限定。在说明书中引用的许多参考文献，包括所公开的和/或因特网公开的核酸和多肽/蛋白序列的Genebank登记号，通过引用将其中公开的内容完全地合并。

                        序列表

<110>Schering-Plough Ltd.

     Junker，David

     Cochran，Mark D.

<120>基于中和表位的生长增强疫苗

<130>AH 06148

<150>60/533,719

<151>2003-12-31

<160>36

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>375

<212>PRT

<213>人类

<220>

<221>肽

<222>(267)..(286)

<223>DJ1

<220>

<221>肽

<222>(282)..(301)

<223>DJ2

<220>

<221>肽

<222>(297)..(316)

<223>DJ3

<220>

<221>肽

<222>(312)..(331)

<223>DJ4

<220>

<221>肽

<222>(327)..(346)

<223>DJ5

<220>

<221>肽

<222>(342)..(361)

<223>DJ6

<220>

<221>肽

<222>(357)..(375)

<223>DJ7

<400>1

Met Gln Lys Leu Gln Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile

1               5                   10                  15

Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn

            20                  25                  30

Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr

        35                  40                  45

Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu

    50                  55                  60

Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Val Ile Arg Gln Leu

65                  70                  75                  80

Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val

                85                  90                  95

Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His

            100                 105                 110

Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu

        115                 120                 125

Met Gln Val Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser

    130                 135                 140

Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu

145                 150                 155                 160

Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu

                165                 170                 175

Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu

            180                 185                 190

Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val

        195                 200                 205

Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly

    210                 215                 220

Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr

225                 230                 235                 240

Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys

                245                 250                 255

Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys

            260                 265                 270

Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val

        275                 280                 285

Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr

    290                 295                 300

Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys

305                 310                 315                 320

Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala

                325                 330                 335

Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr

            340                 345                 350

Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val

        355                 360                 365

Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser

    370                 375

<210>2

<211>2823

<212>DNA

<213>人类

<220>

<221>misc_feature

<222>(134)..(1261)

<223>编码前体GDF8

<220>

<221>肽

<222>(1112)..(1171)

<223>编码DJ5

<400>2

agattcactg gtgtggcaag ttgtctctca gactgtacat gcattaaaat tttgcttggc     60

attactcaaa agcaaaagaa aagtaaaagg aagaaacaag aacaagaaaa aagattatat    120

tgattttaaa atcatgcaaa aactgcaact ctgtgtttat atttacctgt ttatgctgat     180

tgttgctggt ccagtggatc taaatgagaa cagtgagcaa aaagaaaatg tggaaaaaga     240

ggggctgtgt aatgcatgta cttggagaca aaacactaaa tcttcaagaa tagaagccat     300

taagatacaa atcctcagta aacttcgtct ggaaacagct cctaacatca gcaaagatgt     360

tataagacaa cttttaccca aagctcctcc actccgggaa ctgattgatc agtatgatgt     420

ccagagggat gacagcagcg atggctcttt ggaagatgac gattatcacg ctacaacgga     480

aacaatcatt accatgccta cagagtctga ttttctaatg caagtggatg gaaaacccaa     540

atgttgcttc tttaaattta gctctaaaat acaatacaat aaagtagtaa aggcccaact     600

atggatatat ttgagacccg tcgagactcc tacaacagtg tttgtgcaaa tcctgagact     660

catcaaacct atgaaagacg gtacaaggta tactggaatc cgatctctga aacttgacat     720

gaacccaggc actggtattt ggcagagcat tgatgtgaag acagtgttgc aaaattggct     780

caaacaacct gaatccaact taggcattga aataaaagct ttagatgaga atggtcatga     840

tcttgctgta accttcccag gaccaggaga agatgggctg aatccgtttt tagaggtcaa     900

ggtaacagac acaccaaaaa gatccagaag ggattttggt cttgactgtg atgagcactc     960

aacagaatca cgatgctgtc gttaccctct aactgtggat tttgaagctt ttggatggga    1020

ttggattatc gctcctaaaa gatataaggc caattactgc tctggagagt gtgaatttgt    1080

atttttacaa aaatatcctc atactcatct ggtacaccaa gcaaacccca gaggttcagc    1140

aggcccttgc tgtactccca caaagatgtc tccaattaat atgctatatt ttaatggcaa    1200

agaacaaata atatatggga aaattccagc gatggtagta gaccgctgtg ggtgctcatg    1260

agatttatat taagcgttca taacttccta aaacatggaa ggttttcccc tcaacaattt    1320

tgaagctgtg aaattaagta ccacaggcta taggcctaga gtatgctaca gtcacttaag    1380

cataagctac agtatgtaaa ctaaaagggg gaatatatgc aatggttggc atttaaccat    1440

ccaaacaaat catacaagaa agttttatga tttccagagt ttttgagcta gaaggagatc    1500

aaattacatt tatgttccta tatattacaa catcggcgag gaaatgaaag cgattctcct    1560

tgagttctga tgaattaaag gagtatgctt taaagtctat ttctttaaag ttttgtttaa    1620

tatttacaga aaaatccaca tacagtattg gtaaaatgca ggattgttat ataccatcat    1680

tcgaatcatc cttaaacact tgaatttata ttgtatggta gtatacttgg taagataaaa    1740

ttccacaaaa atagggatgg tgcagcatat gcaatttcca ttcctattat aattgacaca    1800

gtacattaac aatccatgcc aacggtgcta atacgatagg ctgaatgtct gaggctacca    1860

ggtttatcac ataaaaaaca ttcagtaaaa tagtaagttt ctcttttctt caggggcatt    1920

ttcctacacc tccaaatgag gaatggattt tctttaatgt aagaagaatc atttttctag    1980

aggttggctt tcaattctgt agcatacttg gagaaactgc attatcttaa aaggcagtca    2040

aatggtgttt gtttttatca aaatgtcaaa ataacatact tggagaagta tgtaattttg    2100

tctttggaaa attacaacac tgcctttgca acactgcagt ttttatggta aaataataga    2160

aatgatcgac tctatcaata ttgtataaaa agactgaaac aatgcattta tataatatgt    2220

atacaatatt gttttgtaaa taagtgtctc cttttttatt tactttggta tatttttaca    2280

ctaaggacat ttcaaattaa gtactaaggc acaaagacat gtcatgcatc acagaaaagc    2340

aactacttat atttcagagc aaattagcag attaaatagt ggtcttaaaa ctccatatgt    2400

taatgattag atggttatat tacaatcatt ttatattttt ttacatgatt aacattcact    2460

tatggattca tgatggctgt ataaagtgaa tttgaaattt caatggttta ctgtcattgt    2520

gtttaaatct caacgttcca ttattttaat acttgcaaaa acattactaa gtataccaaa    2580

ataattgact ctattatctg aaatgaagaa taaactgatg ctatctcaac aataactgtt    2640

acttttattt tataatttga taatgaatat atttctgcat ttatttactt ctgttttgta    2700

aattgggatt ttgttaatca aatttattgt actatgacta aatgaaatta tttcttacat    2760

ctaatttgta gaaacagtat aagttatatt aaagtgtttt cacatttttt tgaaagacaa    2820

aaa                                                                  2823

<210>3

<211>1164

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GDF8激素原FLAG标签融合蛋白

<220>

<221>信号肽

<222>(10)..(75)

<220>

<221>misc_feature

<222>(76)..(1131)

<223>编码前体GDF8

<220>

<221>肽

<222>(985)..(1044)

<223>编码DJ5肽

<220>

<221>misc_feature

<222>(1132)..(1161)

<223>编码C-末端FLAG标签

<400>3

atggatctac agaagttgca gttgtgtgtc tacatctatt tgttcatgtt gatcgtcgcc     60

ggacctgttg acttgaacga aaattctgaa cagaaggaga acgttgagaa ggaaggtttg    120

tgcaacgctt gtacatggcg tcaaaataca aagtcctctc gtattgaagc tatcaagatt    180

caaattttgt ctaagttgag attggaaact gccccaaata tttctaagga cgtcattcgt    240

caattgttgc caaaggcccc acctttgaga gaattgatcg accaatacga tgttcaaaga    300

gacgattctt ctgacggttc ccttgaagac gatgactacc atgccactac tgaaactatt     360

atcactatgc caactgaatc cgactttttg atgcaggttg atggtaagcc aaagtgctgt     420

tttttcaagt tctcttccaa gattcaatac aacaaggttg ttaaagctca attgtggatt     480

taccttcgtc cagttgaaac accaactact gtgtttgttc agattttgcg tttgattaag     540

ccaatgaagg atggaactag atacacaggt attagatcct tgaagttgga tatgaatcct     600

ggtacaggaa tctggcaatc tatcgacgtt aaaactgttc ttcaaaactg gttgaagcaa     660

ccagagtcta atttgggtat cgagattaag gccttggacg aaaacggaca tgacttggcc     720

gttacttttc ctggtcctgg tgaagacggt ttgaacccat ttctggaagt taaggttact     780

gatactccta agcgttccag gagagacttc ggattggatt gtgatgaaca ttctactgag     840

tctagatgtt gtagatatcc attgaccgtt gatttcgagg ccttcggttg ggattggatc     900

attgccccaa agagatacaa agctaactat tgttccggtg aatgtgagtt cgttttcttg     960

cagaagtacc cacataccca tttggttcat caggctaatc caagaggatc tgctggtcca    1020

tgttgtaccc caactaaaat gtcccctatc aacatgttgt acttcaacgg taaggagcag    1080

attatttacg gtaagatccc tgctatggtt gttgatagat gtggttgttc tctcgaggat    1140

tacaaggatg acgacgataa gtag                                           1164

<210>4

<211>20

<212>PRT

<213>人类

<220>

<221>misc_feature

<223>DJ1

<400>4

Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys

1               5                   10                  15

Arg Tyr Pro Leu

            20

<210>5

<211>20

<212>PRT

<213>人类

<220>

<221>mise_feature

<223>DJ2

<400>5

Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp

1               5                   10                  15

Ile Ile Ala Pro

            20

<210>6

<211>20

<212>PRT

<213>人类

<220>

<221>misc_feature

<223>DJ3

<400>6

Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu

1               5                   10                  15

Cys Glu Phe Val

            20

<210>7

<211>20

<212>PRT

<213>人类

<220>

<221>misc_feature

<223>DJ4

<400>7

Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val

1               5                   10                  15

His Gln Ala Asn

            20

<210>8

<211>20

<212>PRT

<213>人类

<220>

<221>misc_feature

<223>DJ5

<400>8

Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

<210>9

<211>20

<212>PRT

<213>人类

<220>

<221>misc_feature

<223>DJ6

<400>9

Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu

1               5                   10                  15

Gln Ile Ile Tyr

            20

<210>10

<211>20

<212>PRT

<213>人类

<220>

<221>misc_feature

<223>DJ7

<400>10

Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

<210>11

<211>20

<212>PRT

<213>Anas platyrhynchos

<400>11

Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

<210>12

<211>20

<212>PRT

<213>Anser anser

<400>12

Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

<210>13

<211>20

<212>PRT

<213>Anser anser

<400>13

Val Leu Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

<210>14

<211>20

<212>PRT

<213>Bos taurus

<400>14

Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

<210>15

<211>20

<212>PRT

<213>Canis familiaris

<400>15

Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

<210>16

<211>20

<212>PRT

<213>Capra hircus

<400>16

Val His Gln Ala Asn Pro Lys Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

<210>17

<211>20

<212>PRT

<213>Columba livia

<400>17

Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

<210>18

<211>20

<212>PRT

<213>Coturnix chinensis

<400>18

Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

<210>19

<211>20

<212>PRT

<213>Danio rerio

<400>19

Val Asn Lys Ala Ser Pro Arg Gly Thr Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

<210>20

<211>20

<212>PRT

<213>Equus caballus

<400>20

Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

<210>21

<211>20

<212>PRT

<213>Gallus gallus

<400>21

Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

<210>22

<211>20

<212>PRT

<213>Gallus gallus

<400>22

Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

<210>23

<211>20

<212>PRT

<213>I.punctatus

<400>23

Val Asn Lys Ala Ser Pro Arg Gly Thr Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

<210>24

<211>20

<212>PRT

<213>Lepus capensis

<400>24

Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

<210>25

<211>20

<212>PRT

<213>Macaca fascicularis

<400>25

Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

<210>26

<211>20

<212>PRT

<213>Meleagris gallopavo

<400>26

Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

<210>27

<211>20

<212>PRT

<213>Morone chrysops

<400>27

Val Asn Lys Ala Asn Pro Arg Gly Thr Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

<210>28

<211>20

<212>PRT

<213>Mus musculus

<400>28

Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

<210>29

<211>20

<212>PRT

<213>O.mykiss

<400>29

Val Asn Lys Ala Asn Pro Arg Gly Thr Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

<210>30

<211>20

<212>PRT

<213>Ovis aries

<400>30

Val His Gln Ala Asn Pro Lys Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

<210>31

<211>20

<212>PRT

<213>Papio hamadryas

<400>31

Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

<210>32

<211>20

<212>PRT

<213>Rattus norvegicus

<400>32

Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

<210>33

<211>20

<212>PRT

<213>Salmo salar

<400>33

Val Asn Lys Ala Asn Pro Arg Gly Thr Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

<210>34

<211>20

<212>PRT

<213>Sparus aurata

<400>34

Val Asn Lys Ala Asn Pro Arg Gly Thr Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

<210>35

<211>20

<212>PRT

<213>Sus scrofa

<400>35

Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

<210>36

<211>20

<212>PRT

<213>Sus scrofa

<400>36

Val Leu Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro

1               5                   10                  15

Thr Lys Met Ser

            20

Claims (27)

1.一种由50个或更少的氨基酸残基组成的分离的肽，其包含SEQID NO：1的氨基酸残基327到346。

2.权利要求1的分离的肽，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸残基321到346。

3.权利要求2的分离的肽，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸残基320到350。

4.权利要求3的分离的肽，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸残基312到残基361。

5.一种由50个或更少的氨基酸残基组成的分离的肽，其包含了包含氨基酸替换的SEQ ID NO：1的氨基酸残基327到346；

其中在氨基酸残基327到残基346之间有不超过五个的氨基酸替换；和

其中所述肽特异性结合大鼠单克隆抗体788。

6.权利要求5的分离的肽，包含在选自由残基328、329、331、333和335、和它们的组合构成的组的位置上的氨基酸替换，其中

(a)氨基酸残基328是His、Leu或Asn；

(b)氨基酸残基329是Gln或Lys；

(c)氨基酸残基331是Asn或Ser；

(d)氨基酸残基333是Arg或Lys；和/或

(e)氨基酸残基335是Ser、Pro或Thr。

7.权利要求6的分离的肽，包含在前体GDF8的残基327到残基346之间的不超过一个的氨基酸替换，条件是所述肽特异性结合大鼠单克隆抗体788。

8.权利要求1的分离的肽，其包含抗GDF8抗体的特异性中和表位。

9.权利要求8的分离的肽，其中所述抗体选自由大鼠抗GDF8单克隆抗体788和山羊抗GDF8多克隆抗血清的IgG部分构成的组。

10.包含权利要求1的肽或所述肽的抗原性亚片段的融合蛋白。

11.编码权利要求10的融合蛋白的核酸分子。

12.编码权利要求6的肽的核酸分子。

13.编码权利要求1的肽的核酸分子。

14.权利要求13的核酸分子，其包含SEQ ID NO：2的核苷酸1112到核苷酸1171的核酸序列。

15.包含权利要求13的核酸分子的可复制克隆载体。

16.包含权利要求15的可复制克隆载体的宿主细胞。

17.权利要求16的宿主细胞，其被所述克隆载体转化。

18.权利要求16的宿主细胞，其是真核细胞。

19.生产GDF8肽的方法，包括培养权利要求18的宿主细胞，表达编码的肽和回收所述肽的步骤。

20.包含权利要求1的肽的疫苗组合物。

21.包含权利要求10的融合蛋白的疫苗组合物。

22.权利要求20的疫苗组合物，进一步包含佐剂。

23.在动物中引发抗GDF8免疫反应的方法，包括向所述动物施用有效量的权利要求20的疫苗组合物。

24.从多种抗体或抗体片段中挑选抗GDF8抗体或抗体片段的筛选方法，包括使权利要求1的肽与包含一种或多种抗体或抗体片段的样品接触，和检测选择性地与所述肽结合的抗体或抗体片段。

25.在动物中下调GDF8活性的方法，包括以在所述动物中有效下调GDF8活性的量和时间，向所述动物施用抗体或抗体片段，其中所述抗体特异性结合权利要求1的肽。

26.在动物中下调GDF8活性的方法，包括用有效量的权利要求20的疫苗组合物免疫所述动物。

27.在动物中下调GDF8活性的方法，包括用有效量的权利要求21的疫苗组合物免疫所述动物。

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