CN1856580A

CN1856580A - 可设计的分子条码

Info

Publication number: CN1856580A
Application number: CNA2004800276143A
Authority: CN
Inventors: X·苏; T-W·库; A·伯林; L·孙; N·桑德拉拉扬; M·山川
Original assignee: Intel Corp
Current assignee: Intel Corp
Priority date: 2003-09-24
Filing date: 2004-09-23
Publication date: 2006-11-01
Anticipated expiration: 2024-09-23
Also published as: KR20060094531A; TW200517659A; US20060199216A1; US20050064435A1; WO2005030996A2; CN1856580B; JP2007506431A; TWI302606B; EP1668164A2; US20070054288A1; WO2005030996A3; JP5014789B2

Abstract

本发明涉及产生和/或使用分子条码的方法。在本发明的某些实施方式中，该条码包括含有一个或多个支链结构的聚合物骨架。标签可以与骨架和/或支链结构连接。该条码也可包括探针，该探针可与靶结合，例如蛋白质、核酸和其它生物分子或聚集体。通过标签的类型和位置，可区别不同的条码。在其它实施方式中，通过一个或多个标记寡核苷酸与模板的杂交，产生条码，该模板包括容器部分和探针部分。标记的寡核苷酸可以被设计为模块码部分，以对于不同的靶形成不同的特异性条码。在可选的实施方式中，通过单体单元的聚合，制备条码。结合的条码可以通过各种成像方法进行检测，例如表面等离子体共振法、荧光或拉曼光谱法。

Description

可设计的分子条码

发明领域

[0005] 本方法、组合物和设备涉及分子条码(molecular barcode)领域。本发明的具体实施方式涉及从有机聚合物骨架构建分子条码的方法。通过将标签(tag)连接于骨架上不同的位置，使用同一骨架可以产生多种分子条码。在其它实施方式中，分子条码可以包括探针区域(probe region)和一种或多种码组分(codecomponent)。在其它实施方式中，分子条码可以包括聚合物拉曼标记，连接于一个或多个探针以检测靶分子。

发明背景

[0006] 生物分子的检测和/或鉴定可用于多种应用，用于医学诊断、法医学、毒物学、病理学、生物战、公共卫生和许多其它领域。虽然被研究的生物分子的主要类型是核酸和蛋白质，但对其它生物分子也感兴趣，例如糖类、脂类、多糖、脂类、脂肪酸和其它感兴趣分子。存在对快速、可靠和低成本的生物分子鉴定方法、区别相似生物分子的方法以及分析大分子复合体如病原孢子或微生物的需要。

[0003] 核酸检测的标准方法，例如DNA印迹法、RNA印迹法或与核酸芯片结合，都依赖于荧光、化学发光或放射探针分子与靶核酸分子的杂交。在基于寡核苷酸杂交的测试中，在序列中与靶核酸互补的标记寡核苷酸探针被用于与核酸结合并检测核酸。最近，DNA(脱氧核糖核酸)芯片已经被设计，其可以包含上百个或上千个连接的寡核苷酸探针，以结合靶核酸。不完全互补的序列之间的核酸杂交可能产生灵敏性和/或特异性问题。或者，样品中存在的低含量靶核酸可能检测不出。

[0004] 多种技术可用于鉴定蛋白质、多肽和肽。通常地，这些都涉及抗体的结合和检测。虽然基于抗体的鉴定相当快速，但这些测试有时显示高水平的假阳性或假阴性。这些测试的成本高而且同时测试一个以上靶是困难的。进一步，这些方法要求在进行测试之前，针对感兴趣的靶蛋白，制备出抗体。

[0005] 在分子生物学、基因组学、疾病诊断和药物响应预测中的许多应用都涉及核酸序列变体的鉴定。已有的核酸测序方法，包括桑格双脱氧测序法和通过杂交测序，都趋于相对缓慢、昂贵、费力而且可能要用到放射标签或其它有毒化学品。已有的方法也受限于在一个反应中所获得的序列信息数量，通常到大约1000个碱基或更少。存在对更加快速、成本有效的和自动化的核酸测序方法的需要。

附图简述

[0006] 以下的附图形成本说明书的一部分，并且被包括以进一步示范说明本发明公开实施方式的某些方面。通过参照一个或多个这些附图，并结合这里提供的详细说明，可以较好地理解这些实施方式。

[0007] 图1说明用支链120和标签130修饰的有机骨架110产生条码100的示例性方法。条码100可以包括能与靶结合的探针部分150。标签130可以接受另外的修饰，例如通过与抗体140结合。

[0008] 图2说明用同一骨架产生不同条码201、202、203的示例性方法。标签240、250、260可以被放在不同位置，以产生可区分的条码201、202、203。条码201、202、203与靶的结合可以通过连接于条码201、202、203上的探针部分210、220、230进行介导。

[0009] 图3说明具有单链核酸骨架的几个条码301、302、303、304的例子。标签310、320、330在骨架上各个不同位置被添加，以产生不同的光谱，为例如拉曼光谱所鉴定。在条码302、303、304上不同位置连接同一标签330的条码可产生可区别的拉曼光谱。

[0010] 图4说明图3中公开的条码所产生的拉曼光谱的例子。条码301、302、303和304出现在同一图中。

[0011] 图5说明用连接有一个或多个标签510的已知序列的多个短寡核苷酸520产生条码的示例性方法。通过与模板分子500杂交，可将寡核苷酸-标签分子组合成条码。模板500可包括用于寡核苷酸-标签杂交的容器部分(containersection)540和用于与靶分子如核酸结合的探针部分550。在可选的实施方式中，探针550可包括，例如，可以与蛋白质、肽或其它靶类型结合的适体序列。

[0012] 图6表示产生条码的示例性方法的示意图，包括：通过将标签部分连接于寡核苷酸或核酸，构建码组分601、602、603、604；形成模板606以及将码组分与模板605杂交，形成条码607。

[0013] 图7表示用图6的方法所产生的条码鉴定互补靶链(complementarytarget strand)存在与否的示例性方法的示意图。

[0014] 图8表示几个拉曼标签801、802、803、804、805、806产生的SERS(surface enhanced Raman spectroscopy(表面增强拉曼光谱))光谱图的例子。

[0015] 图9说明聚合物拉曼标记910的例子。单体单元901、902通过共价键906相连，该共价键由连接于骨架909的功能基904、908与生长聚合链的末端处另一功能基904、908的相互作用产生。任选地，可添加另外的单元903。

[0016] 图10表示产生聚合物拉曼标记的示例性方法的示意图。用固体支持物1001附着组分1005(例如聚合物拉曼标记的一部分)。组分1005的开口端1104被去保护，并通过单体单元1010的去保护功能基1006，将单体单元1010与组分1005连接。拉曼标签1002、1003、1008被连接于聚合物拉曼标记上。

[0017] 图11A表示产生聚合物拉曼标记1105的另一示例性方法。第一反应用于将功能基1102a、1102b连接于拉曼标签1101a、1101b，产生功能化拉曼标签1103a、1103b。第二反应用于聚合功能化拉曼标签1103a、1103b，以形成次级聚合物拉曼标记1104a、1104b。每个次级聚合物拉曼标记1104a、1104b包括预先确定数目的单体拉曼标签1103a、1103b。在本实施例中，第一次级聚合物1104a包括第一单体1103a的“n”个拷贝，而第二次级聚合物1104b包括第二单体1103b的“m”个拷贝。将预先确定比例的次级聚合物拉曼标记1104a、1104b混合并交联，形成聚合物拉曼标记1105。

[0018] 图11B表示产生聚合物拉曼标记的又一示例性方法。具有功能基1112的聚合物分子1109与不同的拉曼标签1110结合，形成聚合物拉曼标记1111。每个类型的拉曼标签1110的数目被预先确定，以产生具有特异化光谱性质的聚合物拉曼标记1111。

[0019] 图12说明与一个或多个探针1206相连以鉴定靶分子的聚合物拉曼标记的几个例子。第一个例子1201显示通过接头1205与探针1206连接的聚合物拉曼标记1204。第二个例子1202显示两个聚合物拉曼标记1204，其通过1205与纳米颗粒1207相连，而另外的接头1205将纳米颗粒1207与两个探针1206连接。第三个例子1203显示通过接头1205与纳米颗粒连接的多个探针1206，并且多个拉曼标签1208与纳米颗粒1207连接。

[0020] 图13表示修饰的核酸，腺嘌呤的几个拉曼标签产生的SERS(表面增强拉曼光谱)光谱图的例子。

说明性实施方式的描述

[0021] 下面详细的描述包含许多具体的细节，以提供对本发明公开实施方式的更透彻的理解。然而，对本领域所属普通技术人员来说，显而易见的是，这些实施方式可以在没有这些具体细节的情况下进行实施。在其它的情况下，本领域所熟知的设备、方法、过程和各个组件在这里没有被详细描述。

定义

[0022] 如这里所使用，“一个(a)”或“一个(an)”可以意味着某项目的一个或多个。

[0023] 如这里所使用，项目的“多种(multiplicity)”意味着两个或多个项目。

[0024] 如这里所使用，“核酸”包括DNA、RNA(核糖核酸)，可为单链的、双链的或三链的及其任何化学修饰。事实上，核酸的任何修饰可以被考虑在内。“核酸”可以具有几乎任何长度，从2个或更多个碱基的寡核苷酸到全长度的染色体DNA分子。核酸包括但不限于寡核苷酸和多核苷酸。

[0025] “探针”分子是表现出与一个或多个靶选择性和/或特异性结合的任何分子。在本发明的各种实施方式中，将各个不同的探针分子与可区分条码连接，以便检测与来自一组不同探针的一个具体探针的结合作用。这些实施方式对于所用探针分子的类型是没有限制的。可以使用本领域所知的任何探针分子，包括但不限于寡核苷酸、核酸、抗体、抗体片段、结合蛋白、受体蛋白、肽类、凝集素、底物、抑制物、激活子、配体、激素、细胞因子等。在某些实施方式中，探针可包括已共价地或非共价地与一个或多个条码连接以鉴定不同靶的抗体、适体、寡核苷酸和/或核酸。

说明性实施方式

[0026] 所公开的方法、组合物和设备用于生物分子如核酸和蛋白质的检测、鉴定和/或加标签。在本发明的具体实施方式中，可使用这些方法、组合物和设备，通过对骨架进行各种修饰，由单个有机骨架(single organic backbone)产生多个条码。这些实施方式并不限于单个骨架，而可以使用一个或多个不同的骨架。优势包括：通过改变标签沿骨架的连接位置，用同一骨架产生不同的条码的能力。其它实施方式涉及产生聚合物拉曼标记，以快速鉴定生物分子或加标签于生物分子。其它优势包括多肽的灵敏性和精确性检测和/或鉴定。

条码合成(Barcodes by Synthesis)

[0027] 在本发明的一个实施方式中，如图1所示，条码骨架(barcodebackbone)110可由包括有机结构的聚合物链形成，该聚合物链包括核酸、肽、多糖和/或化学衍生聚合物序列的任何组合。在某些实施方式中，骨架110可包括单链或双链核酸。在一些实施方式中，骨架可与探针部分150，例如寡核苷酸、抗体或适体连接。骨架110可用一个或多个支链结构(branch structure)120进行修饰，形成额外的形态多样性和标签附着位置。支链结构120可用本领域熟知的技术形成。例如，在条码100包括双链核酸的情况下，支链结构120可通过寡核苷酸的合成并与单链模板核酸的杂交而形成。寡核苷酸可这样设计，使得序列的一部分(例如5′末端)与模板互补而另一部分(例如3′末端)不与模板互补。因此，条码100将包含双链序列的片段和单链支链结构120的短片段。如图1所公开，例如通过标记130的寡核苷酸的杂交，可将标签130添加到条码上，该寡核苷酸与支链结构120的单链部分在序列上是互补的。

[0028] 可用寡核苷酸模拟产生有机骨架(organic backbone)110。可用新的基团取代糖类和核苷酸单元的核苷间键合(internucleoside linkage)即骨架。探针150可被用于与合适的核酸靶化合物杂交。已显示具有优异杂交性质的寡聚化合物或寡核苷酸模拟的一个例子被称为肽核酸(peptide nucleic acid(PNA))。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被含酰胺的骨架取代，例如氨乙基甘氨酸骨架。在此例子中，核碱基(nucleobase)被保留并直接或间接地与骨架酰胺部分的氮杂氮原子相连。几件美国专利公开了PNA化合物的制备过程，包括例如US 5,539,082；US 5,714,331和US5,719,262。除此，PNA化合物也在Nielsen等(Science，1991，254，1497-15)中被公开。

[0029] 为了将一个条码100与另一个区分开来，可将标签130直接加到骨架110上，或者直接添加到一个或多个支链结构120上。条码100可通过将另一分子140(例如抗体)与一个或多个标签130连接而被进一步修饰。在使用大体积基团的情况下，连接于支链位置120的标签部分130的修饰会为与靶分子相互作用的探针150提供较低的空间位阻。标签130可通过成象方法，例如荧光显微法、FTIR(傅里叶变换红外)光谱、拉曼光谱、电子显微法以及表面等离子体共振法(surface plasmon resonance)被读出。已知各种不同的成象可检测标签130的形态学、拓扑学、化学和/或电学性质，包括但不限于传导性、隧穿电流、电容电流等。所用的成象方法取决于标签部分130的性质以及产生的最终信号。不同类型的已知标签130，包括但不限于荧光、拉曼、纳米颗粒、纳米管、富勒烯和量子点标签130，通过其拓扑学、化学、光学和/或电子性质，可用于鉴定条码100。这些性质既作为所用标签部分130的类型，又作为标签130在骨架110或支链结构120上的相对位置的函数而发生变化，导致为每个条码100产生可区分的信号。

[0030] 如图2所示，识别特定靶的不同探针210、220、230可被连接于可区分条码201、202、203。在此示例性实施方式中，多个标签240、250、260在不同位置被连接于条码201、202、203。标签240、250、260可包括，例如，拉曼标签或荧光标签。由于相邻标签可能相互作用，例如通过荧光共振能量转移(FRET)或其它机理，因此从同一套标签部分240、250、260获得的信号可能依赖于标签240、250、260之间的位置和距离而发生变化(参见实施例1)。所以，具有相似或同一骨架的条码201、202、203可被可区分地标记。通过将探针210、220、230，例如抗体、适体或寡核苷酸，连接于条码201、202、203，可提供结合靶分子的特异性。由于对应于给定探针210、220、230特异性的条码201、202、203信号是已知的，因此可能通过测定哪个探针210、220、230与样品中靶相结合而分析分子复合混合物并检测各个种类。

[0031] 在本发明的某些实施方式中，如图1和图2所示，条码100、201、202、203的骨架110由磷酸二酯键、肽键和/或糖苷键组成。例如，可使用标准的亚磷酰胺化学，形成包括DNA链的骨架110。形成由磷酸二酯连接的骨架110的其它方法是已知的，例如聚合酶链反应(PCR^TM)扩增。骨架110的末端可具有不同的功能基，例如生物素、氨基、醛基或硫羟基。这些功能基可用于连接探针部分150、210、220、230，或者用于附着标签130、240、250、260。标签130、240、250、260可被进一步修饰，以获得不同的尺寸、电学或化学性质，便于检测。例如，可使用抗体，与地高辛或荧光素标签130、240、250、260结合。可使用链霉抗生物素与生物素标签130、240、250、260结合。可将金属原子沉积在条码100、201、202、203结构上，例如通过使用酶标签130、240、250、260催化还原金属离子溶液来实现。在条码100、201、202、203包括肽部分的情况下，可对肽进行磷酸化，以形成标签130、240、250、260修饰140。修饰的140标签130、240、250、260可被多种本领域已知的技术检测。

[0032] 在本发明的某些实施方式中，为安全跟踪(security tracking)之目的，可将包含一个或多个条码100、201、202、203的溶液应用于对象。这些方法在本领域是已知的。例如，一个英国公司(SmartWater Ltd.)已经开发出用包含数字DNA(digital DNA)链的流体标记贵重物品的方法。该DNA的确不可能从物品上冲洗掉，而且可用于独特地鉴定昂贵物品或祖传遗物。该DNA可以被任何法医实验室检测。这些方法也可用于标记带有如此处所公开的分子条码100、201、202、203的项目。在这些应用中，检测条码100、201、202、203不需要基于DNA序列的法医分析。

条码杂交

[0033] 在本发明的其它实施方式中，如图5所示，涉及通过杂交产生条码530的方法。在此实施方式中，条码530包括与寡核苷酸520杂交的核酸500。一个或多个标签部分510可被连接于已知序列的寡核苷酸520，该已知序列可例如通过已知的化学合成技术而产生。产生加标签的寡核苷酸520的各种方法在本领域是熟知的。通过一系列加标签的寡核苷酸520与单链DNA模板500的杂交，形成条码530。模板500包括容器部分540和探针部分550。探针部分550被设计与互补靶核酸序列杂交。可选地，探针部分550可包括可以与蛋白质、肽或其它靶生物分子结合的适体序列。在各种实施方式中，探针区域540可以有2到30、4到20或14到15个核苷酸长。探针550长度没有限制，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、200、250个核苷酸或甚至更长的探针部分550被考虑在内。

[0034] 图3说明用于本发明各种实施方式的示例性拉曼标记寡核苷酸。拉曼标签310、320、330被连接于同一寡核苷酸序列的不同核苷酸，以产生不同的光谱(图4)。例如，寡核苷酸302、303和304表示同一寡核苷酸序列，其中标签330的位置有所改变。如图4所示，图3公开的标记寡核苷酸301、302、303、304的拉曼光谱是可以区别的。图4表明，连接在同一寡核苷酸序列302、303、304上的同一拉曼标签330的位置的微小变动可以产生不同类型的拉曼光谱(更详细地，参见下面的实施例1和2)。

[0035] 在图5所示的本发明实施方式中，当将一个或多个标记寡核苷酸520与模板分子500的容器部分540杂交时，形成了条码530。标记寡核苷酸520的序列被设计与容器部分550成互补，而不与探针部分550为互补。通过杂交与模板500结合的标签部分510的组合被选择用于提供可区分的信号。对可以使用的信号类型没有限制，而且可以使用任何已知的检测技术，包括但不限于拉曼光谱、FTIR、表面等离子体共振。杂交之后，通过已知的方法，包括但不限于超滤法、HPLC(高效液相色谱)、羟基磷灰石柱色谱法、超离心法等，将条码530从未杂交的寡核苷酸520和模板链500中分离。产生条码530的这种方法与标准技术比较，具有高的标记效率并且需要减少数量的标记寡核苷酸520，其中每个标记寡核苷酸520包括分离且可鉴别的条码530。正如对技术人员显而易见的是，图5所示的方法表明了产生条码530的组合方法，允许采用较小数量的标记寡核苷酸520，形成大量的可区分条码530。

[0036] 在图5所示的本发明某些实施方式中，模板500序列的长度可以从探针部分550以及与容器部分540杂交的标记寡核苷酸520的大小进行测定。例如，对于长度为“n”个碱基的探针部分550和长度为“m”个碱基的各个标记寡核苷酸520而言，模板500的长度等于(1+m)乘以n(或可选地，(n乘以m)+n)。例如，假设探针部分550的长度为9个碱基，标记寡核苷酸520的长度为5个碱基，则用于给所有可能的9-mer(9聚体)探针序列提供独特条码的所需模板500长度为(1+5)乘以9个，或54个碱基。

[0037] 如果允许部分序列重叠，则给定的54碱基模板可包含最多达50个不同的5-mer(5聚体)序列，条件是全杂交(即，5-mer不能只与模板500的最后4个碱基结合)。包含在这样的模板中的可能的不同m-mer(m聚体)数目也可被计算为等于(n+(n乘以m)-m+1)。另一方面，存在4⁵(或1024)个可能的5-mer(5聚体)序列可以被合成，这是由于5-mer的每个位置可包含4个可能的碱基之一，而且有5个位置。这意味着，有4^m-(n+(n乘以m)-m+1)种5-mer可以被用作码组分。在目前情况下，有974(1024-50)种5-mer可作为码组分。容器部分540将被设计与来自974个有效类型的系列独特5-mer杂交。将包括合适条码序列的标记寡核苷酸520引入并与容器部分540杂交。每个标记的寡核苷酸520将包含提供独特信号的标签，以便可以与其它码组分区别开来。

[0038] 通过参见示例性的说明，可以阐明原理。如果探针部分550是4个碱基长(n＝4)，标记寡核苷酸520包括3个碱基序列(m＝3)，则模板500长度为16个碱基长((1+3)乘以4)。这导致12个碱基的容器部分540和4个碱基(4-mer)的探针部分550。由于m＝3，所以有64(4³)个可能的有效3-mer(3聚体)序列。各个16碱基模板500可包含达14个3-mer类型(4+(3*4)-3+1＝14)。任意的模板500序列示于下面的SEQ ID NO：1中，其中探针部分550(下划线)在左，容器部分540在右。

AGAA AGT ACA TAT GTC(SEQ ID NO：1)

[0039] 在此例子中，16-mer(16聚体)包含14个不同的3-mer(3聚体)序列(AGA GAA AAA AAG AGT GTA TAC ACA CAT ATA TAT ATG TGT GTC)，这是因为3-mer中没有相同的。为防止码组分在错误的位置结合，需要至少18个不同类型(＝14+4)独特标记的3-mer条码序列，以可区分地标记所有可能的4-mer探针序列550。(所需独特码组分的数目可被计算为等于((2乘以n)+(n乘以m)-m+1))。对于SEQ ID NO：1所公开的具体容器序列540，只需要4个标记的3-mer-TCA、TGT、ATG和CAG。每个标记的3-mer可以在模板500上一个位置且只在一个位置结合。由于标记的寡核苷酸520与容器部分540在序列上互补，因此容器部分540中的“A”与寡核苷酸520中的“T”结合，而“G”与“C”结合，反之亦然。探针部分550的序列中的任何变化要求容器部分540序列做相应的变化。例如，如果探针序列550从AGAA变到AGTA，则容器序列540也必须改变，这是因为探针550中的AGT与容器540中的AGT重叠。一个可能的新的模板500序列示于下面的SEQ ID NO：2。

AGTA AGA ACA TAT GTC(SEQ ID NO：2)

[0040] 相应的寡核苷酸520序列为TCT TGT ATA和CAG。同样，每个只在容器部分540上的一个位置结合，而且不能与探针部分550结合。对所有可能的4-mer探针序列540进行独特的标记需要18个不同的3-mer标记寡核苷酸520，这比用已知方法产生所有可能的3-mer序列所需的64个标记3-mer 520少得多，已知方法如使用完整的探针文库，通过杂交进行测序。在64个可能的3-mer中只用18个也避免了采用可潜在地相互杂交的寡核苷酸520序列所产生的问题。

[0041] 标记寡核苷酸520(或码组分)可在合成条码530之前提前制备，并进行纯化和储存。可以使用给定套的m-mer(m聚体)制备条码530，用于任何所需的探针550序列。与已有方法相比，这大大提高了探针550制备的效率，在已有方法中，每个标记探针550分子分开制备而且逐个地标记和纯化。这里公开的模块体系(modular system)与已知方法相比，表现出标记的高效率。

[0042] 通常地，将信号(标记)组分附加在核酸链上包括使用标记的核苷酸或合成后标记过程，这两者都会产生问题。DNA聚合酶一般不能有效地处理标记的核苷酸，将其整合到寡核苷酸520或核酸中。当要将多个信号组分加到单个核酸链时，整合的效率急剧下降。由于低的整合效率，具有多于1或2个标记的DNA链需要大量起始物质和标记分子的大量纯化，以使其从未标记或部分标记的分子中分离。使用这里公开的多个短的标记寡核苷酸520避免了这些问题。

[0043] 当条码530分子被设计用于具体的靶分子时，条码530的结构和信号组分被固定，条码530只适合用于一个目的。如果需要条码530用于其它靶，则必须从头制备每一个。本模块体系使用可提前制备和储存的短的标记寡核苷酸520，用于任何靶，大大提高了灵活性、简便性和产生条码530的速度。所需独特标记码组分数目的减少也降低了成本，并提高了检测的效率，这是因为它减少了必须制备和鉴定的可区分标记探针550的数目。

[0044] 图6说明产生条码的示例性方法，例如上面讨论的条码。例如，通过合成短的寡核苷酸(例如3-mer)以及将标签与寡核苷酸连接或引入已经被标签修饰的核苷酸，可以产生码组分601、602、603、604。与寡核苷酸连接的标签不限于拉曼标签。例如，也可将荧光、纳米颗粒、纳米管、富勒烯和量子点标签连接于寡核苷酸。与寡核苷酸的连接模式多种多样。标签可以直接与寡核苷酸相连或通过支链结构相连。产生用作码组分601、602、603、604的标记寡核苷酸的各种方法是本领域所熟知的。可以构建具有扩展探针区域的模板606，其与标记码组分601、602、603、604在序列上互补。单个地或以混合物的形式，将标记组分601、602、603、604杂交605到模板606上。形成的条码607包括具有可检测标签的双链区域和结合到靶分子的单链探针区域。

[0045] 图7说明产生和使用条码的示意图。条码可通过形成模板分子和码组分而产生，如上所述。码组分与模板杂交，如上所述，产生条码。条码产生后，可用于各种目的，例如用于检测样品中的寡核苷酸、核酸或其它靶分子，或者用于测序核酸分子。如图7所示，可通过将靶分子重复暴露于包括一个或多个条码的溶液，对核酸靶进行测序。条码与靶的杂交表明靶链中互补序列的存在。暴露于不同的条码重复这个过程，表明不同互补序列的存在。如同“鸟枪(shotgun)”测序法中的情形，一些互补序列可重叠。重叠的互补序列可被组合成完整的靶核酸序列。

[0046] 可将条码引入样品，与靶分子结合，通过任何已知的成象方法进行检测，例如荧光显微法、FTIR(傅里叶变化红外)光谱法、拉曼光谱法、表面等离子体共振和/或电子显微法。

共价键合的聚合物拉曼标记条码

[0047] 在本发明的某些实施方式中，可产生聚合物拉曼标记条码。一般而言，聚合物拉曼标记包括拉曼标签直接或通过间隔分子连接其上的骨架部分(backbone moiety)。骨架部分可由适于聚合的任何类型单体组成，包括但不限于核苷酸、氨基酸、单糖或任何各种已知的塑料单体，例如乙烯基、苯乙烯、碳酸酯、乙酸酯、乙烯、丙烯酰胺等。聚合物拉曼标记可连接于探针部分上，例如寡核苷酸、抗体、凝集素或适体探针。在聚合物骨架由核苷酸单体组成的情况下，与抗体探针的连接会使探针和骨架组分都与不同靶分子结合的可能性最小化。可选地，在使用核苷酸单体作为骨架的本发明某些实施方式中，被加入聚合物拉曼标记的核苷酸序列可被设计与靶核酸互补，以使探针功能加入到聚合物拉曼标记中。由于基于核苷酸的骨架本身产生拉曼发射光谱，有可能干扰所附着拉曼标签的检测，因此在一些实施方式中，使用少产生或不产生拉曼发射信号的骨架组分，以使信号检测最佳化和信噪比最小化。以下部分总体上涉及聚合物拉曼标记，并不限于所用单体单元的具体类型。

[0048] 聚合物拉曼标记条码可用于靶分子的检测、鉴定和/或测序，如上所述。探针标记和检测的现有方法具有许多不足。例如，与有机荧光标签连接的探针提供高的检测灵敏度，但具有低的多元检测能力。荧光标签具有宽的发射峰，荧光共振能量转移(FRET)限制了可与单个探针分子连接的不同荧光标签的数量，而自淬灭(self-quenching)减小了荧光信号的量子产生。如果探针包含一个以上类型的发色团，则荧光标签需要多个激发源(excitation source)。它们也由于光漂白而不稳定。潜在的其它类型探针标签是量子点。量子点标签是具有多个层的相对较大的结构。除了产生复杂外，量子点上的涂层也干扰荧光发射。用量子点标签产生的可区分信号的数目也存在限制。第三类探针标记由染料浸渍珠子(dye-impregnated bead)组成。这些体积趋于很大，经常大于探针分子的尺寸范围。染料浸渍珠子的检测是定性的，非定量的。

[0049] 拉曼标记提供了产生尖光谱峰的优势，允许较多的可区分标记与探针相连。使用表面增强拉曼光谱(SERS)或类似技术使得检测的灵敏度比得上荧光标签。示例性的拉曼标签分子的发射光谱示于图8。如从图所见，拉曼标签分子提供了可区分光谱的多样性。图8表示以下拉曼标签分子的光谱：NBU(寡核苷酸5′-(T)20-脱氧水粉蕈素-T-3′)；ETHDA(寡核苷酸5′-(T)-20-(N-乙基脱氧腺苷)-T-3′)；BRDA(寡核苷酸5′-(T)-20-(8-溴腺苷)-T-3′)；AMPUR(寡核苷酸5′-(T)-20-(2-氨基嘌呤)-T-3′)；SPTA(寡核苷酸5′-ThiSS-(T)20-A-3′)；和ACRGAM(寡核苷酸5′-acrydite-(G)20-氨基-C7-3′)。图13表示与核酸光谱本身比较，一个核酸即腺嘌呤的一些核酸类似物的SERS光谱：腺嘌呤；2-F腺嘌呤；4-Am-6-HS-7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤；呋喃甲基氨基嘌呤(kinetin)；N6-苯甲酰基-腺嘌呤；DMAA-A；8-氮杂-腺嘌呤；腺嘌呤硫醇和嘌呤衍生物，6-巯基嘌呤。表1列出在拉曼光谱中可能使用的其它标签分子。技术人员会认识到，可用的拉曼标签并不限于此处所公开的那些，而可以包括可与探针连接并被检测的任何已知拉曼标签。在本领域，许多这样的拉曼标签是已知的(参见，例如www.glenres.com)。

表1 拉曼标签分子的例子

2′，3′-ddA-5′-CE亚磷酰胺

2′-脱氧腺苷a-硫代三磷酸(15mM)(2′dATTPaS)

2′-氟-腺苷a-硫代三磷酸(10mM)(2′-F-ATTPaS)

2′-OMe-A-CE亚磷酰胺

2′-OMe-A-Me亚磷酰胺

2′-OMe-A-RNA

2′-OMe-腺苷a-硫代三磷酸(20mM)(2′-O-Me-ATTPaS)

2′-OMe-Pac-A-CE亚磷酰胺

2-氨基-dA-CE亚磷酰胺

2-氨基嘌呤核苷a-硫代三磷酸(20mM)(2′-AP-TTPaS)

2-F-dA-CE亚磷酰胺

3′-A-TOM-CE亚磷酰胺

3′-dA-CE亚磷酰胺

3′-dA-CPG

7-脱氮-腺苷a-硫代三磷酸(1mM)(7-DATTPaS)

7-脱氮-dA-CE亚磷酰胺

8-氨基-dA-CE亚磷酰胺

8-溴-dA-CE亚磷酰胺

8-氧-dA-CE亚磷酰胺

A-TOM-CE亚磷酰胺

A-RNA-TOM-CPG

腺苷a-硫代三磷酸(0.5mM)(ATTPaS)

Bz-A-CE亚磷酰胺

Bz-A-RNA-CPG

dA-5′-CE亚磷酰胺

dA-5′-CPG

dA-CE亚磷酰胺

dA-CPG 1000

dA-CPG 2000

dA-CPG 500

dA-高含量-CPG(dA-High Load-CPG)

dA-Me亚磷酰胺

dA-Q-CPG 500

二氨基嘌呤核苷a-硫代三磷酸(0.25mM)(DTTPaS)

[0050] 图9说明通过将两个或多个拉曼标记单体单元901、902连接在一起，形成聚合物拉曼标记，从而产生条码的示例性方法。该聚合物拉曼标记可以与探针部分相连，以便与靶分子结合以及检测靶分子。聚合物拉曼标记可包括第一单体单元901，其通过共价键906与第二单体单元902连接。当需要较大的信号复杂性时，可以连接另外的单体单元903。单体单元901、902包括一个或多个拉曼标签部分907a、907b，直接或通过间隔物905连接在骨架909上。间隔物905可包括，例如5个或更多个碳原子。间隔物905的长度可以变化，例如2到30、2到20或3到15个碳原子长。最有效的间隔物905是柔性的，例如脂肪族碳(如通过氨基己酸)、肽链(如通过赖氨酸侧链连接)或聚乙二醇(如亚磷酰胺)。间隔物905可包括碳、氮、硫和/或氧原子。产生和交联标记单体单元901、902的各种方法是本领域已知的。也可从商业渠道获得各种标记单体单元(例如MolecularProbes，Eugene，OR)。

[0051] 如图9所示，可以通过功能基904、908，将一个单体单元901与另一个单体单元902共价连接，形成条码。功能基904、908可包括，例如生物素、氨基、醛基、硫羟基或本领域所知的其它任何活性基团。每个单体单元901、902具有至少两个功能基904、908，单体的每一端连接一个。在进行交联之前，将一个功能基904、908激活(去保护)，以与另一个单体单元901、902连接，而第二个功能基904、908仍被保护，以免受到相互作用或阻断(如通过化学修饰)。当激活时，单体单元901、902的每一端都能够与另一单体单元901、902结合。在各种实施方式中，聚合物拉曼标记包括2到30、4到20或5到15个单体单元901、902(例如，核苷酸、氨基酸、塑性单体等)。对由通过共价键906连接在一起的两个单体单元901、902组成的聚合物拉曼标记910的例子，进行了说明。可见拉曼标签907a、907b通过间隔分子905与骨架909相连。单体单元901、902通过共价键906相互连接，在本例中，是通过酰胺键相互连接，该酰胺键例如通过羧基与伯胺基团进行碳二亚胺催化反应而形成。

[0052] 拉曼标签907a、907b包括一个或多个双键如碳氮双键被考虑在内。拉曼标签907a、907b包括带有与环结构相连的侧基的环结构也被考虑在内。侧基包括但不限于氮原子、氧原子、硫原子和卤素原子以及碳原子和氢原子。提高拉曼信号检测强度的侧基特别有用。有效的侧基包括具有共轭环结构的化合物，例如嘌呤、吖啶、罗丹明染料(Rhodamine dye)和花菁染料(Cyanine dye)。考虑聚合物拉曼标记的总极性为亲水性，但可包括疏水侧基。

[0053] 产生聚合物拉曼标记的示例性方法如图10所示。用固体支持物1001锚定生长着的聚合物拉曼标记。该支持物1001可包括，例如有孔玻璃珠、塑料(包括但不限于丙烯酸、聚苯乙烯、苯乙烯和其它物质的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、特氟隆J等)、多糖、尼龙、硝基纤维素、复合材料、陶瓷、塑料树脂、硅石、硅石基物质、硅、改性硅、碳、金属、无机玻璃、光纤束或其它任何已知类型的固体支持物。一个或多个接头分子1010(如碳原子链)被连接在支持物1001上。接头分子1010的长度可以变化。例如，接头1010可以是2-50个原子长度。有用的各种接头1010在上面已讨论。考虑将一个以上长度或类型的接头分子1010连接于固体支持物1001。接头1010作为连接点，通过逐步连接单体单元1009而使聚合物拉曼标记生长。图10显示包括两个单体的聚合物拉曼标记的连接组分1005。

[0054] 要连接的每个单体单元1009包括两个功能基1006、1007，如上所述，在单体单元1009的每一端有一个。通过选择性激活单体单元1009前端的功能基1006而实现单体单元1009的加入。激活的功能基1006在组分1005的生长端与另一个激活的功能基1004相连。化学合成聚合物的方法在本领域是已知的，包括，例如寡核苷酸的亚磷酰胺合成和/或肽的固相合成。保护和去保护功能基1004、1006、1007的方法在本领域也是已知的，如在寡核苷酸或肽合成的技术中。

[0055] 可将每个连续的单体单元1009引入溶液中，例如悬浮在乙腈或其它溶剂中。在第一单体单元1009前端的功能基1006可与接头分子1010结合。第一单体单元1009与接头分子1010连接后，通过化学处理(如氢氧化铵)，将与单体单元1009另一端连接的功能基1007进行去保护，以便结合另一个单体单元1009。要加入的第二单体单元1009可包括激活的功能基1006和保护的功能基1007，以便定向连接单体单元1009。在将单体单元1009结合进聚合物拉曼标记的生长组分1005之后，将受保护的功能基1004去保护并加入另一个单体单元1009。继续进行该过程的另一轮，直到产生合适长度的聚合物拉曼标记。

[0056] 考虑可将几个不同的单体单元1009在任何给定的时间加入到固体支持物1001上，以产生不同的聚合物拉曼标记。在后一种情况下，如果合适的话，合成之后，分离不同的聚合物拉曼标记。聚合物拉曼标记的长度依赖于加入的单体单元1009的数目而发生变化，但是每个聚合物标记将含有两个或更多个单体单元1009。

[0057] 在本发明的各种实施方式中，聚合物拉曼标记可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个拉曼标签1002、1003、1008。与单个聚合物拉曼标记相连的各个拉曼标签1002、1003、1008可以是各不相同的。可选地，聚合物拉曼标记可包含同一拉曼标签1002、1003、1008的两个或更多个拷贝。为最大化可区分聚合物拉曼标记的数目，考虑在多个拉曼标签1002、1003、1008加入单个聚合物拉曼标记的情况下，它们通常是不相同的。如上所述，可以将拉曼标签1002、1003、1008直接连接在聚合物拉曼标记1009的骨架1011上或者通过间隔分子连接。

[0058] 聚合物拉曼标签比单体标签提供了更大的光谱区别的多样性，同时提供了拉曼光谱检测的灵敏度。使用多个拉曼标签1002、1003、1008与单个聚合物拉曼标记连接使得可以产生很多可区分聚合物拉曼标记。由10个不同的可能的标记单体单元1009形成的4-mer聚合物拉曼标记会产生5000个以上的可区分拉曼标记。对于15个不同的标记单体单元1009，会产生30,000个以上的可区分拉曼标记。对于只有10到20个不同的标记单体单元1009，可产生50,000个以上的可区分拉曼标记。由于单体单元1009的大小与核苷酸大约相同(约1000道尔顿)，因此4-mer拉曼标记的平均大小大约4000道尔顿。所以，聚合物拉曼标记允许具有较小空间位阻的探针-靶结合。

[0059] 在本发明的一些实施方式中，加入聚合物拉曼标记的单体单元1009具有与骨架相连的间隔支链，其中另外的活性基团1004、1006、1007与该间隔支链连接。活性基团1004、1006、1007在聚合物合成期间，可以被保护或阻断。在聚合物合成之后，或在将单体单元1009加入到生长聚合物1005(growing polymer)之后，将拉曼标签1002、1003、1008连接在去保护的间隔支链上。

[0060] 在本发明的某些实施方式中，如图11A所说明，聚合物拉曼标记1105在没有支持物的情况下产生。可对拉曼标签1101a、1101b进行化学改变，添加功能基1102a、1102b，例如生物素、氨基、醛基、硫羟基或其它任何类型的活性基团，以产生功能化的拉曼标签(单体单元)1103a、1103b。然后将单体单元1103a、1103b进行聚合，产生次级聚合物单元(subpolymeric unit)1104a、1104b，每个都包括预先确定数目的单体单元。将该次级聚合物单元1104a、1104b按预先确定的比例(如1∶1、1∶1、1∶10等)混合在一起，并再进行聚合，产生最终的聚合物拉曼标记1105。在所示的例子中，聚合物拉曼标记1105包括一种类型单体单元1103a的“n”个拷贝和第二类型单体单元1103b的“m”个拷贝。

[0061] 图11B说明在没有支持物的情况下，产生聚合物拉曼标记1111的可选方法。在此情况下，一个或多个聚合物1109包含活性侧基1112，其连接在延伸出骨架的间隔物上。活性侧基1112可与一个或多个不同的拉曼标签110连接，以形成聚合物拉曼标记1111。活性侧基1112可包括聚赖氨酸，其中聚赖氨酸被处理，以将胺侧基转变为顺丁烯二酰亚胺残基(聚马来酸酐)，其可以与HS(硫化氢)功能化的拉曼标签1110反应。可选地，侧基1112可包括聚(烯丙胺)的胺基团，其可以与NHS酯功能化的拉曼标签1110反应。侧基1112也可包括丁二酰化聚赖氨酸的羧酸基团或具有氨基或羧酸基的合成寡核苷酸的羧酸基团。可以例如采用碳二亚胺介导的交联，将羧基化侧基1112连接在拉曼标签1110上。

[0062] 聚合物骨架可从有机结构形成，例如核酸、肽、多糖和/或化学衍生聚合物的任何组合。聚合物拉曼标记1111的骨架可由磷酸二酯键、肽键和/或糖苷键形成。例如，可用标准的亚磷酰胺化学形成包括DNA链的骨架。形成磷酸二酯连接的骨架的其它方法是已知的，例如聚合酶链反应(PCR^TM)扩增。骨架的末端可以具有不同的功能基，例如生物素、氨基、醛基或硫羟基。可用这些功能化的基团将两个或多个次级聚合物单元连接在一起。例如，聚合物拉曼标记1111可包括第一单体单元1103a的“m”个拷贝、第二单体单元1103b的“k”个拷贝和第三单体单元的“i”个拷贝。聚合物骨架被合成到期望的长度后，可逐个地或同时地引入两个或多个不同的拉曼标签1110，以与活性侧基1112结合，从而产生聚合物拉曼标记。单体单元并不限于拉曼标签1110。其它的标签，例如荧光、纳米颗粒、纳米管、富勒烯或量子点标签，可与一个或多个单体单元连接，以使聚合物拉曼标记1111多样化。一般地，单体单元的大多数标签1110将是拉曼标签1110。可加入一个以上聚合物拉曼标记1111，以产生更长的产物。

[0063] 在本发明的某些实施方式中，如图12所示，上面公开的任何的聚合物拉曼标记可与探针1206相连。探针分子1206的例子可包括但不限于寡核苷酸、核酸、抗体、抗体片段、结合蛋白、受体蛋白、肽类、凝集素、底物、抑制物、激活子、配体、激素、细胞因子等。

聚合物拉曼标记1204的各种示例性结构1201、1202可包括共价连接的单体单元，带有骨架和直接地或通过间隔分子与骨架相连的一个或多个拉曼标签。聚合物1204可通过接头1205或直接的共价键1205与探针1206连接。可选地，聚合物拉曼标记1204可间接地，通过连接纳米颗粒1207，与一个或多个探针部分1206相连。分子与纳米颗粒交联的各种方法是本领域已知的，可使用任何这样的已知方法。例如，在存在EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)时，通过羧基与氨基的交联来实现。如示例性的结构1202所示，可将一个以上的聚合物拉曼标记1204连接在单个纳米颗粒1207上。然后将纳米颗粒1207连接在一个或多个探针分子1206上。这种结构的优势在于，使用一种聚合物拉曼标记1204，就可以鉴定一个以上的靶分子。可选地，如果纳米颗粒1207与同一探针分子1206的多个拷贝相连，则可以结合同一靶分子的多个拷贝。其它优势包括捕获靶分子的机会更大，这是因为有更多的探针分子1206与拉曼标记相连，并且由于拉曼标记1202可通过离心、过滤或电泳而被分离，使得在溶液检测应用中，更容易进行自由靶分子与结合拉曼标记的靶分子的分离。

[0064] 在可选的结构1203中，单体拉曼标签1208直接地或通过间隔分子1205，与纳米颗粒1207相连。一个或多个探针分子直接地或通过间隔物1205与同一纳米颗粒1207相连。这使得连接于探针1206的多个拉曼标签1208的形成不需要聚合物1204的预先合成。该结构1203的优势在于，纳米颗粒1207具有较大的表面积，允许结合更多的探针分子1206和拉曼标签1208，并提供分子之间降低的空间位阻。

[0065] 使用较少的单体单元，可以形成多种聚合物拉曼标记条码。聚合物拉曼标记的产生使得条码的产生具有较大的灵活性和灵敏性，同时使用相对较少的拉曼标签。

核酸

[0005] 可通过任何标准的技术，制备要测序的核酸分子。在一个实施方式中，核酸可以是自然生成的DNA或RNA分子。当使用RNA时，期望将RNA转变成互补的cDNA。事实上，可通过本发明的方法制备和测序任何自然生成的核酸，包括但不限于染色体DNA、线粒体DNA或叶绿体DNA或者信使RNA、不均一核RNA、核糖体RNA或转移RNA。制备和分离各种形式的细胞核酸的方法是已知的(参见，例如， Guide to Molecular Cloning Techniques，eds.Berger和Kimmel，Academic Press，New York，NY，1987； Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，eds.Sambrook，Fritsch和Maniatis，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，NY，1989)。非自然生成的核酸也可以使用公开的方法和组合物进行测序。例如，通过标准的扩增技术如聚合酶链反应(PCR^TM)扩增制备的核酸可以在本发明的范围内进行测序。核酸扩增的方法在本领域是熟知的。

[0006] 核酸可以从多种来源分离，包括但不限于病毒、细菌、真核细胞、哺乳动物以及人类、质粒、M13、λ噬菌体、P1人工染色体(PACs)、细菌人工染色体(BACs)、酵母人工染色体(YACs)和其它克隆载体。

核酸固定化的方法

[0007] 在各种实施方式中，通过附着在固体表面上，将核酸分子固定化。核酸分子的固定化可以通过多种方法实现，包括非共价或共价附着在载体或表面上。在示例性实施方式中，通过用链霉抗生物素或抗生物素蛋白涂覆固体表面以及结合生物素化的聚核苷酸，实现固定化。固定化也可以通过用聚-L-Lys或聚L-Lys、Phe涂覆聚苯乙烯、玻璃或其它固体表面，然后用双功能交联剂共价附着氨基或硫氢基修饰的核酸来实现。用氨基硅烷，可将胺残基引入到表面上。

[0008] 固定化可通过将5′-磷酸化核酸直接共价附着在化学修饰的聚苯乙烯表面而进行。核酸和固体表面之间的共价键通过与水溶性碳二亚胺缩合而形成。这种方法促进了核酸通过其5′-磷酸主要进行的5′-附着。

[0009] 通常先使玻璃表面硅烷化，然后用碳二亚胺或戊二醛活化，将DNA结合在玻璃上。可选的过程可使用试剂如3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷或氨基丙基三甲氧基硅烷(APTS)，以及通过氨基接头连接的DNA，该氨基接头在DNA合成过程中被加入在分子的3′或5′末端。使用紫外线辐射，可将DNA直接与膜结合。固定化核酸的其它方法是已知的。

[0010] 用于固定化核酸的表面类型没有限制。在各种实施方式中，固定化表面可以是磁珠子、非磁性珠子、平面、打点表面(pointed surface)或包括几乎任何物质的其它任何构型的固体表面，只要该材料允许核酸与探针文库杂交。

[0011] 双功能交联剂可用于许多实施方式。示例性的交联剂包括戊二醛、双功能环氧乙烷、乙二醇二缩水甘油醚和碳二亚胺，例如1-乙基-3-(-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。

[0012] 在某些实施方式中，捕获寡核苷酸(capture oligonucleotide)可与表面结合。该捕获寡核苷酸将与核酸模板的特定核酸序列杂交。通过限制酶消化、内切核酸酶活性、提高的温度、降低的盐浓度或这些和相似方法的组合，可将核酸从表面释放。

蛋白质的纯化

[0013] 在某些实施方式中，对蛋白质或肽进行分离或纯化。在一个实施方式中，这些蛋白质用于产生抗体，以便用任何所述条码(如聚合物拉曼标记)进行标记。蛋白质纯化技术是本领域技术人员所熟知的。这些技术包括，在一个水平上，将细胞、组织或器官匀浆化和粗分级分离为多肽组分和非多肽组分。用层析和电泳技术对感兴趣的蛋白质或多肽进行进一步的纯化，以实现部分或完全的纯化(或纯化至同质性)。特别适合用于制备纯肽的分析方法是离子交换色谱法、凝胶排阻色谱法、HPLC(高效液相色谱法)、FPLC(AP Biotech)、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、亲和色谱法、免疫亲和色谱法和等电点聚焦法。通过亲和色谱法纯化受体蛋白的例子在美国专利US 5,206,347中公开，在此引入其全部内容作为参考。纯化肽的最有效的方法之一是快速性能液相色谱法(fast performance liquidchromatography)(AKTA FPLC)或甚至HPLC。

[0014] 纯化的蛋白质或肽被有意称为组合物，是可以与其它组分分离的，其中蛋白质或肽相对于它的自然可得的状态，可被纯化到任何程度。因此，分离的或纯化的蛋白质或肽也被指脱离其自然生成环境的蛋白质或肽。一般地，“纯化的(purified)”指已经接受分级分离而除去其它各种组分的蛋白质或肽组合物，并且其组成成分基本保持其表达的生物学活性。当使用术语“基本纯化的(substantially purified)”时，该名称指组合物中蛋白质或肽形成该组合物的主要组分，例如在组合物中，蛋白质构成约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多。

[0015] 量化蛋白质或肽的纯化程度的各种方法是本发明所述领域的技术人员知晓的。这些包括，例如，测定活性组分的比活性，或通过SDS/PAGE分析法评估组分中多肽的含量。评估一个组分纯度的优选方法是计算该组分的比活性，将它与初始提取物的比活性比较，以及由此计算其中的纯度，用“纯化倍数(-foldpurification number)”进行评估。用于表示活性量的实际单位当然取决于纯化之后所选用的具体测试方法，以及表达的蛋白质或肽是否表现出可检测的活性。

[0016] 适合用于蛋白质纯化的各种技术是本领域技术人员所熟知的。这些包括，例如，硫酸铵沉淀、PEG、抗体和类似技术或通过加热变性，然后进行：离心；色谱法步骤，例如离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法、反相色谱法、羟基磷灰石色谱法及亲和色谱法；等电点聚焦；凝胶电泳；以及这些和其它技术的结合。如本领域通常已知的，相信，进行各种纯化步骤的次序可以改变，或者某些步骤可以略去，而仍形成制备基本纯化的蛋白质或肽的合适方法。

[0017] 一般不要求蛋白质或肽总是以它的最纯化的状态被提供。事实上，在某些实施方式中使用较低基本纯化的产物被考虑在内。部分纯化可以通过采用结合起来的较少纯化步骤来完成，或者通过采用相同总体纯化方案的不同形式来完成。例如，可以理解，用HPLC设备进行的阳离子交换柱色谱法比采用低压色谱系统的相同技术，一般将产生较大“倍数(-fold)”的纯化。表现出较低程度的相对纯化的方法在蛋白产物的总回收上，或者在保持表达蛋白的活性上具有优势。

[0018] 亲和色谱法是依赖于被分离的物质与其特定结合的分子之间特异性亲和力的色谱方法。这是受体-配体型的相互作用。通过将结合对之一与不溶性基质共价偶联，合成柱材料。然后柱材料能够特定地从溶液中吸收物质。通过将条件改变到结合不发生的条件(例如，改变pH、离子强度、温度等)，进行洗脱。基质应当是它本身不明显吸收分子的物质以及具有较宽的化学、物理和热稳定性的物质。配体应当以不影响它的结合性质的方式进行偶联。配体也应当提供较为紧密的结合作用。而且，应当可能在不破坏样品或配体的情况下洗脱该物质。

[0019] 蛋白质或肽可用本领域技术人员已知的任何技术制备，包括通过标准的分子生物学技术表达蛋白质、多肽或肽；从自然来源分离蛋白质或肽；或者化学合成蛋白质或肽。对应于各种基因的核苷酸和蛋白质、多肽和肽序列已经被公开，并且可以在本领域普通技术人员知晓的计算机化数据库中找到。一个这种数据库是National Center for Biotechnology Information’s GenBank and GenPept数据库( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。使用这里公开的技术或本领域普通技术人员知晓的技术，可以扩增和/或表达已知基因的编码区域。替代地，蛋白质、多肽和肽的各种商业制备物是本领域技术人员已知的。

肽模拟物(peptide mimetics)

[0020] 本发明制备多肽的另一种方法是使用用于单克隆抗体生产的肽模拟物(peptide mimetics)。模拟物(mimetics)是含肽的分子，其模拟蛋白质二级结构的元件。参见，例如，Johnson等，“Peptide Turn Mimetics”，BIOTECHNOLOGYAND PHARMACY中，Pezzuto等，Eds.，Chapman and Hall，New York(1993)，在此引入作为参考。使用肽模拟物的基本原理在于，蛋白质的肽骨架主要以这样的方式朝向氨基酸侧链而存在，以促进分子相互作用，例如抗体和抗原的相互作用。预期肽模拟物允许分子相互作用，如同天然分子一样。这些原理可用于工程设计第二代分子，其具有这里公开的靶向肽(targeting peptides)的许多自然性质，但是具有改变的和甚至改进的特性。

融合蛋白

[0021] 本发明的其它实施方式涉及融合蛋白。这些分子一般具有靶向肽的全部或基本部分，其在N-或C-末端连接到第二多肽或蛋白质的所有或部分上。例如，融合可以使用来自其它物种的前导序列，以允许蛋白质在异源宿主中重组表达。另一种有用的融合包括添加免疫学活性结构域，例如抗体表位，以促进融合蛋白的纯化。在融合接点处或附近加入切割位点将促进纯化后额外多肽的去除。其它有用的融合包括功能结构域的连接，例如酶的活性位点、糖基化结构域、细胞靶向信号或跨膜区域。在某些实施方式中，融合蛋白包括与治疗用蛋白质或肽连接的靶向肽。考虑在本发明的范围内，事实上，可将任何蛋白质或肽加入包括靶向肽的融合蛋白。产生融合蛋白的方法是本领域技术人员熟知的。这种蛋白质可以通过如下途径产生，例如：使用双功能交联剂的化学附着；完整融合蛋白的从头合成；或者将编码靶向肽的DNA序列与编码第二个肽或蛋白质的DNA序列连接，然后表达完整的融合蛋白。

合成的肽

[0022] 由于它们的相对较小的体积，真菌选择方法鉴定的肽可以根据传统技术，在溶液中合成，或者在固体支持物上合成。各种自动化合成仪是商业可得的，并且可根据已知方案使用。参见，例如，Stewart和Young，(1984)；Tam等，(1983)；Merrifield，(1986)；以及Barany和Merrifield(1979)，在此引入每一个作为参考。用这些方法，可以容易合成短的肽序列，通常为约6至高达约35到50个氨基酸。可选地，可使用重组DNA技术，其中编码本发明中肽的核苷酸序列被插入表达载体、被转化或转染到合适的宿主细胞中，并在适于表达的条件下进行培育。

示例性应用

核酸测序

[0023] 在具体的实施方式中，可用这里公开的方法所形成的条码测序靶核酸分子。通过杂交测序的方法是本领域已知的。可以使一个或多个包括已知序列的探针的标记条码杂交到靶核酸序列。标记条码与靶的结合表明靶链中互补序列的存在。可使多个标记条码与靶分子同时杂交并同时检测。在可选的实施方式中，结合的探针可以被鉴定与各个靶分子相连，或者可选地，可以使具体靶分子的多个拷贝与探针序列的重叠集合同时结合。对各个分子，可以例如使用已知的与检测方式结合的分子梳理技术(molecular combing technique)进行扫描。(参见，例如，Bensimon等，Phys.Rev.Lett.74：4754-57，1995；Michalet等，Science 277：1518-23，1997；美国专利US 5,840,862；US 6,054,327；US 6,225,055；US 6,248,537；US 6,265,153；US 6,303,296和US 6,344,319。)

[0024] 给定的靶核酸与完全覆盖靶序列的邻接探针序列杂交是不可能的。更合适地，将靶的多个拷贝与多个标记寡核苷酸进行杂交，并从每一个，收集部分序列数据。采用公共可得的鸟枪序列汇编程序(shotgun sequence compilationprogram)，可将部分序列编译成完整的靶核酸序列。也可从靶分子的群体编译部分序列，该靶分子群体被允许例如在溶液相中同时与一文库的条码探针进行结合。

靶分子检测、鉴定和/或量化

[0025] 在某些实施方式中，通过与条码结合，可以检测、鉴定和/或量化样品中的靶分子。设计与具体靶结合的标记条码可按如上所述进行制备。靶不限于核酸，但也可包括蛋白质、肽类、脂类、糖类、糖脂、糖蛋白或其它可以为其制备具体探针的任何可能的靶。如上所述，可将抗体或适体结合进条码，并用于鉴定可为其制备适体或抗体的任何靶标。可以同时测试样品中多个靶的存在，这是因为每个条码可以被可区分地标记和检测。可采用标准的技术进行靶的量化，这些技术在光谱分析中是熟知的。例如，通过测量结合条码的信号强度以及与从已知量条码标准得到的校正曲线进行比较，可以测定与标记条码结合的靶的量。这些量化方法完全在本领域的常规技术之内。

阵列化学

[0026] 可以将具有不同化学功能性(例如不同结合特异性)的珠子(例如微球)混合在一起。采用光学可询编码方案(optically interrogatable encodingscheme)(“光学签名(optical signature)”)，可以实现鉴定每个珠子功能性的能力。例如，使用如上所述的聚合物拉曼标记，可以产生光学签名。基质，例如芯片或微量滴定板，可包括含有独立位点的有图案表面，所述独立位点与各个珠子相结合。这使得探针(即，核酸、适体或抗体)的合成可以与其在阵列上的定位分离开来。探针可被合成、与珠子相连而且珠子随机地分布在有图案表面上。由于珠子首先用光学签名编码，因此形成的阵列(array)稍后可被“译码”。就是说，阵列上各个位点位置与位于该具体位点的珠子或探针之间的关系可以被得到。由于珠子随机分布在阵列上，与产生阵列的原位合成或定位技术(spotting technique)相比，这形成了快速及低成本的方法。

[0027] 阵列组合物可包括至少第一基质，其具有包括各个位点的表面。阵列大小取决于阵列的最终用途。可形成包含大约2个不同介质(agent)(即不同珠子)到上百万个不同介质的阵列。一般地，阵列包括两个不同珠子到十亿个或更多，这取决于珠子和基质的尺寸。因此，可形成很高密度、高密度、中密度、低密度或很低密度的阵列。很高密度阵列的一些范围是每阵列为约10,000,000到约2,000,000,000个位点。高密度阵列的范围是约100,000到约10,000,000个位点。中密度阵列的范围是约10,000到约50,000个位点。低密度阵列一般少于10,000个位点。很低密度阵列少于1,000个位点。

[0028] 在本发明的一些实施方式中，可使用多个基质，具有不同或相同的组合成分。因此例如，大阵列可包括多个较小的基质。“基质(substrate)”或“固体支持物(solid support)”意指可以被修饰而包含不连续的各个位点的任何材料，其适应于至少一种检测方法，所述位点适合于珠子的附着或结合。一般地，基质允许光学检测而不会感到对信号发射有干扰。

[0029] 位点包括图案，即规则的设计或构型，或者位点为随机分布。可使用规则图案的位点，以便位点集中在X-Y坐标平面上。基质表面可以被修饰，以允许微球在各个位点附着。因此，可修饰基质表面，以便形成不连续位点，其只有单个结合的珠子。在一个实施方式中，修饰基质表面，使其包含孔，即底物表面的凹陷。这可以使用各种已知技术来进行，包括但不限于照相平板印刷术(photolithography)、冲压技术(stamping technique)、塑型技术(molding technique)以及微蚀刻技术(microetching technique)。正如本领域技术人员理解，所用技术取决于基质的组成和形状。可选地，修饰基质表面，使其包括化学衍生的位点，该位点可以用于将微球和/或珠子附着在基质的不连续位置上。可以采用加入化学功能基的图案，例如氨基、羧基、氧基和硫羟基，以便共价附着微球，微球一般包含相应的活性功能基或接头分子。

[0030] 合适的珠子组合物包括用于肽、核酸和有机部分合成中的那些，包括但不限于塑料、陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、顺磁物质、氧化钍溶胶、碳石墨、二氧化钛、乳胶或交联葡聚糖如Sepharose(琼脂糖)、纤维素、尼龙、交联微团以及Teflin^，都可以使用。珠子大小范围可以从纳米即100nm到毫米即1mm，珠子可以为约0.2微米到约200微米以及从约0.5到约5微米，但在一些实施方式中可以使用更小的珠子。

[0031] 可使用组合物检测具体靶分析物的存在，例如核酸、寡核苷酸、蛋白质、酶、抗体或抗原。也可使用组合物筛选生物活性物质(bioactive agent)，即药物候选物，筛选其与具体靶的结合，或用于检测污染物之类的物质。如上所述，可以为其设计探针部分如肽、蛋白质、寡核苷酸或适体的任何分析物可以和所公开的条码结合使用。

[0032] 生物活性物质可以从各种来源获得，包括合成或天然化合物的文库。例如，许多方法可以用于随机和定向合成各种有机化合物和生物分子，包括随机化寡核苷酸的表达。可选地，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库是可用的或容易制备。另外，通过传统的化学、物理和生物化学方法，容易修饰天然或合成产生的文库和化合物。可对已知的药理学物质进行定向或随机的化学修饰，例如酰化、烷基化、酯化和/或酰胺化(amidification)，以产生结构类似物。

[0033] 生物活性物质可包括天然生成的蛋白质或天然生成蛋白质的片段。因此，例如，可以使用包含蛋白质的细胞提取物，或蛋白质细胞提取物的随机或定向消化物。在此情况下，原核生物和真核生物蛋白质文库可以被制备以便筛选这里所述的体系。例如可以生成细菌、真菌、病毒和哺乳动物蛋白质的文库，用于筛选目的。

[0034] 生物活性物质可以是约5到约30个氨基酸或约5到约15个氨基酸的肽。肽可以是天然生成蛋白的消化物或随机肽。由于一般地，随机肽(或随机核酸)可以被化学合成，因此它们可在任何位置将任何核苷酸或氨基酸整合。可以设计合成过程，以产生随机化的蛋白质或核酸，这使得可以在序列的整个长度范围形成所有或大多数可能的组合，从而形成随机化生物活性物质的文库。

[0035] 可选地，生物活性物质可以是核酸。核酸可以是单链或双链或其混合物。核酸可以是DNA、基因组DNA、cDNA、RNA或杂种，其中核酸包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何组合，以及碱基的任何组合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤(xanthanine)、次黄嘌呤(hypoxanthanine)、异胞嘧啶、异鸟嘌呤以及碱基对类似物如硝基吡咯和硝基吲哚等。

[0036] 这里公开的条码的应用不限于前述用途，而包括任何涉及靶的检测、鉴定和/或量化的应用。非限定性的应用包括单核苷酸多态性(SNPs)的检测；遗传突变的检测、疾病诊断、法医分析；环境污染和/或病原体的检测；临床诊断测试以及本领域所知的各种其它应用。

探针制备

寡核苷酸探针

[0037] 寡核苷酸的合成方法是本领域熟知的，可以使用任何这样的已知方法。例如，可以使用商业可得的寡核苷酸合成仪(如Applied Biosystems，Foster City，CA)制备寡核苷酸。可以从商业渠道获得与各种标签连接的核苷酸前体(例如，Molecular Probes，Eugene，OR)，并结合进寡核苷酸。可选地，可以购买包含各种活性基团的核苷酸前体，例如生物素、地高辛(diogoxigenin)、硫氢基、氨基或羧基。在寡核苷酸合成之后，采用标准的化学方法连接标签。也可以从各种来源得到具有任何期望序列的寡核苷酸，用于标签的连接，其具有或没有活性基团(例如，Miland Certified Reagents，Miland，TX)。也可以通过标准酶促方法，制备寡核苷酸探针，例如采用聚合酶链反应(PCR^TM)扩增(例如Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，NY，1989；美国专利US 5,279,721；US 4,683,195；US 4,683,202；US4,800,159；US 4,883,750)。

适体探针

[0038] 适体是通过被称为SELEX的体外进化过程衍生的寡核苷酸(例如，Brody和Gold，Molecular Biotechnology 74：5-13，2000)。SELEX过程涉及，重复循环暴露潜在的适体(核酸配体)于靶，使得发生结合；从自由核酸配体(freenucleic acid ligand)分离结合配体；扩增结合的配体以及重复结合过程。经过许多循环后，可制备出真正针对任何类型生物靶而具有高亲和性及特异性的适体。由于其小的体积、相对稳定性和制备简便，适体非常适合用作探针。因为适体由寡核苷酸组成，因此它们能容易地结合进核酸型条码中。制备适体的方法是众所周知的(例如，美国专利US 5,270,163；US 5,567,588；US 5,670,637；US 5,696,249；US 5,843,653)。可选地，可从商业来源获得针对特定靶标的各种适体(如Somalogic，Boulder，CO)。适体是相对较小的分子，其量级为7到50kDa。

抗体探针

[0105] 产生抗体的方法也是本领域熟知的(例如，Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY，1988)。适合用作探针的单克隆抗体也可从许多商业渠道获得。这些商业抗体可以针对多种靶标起作用。使用标准的化学方法，可以将抗体探针与条码结合，如下所述。

[0106] 所公开的方法和组合物并不限于所用探针的类型，并且本领域所知的任何类型探针部分都可以与条码连接并用于所公开的方法中。这样的探针包括但不限于抗体片段、affibodies、嵌合抗体、单链抗体、配体、结合蛋白、受体、抑制物、底物等。

标签

[0101] 在本发明的各种实施方式中，将条码与一个或多个标签连接，以便于检测和/或鉴定。可以使用本领域已知的任何可检测的标签。可检测的标签包括但不限于，可以用电学技术、光学技术、分光光度技术、光化学技术、生物化学技术、免疫化学技术或化学技术检测的任何组合物。标签包括但不限于传导的、发光的、荧光的、化学发光的、生物发光的和发磷光的部分；量子点；纳米颗粒；金属纳米颗粒；金纳米颗粒；银纳米颗粒；色原体；抗体；抗体片段；基因工程抗体；酶；底物；辅因子；抑制物；结合蛋白；磁性颗粒以及自旋标记化合物。(美国专利US 3,817,837；US 3,850,752；US 3,939,350；US 3,996,345；US 4,277,437；US 4,275,149和US 4,366,241。)

拉曼标签

[0102] 使用的拉曼标签的非限定性例子包括TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、NBD(7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑)、德克萨斯红染料、邻苯二甲酸、对苯二酸、间苯二酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、藻红、生物素、地高辛、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、TET(6-羧基-2′，4，7，7′-四氯荧光素)、HEX(6-羧基-2′，4，4′，5′，7，7′-六氯荧光素)、Joe(6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素)、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、Tamra(四甲基罗丹明)、6-羧基罗丹明、Rox(羧基-X-罗丹明)、R6G(罗丹明6G)、酞菁、偶氮次甲(azomethine)、花菁(如Cy3、Cy3.5、Cy5)、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、N，N-二乙基-4-(5′-偶氮苯三唑基)-苯胺以及氨基吖啶。这些以及其它拉曼标签可以从商业渠道获得(例如，Molecular Probes，Eugene，OR)。

[0103] 多环芳香化合物一般可用作拉曼标签。可用的其它标签包括氰化物、硫醇、氯、溴、甲基、磷和硫。在某些实施方式中，碳纳米管可用作拉曼标签。标签在拉曼光谱中的用法是已知的(例如美国专利US 5,306,403和US 6,174,677)。

[0104] 拉曼标签可以直接与条码连接或者通过各种接头化合物与之连接。与拉曼标签共价连接的核苷酸可以从标准商业来源得到(例如，Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，IN；Promega Corp.，Madison，WI；Ambion，Inc.，Austin，TX；Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。含有活性基团、设计与其它分子如核苷酸或氨基酸进行共价反应的拉曼标签是商业可得的(例如，Molecular Probes，Eugene，OR)。

荧光标签

[0105] 可能使用的荧光标签包括但不限于荧光素、5-羧基荧光素(FAM)、2′7′-二甲氧基-4′5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、罗丹明、6-羧基罗丹明(R6G)、N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、4-(4′-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)以及5-(2′-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)。其它可用的荧光标签在本领域是已知的(例如，美国专利US 5,866,336)。各种荧光标签都可从商业渠道获得，例如Molecular Probes(Eugene，OR)。标记分子的荧光检测方法也是本领域熟知的，并且可以使用任何这样的已知方法。

[0106] 使用的发光标签包括但不限于稀土金属穴状化合物、三双吡啶二胺铕(europium trisbipyridine diamine)、铕穴状化合物或螯合物、三双吡啶铽(Tbtrisbipyridine)、二胺、二花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白(allopycocyanin)、别花青素B(allococyanin B)、藻青素C、藻青素R、硫胺素、藻胆青素(phycoerythrocyanin)、藻红素R、上转换或下转换磷(up-converting ordown-converting phosphor)、萤光素或吖啶酯(acridinium ester)。

纳米颗粒标签

[0107] 纳米颗粒可用作标签，例如在用各种方法检测条码时。制备纳米颗粒的方法是已知的(例如美国专利US 6,054,495；US 6,127,120；US 6,149,868；Lee和Meisel，J.Phys.Chem.86：3391-3395，1982)。纳米颗粒也可以从商业途径得到(例如，Nanoprobes Inc.，Yaphank，NY；Polysciences，Inc.，Warrington，PA)。虽然金或银纳米颗粒通常被用作标签，但纳米颗粒的任何类型或组合物都可以与条码连接，用作标签。

[0108] 使用的纳米颗粒可以是纳米颗粒的无规则聚集体(胶状纳米颗粒)。可选地，纳米颗粒可以被交联，以产生特殊的纳米颗粒聚集体，例如二聚体、三聚体、四聚体或其它聚集体。包含选择数目纳米颗粒的聚集体(二聚体、三聚体等)可以用已知的方法进行富集或提纯，例如在蔗糖溶液中的超离心法。

[0109] 适合用于连接条码的修饰纳米颗粒是商业可得的，例如Nanoprobes，Inc.(Yaphank，NY)的Nanogold^纳米颗粒。Nanogold^纳米颗粒可以用单个或多个马来酰亚胺、胺或其它基团连接在每个纳米颗粒上而获得。使用各种已知的接头化合物，可将这种修饰的纳米颗粒连接于条码。

金属标签

[0110] 标签可包括亚微米大小的金属标签(例如，Nicewarner-Pena等，Science 294：137-141，2001)。Nicewamer-Pena等(2001)公开了编码亚微米条纹(stripe)的多金属微棒(microrod)的方法，其由不同类型的金属组成。该系统可以产生大量可区分的标签-用两种金属可达4160个，用三种不同金属可多达8×10⁵个。这样的标签可与条码连接并被检测。将金属颗粒如金或银与寡核苷酸和其它类型分子连接的方法是本领域已知的(例如美国专利US 5,472,881)。

富勒烯标签

[0111] 富勒烯也可用作条码标签。产生富勒烯的方法是已知的(例如美国专利US 6,358,372)。通过类似于下面所述的关于碳纳米管的方法，可以对富勒烯进行衍生并连接于其它分子。标记富勒烯的条码可以用例如各种技术进行鉴定。

[0112] 可连接于条码并可检测的其它类型的已知标签被考虑在内。可能使用的标签的非限定性例子包括量子点(例如，Schoenfeld等，Proc.7th Int.Conf.onModulated Semiconductor Structures，Madrid，pp.605-608，1995；Zhao等，1st Int.Conf.on Low Dimensional Structures and Device，Singapore，pp.467-471，1995)。量子点和其它类型的标签也可以从商业渠道获得(例如，Quantum Dot Corp.，Hayward，CA)。

碳纳米管标签

[0113] 碳纳米管如单壁碳纳米管(SWNTs)也可用作标签。纳米管可以用例如拉曼光谱进行检测(例如，Freitag等，Phys.Rev.B 62：R2307-R2310，2000)。碳纳米管的特性，如电或光性质，至少部分取决于纳米管的大小。

[0114] 可以用本领域已知的各种技术制造碳纳米管，包括但不限于碳电弧放电法、通过烃催化裂解的化学气相沉积法、等离子体辅助的化学气相沉积法、催化含金属石墨靶的激光烧蚀或浓缩相电解(condensed-phase electrolysis)。(参见，例如，美国专利US 6,258,401；US 6,283,812和US 6,297,592)。使用本领域已知的任何方法，根据纳米管长度和直径，可将包括不同长度碳纳米管混合物的组合物分离成不连续的大小级别。例如，可以用质谱法，对纳米管进行大小分类(参见，Parker等，“High yield synthesis，separation and mass spectrometriccharacterization of fullerene C60-C266，”J.Am.Chem.Soc.113：7499-7503，1991)。碳纳米管也可以从商业渠道得到，例如CarboLex(Lexington，KY)、NanoLab(Watertown，MA)、Materials and Electrochemical Research(Tucson，AZ)或CarbonNano Technologies Inc.(Houston，TX)。

[0115] 可以用活性基团对碳纳米管进行衍生，以便于附着条码。例如，纳米管可以被衍生为含有羧酸基团(美国专利US 6,187,823)，羧酸基团可以用碳二亚胺交联剂与胺连接。

核苷酸标签

[0116] 核苷酸或碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶可以用于标记除寡核苷酸和核酸以外的分子条码。例如，基于肽的分子条码可以用核苷酸或嘌呤或嘧啶碱基标记。其它类型的嘌呤或嘧啶或其类似物也可用作标签，例如尿嘧啶、肌苷、2，6-二氨基嘌呤、5-氟-脱氧胞嘧啶、7-脱氮-脱氧腺嘌呤或7-脱氮-脱氧鸟嘌呤。其它标签包括碱基类似物。碱基是没有糖类或磷酸的含氮环结构。这些标签可以用光学技术如拉曼或荧光光谱进行检测。当要检测的靶分子是核酸或寡核苷酸时，使用核苷酸或核苷酸类似物标签是不合适的，这是因为条码的标签部分可能会与不同的靶分子杂交，而不与探针部分杂交。

氨基酸标签

[0117] 氨基酸也可用作标签。可能用作标签的氨基酸包括当不限于苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸、精氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸。

交联剂

[0118] 双功能交联剂可用于各种目的，例如将标签与条码连接。双功能交联剂可以根据其功能基如氨基、胍基、吲哚或羧基特定基团的专一性进行划分。在这些交联剂中，涉及自由氨基的交联剂由于其商业可得性、易于合成以及应用时温和的反应条件而受青睐(美国专利US 5,603,872和US 5,401,511)。可能使用的交联剂包括戊二醛(GAD)、双功能环氧乙烷(OXR)、乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)和碳二亚胺，例如1-乙基-3-(-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。

条码检测

[0119] 可以用本领域已知的任何方法检测条码。例如，可用荧光光谱法检测条码。可将几个荧光染料连接在单个条码上。条码中染料的量和化学性质将决定条码的荧光发射图谱。对于给定的条码组合物而言，信号可受到标签之间的相对距离影响，这是因为可能存在共振能量的转移。

[0120] 在其他实施方式中，可用拉曼光谱法检测条码。可将各种拉曼标签与条码连接，以便用已知的拉曼光谱技术进行检测，例如SERS(表面增强拉曼光谱法)。除了连接的拉曼标签外，条码骨架本身也可用作拉曼标签。DNA分子的不同碱基组合物产生不同的拉曼信号，这些信号可用于鉴定基于DNA的条码。各种具体的检测模式将在下面讨论。

拉曼光谱法

用于拉曼光谱法的表面

[0121] 各种形式的拉曼光谱法都利用标记(条码)分子接近表面所引起的拉曼信号的增强。在某些方法中，例如表面增强拉曼光谱法(SERS)或表面增强共振拉曼光谱法(SERRS)中，与拉曼活性金属表面如金、银、铝、铂、铜或其他金属的接近可增强拉曼信号达6或7个数量级。

其它类型的化合物也可用于增强SERS中的信号，例如LiF、NaF、KF、LiCl、NaCl、KCl、LiBr、NaBr、KBr、LiI、NaI和KI。具体地，LiCl已被证明能提高具体分析物(如dAMP、脱氧腺苷、腺苷、和腺嘌呤)的相对信号强度2到100倍。取决于感兴趣的分析物，与通常使用的NaCl比较，LiCl提高相对强度2倍以上。在其他实施方式中，对于分析物如脱氧鸟苷-一磷酸(deoxyguanosine-monophosphate)(dGMP)，NaBr或NaI比LiCl好。

拉曼检测器

[0122] 各种拉曼检测的方法在本领域是已知的。美国专利US 6,002,471公开了可用的拉曼检测装置的一个例子。正如所公开的，激发光束由532nm波长的Nd:YAG激光器或365nm波长的Ti:蓝宝石激光器产生。可使用脉冲激光光束或连续激光光束。激发光束通过共焦光学系统和显微镜物镜，并被聚焦在靶区域上。来自拉曼标记的拉曼发射光聚集于显微镜物镜和共焦光学系统并连到单色仪(monochromonator)，以分离光谱。共焦光学系统包括分色滤光器、阻挡层滤波器、共焦小孔、透镜和平面镜的组合，以减小背景信号。和共焦光学系统一样，也可使用标准的全视场光学系统。用任何已知的拉曼检测器检测信号。

[0123] 检测装置的可选例子在例如美国专利US 5,306,403中公开，其包括Spex Model 1403型双光栅分光光度计，它装备有镓-砷(GaAs)光电倍增管(RCAModel C31034或Burle Industries Model C3103402)，以单光子计数模式进行操作。

[0124] 另一个示例性拉曼检测装置包括激光和拉曼检测器。激发光束由近红外波长(750～950nm)的钛:蓝宝石激光器(SpectraPhysics公司的Tsunami)或者785nm或830nm的镓铝砷二极管激光器(Process Instruments公司的PI-ECL系列)产生。可使用脉冲激光束或连续激光束。激发光束由分色镜(Kaiser Optical公司的全息陷波滤波器或者Chroma或Omega Optical公司的干扰滤波器)反射为具有聚集光束的共线几何关系(collinear geometry)。反射的光束通过显微镜物镜(NikonLU系列)，被聚焦在条码结合的靶标所在的区域上。拉曼散射光由同一显微镜物镜聚集，并经过分色镜到达拉曼检测器。拉曼检测器包括聚焦透镜、摄谱仪和阵列式检测器。聚焦透镜将拉曼散射光聚焦，通过摄谱仪的入口。摄谱仪(RoperScientific)包括光珊，其按波长使光分散。分散的光成像在阵列检测仪上(RoperScientific公司的背景照明深度耗尽CCD照相机)。阵列检测器与控制器电路相连，并与计算机连接，以传输数据及控制检测器功能。

[0125] 可选的激发光源包括氮激光器(Laser Science Inc.)和氦-镉激光器(Liconox)(美国专利US 6,174,677)。激发光束用带通滤波器(Corion)进行光谱纯化并用6X物镜(Newport，Model L6X)进行聚焦。物镜用于激发感兴趣的分子和聚集拉曼信号(Kaiser Optical Systems，Inc.，Model HB 647-26N18)。全息陷波滤波器(Kaiser Optical Systems，Inc.)用于减小Rayleigh发散辐射。可使用其他类型的检测器，例如带电注入器件(charged injection device)、光电二极管阵列或光电晶体管阵列。

[0126] 对于多元条码，可选的检测系统包括译码重叠条码的差异。区分这些条码的一个方法可以是标准的DSP(数字信号处理)方法，使得例如可以区分信号单元中不同条码元素之间的距离(激发引起的波长吸收或位移、物理距离、隧道效应传导率等)。

[0127] 可以使用本领域已知的任何合适形式或构造的拉曼光谱法或相关技术，例如常规拉曼散射、共振拉曼散射、SERS、表面增强共振拉曼散射、相干反斯托克斯拉曼光谱法(CARS)、受激拉曼散射、逆转拉曼光谱法、受激增益拉曼光谱法、超拉曼散射、分子光学激光检查器(MOLE)或拉曼微探针或拉曼显微镜法或共焦拉曼显微分光光度计法、三维或扫描拉曼、拉曼饱和光谱法、时间分辨共振拉曼、拉曼去耦光谱法或UV-拉曼显微镜法。

微-电-机械系统(Micro-Electro-Mechanical Systems)(MEMS)

[0128] 可将条码制备、使用和/或检测的设备与较大设备和/或系统相结合。在某些实施方式中，这些设备包括微-电-机械系统(MEMS)。MEMS是包括机械元件、传感器、执行元件(actuator)和电子元件(electronics)的集成系统。所有这些组件都可以在硅基或等同衬底的常规芯片上通过微加工技术制造(例如，Voldman等，Ann.Rev.Biomed.Eng.1：401-425，1999)。MEMS的传感器组件用于测量机械、热、生物、化学、光学和/或磁现象，以便检测条码。电子元件处理来自传感器的信息，并控制执行组件，例如泵、阀、加热器等，从而控制MEMS的功能。

[0129] MEMS的电子组件可使用集成电路(IC)工艺(CMOS或两极处理工艺(Bipolar process))制造。这些电子组件可使用制造计算机芯片的照相平版印刷法和蚀刻法而带有图案。微机械组件用兼容的“显微机械加工”方法进行制造，其选择性地蚀刻硅芯片部分或者加入新的结构层，以形成机械和/或机电组件。

[0130] MEMS制造中的基本技术包括：在衬底上沉积薄膜层物质；用平版印刷法将有图案的掩模施用在膜的顶部；以及选择性地时刻膜。薄膜可以是几纳米到100微米范围。可用的沉积技术包括化学方法如化学气相沉积(CVD)、电镀、晶体取向附生(epitaxy)和热氧化以及物理方法如物理气相沉积(PVD)和浇铸。也可使用制造纳米机电系统的方法(参见，例如，Craighead，Science 290：1532-36，2000)。

[0131] 在一些实施方式中，设备和/或检测器可与各种充满流体的室相连，例如微流体通道(microfluidic channel)或纳米通道(nanochannel)。这些以及其他设备组件可以形成单个元件，例如以芯片(如半导体芯片)和/或微毛细管或微流体芯片(microfluidic chip)的形式。可选地，各个组件可以分开制造，再组合在一起。在这些芯片中使用的任何已知的物质可用于所公开的设备，例如硅、氧化硅、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、塑料、玻璃、石英等。

[0132] 批量制造芯片的技术在计算机芯片制造和/或微毛细管芯片制造中是众所周知的。这些芯片可以用本领域已知的任何方法制造，例如光蚀刻和蚀刻、激光烧蚀、注塑成形、浇铸、分子束外延、蘸水笔式纳米光刻法、化学气相沉积(CVD)制造、电子光束或聚焦离子束技术或压印技术。非限定性例子包括二氧化硅的传统铸型、干蚀刻；以及电子束平板光刻法。制造纳米机电系统的方法可用于某些实施方式。(参见，例如，Craighead，Science 290：1532-36，2000。)各种形式的微制造芯片是商业可得的，例如从Caliper Technologies Inc.(MountainView，CA)和ACLARA BioSciences Inc.(Mountain View，CA)获得。

[0133] 在某些实施方式中，可选择部分或所有的设备对于激发和发射频率的电磁辐射是透明的，以用于例如拉曼光谱法所进行的条码检测。合适的组件可以由物质如玻璃、硅、石英或其它任何光学透明物质制造。对于暴露于各种分析物如核酸、蛋白质和类似物的充满流体的区室，暴露于这些分子的表面可以通过涂覆进行修饰，以使表面从疏水性转变为亲水表面，和/或降低分子在表面的吸附。常规芯片材料如玻璃、硅、石英和/或PDMS的表面修饰是已知的(例如美国专利US 6,263,286)。这样的修饰包括，例如用商业可得的毛细管涂料(capillary coating)(Supelco，BellafoNTe，PA)、具有各种功能(例如聚环氧乙烷、丙烯酰胺等)的硅烷进行涂覆。

[0134] 在某些实施方式中，使用这种MEMS设备制备分子条码，以从未被结合的组分中分离形成的分子条码；使分子条码暴露于靶标；和/或检测与靶标结合的分子条码。

实施例

[0135] 下面的实施例用于说明本发明的优选实施方式。本领域的技术人员应当理解，在按照发明人所发现的本技术所进行的实施例中所公开的技术在本发明的实践中效果较好，因而可以被看作构成其实践的优选方式。然而，本领域的技术人员根据本公开内容应当理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，在公开的具体实施方式中可以进行许多改变，而仍获得类似或相似的结果。

实施例1.分子条码的拉曼检测

[0136] 图3说明带有附着的拉曼标签的示例性单链条码。示例性寡核苷酸序列301、302、303、304通过标准的亚磷酰胺化学合成。用于光学检测的标签被连接在寡核苷酸上，包括荧光染料ROX(羧基-X-罗丹明)310；FAM(6-羧基荧光素)320；和TAMRA(四甲基罗丹明)330。连接在每个条码上的染料标签的位置和类型如图3所示。在合成过程中，氨基附加在三个寡核苷酸302、303、304的5′端。

实施例2.分子条码的拉曼光谱

[0137] 对图3所示的分子条码进行SERS。SERS发射光谱如图4所示。样品含有220μl所示条码301、302、303、304在银凝胶和LiCl中的1μM溶液，将样品暴露于100ms的激光束，并记录表面增强拉曼光谱。光谱偏移大约1000CCD计数单位。如图4所示，即使三个分子条码302、303、304含有在同一寡核苷酸序列302、303、304上不同位置连接的同一拉曼标签330，但四个分子条码301、302、303、304中每一个都产生了可区别开的拉曼发射光谱。这证明了用本公开的方法产生可区别分子条码的可行性。

实施例3

[0138] 由附加在核苷酸上的几个示例性拉曼标签所产生的SERS光谱801、802、803、804、805、806如图8所示。各个拉曼标签所产生的光谱图801、802、803、804、805、806是容易区别的。样品含有220μl条码在银凝胶和LiCl中的1μM溶液，将样品暴露于100ms的激光束，并记录表面增强拉曼光谱。显示的是聚T[NeBu]T 801；聚T[EthdA]T 802；聚T[8Br-dA]T 803；聚T[2AmPur]T 804；[ThiSS]聚TdA 805和[5Acrd]聚dG[AmC7]806的SERS发射光谱。

实施例4

[0139] 对本发明的一个示例性实施方式进行说明。用译码方法确定核酸序列，如图5和图6/7所示。创建码组分文库或多个文库(图6，601、602、603、604)，使得文库的每个组分都具有相伴的标记(如拉曼标签)，该标记特异地、惟一地鉴定该组分(如3-mer)。将核酸与组分库或多个文库一起温育，使探针与靶序列605杂交。杂交的核酸受控通过微流体通道，在那里，它们流过激发源和检测器。检测码组分的发射光谱并传送到数据处理系统。通过将发射光谱和发射光谱被检测的次序与结合标记的码组分的光谱数据库比较，确定核酸的序列。

[0140] 例如，可以从怀疑有疾病的对象获得组织样品(如活体解剖样品或可能的血液样品)。通过本领域已知的技术可以产生单份细胞悬浮液，并用几种膜破裂缓冲液之一裂解细胞，以释放细胞内物质。用本领域已知的方法分离核酸(如苯酚/氯仿提取、凝胶纯化等)。纯化的核酸分子通过附着在尼龙膜、96孔微量滴定板或其它固定化基质上被固定。将码组分引入固定的核酸，例如一次一个或一次几个，并使其在预先确定的严紧性(NaCl含量)的缓冲液中与分子相互作用。将编码的探针与靶核酸杂交。在第一个或多个码组分杂交后，可以再加入另外的编码组分。通过大量洗涤，除去未杂交的码组分和相互杂交的码组分，只留下与固定的核酸杂交的码组分。然后逐个移去码组分并通过译码与码组分匹配的核酸序列进行阅读。根据期望的最终结果，测定所有或部分序列。将这些信息与被测试疾病的已知信息进行比较，具体序列的存在与否可确定相关问题疾病的对象状况。在一个例子中，与疾病相关的SNPs(单核苷酸多态性)被鉴定，从而不需要对固定的核酸进行完整测序。

[0141] 可选地，可将一个或多个码组分固定在表面上，如96孔平板，这些可用于捕获包含靶序列的相应核酸分子，例如已知的SNP、作为具体基因型的标志的插入或删除等。由于标签如拉曼标记的灵敏性，快速鉴定靶序列是可能的。

实施例5

[0142] 对本发明的一个示例性实施方式进行说明。如前所述纯化蛋白质或肽(例如稀有的调节蛋白质等)。然后，使用本领域熟知的技术，用纯化的蛋白质/肽产生抗体(单克隆抗体也可用本领域已知的技术产生)(Antibodier：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press，ColdSpring Harbor，NY，1988)。通过一同引入佐剂如弗氏完全或不完全佐剂，可提高抗原的反应性。将抗原附着于载体，例如牛血清清蛋白、匙孔血蓝蛋白，可提高抗原性。通过周期性地强化注射抗原，可提高动物的免疫响应。抗体1206分泌进入动物的循环系统，并通过出血或心脏穿刺(cardiac puncture)获取。抗体1206用熟知的方法与其它血液组分分离，例如血液凝块、离心、过滤和/或免疫亲和纯化(如采用抗兔抗体)或亲和层析(例如，蛋白A琼脂糖柱层析)。然后将这些抗体与图12所示的任何一个聚合物拉曼标记连接(例如，共价地连接)。然后用聚合物拉曼标记抗体鉴定具有许多分子的提取物中的蛋白质。可选地，可用聚合物拉曼标记抗体从众多分子的提取物中分离出几个相同的蛋白质，目的在于鉴定、进一步研究感兴趣的蛋白质；阻遏蛋白质的活性；鉴定与疾病相关的蛋白质等。由于聚合物拉曼标记分子(如聚合物拉曼标记Ab)容易被检测，因此也可将它用于诊断目的，以评估疾病的存在和/或程度。

实施例6.用图5-7所示的技术鉴定核酸序列：

[0143] 在一个实施方式中，用一个或多个拉曼标签修饰核酸。许多小而独特的拉曼标签是有效的。在一个例子中，图13说明了具有强而独特的拉曼标记的几个腺嘌呤类似物(其它如图8所示)。在一个例子中，将拉曼标签通过一个或多个碱基修饰与核酸连接，然后用这些修饰的碱基制造亚磷酰胺，用于寡核苷酸的化学分析。修饰碱基的亚磷酰胺可用本领域已知的技术制造(McBride，L.J.和Caruthers，M.H.(1983)“An investigation of several deoxynucleosidephosphoramidites useful for synthesizing deoxyoligonucleotides.”Tetrahedron Lett.24：245-248)。

[0144] 在一个实施方式中，码组分可以由大约10-20个碱基的长度组成。对于10-mer，这有4^10个可能的序列。对于20-mer，这有4^20个可能的序列。在实际应用中，靶序列(多个靶序列)是已知的或者序列可以分成序列子集。因此，例如，可用一个或多个拉曼标签标记和鉴别寡核苷酸。在一个例子中，如果使用10个不同的亚磷酰胺(每个具有不同的拉曼标签)，则如果每个合成的寡核苷酸序列有1个拉曼标签，那么可合成10个不同的寡聚体(oligo)；如果每个合成的寡核苷酸有2个拉曼标签，那么可合成55个寡聚体；如果每个寡核苷酸有3个标签，那么可合成175个寡聚体。例如，可使用亚磷酰胺合成寡核苷酸(码组分)，这些方法是本领域知晓的。举一个例子，一个组分可为ATGCGACGT(SEQ ID NO：3)，以呋喃甲基氨基嘌呤(KN)为标签(图13)，而另一个为GCTATAGCCG(SEQ IDNO：4)，以苯甲酰基-腺嘌呤(BA)为标签(图13)。许多条码组分可预先制备并存放备用。

[0145] 在一个实施方式中，用下面的方法制备条码。条码可以由几个码组分组装而成。条码模板可以是相对较长的多核苷酸，例如40个核苷酸的DNA片段，其可以用标准的亚磷酰胺化学方法合成：5′ ACGTCGCATT-CGGCTATAGC-TTTCTATAGCGCTATGGTAC 3′(SEQ ID NO：5)

[0146] 本例中下划线部分是容器部分，其它序列是探针部分。条码组分5′-ATGCGACGT(KN)-3′(SEQ ID NO：3)和5′-GCTATAGCCG(BA)-3′(SEQ IDNO：4)在标准条件下与容器部分杂交(例如，在200mM NaCl、10mM TrisHCl、pH7.5和1mM EDTA存在下，寡核苷酸的浓度为1到10μM)。因此，在本例中，探针部分由2条码组分表示，并通过将呋喃甲基氨基嘌呤和苯甲酰基-腺嘌呤都作为拉曼标签，测定其拉曼标记。为合成不同的条码模板，探针部分和容器部分相应地改变；不同的条码组分(预先制备)杂交在一起，形成新的条码。

[0105] 该技术可以用于，例如，通过分析对应于传染性物质的DNA或RNA的存在，检测传染性物质。在收集到样品并通过本领域已知技术从样品中提取核酸之后，将核酸消化(例如，通过限制酶、有限DNA酶消化等)，在生物素化ddNTP(Perkin Elmer Life Sciences)存在时，通过Terminal Transferase(来自New EnglandBiolabs)用生物素进行末端标记。在用凝胶过滤柱(Amersham-Pharmacia Biotech)去除自由核苷酸后，生物素化的DNAs被捕获在包被有链霉抗生物素的磁性珠子(Roche)上。然后用0.1N NaOH(对DNA)使核酸变性，分离2个互补链。在中和靶分子后，引入条码分子，以便结合互补序列。结合/洗涤缓冲液的一个例子是200mM NaCl、10mM TrisHCl、pH7.5和1mM EDTA。使用本领域已知的方法，可使用磁体(Dynal Corp)控制颗粒。

[0106] 在一个例子中，条码的探针部分与靶序列互补，例如，5’GTACCATAGCGCTATAGAAA 3’(SEQ ID NO：6)条码分子将与靶序列结合，从而通过本例中的磁体(Dyna珠子，Dyna)而被保留。将珠子与银胶体(由1mMAgNO3，用水1∶2稀释制得)和0.1M LiCl(最终浓度)混合。当颗粒通过拉曼检测器时，就可以检测与条码分子特定地结合的拉曼信号(KN和BA)。在本例中，该信息被用于确认一个或多个样品中具体传染性物质存在与否。

实施例7

用于检测蛋白质的条码-抗体

[0107] 另一个实施方式包括，如实施例6制备拉曼标记条码(或多个条码)，而条码然后与抗体连接，用于检测抗原(如蛋白质)。由此，制备条码制剂并制造DNA标记的抗体。例如，用在200μl 0.1xPBS(稀释自10xPBS，从Ambion获得)中的20μg(52纳摩尔)磺基-GMBS(Pierce Cat.No.22324)在37℃时活化IgG抗体(例如，200μg(1.33纳摩尔))30min，再在室温下活化30min。然后使溶液通过PD-10柱(Amersham-Pharmacia)，收集含有抗体的组分。硫醇修饰的DNA寡聚物由商家合成(Qiagen-Operon)。在根据商家的说明还原二硫键(如DTT处理)后，将DNA寡聚物(如13纳摩尔)与纯化且活化的抗体混合。反应在室温进行2小时并在4℃过夜。然后用离子交换柱(Amersham-Pharmacia)纯化DNA-抗体，使用例如0-2M NaCl梯度。收集既含有DNA又含有蛋白质的组分。在采用本领域已知的技术进行脱盐和浓缩处理后，将样品用于抗原的结合(蛋白质检测)。

[0108] 几种方法可用于将抗原(如蛋白质)固定在固体支持物上。优选地，对于拉曼检测，可通过EDC化学方法，将捕获的抗体固定在金表面上(捕获抗体和检测抗体应当识别同一抗原，其可从商家获得，例如R&D System和BDBiosciences)(Benson等，Science，193，(2001)，1641-1644)。将含有靶抗原(如蛋白质)的样品稀释在1xPBS中，然后施用于固体表面，进行特异性结合。例如，使DNA标记抗体与捕获的抗原(如蛋白质靶标)结合。然后进行标准的免疫测试过程，一般地，使用1xPBS和0.05％Tween-20(吐温-20)。一旦发生了结合，就可将互补的拉曼标记DNA与固定的与检测抗体相连的DNA寡聚物相结合。一般地，条码分子在2xPBS和1□g/ml酵母tRNA(Sigma)中的浓度可以为10nM。在用1xPBS洗涤之后，将银胶体(由1mM AgNO3，用水1∶2稀释制得)加入结合表面，然后将LiCl加到0.1M，接着进行拉曼测定。由于与抗体连接的DNA寡聚物与条码的探针部分互补，因此条码标记的存在将表明抗体的存在，进而表明靶抗原(蛋白质)的存在。当不同的捕获抗体和DNA标记检测抗体用于同一系统中时，用这种方法可同时检测几个不同的抗原。

[0109] 根据本公开内容，在没有不适当的实验方法的情况下，可制造和使用这里公开的和要求保护的所有方法、组合物和设备。对本领域技术人员来说，显而易见的是，在不偏离要求保护主题的概念、精神和范围的情况下，可以对这里所述的方法、组合物和设备进行改变。更具体地，显然，化学及生理学关联的某种试剂(物质)可以替代这里所述的试剂(物质)，同时获得相同的或相似的结果。对本领域技术人员显而易见的所有这些类似的替代和修饰都被认为在所要求保护主题的精神、范围和概念之内。

Claims

1.一种方法，包括：

获得条码，所述条码包括与有机分子骨架相连的两个或更多个标签；

将所述条码与靶结合；以及

检测与所述靶结合的所述条码。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述骨架包括选自核酸、肽、多糖、生物聚合物和合成聚合物中的至少一种分子。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述核酸是单链DNA。

4.如权利要求2所述的方法，其中所述骨架包括共价连接于肽的核酸。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述标签选自核酸、核苷酸、核苷酸类似物、碱基类似物、荧光染料、肽、氨基酸、修饰氨基酸、有机部分、拉曼标签、量子点、碳纳米管、富勒烯、亚微米金属颗粒、电子致密颗粒和晶体颗粒。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述骨架包括一种或多种支化的核酸。

7.如权利要求6所述的方法，其中支链位于骨架上预先确定的位置。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述条码用选自荧光光谱法、拉曼光谱法、傅里叶变换红外光谱法(FTIR)和表面等离子体共振法的技术进行检测。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述条码通过探针部分与靶结合。

10.如权利要求1所述的方法，其中可区分的条码通过同一标签连接在同一骨架上不同位置而产生。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述靶选自蛋白质、肽、糖蛋白、脂蛋白、感染性蛋白、核酸、多核苷酸、寡核苷酸、脂、脂肪酸、糖类、糖脂、磷脂、鞘脂、脂多糖、多糖、真核细胞、原核细胞、细菌、噬菌体、病毒和病原体。

12.一种方法，包括：

获得核酸模板，所述核酸模板包括容器部分和探针部分；和

将一种或多种标记寡核苷酸与所述容器部分杂交，形成条码。

13.如权利要求12所述的方法，进一步包括将所述条码与靶结合。

14.如权利要求13所述的方法，进一步包括检测与所述靶结合的所述条码。

15.制造聚合物拉曼标记的方法，包括：

获得两个或多个单体单元；和

聚合所述单体单元，形成聚合物拉曼标记。

16.如权利要求15所述的方法，其中每一单体单元包括拉曼标签。

17.如权利要求16所述的方法，其中在单个聚合物拉曼标记中的每个拉曼标签是不同的。

18.如权利要求16所述的方法，其中所述拉曼标签通过间隔部分与聚合物拉曼标记的骨架连接。

19.如权利要求15所述的方法，其中在单体单元的聚合之后，将拉曼标签与聚合物拉曼标记连接。

20.如权利要求15所述的方法，进一步包括，在单体单元的一端去保护功能基，以及在所述单体单元与所述聚合物拉曼标记之间形成共价键。

21.如权利要求15所述的方法，进一步包括产生次级聚合单元，每个次级聚合单元包括预先确定数目的单体单元。

22.如权利要求15所述的方法，进一步包括将所述聚合物拉曼标记与固体支持物连接。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述固体支持物是纳米颗粒或珠子。

24.如权利要求15所述的方法，进一步包括将探针连接在所述聚合物拉曼标记上。

25.如权利要求24所述的方法，进一步包括将所述探针与靶结合。

26.如权利要求25所述的方法，进一步包括检测与所述靶结合的所述探针。

27.一种聚合物拉曼标记，其包括：

两个或更多个单体单元，其相互共价地连接；

两个或更多个拉曼标签；和

至少一个探针。

28.如权利要求27所述的聚合物拉曼标记，进一步包括与所述聚合物拉曼标记连接的纳米颗粒或珠子。

29.如权利要求27所述的聚合物拉曼标记，其中标记中每个拉曼标签是不同的。

30.如权利要求27所述的聚合物拉曼标记，进一步包括每个拉曼标签的两个或更多个拷贝。

31.一种系统，其包括：

成像仪器；

至少一个与探针连接的条码；和

至少一个与所述探针结合的靶。

32.如权利要求31所述的系统，其中所述成像仪器选自荧光仪器、拉曼仪器和FTIR仪器。

33.如权利要求31所述的系统，其中每个条码包括两个或更多个拉曼标签。

34.如权利要求33所述的系统，其中在单个条码上的每个拉曼标签具有不同的拉曼发射光谱。