CN1849136A - 癌症疾病改善抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种使用新颖的筛选模式制备患者癌症疾病改善抗体的方法。通过使用癌症细胞毒性作为终点分离抗癌抗体，本方法使得制备用于治疗和诊断目的的抗癌抗体成为可能。所述抗体可被用于协助对癌症的定级和诊断，且能被用于治疗原发肿瘤和肿瘤转移。抗癌抗体能够与毒素、酶、放射性化合物和造血细胞偶联。

Description

癌症疾病改善抗体
技术领域
本发明涉及癌症疾病改善抗体(CDMAB)的分离和制备以及这些CDMAB在治疗和诊断过程中的应用，选择性地与一种或多种化疗试剂组合应用。本发明进一步涉及运用本发明的CDMAB进行的结合实验。
背景技术
每个患有癌症的个体是独特的，正如人的身份有所不同，其所患癌症不同于其它癌症。尽管如此，目前的治疗采用相同的方法治疗患有同类癌症处于同样阶段的所有患者。这些患者中至少有30％在一线治疗(first line treatment)中失败，由此造成更多轮次的治疗，增加了治疗失败、癌症转移和最终死亡的可能性。治疗的最佳方法是针对特定个体定制疗法。当前唯一的定制疗法是外科手术。化疗和放疗不能针对患者进行设计，而手术本身在大多数病例中不足以治愈癌症。
伴随着单克隆抗体的出现，发展定制疗法的可能性变得更加现实，因为各抗体可以导向单个抗原决定簇。进一步地，制备导向一群抗原决定簇的抗体组合成为可能，这些抗原决定簇唯一地定义了特定个体的癌症。
在认识到癌细胞和正常细胞之间的显著差异在于癌细胞含有转化细胞所特有的抗原后，科学界长期认为可以设计单克隆抗体通过与这些癌抗原的特异结合专一地作用于转化细胞；由此产生信念认为单克隆抗体可以作为“魔术子弹”去除癌细胞。
根据本发明公开的方法分离出的单克隆抗体已经显示能够以有利于患者的方式改善癌症疾病的进程，例如通过降低肿瘤负荷。这些单克隆抗体在此被称作癌症疾病改善抗体(CDMAB)或“抗癌”抗体。
当前，癌症患者的治疗选择通常很少。统一而严格的癌症治疗方法在整体存活和发病率方面有所改善。然而，对于特定个体，这些改善了的统计数字和他们个人情况的改善没有必然关联。
因此，如果采用方法学使得操作者能够在同组患者中独立于其他患者治疗每一例癌症，该方法学将允许针对每个人进行独特设计的治疗。理想地，这样的治疗过程将提高治愈率，产生更好的效果，由此满足长期需要。
历史上，多克隆抗体在人癌症的治疗中已取得了有限的成功。已经采用人血浆对淋巴瘤和白血病进行了治疗，但是几乎没有长期的缓解或应答。此外，该方法缺乏可重复性，和化疗相比没有额外的益处。已经采用人全血、黑猩猩血清、人血浆和马血清对实体瘤如乳腺癌、黑素瘤和肾细胞癌进行了治疗，相应产生了无法预测和无效的结果。
已经进行了很多用单克隆抗体治疗实体瘤的临床实验。在20世纪80年代针对人乳腺癌进行了至少4次临床实验，用针对特定抗原或基于组织选择性的抗体在至少47名患者中只产生了1名应答者。直到1998年才使用人源化抗Her 2抗体结合顺铂进行了成功的临床实验。在该实验中对37名患者的应答进行了观察，其中大约四分之一有部分应答率，另一半具有较慢或稳定的疾病进程。
研究结直肠癌的临床实验采用了针对糖蛋白和糖脂靶点的抗体。诸如对腺癌有一定专一性的17-1A抗体，已经进入了二期临床，在60多名患者中只有1名产生了部分应答。在其它实验中，在附加使用环磷酰胺的方法中，17-1A的使用在52名患者中只产生了一个完全应答和两个微弱应答。其它使用17-1A的实验产生的效果相似。起初被批准用来成像的人源化鼠单克隆抗体的使用同样不能引起肿瘤的消退。迄今为止还没有能够有效治疗结直肠癌的抗体。同样的，对于肺癌、脑癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌的治疗效果均不能令人满意。用抗GD3单克隆抗体治疗黑素瘤已经取得了有限的成功。因此，可以看出尽管有成功的小动物实验，这些实验是人临床试验的前提，但已测试的抗体大部分还是无效的。
现有专利
美国专利号5,750,102公开了一种用MHC基因转染患者肿瘤细胞的方法，MHC基因可以从患者的细胞或组织克隆。随后用这些转染的细胞对患者进行预防接种。
美国专利号4,861,581公开的方法包括的步骤有：获取对哺乳动物肿瘤和正常细胞的一种细胞内组分而非胞外组分具有专一性的单克隆抗体；标记单克隆抗体；将标记后的抗体与接受治疗的哺乳动物组织进行接触以杀死肿瘤细胞；以及通过测定标记抗体与降解的肿瘤细胞胞内组分的结合确定疗效。在制备针对人胞内抗原的抗体时，专利权人认识到恶性细胞代表了这类抗原的便捷来源。
美国专利号5,171,665提供了一种全新抗体及该抗体的制备方法。特别地，该专利对一种单克隆抗体的形成进行了指导，该单克隆抗体可以和人肿瘤相关蛋白抗原发生很强地结合，例如结肠癌和肺癌，但和正常细胞的结合程度小得多。
美国专利号5,484,596提供了一种癌症治疗的方法，该方法包括：从人癌症患者体内手术去除肿瘤组织；处理肿瘤组织获得肿瘤细胞；照射肿瘤细胞，使其可以存活但不再是致瘤的；以及采用这些细胞为患者制备疫苗，该疫苗能够抑制原发瘤的复发并同时抑制肿瘤转移。该专利对与肿瘤细胞表面抗原反应的单克隆抗体的开发进行了指导。如第4列第45行及其以后所述，专利权人用内源性肿瘤细胞开发单克隆抗体，在人肿瘤形成中形成有活性的专一免疫疗法。
美国专利号5,693,763提供了人癌症特征性的糖蛋白抗原，且其不依赖于其来源的上皮组织。
美国专利号5,783,186提出了诱导Her2表达细胞凋亡的抗Her2抗体，生成抗体的杂交瘤细胞系，用抗体和含有所述抗体的药物组合物治疗癌症的方法。
美国专利号5,849,876描述了新的杂交瘤细胞系，该细胞系可生成从肿瘤和非肿瘤组织源中纯化出的粘蛋白抗原的单克隆抗体。
美国专利号5,869,268提出了人淋巴细胞的生成方法，该淋巴细胞产生专一针对目标抗原的抗体，生产单克隆抗体的方法以及用这种方法生产的单克隆抗体。该专利特别提到一种抗-HD人单克隆抗体的制备，该抗体可用于癌症的诊断和治疗。
美国专利号5,869,045涉及与人体癌症细胞反应的抗体、抗体片段、抗体偶联物和单链免疫毒素。这些抗体的功能机制是双重的，分子与人癌表面上的细胞膜抗原反应，进一步地抗体在结合之后能够内化进癌细胞，使它们特别适于形成抗体-药物和抗体-毒素偶联物。在特定浓度下未修饰的抗体同样具有明显的细胞毒性。
美国专利号5,780,033公开了自身抗体在肿瘤治疗和预防中的应用。但是，该抗体是源自老年哺乳动物的抗细胞核自身抗体。在该例中，自身抗体据称是免疫系统中发现的一类天然抗体。因为自身抗体来自“老年哺乳动物”，因此不要求自身抗体真正来自接受治疗的患者。此外该专利公开了老年哺乳动物中的天然和单克隆抗核自身抗体，以及制备单克隆抗核自身抗体的杂交瘤细胞系。
发明内容
本发明的发明者此前已被授予名为“个性化的患者专一性抗癌抗体(Individualized Patient Specific Anti-Cancer Antibodies)”的美国专利6,180,357，该专利提出了个性化定制的用于治疗癌症疾病的抗癌抗体的选择方法。为了本文的目的，术语“抗体”和“单克隆抗体”(mAb)可交替使用来指：杂交瘤(例如鼠或人的)生成的完整的免疫球蛋白、免疫偶联物和合适的由免疫球蛋白衍生出的免疫球蛋白片段和重组蛋白，如嵌合的和人源化免疫球蛋白、F(ab’)和F(ab’)2片段、单链抗体、重组免疫球蛋白可变区(Fv)等。进一步地，将标准的化疗模式例如放射核与本发明的CDMAB偶联由此关注所述化疗的应用也在本发明的范围内。CDMAB还可以与毒素、细胞毒成份或酶如生物素偶联酶偶联。
本申请使用‘357专利中生产患者专一性抗癌抗体的方法分离杂交瘤细胞系，这些细胞系编码癌症疾病改善单克隆抗体。这些抗体可以专一性地针对一种肿瘤制备，由此使得癌症治疗的定制成为可能。在本申请全文中，具有杀死细胞(细胞毒性的)或抑制细胞生长(抑制细胞生长的)性质的抗癌抗体在此后将被称作细胞毒性的。这些抗体可用于帮助癌症的定级和诊断，也可用于肿瘤转移的治疗。
个性化抗癌治疗的前景将给患者的管理方式带来改变。可能出现的临床情景是在肿瘤出现时获取并储存肿瘤样品。通过这个样品，可以用一组既存的癌症疾病改善抗体检测肿瘤的类型。患者将会按常规定级但是适用的抗体可以用于对患者进一步的定级。可以用存在的抗体立即对患者进行治疗，且/或可以使用在此概述的方法或通过噬菌体表面展示文库结合在此公开的筛选方法制备一组肿瘤专一抗体。将生成的所有抗体加入抗癌抗体文库，因为其它肿瘤可能与正在接受治疗的肿瘤存在部分相同的抗原决定簇。根据本方法生产的抗体可用于治疗任意数量患者的癌症疾病，如果这些患者的癌症可以与这些抗体结合。
基本使用美国专利6,180,370的方法，在用患者肺肿瘤活检细胞使小鼠免疫之后，获得小鼠单克隆抗体H460-16-2。H460-16-2抗原在来自不同组织的广泛的人细胞系的细胞表面表达。乳腺癌细胞系MDA-MB-231(MB-231)是经测试的2种癌细胞系中唯一对H460-16-2细胞毒效应敏感的细胞系。
在细胞培养中H460-16-2对MB-231细胞的细胞毒性结果通过在其被移植进小鼠时对这些细胞的抗肿瘤活性得以进一步延伸。在乳腺癌体内模型中，人MB-231细胞被移植进免疫缺陷小鼠后颈部的皮肤下，因为这些小鼠由于缺乏某些免疫细胞不能拒绝人肿瘤细胞。临床前异种移植肿瘤模型被认为是治疗功效的有效预测。小鼠中的异种移植物生长为实体瘤，形成间质、中央坏死和新生血管。哺乳动物肿瘤细胞系MB-231已被评为免疫缺陷小鼠的体内异种移植模型。MB-231肿瘤的成功移植或“获取率”以及肿瘤对标准化疗试剂的敏感性说明其是合适的模型。在异种移植肿瘤模型中，母细胞系及细胞系的变体已被用于异种移植肿瘤模型对广泛的治疗试剂进行评估。
在人乳腺癌的预防性体内模型中，在肿瘤细胞移植前1天用H460-16-2对小鼠给药并在随后的7周每周注射。在治疗期间，H460-16-2治疗比同型对照抗体显著更有效地(p＜0.0001)抑制肿瘤生长，同型对照抗体在结构和大小上与H460-16-2相同但不能结合MB-231细胞。在治疗期结束时，接受H460-16-2的小鼠其肿瘤生长只有对照组的1.3％。在治疗后的后续期间，H460-16-2的治疗效应继续维持，且直到测量期结束，治疗组的平均肿瘤体积一直显著地小于对照组。使用存活作为抗体效应的衡量指标，据估计在治疗后的70天，H460-16-2治疗组中的死亡风险是抗体缓冲液对照组的大约71％(p＝0.028)。这些数据说明H460-16-2治疗与对照治疗组相比具有存活益处。由于没有诱导任何毒性迹象，包括体重降低和临床痛苦，H460-16-2治疗似乎是安全的。因此，H460-16-2治疗是有效的，因为在完善的人乳腺癌模型中它与对照治疗组相比延缓了肿瘤的生长并提高了存活。这些结果也是可重复的，因为在另一个此类研究中观察到相似的发现且暗示其与人癌症治疗的关联和益处。
除了乳腺癌的预防性体内肿瘤模型，H460-16-2在体内成熟肿瘤的模型中证明了对MB-231细胞的抗肿瘤活性。在该异种移植肿瘤模型中，MB-231乳腺癌细胞被皮下移植进免疫缺陷小鼠由此在抗体治疗前肿瘤达到临界尺寸。将H460-16-2的治疗和标准化疗药物顺铂比较，比较显示顺铂和H460-16-2治疗组和接受抗体稀释缓冲液或同型对照抗体治疗的组相比具有显著小的平均肿瘤体积(p＜0.001)。H460-16-2治疗介导了大约为顺铂化疗2/3的肿瘤抑制但没有顺铂治疗中观察到的显著的体重降低(p＜0.003)和临床痛苦。H460-16-2的抗肿瘤活性及其最小化的毒性使其成为一种具有吸引力的抗癌治疗试剂。
在治疗后阶段，H460-16-2显示了显著的存活益处(p＜0.02)，因为在治疗后的＞70天，H460-16-2组的死亡风险是同型对照抗体组的一半。观察到的存活益处持续到治疗后的120天，其时相比于67％的H460-16-2治疗组，100％的同型对照和顺铂治疗小鼠死亡。和同型对照抗体组相比，通过以26％的比例延缓肿瘤生长，H460-16-2维持对肿瘤的抑制。在治疗后的31天，H460-16-2通过以相对于同型对照组48％的比例减慢肿瘤生长从而限制肿瘤体积，这和在治疗结束时观察到的49％的降低相当。在乳腺癌的成熟肿瘤模型中，这些结果意味着H460-16-2在治疗期以外维持肿瘤抑制的滑力且证明了抗体在哺乳动物体内降低肿瘤负荷和提高存活的能力。
通过免疫组织化学(IHC)染色，用H460-16-2对取自多个器官的小鼠组织切片染色以在不同组织的各细胞型中定位H460-16-2抗原。与H460-16-2在体内对MB-231细胞的肿瘤抑制效应相一致，H460-16-2抗原在从皮下移植了MB-231细胞的未经治疗的小鼠中获得的肿瘤组织切片中大量表达。在小鼠正常组织中必须表达H460-16-2抗原以支持小鼠成为H460-16-2毒性的合适模型。观察到H460-16-2抗原在小鼠中呈现有限的表达模式，因为该抗原仅在肾脏和卵巢表达。为了证实小鼠是毒性的合适模型，在正常的人组织中需要有相似的抗原表达。
为了临床实验和验证合适的毒性动物模型，确定了H460-16-2对正常人组织的专一性。通过H460-16-2的IHC染色，大部分组织没有表达H460-16-2抗原，包括要害器官如肝脏、肾脏、心脏和肺。H460-16-2对皮肤、输尿管、胃和前列腺发生了染色，并对唾液腺发生了强染色。组织染色的结果意味着H460-16-2呈现对各种细胞类型的受限结合但与浸润巨噬细胞、淋巴细胞和纤维原细胞结合。因此，数据显示小鼠可能不是毒性的最佳模型，因为尽管小鼠和人都呈现了有限的H460-16-2组织表达，两物种之间染色阳性的组织并不相同。
H460-16-2抗原的定位及其在乳腺癌患者中的普遍性对评价H460-16-2免疫治疗对患者的益处和设计有效临床实验是重要的。为了弄清H460-16-2抗原在癌症患者乳腺肿瘤中的表达，对来自50个乳腺癌患者的肿瘤组织样品中H460-16-2抗原的表达进行了筛选。研究结果显示64％的组织为H460-16-2抗原染色阳性。在患者样品中H460-16-2的表达似乎对癌细胞具有专一性因为染色限制在恶性细胞。相反，H460-16-2对乳腺癌患者9个正常组织样品中的2个发生了染色。乳腺肿瘤中H460-16-2抗原的表达似乎主要定位在恶性细胞的细胞膜上，使其成为具有吸引力的治疗靶点。基于雌激素和孕酮受体在乳腺肿瘤中的表达对H460-16-2的表达进行了进一步的评估，这两种激素受体在乳腺肿瘤的发展、治疗和预后中发挥重要作用。在H460-16-2抗原表达和雌激素或孕酮受体表达之间没有明显的关联性。当根据肿瘤的阶段或癌症发展的程度分析肿瘤时，结果暗示更高的肿瘤阶段伴随着更强的阳性表达的趋势，但结果受到样品数量少的局限。
为了进一步延伸H460-16-2的潜在治疗益处，确定了在各种人癌症组织中抗原的频率和定位。除了乳腺癌，一些癌症类型是H460-16-2抗原阳性的。阳性的人癌症类型包括皮肤(1/2)、肺(4/4)、肝脏(2/3)、胃(4/5)和肾脏(3/3)。一些癌症不表达抗原；这些癌症包括卵巢(0/3)、肾上腺(0/2)和小肠(0/1)。和人乳腺肿瘤组织一样，定位主要发生在肿瘤细胞的细胞膜上。因此，除了H460-16-2抗体在体外与癌细胞系结合，有证据说明抗原在人体中表达，并在多种癌症类型中表达。总之，该数据说明H460-16-2抗原是癌症相关抗原且在人体中表达，且其是病理相关癌症靶点。此外，该数据还证明H460-16-2抗体与人癌症组织的结合，且该数据可被合适地用于诊断性、治疗预测性或预后性分析。此外，该抗原的细胞膜定位对细胞的癌状态具有指示性，因为在大部分非恶性细胞中没有抗原的表达，并且该观察允许该抗原的应用，允许其基因或衍生物、其蛋白或衍生物被用于诊断性、治疗预测性或预后性分析。
原始数据显示H460-16-2识别的抗原可能是一种已知为96kDa热休克蛋白(gp96)的肿瘤排斥抗原的变体。这一点得到生化研究的支持，生化研究显示与gp96反应的单克隆抗体识别与H460-16-2结合的蛋白。通过使用H460-16-2和抗gp96抗体对小鼠组织的IHC分析，gp96抗原似乎比H460-16-2抗原更广泛地表达。这些结果与对正常人组织的IHC染色结果相似，因为H460-16-2抗原和gp96抗原相比在更小的一组细胞上表达。人乳腺肿瘤组织的IHC分析说明gp96抗原更加普遍，大约84％的样品为抗gp96抗体染色阳性。gp96抗原相比H460-16-2表达也不同，其在细胞质和细胞膜都呈现出大量定位。这些结果因此暗示H460-16-2可能是gp96的变体。
总之，本发明指导了H460-16-2抗原作为治疗试剂靶点的应用，该试剂在给药时能够降低哺乳动物体内表达抗原的癌症的肿瘤负荷，且还能够延长受治疗哺乳动物的存活。本发明还指导了CDMAB(H460-16-2)及其衍生物靶向其抗原以降低哺乳动物体内表达抗原的癌症的肿瘤负荷的应用和延长患有表达该抗原的肿瘤的哺乳动物存活的应用。此外，本发明还指导了在癌细胞中检测H460-16-2抗原的应用，该应用可用于对患有表达该抗原的肿瘤的哺乳动物的诊断、治疗预测和预后。
如果患者对治疗的初始阶段不敏感或发生转移，可以重复产生肿瘤专一性抗体的过程用于再治疗。此外，可以将抗癌抗体与从患者体内获得的红血细胞偶联并重输注用于转移的治疗。对转移型癌症很少有有效的治疗且转移通常预示着不理想的结果导致死亡。但是，转移型癌症常常是充分血管化的且红血细胞对抗癌抗体的运送具有在肿瘤位点聚集抗体的作用。甚至在转移前，大部分癌细胞的存活依赖于宿主的血液供应，且与血红细胞偶联的抗癌抗体对原位肿瘤也是有效的。可替换地，抗体可以与其它造血细胞偶联，例如淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、自然杀手细胞等。
有5类抗体且各类抗体与一种由其重链赋予的功能关联。一般认为由裸抗体杀死癌细胞由抗体依赖细胞介导细胞毒性(ADCC)或补体依赖细胞毒性(CDC)介导。例如小鼠IgM以及IgG2a抗体可以通过与补体系统中的C-1成分结合激活人的补体，由此激活补体活化的经典通路，该通路可导致肿瘤降解。对于人抗体，最有效的补体激活抗体一般为IgM和IgG1。小鼠IgG2a和IgG3同型抗体有效募集具有Fc受体的细胞毒性细胞，由此造成单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和某些淋巴细胞的杀细胞作用。人的IgG1和IgG3同型抗体均介导ADCC。
抗体介导的癌症杀死的另一个可能的机制可能通过抗体的应用，这些抗体能够催化细胞膜及其相关糖蛋白或糖脂中的各种化学键的水解，即所谓的催化抗体。
有另外两种更广为接受的抗体介导癌症细胞杀死机制。第一种机制是将抗体用作疫苗以诱导抗体产生对位于癌细胞上的推定抗原的免疫反应。第二种机制是将抗体用于靶向生长受体并干扰它们的功能或下调受体以有效地使其功能丧失。
因此，本发明的目的是利用从来自特定个体的细胞中制备癌症疾病改善抗体的方法来分离杂交瘤细胞系和相应的由所述杂交瘤细胞系编码的分离的单克隆抗体及其抗原结合片段，该疾病改善抗体对癌细胞是细胞毒性的，但同时对非癌细胞相对无毒。
本发明的另一目的是指导CDMAB及其抗原结合片段。
本发明的进一步的目的是制备CDMAB，其细胞毒性通过ADCC介导。
本发明的进一步的目的是制备CDMAB，其细胞毒性通过CDC介导。
本发明的进一步的目的是制备CDMAB，其细胞毒性是其催化细胞化学键水解能力的一个功能。
本发明的进一步的目的是制备CDMAB，该抗体在癌症诊断、预后和监测的结合实验中有用。
通过以下说明，其中通过图解和实施例的方式阐述了本发明的某些具体实施方式，本发明的其它目的和优势将变得明显。
附图简要说明
本专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。在提出要求并支付了必要费用后，专利局将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开文本的复印件。
图1.显示在研究期间不同治疗组的平均体重的直方图。数据表示为在各时间点各组的平均值+/-SEM。
图2.在预防性MB-231乳腺癌模型中H460-16-2对肿瘤生长的作用。虚线表示抗体给药的期间。数据点代表平均值+/-SEM。
图3.在H460-16-2、缓冲液和同型对照抗体治疗后患肿瘤小鼠的存活。在治疗后70天内监测小鼠的存活。
图4.在成熟MDA-MB-231乳腺癌模型中H460-16-2对肿瘤生长的作用。虚线表示抗体给药的期间。数据点代表平均值+/-SEM。
图5.ARH460-16-2和顺铂的治疗功效或抗肿瘤作用的图示。生长抑制计算为治疗的肿瘤体积中值相对于同型对照治疗组的百分率：T/C×100，其中T是第X天治疗组的肿瘤中值，且C是第X天对照组的肿瘤体积中值。虚线表示治疗的期间。
图6.在治疗期前和后的实验组动物的平均体重。
图7.在H460-16-2、顺铂或同型对照抗体治疗后患肿瘤小鼠的存活。在治疗后60天内监测小鼠的存活。
图8.从SCID小鼠外植的人MB-231乳腺癌。A.抗波形丝蛋白。B.H460-16-2。C.抗gp96。箭头指向带有细胞质和点状染色的细胞。放大率为100X。
图9.小鼠肝脏。A.抗波形丝蛋白。B.H460-16-2。C.抗gp96。数以肝细胞的抗gp96阳性染色。放大率为100X。
图10.小鼠肾脏。A.抗波形丝蛋白。B.H460-16-2。箭头指向肾小管细胞的顶端(apical)染色。C.抗gp96。箭头指向肾小管细胞的弥散(iffuse)染色。放大率为100X。
图11.小鼠卵巢。A.抗波形丝蛋白。B.H460-16-2。箭头指向滤泡中卵子的胞质染色。C.抗gp96。箭头指向粒细胞。放大率为100X。
图12.H460-16-2结合乳腺癌肿瘤(浸润型导管癌)的代表性显微图。在图中的黄色和橙色箭头分别指向黏膜细胞和恶性细胞层。放大率为100X。
图13.显示H460-16-2(A)和抗gp96抗体(B)在乳腺癌组织阵列的浸润型导管癌样品的组织切片上的结合模式的代表性显微图。蓝色箭头表示抗原靶的细胞定位。放大率为200X。
本发明的详细说明
实施例1
根据布达佩斯条约，杂交瘤细胞系H460-16-2在2002年9月4日保藏于美国典型菌种保藏中心(American Type Culture Collection)，弗吉尼亚马纳萨斯大学大街10801，20110-2209，其保藏号为PTA-4621。根据37CFR1.808，保藏者保证在专利授权后将永久取消被保藏材料在公众使用方面的所有限制。
通过在CL-1000瓶(BD Biosciences，Oakville，ON)里培养杂交瘤制备H460-16-2单克隆抗体，每周两次进行收集和重新接种，且根据Protein G Sepharose 4 Fast Flow(Amersham Biosciences，Baie d′Urfe，QC)的标准抗体纯化步骤进行纯化抗体。
体内预防性肿瘤实验
参考图1和2中显示的数据，将含有5百万MB-231人乳腺癌细胞的100微升盐溶液皮下注射进小鼠后颈部移植进4至8周大的雌性SCID小鼠。将小鼠随机分成3个治疗组，每组10只。在灌输20mg/kg的H460-16-2测试抗体之前一天，在用含有2.7mM KCl、1mM KH2PO4、137mM NaCl和20mM Na2HPO4的稀释液从储备浓度稀释后，将体积为300微升的抗体缓冲液或同型对照抗体(已知不与MB-231细胞结合)腹腔内给药。抗体随后以相同的方式在7周内每周给药一次。
大约每7天用测径器测量肿瘤的生长，测量10周或直至各动物达到加拿大动物保护委员会(CCAC)的终点或第120天。在研究期间记录动物的体重。在研究结束时，根据CCAC规定将所有动物处以安乐死。
在本试验中呈现的数据是纵向数据组的典型实例。通常，在这样的数据组中在时间点之间存在高度关联且在更邻近的时间点之间观察到更高度的关联。因此，方差的重复测量分析(重复ANOVA)被用于确定治疗之间的差异，且协方差分析的方法被用于确定差异发生的时间点。当在各时间点的组间差异不仅仅由于组而是由于之前的时间点造成时，后一方法是合适的方法。
在整个研究中没有毒性的临床迹象。每周测量的体重是康复和生存失败的指示剂。图1代表了3组小鼠在研究期间的平均体重。各组内的体重随着时间增加。重复ANOVA说明组间没有显著差异且接受同型对照、抗体缓冲液或H460-16-2治疗的组在时间点的平均分布没有变化。
对整个实验使用重复ANOVA，以下结果是值得注意的。重复ANOVA法说明不仅组的平均值没有不同(p＜0.001)且相互之间在平均分布的形态上没有不同。从图2中可以看出，治疗组H460-16-2和其它组相比似乎有更显著的作用。此外，同型对照治疗组和抗体缓冲液治疗组之间的差异在统计学上不显著。在协方差的分析中，在第18天第一次出现了显著差异，其中同型和缓冲液治疗对照组和H460-16-2治疗组有所不同。在第53天，(在治疗结束后的第一次肿瘤体积测量)H460-16-2治疗组的肿瘤体积是抗体对照治疗组的1.3％(p＜0.0001)由此证实预防肿瘤负荷的有效性。H460-16-2治疗还有相应的存活益处(图3)。提高的存活是功效的有价值的指示剂。在治疗后的70多天中对所有3组进行了跟踪。Cox比例风险分析测试估计在ARH460-16-2组中的死亡风险是缓冲对照组的大约71％(p＝0.028)。这些数据证明和对照治疗组相比测试抗体具有存活益处。对照组在移植后的74-81天之间达到50％的死亡率。相反，治疗组在研究结束时(移植后第120天)还没有达到50％死亡率。同型对照治疗组在移植后第74天达到100％死亡率。相反，H460-16-2治疗动物在治疗结束时呈现60％的存活。
总之，H460-16-2抗体治疗和对照抗体相比在公认的人癌症疾病模型中防止肿瘤负荷并增加存活。这些结果暗示该抗体(H460-16-2)用作包括人的其它哺乳动物治疗的有力的药理学和制药学益处。
实施例2
体内成熟肿瘤实验：
将含有5百万MB-231乳腺癌细胞的100微升盐溶液通过皮下注射进后颈部移植进5-6周大的雌性SCID小鼠。用测径器每周测量肿瘤生长。当群体中大部分在移植后的34天达到100mm3的肿瘤体积(范围在70-130mm3)时，将12只小鼠随机分入4个治疗组。在用含有2.7mM KCl、1mM KH2PO4、137mM NaCl和20mM Na2HPO4的稀释液从储备浓度稀释后，H460-16-2或同型对照抗体(已知不和MB-231细胞结合)以150微升的体积按15mg/kg/剂的剂量静脉给药；顺铂以300微升的体积按9mg/kg/剂(用盐溶液稀释)的剂量腹腔内给药。随后以相同的方式每周3次进行总计10剂的抗体给药直至移植后的第48天。顺铂每四天给药，共3剂。在研究期间或直至各动物达到CCAC终点，大约每7天用测径器测量肿瘤的生长。在研究期间记录动物的体重。在研究结束时根据CCAC规定对所有动物处以安乐死。
在随机分组时，各组的平均肿瘤体积和标准偏差是相似的：同型对照，(97.60+/-18.33)；H460-16-2(95.25+/-16.82)；顺铂(98.00+/-18.93)。这说明进行了真正的随机化。如图4中所示，在3周治疗期结束时，抗体H460-16-2能够显著抑制肿瘤生长。3组之间的平均肿瘤体积比较显示组间的差异是非常显著的(表1)。
表1：在治疗结束时的平均肿瘤体积比较
  第1组   第2组   均数差(1-2)   标准差   显著性
  同型   H460-16-2   187.58*   41.09   0
  顺铂   300.69*   43.1   0
  H460-16-2   同型   187.58*   41.09   0
  顺铂   113.12*   43.1   0.012
  顺铂   同型   300.69*   43.1   0
  H460-16-2   113.12*   43.1   0.012
*在0.05的水平均数差是显著的。
通过计算反映生长抑制的T/C率(接受治疗的肿瘤体积中值(T)对同型对照的肿瘤体积中值(C)的百分比)进一步评估功效。H460-16-2抗体实现了相当于49％的T/C肿瘤体积中值的终点(图5)。图4进一步显示在与同型对照相比时H460-16-2治疗导致了显著的对肿瘤生长的抑制且抑制是以最大耐受剂量(MTD)给药的顺铂的2/3，但没有顺铂伴随的毒性或死亡。
在实验期间每周记录的体重被用作安全和毒性评估的指示剂。如表2中列出的和图6中显示的，在同型对照或H460-16-2治疗组中的体重差异最小化。相反，在治疗期间，在顺铂组中观察到显著的恶体质(p＝0.005)。在该组中，体重减轻达到初始体重的19.2％且产生了临床痛苦的额外证据诸如毛皮起褶、由脱水引起的皮肤隆起以及嗜睡。和顺铂治疗组中观察到的2例死亡相比，H460-16-2治疗组中没有死亡。
表2：在治疗结束时体重和肿瘤生长抑制的变化(％T/C)
  治疗试剂   数量/组   剂量   ％体重变化   ％肿瘤生长抑制
  同型对照   12   15mg/kg/剂*   没有平均变化
  H460-16-2   12   15mg/kg/剂*   -2.30％   49
  顺铂   12(-2)   9mg/kg/剂**   -19.20％   25
*给药剂重 静脉内每周3次，共3周。
**给药剂量 腹腔内每4天1次，共3剂。
和同型对照治疗相比(图7)，H460-16-2显示了存活益处。在第170天(大约在治疗后的120天)，与顺铂和同型对照组的0％相比，33％的H460-16-2治疗组仍然存活。
总之，在SCID小鼠的乳腺癌成熟肿瘤的异种移植模型中，H460-16-2比同型对照抗体显著更有效地抑制肿瘤生长。在3周的治疗期间，H460-16-2达到的T/C肿瘤体积中值的终点和对照相比小于50％。此外，H460-16-2造成的抑制是以MTD给药的顺铂造成的抑制的2/3而没有化疗药物观察到的毒性或死亡迹象。
因此，H460-16-2治疗和对照抗体相比显著降低了成熟肿瘤的肿瘤负荷且在公认的人癌症疾病模型中显示了存活益处，暗示着该抗体用于其它哺乳动物包括人在内的治疗的药理学和制药学益处。
实施例3
正常小鼠组织染色
在小鼠组织中研究了H460-16-2抗原的分布并与gp96抗原比较。为了确定进一步实验的条件，首先进行IHC优化实验。如上所述进行H460-16-2单克隆抗体的制备和纯化。
皮下移植了MB-231肿瘤细胞的未接受治疗小鼠在移植后的74天被处以安乐死。分解出肿瘤组中和主要器官的组织并在10％中性缓冲福尔马林中固定48小时。在固定后，将组织转移至70％乙醇中，处理、石蜡包埋、切片并在玻璃载玻片上封片以染色。在60℃烘箱中干燥1小时对载玻片脱石蜡并将载玻片在Coplin瓶中浸于二甲苯5次，每次4分钟脱蜡。在一系列梯度乙醇洗涤(100％-75％)处理后，在水中对切片重新水合。将载玻片浸入pH 6的10mM柠檬酸缓冲液中(Dako，Toronto，ON)并在高、中、低档各微波加热5分钟并最后浸入冷的PBS中。随后将载玻片浸入3％的过氧化氢溶液6分钟，用PBS洗涤3次，每次5分钟，干燥，与Universal封闭液(Dako，Toronto，ON)在室温共同放置5分钟并干燥。将H460-16-2、单克隆小鼠抗波形丝蛋白(Dako，Toronto，ON)和亦被称作抗gp96的抗grp94(Stressgen Biotechnologies，Victoria，BC)在抗体稀释缓冲液(Dako，Toronto，ON)中稀释至其工作浓度(各抗体为2.5μg/mL、5μg/mL或10μg/mL)并在4℃潮湿的培养箱中过夜培养。用PBS将载玻片洗涤3次，每次5分钟。用供应的HRP偶联二级抗体(Dako Envision System，Toronto，ON)在室温检测/观察初级抗体的免疫反应30分钟。在该步骤后，用PBS将载玻片洗涤3次，每次5分钟，并通过加入用于免疫过氧化酶染色的DAB(3，3’-二氨基联苯胺四氯化氢，Dako，Toronto，ON)色原底物溶液在室温进行颜色反应10分钟。用自来水洗涤载玻片中止色原反应。在用Meyer′s苏木精(Sigma Diagnostics，Oakville，ON)复染后，用梯度乙醇(75-100％)将载玻片脱水并用二甲苯使其透明。使用封片剂(Dako Faramount，Toronto，ON)在载玻片上封上盖玻片。使用Axiovert 200(Zeiss Canada，Toronto，ON)显微镜观察载玻片并用Northern Eclipse图像软件(Mississauga，ON)获取并储存数字图像。由病理学家对结果进行读取、评价和解释。
合适的浓度是使阳性(抗gp96)和阴性对照抗体(抗波形丝蛋白)均产生预期结果的浓度。抗波形丝蛋白对小鼠组织已呈现阴性但对人组织呈现阳性。此前已显示抗gp96抗体对小鼠和人组织均为阳性。在这些研究中，对照抗体在高和低浓度均没有产生预期结果，但5μg/mL的浓度产生。
  组织  抗波形丝蛋白   H460-16-2   抗gp96
  MB-231  +++MB-231(M/C)   +++MB-231(M)   +++MB-231(C/P)
  肝脏  -   -   +++肝细胞(C)
  胰腺  -   -   ++朗格汉斯氏岛(C/P)
  脾  -   -   -
  心脏  -   -   -
  脂肪组织  -   -   -
  肺  +++转移MB-231(C)   +转移MB-231(M)   +转移MB-231(C)
  肾脏  -   +++DCT+PCT(A)   ++DCT+PCT(C/D/P)
  脑  -   -   +星形胶质细胞(C/P)(大脑)
  卵巢  -   ++卵子(C/N)   +++颗粒层(C/P)卵子(C/N/D)
  输卵管  -   -   ++黏膜上皮(C/A)
缩写是-M：膜染色；C：细胞质染色；M/C：膜-质染色；N：细胞核染色；D：弥散染色；P：点状染色；A：顶部染色；DCT：远曲小管；PCT：近曲小管。
SCID小鼠组织和移植人乳腺癌MB-231的IHC调查结果(表3)显示阴性对照抗体抗波形丝蛋白对小鼠组织是阴性的但对人组织是阳性的。抗波形丝蛋白(图8A)显示强细胞质染色和一些细胞膜染色；H460-16-2显示强细胞膜染色(图8B)，且抗gp96显示偶发的阳性点状和胞质染色细胞(图8C)。抗波形丝蛋白(图9A)和H460-16-2(图9B)没有对小鼠肝脏染色但抗gp96产生了肝细胞的强细胞质染色(图9C)。抗波形丝蛋白(图10A)没有对小鼠肾脏染色。H460-16-2(图10B)显示了对近曲小管和远曲小管的顶端染色而抗gp96对相同细胞产生了胞质和点状的弥散染色(图10C)。抗波形丝蛋白(图11A)没有对小鼠卵巢发生染色。H460-16-2(图11B)仅对卵子发生了胞质和细胞核染色而抗gp96对卵子产生了弥散的胞质和细胞核染色且对粒细胞发生了细胞质和点状染色(图11C)。
抗波形丝蛋白阴性对照抗体对人组织发生预期染色且对小鼠组织没有染色(见图8-11)。由于H460-16-2抗原是gp96癌变体的可能性，抗gp96抗体可被用作阳性对照。抗gp96抗体显示了对MB-231细胞的染色(图9)，与gp96表达与乳腺癌的关联相一致。gp96也在涉及蛋白质合成的很多细胞型的细胞质中表达，例如肝细胞、胰腺的朗格汉斯氏岛细胞、卵巢粒细胞和卵子、以及输卵管的粘膜上皮(表3)。这和gp96作为内质网蛋白伴侣的推定作用是完全一致的。
H460-16-2抗体对MB-231细胞染色，这和其在相应肿瘤模型中的体内作用是一致的。此外，该抗体对小鼠肾中的DCT和PCT(表3)和小鼠卵子(图11)染色。根据小鼠组织的取样，似乎H460-16-2抗原不只局限于人细胞，而且也以抗体能够识别的抗原的方式在小鼠中表达。如同正常小鼠肾组织染色所证实的，在H460-16-2和gp96抗原的表达上存在显著的差别；H460-16-2中获得顶部染色而由抗gp96观察到弥散染色(图10)。该差异的另一个实例是用抗gp96对卵子的额外染色(图11)。关键的差异在于在肝脏中不发生H460-16-2染色，而gp96染色相当广泛(图9)。
为了进一步进行上述实验，使用H460-16-2、抗gp96(为了和H460-16-2比较)以及抗波形丝蛋白(阴性对照)对正常小鼠组织阵列(Imgenex，San Diego，CA)染色。使用的染色程序和上述相同。如表4中所总结，抗波形丝蛋白没有对测试的任何组织发生染色；H460-16-2又一次仅对卵巢和肾脏染色而抗gp96仍然对广泛得多的小鼠组织染色。这些结果与上述结果一致且再一次证明H460-16-2表达不限于人细胞且其表达限于且特异于正常小鼠组织。同样肯定H460-16-2和抗gp96一样对相同组织染色，但抗gp96继续对更广泛的组织染色，支持H460-16-2抗原可能是gp96子集的观点。
表4：对正常小鼠组织阵列的IHC
  组织   抗波形丝蛋白   H460-16-2   抗gp96
  1   皮肤   -   -   -
  2   皮肤   -   -   -
  3   脾   -   -   +/-(淋巴细胞)
  4   脾   -   +/-(淋巴细胞)   +/-(淋巴细胞)
  5   骨骼肌   -   -   -
  6   肺   -   -   -
  7   肺   -   -   -
  8   心脏   -   -   -
  9   心脏   -   -   -
  10   唾液腺   -   -   +/-(泡状上皮)
  11   肝   -   -   ++(肝细胞)
  12   肝   -   -   ++(肝细胞)
  13   胆囊   -(NR)   -(NR)   -(NR)
  14   胰腺   -   -   +(泡状上皮)
  15   食道   -   -   +(节细胞)
  16   胃   -   -   ++(消化腺上皮)
  17   胃   -   -   ++(消化腺上皮)
  18   小肠   -   -   ++(黏膜上皮&淋巴细胞/巨噬细胞)
  19   小肠   -   -   ++(黏膜上皮&固有层中的淋巴细胞/巨噬细胞)
  20   结肠   -   -   ++(黏膜上皮&固有层中的淋巴细胞/巨噬细胞)
  21   结肠   -   -   ++(黏膜上皮&固有层中的淋巴细胞/巨噬细胞)
  22   肾   -   ++(管状上皮)   ++(管状上皮)
  23   肾   -   +++(管状上皮)   ++(管状上皮)
  24   子宫   -   -   -
  25   子宫   -   -   +++(子宫内膜黏膜上皮&腺体)
  26   卵巢   -   +(卵子)   +++(卵子&颗粒层)
  27   肾上腺   -   -   ++(内分泌细胞)
  28   胸腺   -(NR)   -(NR)   -(NR)
  29   脑   -   -   -
  30   脑   -   -   -
  31   小肠   -   -   -
缩写：NR：非代表性照片。
实施例4
正常人组织染色
进行IHC研究表征H460-16-2抗原在人体中的分布。由于H460-16-2抗原如之前生化方法所确定的可能是gp96的癌症变体，将H460-16-2抗原与靶向gp96的抗体进行比较。使用人体正常器官组织阵列(Imgenex，San Diego，CA)进行了抗体与60个正常人体组织的结合。在抗体稀释缓冲液中将所有初级抗体(H460-16-2；抗grp94(也被称作抗gp96，Stressgen Biotechnologies，Victoria，BC)；以及小鼠IgG1阴性对照(Dako，Toronto，ON))稀释至5μg/ml的浓度(在优化步骤中发现的最佳浓度)。该阴性对照抗体已经由制造商证实对所有哺乳动物组织是阴性的。遵照实施例3中的IHC步骤。
表5陈列了H460-16-2对正常人体组织阵列的染色结果的总结。该表中有3类组织染色。一组组织是完全阴性的。这些组织包括正常心脏、肾脏、脑、胰腺、乳腺、睾丸、卵巢和胎盘。第二组组织包括显示了阳性染色的组织。这些组织包括皮肤、输尿管、胃和前列腺。唾液腺对该抗体呈现了最强的染色。第三组组织包括在组织切片中染色阳性的组织，但染色限于浸润型巨噬细胞、淋巴细胞和纤维原细胞。该组中包括肺、肝脏、胃、小肠和结肠中的巨噬细胞，以及脾脏和胆囊中的淋巴细胞。应当注意抗原在要害器官包括肝脏、肾脏、心脏和肺的细胞上不存在。抗体与巨噬细胞和淋巴细胞结合，且在这些切片的一些器官中观察到它们的存在。作为对比，对抗gp96呈现阴性的组织包括皮下脂肪、骨骼肌、肺、心脏、胃平滑肌、膀胱、子宫肌层、卵巢、胎盘脐带、脑(白质和灰质)、小脑和脊髓。除了子宫肌层的例外，所有这些组织对H460-16-2染色也是阴性的。这些结果暗示H460-16-2与抗gp96抗体识别的组织中的一个小子集结合。这和小鼠组织研究是一致的，其中抗gp96除了与也和H460-16-2结合的两个组织，肾脏和卵巢结合外，与肝脏、胰腺、脑和输卵管结合。这些结果暗示H460-16-2抗原没有在正常组织上广泛表达，且该抗体与人体中有限数量的组织特异性地结合。
表5：H460-16-2对正常人体组织的IHC
阴性   除巨噬细胞、淋巴细胞、纤维原细胞以外阴性 阳性
  1   乳腺   皮下脂肪   皮肤，臀
  2   骨骼肌   脾   唾液腺
  3   支气管   淋巴结，肠系膜   胃窦
  4   心脏   鼻黏膜   前列腺
  5   胰腺   肺   精囊腺
  6   胃平滑肌   肝脏   子宫内膜，分泌期
  7   肾皮质   胆囊   甲状腺
  8   肾髓质   扁桃腺   输尿管
  9   睾丸   食道   子宫肌层
  10   附睾   胃体
  11   子宫内膜，增生期   十二指肠
  12   卵巢   回肠
  13   胎盘，绒毛   阑尾
  14   胎盘，羊水绒毛膜   结肠
  15   胎盘脐带   乙状结肠
  16   肾上腺皮质   膀胱
  17   肾上腺髓质   子宫颈(内子宫颈)
  18   胸腺   子宫颈(外子宫颈)
  19   脑，白质   输卵管
  20   脑，灰质
  21   小脑
  22   脊髓
为了描述gp96和H460-16-2抗原分布之间的差异，在表6中罗列了表达抗原的细胞类型。从表中，很清楚的是抗gp96抗体比H460-16-2与更大范围的细胞类型结合。进一步地，H460-16-2的最强结合是纤维原细胞、腺泡上皮和淋巴细胞。其和巨噬细胞、角质细胞、平滑肌、黏膜上皮以及甲状腺滤泡细胞发生弱结合。抗gp96与额外的15种细胞类型结合，且与表达H460-16-2抗原的各细胞类型结合。结果暗示H460-16-2抗原是gp96的子集，因为表达H460-16-2的细胞均表达gp96抗原。
表6：正常人体组织的IHC总结
  细胞类型   H460-16-2   抗gp96
  纤维原细胞   +/++   +
  腺泡上皮   +/++++   +
  淋巴细胞   +/++   +/++
  巨噬细胞   +   +
  角质细胞   +   +
  平滑肌   +   +
  黏膜上皮   +   +
  输卵管细胞   +   +
  小叶上皮   -   +
  内皮   -   +
  黏膜腺   -   +
  胆管上皮   -   +
  肝细胞   -   ++
  腺泡细胞   -   ++
  神经节细胞   -   +
  绒毛上皮   -   +
  亨氏袢   -   +
  PCT&DCT   -   +/++
  腺上皮   -   +/++/+++
  生发细胞   -   ++
  细胞滋养层细胞   -   ++
  融合滋养层细胞   -   ++
  颗粒细胞   -   +
这些组织调查证实H460-16-2抗原在包括要害器官在内的正常组织中有非常有限的分布。实验也显示抗gp96抗体和H460-16-2相比与更广泛的组织结合。H460-16-2与结合抗gp96的组织中一子集结合且与有限的细胞类型结合。在H460-16-2阳性但非gp96阳性的组织中，H460-16-2仅与巨噬细胞和纤维原细胞，通常表达gp96的细胞类型结合。小鼠和人组织调查之间的差异也指出H460-16-2抗体识别人体中相关的抗原且在正常小鼠中由于表达很有限而仅有有限重要性的抗原。由于H460-16-2抗体本身不能识别人抗原形式，其本身是可以使用的。
实施例5
人肿瘤组织染色
进行了IHC研究以确定H460-16-2抗原与人乳腺癌之间的癌症关联以及确定H460-16-2抗体是否可能识别人癌症。将抗gp96染色和靶向黑曲霉葡萄糖氧化酶的抗体染色比较，该酶在哺乳动物组织中不存在也不能被诱导(阴性对照)。使用了从50名乳腺癌患者中获得的乳腺癌组织阵列和从乳腺癌患者的非癌乳腺组织中获得的9个样品(Imgenex Corporation，San Diego，CA)。各患者提供了以下信息：年龄、性别、美国癌症联合委员会(AJCC)肿瘤阶段、淋巴结、雌激素受体(ER)和黄体素受体(PR)的状态。遵照实施例3中IHC的步骤。所有抗体在5μg/ml的工作浓度使用。
表7和8提供了H460-16-2和抗gp96抗体与乳腺癌组织阵列的结合总结。各阵列包含来自50名患者的肿瘤样品。总之，测试的50名患者中的64％对H460-16-2抗原呈现阳性而对于gp96，84％呈现阳性。对H460-16-2和gp96抗原，来自乳腺癌患者的9个正常乳腺组织样品中仅2个是阳性的。明显的，在雌激素和黄体素受体状况之间没有明确的关联。还显示，在更高的肿瘤阶段，存在H460-16-2抗原更强的阳性表达的趋势。如图12所示，H460-16-2染色相对于正常细胞，对癌细胞是相当专一的，图12中黏膜细胞是明显阴性的且恶性细胞层是高度阳性的。H460-16-2抗原观察到的细胞定位模式在大多数情况下局限在细胞膜。抗gp96抗体对更多的乳腺癌样品染色但一致地显示细胞膜定位和基本的胞质定位(图13)。抗gp96对来自乳腺癌患者正常组织样品的染色和H460-16-2相同。这些结果暗示在接近2/3的乳腺癌患者中可以表达H460-16-2抗原。染色模式显示在患者样品中，抗体对恶性细胞有高特异性且H460-16-2抗原位于细胞膜上由此使其成为具有吸引力的可入药靶点。
表7：H460-16-2对正常和肿瘤人乳腺的IHC
       H460-16-2   总数#   -   +/-   +   ++   +++   总阳性   ％阳性
患者样品   肿痛   50   18   13   15   2   2   32   64
  正常   9   7   0   2   0   0   2   22
  ER状态   ER+   21   9   5   7   0   0   12   57
  ER-   28   8   8   8   2   2   20   71
  未知   1   1   0   0   0   0   0   0
  PR状态   PR+   11   5   2   4   0   0   6   55
  PR-   38   12   11   11   2   2   26   68
  未知   1   1   0   0   0   0   0   0
  AJCC肿瘤阶段   T1   7   3   2   2   0   0   4   57
  T2   26   11   6   6   2   2   15   58
  T3   16   4   6   6   0   0   12   75
  T4   1   0   1   1   0   0   1   100
表8：抗gp96对正常和肿瘤人乳腺的IHC
        抗gp96   总数#   -   +/-   +   ++   +++   总阳性   ％阳性
患者样品   肿瘤   50   8   9   12   9   12   42   84
  正常   9   7   0   1   1   0   2   22
  ER状态   ER+   21   6   5   4   3   3   15   71
  ER-   28   1   4   8   6   9   27   96
  未知   1   1   0   0   0   0   0   0
  PR状态   PR+   11   4   1   2   2   2   7   64
  PR-   38   3   8   10   10   10   35   92
  未知   1   1   0   0   0   0   0   0
  AJCC肿瘤阶段   T1   7   2   2   0   3   0   5   71
  T2   26   5   5   5   5   6   21   81
  T3   16   1   1   6   1   6   15   94
  T4   1   0   0   1   0   0   1   100
为了确定H460-16-2抗原是否在除了乳腺以外的其它人肿瘤组织上表达，在多种人肿瘤组织阵列(Imgenex，San Diego，CA)上使用H460-16-2。为各患者提供了以下信息：年龄、性别、器官和诊断。使用的染色步骤和实施例3中说明的相同。使用波形丝蛋白作为阳性对照且使用与所述人乳腺肿瘤组织阵列中使用的相同的阴性对照抗体。所有抗体在5μg/mL的工作浓度使用。
如表9中罗列的，H460-16-2对除了乳腺以外的数种不同的人癌症染色。以下的肿瘤类型对H460-16-2总是阳性的(尽管程度不同)：淋巴结(2/2)、骨(2/2)、肺(4/4)、肾脏(3/3)、子宫(3/3)以及甲状腺(2/2)。胃(4/5)、肝脏(2/3)和腮腺(2/3)也呈现出现相对一致的阳性染色。一些其它的肿瘤类型也偶尔出现染色阳性。如同乳腺癌中观察到的，H460-16-2染色主要定位在癌细胞的细胞膜上。
因此，H460-16-2抗原似乎不仅仅在乳腺癌的细胞膜上存在，而且在大量的肿瘤类型的细胞膜上出现。这些结果暗示H460-16-2有在除了乳腺以外的广泛的肿瘤类型中作为治疗药物的潜力。
  切片号   年龄   性别   器官  诊断   H460-16-2   波形丝蛋白   阴性对照
  1   59   男   皮肤  恶性黑素瘤   +++M   +++M/C   -
  2   25   女   皮肤  鳞状细胞癌   -   +++M/C   -
  3   50   女   乳腺  浸润型导管癌   +肿瘤，+++间质   ++间质   -
  4   57   女   乳腺  侵犯性乳头状癌   +/-   ++间质纤维原细胞，血管   -
  5   35   女   乳腺  浸润型小叶状癌   +/-   CS   -
  6   40   男   淋巴结  恶性淋巴癌，immunoplastic   +++M   +++M/C   -
  7   58   男   淋巴结  从胃的转移型腺癌   +/-   +++肿瘤，脂细胞   -
  8   53   女   骨  骨肉瘤   +M/C   +++M/C   -
  9   26   男   骨  巨细胞肿瘤   +M/C   ++M/C   -
  10   40   男   骨  软骨肉瘤   CS   CS   CS
  11   51   女   软组织  脂肪肉瘤   -   +++M/C   -
  12   47   女   软组织  神经纤维瘤   +M/C   +++M/C   -
  13   74   男   鼻腔  内生性乳头状瘤   ++M   +角质素   -
  14   57   男   喉  鳞状细胞癌   +++M   +++间质   -
  15   60   男   肺  腺癌   +/-   ++M/C   -
  16   51   女   肺  鳞状细胞癌   +++M/C   +++M/C   -
  17   68   女   肺  腺癌   +/-   +++M/C   -
  18   60   男   肺  小细胞癌   +/-   +++M/C   -
  19   88   女   舌  鳞状细胞癌   +++M   +++间质   -
  20   34   女   腮腺  多形性腺瘤   -   ++M/C   -
  21   50   女   腮腺  Warthin瘤   +++M/C   +++肿瘤，淋巴细胞   -
  22   40   女   腮腺  多形性腺瘤   ++M/C   +++M/C   -
  23   56   男   颌下腺  唾液导管癌   -   +++M/C   -
  24   69   女   肝脏  胆管癌   +/-   +/-肿瘤，+++血管   -
  25   51   男   肝脏  转移型胃癌   -   ++间质   -
  26   64   男   肝脏  肝细胞癌   +/-   +/-   -
  27   62   女   胆囊  腺癌   ++肿瘤，淋巴细胞   +间质   -
  28   64   女   胰腺  腺癌   ++M/C   ++间质   -
  29   68   男   食道  鳞状细胞癌   +/-   ++间质   -
  30   73   男   胃  腺癌，弱分化的   +M/C   ++间质，血管   -
  31   63   男   胃  腺癌，中度分化的   ++M/C   ++M/C   -
  32   59   女   胃  印戒细胞癌   ++M/C   ++M/C   -
  33   62   男   胃  恶性淋巴瘤   +++M/C   +++M/C   -
  34   51   男   胃  临界性间质瘤   -   ++M/C   -
  35   42   男   小肠  恶性间质瘤   -   +++M/C   -
  36   52   女   阑尾  pseuomvxoma peritonia   -   +肿瘤，+++脂细胞   -
  37   53   男   结肠  腺癌   +M/C   ++间质   -
  38   67   男   直肠  腺癌   ++M   ++脂细胞，血管   -
  39   75   女   肾脏  移行性上皮细胞癌   +M/C   ++间质   -
  40   54   女   肾脏  肾细胞癌   +/-   ++M   -
  41   75   女   肾脏  肾细胞癌   +/-   +肿瘤，+++间质   -
  42   65   男   膀胱  癌，弱分化的   ++M/C   ++间质   -
  43   67   男   膀胱  移行性上皮细胞癌，高度   -   +++间质，血管   -
  44   62   男   前列腺  腺癌   +++M   +++肿瘤，间质，血管   -
  45   30   男   睾丸  精原细胞瘤   +/-   +++血管   -
  46   68   女   子宫  子宫内膜腺癌   ++间质   +肿瘤，+++间质   -
  47   57   女   子宫  平滑肌肉瘤   +PS   +M/C   -
  48   45   女   子宫  平滑肌瘤   +C   +++M/C   -
  49   63   女   子宫颈  鳞状细胞癌   +++M   +/-肿瘤，++间质   -
  50   12   女   卵巢  内胚窭瘤   -   ++肿瘤，间质   -
  51   33   女   卵巢  粘液腺癌   -   ++间质   -
  52   70   女   卵巢  Fibrothecoma   -   +++M/C   -
  53   67   女   肾上腺  皮质癌   -   +++M/C   -
  54   61   女   肾上腺  pheohromcytoma   -   +++M/C   -
  55   54   男   甲状腺  乳头状癌   ++M/C   +/-肿瘤，++间质   -
  56   58   女   甲状腺  滤泡癌，最低侵犯性   ++M   +++M/C   -
  57   74   男   胸腺  胸腺瘤   +/-   ++M/C   -
  58   66   女   脑  脑膜瘤   -   +++M/C   -
  59   62   男   脑  多形性恶性胶质瘤   +++M   ++肿瘤，血管   -
表9：人多种肿瘤阵列上的IHC
缩写：M：细胞膜染色；C：胞质染色；M/C：细胞膜-细胞质染色；CS：完全脱落的切片；PS：部分脱落的切片；F：切片被折叠。
在本说明书中提及的所有专利和公开物对本发明涉及的领域的技术人员而言具有说明性。所有专利和公开物在此以相同程度被参考引用，如同各公开物被专门且独立地说明被参考引用一样。
应当明白尽管说明了本发明的一些形式，本发明不应收到在此说明的具体形式和各部分的安排的限制。在不背离本发明范围的情况下进行各种改变对本领域技术人员是明显的且本发明不应被认为受到本说明书中显示和说明的内容的限制。本领域技术人员将容易地认同本发明很适于实现发明目的并获得提及的以及其中固有的结果和优势。在此所述的任何寡核苷酸、肽、多肽、生物学相关化合物、方法、步骤和技术是目前优选具体实施方式的代表，旨在示范而不作为对范围的限制。本发明精神所包含的和所附权利要求范围所定义的其中的变化和其它应用将由本领域技术人员进行。尽管结合特定优选具体实施方式对本发明进行了说明，应当明白权利要求的本发明不应当不恰当地受到这些特定具体实施方式的限制。事实上，对于本领域技术人员显而易见的对进行本发明的所述模式进行的各种修改被认为在随后权利要求的范围内。

Claims (18)

1、一种在哺乳动物体内治疗人肿瘤的方法，其中所述肿瘤表达和单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合的抗原，所述抗原结合片段具有由保藏于ATCC保藏号为PTA-4621的克隆编码的单克隆抗体的识别特征，所述方法包括对所述哺乳动物以有效降低所述哺乳动物肿瘤负荷的量进行所述单克隆抗体的给药。
2、根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体与细胞毒部分偶联。
3、根据权利要求2所述的方法，其中所述细胞毒部分是放射性同位素。
4、根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体激活补体。
5、根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体介导抗体依赖的细胞毒性。
6、根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体是小鼠抗体。
7、根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体是人源化抗体。
8、根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体是嵌合抗体。
9、由保藏于ATCC保藏号为PTA-4621的克隆编码的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。
10、根据权利要求9所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段是人源化的。
11、根据权利要求9所述的分离的抗体或抗原结合片段，其与细胞毒部分、酶、放射性化合物或造血细胞偶联。
12、根据权利要求9所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体。
13、根据权利要求9所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段是小鼠抗体。
14、保藏于ATCC保藏号为PTA-4621的分离的抗体。
15、一种确定选自人肿瘤的组织样品中癌细胞的存在的结合实验，包含：
提供来自所述人肿瘤的组织样品；
提供由保藏于ATCC保藏号为PTA-4621的克隆编码的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段；
将所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述组织样品接触；以及
确定所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述组织样品的结合；
由此说明在所述样品中所述癌细胞的存在。
16、根据权利要求15所述的结合实验，其中人肿瘤组织样品取自源自结肠、卵巢、肺或胸腺组织的肿瘤。
17、一种在选自人肿瘤的组织样品中分离或筛选癌细胞的方法，包括：
提供来自所述人肿瘤的组织样品；
提供由保藏于ATCC的保藏号为PTA-4621的克隆编码的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段；
将所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述组织样品接触；以及
确定所述单克隆抗体或其抗原结合片段与所述组织样品的结合；
由此通过所述结合将所述癌细胞分离且确定在所述组织样品中癌细胞的存在。
18、根据权利要求17所述的方法，其中人肿瘤组织样品获自源自结肠、卵巢、肺或乳腺组织的肿瘤。
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