CN1829803A - 蛋白酶活性分析 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于测定诸如β-分泌酶和半胱天冬酶的蛋白酶活性的生物轭合物,试剂盒与分析方法。该生物轭合物包含连接物、荧光剂和猝灭剂,其中该连接物包含能识别所述酶并与之相互作用(例如,被剪切)的部分;该荧光剂包含多种荧光物质,并与所述连接物的第一位置轭合;该猝灭剂与所述连接物的第二位置轭合。所述能识别蛋白酶并与之(例如,β-分泌酶或半胱天冬酶)相互作用的部分位于所述连接物的所述第一和第二位置之间。所述多种荧光物质相互结合,使得所述猝灭剂能放大所述荧光剂的超猝灭。所述分析适于以高通量筛查潜在药物对诸如β-分泌酶的蛋白酶活性的抑制效力,从而对该潜在药物进行评估。
Description
本申请涉及2002年8月23日提交的美国专利申请第10/226,300号未决申请,本文将其全部应用作为参考。
发明背景
技术领域
从总体而言,本申请涉及检测分子间相互作用的分析方法。特别地,本申请涉及可用于检测蛋白酶(例如,β-分泌酶和半胱天冬酶)活性的生物轭合物,包括该生物轭合物的试剂盒,以及包括使用所述生物轭合物来检测酶活性的分析方法。
发明背景
蛋白酶在细胞生物学中具有重要作用,并成为了新药的优先作用靶。对研究,药物发现和开发而言,蛋白水解酶活性测定的关注程度与重要性不断增加。凋亡是引起发育,正常组织周转中细胞死亡的一个重要过程,并且是暴露于细胞毒性化合物,组织缺氧或病毒感染后的众多细胞死亡的原因。许多癌症治疗制剂通过启动凋亡来发挥作用。甚至致癌作用的过程有时看起来也依赖于凋亡的选择性的关键的失败,其允许突变DNA损伤得以存活。但凋亡还被怀疑有助于慢性退行性过程,例如帕金森氏病和心力衰竭。几种半胱天冬酶被认为可以调节极早期的凋亡。由于半胱天冬酶可能是引发导致凋亡性细胞死亡的生化事件的最重要的效应物,所以测定半胱天冬酶活性的分析可以比许多其它常用方法更早地检测细胞凋亡。
阿尔兹海默病的特征是包含4kD淀粉样β-多肽(Aβ)的不可溶淀粉样蛋白斑的细胞外沉积。参见,戈兰纳等人(Glenner et al.),Biochem.Biophys.Res.Commun.1984,120,pp.885-890。通过β和γ分泌酶从所述淀粉样前体蛋白(APP)的蛋白水解中生成Aβ,以分别形成Aβ的N-和C-末端。参见康等人(Kang et al.)Nature 1987,325,733-736。所述β-分泌酶对神经细胞形成所述蛋白斑相当关键。参见瓦萨尔等人(Vassar et.al.)Science 1999,286,735-741。
大多数目前对阿尔兹海默病的治疗手段都包括寻找阻断所述β-分泌酶催化位点并阻止其功能的药物。可见,开发快速和灵敏的分析平台是至关重要的,该平台兼容高通量的筛选,以辅助发现治疗所述疾病的新药。
所以,需要以高灵敏度快速并准确检测和定量诸如β-分泌酶和半胱天冬酶的蛋白酶活性。
发明概述
本发明在第一方面提供了生物轭合物,所述生物轭合物包括:包含能识别β-分泌酶并与之相互作用的部分的连接物;包含多种荧光物质并轭合于所述连接物的第一位置的荧光剂;以及轭合于所述连接物的第二位置的猝灭剂。在本发明的这一方面,所述能识别β-分泌酶并与之相互作用的部分位于所述连接物的所述第一和第二位置之间。所述多种荧光物质相互结合,使得所述猝灭剂能放大所述荧光剂的超猝灭。所述能识别β-分泌酶并与之相互作用的部分包含多肽序列:SEVNLDAEF(SEQ ID NO:1)。
本发明在第二方面提供了分析样品中的β-分泌酶活性的方法,包括:将所述样品与上述生物轭合物孵育;测定所述孵育样品的荧光。所述孵育样品中测得的荧光表明了所述样品中β-分泌酶活性的存在和/或数量。所述方法还包括:测定对照的荧光;比较所述对照的荧光和所述孵育样品的荧光,其中所述对照和所述孵育样品之间的荧光差值说明了所述样品中β-分泌酶活性的存在或数量。所述样品可包含β-分泌酶和测试化合物,所述方法可分析所述测试化合物抑制β-分泌酶活性的能力。所述荧光剂可包含固体载体,其中所述多种荧光物质与所述固体载体结合。
本发明在第三方面提供了分析样品中β-分泌酶活性的方法,包括:将所述样品与生物轭合物孵育,所述生物轭合物包含分别轭合在连接物的第一和第二位置上的猝灭剂和配基,其中所述连接物包含位于所述第一和第二位置之间的能识别β-分泌酶并与之相互作用的部分;向所述孵育样品中加入荧光剂形成样品混合物,所述荧光剂包含与多种荧光物质结合的固体载体,其中所述固体载体包含能结合所述生物轭合物的配基的半族,使得所述生物轭合物能结合到所述固体载体,且所述生物轭合物与所述固体载体的结合导致了所述荧光剂的放大的超猝灭;使所述生物轭合物上的所述配基与所述固体载体结合;及随后测定所述样品混合物的荧光。所述样品混合物的荧光量说明了所述样品中β-分泌酶活性的存在和/或数量。所述配基可以是生物素半族,且在所述固体载体上的半族可以是亲和素,中性链亲和素或链霉亲和素半族。所述方法还包括:向包含所述生物轭合物但未与所述酶孵育的第二样品中加入所述荧光剂形成对照;测定所述对照的荧光;及比较所述对照的荧光和所述样品混合物的荧光;其中所述对照和所述样品混合物之间荧光差值说明了所述样品中β-分泌酶的存在和/或数量。所述样品可包含β-分泌酶和测试化合物,所述方法还包括:将不含测试化合物的第二样品与所述生物轭合物孵育;向所述孵育的第二样品中加入所述荧光剂形成对照;测定所述对照的荧光;及比较所述对照的荧光和所述样品混合物的荧光,其中所述对照和所述样品混合物之间的荧光差值说明了所述样品中所述测试化合物抑制β-分泌酶活性的能力。
本发明在第四方面提供了试剂盒,其包括:荧光剂和生物轭合物,该荧光剂包括与固体载体结合的多种荧光物质;该生物轭合物包含分别轭合在连接物的第一和第二位置上的猝灭剂和配基,其中所述连接物包含位于所述第一和第二位置之间的能识别β-分泌酶并与之相互作用的部分。所述固体载体包含能与所述生物轭合物上的配基结合的半族,且所述多种荧光物质相互结合,从而当所述生物轭合物的配基与所述固体载体结合时,所述猝灭剂能放大所述荧光剂的超猝灭。所述配基可以是生物素半族,所述能与所述配基结合的半族可选自亲和素,中性链亲和素和链霉亲和素。所述能识别β-分泌酶并与之相互作用的部分包含多肽序列:SEVNLDAEF(SEQ ID NO:1)。
本发明在第五方面提供了生物轭合物,其包括:包含能识别β-分泌酶并与之相互作用的部分的连接物;轭合于所述连接物的第一位置的猝灭剂,该猝灭剂能猝灭荧光剂的荧光,该荧光剂包含多种结合的荧光物质;以及轭合于所述猝灭剂上的第二位置的生物素分子;其中能识别所述靶生物分子并与之相互作用的部分位于所述连接物的第一和第二位置之间,且所述多种荧光物质相互结合,使得所述猝灭剂能放大所述荧光剂的超猝灭。所述能识别β-分泌酶并与之相互作用的部分包含多肽序列:SEVNLDAEF(SEQ ID NO:1)。
本发明在第六方面提供了分析样品中靶酶活性的方法,包括:将所述样品与生物轭合物孵育,所述生物轭合物包含与连接物轭合的猝灭剂,其中所述连接物包含能被所述靶酶剪切的部分;向所述孵育样品中加入荧光剂形成样品混合物,所述荧光剂包含多种相互结合的荧光物质,使得所述荧光剂与所述猝灭剂的结合能放大所述荧光剂的超猝灭;及使所述靶酶剪切所述连接物,其中所述连接物的剪切导致含有猝灭剂的片段比所述生物轭合物具有更大的与所述荧光剂结合的倾向;以及随后测定所述样品混合物的荧光。所述样品混合物的荧光量说明了所述样品中靶酶活性的存在和/或数量。所述猝灭剂与所述荧光剂之间的结合可以是库伦引力,氢键力,范德华力或形成共价键的结果。例如,所述荧光剂和所述生物轭合物中的每一个都具有总的负电荷,且所述含有猝灭剂的片段的具有净正电荷。所述荧光剂可以是阴离子型的轭合聚合物。所述猝灭剂可以是阳离子型的电子转移或能量转移猝灭剂。根据一实施方案,所述生物轭合物如以下通式所示:
D-E-V-D-QSY7`(SEQ ID NO:7)
根据另一实施方案,所述荧光剂是包含花菁染料供体聚集体的虚拟聚合物,所述猝灭剂是花菁染料受体,当与所述连接物轭合时,所述受体不能与所述花菁染料供体形成聚集体。所述生物轭合物不能与所述供体形成聚集体可以是电荷效应或空间效应的结果。所述花菁染料受体可以是荧光分子或非荧光分子。当所述花菁染料受体为荧光分子时,可测定所述受体的荧光。可选择地,测定所述供体的荧光。所述分析可以是细胞内分析或细胞外分析。
本发明在第七方面提供了分析样品中的靶酶活性的方法,包括:将所述样品与生物轭合物孵育,所述生物轭合物包含与连接物轭合的荧光染料,其中所述连接物包含能被所述靶酶剪切的部分,以产生含有荧光染料的片段,其中所述含有荧光染料的片段能形成染料聚集体,所述聚集体具有与所述生物轭合物不同的吸收谱;使所述靶酶剪切所述连接物;及通过在所述染料聚集体比所述生物轭合物吸收程度更大的波长激发所述样品,测定所述样品混合物的荧光。所述样品混合物的荧光量说明了所述样品中靶酶活性的存在和/或数量。所述荧光染料可以是花菁染料。通过酶剪切从所述生物轭合物中释放的包含荧光染料的片段能形成J-聚集体。所述靶酶可以是半胱天冬酶。例如,所述靶酶可以是半胱天冬酶-3,并具有以下通式所示的结构:
D-E-V-D-花菁(SEQ ID NO:8)。
本发明在第八方面提供了试剂盒,其包括:荧光剂以及生物轭合物,该荧光剂包含多种荧光物质,该生物轭合物包含与连接物轭合的猝灭剂,其中所述连接物包含能被半胱天冬酶剪切的部分。根据本发明的这一实施方案,所述连接物的剪切产生了含有猝灭剂的生物轭合物片段,其比所述生物轭合物具有更大的与所述荧光剂结合的倾向,且所述荧光剂与所述猝灭剂的结合导致了所述荧光剂的放大的超猝灭。所述结合的多种荧光物质与固体载体结合。所述靶酶可以是半胱天冬酶-3,且所述能被半胱天冬酶剪切的片段是多肽序列:DEVD(SEQ ID NO:9)。
所述含有猝灭剂的生物轭合物片段可通过库伦引力,氢键力,范德华力或形成共价键来与所述荧光剂结合。例如,所述荧光剂和所述生物轭合物中的每一个都具有总的负电荷,且所述含有猝灭剂的生物轭合物片段具有净正电荷。
还提供了如上所述的试剂盒,其中所述荧光剂是包含花菁染料供体聚集体的虚拟聚合物,所述猝灭剂是花菁染料受体,当与所述连接物轭合时,所述受体不能与所述花菁染料供体形成聚集体。所述生物轭合物不能与所述供体形成聚集体可以是电荷效应或空间效应的结果。所述花菁染料受体可以是荧光分子或非荧光分子。
本发明在第九方面提供了生物轭合物,其包括:连接物和与所述连接物轭合的猝灭剂,所述连接物包含能被半胱天冬酶剪切的部分。所述半胱天冬酶可以是半胱天冬酶-3,且所述能被半胱天冬酶剪切的片段是多肽序列:DEVD(SEQ ID NO:9)。
所述猝灭剂可以是阳离子型电子转移或能量转移猝灭剂。
本发明在第十方面提供了生物轭合物,其包括:轭合于连接物的荧光染料,其中所述连接物包含能被所述靶酶剪切的部分,以产生含有荧光染料的片段。所述含有荧光染料的片段能形成染料聚集体,所述聚集体具有与所述生物轭合物不同的吸收谱。所述靶酶可以是半胱天冬酶,例如半胱天冬酶-3。所述荧光染料可以是花菁染料。根据本发明的另一实施方案,所述包含荧光染料的片断能形成J-聚集体。所述能被所述靶酶剪切的片段是多肽序列:DEVD(SEQ ID NO:9)。
附图的简要描述
图1所示为进行蛋白酶(例如β-分泌酶)活性分析的两种一般方案。
图2所示为半胱天冬酶-3酶活性的猝灭剂-连接物(QT)分析。
图3所示为半胱天冬酶-3酶活性的J-聚集体分析。
实施方案的详细说明
生物传感的猝灭剂-连接物-配体(QTL)方法通过电子和能量转移猝灭剂具有诸如荧光聚合电解质的荧光剂的超猝灭的优点。在一种方式中,所述荧光剂(例如荧光聚合物)P与特定待分析物的受体共同位于诸如聚合物微球的固体载体的表面。所述受体可通过例如共价连接或生物素-生物素结合蛋白(BBP)结合粘附在固体载体(如小珠载体)上。该分析基于待分析物和合成QTL轭合物对所述受体的竞争。然而,所述聚合物-受体集合体(ensemble)的荧光性不受所述待分析物的结合影响,并且当QTL结合后被猝灭。用该技术进行了小分子和蛋白的定量分析。参见陈(Chen)等,Proc.Nat.Acad.Sci.1999,96,12287-12292页。
2002年8月23号提交的美国专利申请第10/226,300号公开了用于蛋白酶的传感器,其包括将荧光剂(如荧光聚合物)P和猝灭剂Q结合在一起的反应性连接物。这种改进的QTL方法成为“QTP”,其中所述QTP集合体是反应分子传感器,其包括通过可被靶酶识别和剪切的肽连接物连接到荧光剂P的猝灭剂Q。当所述QTP分子未与酶或其它靶分子发生特异结合或反应时,Q的相对靠近会使P的荧光减弱或完全猝灭。当连接物T被所述靶识别和剪切,则实现了Q和P组分的分离,因而使得后者产生荧光。由于T的酶诱导的剪切是催化的,因此产生检测事件的放大,从而能在极低的水平检测所述酶。
在另一形式中,采用了QTB分子,其中“B”指生物素基团。该附加的生物素结合到所述生物素结合蛋白(BBP),其与所述聚合物共同位于所述传感器中,并促进了猝灭剂对所述聚合物的有效猝灭。当所述肽被靶酶剪切后,猝灭剂和生物素基团彼此分离,因而不发生聚合物荧光的猝灭。
图1中说明了进行蛋白酶分析的两种一般性的方案。在图1显示的由箭头17和34表示的第一个方案中,将包括猝灭剂(16)、生物素半族(12)和连接猝灭剂(16)和生物素半族(12)的连接物(11)的生物轭合物(10)与蛋白酶(18)(例如β-分泌酶)一起孵育(17)。所述连接物包括能被所述β-分泌酶(18)识别(如剪切)的识别序列(14)。随后将孵育后的生物轭合物与包括生物素结合蛋白(23)的荧光剂接触(34)。图1中显示的作为荧光剂(23)的是荧光聚合物包被的表面带有链霉亲和素基团(25)的微球(26)。如猝灭的生物轭合物(28)所示,当未剪切的生物轭合物(10)的生物素部分(12)与荧光聚合物包被的微球(26)上的链霉亲和素部分(25)反应时,来自荧光剂(23)的荧光被猝灭。然而,如蛋白酶分析的第一种方案所示,当含由酶(18)对所述连接物的剪切得到的生物片段(32)的生物素的生物素半族与微球体(26)上的链霉亲和素部分(25)反应时,来自荧光剂(23)的荧光不被猝灭。因此,所述荧光可以用来测定β-分泌酶活性的存在或数量。
在图1所示的由箭头24和30表示的蛋白酶分析的第二种方案中,首先使包括猝灭剂(16)、生物素部分(12)和连接猝灭剂(16)和生物素部分(12)的连接物(11)的生物轭合物(10)与包括生物素结合蛋白(23)的荧光剂接触(24)。所述连接物(11)包括能被所述β-分泌酶(18)识别(如剪切)的识别序列(14)。如猝灭的生物轭合物(28)所示,当未剪切的生物轭合物(10)的生物素半族(12)与荧光聚合物包被的微球(26)上的链霉亲和素半族(25)反应时,来自荧光剂(23)的荧光被猝灭。然后将所得猝灭的生物轭合物(28)与蛋白酶(如β-分泌酶)一起孵育(30)。酶(18)对所述连接物的剪切导致含猝灭剂的片段(22)与含荧光剂的片段(32)分离。结果,来自所述荧光剂的荧光增强(即,所述荧光剂的猝灭量降低)。
所述QTB分析中采用的肽底物是三功能的,其中该肽具有位于中间的能被靶酶识别和剪切的肽序列,位于一端的能促进所述QTB对所述聚合物-受体集合体的结合的生物素功能基团,以及接近所述聚合物时能有效猝灭聚合物荧光的猝灭剂。
据显示,所述β-分泌酶能识别和结合以下肽序列:
SEVNLDAEF(SEQ ID NO:1)。
参见蔡(Cai)等,Science 1993,259,514-516页。结合后,该酶剪切亮氨酸和天冬氨酸之间的肽键。根据本发明的一个实施方案,用于β-分泌酶的QTB肽底物包含包括这一序列的连接物,该连接物一端与生物素侧翼相连,另一端与猝灭剂侧翼相连。
β-分泌酶分析中可采用的肽底物的示例性的结构列举如下:
(QSY-7)-TEEISEVNLDAEFK-(Nε-生物素)(SEQ ID NO:2);
(QSY-7)-TEEISEVNLDAEFK-(Nε-PEG-生物素)(SEQ ID NO:3);
(AZO)-TEEISEVNLDAEFK-(Nε-生物素)(SEQ ID NO:4);及
(AZO)-TKKISEVNLDAEFRK-(Nε-生物素)(SEQ ID NO:5);
其中QSY-7、AZO、生物素和PEG-生物素如以下结构式所示:
且其中“*”表示每一半族对所述多肽连接物的连接位点,而“N”表示所述生物素半族通过赖氨酸残基(K)的ε-氨基基团连接到所述多肽连接物的赖氨酸残基。如上所示的QSY-7和AZO半族通过苏氨酸残基的自由氨基基团连接到所述多肽连接物。
因此,当β-分泌酶剪切所述肽连接物时,生物素会保留在所得片段的其中一个上,而所述猝灭剂与其物理分离并保留在另一片段上。因而,所述猝灭剂离开且不含辅助结合所述荧光剂-受体集合体的生物素半族。因此,所述被剪切的底物的含生物素片段不能猝灭所述集合体的荧光。
所述生物素特异地包含在所述QTB生物轭合物中,以通过结合所述聚合物-BBP集合体的BBP来将所述聚合物和猝灭剂结合在一起。虽然以上公开了生物素与BBP之间的相互作用,该生物素-BBP相互作用可很容易地用任何能将所述荧光剂和猝灭剂结合的系统来替代。例如,所述结合相互作用可以是任何生物学抗体-受体结合,或金属-配体结合事件,或者两个或更多个反应物质之间的化学反应。该相互作用可包括但不限于氢键或库仑引力或共价键结合。
所述猝灭剂Q设计为吸收所述激发的聚合物的辐射能以猝灭所述荧光。示例性的猝灭剂包括但不限于以下物质:中性物质、带正电或带负电或两性离子型物质、非荧光或荧光物质、有机物质、无机物质、有机金属物质、生物物质或聚合物、或能量或电子转移物质。根据本发明的一个实施方案,所述猝灭剂是非荧光的小分子染料,如QSY-7或Azo(含氮)染料。根据一个实施方案,所述猝灭剂能放大所述荧光剂的多种荧光物质的猝灭或超-猝灭。根据进一步的实施方案,所述猝灭剂能将所吸收的来自所述荧光剂的辐射能以荧光形式再次放射出来。
根据本发明的实施方案,所述生物轭合物的连接物包括肽序列:
SEVNLDAEF(SEQ ID NO:1).
该序列可在任意端侧翼连接更多的氨基酸或其它化学或生物学个体。所述QTB连接物的长度对所述分析并不关键。
根据本发明的实施方案,当所述QTB结合到所述聚合物-受体集合体时,所述猝灭剂离所述聚合物的距离在约100范围内。由于所述连接物通常以某些二级折叠的构象出现,该构象可能将所述猝灭剂携带到接近所述聚合物的位置,因此即使非常长的QTB连接物依然能够实现空间距离。
所述荧光剂(F)包括多种荧光物质。根据示例性的实施方案,该荧光剂是共轭聚合物,其可以是中性的或者是带正电的或带负电的或两性离子型的。所述荧光剂(F)还可为包含带有侧链荧光染料的非共轭骨架的侧链型聚合物,该染料表现出J-型聚集行为。所述荧光剂还可包括多种独立的小分子荧光发色团(chromophore),其聚集在固体表面形成“虚拟(virtual)”聚合物。
示例性荧光剂聚合物(1)和(2)的结构如下:
根据本发明的实施方案,所述荧光聚合物与生物素结合蛋白(BBP)共同存在于溶液中或锚定在固体载体上。在一实施方案中,上述式(1)所示的带正电的PPE聚合物吸附性地包被在中性链亲和素(neutravidin)-官能化的阴离子羧酸结合的直径0.6μm的橡胶微球上(聚合物集合体A)。在另一实施方案中,上述式(2)所示的生物素化的阴离子PPE聚合物与亲和素复合形成溶液传感器集合体(聚合物集合体B)。该聚合物通过生物素-亲和素相互作用结合亲和素,形成交联的超-分子(supra-molecular)集合体,其包括自由的能用于QTB生物轭合物的生物素结合位点。通过调整所述混合物中聚合物(2)和BBP的比例可以优化它们的猝灭作用。
在本发明的另一实施方案中,通过加入生物素化的R-藻红蛋白(BRPE),可以改进所有这些聚合物形式。所得形式用聚合物聚合体C和D表示。在BRPE掺杂剂存在下,激发的聚合物发色团将其能量传递至邻近的BRPE分子,然后该BRPE分子更有效地将这些能量再次发射出去,得到强烈的红色迁移的荧光信号。然后,当所述QTB结合时,BRPE的荧光猝灭。
在本发明的另一实施方案中,所述荧光聚合物是包括藻红蛋白或藻胆蛋白体的生物聚合体。这些蛋白由含有约34个发色团的聚合聚合体构成,并且是某些已知的荧光最强的个体,当与生物素结合蛋白共轭结合时,其可作为用于β-分泌酶和其它蛋白酶的QTP分析中的优良的传感器(聚合物聚合体E),其中所述发色团吸收能量并将其集中在适度保护的发射位点。例如,1∶1的共价链霉亲和素-B-藻红蛋白轭合物(SAv-BPE)在SEQ ID NO:2代表的β-分泌酶蛋白肽底物存在下表现出超猝灭,2.5nM所述荧光轭合物溶液的Stern-Volmer猝灭常数为约1×108M-1证明了这一点。
使用本文公开的各种聚合物形式和肽底物优化了β-分泌酶的QTP分析。所述聚合物的光吸收特性提供的检测灵敏度的放大结合所述猝灭剂的超猝灭效力,使得所述QTP分析比其它基于荧光的分析灵敏得多。
在传感器的一个实施方案中,将QTB与所述聚合物-受体集合体一起孵育,以形成所述QTP单元。然后通过将含β-分泌酶的样品暴露于QTP,并以连续监测形式跟踪荧光的“恢复(recovery)”来进行β-分泌酶的分析。当猝灭剂非常接近所述聚合物时,所述QTP单元几乎或完全没有荧光性。根据所述样品中酶的活性,产生酶底物的剪切,使得猝灭反应降低或有效增强所述样品的荧光。在所述传感器的另一实施方案中,将所述QTB实体暴露于含β-分泌酶的样品,并在CRT孵育较短的时间。孵育后,向样品中加入所述聚合物-受体集合体,并检测最终混合物的荧光强度。通过将所检测到的荧光性与含相同量的QTB和聚合物但不含酶的样品的荧光性比较,可检测单独由酶活性导致的荧光性的增强。所述酶和基体的孵育在缓冲溶液(分析缓冲液)中进行,该缓冲液已经经过优化以使酶对所述QTB底物具有最大的活性。所述聚合物通常在缓冲溶液中制备(聚合物缓冲液),该缓冲液已经经过优化以实现双重作用:通过加入到反应混合物中来终止反应,并由所述聚合物-QTB相互作用提供最大的猝灭反应。在所述传感器的当前实施方案中,所述QTL分析能够在30分钟内检测浓度低于1nM的溶液中的β-分泌酶活性。
在另一实施方案中,所述QTL分析能检测未知样品中的β-分泌酶活性的抑制。尽管,当反应混合物中不存在任何抑制性物质时,该酶可以剪切大部分所含的反应性连接物,但在有效抑制剂存在下,该酶失去大部分的活性。QTL分析通过这类样品中“荧光恢复”降低或完全缺乏的现象为酶活性的部分或完全抑制提供了证据。
示例性的荧光剂包括含有多个荧光性重复单元的聚合物或寡聚物,或与多个荧光物质结合的固体载体。当使用固体载体时,一种或多种猝灭剂中每一个均可通过反应性连接物连接到所述固体载体。示例性的固体载体包括但不限于以下物质:链霉亲和素包被的球体;聚合物微球;硅石微球;有机纳米颗粒;无机纳米颗粒;磁性珠;磁性颗粒;半导体纳米颗粒;量子点(quantum dot);膜;片;板及试管。所述荧光剂可选自:轭合的聚合电解质;生物素化的轭和的聚合电解质;官能化的轭合寡聚物;带电的轭合聚合物;不带电的轭合聚合物;轭合聚合物的混合物;及包括组合的单体或寡聚物的J-型聚集的聚合物集合。例如,所述荧光剂可以是聚(L-赖氨酸)聚合物或含有花菁侧基的寡聚物。所述荧光剂也可为虚拟聚合物。可选择地,所述荧光剂可从低聚糖构建。
所述荧光聚合物或寡聚物可以通过共价结合到固体载体、吸附到固体载体表面,或者通过所述荧光聚合物或寡聚物上的生物素半族与固体载体表面上的亲和素、中性链亲和素或链霉亲和素部分之间的相互作用与所述图体载体连接。
所述荧光剂可以通过蛋白分子轭合到所述连接物。示例性的蛋白分子包括亲和素、中性链亲和素和链霉亲和素。
在一个实施方案中,当所述样品仅孵育15分钟时,称为STA-200的公知的β-分泌酶的抑胃酶氨酸(statine)衍生的肽抑制剂显示出纳摩尔浓度范围的IC50值。所述β-分泌酶的抑胃酶氨酸-衍生的肽抑制剂的结构如下:
KTEISEVN-(Sta)-VAEF-OH(SEQ ID NO:6).
其中“Sta”表示抑胃酶氨酸残基。在本发明的当前实施方案中,所述分析在诸如96-孔或384-孔板的微孔培养板的孔中进行。因此,该分析方便在多数药物筛选实验室中都有的常规微孔板阅读器中使用。该分析对β-分泌酶活性检测是均一、灵敏和快速的。在本发明的当前实施方案中,该β-分泌酶的QTL分析对反应混合物中存在的最高10%水平的DMSO具有耐受性。该分析对反应混合物中存在的最高至10%水平的甲醇和乙腈具有耐受性。因此,该分析适用于以高通量方式筛选潜在的药物,评估该潜在药物抑制β-分泌酶对肽底物的活性的效力。在本发明的当前实施方案中,该分析是非常强力的,并且当肽底物的转化率约为10%时提供超过0.6的Z’值。
根据本发明的另一实施方案,提供了分析样品中靶酶活性的方法,该方法包括:将该样品与包含与连接物轭合的猝灭剂的生物轭合物孵育,其中所述连接物包括能被所述靶酶识别并与之相互作用的部分;向该孵育的样品中加入荧光剂来形成样品混合物,该荧光剂包括多种相互结合的荧光物质,因而该荧光剂与所述猝灭剂的联合产生放大的所述荧光剂的超猝灭;让所述靶酶剪切所述生物轭合物并释放所述猝灭剂;及随后检测所述样品混合物的荧光。所述样品混合物的荧光量表明样品中靶酶活性的存在和/或数量。
上述分析使用了猝灭剂-连接物(QT)生物轭合物,该轭合物不能与所添加的荧光剂反应来猝灭其荧光。通过靶酶的剪切,所述猝灭剂从该生物轭合物中释放出来,使得其可与所述荧光剂相互作用引起荧光猝灭反应。所述猝灭剂与荧光剂之间的相互作用可以是库仑引力、氢键力、范德华力或者是共价键结合的结果。
根据本发明的一个实施方案,所述荧光剂是阴离子型轭合聚合物,而所述猝灭剂是阳离子型电子或能量转移猝灭剂。根据该实施方案,所述猝灭剂-连接物生物轭合物整体带负电,因此不能与所述荧光剂反应并使其猝灭。通过靶酶对所述生物轭合物的剪切,所述阳离子型猝灭剂被释放,使得其能猝灭所述荧光剂。
在本发明进一步的实施方案中,所述荧光剂是包括花菁染料供体聚集体的“虚拟聚合物”,而所述猝灭剂是受体(acceptor)花菁染料。根据该实施方案,当所述受体与所述连接物轭合时,其不能与花菁染料供体形成聚集体,因此不能猝灭供体的荧光。该生物轭合物不能与所述供体形成聚集体可以是电荷效应、空间效应或其组合的结果。当所述连接物被靶酶剪切后,所述生物轭合物的含猝灭剂的片段能与供体花菁形成聚集体,进而猝灭该供体的荧光。
所述花菁染料受体可以是荧光分子或非荧光分子。如果该受体花菁本身具有荧光,其与所述供体花菁形成聚集体会使所述受体产生敏化荧光。因此,通过跟踪所述供体的荧光强度的降低或所述受体的信号强度的增强可以监测所述样品的酶活性。该实施方案的分析方法能以细胞内和细胞外分析方式测定酶活性。
本发明的另一方面,提供了用于分析细胞内或细胞外样品内的靶酶活性的方法,该方法包括:将该样品与生物轭合物孵育,该轭合物包含与连接物轭合的荧光染料,其中当被酶从该生物轭合物上剪切下后,所述荧光染料能形成如J-型聚集体的聚集体,而所述连接物包括能被所述酶识别并与其发生相互作用的部分;使所述酶剪切所述生物轭合物,使其释放所述染料;及随后通过用所述染料聚集体能吸收而所述染料标记的生物轭合物不能吸收的波长激发所述样品来检测所述样品混合物的荧光。所述样品混合物的荧光数值表明所述样品中靶酶活性的存在和/或数量。
根据本发明的该方案,所述荧光染料可以是花菁分子,当与所述连接物轭合时,其以单体形式存在并具有较宽的吸收和发射光谱。通过靶酶剪切所述连接物后,含所述荧光染料的片段从所述生物轭合物中释放出来,并能形成结合较弱的如J-聚集体的聚集体,与所述单体相比该聚集体表现出吸收和发射最大值朝长波方向的较大偏移和窄得多的光谱。因此,通过在所述聚集体的最大吸收波长激发所述样品来监测所述样品的发射,该波长导致来自所述生物轭合物本身的信号很低或没有信号。在由酶切生物轭合物产生的游离染料分子形成的染料聚集体存在下,所述样品提供的信号强度是酶活性的指标。
在卢(Lu)等的″Surface Enhanced Superquenching of Cyanine Dyes asJ-Aggregates on Laponite Clay Nanoparticles《Laponite粘土纳米颗粒上的J-聚集体形式的花菁染料的表面增强的超猝灭》″,Langmuir,18卷,20期,7706-7713页(2002)中公开了能形成J-聚集体的花菁染料。该参考文献还公开了能猝灭J-聚集花菁染料供体的荧光的花菁染料受体。在卢(Lu)等的“《花菁侧链聚(L-赖氨酸)染料中的超猝灭:对分子量,溶剂和聚集的的依赖》Superquenching in Cyanine Pendant Poly(L-Lysine)Dyes:Dependence on Molecular Weight,Solvent and Aggregation”,J.Am.Chem.Soc.,Vol.124,No.3(2002)中公开了J-型聚集的聚合物。
实验
β-分泌酶活性测定的通用分析方法
在384-孔培养板中,将适合浓度的5mL β-分泌酶肽底物溶液与给定含量的β-分泌酶在分析缓冲液中以总量10mL混合。在相同的培养板中进行对照实验,其中在缓冲液中加入相同含量的肽而不加入酶。对于样品与对照通常进行三次重复的实验。在CRT进行预定时间的孵育之后,在样品与对照孔中加入聚合物缓冲液中的荧光聚合物。在培养板读数仪中振动该孔板,并检测所述样品与的荧光强度。
样品与对照孔中相对荧光单位的差值为酶活性的检测值。
在上述实施例中,所述聚合物包括以下任意聚合物:
A.聚苯乙烯乳胶羧酸微球官能化的生物素结合蛋白(BBP),其用轭合的聚合物1来包被;
B.BBP与生物素化聚合物2复合物的溶液;
C.掺杂有少量与生物素轭合的藻红蛋白或相关的荧光素蛋白的A中的微球;
D.掺杂有少量与生物素轭合的藻红蛋白或相关的荧光素蛋白的B中的溶液传感器,及
E.藻红蛋白或另一种荧光素蛋白与BBP的共价轭合物。
上述实验中的肽底物可以是上述列出的任意底物。所有这些肽含有能够被β-分泌酶识别和剪切的氨基酸序列。此外,可在每一底物的一端加上生物素基标签,而在另一端加上猝灭剂。
以下的实施例说明利用不同的聚合物形式以及不同的肽来测定样品中β-分泌酶活性的QTP分析的作用,来表明在β-分泌酶已知抑制剂的存在下酶的活性的抑制,并证明在诸如生理浓度的有机溶剂、有色化合物、荧光化合物、公知的蛋白、表面活性剂以及阳性和阴性的带电离子的不同潜在的干扰物的存在下,所述分析的稳定性。
实施例1
向384孔培养板小孔中的5μL含400nM BSEC-1溶液的分析缓冲液中,加入含20ng β-分泌酶的5μL分析缓冲液。在对照小孔中,将5μL 400nM BSEC-1溶液与不含任何酶的5μL分析缓冲液混合。将混合物在CRT中孵育30分钟。在孵育阶段结束时,将18.5μL含1×107微球的聚合物悬浮液加入到每一小孔中。在微板读数仪中振动该培养板60秒,通过在420nm处激发,探测所述样品在530nm处的散射。在分析中使用475nm排阻滤片(cut-off filter)。每一样品与对照检测三次,并将结果平均来提供可靠数值。对照组的荧光强度单位(RFU)为5529±286,而样品的RFU为9045±109。所述样品相对于对照组的增益(也称为δ值)与样品中所述β-分泌酶活性直接对应。
实施例2
当实验中使用含偶氮染料猝灭剂的BSEC-2肽,可看到增强的分析表现。向含5μL 400nM BSEC-3的溶液中加入5μL β-分泌酶(60ng)溶液。与实施例1相同建立本实验的对照小孔。在加入聚合物之前将酶和对照小孔在CRT中仅孵育10分钟。将20μL含1×107微球的聚合物悬浮液加入每一小孔中。通过在440nm处激发并使用475nm排阻滤片,探测所述样品在530nm处的荧光强度。对照组的RFU为8111±707,而样品的RFU为10996±424。
实施例3
当聚合物微球样品A掺杂少量生物素-R-藻红蛋白(生物素-R-PE)轭合物时所述分析表现出进一步改善。在一个实验中,在相同的条件下,将BSEC-1、BSEC-3(a,b)(由不同厂商合成的相同的肽底物)以及BSEC-4全部暴露于β-分泌酶来比较在所述分析中的它们的效率。通过将聚合物A与生物素-R-PE以设计提供掺杂有10μL的100fmol生物素-R-PE每孔的5×106微球的比例混合,在实验开始前新鲜制备聚合物样品C。
向分开的小孔中的5μL含300nM每一肽底物的分析缓冲溶液中加入含10ng β-分泌酶5μL分析缓冲液来起始该反应。每一反应进行三次。不含酶的每一肽的对照重复进行四次。在CRT中孵育样品60分钟。孵育结束时,将掺杂有聚合物C的生物素-R-PE加入到每一小孔中。在培养板读数仪中振动该培养板60秒,随后通过在440nm处激发并使用475nm排阻滤片,探测所述样品在576nm处的散射。BSEC-1的对照组RFU值为6270±196,样品组值为9645±152。BSEC-3a的对照组RFU值为7656±20,样品组值为15022±743,而BSEC-3b的对照组与样品组的RFU值分别为6054±41和12265±913。相比较而言,BSEC-4的对照组与样品组的值分别为9207±364和732±319。
实施例4
通过将56.5nmol亲和素(结合蛋白的生物素,BBP)与848nmol的生物素化PPE聚合物2在11.3μL的总体积中混合来制备聚合物溶液传感器B并在CRT孵育24小时。该聚合物与BBP通过生物素-亲和素相互作用来形成稳定的实体。在每一实验的开始用聚合物缓冲液稀释由此制备的该溶液传感器。
实施例5
向384孔培养板中的5μL的含400nM BSEC-1的分析缓冲液中加入溶解在5μL分析缓冲液中的30ng β-分泌酶。制备该混合物三次,并在CRT中孵育30分钟。对照小孔仅含肽不含酶。孵育后,以每孔20μL加入上述溶液传感器的100倍稀释液。在微板读数仪中振动该培养板,通过在440nm处激发该聚合物,探测在530nm处的散射强度。对照组的平均RFU值为5400±200,而含酶的样品RFU为8350±200。
实施例6
通过用少量的生物素-R-PE掺杂溶液传感器聚合物B可较好地改善分析表现。通过孵育200倍稀释的聚合物B的主储存液与生物素-R-PE,在每一实验的开始制备聚合物传感器D,该混合的比例为在40μL该混合物中能够提供250fmol的后者。向含5μL 300nM BSEC-3溶液的分析缓冲液中加入含30ng β-分泌酶的5μL分析缓冲液。在CRT中孵育所述对照与样品混合物30分钟后,向每一小孔中加入40μl掺杂溶液传感器D。在培养板读数仪中振动该培养板60秒,通过在440nm处激发该聚合物,使用475nm排阻滤片,探测所述小孔在576nm处的荧光强度。对照组的RFU值为5200±100,而样品的RFU为14500±200。
实施例7
在β-分泌酶的QTL分析中,可单独使用含诸如藻红蛋白的多种生色团的高度荧光蛋白。向5μL含300nM BSEC-1溶液的分析缓冲液中加入含20ng β-分泌酶的5μL分析缓冲液。对照小孔只含有BSEC-1而不含酶。将该混合物孵育30分钟后,向每一小孔中加入10μL 5nM(50fmol)的抗生素蛋白链菌素-B-藻红蛋白轭合物(SAv-BPE,聚合物E)。在培养板读数仪中振动该培养板,通过在490nm处激发该聚合物,使用515nm排阻滤片,探测所述样品与对照小孔在576nm处的荧光强度。对照组的平均RFU值为7671±286,而酶小孔为11828±556。
在相同的条件下用BSEC-3替代BSEC-1进行分析时δRFU更佳:对照RFU为11639±335,而样品RFU为18032±228。
实施例8
STA-200是已知的β-分泌酶活性抑制剂。向2.5μL含800nMBSEC-1的分析缓冲液中加入30ng β-分泌酶并用分析缓冲液使总体积为10μL。在另一小孔中,将2.5μL 800nM BSEC-1溶液与2.5μL STA-200和30ng的β-分泌酶的预混合溶液孵育,使终体积也为10μL。在分开的小孔中也建立两个对照反应,其中一个在分析缓冲液中仅含有肽,而另一个在分析缓冲液含有肽和抑制剂。在CRT孵育所有样品15分钟,随后每一孔加入含19.2μL含聚合物A悬浮液(1×107微球)的聚合物缓冲液。随后通过在440nm处激发该混合物,使用475nm排阻滤片,探测所述混合物在530nm处的发散。单独的肽与酶的混合物具有高于对照的δRFU值(delta-over-control RFU)为4468±85。相比较而言,肽、酶和60nM STA-200(600fmol)的混合物给出了高于对照的δRFU值为2746±241,而含有250nM STA-200(2.5pmol)混合物的对应值仅为865±178。
其它蛋白酶的肽底物、试剂盒及分析
以上公开了对β-分泌酶的肽底物、试剂盒及分析。以下是对可用于诸如半胱天冬酶的其它蛋白酶分析的示例性肽底物进行讨论。以下也讨论的用于半胱天冬酶-3活性的特异底物。
特别是,提供了用于分析样品中靶酶活性的方法,其包括:将所述样品与包含与连接物轭合的猝灭剂的生物轭合物孵育,其中所述连接物包括能够被所述靶酶剪切的部分;向孵育的样品中加入荧光剂来形成样品混合物,所述的荧光剂包括多种相互结合的荧光素种类,使得所述荧光剂与所述猝灭剂的结合产生放大的所述荧光剂的超猝灭;及使用所述靶酶剪切所述连接物,其中所述连接物的剪切产生含有猝灭剂的片段,该片段具有比与所述生物轭合物更强的与所述荧光剂的结合趋势;及随后检测所述样品混合物的荧光。所述样品混合物的荧光量提示所述样品中靶酶活性的存在和/或其数量。所述猝灭剂与荧光剂的结合可产生库仑吸引、氢结合力、范德华力或共价键形式。例如,所述荧光剂与所述生物轭合物每一个可具有完全的负电荷,且所述含有片段的猝灭剂具有净正电荷。所述荧光剂可以是阴离子轭合的聚合物,且所述猝灭剂为阳电子或能量转移猝灭剂。
可由以下通式代表所述的生物轭合物:
D-E-V-D-QSY7′(SEQ ID NO:7)
其中“QSY7”代表猝灭剂半族,其可由以下通式表示:
其中“*”代表所述猝灭剂半族与所述连接物的结合点。
在由SEQ ID NO:7表示的肽底物中,所述猝灭剂部分通过所述猝灭剂的氨基与所述C-末端天冬氨酸残基的羧酸基团结合。
通过所述猝灭剂上的氨基,所述多肽连接物可与所述猝灭剂轭合。通过氨基与所述猝灭剂轭合的示例性猝灭剂如下所示:
当通过伯氨基与所述多肽连接物轭合时,此猝灭剂形成所述的QSY7′猝灭剂半族。也可使用具有氨基的其它猝灭剂。利用已知的化学合成技术可合成这些猝灭剂。
由SEQ ID NO:7表示的所述QT生物轭合物的总电荷为-2(D与E=-1,QSY7′=+1)。因此所述生物轭合物不会与带有净负电荷的荧光剂结合。然而利用所述酶对所述连接物的剪切可产生含有猝灭剂的片段,该片段带有总的正电荷(+1)。因此所述含有猝灭剂的片段将倾向于与具有净负电荷的荧光剂结合。
根据本发明的另一实施方案,所述荧光剂是含有花菁染料(cyaninedye)供体集合体的虚拟的聚合物,所述猝灭剂为花菁染料受体,当与所述连接物轭合时,不能与所述花菁染料供体形成集合体。所述生物轭合物不能与所述花菁染料供体形成集合体是电荷作用或空间作用的结果。所述花菁染料受体可以是荧光分子和非荧光分子。当所述花菁染料受体为荧光分子时,可检测所述受体的荧光性。可选择地,也可检测所述供体的荧光性。根据本发明实施方案的分析可以是细胞内和细胞外分析。
根据本发明的另一实施方案,提供了分析样品中靶酶活性的方法,其包括:将所述样品与含有与连接物轭合的荧光染料的生物轭合物孵育,其中所述连接物包含能够被所述靶酶剪切产生含有荧光染料的片段的部分,且其中所述含有荧光染料的片段能够形成染料聚合体,该聚合体具有不同于所述生物轭合物的吸收光谱;使用所述酶剪切所述的生物轭合物;及检测所述样品混合物荧光性,通过在某一波长激发所述样品,其中所述染料聚合体比所述生物轭合物吸收更大的范围。所述样品混合物的荧光量提示所述样品中所述靶酶活性的存在和/或其数量。所述荧光染料可以是花菁分子。所述通过酶剪切从所述生物轭合物释放的含有荧光染料的片段能够形成J-聚合体。所述靶酶可以是半胱天冬酶。例如,所述靶酶可以是半胱天冬酶-3,以及所述生物轭合物可具有由以下通式代表的结构:
D-E-V-D-花菁(SEQ ID NO:8)
其中“花菁”代表花菁染料半族。
示例性的花菁染料半族包括但不限于如下:
可使用常规的合成化学方法来将所述花菁染料轭合到所述肽连接物上。根据一个实施方案,可通过所述染料侧链上的官能基团将所述连接物与所述染料轭合。例如,利用具有官能基团的侧链与所述连接物上的基团(即氨基和羧酸基团)反应合成花菁染料。在所述染料上可合成的反应基团的例子为氨基和羧酸基团。根据本发明的一个实施方案,利用氨基和羧酸基团可合成所述花菁染料上的烃基侧链基团,该氨基和羧酸基团随后可用于与所述连接物上羧酸基团的轭合。
可用于J-聚合体形式的蛋白酶分析的肽底物的例子如以下所示:
其中所述“连接物”表示能够被蛋白酶剪切的多肽。对应半胱天冬酶-3分析,所述连接物包括如下肽序列:
D-E-V-D(SEQ ID NO:9)
其中所述连接物通过所述C末端天冬氨酸残基的羧酸基团与所述染料半族结合。
尽管多肽连接物包括序列:
D-E-V-D(SEQ ID NO:9)
如上所述,其用于半胱天冬酶-3分析,也可使用其它的能够被半胱天冬酶-3剪切的序列。此外,上述技术也可用于其它蛋白酶的分析中,其中所述连接物包括能够被感兴趣蛋白酶剪切的肽序列。
根据本发明的另一实施方案,所述酶的剪切产生含有染料的片段,该片段能够形成J-聚合体。通过在所述聚合体的吸收最大值激发所述样品,来对所述样品的散射进行监测,可提供其强度可作为酶活性指示剂的信号。
根据本发明的另一实施方案,提供上述的生物轭合物和含有所述生物轭合物的试剂盒。本发明的另一实施方案提供包括荧光剂和生物轭合物的试剂盒,该荧光剂包括所述多种荧光剂种类,该生物轭合物包括与连接物轭合的猝灭剂,其中所述连接物包括能够被半胱天冬酶剪切的部分。根据本发明的这一实施方案,所述连接物的剪切产生含有猝灭剂的生物轭合物片段,该片段具有比所述生物轭合物对荧光剂更强的结合趋势。此外,所述荧光剂与所述猝灭剂的结合产生放大的所述荧光剂的超猝灭。多种结合荧光剂种类可与固体支持物结合。所述的靶半胱天冬酶可以是半胱天冬酶-3,且所述能够被半胱天冬酶剪切的部分为肽序列:
DEVD(SEQ ID NO:9)。
所述含有猝灭剂的生物轭合物片段可通过库仑吸引、氢结合力、范德华力或共价键形式与所述荧光剂结合。例如,所述荧光剂与所述生物轭合物的每一个可具有完全的负电荷,且所述含有猝灭剂的生物轭合物片段可具有净正电荷。所述荧光剂可以是阴离子轭合聚合物,且所述猝灭剂为阳电子或能量转移猝灭剂。所述生物轭合物可以由以下通式表示:
D-E-V-D-QSY7′(SEQ ID NO:7)
其中“QSY7′”代表所述猝灭剂半族:
其中“*”代表所述猝灭剂半族与所述连接物的结合点。且其中所述猝灭剂半族通过所述连接物的C末端天冬氨酸残基的α-羧酸基团与所述连接物轭合。
所述猝灭剂可通过二价键半族与所述连接物轭合。例如,诸如QSY7的具有羧酸基团的猝灭剂可利用二胺与所述的多肽连接物的羧酸基团轭合。
因此,二价连接剂半族可以是二胺。二胺的例子包括但不限于诸如1,2-二氨基乙烷的二氨基烷。
根据本发明的另一实施方案,还提供上述的试剂盒,其中所述荧光剂是含有花菁染料(cyanine dye)供体聚合体的虚拟的聚合物,所述猝灭剂为花菁染料受体,且其中当与所述连接物轭合时,所述受体不能与所述花菁染料供体形成聚合体。所述生物轭合物不能与所述供体形成聚合体是电荷作用或空间作用的结果。所述花菁染料受体可以是荧光分子和非荧光分子。
根据本发明的另一实施方案,提供包括连接物和与所述连接物轭合的猝灭剂的生物轭合物,所述连接物包括能够被半胱天冬酶剪切的部分。所述半胱天冬酶可以是半胱天冬酶-3,且所述能够被半胱天冬酶剪切的部分可以是肽序列:
DEVD(SEQ ID NO:9).
所述猝灭剂可以是为阳电子或能量转移猝灭剂。
所述生物轭合物可以是由以下通式表示的生物轭合物:
D-E-V-D-QSY7′(SEQ ID NO:7)
其中所述“QSY7′”代表以下结构的猝灭剂半族:
其中“*”代表所述猝灭剂半族与所述连接物的结合点,且其中所述猝灭剂半族通过所述连接物的C末端天冬氨酸残基的α-羧酸基团与所述连接物轭合。
猝灭剂可通过二价键半族与所述连接物轭合。例如,诸如QSY7的具有羧酸基团的猝灭剂可利用二胺与所述的多肽连接物羧酸基团轭合。
因此,二价连接剂半族可以是二胺。二胺的例子包括但不限于诸如1,2-二氨基乙烷的二氨基烷。
根据本发明的另一方面,提供包括与连接物轭合的荧光素的生物轭合物,其中所述连接物包括能够由所述靶酶剪切产生含荧光染料的片段的部分。所述含荧光染料的片段能够形成染料聚合体,其具有与所述生物轭合物不同的吸收光谱。所述荧光染料可以是花菁染料。所述含有荧光染料的片段能够形成J-聚合体。所述靶酶可以是诸如半胱天冬酶-3的半胱天冬酶。所述能够被所述靶酶剪切的部分可以是肽序列:
DEVD(SEQ ID NO:9)。
示例性的生物轭合物具有以下通式表示的结构:
D-E-V-D-花菁(SEQ ID NO:8)
其中所述“花菁”表示花菁染料半族,其中所述花菁染料半族与所述连接物的C末端天冬氨酸残基的α-羧酸基团轭合。例如,所述生物轭合物可具有以下通式表示的结构:
以下的预测实施例(实施例9与10)涉及半胱天冬酶-3活性的分析。
实施例9-QT分析形式
在此实施例中,描述了用于半胱天冬酶-3分析的猝灭剂-连接物轭合物的利用。向384孔培养板小孔中的含已知含量的由SEQ ID NO:7表示的肽的分析缓冲液中加入含有半胱天冬酶-3的样品。将所述混合物在CRT中孵育几分钟。通过所述的酶剪切完全负电性的所述的肽底物,来分离所述的负电性的肽和所述的正电性的猝灭剂。孵育后,将由上述通式2代表的负电性的聚合物加入到小孔中,随后检测所述混合物的荧光性,并与含有肽和聚合物但不含酶的对照混合物比较。
样品与对照之间的荧光差异为所述样品酶活性的检测值。这种类型的分析如图2所示。
实施例10-聚合体形成分析
在384孔培养板一个小孔中,向含已知含量的由SEQ ID NO:8表示的肽底物的分析缓冲液中加入含有半胱天冬酶-3的样品溶液。在另一小孔中只有肽底物没有酶。将所述培养板在CRT中孵育,在不同的时间阶段检测样品与对照小孔的荧光强度。对照随时间的增加保持不变时,而所述样品显示荧光的增加,其即为酶活性的检测。这种类型的分析如图3所示。
上述描述仅是以示例性的方式进行的并不是对其的限制。尽管为了说明的目本发明描述了特定的实施方案,但是在不用创造性的实践条件下可对这些实施方案进行各种修改。所有这些修改均属于所附权利要求的精神与范围内。
Claims (91)
1.生物轭合物,包含:
连接物,所述连接物包含能识别β-分泌酶并与之相互作用的部分;
荧光剂,所述荧光剂包含多种荧光物质,并与所述连接物上的第一位置轭合;以及
猝灭剂,所述猝灭剂与所述连接物上的第二位置轭合;
其中,所述能识别所述靶生物分子并与之相互作用的部分位于所述连接物的所述第一和第二位置之间,且所述多种荧光物质相互结合,使得所述猝灭剂能放大所述荧光剂的超猝灭。
2.如权利要求1所述的生物轭合物,其中所述能识别β-分泌酶并与之相互作用的部分包含多肽序列:SEVNLDAEF(SEQ ID NO:1)。
3.如权利要求1所述的生物轭合物,其中所述荧光剂包含聚合物或寡聚物,所述聚合物或寡聚物包含多种荧光重复单元。
4.如权利要求1所述的生物轭合物,其中所述荧光剂包含与多种荧光物质结合的固体载体。
5.如权利要求4所述的生物轭合物,其中一种或多种猝灭剂中的每一种均通过反应性的连接物连接到所述固体载体。
6.如权利要求4所述的生物轭合物,其中所述固体载体选自链霉亲和素包被的球体;聚合物微球体;硅石微球体;有机纳米颗粒;无机纳米颗粒;磁珠;磁颗粒;半导体纳米颗粒;量子点;膜;片;板和试管。
7.如权利要求1所述的生物轭合物,其中所述荧光剂选自轭合的聚合电解质;荧光蛋白质;生物素基化的轭合的聚合电解质;官能化的轭合聚合物;荷电的轭合聚合物;不荷电的轭合聚合物;轭合聚合物的混合物;以及J-型聚集的聚合物聚集体,所述聚合物聚集体包含聚集的单体或寡聚物。
8.如权利要求1所述的生物轭合物,其中所述荧光剂是虚拟聚合物。
9.如权利要求1所述的生物轭合物,其中所述荧光剂是具有花菁侧基的聚(L-赖氨酸)聚合物或寡聚物。
10.如权利要求1所述的生物轭合物,其中所述荧光剂是从寡糖构建的。
11.如权利要求4所述的生物轭合物,其中所述荧光剂包含荧光聚合物或寡聚物。
12.如权利要求11所述的生物轭合物,其中所述荧光聚合物或寡聚物通过共价连接到所述固体载体或吸附到所述固体载体表面与所述固体载体结合;或通过所述荧光聚合物或寡聚物上的生物素半族与所述固体载体表面上的亲和素、中性链亲和素或链霉亲和素之间的相互作用与所述固体载体结合。
13.如权利要求1所述的生物轭合物,其中所述荧光剂通过蛋白分子轭合到所述连接物。
14.如权利要求13所述的生物轭合物,其中所述蛋白分子选自亲和素,中性链亲和素和链霉亲和素。
15.如权利要求1所述的生物轭合物,其中所述猝灭剂是非荧光的。
16.如权利要求1所述的生物轭合物,其中所述猝灭剂是具有荧光的,且能够将吸收自所述荧光剂的能量重新放射。
17.分析样品中的β-分泌酶活性的方法,包括:
将所述样品与生物轭合物孵育,所述生物轭合物包含分别轭合在连接物的第一和第二位置的猝灭剂和配基,其中所述连接物包含位于所述第一和第二位置之间的、能识别β-分泌酶并与之相互作用的部分;
向所述孵育样品中加入荧光剂形成样品混合物,所述荧光剂包含多种荧光物质,其中所述荧光剂包含能与所述生物轭合物的配基结合的半族,使得所述生物轭合物能结合到所述荧光剂,且所述荧光剂与所述配基的结合导致所述荧光剂的放大的超猝灭;
使所述生物轭合物上的所述配基结合到所述荧光剂;及
随后测定所述样品混合物的荧光;
其中所述样品混合物的荧光量表明了所述样品中β-分泌酶活性的存在和/或数量。
18.如权利要求17所述的方法,其中所述多种结合的荧光物质与固体载体结合。
19.如权利要求17所述的方法,还包含:
向包含所述生物轭合物但未与所述酶孵育的第二样品中加入所述荧光剂形成对照;
测定所述对照的荧光;及
将所述对照的荧光和所述样品混合物的荧光进行比较;
其中所述对照和所述样品混合物之间荧光的差值表明了所述样品中β-分泌酶的存在和/或数量。
20.如权利要求17所述的方法,其中所述样品包含β-分泌酶和测试化合物,所述方法还包含:
将不含测试化合物的第二样品与所述生物轭合物孵育;
向所述孵育的第二样品中加入所述荧光剂形成对照;
测定所述对照的荧光;及
将所述对照的荧光和所述样品混合物的荧光进行比较;
其中,所述对照和所述样品混合物之间荧光的差值表明了所述样品中所述测试化合物抑制β-分泌酶活性的能力。
21.如权利要求17所述的方法,其中所述配基是生物素部分,且所述荧光剂上的半族是亲和素,中性链亲和素或链霉亲和素半族。
22.分析样品中的β-分泌酶活性的方法,所述方法包括:
将所述样品与权利要求1所述的生物轭合物孵育;及
测定所述孵育样品的荧光;
其中,测得的所述孵育样品的荧光表明了所述样品中β-分泌酶活性的存在和/或数量。
23.如权利要求22所述的方法,还包括:
测定对照的荧光;及
将所述对照的荧光和所述孵育样品的荧光进行比较;
其中,所述对照和所述孵育样品之间荧光的差值表明了所述样品中β-分泌酶活性的存在或数量。
24.如权利要求22所述的方法,其中所述样品包含β-分泌酶和测试化合物,并且分析了所述测试化合物抑制β-分泌酶活性的能力。
25.如权利要求22所述的方法,其中所述荧光剂包含固体载体,且所述多种荧光物质与所述固体载体结合。
26.如权利要求25所述的方法,其中一种或多种猝灭剂中的每一种均通过反应性连接物连接到所述固体载体。
27.如权利要求25所述的方法,其中所述固体载体选自链霉亲和素包被的球体;聚合物微球体;硅石微球体;有机纳米颗粒;无机纳米颗粒;磁珠;磁颗粒;半导体纳米颗粒;量子点;膜;片;板和试管。
28.试剂盒,包含:
荧光剂,所述荧光剂包含多种荧光物质;以及
生物轭合物,所述生物轭合物包含分别轭合在连接物的第一和第二位置上的猝灭剂和配基,其中所述连接物包含位于所述第一和第二位置之间的能识别β-分泌酶并与之相互作用的部分;
其中所述荧光剂包含能与所述生物轭合物上的所述配基结合的半族,且所述多种荧光物质相互结合,因而当所述配基与所述荧光剂结合时,所述猝灭剂能放大所述荧光剂的超猝灭。
29.如权利要求28所述的试剂盒,其中所述结合的多种荧光物质与固体载体结合。
30.如权利要求28所述的试剂盒,其中所述配基是生物素半族。
31.如权利要求28所述的试剂盒,其中所述能与所述配基结合的所述半族选自亲和素,中性链亲和素和链霉亲和素。
32.如权利要求28所述的试剂盒,其中所述能识别β-分泌酶并与之相互作用的部分包含多肽序列:SEVNLDAEF(SEQ ID NO:1)。
33.生物轭合物,包含:
连接物,所述连接物包含能识别β-分泌酶并与之相互作用的部分;
猝灭剂,所述猝灭剂轭合到所述连接物上的第一位置,所述猝灭剂能猝灭荧光剂的荧光,所述荧光剂包含多种结合的荧光物质;及
生物素分子,所述生物素分子轭合到所述猝灭剂上的第二位置;
其中能识别所述靶生物分子并与之相互作用的部分位于所述连接物上的第一和第二位置之间,且所述多种荧光物质相互结合,使得所述猝灭剂能放大所述荧光剂的猝灭。
34.如权利要求33所述的生物轭合物,其中所述能识别β-分泌酶并与之相互作用的部分包含多肽序列:SEVNLDAEF(SEQ ID NO:1)。
35.如权利要求34所述的生物轭合物,其中所述生物轭合物具有以下序列所示的结构:
(QSY-7)-TEEISEVNLDAEFK-(Nε-生物素)(SEQ ID NO:2);
(QSY-7)-TEEISEVNLDAEFK-(Nε-PEG-生物素)(SEQ ID NO:3);
(AZO)-TEEISEVNLDAEFK-(Nε-生物素)(SEQ ID NO:4);或
(AZO)-TKKISEVNLDAEFRK-(Nε-生物素)(SEQ ID NO:5);
其中QSY-7,AZO,生物素和PEG-生物素所代表的半族具有以下结构:
其中,“*”表示每个半族对所述多肽的连接点,“Nε”表示所述生物素半族或PEG-生物素半族通过所述C-末端赖氨酸残基的ε-氨基与所述多肽的赖氨酸残基相连,且所述QSY-7和AZO半族通过所述N-末端苏氨酸残基的氨基与所述多肽相连。
36.分析样品中的靶酶活性的方法,包括:
将所述样品与生物轭合物孵育,所述生物轭合物包含与连接物轭合的猝灭剂,其中所述连接物包含能被所述靶酶剪切的部分;
向所述孵育样品中加入荧光剂形成样品混合物,所述荧光剂包含多种相互结合的荧光物质,使得所述荧光剂与所述猝灭剂的结合能放大所述荧光剂的超猝灭;及
使所述靶酶剪切所述连接物,其中所述连接物的剪切导致含有猝灭剂的生物轭合物片段比所述生物轭合物具有更大的与所述荧光剂结合的倾向;及
随后测定所述样品混合物的荧光;
其中所述样品混合物的荧光量表明了所述样品中的靶酶活性的存在和/或数量。
37.如权利要求36所述的方法,其中所述靶酶是半胱天冬酶。
38.如权利要求36所述的方法,其中所述靶酶是半胱天冬酶-3。
39.如权利要求38所述的方法,其中所述能被所述靶酶剪切的部分是多肽序列:DEVD(SEQ ID NO:9)。
40.如权利要求36所述的方法,其中所述含有猝灭剂的生物轭合物片段与所述荧光剂之间的结合包括库伦引力,氢键力,范德华力或形成共价键。
41.如权利要求36所述的方法,其中所述荧光剂和所述生物轭合物总体上都带负电荷,且所述含有猝灭剂的生物轭合物片段具有净正电荷。
42.如权利要求41所述的方法,其中所述荧光剂是阴离子型轭合聚合物。
43.如权利要求41所述的方法,其中所述猝灭剂是阳离子型电子转移或能量转移猝灭剂。
45.如权利要求36所述的方法,其中所述猝灭剂通过二价链接剂与所述连接物轭合。
46.如权利要求45所述的方法,其中所述二价链接剂是二胺。
47.如权利要求36所述的方法,其中所述荧光剂是包含花菁染料供体聚集体的虚拟聚合物,所述猝灭剂是花菁染料受体,其中当与所述连接物轭合时,所述受体不能与所述花菁染料供体形成聚集体。
48.如权利要求47所述的方法,其中所述生物轭合物不能与所述供体形成聚集体是电荷效应或空间效应的结果。
49.如权利要求47所述的方法,其中所述花菁染料受体具有荧光。
50.如权利要求47所述的方法,其中所述花菁染料受体具有荧光,并且测定了所述受体的荧光。
51.如权利要求47所述的方法,其中测定了所述花菁染料供体的荧光。
52.如权利要求47所述的方法,其中所述分析是细胞内分析或细胞外分析。
53.分析样品中靶酶活性的方法,包括:
将所述样品与生物轭合物孵育,所述生物轭合物包含与连接物轭合的荧光染料,其中所述连接物包含能被所述靶酶剪切的部分以产生含有荧光染料的片段,其中所述含有荧光染料的片段能形成染料聚集体,所述聚集体具有与所述生物轭合物不同的吸收谱,及;
使所述靶酶剪切所述连接物;及
通过在所述染料聚集体吸收程度大于所述生物轭合物的波长激发所述样品,来测定所述样品混合物的荧光;
其中,所述样品混合物的荧光量表明了所述样品中靶酶活性的存在和/或数量。
54.如权利要求53所述的方法,其中所述荧光染料是花菁染料。
55.如权利要求54所述的方法,其中所述包含荧光染料的片段能形成J-聚集体。
56.如权利要求53所述的方法,其中所述靶酶是半胱天冬酶。
57.如权利要求53所述的方法,其中所述靶酶是半胱天冬酶-3。
58.如权利要求53所述的方法,其中所述能被所述靶酶剪切的部分是多肽序列:DEVD(SEQ ID NO:9)。
59.如权利要求58所述的方法,其中所述生物轭合物具有如以下通式所示的结构:
D-E-V-D-花菁(SEQ ID NO:8)
其中“花菁”代表花菁染料半族,其中所述花菁染料半族轭合于所述C-末端天冬氨酸残基的α-羧酸基团。
60.如权利要求59所述的方法,其中所述生物轭合物具有以下通式代表的结构:
61.试剂盒,包含:
荧光剂,所述荧光剂包含多种荧光物质;以及
生物轭合物,所述生物轭合物包含与连接物轭合的猝灭剂,其中所述连接物包含能被半胱天冬酶剪切的部分;
其中,所述连接物的剪切产生含有猝灭剂的生物轭合物片段,其与所述荧光剂结合的倾向比所述生物轭合物更强,其中所述荧光剂与所述猝灭剂的结合导致了所述荧光剂的放大的超猝灭。
62.如权利要求61所述的试剂盒,其中所述结合的多种荧光物质与固体载体结合。
63.如权利要求61所述的试剂盒,其中所述半胱天冬酶是半胱天冬酶-3。
64.如权利要求63所述的试剂盒,其中所述能被半胱天冬酶剪切的部分是多肽序列:DEVD(SEQ ID NO:9)。
65.如权利要求61所述的试剂盒,其中所述含有猝灭剂的生物轭合物片段通过库伦引力,氢键力,范德华力或形成共价键来与所述荧光剂结合。
66.如权利要求61所述的试剂盒,其中所述荧光剂和所述生物轭合物中每个整体上都带负电荷,且所述含有猝灭剂的生物轭合物片段具有净正电荷。
67.如权利要求66所述的试剂盒,其中所述荧光剂是阴离子型的轭合聚合物。
68.如权利要求66所述的试剂盒,其中所述猝灭剂是阳离子型的电子转移或能量转移猝灭剂。
70.如权利要求61所述的试剂盒,其中所述猝灭剂通过二价链接剂与所述连接物轭合。
71.如权利要求70所述的试剂盒,其中所述二价链接剂是二胺。
72.如权利要求61所述的试剂盒,其中所述荧光剂是包含花菁染料供体聚集体的虚拟聚合物,所述猝灭剂是花菁染料受体,且当与所述连接物轭合时,所述受体不能与所述花菁染料供体形成聚集体。
73.如权利要求72所述的试剂盒,其中所述生物轭合物不能与所述供体形成聚集体是电荷效应或空间效应的结果。
74.如权利要求72所述的试剂盒,其中所述花菁染料受体是非荧光分子,或者是能够将吸收自所述荧光剂的能量重新放射的荧光分子。
75.生物轭合物,包括:
连接物,所述连接物包含能被半胱天冬酶剪切的部分;及
猝灭剂,所述猝灭剂与所述连接物轭合。
76.如权利要求75所述的生物轭合物,其中所述半胱天冬酶是半胱天冬酶-3。
77.如权利要求76所述的生物轭合物,其中所述能被半胱天冬酶剪切的部分是多肽序列:DEVD(SEQ ID NO:9)。
78.如权利要求75所述的生物轭合物,其中所述猝灭剂是阳离子型的电子转移或能量转移猝灭剂。
79.如权利要求75所述的生物轭合物,其中所述生物轭合物如以下通式所示:
D-E-V-D-QSY7`(SEQ ID NO:7)
其中“QSY7`”代表由以下结构表示的猝灭剂半族:
其中,“*”代表所述猝灭剂半族与所述连接物的连接点,且所述猝灭剂半族通过所述连接物的C-末端天冬氨酸残基的α-羧酸与所述连接物轭合。
80.如权利要求75所述的生物轭合物,其中所述猝灭剂半族通过二价链接剂与所述连接物轭合。
81.如权利要求80所述的生物轭合物,其中所述二价链接剂是二胺。
82.如权利要求75所述的生物轭合物,其中所述猝灭剂是花菁染料受体。
83.如权利要求82所述的生物轭合物,其中所述花菁染料具有荧光。
84.生物轭合物,包括:
轭合到连接物的荧光染料,其中所述连接物包含能被所述靶酶剪切的部分以产生含有荧光染料的片段,且所述含有荧光染料的片段能形成染料聚集体,所述聚集体具有与所述生物轭合物不同的吸收谱。
85.如权利要求84所述的生物轭合物,其中所述荧光染料是花菁染料。
86.如权利要求84所述的生物轭合物,其中所述包含荧光染料的片断能形成J-聚集体。
87.如权利要求84所述的生物轭合物,其中所述靶酶是半胱天冬酶。
88.如权利要求84所述的生物轭合物,其中所述靶酶是半胱天冬酶-3。
89.如权利要求88所述的生物轭合物,其中所述能被所述靶酶剪切的部分是多肽序列:DEVD(SEQ ID NO:9)。
90.如权利要求89所述的生物轭合物,其中所述生物轭合物具有如以下通式所示的结构:
D-E-V-D-花菁(SEQ ID NO:8)
其中“花菁”代表花菁染料半族,且所述花菁染料半族轭合到所述连接物的C-末端天冬氨酸残基的α-羧酸基团。
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