CN1829795A

CN1829795A - 预防和治疗细菌以及真菌病理学的核苷酸

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Publication number: CN1829795A
Application number: CNA2004800218684A
Authority: CN
Inventors: 陈寅; 谭新星
Original assignee: CytoGenix Inc
Current assignee: CytoGenix Inc
Priority date: 2003-06-03
Filing date: 2004-06-03
Publication date: 2006-09-06
Also published as: US20040248101A1

Abstract

一种可选择性诱导、单链DNA(ssDNA)表达文库，一种构建ssDNA表达文库的方法，一种使用表达文库筛选ssDNA的方法，和一种用于鉴定改变细菌和真菌基因的表达的ssDNA分子，所述基因涉及细胞生长和毒素产生及分泌。所述筛选文库用于特别是鉴定有效阻止细胞生长、杀死细菌或真菌，或阻止细菌和/或真菌免于合成和分泌它们的毒素的ODNs，和/或发现有效用于在真核(例如哺乳动物)细胞中靶基因功能改变的ODNs。所述文库还有效用于鉴定用作治疗剂的ssDNAs或ODNs，从而例如提供治疗细菌感染诸如脓毒症的方法。

Description

预防和治疗细菌以及真菌病理学的核苷酸

重度脓毒症和脓毒性休克是威胁生命的感染并发症和重症监护室(intensive care units)中的常见死因(Angus，et al.，2001，Crit.Care Med.，29：1303-1310)。最近的调查估计重度脓毒症占医院或重症监护室所有入住的2-11％(Martin，et al.，2003，New Engl.J.Med.，348，1546-1554)，并且由于人口的老化和免疫受损的以及危急疾病(critically ill)患者的数量增加，发病率正在增加。脓毒症包括由细菌和/或真菌病原体导致的感染造成的复杂临床综合征(Cohen，2002，Nature，420，885-891)。通常，免疫级联确保针对微生物攻击的保护性应答。然而，有缺陷的防御机制可通过内源炎性化合物的不良适应释放使感染形成或损害宿主。炎症和凝结(coagulation)的级联刺激了脓毒症的进展，导致了缺氧、局部缺血、器官功能异常和最终大量患者的死亡。另外，由于由水肿介质或循环的缺乏提供的生长潜能，遭受淋巴水肿的糖尿病个体或其它人有风险遭受条件性病原体。这些感染可导致重度蜂窝组织炎或导致脓毒症的相关后遗症。

革兰氏阴性细菌(主要是大肠杆菌(Escherichia coli)，克雷伯氏属菌株(Klebsiella spp.)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))和革兰氏阳性球菌(主要是葡萄球菌(Staphylococci)和链球菌(Streptococci))是分离自患有重度脓毒症和脓毒性休克患者的常见微生物病原体(Bochud，2001，Intensive Care Med.，27(Suppll)：S33-S48)。真菌，大多数是假丝酵母(Candida)，占重度脓毒症所有的病例的约5％，但是真菌感染的发病率正在增加。

革兰氏阴性感染发生在肺、腹部、血流或尿道中。以脂多糖(LPS)形式存在的内毒素是革兰氏阴性细菌外膜的重要成分并在诱导革兰氏阴性脓毒症中具有关键作用(Alexander，et al.，2001，J.Endotoxin Res.，7：167-202)。革兰氏阳性细菌通常引起皮肤、软组织和血管内装置的感染以及原发血流和呼吸感染。通常认为革兰氏阳性细菌和真菌的独特细胞壁物质引发与革兰氏阴性细菌相似的级联事件，尽管涉及的结构通常没有象革兰氏阴性内毒素一样得到充分研究。革兰氏阳性细菌可以通过至少两种机制导致脓毒症：通过产生作为超抗原的外毒素和通过它们细胞壁的成分刺激免疫细胞(Calandra，2001，J.Chemother.，13：173-180)。可能通过经过与在革兰氏阴性脓毒症中的那些相似的机制刺激的先天免疫应答，没有外毒素的革兰氏阳性细菌还可诱导休克。

已经试验了许多附加的对于重度脓毒症和脓毒性休克的治疗方法(除了抗生素和辅助疗法(supportive care))，包括微生物毒素和原-炎症细胞因子的中和，非特异性抗炎药和免疫抑制药，以及修正凝结中的异常。这些结果已经被组合起来(Vincent et al.，2002，Clin.Infect.Dis.，34：1084-1093)，并且似乎没有任何一种治疗解决了所有的脓毒症疾病和/或病原体。

尽管存在理论和实验动物证据支持将大剂量皮质类固醇应用在重度脓毒症和脓毒性休克中，所有的随机人研究发现皮质类固醇没有预防脓毒性休克，逆转休克状态，或改善死亡率。Lefering，et al.，1995，Crit.CareMed.，23，1294-1303；Cronin，1995，Crit.Care Med.，23，1430-1439。在患有脓毒症和微血管血栓形成的患者中常见凝结异常。用活化的蛋白质C进行的处理减少了重度脓毒症的死亡率(Bernard，et al.，2001，N.Engl.J.Med.，344：699-709)。迄今为止已知的是，它是目前市场上治疗脓毒症的唯一药物。然而，用该药物进行的治疗以出血事件(Id.)的轻微增加为代价，使患者死亡率得到适度的改善。

因此，抗生素的预防性施用是在医院中对于脓毒症治疗方法的选择(Cunha，1995，Med.Clin.North Am.，79，551-558)。抗生素必须是广谱的并且覆盖革兰氏阳性、革兰氏阴性和厌氧细菌，因为这些微生物的所有类别都产生同样的临床表现。抗生素必须以足够获得杀细菌血清水平的剂量进行肠胃外施用，因为临床改善与血清杀菌水平的获得而不是与施用的抗生素的数量相关。

不幸的是，因为由细菌诸如金黄色葡萄球菌(S.aureus)，肺炎链球菌(S.pneumoniae)和粪肠球菌(E.faecalis)引起的抗生素抗性，许多种类的抗生素的有效性减少(Nicolaou，et al.，2001，Scientific American，p.56-61)。甲氧西林-耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)，青霉素-抗性肺炎链球菌和万古霉素抗性粪肠球菌(VRE)现在难于有效治疗(Pfaller，et al.，1998，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，42：1762-1770；Jones，et al.，1999，Microbiol.Infect.Dis.，33：101-112)。还令人惊讶的是多种药物抗性病原体的出现(Swartz，1994，Proc Natl.Acad.Sci.USA，91：2420-2427；Baquero，1997，J.Antimicrobial Chemotherapy，39：1-6)。针对抗真菌药的真菌病原体也已经在文献中有所报道并且它们的频率将可能增加(Rex，1997，Clin.Infect.Dis.，24：235-247)。

涉及脓毒症的药物抗性细菌和真菌病原体的发展举例说明了对于治疗脓毒症的新方法的需要。在更广的范围上，药物抗性病原体的出现举例说明了对于治疗任何病理疾病的新方法的需要，在所述病理疾病中涉及细菌或真菌试剂。曾经用抗生素容易进行治疗的感染性疾病诸如肺结核、脑膜炎和肺炎不再这样容易处理。

因此，出于治疗的目的，本发明利用寡核苷酸介导的干涉(OMI)技术来改变涉及这些病理疾病的基因的活性。在选定的细胞中产生任何序列和长度的单链DNA(ssDNA)的能力能使用三链结构寡核苷酸(TFOs)在基因组水平使基因表达靶目标改变，使用反义和DNA酶寡核苷酸在信使RNA(mRNA)水平上使基因表达靶目标改变，并且使用ssDNA作为适体在蛋白质水平上使基因表达靶目标改变(Chen，2002，Expert Opin.Biol.Ther.2(7)735-740)。反义、DNA酶、三链体和适体技术提供对于更困难的方法诸如在细胞和生物中产生基因敲除的有效备选方法。反义寡核苷酸(ODNs)通过在ODN和其靶mRNA之间的Watson-Crick碱基配对，阻断基因表达(Crooke，1999，Biochim.Biophys.Acta 1489：31-44)。反义ODNs已经用于在真核细胞中有效抑制基因表达并且在市场上存在一个反义的基于ODN的产物并且在临床实验中存在其它的(Uhlman，2001，Expert Opinion Biol.Ther.，1：319-328)。然而，反义技术没有广泛用于原核系统。原核细胞本身形成了内源的基因调节的反义机制(Simons，et al.，1988，Ann.Rev.Genet.，22，567-600)。早期结果指出细菌中的基因表达可通过修饰的ODNs而容易得以抑制(Jayayaraman，et al.，1981，PNAS，78：1537-1541；Gasparro，et al.，1991，Antisense Res Dev.，1：117-140)。其它人报道肽核酸(PNA)可抑制细菌中的基因表达(Good，et al.，1998，Nature Biotechnology，16：355-358)。PNA是一种DNA模拟物，其与互补DNA、RNA或PNA寡聚体通过Watson-Crick碱基配对和螺旋形成而杂交，在所述PNA中，核苷酸碱基附着于假肽主链。

在任何OMI策略的功效中的一个重要因素是靶位点的可接近性。碱基组成可影响异源双链体的形成，但是其似乎不是主要主要因素。目前存在互补ODNs的结合是通过RNA分子的二级和三级结构来进行确定的证据(Frauendorf，et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1996，4：1019-1024)。已经发展了鉴定靶mRNA的可接近位点的各种方法，所述可接近位点与反义和/或DNA酶设计有关。通常地，使用线型鸟枪法，其中合成了一些靶mRNA的各种区域的ODNs并测量了它们的反义、DNA酶促或其它活性(或与靶位点的结合亲和性)。然而，通常发现仅2-5％的ODNs是良好的反义试剂。还已知应用计算机程序来选择靶目标。例如，使用RNA折叠程序诸如MFOLD来预期靶RNA的二级结构(M.Zuker，1989，Science，244，48-32)并且对反义ODNs进行设计以结合被预期没有分子内碱基配对的区域。然而，基于能量预期RNA结构的方法对于设计反义试剂是非常不充分的并且使用该方法的成功被限制。

核糖核酸酶H(RNase H)涉及反义-介导的作用的证据已经导致了鉴定可接近的mRNA的结合位点的方法的发展。在一个方法中，将RNase H与ODN库一起使用以鉴定在mRNA中的可接近位点，所述ODN库包括所有可能的限定长度的ODNs。例如，对于长度N，存在包括设定的ODN库的N4种不同可能的ODNs从而对于40-mer ODN存在约2.56×10⁶分子。库ODNs与靶RNA上的可接近位点互补产生与RNA的杂交，其通过凝胶电泳被鉴定为RNase H裂解位点，并且对库设定成员进行测试以显示哪一个对特异性靶mRNA产生下调作用。原核细胞中受控的表达系统诸如四环素调节系统容许选择性基因的下调或上调，由此提供基因产物上的信息。

锤头状核酶和发夹型核酶是催化RNA分子，其结合并裂解限定的RNA靶目标，所述RNA靶目标已被用于击倒(knock down)病毒和细胞靶目标的基因表达(见James，et al.，Blood，91：371-382，1998)。使用锤头状核酶文库，已经开发了一种用于反义-介导的基因抑制的鉴定在ICP4mRNAs上的可接近位点的方法，所述锤头状核酶文库容许文库成分在哺乳动物细胞中进行表达(Pierce，et al.，1998，Nucleic Acid Research，26：5093-5101)。尽管锤头状核酶有效裂解特异性mRNA靶目标，由于RNase的体内降解所导致的不稳定性，它们的临床应用是有限的。核酶文库还可用于鉴定涉及产生特定表型的基因。来自Immusol，Inc.的研究者构建了发夹型核酶文库，其被质粒或反转录病毒载体传递到哺乳动物细胞中(Welch，et al.，Genomics，66，274-283，2000，Li，et al.，Nucleic AcidResearch，28：2605-2612，2000，Kruger，et al.，PNAS，97：8566-8571，2000，Beger，et al.，PNAS，98：130-135，2001)。通过击倒基因表达，它们能够鉴定新基因或已知基因的新功能。然而，与锤头状核酶相似，发夹型核酶限制了体内的稳定性。

Ji等通过剪切基因组DNA构建了200-800bp的葡萄球菌DNA片段的文库(Ji，et al.，2001，Science，293：2266-2269)。通过将文库转化到金黄色葡萄球菌中，产生了随机的反义RNA分子。使用这种方法，鉴定了能充当抗生素发现靶目标的基因。Forsyth等在金黄色葡萄球菌中使用了相似的方法(Forsyth，et al.，2002，Molecular Microbiology，43：1387-1400)。然而，这种方法仅用于鉴定必需的基因，因为大小在200-800bp之间的反义RNA对于治疗目的是没有用的，原因在于1)RNA分子的不稳定性；2)合成200-800bp大小的RNA分子的困难；和3)传递RNA到合适细胞中的问题。

因此，存在对于发现和开发针对细菌和真菌病原体的新治疗方法的迫切需求。最近在DNA测序技术上的进展已经使阐明病原细菌的整个基因组序列成为可能。基因组测序揭示了细菌中涉及抗生素的潜在靶目标的所有信息并因此提供了更合理的基于靶目标的方法以开发新的治疗剂。因此，本发明的一个目标是使用筛选文库来鉴定ODNs用于抑制细菌和/或真菌的生长，杀死细菌和/或真菌或预防细菌和/或真菌合成和分泌毒素。使用筛选文库来发现在真核生物(例如哺乳动物)细胞中对于基因功能的靶目标改变是有效的ODNs是合理应用。

因此，本发明的一个目标是提供鉴定ssDNA的方法，所述ssDNA诸如三链体形成寡聚物(TFOs)、反义寡聚物、DNA酶，或适体，其有效作为治疗用抗细菌和/或抗真菌剂。

本发明的另一个目标是提供鉴定细菌和/或真菌基因的方法，所述细菌和/或真菌基因可充当抗细菌和/或抗真菌剂的发现的靶目标。

本发明的另一个目标是提供用于治疗细菌和真菌感染的方法和ODNs。

本发明的另一个目标是提供一种方法，所述方法通过使用可选择性诱导的表达载体诸如四环素系统来以受控的方式在真核细胞中调节基因表达。

本发明的另一个目标是鉴定对于细菌和真菌的生活力是必需的基因以及与指示脓毒症的超常(exaggerate)先天免疫应答相关的宿主基因。

本发明的另一个目标是提供ODNs和它们的序列，它们击倒(沉默)细菌、真菌和宿主基因。

本发明的另一个目标是提供作为治疗用抗细菌和抗真菌剂的ODNs和它们的序列。

本发明的另一个目标是提供将治疗用ODNs传递到靶细菌或真菌细胞中的方式。

本发明的另一个目标是提供用于击倒细菌、真菌和宿主基因的质粒构建体。

本发明的另一个目标是提供用作治疗用抗细菌和抗真菌剂的质粒构建体。

本发明的另一个目标是提供在动物患者中用于细菌和/或真菌感染诸如脓毒症的治疗方法，所述治疗方法包括使细菌或真菌病原体与ODN接触的步骤以改变特异性基因的表达从而抑制病原体的生长、杀死病原体，或抑制病原体引起的毒素的合成或分泌，所述ODN包括靶病原体的特异性基因的序列。

这些目标和许多其它目标通过提供可选择性诱导单链DNA(ssDNA)表达文库，构建ssDNA表达文库的方法，用于筛选ssDNA表达文库的方法，和鉴定ssDNA分子的方法来得以实现，所述ssDNA分子打开或关闭与细胞生长、复制和/或毒素产生和分泌有关的细菌基因。所述方法包括这样的方法，其构建一组随机排序、固定长度的寡脱氧核苷酸(ODN)链并将这些ODNs亚克隆到如此组成的表达载体中从而使得当被转化到随后与某种化学环境接触的细胞中时，所述细胞通过表达被插入表达载体中的个体ODN序列来起作用。包含个体ODN的指令(instructions)的细胞生长成为集落并且将每个集落分成对照和实验组。当实验集落与诱导ODN产生的化学品接触时，所述ODN被表达并且推定地改变细胞基因功能，例如蛋白质产生，产生了不同的细胞表型。如果表型表达表现了理想的最终结果，处理对照集落以抽提DNA从而确定所述ODN的精确核苷酸序列，所述ODN产生被讨论的表型。

将该方法用于鉴定ODNs，所述ODNs抑制细菌和/或真菌的生长，杀死它们或抑制细菌和/或真菌导致的毒素的分泌的合成，由此使鉴定针对病原细菌和/或真菌的新治疗剂以及鉴定细菌和/或真菌的必需基因成为可能，所述必需基因可充当新治疗剂的发现的另外的靶目标。将相同的方法和筛选文库用于鉴定ssDNA分子，其打开和/或关闭与细胞生长、复制和/或毒素产生及分泌有关的细菌和真菌的基因。

本发明包括治疗细菌或真菌诱导的疾病诸如脓毒症的方法，其通过在细菌或真菌细胞中体内产生ODNs从而当所述ODNs达到并击倒它们的靶基因由此杀死细菌或真菌细胞或抑制它们的生长时，细菌或真菌在血流中的累积保持恒定或减少并且脓毒症的症状被减少或消除来进行。

在另一个方面，本发明提供一种新的具有催化序列的ssDNA酶，所述催化序列两侧为有效杀死细菌或真菌细胞的靶序列，在所述细胞中所述靶序列被引入和/或所述靶序列被体内合成。

本发明还包括一种治疗脓毒症的方法，其中ODNs在体内在宿主细胞中产生从而当ODNs使它们的靶基因沉默时，宿主超常先天免疫应答被取消并且脓毒症症状被减轻。

本发明还包括一种治疗脓毒症的方法，其通过体内将ODN-表达质粒构建体传递到宿主细胞中从而当ODNs在细胞内产生并击倒它们的靶基因时，所述宿主超常先天免疫应答被取消并且脓毒症症状被减少来进行。

在另一个方面中，本发明还包括一种用于治疗细菌或真菌病理疾病的试剂盒，所述试剂盒包括靶向在微生物病原体诸如细菌或真菌中的基因的寡核苷酸和药用赋形剂，所述寡核苷酸起作用以下调或改变基因的表达以杀死细菌或真菌细胞或抑制它们的生长，或减少细菌或真菌细胞导致的毒素的合成或分泌。

现在参考附图，图1是按照本发明构建的质粒pssXG的示意图，并且该质粒显示在此情形中，以双链DNA环的形式存在的生化说明(biochemical instructions)的内容和构造，所述双链DNA被引入靶细菌细胞中从而使靶细胞产生如下文所述的确定的理想的核酸。

图2显示被修饰的图1的质粒pssXG从而在靶细胞中产生FtsZ基因靶向的DNA酶，并将其称为pssXGb(FtsZ-DZ)。

图2显示的质粒pssXGb(FtsZ-DZ)的关键成分是逆转录酶，并且图3显示对于在大肠杆菌中由四环素诱导的HIS-标记的逆转录酶(RT)的表达的蛋白质印迹分析的结果。在存在0，100，或200ng/ml的aTc时，将携带pssXGb(FtsZ-DZ)载体的细菌细胞培养在37℃达1小时(泳道1-3)，2小时(泳道4-6)，或3小时(泳道7-9)。将细胞裂解物用于测定并将RT带用箭头标记，证实了RT酶的活性。

图4显示为证实在图2所示pssXGb(FtsZ-DZ)质粒中的逆转录酶(RT)的表达和活性，而进行的第二次测定的结果。在该测定中，大肠杆菌中HIS-标记的RT的产生由四环素诱导。将携带载体的细菌细胞培养在37℃直到OD280值达到0.5，并且接着将200ng/ml的aTc，一种四环素的衍生物加入细胞中，再培养1-2小时。将细胞裂解物用于按照Silver等(1993，Nucleic Acids Res.21：3593-3594)进行的测定。泳道1：没有四环素诱导；泳道2：1小时aTc诱导；泳道3：2小时aTc诱导。用箭头标记PCR扩增产物。

图5A显示由FtsZ基因产生的mRNA的预期结构(Tetart，et al.，1992，Mol.Microbiol.6：615-620)。箭头指出其中核酸不匹配的环，由此产生得到结合mRNA的单链核酸序列的机会。如下面提及，探索将箭头指出的位置880上的GU位点用于设计FtsZ mRNA-裂解DNA酶。图5B分别显示该FtsZ mRNA-裂解DNA酶(3′到5′序列)及其靶序列，或底物(5′到3′序列)的设计的图。

图6显示FtsZ RNA的体外裂解的结果并证明本发明的DNA酶功能是消化靶mRNA。泳道1是在DNA酶缺乏时，培养2小时的对照反应。S：底物；P1(857nt)和P2(368nt)：DNA酶消化产物。

图7显示出于证明DNA酶介导的对ftsZ基因表达的抑制的目的，被诱导时，使用特异于FtsZ蛋白质的抗体检测细胞中的该蛋白进行的测定的结果，在所述细胞中pssXG和pssXGb(FtsZ)质粒已经被引入：A.携带pssXGb(FtsZ-DZ)载体的细菌细胞；B.携带对照pssXGa载体的细菌细胞。如下面提及，使用可诱导的系统以促进筛选。

图8A显示通过体内表达本发明的FtsZ mRNA-裂解DNA酶来抑制细胞增生。

图8B显示携带pssXGb(FtsZ-DZ)的细菌细胞的形态：A携带pssXGb(FtsZ-DZ)的细菌细胞，没有aTc；B.携带pssXGb(FtsZ-DZ)的细菌细胞，含有800ng/ml的aTc；C.携带载体pssXGa的细菌细胞，不含aTc；和D.携带pssXGa的细菌细胞，含有800ng/ml。长丝状细胞(B)指示不能分裂的细胞。

图9显示文库筛选的结果。含有或不含aTc时，将集落重复培养在LB平板中。将阳性克隆(包含含有CYGX080103序列的pssXGb载体)用箭头标记。

图10显示再次证实来自文库筛选的阳性克隆(CYGX080103，图9)的抑制作用。将作为阴性对照的CYGX080103质粒和不含ODN插入物的质粒转化到DH5αPro中，并接种在含或不含200ng/ml aTc的LB培养基上。图10A显示携带CYGX080103质粒的DH5αPro正常生长在不含aTc的培养基上，但是在含aTc的培养基上则不然。携带不具有ODN插入物的质粒的DH5αPro生长在两种培养基上(图10B)。

图11显示ODN(CYGX080103)表达载体转化到大肠杆菌X110-gold(kan)细胞中的结果。将转化子接种在含有氯霉素的LB培养基中并培养在37℃O/N。在所述LB培养基上，没有携带CYGX080103表达质粒的XL10-gold(kan)细胞生长，但是携带不含ODN插入物的质粒的XL10-gold(kan)细胞正常生长。

图12显示用或不用ODN处理的被感染的小鼠的存活。将细菌的对数期制备物稀释在PBS中，并将3×10⁸CFU的细菌i.p.注射以诱导小鼠脓毒症。为了处理小鼠，将ODN在体外与细菌混和并接着注射或在感染前用ODN预处理小鼠。注射后在不同的时间点收集血清，测试促炎细胞因子(IL-6、TNF、IL-1)和细菌接种量并监测小鼠的行为。

图13显示小鼠促炎细胞因子IL-6在细菌感染后4和24小时的变化；使用商业试剂盒测量IL-6浓度。

图14显示ODN对细菌生长的抑制。紧接着以1/50稀释O/N培养物后，将ODN加入到终浓度为4μM，40μM或400μM，将等体积的水作为阴性对照，并于30℃进行摇合培养。在2，4，或6小时后，通过活细胞计数来测量生长，所述活细胞计数通过稀释培养物并接种在具有链霉素的LB平板上进行。

图15显示在感受态XL10-gold(kan)细胞中的细菌生长抑制，用ODN表达质粒AS830103或不含ODN插入物的质粒转化所述细胞，并将所述细胞接种在含有氯霉素的LB培养基上并在37℃O/N进行培养。

图16显示肽-PNA缀合物对细菌生长的剂量依赖型抑制。如所示，所述缀合物抑制K-12细胞生长82-99.8％。

通过参照下面其一些实施方案的描述来更好地理解本发明的方法和构建体。

构建可四环素诱导的原核ssDNA表达载体

使用国际申请号PCT/US00/27381所述的真核质粒pssXE作为模板来进行PCR纯化，将其全文特此并入本说明书作为具体参考。

使用在PCR反应中的DNA引物，5′NheI PvuI ATG

5′-CTAGCTAGCTAGCGATCGATGGGACCAATGGGGCAG-3′[Seq.ID No.1]

和3′KpnI

5′-CGGGGTACCAGTATTCCCTGGTC-3′[Seq.ID No.2]

通过整合DNA技术(Integrated DNA Technologies(Coralville，IA))进行合成。用NheI和KpnI双重消化PCR扩增的DNA片段，然后将其亚克隆到用相同的酶双重消化的pssXE载体中。所述取代去除了翻译起始位点(ATG)前的序列，所述序列对于原核基因表达是不必要的，而产生了新的限制性酶切位点，PvuI。用PvuI和XbaI消化新产生的构建体。所述PvuI-Xbal片段包含ssDNA产生的所有的必需元件，包括：1)编码截短的但具有完整活性的RT的小鼠Moloney白血病病毒逆转录酶(MoMuLV RT)基因(Tanase，et al.，PNAS，2000，85：1777-1781)；2)和启动子的某些侧翼区一起的引物结合位点(PBS)，所述区域是通过MoMuLV RT的逆转录起始所必需的(Shinnick，et al.，Nature，1981，293：543-548)；和3)被设计用于终止逆转录反应的茎-环结构，所有的都如上面结合的国际申请号PCT/US00/27381所述。将该DNA片段亚克隆到pPROTet.E 233载体(BDBioscience，Palo Alto，CA)中，并将新产生的构建体称为pssXGa，如图1所示。然而，细菌tRNAPro的序列不同于哺乳动物的tRNAPro的序列，其被进行设计以在哺乳动物细胞中结合PBS。因为可将细菌tRNAVal用作RT的引物，设计一种新的PBS来取代用在载体pssXE中的PBS，其用于哺乳动物细胞。新PBS的序列是

5′-TGGTGCGTCCGAG-3′ [Seq.ID No.3]。

为了构建表达所需的DNA酶的载体并取代pssXE(CMV)中的表达盒的起始引物结合位点(PBS)，对序列

5′-dTAACTGGATGATCGTTGTAGCTAGCCTTCGAAACTTGGTGGT-GCGTCCGAGTGGACCGGGAGACCCCTGCTCGAGT-3′[Seq.ID No.4]

和

5′-CTAGACTCGAGCAGGGGTCTCCCGGTCCACTCGGACGCACCACCAA-GTTTCGAAGGCTAGCTACAACGATCATCCAGTTAAT-3′[Seq.ID No.5]的ODNs进行退火以产生具有5′PacI和3′XbaI粘性末端的合成双链体并连接到pssXGa的PacI和XbaI的位点。将得到的载体称为pssXGb(FtsZ-DZ)并显示于图2中。

pPROTet.E233是表达具有6xHN的融合蛋白的可四环素诱导的细菌表达载体。其利用P_Ltet01启动子，所述启动子被高度特异性的Tet阻抑物蛋白所紧密抑制并响应于脱水四环素(anhydrotetracycline)(aTc)被诱导，使诱导的控制在广泛的范围内(脱水四环素是作为PROTet.E系统的有效抑制物的四环素的衍生物)。当存在34μg/ml的氯霉素(Cm)和50μg/ml的大观霉素(spec)时，将pssXG载体转化到细菌菌株DH5αPro(BD Bioscience，Palo Alto，CA)中。将大观霉素用于选择DH5αPro细胞，所述细胞携带编码TetR的转录单位(Lutz，et al.，Nucleic Acids Res.，1997，25：1203-1210)。所述DH5αPro细胞表达限定量的Tet阻遏物。按照生产商的说明书使用B-PER II细菌蛋白抽提试剂(Pierce，Rockford，IL)制备细胞裂解物。使用细胞裂解物，逆转录酶(RT)的表达通过如图3所示的按照Silver等(NucleicAcids Res.，1993，21：3593-3594)使用细胞裂解物进行RT活性测定和如图4所示的使用针对6xHN(BD Bioscience，Palo Alto，CA)的抗体进行蛋白质印迹得以证实。

通过靶向FtsZ的DNA酶来抑制细菌生长

细胞分裂对于细菌的存活是关键的；细菌诸如大肠杆菌(E.coli)通常通过二分裂进行分裂，产生两个相等大小的子代细胞，每个包含髓核。FtsZ是细菌分裂和生活力的必需基因。分裂以FtsZ定位到母细胞中心并形成隔膜结构，Z环开始，然后其它的必需的细胞分裂蛋白被募集到Z环。FtsZ基因的缺失和突变在早期阶段阻断细胞分裂并因此给针对广泛范围的细菌病原体的新治疗剂提供了机会靶目标。

因为在嘌呤/嘧啶连接处它们结合和裂解任何靶RNA的能力，DNA酶能如上面结合的国际申请号PCT/US00/27381所述干扰基因表达。基于FtsZ mRNA的预期二级结构，对DNA酶(DNAzymes)进行设计以在该mRNA上靶向各种位点，所述位点例如，包括在位置50-66，530-547，612-629，648-662，871-887，958-972，和1032-1048的环。具体地，10-23DNA酶裂解位点在大多数生物底物中是充分的并因此提供获得最大裂解效率的机会，对靶向在位置880的GU位点的10-23DNA酶进行设计，使其具有如下的31nt序列：

5′-GTTTCGAAGGCTAGCTACAACGATCATCCAG-3′[Seq.ID No.6]，所述31nt序列具有21.3kcal/mol的预期自由能(图5)。从图5清楚的是，该31nt酶由15个核苷酸的催化结构域组成，所述结构域两侧是8个核苷酸的随机靶结合结构域，但是从本说明书获益的本领域技术人员将意识到靶结合结构域可以在大小上从少到3个核苷酸变化到多到25个或更多的核苷酸。在一个优选的实施方案中，靶结合结构域由7-10个核苷酸组成，从而使所述酶采取

5′-N₁-GGCTAGCTACAACGA-N₂-3′[Seq.ID No.7]的形式，其中N₁和N₂代表靶向特异RNA的核苷酸的任何序列，其大小范围在3-25个核苷酸之间，并优选7-10个核苷酸。

通过在无细胞系统中评价被设计的DNA酶的裂解活性来测试本发明的pssXGb(FtsZ-DZ)表达载体在细菌细胞中产生DNA酶分子的能力。将通过体外转录产生的1225nt FtsZ RNA用作底物并如10μl反应所指示在37℃进行各个时间阶段的裂解测定，所述反应包含10mM MgCl2，50mMTris-HCl，pH7.5，100nM模板FtsZ RNA，100μM DNA酶，和10单位RNasin。如图6所示，合成DNA酶可以在短到0.5小时的时间内有效裂解FtsZ RNA，产生具有预期大小的产物(368nt和857nt)。

可以对其它的DNA酶进行设计以靶向除上面列出的位置880之外的FtsZ mRNA的环。例如，设计具有如下序列的靶向位置1032-1038的环的DNA酶：

5′-CCTGCTTAGGCTAGCTACAACGATGGTCACC-3′[Seq.ID No.8]。

如果被设计的DNA酶已经显示能够体外裂解FtsZ RNA(图6)，并且aTc调节的表达载体可以产生活性RT(图3和4)，将表达载体用于在细胞中产生DNA酶，然后确定DNA酶对FtsZ基因表达的影响。如图7所示，携带pssXGb(FtsZ-DZ)载体(A)的细菌细胞以及携带pssXGa载体(B)的阴性对照细胞可以在不同量的aTc(0，200，400，800ng/ml)存在时生长3小时。与在缺乏aTc时培养的细胞相比，携带pssXGb(FtsZ-DZ)细菌细胞的FtsZ表达水平在添加aTc后显著减少(图7A)。在对照细胞中没有观察到这种减少(图7B)。

因为FtsZ基因对于细菌分裂和生活力是必需的，并且图7说明细胞内产生的DNA酶明显抑制FtsZ表达，因此研究了被表达的DNA对细菌细胞增生的影响。在不同量的aTc(0，200，400，800ng/ml)存在时，将携带pssXGb(FtsZ-DZ)载体的细菌细胞培养1或2小时并对活细胞进行计数。如图8A所示，细胞生长以时间和aTc-浓度依赖型方式被抑制。而且，作为细胞生长抑制的结果，观察到了长丝状细胞的形成(图8B)。

构建可四环素诱导的ssDNA或ODN表达文库

通过以1∶20∶20的摩尔比率对三个ODNs，CY(SacII)-40

CTCTCACTCC(N)40ACTGTTGAAAGGC [Seq.ID No.9]

CY(SacII)-L，

CGGAGAGTGAGG [Seq.ID No.10]

和CY(SacII)-R，

CTTTCAACAGT [Seq.ID No.11]

进行退火来构建文库插入物。“N”代表碱基A T，C，或G的任何一个。因此存在被随机合成的40-mer的序列，并将其表示为CY(SacII)-40ODNs。混和所述ODNs并在95℃进行变性3分钟，接着在约1小时内缓慢冷却到室温。由于CY(SacII)-L互补CY(SacII)-40的左臂，而CY(SacII)-R互补相同的ODN的右臂，通过退火过程形成部分双链ODNs。

退火的ODN形成部分双链DNA，并使用DNA聚合酶I，大(Klenow)片段(New England Biolabs，Beverly，MA)补平那些剩余的单链Ns和平端化。接着，将双链DNA亚克隆到原核ssDNA表达载体pssXGb中并通过电穿孔将其转化到DH5αPRO细胞中。

相似地，使用a.Dzlib1

5′-CTCGAGTCTAGANNNNNNNNGGCTAGCTACAACGANNNNNNN-NTTAATTAAGCTAGC-3′ [Seq.ID No.12]

(N可以是A或T，或C或G的任一)

和b.DZlib2

5′-GCTAGCTTAATTAA-3′ [Seq.ID No.13]

来构建DNA酶表达文库。将两个寡核苷酸以1∶20(a∶b)的摩尔比率混和并通过在75℃加热5分钟，接着缓慢冷却到室温来退火形成部分双链DNA。通过Klenow片段来补平部分双链DNA的3′凹端，并用PacI和XbaI来消化得到的双链DNA。接着对双消化的产物进行凝胶纯化。苯酚抽提和乙醇沉淀后，将PacI/XbaI消化的文库DNA克隆到pssXGb表达载体中。

ssDNA表达文库筛选

由于ssDNA表达文库是基于可四环素诱导的载体构建的，在存在或缺乏200ng/ml的aTc时，将包含ssDNA表达文库的细菌细胞两次重复接种在Luria broth(LB)平板中。如图9所示，将仅在aTc缺乏时生长的集落鉴定为阳性集落。从文库筛选的阳性集落中抽提质粒DNA，并通过3′末端单向测序确定插入物序列。将通过该组实验产生的插入物称为CYGX080103，其序列为5′-CTTTCAACAGTTTTGATGACCTTTGCTGACCATACAATTGC-GATATCGTGGGGAGTGAGAG-3′[Seq.ID No.14]。

然后使用GenBank BLASTN程序来分析所述序列以基于序列同源性来鉴定潜在的基因靶目标。按照本发明的包括在CYGX080103中的ODNs和可被击倒的它们的潜在基因包括，但不限于CYGX08010301

5′-CCTTTGCTGACCATAC-3′ [Seq.ID No.15]

及其靶目标btuE(GenBank ID：NP-416225.1)，CYGX08010302

5′-GACCTTTGCTGACCA-3′ [Seq.ID No.16]

及其靶目标CaiB(GenBank ID：NP-414580.1)，CYGX08010303

5′-ACAGTTTTGATGAC-3′ [Seq.ID No.17]

及其靶目标ydgD(GenBank ID：NP-418152.1)，CYGX08010304

5′-ACAATTGCGATAT-3′ [Seq.ID No.18]

及其靶目标ygcQ(GenBank ID：NP-417249.2)，CYGX08010305

5′-GACCTTTGCTGAC-3′ [Seq.ID No.19]

及其靶目标ftsH(GenBank ID：NP-417645.1)，CYGX08010306

5′-TCAACAGTTTTGATGAC-3′ [Seq.ID No.20]

及其靶目标ppiB(GenBank ID：NP-415058.1)，CYGX08010307

5′-ATGACCTTTGCTG-3′ [Seq.ID No.21]

及其靶目标yihl(GenBank ID：NP-418308.1)，CYGX08010308

5′-CAGTTTTGATGA-3′ [Seq.ID No.22]

及其靶目标zntA(GenBank ID：NP-417926.1)，CYGX08010309

5′-ACCTTTGCTGAC-3′ [Seq.ID No.23]

及其靶目标yicI(GenBank ID：NP-418116.1)，CYGX08010310

5′-TTGCTGACCATA-3′ [Seq.ID No.24]

及其靶目标fhuA(GenBank ID：NP-414692.1)，CYGX08010311

5′-TGACCTTTGCTG-3′ [Seq.ID No.25]

及其靶目标rplD(GenBank ID：NP-417778.1)，CYGX08010312

5′-GTTTTGATGACC-3′ [Seq.ID No.26]

及其靶目标ilvB(GenBank ID：NP-418127.1)，CYGX08010313

5′-GCGATATCGTGG-3′ [Seq.ID No.27]

及其靶目标lepB(GenBankID：NP-417063.1)，CYGX08010314

5′-TTGATGACCTTT-3′ [Seq.ID No.28]

及其靶目标aroK(GenBank ID：NP-417849.1)，CYGX08010315

5′-TGGGGAGTGAG-3′ [Seq.ID No.29]

及其靶目标mfd(GenBank ID：NP-415632.1)，CYGX08010316

5′-TTGCTGACCAT-3′ [Seq.ID No.30]

及其靶目标rlpA(GenBank ID：NP-415166.1)，CYGX08010317

5′-TTTTGATGACC-3′ [Seq.ID No.31]

及其靶目标accA(GenBank ID：NP-414727.1)，CYGX08010318

5′-TGATGACCTTT-3′ [Seq.ID No.32]

及其靶目标pgpA(GenBank ID：NP-414952.1)。

在两个单独的实验中，进一步评价ODN CYGX080103的抗菌功效。对第一个实验进行设计以检测ODN表达质粒在宿主细胞DH5αPro中的条件致死作用，所述DH5αPro是使用在文库筛选中的细菌菌株。设计第二个实验来研究ODN表达质粒对其它细菌菌株的影响。在第一个研究中，将ODN表达质粒和作为阴性对照的没有ODN插入物的质粒转化到DH5αPro中并接种在含或不含200ng/ml aTc的LB培养基中。如图10A所显示，携带ODN表达质粒的DH5αPro细胞在不含aTc的培养基上正常生长而在含aTc的培养基上不正常生长。携带不含ODN插入物的质粒的DH5αPro细胞在两种培养基上都生长(图10B)。在第二项研究中，将ODN表达质粒和不含ODN插入物的质粒转化到大肠杆菌XL10-gold(kan)中。将得到的转化子接种到具有氯霉素的LB培养基上，并在37℃O/N进行培养。如图11所显示，没有携带ODN表达质粒的XL10-gold(kan)生长在LB培养基中，而携带不含ODN插入物的质粒的XL10-gold(kan)正常生长。

小鼠脓毒症模型的形成

将大肠杆菌SM101，及其野生型K12如下面所述进行i.p.注射以诱导在小鼠中诱导脓毒症，所述SM101是失去所有的可检测的酰基转移酶活性的温度敏感型UDP-N-乙酰葡萄胺酰基转移酶突变子。SM101在脂质A生物合成中有缺陷，这导致了外膜对于高分子量物质是可通透的。与野生型相比，SM101的脂质A含量减少了2-3倍。为了制备用于小鼠感染的细菌，将SM101的对数期培养物于37℃培养在LB培养基中到600nm的光密度为1.1(相当于5×10⁸CFU/ml)，随后于4℃进行离心并重悬于无菌的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中。将细菌的该对数期制备物连续稀释于PBS中，并将3×10⁸CFU的细菌进行i.p.注射以诱导小鼠的脓毒症。在注射后的各个时间点，收集血清并测试促炎细胞因子(IL-6，TNF，IL-1)和细菌接种量，并监测小鼠行为。每24小时对小鼠进行放血。在6小时，小鼠显示感染的迹象(昏睡、对触摸兴奋(warm to the touch)、肮脏)。如图12所示，在感染后48小时内约60％小鼠死亡。如图13所示，5只小鼠中的3只显示血清IL-6浓度的明显减少。随后的表显示小鼠在注射后血液中的细菌负荷。

	小鼠采血的数量	CFU/ml
	小鼠采血的数量	CFU/ml	对照^*	6	0，0，3.6×10³，1.6×10³，4.6×10⁵，＞10⁵
PNA[10μM]	4	0，0，0，0	对照^*	6	0，0，3.6×10³，1.6×10³，4.6×10⁵，＞10⁵
PNA[10μM]	4	0，0，0，0	IP，PNA[100μM]	4	0，0，0，0

^*在46小时前死于感染的败血症小鼠

在注射后24小时收集血清样品，通过测量活细胞数量来进行细胞生长测定。通过稀释培养物并将其接种在LB平板上来进行活细胞计数。将平板在37℃培养过夜并通过视觉观察来计算集落的数量。

ODN对细菌生长的抑制

通过检测ODN剂量对SM101生长的影响来评价ODN对细菌生长的抑制。在该项研究中，将具有序列CTC ATA CTC T的ODN以40μM或400μM的终浓度，加入1/50稀释的O/N SM101细胞培养物中，以加入等体积的水作为阴性对照，并在30℃来进行振荡培养。在2，4，或6小时后，通过在600nm的光密度(OD600)或活细胞计数来测量生长，其是通过稀释培养物并将其以三次重复接种在具有链霉素的LB平板上进行。如在图14中所显示，在添加ODN后，细胞生长被抑制达86-96％。

ODN表达质粒对细菌生长的抑制

在该研究中，将具有上面列出的序列CYGX080103的ODN表达质粒As080103和作为阴性对照的不含ODN插入物的质粒pssxGb转化到大肠杆菌XL10-gold(kan)中。将得到的细胞培养物接种在具有氯霉素的LB培养基上并在37℃O/N进行培养。如图15所显示，携带ODN表达质粒的XL 10-gold(kan)不在LB培养基上生长。

在小鼠模型中建立致死剂量(LD70)

将6周龄的小鼠Balb/c(每组5只)用于感染实验。将SM101的连续稀释物以400μl的等分试样腹膜内(i.p.)接种到小鼠中。观察动物100小时。基于一些临床体征反应的进展性疾病状态，在5-0的等级上对被用细菌接种的小鼠进行关于它们的健康状况的评分。将正常的和寻常的状况评分为5；将限定为昏睡和毛皮发皱的轻微疾病评分为4；将限定为重度昏睡、毛皮发皱和背部隆起的中度疾病评分为3；将具有上述体征和在部分闭合的眼睛周围有渗出性累积物的重度疾病评分为2；将垂死状态评分为1；将死亡评分为0。尽管没有以双盲方式进行实验，所有的动物由两个或更多独立的观察者进行评价。这些实验说明10⁹CFU的菌株SM101对于6周龄的小鼠Balb/c是LD70，其中～60％的接受LD70剂量的小鼠在48小时内死亡。将该LD70用在下文所述的DNA治疗实验中。将相似的方法用于确定对于大肠杆菌菌株K-12的LD70。

使用ODN治疗脓毒症

使用上述的SM101细菌小鼠模型在两个实验中来评价ODN治疗的功效。第一个检测DNA剂量对ODN的救治小鼠免于SM101菌血症侵害的能力的影响。第二个研究对于各个阶段的延迟治疗的后果的影响。在剂量范围内的研究中，通过用LD70的SM101的i.p.注射来攻击5组(每组5只)的小鼠。在4nmol，40nmol，400nmol和0nmol的细菌攻击后，立即用ODN

CTC ATA CTC T [Seq.ID No.33]的单一注射对每组进行处理，i.p.施用。作为另外的对照，第5组(2只小鼠)没有用细菌进行攻击，仅接受了ODN(以最高剂量)的注射。对这些动物的健康状态进行了为期一周的监控。图12显示了用或不用ODN处理的被感染小鼠的存活。

通过噬菌体T3抽提物将质粒传递到靶细菌细胞

标准DNA包装反应混合物(25μl)在完全pac缓冲液中包含0.5mg质粒DNA，2×10¹⁰头部前体的噬菌体等价物(peg)，20pmol的gp18和3pmol的gp 19。将反应混合物在30℃温育30分钟以进行DNA包装并通过添加1μl的2mg/ml DNaseI来终止反应。在30℃温育20分钟后，通过与包含尾和尾丝蛋白的头部受体抽提物一起温育来将被填充的头部转化成感染的颗粒。如Nakasu等所述，通过用被噬菌体T3感染的细菌细胞的裂解物的蔗糖梯度离心来制备头部前体(1983，Virology，127，124-133)。如Hamada等(1986，Virology，151，110-118)所述对gp18和gp19蛋白进行纯化。从被噬菌体T3感染的细菌细胞的裂解物中分离头部受体抽提物并通过硫酸铵沉淀来进行纯化。所述得到的感染性颗粒包含传递到靶细菌细胞中的ODN表达质粒。

肽-ODN缀合物对细菌生长的抑制

通过检测缀合物的剂量对缀合物抑制K12生长的能力的影响，来评价肽-PNA缀合物对细菌生长的抑制。在该项研究中，将具有序列KFFKFFKFFK-CTC ATA CTC T [Seq.ID No.34]的肽-ODN缀合物加入1/50稀释的O/N K12细胞培养物，终浓度为4μM、40μM或400μM，将等体积的水的添加作为阴性对照，并在37℃进行振荡培养。紧接着将O/N培养物稀释1/50后，将肽-ODN缀合物添加到4μM、40μM或400μM的终浓度，将添加等体积的水作为阴性对照，并在37℃进行振荡培养。2小时后，通过稀释培养物和以三次重复接种到LB平板上进行活细胞计数来测量生长。如图16所示，在添加肽-ODN缀合物后，细胞生长被抑制达82-99.8％。

肽-ODN缀合物对小鼠的血液中细菌负荷的减少

通过检测缀合物减少在血液中小鼠的细菌负荷的能力来评价肽-ODN缀合物治疗的功效。在该项研究中，将K12的对数期制备物在PBS中进行稀释并通过3×10⁹CFU的野生型细菌K12的i.p.注射来感染6周龄的小鼠Balb/c。在细菌攻击后，用50nmol肽-ODN缀合物[Seq.ID No.34]的i.p.施用30分钟的单一注射来对被感染的小鼠进行处理。将所述缀合物在体外与细菌进行混和，接着注射到小鼠中，或在感染后30分钟，用缀合物预处理小鼠。在感染后24小时，收集血清样品，以通过测量活细胞计数来进行细胞生长测定。通过稀释培养物并将它们接种在LB平板上来进行活细胞计数。将结果显示于下表中：

	被放血的小鼠	CFU/ml
	被放血的小鼠	CFU/ml	对照	3	1.3×10⁶，1.4×10⁵，1.3×10⁵
PNA[10μM]	4	5.1×10⁴，9.4×10⁴，7.0×10⁵，1.5×10⁴	对照	3	1.3×10⁶，1.4×10⁵，1.3×10⁵
PNA[10μM]	4	5.1×10⁴，9.4×10⁴，7.0×10⁵，1.5×10⁴	IP，PNA[100μM]	4	2.1×10⁴，1.1×10⁵，6.8×10⁴，160

*****

本发明涉及对抗细菌和真菌病原体的新策略，其中选定的ODNs和用于产生它们的表达质粒被用作治疗剂。使用本发明的ODNs和表达质粒成功治疗的一种这样的病原疾病是脓毒症。可按照本发明进行治疗的导致脓毒症的微生物的实例包括，但不限于，导致肺、腹部、血流、皮肤、软组织的感染，与血管内装置有关感染，和呼吸感染的那些。可按照本发明治疗的其它病原微生物的实例包括，但不限于，革兰氏阴性细菌拟杆菌属(Bacteroides)，梭杆菌属(Fusobacterium)，埃希氏菌属(Escherichia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，沙门氏菌属(Salmonella)，志贺氏菌属(Shigella)，变形菌属(Proteus)，假单胞菌属(Pseudomonas)，弧菌属(Vibrio)，军团菌属(Legionella)，嗜血菌属(Haemophilus)，博德特氏菌属(Bordetella)，布鲁氏菌属(Brucella)，弯曲杆菌属(Campylobacter)，奈瑟氏球菌属(Neisseria)，布兰汉氏球菌属(Branhamella)，革兰氏阳性细菌诸如链球菌属(Streptococcus)，葡萄球菌属(Staphylococcus)，消化球菌属(Peptococcus)，芽孢杆菌属(Bacillus)，利斯特氏菌属(Listeria)，梭菌属(Clostridium)，Propionebacteria；革兰氏染色微弱或根本不具有革兰氏染色的生物诸如分枝杆菌属(Mycobacteria)，密螺旋体属(Treponema)，钩端螺旋体属(Leptospira)，疏螺旋体属(Borrelia)，枝原体属(Mycoplasma)，Clamydia，立克次氏体属(Rickettsia)和考克斯氏体属(Coxiella)；或真菌念珠菌属(Candida)，Aspergillosis，Blastomycosis，Coccidioidomycosis，Cryptococcosis，Histoplasmosis，Paracoccidiomycosis，Sporotrichosis，Zygomycosis。

可以按照本发明被击倒的细菌靶基因的实例包括，但不限于，从文库筛选中鉴定的那些和基于细菌生理学知识选择的那些。可从那些涉及主要过程复合体(complex)之一的那些中发现靶基因，所述主要过程复合体为：细胞分裂、细胞壁合成、蛋白质合成(翻译)、核酸合成、脂肪酸代谢、和基因调节。因此，可以按照本发明被击倒的细菌靶基因的实例包括，但不限于上述FtsZ基因，MurB，acpP，16srRNA，PBPs，DNAA，DNAC，pcrA，rpoB，rpoA，rpoC，rpsC，rpsD，rpsF，rpsI，rpsJ，rpsM，rpsR，FabK，FabH，rplB，rplC，rplJ，rpIK，rplM，rplN，rplO，rplP，rPlR，rplT，rplV，rplX，rpmA，rpmL，valS，serS，proS，cysS，alaS，pheS，sporC，tsf，tufA，fus，secA，secV，pyrC。

可从那些涉及主要过程复合体之一的那些中发现对于真菌的生活力是关键的靶基因，所述主要过程复合体为：细胞分裂、细胞壁合成、蛋白质合成(翻译)、核酸合成、脂肪酸代谢、和基因调节。因此，可按照本发明被击倒的真菌靶基因的实例包括，但不限于，ERG1，ERG2，ERG3，ERG4，ERG5，ERG6，ERG7，ERG11，ERG24，ERG25，ERGX，ERGY，CHS1，CHS2，CHS3，CWP1，CWP2，KRE1，KRE2，KRE5，KRE11，TIP1，GFA1。

ODN技术可下调与脓毒症中超常先天免疫应答有关的宿主基因的过度表达，从而保留针对感染的合适的宿主的应答。可按照本发明被击倒的宿主靶基因的实例包括，但不限于，肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-15(IL-15)、氧化氮合酶(NOS)、高速流动性族1蛋白质(HMG-1)、移动抑制因子(MIF)、激肽、血小板活化因子受体拮抗剂(PAFra)、可溶的磷脂酶A2(sPLA2)。具体而言，认为TNF是脓毒症级联中最重要的炎性介质之一。TNF主要在脓毒症中明显升高(Casey，et al.，1993，Ann.Intern.Med.119：771-778；van der Poll，et al.，1995，Shock，1-12)，并且TNF的水平与脓毒症的严重性和临床后果有关(Calandra，et al.，1990，J.Infect.Dis.161：982-987；Cannon，et al.，1990，J.Infect.Dis.，161：79-84)。而且，大多数脓毒症的有害作用可被TNF的施用所模仿(Okusawa，et al.，1988，J.Clin.Invest.，81：1162-1172；Natanson，et al.，1989，J.Exp.Med.，169：823-832)。

按照本发明用于治疗脓毒症的ODN疗法的实例包括，但不限于，CYGX080103，其中其序列是5′(CTT TCA ACA GTT TTG ATG ACC TTTGCT GAC CAT ACA ATT GCG ATA TCG TGG GGA GTG AGA G)3′，并且其潜在靶目标是btuE(GenBank ID：NP_416225.1)，CaiB(GenBank ID：NP_414580.1)，ydgD(GenBank ID：NP_418152.1)，ygcQ(GenBankID：NP_417249.2)，ftsH(GenBank ID：NP_417645.1)，ppiB(GenBankID：NP_415058.1)，yihl(GenBank ID：NP_418308.1)，zntA(GenBankID：NP_417926.1)，yicI(GenBank ID：NP_418116.1)，fhuA(GenBank ID：NP_414692.1)，rplD(GenBank ID：NP_417778.1)，ilvB(GenBank ID：NP_418127.1)，lepB(GenBank ID：NP_417063.1)，aroK(GenBank ID：NP_417849.1)，mfd(GenBank ID：NP_415632.1)，rlpA(GenBank ID：NP_415166.1)，accA(GenBank ID：NP_414727.1)，pgpA(GenBank ID：NP_414952.1)；CYGXacpP，其中，其序列是PNA形式的5′(CTC ATA CTCT)3′，并且其靶目标是细菌必需脂肪酸生物合成基因acpP(GenBankID：NP_309499)；CYGXFtsZDZ，其中，其序列是5′(GTT TCG AAG GCTAGC TAC AAC GAT CAT CCA G)3′，并且其靶目标是细菌必需细胞分裂基因FtsZ(GenBank ID：NP_308126)。

按照本发明治疗脓毒症的DNA治疗法的实例包括，但不限于，一般ODN及其表达质粒，其修饰形式诸如锁定核酸(LNA)，肽核酸(PNA)诸如上述的那些，硫代磷酸酯，或硫代磷酸酯吗啉代寡聚体(PMO)。

按照本发明，将本发明的ODNs和所述ODN表达质粒传递到细菌或真菌细胞中从而治疗细菌或真菌病原疾病的方式包括，但不限于，裸DNA的直接注射；阳离子聚合物诸如PEI、EPEI和卟啉；病毒载体诸如逆转录病毒和腺病毒；阳离子脂质体诸如DOTAP和DOTMA；和肽诸如Xaa Xaa Xaa Lys Lys Arg Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Trp Xaa GluThr Trp Trp Xaa Xaa Xaa，Lys Xaa Xaa Trp Trp Glu Thr Trp Trp Xaa Xaa SerGln Pro Lys Lys Xaa Arg Lys Xaa，Tyr Gly Phe Lys Lys Xaa Arg Arg Pro TrpThr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Xaa，其中任一个Xaa可以是任何氨基酸。还可通过使用上述的噬菌体抽提物将质粒包装到感染的颗粒中来将本发明的ODN表达质粒传递到细菌或真菌细胞中。

可以将本发明的抗真菌序列(AFS)和抗细菌序列(ABS)结合到质粒、病毒，以及其它本领域已知的载体中并包装在脂质体、阳离子聚合物诸如PEI，或其它赋形剂中，并用于，例如预防性地阻止或减少感染诸如导致脓毒症的感染的可能性。这些应用包括，但不限于，在皮肤或外科手术切除位点上的喷射应用，从而减少细菌负荷和因此减少感染的风险。还可将本发明的AFS和ABS用于有利于在针对局部感染的相同方式和通过静脉内全身注射获得良好效果。出于该目的，将对于普通微生物病原体的AFS和ABS的“混合物”进行施用，或一旦细菌或真菌病原体被培养和鉴定，选择并施用特异性病原体的合适序列。

还以上述在国际申请号PCT/US02/12345中所述的方式，将本发明的AFS和ABS与针对宿主炎症相关蛋白诸如细胞间粘着分子(ICAM)的序列结合使用，所述国际申请号PCT/US02/12345被转让给本发明相同的受让人。抗炎和抗菌序列的结合应用可减少手术程序感染和瘢痕的风险。结合的序列还在治疗导致感染诸如decubiti(bed sores)的炎性疾病中有作用。

那些在本说明书中获益的本领域技术人员将意识到可对本发明的装置的组成部分作出某些变化而不会改变其中那些部分获得它们预期结果的作用方式。所有的这些变化，和从本发明的说明书，对本领域的那些技术人员而言是清楚的其它变化，倾向于在后附的，非限制性的权利要求范围内。

Claims

1.一种寡脱氧核苷酸(ODN)文库，其包括多个具体长度的寡脱氧核苷酸，所述寡脱氧核苷酸的至少一个包括所述ODN文库，当被插入具有特异引入序列的DNA表达载体中时，其能够与靶基因组DNA、mRNA或蛋白质相互作用，所述特异引入序列是针对所述寡脱氧核苷酸被插入所述表达载体而言的，当通过与化学剂接触而被诱导时，所述表达载体能够被引入靶细胞以产生至少一个所述寡脱氧核苷酸从而以可观察到的结果与基因组DNA、mRNA或蛋白质相互作用。

2.一种鉴定和分离寡脱氧核苷酸的方法，其包括如下步骤：

使用权利要求1的ODN文库来在靶细胞中表达至少一种所述寡脱氧核苷酸的多个拷贝；

将靶细胞培养成细胞的集落；

将所述集落分成成对的集落；

使成对的集落的其中一个与化学试剂接触，所述化学试剂能诱导被接触的集落的细胞表达所述至少一种寡脱氧核苷酸，导致了被表达的寡脱氧核苷酸与基因组DNA、mRNA或蛋白质相互作用从而改变基因的表达；

在所述被接触的细胞中观察结果；和

对未接触的集落的细胞的DNA进行测序从而鉴定导致基因改变的文库寡核苷酸的序列。

3.权利要求2的方法，其中所述细胞是细菌菌株DH5αPro。

4.质粒pssXG。

5.权利要求4的质粒，其包括具有序列5′-TGGTGCGTCCGAG-3′[Seq.IDNo.3]的PBS。

6.一种细胞，其具有被转化其中的权利要求4的质粒。

7.一种原核细胞，其具有被转化其中的权利要求4的质粒。

8.权利要求4的质粒，其包括一种序列，所述序列编码单链DNA酶的体内表达，所述单链DNA酶靶向细菌FtsZ基因的mRNA转录物。

9.权利要求8的质粒，其中所述单链DNA酶特异于细菌FtsZ基因的位置880的GU位点。

10.权利要求8的质粒，其中单链DNA酶包括5′-N₁-GGCTAGCTACAACGA-N₂-3′[Seq.ID No.7]，其中N₁和N₂代表靶向特异RNA的范围在约7-约10个核苷酸大小的任何核苷酸序列。

11.一种细胞，其具有被转化到其中的权利要求8的质粒。

12.一种单链DNA酶，其包括15个核苷酸的催化结构域，所述结构域两侧是每个都介于约7-约10个核苷酸的随机RNA靶目标结合结构域。

13.权利要求12的单链DNA酶，其中所述催化结构域包括序列5′-N₁-GGCTAGCTACAACGA-N₂-3′[Seq.ID No.7]，其中N₁和N₂代表靶向特异RNA的范围在约7-约10个核苷酸大小的任何核苷酸序列。

14.一种质粒，其具有包含其中的编码权利要求12的DNA酶的序列。

15.一种细胞，其具有被转化到其中的权利要求14的质粒。

16.ODN表达质粒AS080103。

17.一种在动物患者中治疗脓毒症的方法，其包括如下步骤：使脓毒症的病原体与包括靶向病原体的特异基因的序列的ODN接触从而改变特异基因的表达以抑制病原体的生长、杀死病原体或抑制病原体导致的毒素的合成或分泌。

18.一种治疗脓毒症的DNA、RNA或PNA寡核苷酸，其具有如下核苷酸序列的一个或多个：

5′(CTT TCA ACA GTT TTG ATG ACC TTT GCT GAC CAT ACAATT GCG ATA TCG TGG GGA GTG AGA G)3′；

5′(CTC ATA CTC T)3′；或

5′(GTT TCG AAG GCT AGC TAC AAC GAT CAT CCA G)3′。

19.一种细胞，其具有被转化到其中的权利要求18的序列的一个或多个。

20.一种寡核苷酸，其具有如下序列：

5′-CTTTCAACAGTTTTGATGACCTTTGCTGACCATACAATTGC-GATATCGTGGGGAGTGAGAG-3′ [Seq.ID No.13]

或如下的其同源序列之一：

5′-CCTTTGCTGACCATAC-3′ [Seq.ID No.14]

5′-GACCTTTGCTGACCA-3′ [Seq.ID No.15]

5′-ACAGTTTTGATGAC-3′ [Seq.ID No.16]

5′-ACAATTGCGATAT-3′ [Seq.ID No.17]

5′-GACCTTTGCTGAC-3′ [Seq.ID No.18]

5′-TCAACAGTTTTGATGAC-3′ [Seq.ID No.19]

5′-ATGACCTTTGCTG-3′ [Seq.ID No.20]

5′-CAGTTTTGATGA-3′ [Seq.ID No.21]

5′-ACCTTTGCTGAC-3′ [Seq.ID No.22]

5′-TTGCTGACCATA-3′ [Seq.ID No.23]

5′-TGACCTTTGCTG-3′ [Seq.ID No.24]

5′-GTTTTGATGACC-3′ [Seq.ID No.25]

5′-GCGATATCGTGG-3′ [Seq.ID No.26]

5′-TTGATGACCTTT-3′ [Seq.ID No.27]

5′-TGGGGAGTGAG-3′ [Seq.ID No.28]

5′-TTGCTGACCAT-3′ [Seq.ID No.29]

5′-TTTTGATGACC-3′ [Seq.ID No.30]

5′-TGATGACCTTT-3′ [Seq.ID No.31]。

21.一种质粒，其具有包含其中的编码权利要求20的寡核苷酸的一个或多个的序列。

22.一种细胞，其具有被转化到其中的权利要求21的质粒。

23.一种单链DNA酶，其包括核苷酸序列

5′-N₁-GGCTAGCTACAACGA-N₂-3′[Seq.ID No.7]，和其同源序列，其中N₁和N₂代表适应于靶向特异RNA的范围在约7-约10个核苷酸的任何核苷酸序列。

24.权利要求23的单链DNA酶，其中N₁和N₂由特异于包括细菌FtsZ基因的mRNA转录物部分的序列的序列，和/或其同源序列组成。

25.一种质粒，其具有包含其中的编码权利要求23的单链DNA酶的序列。

26.一种肽-PNA缀合物，其包含序列KFFKFFKFFKCTC ATA CTC T[Seq.ID No.34]。

27.一种寡核苷酸，其能结合转录自细菌或真菌病原体的细胞生长、复制或毒素产生或分泌基因的mRNA，其中所述结合改变基因的活性。

28.按照权利要求27的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自：

5′-CCTTTGCTGACCATAC-3′ [Seq.ID No.14]

5′-GACCTTTGCTGACCA-3′ [Seq.ID No.15]

5′-ACAGTTTTGATGAC-3′ [Seq.ID No.16]

5′-ACAATTGCGATAT-3′ [Seq.ID No.17]

5′-GACCTTTGCTGAC-3′ [Seq.ID No.18]

5′-TCAACAGTTTTGATGAC-3′ [Seq.ID No.19]

5′-ATGACCTTTGCTG-3′ [Seq.ID No.20]

5′-CAGTTTTGATGA-3′ [Seq.ID No.21]

5′-ACCTTTGCTGAC-3′ [Seq.ID No.22]

5′-TTGCTGACCATA-3′ [Seq.ID No.23]

5′-TGACCTTTGCTG-3′ [Seq.ID No.24]

5′-GTTTTGATGACC-3′ [Seq.ID No.25]

5′-GCGATATCGTGG-3′ [Seq.ID No.26]

5′-TTGATGACCTTT-3′ [Seq.ID No.27]

5′-TGGGGAGTGAG-3′ [Seq.ID No.28]

5′-TTGCTGACCAT-3′ [Seq.ID No.29]

5′-TTTTGATGACC-3′ [Seq.ID No.30]

5′-TGATGACCTTT-3′ [Seq.ID No.31]。

29.按照权利要求27或28的寡核苷酸，其中所述结合阻止mRNA的翻译并且所述改变是基因产物的减少。

30.按照权利要求27-29任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自单链DNA(ssDNA)、RNA、肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、硫代磷酸酯或硫代磷酸酯吗啉代寡聚体(PMO)。

31.按照权利要求27-30任一项的寡核苷酸，其中所述病原体是脓毒症病原体。

32.按照权利要求27-30任一项的寡核苷酸，其中所述病原体选自革兰氏阴性细菌拟杆菌属(Bacteroides)，梭杆菌属(Fusobacterium)，埃希氏菌属(Escherichia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，沙门氏菌属(Salmonella)，志贺氏菌属(ShigellA)，变形菌属(Proteus)，假单胞菌属(Pseudomonas)，弧菌属(Vibrio)，军团菌属(Legionella)，嗜血菌属(Haemophilus)，博德特氏菌属(Bordetella)，布鲁氏菌属(Brucella)，弯曲杆菌属(Campylobacter)，奈瑟氏球菌属(Neisseria)，布兰汉氏球菌属(Branhamella)，革兰氏阳性细菌诸如链球菌属(Streptococcus)，葡萄球菌属(Staphylococcus)，消化球菌属(Peptococcus)，芽孢杆菌属(Bacillus)，利斯特氏菌属(Listeria)，梭菌属(Clostridium)，Propionebacteria；革兰氏染色微弱或根本不具有革兰氏染色的生物分枝杆菌属(Mycobacteria)，密螺旋体属(Treponema)，钩端螺旋体属(Leptospira)，疏螺旋体属(Borrelia)，枝原体属(Mycoplasma)，Clamydia，立克次氏体属(Rickettsia)和考克斯氏体属(Coxiella)；或真菌念珠菌属(Candida)，Aspergillosis，Blastomycosis，Coccidioidomycosis，Cryptococcosis，Histoplasmosis，Paracoccidiomycosis，Sporotrichosis，Zygomycosis。

33.按照权利要求27-32任一项的寡核苷酸，其中所述基因涉及细胞分裂、细胞壁合成、蛋白质合成(翻译)、核酸合成、脂肪酸代谢和基因调节的其中一个。

34.按照权利要求27-33任一项的寡核苷酸，其中所述mRNA已翻译自选自细菌基因FtsZ MurB，acpP，16s rRNA，PBPs，DNAA，DNAC，pcrA，rpoB，rpoA，rpoC，rpsC，rpsD，rpsF，rpsI，rpsJ，rpsM，rpsR，FabK，FabH，rplB，rplC，rplJ，rplK，rplM，rplN，rplO，rplP，rplR，rplT，rplV，rplX，rpmA，rpmL，valS，serS，proS，cysS，alaS，pheS，sporC，tsf，tufA，fus，secA，secV，pyrC，btuE，CaiB，ydgD，ygcQ，ftsH，ppiB，yihl，zntA，yicI，fhuA，rplD，ilvB，lepB，aroK，mfd，rlpA，accA，pgpA，或真菌基因ERG1，ERG2，ERG3，ERG4，ERG5，ERG6，ERG7，ERG11，ERG24，ERG25，ERGX，ERGY，CHS1，CHS2，CHS3，CWP1，CWP2，KRE1，KRE2，KRE5，KRE11，TIP1，GFA1的基因。

35.按照权利要求27-34任一项的寡核苷酸核苷酸，其中所述寡核苷酸作为反义分子发挥功能。

36.按照权利要求27-34任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸作为DNA酶发挥功能。

37.按照权利要求36的寡核苷酸，其中所述DNA酶是10-23DNA酶。

38.按照权利要求37的寡核苷酸，其中所述DNA酶采取5′-N₁-GGCTAGCTACAACGA-N₂-3′[Seq.ID No.7]的形式，其中N₁和N₂代表靶向特异RNA的范围在3-25个核苷酸，优选7-10个核苷酸大小的任何核苷酸序列。

39.按照权利要求37的寡核苷酸，其中所述DNA酶是5′-GTTTCGAAGGCTAGCTACAACGATCATCCAG-3′[Seq.ID No.6]。

40.按照权利要求39的寡核苷酸，其中所述DNA酶结合FtsZ mRNA。

41.一种缀合物，其包含按照权利要求27-41的任一项的寡核苷酸和肽。

42.按照权利要求41的缀合物，其中所述肽是KFFKFFKFFK或其同源物和衍生物。

43.一种载体，其包括按照权利要求27-41任一项的寡核苷酸。

44.按照权利要求43的载体，其中所述载体是表达载体，优选可诱导的表达载体。

45.一种宿主细胞，其被按照权利要求43-44任一项的载体所转化。

46.按照权利要求45的宿主细胞，其中所述细胞是细菌或真菌病原体，优选脓毒症病原体。

47.按照权利要求27-40的任一项的寡核苷酸，按照权利要求41或42的缀合物，或按照权利要求43或44的载体，用于在治疗中使用。

48.按照权利要求47的寡核苷酸，其中所述治疗是细菌或真菌病原疾病和优选脓毒症的治疗。

49.按照权利要求27-40任一项的寡核苷酸在制备用于治疗细菌或真菌病原疾病的药物中的应用。

50.按照权利要求49的应用，其中所述疾病由拟杆菌属，梭杆菌属，埃希氏菌属，克雷伯氏菌属，沙门氏菌属，志贺氏菌属，变形菌属，假单胞菌属，弧菌属，军团菌属，嗜血菌属，博德特氏菌属，布鲁氏菌属，弯曲杆菌属，奈瑟氏球菌属，布兰汉氏球菌属，链球菌属，葡萄球菌属，消化球菌属，芽孢杆菌属，利斯特氏菌属，梭菌属，Propionebacteria；分枝杆菌属，密螺旋体属，钩端螺旋体属，疏螺旋体属，枝原体属，Clamydia，立克次氏体属和考克斯氏体属；或念珠菌属，Aspergillosis，Blastomycosis，Coccidioidomycosis，Cryptococcosis，Histoplasmosis，Paracoccidiomycosis，Sporotrichosis，Zygomycosis所引起。

51.按照权利要求49或50的应用，其中所述疾病是脓毒症。

52.一种试剂盒，其包括：

(a)按照权利要求27-40任一项的寡核苷酸；和

(b)用于治疗细菌或真菌病理疾病的药用赋形剂。

53.按照权利要求52的试剂盒，其中所述疾病是脓毒症。

54.按照权利要求52-53的试剂盒，其中药用赋形剂选自肽，优选KFFKFFKFFK，和载体。

55.一种文库，其包括用可诱导表达载体转化的至少一种细菌菌株，所述可诱导表达载体包括测试的寡核苷酸，其中所述细菌菌株能导致病理疾病。

56.按照权利要求55的文库，其中所述病理疾病是脓毒症。

57.按照权利要求55或56的文库，其中所述细菌菌株选自革兰氏阴性细菌拟杆菌属，梭杆菌属，埃希氏菌属，克雷伯氏菌属，沙门氏菌属，志贺氏菌属，变形菌属，假单胞菌属，弧菌属，军团菌属，嗜血菌属，博德特氏菌属，布鲁氏菌属，弯曲杆菌属，奈瑟氏球菌属，布兰汉氏球菌属，革兰氏阳性细菌链球菌属，葡萄球菌属，消化球菌属，芽孢杆菌属，利斯特氏菌属，梭菌属，Propionebacteria。

58.按照权利要求55-57任一项的文库，其中所述细菌菌株是大肠杆菌，优选DH5αPro细胞。

59.按照权利要求55-58任一项的文库，其中所述测试的寡核苷酸是至少10，优选地20，更优选地30，还更优选地40，甚至更优选地50并尤其优选地60个碱基的长度。

60.按照权利要求55-59任一项的文库，其中所述可诱导的表达载体由四环素调节并优选地所述载体是pssXGb。

61.一种鉴定用于治疗细菌或真菌病原疾病的寡核苷酸的方法，所述方法包括：

(a)提供按照权利要求55-60任一项的文库；

(b)在支持细菌生长的条件下，提供至少一个细菌菌株的至少两个样品，其中最后一个样品与诱导物接触并且至少一个样品不与所述诱导物接触；和(c)选择仅在缺乏所述诱导物的条件下能够生长的细菌菌株并分离所述测试的寡核苷酸。

62.按照权利要求61的方法，其中所述疾病是脓毒症。

63.按照权利要求61或62的方法，其还包括在步骤(c)后进行的步骤(d)，其包括：(d)分析所述分离的测试寡核苷酸从而鉴定靶细菌基因序列。

64.按照权利要求61-63任一项的方法，其还包括在步骤(c)或(d)后进行的步骤(e)，其包括：(e)分离的测试寡核苷酸在治疗脓毒症中的应用。

65.按照权利要求61-64任一项的方法，其中所述细菌菌株选自拟杆菌属，梭杆菌属，埃希氏菌属，克雷伯氏菌属，沙门氏菌属，志贺氏菌属，变形菌属，假单胞菌属，弧菌属，军团菌属，嗜血菌属，博德特氏菌属，布鲁氏菌属，弯曲杆菌属，奈瑟氏球菌属，布兰汉氏球菌属，革兰氏阳性细菌诸如链球菌属，葡萄球菌属，消化球菌属，芽孢杆菌属，利斯特氏菌属，梭菌属，Propionebacteria。