CN1826170B - 通过受控相分离制备的小球形颗粒的制造方法、其用途和成分 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过提供单一液相的溶液制备活化剂小球形颗粒的方法。所述单一液相包含活化剂、相分离增强剂和第一溶剂。在溶液中以受控速度引发相转变，导致活化剂液固相分离，并形成固相和液相。所述固相包含活化剂的固体小球形颗粒。所述液相包含所述相分离增强剂和所述溶剂。所述小球形颗粒基本上是球形，并具有从约0.01μm至约200μm的尺寸。

Description

通过受控相分离制备的小球形颗粒的制造方法、其用途和成分

相关申请的交叉引用： 

本申请要求2003年7月18日提交的美国临时申请系列号60/488,712的优先权，此处全部引入作为参考，并作为本文的一部分。 

发明背景： 

技术领域

本发明涉及活化剂小球形颗粒的制备方法、使用方法和成分。根据制备方法，将所述活化剂溶解在包含溶解相分离增强剂(PSEA)的含水或水可混溶溶剂中，以在单一液相中形成溶液。然后对所述溶液进行液固相分离，所述活化剂含在固相，所述PSEA和溶剂含在液相。可以多种方法引发液固相分离，例如溶液的温度改变至低于体系的相转变温度。所述方法最适用于形成治疗剂的小球形颗粒，其可以投递给需要治疗剂的患者。所述方法还最适用于形成固体、大分子的小球形颗粒，特别是不耐热的大分子，例如蛋白质。 

背景技术

过去已有多种技术用于制备生物聚合物纳米和微米颗粒。传统方法包括喷雾干燥并研磨形成颗粒，并可用于制备尺寸为5μm或更小的颗粒。 

美国专利号5,654,010和美国专利号5,667,808公开了制备固态重组体人生长激素，hGH，通过与锌络合产生无定形络合物，然后其通过超声波喷嘴微粒化，并在液氮中向下喷雾以冷冻小滴。然后在-80℃温度下蒸发液氮，并冷冻干燥得到的材料。 

 微米颗粒、微球体和微胶囊是固体或半固体颗粒，具有小于1毫 

米的直径、更优选小于100微米、最优选小于10微米，其可以由多种材料形成，包括蛋白质、合成聚合物、多糖和其组合物。微球体已经用于许多不同的应用，主要是分离、诊断和药物递送。 

用于分离技术的微球体大多数公知实例是由合成或天然来源的聚合物形成的，例如聚丙烯酰胺、羟基磷灰石或琼脂糖。受控药物递送区域中，通常将分子并入或封装在小球形颗粒内或并入整体基质，用于随后的释放。通常使用多种不同的技术从合成聚合物、天然聚合物、蛋白质和多糖制备微球体，所述技术包括相分离、溶剂蒸发、coascervation、乳化和喷雾干燥。通常聚合物形成这些微球体的支承结构，并将所用药物并入所述聚合物结构。 

目前可利用的是使用类脂封装靶药物制备的颗粒。脂质体是由单一种或多种磷脂和/或胆固醇双层组成的球形颗粒。脂质体尺寸为100纳米或更大，并可以携带多种水溶性或类脂可溶性药物。例如，在包围多个含水隔室的双层膜中排列以形成颗粒的类脂可以用于封装水溶性药物，用于随后的递送，如公开于Sinil Kim的美国专利号5,422,120。 

球形珠粒多年来已可商购作为生化专家的工具。例如，抗体配合珠粒产生相对较大的颗粒，其对于特定的配体具有粘合专一性。抗体通常用于粘合细胞活化池表面上的受体，粘合至固相以形成免疫亲合性提纯用抗体被覆颗粒，并可以用于投递随时间缓慢释放的治疗剂，使用配合至颗粒的组织或肿瘤特定抗体以将试剂靶定在所需位置。 

一直需要开发制备颗粒的新方法，特别是适用于药物递送、分离和诊断领域的那些。从应用立场最合乎需要的颗粒为小球形颗粒，其具有下列特性：粒度分布、基本上球形、基本上仅由活化剂组成、保持生化完全性和活化剂的生物活性。应该提供适当的固体颗粒，其可以通过被覆或微囊化进一步稳定颗粒。此外，制造小球形颗粒的方法应具有下列合乎需要的特性：制造简单、基本上含水的方法、高产率 和不需随后的筛分。 

发明概述： 

本发明涉及活化剂小球形颗粒的制备方法和使用方法。根据所述方法，将所述活化剂溶解在包含溶解相分离增强剂的溶剂中，以形成溶液即单一液相。溶剂优选为含水或水可混溶溶剂。然后对所述溶液进行液固相分离，使所述活化剂包含在固相中，所述PSEA和溶剂包含在液相中。可以多种方法引发液固相分离，例如溶液的温度改变至低于溶液的相转变温度。 

本发明的优选实施方式中，对所述溶液进行液固相分离的方法是通过冷却所述溶液至低于溶液中活化剂的相转变温度。其温度可以高于或低于所述溶液的凝固点。对于凝固点高于相转变温度的溶液，溶液可以包括凝固点降低剂，例如聚乙二醇或丙二醇，以降低溶液的凝固点，并使所述溶液发生相分离，而没有溶液冻结。 

当对溶液进行相转变步骤时，本发明的相分离增强剂增强或引发溶液中活化剂的液固相分离，其中活化剂固化形成作为不连续相的小球形颗粒悬浮液，而相分离增强剂仍然溶解在连续相中。即，所述相分离增强剂不发生相转变，但是活化剂发生相转变。 

在本发明中制备颗粒的方法还可以包括控制颗粒液固相分离的附加步骤以控制形成颗粒的形状和尺寸。控制相分离的方法包括控制离子强度、pH、相分离增强剂的浓度、溶液中活化剂的浓度，或控制溶液的温度变化速度，这些因素的控制在相分离之前进行或控制改变这些因素的任何一个或多个，以引发相分离。 

本发明优选实施方式中，形成颗粒后，在连续相中从PSEA分离所述小球形颗粒。另一个优选实施方式中，分离方法是用液体介质洗涤包含所述颗粒的溶液，其中活化剂不溶于所述液体介质，而相分离 增强剂可溶于液体介质。液体洗涤介质可以包含降低活化剂在液体介质中溶解度的试剂。液体洗涤介质还可以包含一种或多种赋形剂。所述赋形剂可以作为小球形颗粒或活化剂或载体试剂的稳定剂。赋形剂还可以赋予活化剂或颗粒以附加的特性，例如活化剂从颗粒的受控释放，或改进活化剂通过生物组织的渗透性。 

另一个优选实施方式中，虽然小颗粒不包括PSEA，但在后续加工步骤中PSEA相分离之前，在PSEA相的存在下获得它们。 

另一个优选实施方式中，所述溶液是包括含水溶剂或水可混溶性溶剂的水溶液。 

本发明的活化剂优选是药用活化剂，其可以是治疗剂、诊断试剂、美容剂、营养增补剂或杀虫剂。本发明优选实施方式中，活化剂是大分子，例如蛋白质、多肽、碳水化合物、多聚核苷酸或核酸。另一个优选实施方式中，包含活化剂的颗粒适用于在活体内通过适当的路线，例如肠胃外注射、局部、口服、直肠、经鼻、肺、阴道、颊、舌下、透皮、经粘膜、眼睛、眼内或耳部递送所需试剂给患者。 

附图说明：

图1是以活化剂浓度对温度作图的二维相图。 

图2是冷却温度分布图。 

图3a是起始胰岛素材料的扫描电子显微照片(SEM)。 

图3b是胰岛素(实施例4)小球形颗粒的SEM。 

图4是显示制备成为小球形颗粒时总体维持胰岛素化学稳定性的HPLC分析。 

图5a和5b是表示批次间可重现性的示意图。 

图6是表示批次间可重现性的示意图。 

图7是实施例3中制备胰岛素小球形颗粒的连续流通方法的示意图。 

图8是用实施例3中连续流通方法制备的胰岛素小球形颗粒的扫描电子显微照片(以10Kv和6260X放大倍数)。 

图9是用实施例3中连续流通方法制备的溶解胰岛素小球形颗粒的高效液相色谱。 

图10a-10d表明氯化钠对胰岛素溶解度的影响。 

图10e-10h表明不同的盐对胰岛素溶解度的影响。 

图10i是原料胰岛素、从小球形颗粒释放的胰岛素和小球形颗粒中胰岛素的拉曼光谱。 

图11是实施例10放射性同位素示踪的胰岛素得到的安得生级联碰撞仪数据。 

图12是实施例8的P/I比率的柱状图。 

图13是得自实施例8的肺部闪烁扫描图像。 

图14a是α-1-抗胰蛋白酶(AAT)的圆二色性(CD)绘图。 

图14b是实施例17中在室温下活性对存储时间的作图。 

图14c是实施例17中在4℃下活性对存储时间的作图。 

图15-25b是DSC绘图。 

图26是TSI Corporation Aerosizer粒度数据作图。 

图27是人生长激素(hGH)小球形颗粒的SEM。 

图28显示了在HFA-134a中胰岛素稳定性数据。 

图29是使用三种吸入设备比较胰岛素空气动力性能的图表。 

图30是与在25℃储存的胰岛素原材料相比，胰岛素小球形颗粒的稳定性数据图表。 

图31是与在37℃储存胰岛素原材料相比，胰岛素小球形颗粒的稳定性数据图表。 

图32是与在25℃储存胰岛素原材料相比，胰岛素小球形颗粒的稳定性数据图表。 

图33是与在37℃储存胰岛素原材料相比，胰岛素小球形颗粒的稳定性数据图表。 

图34是与在25℃储存胰岛素原材料相比，胰岛素小球形颗粒的稳定性数据图表。 

图35是与在37℃储存胰岛素原材料相比，胰岛素小球形颗粒的稳定性数据的图表。 

图36是使用Cyclohaler DPI的胰岛素空气动力稳定性柱状图。 

图37是脱氧核糖核酸酶小球形颗粒的光学显微图。 

图38是脱氧核糖核酸酶的酶活性图表。 

图39是SOD小球形颗粒的光学显微图。 

图40是SOD小球形颗粒酶催化数据的图表。 

图41A-B是连续乳化反应器的示意图，其中图41A是当在乳化前将表面活性化合物加入至连续相或分散相时的连续乳化反应器的示意图，图41B是当在乳化后加入表面活性化合物时的连续乳化反应器示意图。 

图42说明PEG对PLLA封装HSA颗粒(实施例32)的IVR分布的影响。 

图43图解PLGA封装LDS小球形颗粒(实施例33)的IVR分布。 

图44图解连续相pH对PLGA封装胰岛素小球形颗粒(实施例31)IVR分布的影响。 

图45图解PLGA封装hGH小球形颗粒(实施例34)的IVR分布。 

图46图解封装INSms中，微囊化变量(连续相和基质材料的pH)对形成INS二聚物的影响。 

图47图解封装INSms(实施例35)中，微囊化变量(连续相和基质材料的pH)对形成HMW物种的影响。 

图48图解小鼠中从非封装和封装预制胰岛素小球形颗粒体内释放重组体人胰岛素(实施例36)。 

图49是实施例27颗粒的SEM。 

发明的详细说明： 

本发明有多种不同形式的实施方式。公开了本发明的优选实施方式，但应当理解本发明的公开内容被认为是本发明原理的例证，而不应认为将本发明的范围限制在举例说明的实施方式。 

本发明涉及活化剂小球形颗粒的制备方法和使用方法及其组分。根据所述制备方法，将所述活化剂溶解在包含溶解相分离增强剂的溶剂中，以形成溶液，即单一液体连续相。溶剂优选为含水或水可混溶性溶剂。然后所述溶液经历相转变，例如，通过降低溶液温度至低于所述活化剂的相转变温度，从而使活化剂发生液固相分离，形成构成不连续相的小球形颗粒的悬浮液，而相分离增强剂留在连续相中。 

相： 

连续相 

本发明制备活化剂小球形颗粒的方法始于提供单一液相的溶液，其具有溶解在第一溶剂中的活化剂和相分离增强剂。所述溶液可以是有机体系，包含有机溶剂或可混溶的有机溶剂的混合物。所述溶液还可以是水基溶液，包含水性介质、或水可混溶的有机溶剂、或水可混溶的有机溶剂的混合物、或其组合物。所述水性介质可以是水、生理盐水、缓冲溶液、缓冲盐水等。合适的水可混溶的有机溶剂包括，但是不局限于N-甲基-2-吡咯烷酮、2-吡咯烷酮、1，3-二甲基-2-咪唑烷酮(DMI)、二甲亚砜、二甲基乙酰胺、乙酸、乳酸、丙酮、甲基乙基酮、乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、3-戊醇、正丙醇、苯甲醇、丙三醇、四氢呋喃(THF)、聚乙二醇(PEG)，PEG-4，PEG-8，PEG-9，PEG-12，PEG-14，PEG-16，PEG-120，PEG-75，PEG-150，聚乙二醇酯、PEG-4二月桂酸酯、PEG-20二月桂酸酯、PEG-6异硬脂酸酯、PEG-8硬脂酸棕榈酸酯、PEG-150硬脂酸棕榈酸酯、聚乙二醇山梨聚糖、PEG-20山梨聚糖异硬脂酸酯、聚乙二醇单烷基醚、PEG-3二甲醚、PEG-4二甲醚、聚丙二醇(PPG)、聚丙烯藻酸酯、PPG-10丁二醇、PPG-10甲基葡萄糖醚、PPG-20甲基葡萄糖醚、PPG-15硬脂酰基醚、丙二醇二辛酸酯/二癸酸酯、丙二醇月桂酸酯、和四氢呋喃聚乙二醇醚(四氢糠醇聚乙二醇醚)、烷烃，包括丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷或其组合物。 

制备单一的连续相可通过，首先提供相分离增强剂的溶液，其可 溶于第一溶剂或可与第一溶剂混溶。随后加入活化剂至所述溶液。所述活化剂可以直接加入至所述溶液，或可以首先将所述活化剂溶解在第二溶剂中，然后同时加入至所述溶液。第二溶剂可以是与第一溶剂相同的溶剂，或它可以是选自上述的另一种溶剂，其可与所述溶液混溶。优选在环境温度或更低温度加入所述试剂至所述溶液，这对于不耐热的分子例如某些蛋白质是特别重要的。″环境温度″的含义是指约20℃至约40℃的室温附近。然而，也可以加热体系，以增加活化剂在体系中的溶解度，只要加热不导致所述试剂的活性明显降低。 

相分离增强剂 

当溶液经历相分离步骤时，本发明相分离增强剂(PSEA)增强或引发活化剂从溶液的液固相分离，其中活化剂凝成为固体或半固体，形成作为不连续相的悬浮液，而相分离增强剂仍然溶解在连续相中。当使所述溶液达到相分离条件时，相分离增强剂降低活化剂的溶解度。合适的相分离增强剂包括但不局限于与所述溶液具有可溶性或可混溶性的聚合物或聚合物的混合物。合适的聚合物实例包括线性或支化聚合物。这些聚合物可以是水溶性的、半水溶性的、水可混溶的或不溶的。 

本发明优选形式中，相分离增强剂是水溶性或水可混溶性的。可以使用的聚合物类型包括碳水化合物基聚合物、聚脂肪醇、聚(乙烯基)聚合物、聚丙烯酸、聚有机酸、聚氨基酸、共聚物和嵌段聚合物(例如，泊洛沙姆例如Pluronics F127或F68)、叔聚合物、聚醚、天然存在的聚合物、聚酰亚胺、表面活性剂、聚酯、支化和环聚合物和聚醛。 

优选聚合物是可作为活化剂颗粒给药预定途径的药物添加剂的物质。优选聚合物是药用可接受的添加剂，例如多种分子量的聚乙二醇(PEG)，例如PEG 200、PEG 300、PEG 3350、PEG 8000、PEG 10000、PEG 20000等，和泊洛沙姆例如Pluronics F127或Pluronics F68。另一种优选聚合物是聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)。另一种优选聚合物是羟乙 基淀粉。也可以单独或结合使用其它两亲性聚合物。相分离增强剂还可以是非聚合物，例如丙二醇和乙醇的混合物。 

液固相分离 

可以用本领域中已知的任何方法引发溶液中活化剂的液固相分离，例如改变温度、改变压力、改变pH、改变溶液的离子强度、改变活化剂的浓度、改变相分离增强剂的浓度、改变溶液的渗透压浓度、和这些改变的组合等。 

本发明优选实施方式中，相转变是温度引发的相转变，通过降低温度至低于溶液中活化剂的相转变温度。 

图1是包含溶剂、PSEA和活化剂的溶液的二维相图10。该图以活化剂浓度对溶液的温度绘图。PSEA的浓度保持恒定。 

该图具有饱和曲线12；过饱和曲线14；之间的亚稳态区域16；第一区域18低于饱和曲线，其中体系是同质的单一液相，其中全部成分在液相中；第二区域20在过饱和曲线之上，其中体系是两相体系，具有活化剂的固相和含PSEA与溶剂的液相。相图有助于测定体系的温度和纯液相、液固相中组分的相对浓度，和测定这两相间的转变条件。 

如此处公开的，制备活化剂的小球形颗粒主要涉及从欠饱和的溶液(点A′)冷却到达点A饱和，其中溶液与可能存在的任何固相相平衡。进一步冷却时，达到这样的状态，其中溶液包含比在指定温度下平衡溶解度更多的活化剂；因此溶液变为过饱和。直至达到B点才会发生固相自发形成。B点是亚稳态区域的边界上的点。亚稳态的区域宽度可以表达为最大可到达的过冷ΔT_max＝T₂-T₁或过饱和ΔC_max＝C^* ₂-C^* ₁。这两种表达是热力学等价的： 

$\mathrm{\Δ}{C}_{\max }=C_2^{*}-C_1^{*}=\underset{T_1}{\overset{T_1}{\∫}}\left(\frac{{\∂C}^{*}}{\∂T}\right)\mathrm{dT}\≅\mathrm{\Δ}{T}_{\max }\left(\frac{{\mathrm{dC}}^{*}}{\mathrm{dT}}\right)$

线路A ′-A-B代表制备亚稳溶液的热聚合方法。非等温方法中，起点为A″。通过在恒温下增加浓度，将再次在点A获得饱和。等温增加浓度(例如，通过溶剂蒸发或通过接种/加入活化剂)至点C将导致溶液移动进入亚稳区，直至再次达到亚稳态边界。当超过亚稳极限时，溶液变得不稳定，并立即出现自发形成固相。 

等温获得的值(ΔC_max)_T＝C^* ₃-C^* ₂可以不同于非等温获得的对应值ΔT_max＝T₃-T₂。随着接近亚稳态区域的边界，形成固体颗粒需要的时间降低，直至达到亚稳态极限。 

非等温方法中，冷却速度是受控速度，以控制颗粒的尺寸和形状。受控速度的含义是指约0.2℃/分钟至约50℃/分钟、更优选0.2℃/分钟至30℃/分钟。变化速度可以是恒定值或线性速度、非线性速度、间歇的、或一种程序控制的速度(具有多相循环)。 

可以从溶液的PSEA中分离颗粒，并通过将在以下讨论的洗涤进行提纯。 

本发明尝试调节活化剂的浓度、PSEA的浓度、温度或这些参数的任何组合，以产生相转变，其中活化剂经历从液态到固态，而PSEA和溶剂不经历相转变，并保持为液体。也预期改变pH、离子强度、渗透压浓度等，以增强、促进、控制或抑制相转变。对于凝固点比较高的溶液，或凝固点高于相转变温度的溶液，所述溶液可以包含凝固 点降低剂，例如丙二醇、蔗糖、乙二醇、醇类(例如：乙醇、甲醇)或凝固点降低剂的含水混合物，以降低体系的凝固点，使得体系中可以相转变，而没有冻结体系。还可以进行所述方法，以降低温度至低于体系的凝固点。此处公开的方法特别适用于不耐热的分子(例如蛋白质)。 

任选的赋形剂 

本发明的颗粒可以包含一种或多种赋形剂。赋形剂还可以赋予活化剂或颗粒以附加的特性，例如增加颗粒或活化剂或载体试剂的稳定性、增加活化剂从颗粒的受控释放，或改进活化剂通过生物组织的渗透性。合适的赋形剂包括，但是不局限于碳水化合物(例如海藻糖、蔗糖、甘露糖醇)、阳离子(例如，Zn²⁺，Mg²⁺，Ca²⁺)、阴离子(例如SO₄ ^2-)、氨基酸类(例如甘氨酸)、类脂、磷脂、脂肪酸、表面活性剂、三酸甘油酯、胆汁酸类或其盐(例如胆酸酯或其盐，例如胆酸钠；脱氧胆酸或其盐)、脂肪酸酯和存在浓度低于它们作为PSEA时浓度的聚合物。当使用赋形剂时，赋形剂没有明显影响溶液的相图。 

分离并洗涤颗粒 

本发明优选实施方式中，通过从溶液相分离增强剂中将其分离，获得小球形颗粒。另一个优选实施方式中，分离方法是用液体介质洗涤包含小球形颗粒的溶液，其中活化剂不溶于所述液体介质，而相分离增强剂可溶于液体介质。某些洗涤方法可以为通过透滤法或离心法。所述液体介质可以是含水介质或有机溶剂。对于具有低水溶性的活化剂，所述液体介质可以是含水介质，或包含降低活化剂水溶性试剂例如二价阳离子的含水介质。对于具有高水溶性的活化剂，例如许多蛋白质，可以使用有机溶剂或包含蛋白质沉淀剂例如硫酸铵的含水溶剂。 

适用作为液体介质的有机溶剂实例包括上述规定适用于连续相的有机溶剂，更优选二氯甲烷、氯仿、乙腈、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、 戊烷等。 

还考虑使用任何这些溶剂的混合物。一种优选共混物是二氯甲烷或二氯甲烷与丙酮的1∶1混合物。优选液体介质具有低沸点，通过例如冷冻干燥、蒸发或干燥容易除去。 

所述液体介质还可以是超临界流体，例如液态二氧化碳或接近其超临界点的流体。超临界流体可以是所述相分离增强剂的合适溶剂，特别是某些聚合物，但是对于蛋白质颗粒是非溶剂。超临界流体可以单独使用或与共溶剂一起使用。可以使用下列超临界流体：液态CO₂、、乙烷、或氙气。可能的共溶剂可以是乙腈、二氯甲烷、乙醇、甲醇、水或2-丙醇。 

用于从此处公开的PSEA分离小球形颗粒的液体介质可以包含降低活化剂在液体介质中溶解度的试剂。最合乎需要的是颗粒在液体介质中显示出最小的溶解度，以最大化颗粒的产率。对于某些蛋白质，例如胰岛素和人生长激素，可以通过加入二价阳离子例如Zn²⁺至蛋白质获得溶解度下降。其它可用于形成络合物的离子包括但不限于Ca²⁺，Cu²⁺，Fe²⁺，Fe³⁺等。 

胰岛素-Zn或生长激素-Zn络合物的溶解度足够低，使得络合物可以在水溶液中透滤。 

液体介质还可以包含一种或多种赋形剂，其可以赋予活化剂或颗粒以附加的特性，例如增加颗粒和/或活化剂或载体试剂的稳定性、活化剂从颗粒的受控释放，或改进如上所述活化剂通过生物组织的渗透性。 

本发明另一种形式中，小球形颗粒不从含PSEA的溶液中分离。 

水基方法 

另一个优选实施方式中，本体系制造方法是包括含水溶剂或水可混溶性溶剂的含水体系的制造方法。合适的水可混溶性溶剂的实例包括但不局限于上述对于连续相指出的溶剂。使用水基方法的一个优点是溶液可以是缓冲的，并可以包含赋形剂，其提供生化稳定性，以保护活化剂，例如蛋白质。 

活化剂 

本发明的活化剂优选是药用活化剂，其可以是治疗剂、诊断试剂、美容剂、营养增补剂或杀虫剂。 

治疗剂可以是生物的，其包括但是不局限于蛋白质、多肽、碳水化合物、多聚核苷酸和核酸。蛋白质可以是抗体，其可以是多克隆或单克隆的。治疗剂可以是低分子量分子。此外，治疗剂可以选自多种已知的药物，例如但不局限于：镇痛剂、麻醉剂、兴奋剂、类肾上腺素剂、类肾上腺素阻滞剂、抗肾上腺素剂、肾上腺类皮质激素、拟肾上腺素药、抗胆碱药剂、抗胆碱酯酶、抗惊厥剂、烷基化剂、生物碱、变构抑制剂、促同化激素类、减食欲药、抗酸剂、止泻药、解毒剂、抗叶酸药、退热药、抗风湿药剂、心理治疗剂、神经阻滞剂、消炎剂、驱虫剂、抗心律不齐剂、抗生素、抗凝剂、抗抑郁剂、抗糖尿病药剂、镇癫痫剂、抗真菌剂、抗组胺剂、抗高血压药、抗毒蕈碱剂、抗分支杆菌剂、抗疟药、抗菌剂、抗肿瘤剂、抗原生物药剂、抑制剂、免疫刺激剂、抗甲状腺剂、抗病毒剂、抗焦虑镇静剂、收敛药、β-肾上腺素受体阻滞剂、造影剂、皮质类甾醇、咳嗽抑制剂、诊断剂、诊断显象剂、利尿剂、多巴胺能、止血剂、血液学试剂、血色素调节剂、荷尔蒙、安眠剂、immuriological剂、抗高血脂药和其它类脂调节剂、毒蕈碱、肌肉松弛药、拟副交感神经药、甲状旁腺激素、降血钙素、前列腺素、辐射药物、镇静剂、性激素、抗过敏剂、兴奋剂、拟交感神经药、甲状腺剂、血管扩张剂、疫苗、维生素和黄质。抗肿瘤或抗癌剂，包括但是不局限于紫杉醇和衍生化合物，和其它抗肿瘤药，选 自生物碱、抗代谢物、酶抑制剂、烷基化剂和抗生素。 

美容剂是任何能够具有美容剂活性的有效成份。这些活性成分的实施例尤其可以是润肤剂、湿润剂、自由基抑制剂、抗炎性剂、维生素、脱色剂、抗粉刺剂、抗溢脂性皮炎剂、溶角蛋白剂、减肥剂、皮肤着色剂和防晒剂，特别是亚油酸、视黄醇、视黄酸、抗坏血酸烷基酯、多不饱和脂肪酸、烟碱酯、维生素E烟酸酯、米、大豆或非洲酪脂树的非皂化物、神经酰胺、醇酸例如乙醇酸、硒衍生物、抗氧化剂、β-胡萝卜素、γ-阿魏酸脂和硬脂酰基甘油酸酯。美容剂是可商购的，和/或可以用本领域已知技术制备。 

用于本发明实践的营养增补剂实例包括但不局限于蛋白质、碳水化合物、水溶性维生素(例如维生素C、B-络合维生素等)、脂溶性维生素(例如族维生素A、D、E、K、等)和药草浸液。营养增补剂是可商购的，和/或可以用本领域已知技术制备。 

术语杀虫剂理解为包括除草剂、杀虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、杀寄生虫剂和杀真菌剂。在本发明中杀虫剂的化合物类别实例可以包括脲、三嗪、三唑、氨基甲酸酯、磷酸酯、二硝基苯胺、吗啉、酰基丙氨酸类、拟除虫菊酯、二苯乙醇酸酯、二苯醚和多环卤代烃。每种这些类别杀虫剂具体实例列于Pesticide Manual(杀虫剂手册)，第九版，British Crop Protection Council。杀虫剂是可商购的，和/或可以用本领域已知技术制备。 

本发明优选实施方式中，活化剂是大分子，例如蛋白质、多肽、碳水化合物、多核苷酸、病毒或核酸。核酸包括DNA、低聚核苷酸、反义低聚核苷酸、aptimers、RNA和SiRNA。大分子可以天然或合成的。蛋白质可以是抗体，其可以是单克隆或多克隆的。此外蛋白质可以是任何从天然源分离的治疗蛋白质，或用合成或重组体方法制备的治疗蛋白质。治疗蛋白质的实例包括但不局限于凝血级联的蛋白质(例 如凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX等)，枯草溶菌素、卵白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、脱氧核糖核酸酶、过氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶、核糖核酸酶、透明质酸酶、胶原酶、生长激素、促血红细胞生长素、类似胰岛素的生长因子或其类似物、干扰素、glatiramer、粒性细胞-巨噬细胞菌落-刺激因子、粒性细胞菌落-刺激因子、抗体、聚乙二醇化的蛋白质、糖基化的蛋白质或强糖基化(hyperglycosylate)的蛋白质、去氨加压素、LHRH激动剂例如：亮丙瑞林、戈舍瑞林、那法瑞林、布舍瑞林；LHRH对抗剂、加压素、环孢素、降血钙素、甲状旁腺激素、甲状旁腺激素肽和胰岛素。优选治疗蛋白质是胰岛素、α-1抗胰蛋白酶、LHRH激动剂和生长激素。 

低分子量治疗分子的实例包括但不局限于类固醇、β-激动剂、抗微生物剂、抗真菌剂、紫杉烷类(有丝分裂剂和微小管抑制剂)、氨基酸、脂族化合物、芳香族化合物和脲化合物。 

优选实施方式中，活化剂是治疗肺紊乱的治疗剂。该试剂的实例包括但不局限于类固醇、β-激动剂、抗真菌剂、抗微生物化合物、支气管扩张剂、抗气喘剂、非甾族消炎剂(NSAIDS)、α-1-抗胰蛋白酶、和治疗囊性纤维化的试剂。类固醇的实例包括但不局限于倍氯米松(包括二丙酸氯地米松)、氟替卡松(包括氟替卡松丙酸酯)、布地奈德、雌甾二醇、氟氢可的松、flucinonide、氟羟脱氢皮醇(包括氟羟脱氢皮醇丙酮化合物)和氟尼缩松。β-激动剂的实例包括但不局限于希萘酸沙美特罗、富马酸福莫特罗、左旋舒喘宁、班布特若和妥洛特罗。 

抗真菌剂的实例包括但不限于伊曲康唑、氟康唑和两性霉素B。 

诊断试剂包括X射线显象剂和造影剂。X射线显象剂的实例包括WIN-8883(乙基3，5-二乙酰氨基-2，4，6-三碘苯甲酸酯)也称为二atrazoic酸的乙酯(EEDA)、WIN 67722，即，(6-乙氧基-6-氧己基-3，5-双(乙酰胺基)-2，4，6-三碘苯甲酸酯；乙基-2-(3，5-双(乙酰胺基)-2， 4，6-三碘苯甲酰氧基)丁酸酯(WIN 16318)；乙基diatrizoxy乙酸酯(WIN12901)；乙基-2-(3，5-双(乙酰胺基)-2，4，6-三碘苯甲酰氧基)丙酸酯(WIN16923)；N-乙基-2-(3，5-双(乙酰胺基)-2，4，6-三碘苯甲酰氧基乙酰胺(WIN 65312)；异丙基2-(3，5-双(乙酰胺基)-2，4，6-三碘苯甲酰氧基)乙酰胺(WIN 12855)；二乙基-2-(3，5-双(乙酰胺基)-2，4，6-三碘苯甲酰氧基丙二酸酯(WIN 67721)；乙基-2-(3，5-双(乙酰胺基)-2，4，6-三碘苯甲酰氧基)苯基乙酸酯(WIN 67585)；丙烷二酸、[3，5-双(乙酰氨基)-2，4，5-三碘苯甲酰氧基]双(1-甲基)酯(WIN 68165)；和苯甲酸、3，5-双(乙酰胺基)-2，4，6-三碘-4-(乙基-3-乙氧基-2-丁烯酸酯)酯(WIN 68209)。优选的造影剂包括在生理条件下应该相对快速崩解的那些，因此最小化任何颗粒相关的炎性响应。酶水解、羧酸类在生理pH溶解、或其它机理可以产生崩解。因此，可以优选溶解性较差的碘化羧酸类例如胆影酸、泛影酸和甲泛影酸，与水解不稳定的碘化物种，例如WIN 67721，WIN 12901，WIN 68165和WIN68209或其它。 

许多活化剂的组合物可以是所需的，包括例如类固醇和β-激动剂，例如氟替卡松丙酸酯和沙美特罗、布地奈德和福莫特罗等的组合物。 

碳水化合物的实例是右旋糖酐、羟乙基淀粉、环糊精、藻酸盐、壳聚糖、软骨素、肝素等。 

小球形颗粒 

本发明的颗粒和小球形颗粒优选具有约0.01μm至约200μm的平均几何粒度，更优选0.1urn至10μm，更加优选约0.5μm至约5μm，最优选约0.5μm至约3μm，测量用动态光散射法(例如，光关联光谱、激光衍射、小角度激光散射(LALLS)、中等角度激光散射(MALLS))，用光遮蔽方法(例如Coulter分析方法)或用其它方法，例如流变学或显微术(光或电子)。肺部递送颗粒应具有用飞行时间测量(例如雾化)或安得生级联碰撞仪测量确定的空气动力学粒度。 

小球形颗粒基本上是球形。″基本上球形″是指颗粒横截面的最长与最短垂直轴的长度比率小于或等于约1.5。基本上球形不要求线性对称。此外，颗粒可以具有这样的表面结构，例如与颗粒总尺寸相比比例较小的直线或凹痕或突起，但基本上仍然是球形。更优选，颗粒最长轴和最短轴之间的长度比率小于或等于约1.33。最优选，颗粒最长轴和最短轴之间的长度比率小于或等于约1.25。在基本上球形的微球体中表面接触最小化，这使储存时颗粒所不希望的聚集最小化。许多具有扁平面的晶体或薄片可以具有较大的表面接触面积，其中由于离子或非离子的相互作用可能发生聚集。球形使得接触面积很小。 

此外颗粒优选具有基本上相同的粒度。具有宽粒度分布的颗粒(其中存在相对较大和较小的颗粒)使得较小颗粒填充较大颗粒之间的缝隙，从而产生新的接触表面。较宽的粒度分布可能通过产生许多结合聚集的接触机会而产生较大的球体。本发明产生具有窄粒度分布的球形颗粒，从而最小化接触聚集的机会。″窄粒度分布″是指在90百分位点小球形颗粒的容积直径与10百分位点小球形颗粒的容积直径的比率小于或等于5的优选粒度分布。更优选，粒度分布是90百分位点小球形颗粒的容积直径与10百分位点小球形颗粒容积直径的比率小于或等于3。最优选，粒度分布是90百分位点小球形颗粒的容积直径与10百分位点小球形颗粒的容积直径的比率小于或等于2。 

几何标准偏差(GSD)也可以用于标明窄粒度分布。GSD计算包括在累积低于15.9％和84.1％时确定有效截止直径(ECD)。GSD等于低于84.17％ECD与低于15.9％ECD比率的平方根。当GSD＜2.5，更优选低于1.8时，GSD具有窄粒度分布。 

本发明优选形式中，小球形颗粒中活化剂是半结晶或非结晶性的。 

通常，用本发明方法制备的小球形颗粒基本上是无孔的，并具有大于0.5g/cm³的密度，更优选大于0.75g/cm³，最优选大于约0.85g/cm³。优选密度范围是约0.5至约2g/cm³，更优选约0.75至约1.75g/cm³，更加优选约0.85g/cm³至约1.5g/cm³。 

本发明颗粒可以显示出高含量活化剂。没有要求显著量的填充剂或类似赋形剂，而在许多其它制备颗粒方法中要求这一点。例如，胰岛素小球形颗粒包含等于或大于95重量％的颗粒。然而，填充剂或赋形剂可以包括在颗粒中。优选，活化剂存在量为颗粒的约0.1％至大于95重量％，更优选约30％至约100重量％，更加优选约50％至约100重量％，更加优选约75％至约100重量％，最优选大于90重量％。当陈述这些范围时，它们包括其中的任何范围或范围的组合。 

本发明的另一个方面是小球形颗粒保留生物化学整体性和活化剂的生物活性，包含或者不包含赋形剂。 

在活体内递送颗粒 

包含本发明活化剂的颗粒适用于在活体内用合适的途径递送所需试剂给患者，所述合适的途径例如为可注射的、局部的、口服的、直肠的、经鼻的、肺的、阴道的、口腔的、舌下的、经皮的、经粘膜的、耳的、眼内的或眼睛的。可以稳定的液体悬浮液递送颗粒，或配制成为固体剂型例如制片、囊片、胶囊剂等提供颗粒。优选递送途径是可注射的，其包括静脉内注射、肌肉内注射、皮下注射、腹膜内注射、鞘内注射、硬膜外注射、动脉注射、关节内注射等。另一中优选递送途径是肺吸入。在该递送路径中，颗粒可以沉积至肺深部、在上呼吸道中、或呼吸道中任何地方。可以用干燥粉末吸入器以干燥粉末提供颗粒，或可以用定量吸入气雾器或喷雾器提供颗粒。 

用于系统性功能的药物，例如胰岛素合乎需要地沉积在肺泡中，其中存在非常大的表面积用于有效吸收进入血液。当目标药物沉积至 肺内部某些区域时，可以通过控制颗粒的基本物理特性，例如形状、密度和粒径，将颗粒的空气动力学直径调节至最佳范围。 

经常通过将赋形剂加入至配方，或并入颗粒组合物中或作为与药物颗粒的混合物，获得吸入药物颗粒可接受的能被吸入的分数。例如，微粉化药物颗粒(约5μm)的改善分散受到与较大的惰性载体颗粒(30-90μm)例如海藻糖、乳糖或麦芽糖糊精混合的影响。较大的赋形剂颗粒改善粉末流动特性，其与改善的药效有关。另一种改进中，将赋形剂直接引入小球形颗粒，以影响雾化性能，并潜在地增强蛋白质药物的稳定性。通常，选择先前FDA批准用于吸入的赋形剂，例如乳糖，或肺内生的有机分子，例如清蛋白和外消旋α-卵磷脂二棕榈酰(DPPC)。其它赋形剂，例如聚(乳酸共乙醇酸)(PLGA)已经用于制造具有合乎需要的物理和化学特性的颗粒。然而，许多得到FDA批准的赋形剂的吸入剂已经具有哮喘药物，其具有大的空气动力学颗粒尺寸，合乎需要地沉积在气管支气管区域中，并且没有明显透入到肺深部。对于吸入蛋白质或将缩氨酸治疗递送至肺深部，存在不合乎需要的长期副作用，例如可能出现炎症和发炎，其可归因于免疫响应或赋形剂递送至肺泡区域时产生的。 

为了最小化肺深部吸入治疗的潜在有害副作用，可以有利地制备吸入剂颗粒，其基本上由要递送的药物构成。该策略将最小化肺泡暴露至赋形剂，并减少每剂量沉积在肺泡表面上的颗粒总质量，可以最小化长期采用吸入治疗的刺激。具有适用于肺深部沉积空气动力学特性的小球形颗粒基本上完全由治疗蛋白质或缩氨酸组成，其特别可用于单独研究长期治疗剂量对肺泡薄膜的影响。然后可以研究系统递送小球形颗粒形式蛋白质或缩氨酸的影响，而不伴随赋形剂引入的复杂因素。 

用吸入剂递送颗粒至肺深部的要求是颗粒具有0.5-10微米的较小平均空气动力学直径和窄粒度分布。本发明还考虑混合多批粒度范围 不同的颗粒。本发明方法可以制造具有上述特性的小球形颗粒。 

有两种形成空气动力学直径为0.5至3微米颗粒的主要方法。第一种方法是制备相对较大但是非常多孔(或穿孔)的微粒。因为空气动力学直径(D_{空气动力学})和几何直径(D_几何)之间的关系D_空气动力学等于D_几何乘以具有极低质量密度(约0.1g/cm³)的颗粒密度的平方根，可以显示出较小的空气动力学直径(0.5至3微米)，同时具有相对较高的几何直径(5至10微米)。 

替代方法是制备具有相对低孔隙率的颗粒，在本发明的情况下，颗粒具有上述范围的密度，一般地说接近1g/cm³。因此，该无孔的致密颗粒的空气动力学直径接近其几何直径。 

上述形成颗粒的方法提供存在或不存在赋形剂的情况下形成颗粒。 

从蛋白质本身制造蛋白质小球形颗粒(没有添加剂)提供优异的优点，用于肺部递送，它提供任选较大的药物有效载荷，增加安全性并降低所需吸入剂的数量。 

预制小球形颗粒的微囊化 

可以进一步将本发明小球形颗粒或从其它方法制备的小颗粒(包括微粒、微球体、纳米球体、纳米颗粒等)封装到成壁材料的基体内部，以形成微囊封装的颗粒。可以用本领域任何已知方法实现微囊化。优选实施方式中，用如下所述乳化/溶剂萃取法实现本发明小球形颗粒或任何其它小颗粒的微囊化。基体可以赋予活化剂持续的释放性能，根据需要的治疗应用，产生从分钟到小时、天或周的释放速度。微囊化的颗粒还可以产生预制小球形颗粒的延迟释放配方。优选实施方式中，预制小球形颗粒是大分子的颗粒。另一个优选实施方式中，大分子是蛋白质或多肽。 

乳化/溶剂萃取法中，实现乳化是通过混合两种不混溶的相，连续相和不连续相(其也称为分散相)，以形成乳液。优选实施方式中，连续相是含水相(或水相)，不连续相是有机相(或油相)，以形成水包油型(O/W)乳液。不连续相可进一步包含以微悬浮体或微分散体存在的固体颗粒的分散体，形成油包固体(S/O)相。有机相优选是与水不混溶或部分水混溶性的有机溶剂。有机相与水相的重量比是约1∶99至约99∶1，更优选1∶99至约40∶60，最优选约2∶98至约1∶3，或其中任何范围或其中范围的组合。优选实施方式中，有机相与水相的比率是约1∶3。本发明进一步预期利用反相乳液或油包水乳液(W/O)，其中油相形成连续相，水相形成不连续相。本发明进一步预期利用具有两种以上相的乳液，例如油/水/油乳液(O/W/O)或水/油/水乳液(W/O/W)。 

优选实施方式中，使用乳化/溶剂萃取法的微囊化方法开始于用以前描述的方法制备预制小球形颗粒和包含成壁材料的有机相。将预制小球形颗粒分散在成壁材料的有机相中，以形成油包固体(S/O)相，其在油相中含预制小球形颗粒的分散体。优选实施方式中，通过均化小球形颗粒和有机相的混合物，实现分散。含水介质形成连续相。在这种情况下，通过用水相乳化S/O相形成的乳液体系是固体/水/油(S/O/W)乳液体系。 

成壁材料是指能够单独或组合形成基体结构实体的材料。优选可生物降解的成壁材料，特别是对于可注射应用。该材料的实例包括但不局限于聚丙交酯/聚乙交酯聚合物(PLGA)、聚乙二醇配合PLGA(PLGA-PEG)和三酸甘油酯的系列。其中使用PLGA或PLGA-PEG的实施方式中，PLGA优选聚丙交酯与聚乙交酯的比率为100∶0至0∶100、更优选约90∶10至约15∶85，最优选约50∶50。通常，聚合物中聚乙交酯与聚丙交酯的比率越高，微囊化颗粒亲水性越大，导致更快的水合和更快的降解。还可以使用多种分子量的PLGA。通常，对 于聚合物中相同的聚乙交酯和聚丙交酯比率，PLGA的分子量越高，活化剂的释放越慢，微囊化颗粒尺寸分布越宽。 

水包油(O/W)或固体/油/水(S/O/W)乳液的有机相(油相)中有机溶剂可以是水不混溶的或部分水不混溶的。术语″水不混溶的溶剂″是指当以1∶1比率与水溶液(O/W)混合时形成界面为新月面形的溶剂。合适的水不混溶性溶剂包括但不局限于具有5或更高碳数的取代或未被取代的线性、支化或环烷烃，具有5或更高碳数的取代或未被取代的线性、支化或环烯烃，具有5或更高碳数的取代或未被取代的线性、支化或环炔烃；芳烃、完全或部分卤代烃、醚、酯、酮，单、二或三甘油酯，天然油剂、醇、醛、酸、胺、线性或环状硅氧烷、六甲基硅氧烷、或这些溶剂的任何组合物。卤化溶剂包括但不局限于四氯化碳、二氯甲烷、氯仿、四氯乙烯、三氯乙烯、三氯乙烷、含氢氟烃、氯苯(单、二、三)、三氯氟甲烷。特别合适的溶剂是二氯甲烷、氯仿、二乙醚、甲苯、二甲苯和乙酸乙酯。″部分水可混溶的溶剂″是指以一个浓度是水不混溶的，而在其他更低浓度下则是水可混溶的。这些溶剂具有有限的水混溶性，并能够自发形成乳液。部分水可混溶的溶剂实例是四氢呋喃(THF)、碳酸丙二酯、苯甲醇和乙酸乙酯。 

例如，可以加入表面活性化合物以增加有机相的湿润性。可在乳化过程前，将表面活性化合物加入到水相、有机相、含水介质和有机溶液，或在乳化过程后，加入到乳液。使用表面活性化合物可以降低非封装或部分封装小球形颗粒的数量，导致降低释放期间活化剂的初始破裂。取决于化合物的溶解度，可将表面活性化合物加入到水相、有机相、或水相和水相。 

术语″表面活性化合物″是指例如阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、非离子表面活性剂或生物表面活性分子的化合物。无论何种情况，表面活性化合物的存在量以水相或有机相或乳液的重量计为小于约0.01％至约30％，更优选约0.01％至约10％， 或其中任何范围或范围的组合。 

合适的阴离子表面活性剂包括但不局限于：月桂酸钾、月桂酰基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、烷基聚氧乙烯硫酸酯、海藻酸钠、二辛基硫基琥珀酸钠、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰基肌苷、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸和其盐、甘油酯、羧甲基纤维素钠、胆酸和其它胆汁酸类(例如胆酸、脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、甘氨脱氧胆酸)和其盐(例如脱氧胆酸钠等)。 

合适的阳离子表面活性剂包括但不局限于季铵化合物，例如氯化苯甲羟铵、十六烷基三甲基溴化铵、月桂基二甲基苄基氯化铵、氢氯化酰基肉碱、或卤化烷基吡啶盐。至于离子表面活性剂，可以使用磷脂。合适的磷脂包括，例如卵磷脂、脑磷酯、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、溶血磷脂、鸡蛋或大豆磷脂或其组合物。磷脂可以是盐或脱盐的、氢化或部分氢化的，或天然的、半合成或合成的。 

合适的非离子型表面活性剂包括：聚氧乙烯脂肪族醇醚(Macrogol和Brij)、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯(Polysorbates)、聚氧乙烯脂肪酸酯(Myrj)、失水山梨糖醇酯(Span)、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、聚丙二醇、鲸蜡醇、十六十八混合醇、十八烷醇、芳基烷基聚醚醇、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(poloxomers)、polaxamines、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮和多糖(包括淀粉和淀粉衍生物，例如羟乙基淀粉(HES)、甲基纤维素、羟基纤维素、羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素和非结晶纤维素)。本发明优选形式中，非离子型表面活性剂是聚氧乙烯和聚氧丙烯共聚物，优选是丙二醇和乙二醇的嵌段共聚物。该聚合物以商品名POLOXAMER销售，有时也称为PLURONIC ，并由若干供应商销售，包括Spectrum Chemical和Ruger。其中，包括具有短烷基链的聚氧乙烯脂肪酸酯。该表面活性剂的实例是SOLUTOL 

HS15、聚乙烯-660-羟基硬脂酸酯，由BASF Aktiengesellschaft制备。 

表面活性生物分子包括分子如清蛋白、酪蛋白、肝素、水蛭素、羟乙基淀粉或其它合适的生物相容的试剂。 

优选本发明形式中，水相包括蛋白质，如表面活性化合物。优选蛋白质是清蛋白。此外蛋白质可以起赋形剂作用。蛋白质不是表面活性化合物的实施方式中，乳液中可以包括其它赋形剂，在乳化过程之前或之后加入。合适的赋形剂包括但不局限于糖类、二糖和糖醇。优选二糖是蔗糖，优选糖醇是甘露糖醇。 

此外，使用通道剂，例如聚乙二醇(PEG)，可以增加最终产物的水渗透速度，其导致改进活化剂从基体的初始释放动力学以及基体的降解速度，并通过改变水合速度来改变依赖降解的释放动力学。封装期间使用PEG作为通道剂可以有利于小球形颗粒制造期间消除部分洗涤过程，其中PEG用作相分离增强剂。此外，通过使用缓冲剂改变连续相的pH可以明显增加颗粒表面和有机相之间的润湿过程，因此导致封装治疗剂从微囊化颗粒基体初始破裂的明显减少。此外例如通过加入盐例如NaCl增加其盐度可改变连续相的性能，以降低两相的溶混性。 

在有机相(油相)中分散小球形颗粒后，通过例如均化或超声处理剧烈混合含水介质(水相)的连续相和有机相的不连续相，以形式包含未成熟微囊化颗粒的乳化液滴的乳液。可以在混合水相和有机相之前，用有机相中使用的有机溶剂饱和连续水相，以最小化从乳化液滴快速萃取有机溶剂。可以在混合物能保持其液体性能的任何温度下进行乳化过程。乳化稳定性是有机相或水相表面活性化合物浓度的函数，或如果在乳化过程后将表面活性化合物加入到乳液中时，是乳液中表面活性化合物浓度的函数。这是确定乳液体系(未成熟微囊化颗粒)的液滴尺寸和微囊化颗粒尺寸和粒度分布的一个因素。其它影响微囊化颗粒粒度分布的因素是连续相的粘度、非连续相的粘度、乳化期间 的剪切力、表面活性化合物的类型和浓度以及油/水比率。 

乳化后，将乳液转移进入硬化介质。硬化介质从未成熟微囊化颗粒萃取非连续相中的溶剂，导致在乳化液滴边缘内预制小球形颗粒周围形成具有固体聚合物基质的固体微囊化颗粒。在O/W或S/O/W体系的实施方式中，硬化介质是含水介质，其可以包含表面活性化合物、或增稠剂、或其它赋形剂。微囊化颗粒优选是球形，并具有约0.6至约300μm的粒径，更优选约0.8至约60μm。另外，微囊化颗粒优选具有窄粒度分布。为了减少不连续相的萃取时间，可以对硬化介质施加热或减压。从未成熟微囊化颗粒的不连续相萃取速度是最终固态微囊化颗粒中孔隙度的重要因素，因为例如通过蒸发(沸腾效果)快速除去不连续相导致破坏基体的连续性。 

优选实施方式中，以连续方式代替间歇法进行乳化过程。图41描述了连续乳化反应器的设计。 

另一个优选实施方式中，进一步通过离心和/或过滤(包括透滤法)，并用水洗涤得到硬化的成壁聚合物基体，封装有活化剂的小球形颗粒。可以进一步通过例如冷冻干燥法或蒸发法除去残余的液相。 

A.胰岛素小球形颗粒 

实施例1：制备胰岛素小球形颗粒的一般方法 

制备包含16.67％PEG 3350、缓冲(0.033M乙酸钠缓冲液)至pH5.65的溶液。搅拌的同时，将锌结晶胰岛素的浓缩浆液加入到该溶液。最终溶液内的胰岛素浓度是0.83mg/mL。将溶液加热到约85至90℃。在该温度范围下5分钟内胰岛素晶体完全溶解。当以受控速度降低溶液的温度时，在约60℃开始形成胰岛素小球形颗粒。随着PEG浓度的增加，产率增加。该方法得到具有多种粒度分布的小球形颗粒，其粒度分布平均值为1.4μm。 

在小球形颗粒不溶解的条件下，经过透滤法洗涤微球体，从PEG分离形成的胰岛素小球形颗粒。使用包含Zn²⁺的水溶液，将胰岛素小球形颗粒洗出悬浮液。Zn²⁺离子降低胰岛素的溶解度，并防止溶解的发生，因为溶解会降低产率并导致小球形颗粒聚集。 

实施例2：制备胰岛素小球形颗粒的非搅拌间歇法 

在室温下将20.2mg锌结晶胰岛素悬浮在1毫升去离子水中。将50微升0.5N HCl加入到胰岛素中。加入1毫升去离子水，以形成10mg/mL的锌结晶胰岛素溶液。在50mL 100毫摩尔乙酸钠缓冲液(pH5.7)中溶解12.5g聚乙二醇3350(Sigma)和12.5g聚乙烯基吡咯烷酮(Sigma)。用乙酸钠缓冲液将聚合物溶液体积调节至100mL。向在eppendorf离心管内的800微升聚合物溶液中加入400微升的10mg/mL的胰岛素溶液。混合后胰岛素/聚合物溶液变浑浊。使用水代替聚合物溶液制备对照物。在90℃水浴中不混合或不搅拌条件下加热eppendorf离心管30分钟，然后移去，并放置在冰块上10分钟。从90℃水浴移去时，胰岛素/聚合物溶液是澄清的，但随着冷却开始变混浊。不含聚合物的对照物在整个实验中保持澄清。通过离心法从胰岛素/聚合物管收集颗粒，随后洗涤两次除去聚合物。冷冻干燥水中最终的悬浮液，以得到干燥粉末。得自胰岛素/聚合物管的冷冻干燥颗粒的扫描电镜分析显示出小球形颗粒在直径约为1微米均匀分布。颗粒的Coulter光散射粒度分析显示出窄粒度分布，平均粒度为1.413微米，0.941-1.88微米95％的置信度，标准偏差0.241微米。没有聚合物或洗涤步骤但以相同方式进行其它处理和冷冻干燥的胰岛素对照物在扫描电镜下显示出仅有薄片(没有颗粒)，外观类似于冷冻干燥蛋白质后通常获得的外观。 

实施例3：制备胰岛素小球形颗粒的连续流通法 

称出36.5mg胰岛素，并悬浮于3mL去离子水中。加入30μL浓度为1N的HCl以溶解胰岛素。用去离子水将溶液的最终体积调节为3.65mL。然后将7.3mL PEG/PVP溶液(25％PEG/PVP在100mM NaOAc缓冲液中，pH 5.6)加入到胰岛素溶液中，使得胰岛素溶液最终总体积为10.95mL。然后旋转溶液，以得到胰岛素和PEG/PVP的均匀悬浮液。 

通过Teflon 

管(TFE 1/32″内径挠性管)将胰岛素悬浮液连接到运行速度为0.4mL/min的BioRad蠕动泵。从泵引出的管路在插入浸于冰块中的收集管之前，浸入保持在90℃的水浴中。当胰岛素溶液的温度从水浴中约90℃降低到冰块中收集管约4℃时，形成胰岛素小球形颗粒。图7是该过程的示意图。对于10.95mL的体积，该过程的总运行时间是35分钟。收集小球形颗粒后，在Beckman J6B离心机中以3000rpm离心所述收集管20分钟。之后，完成水洗，并以2600rpm离心所述小球形颗粒状物15分钟。以1500rpm离心最终的水洗物15分钟。移去等分试样用于粒度分析。在-80℃下冷冻，并冷冻干燥2天。 

用Beckman Coulter LS 230颗粒计数器，测定体积粒度是1.397μm，表面积粒度是1.119μm，数量粒度是0.691μm。扫描电子显微照片显示出均匀尺寸和非聚集的胰岛素小球形颗粒(图8)。 

可以使用连续流通法制备小球形颗粒，其中将胰岛素溶液短时间暴露至90℃。该方法产生最终组合物，其用高效液相色谱(HPLC)测定为90％蛋白质(图9)。HPLC分析还表明溶解的小球形颗粒具有约4.74分钟的洗脱时间，没有明显不同于胰岛素标液或天然胰岛素原材料的洗脱时间，表明加工成为小球形颗粒后保持了胰岛素的生物化学完整性。 

实施例4：制备胰岛素小球形颗粒的换热器间歇法 

通过超声振荡法将人类的锌结晶胰岛素悬浮在最少量去离子水中，确保完全分散。将胰岛素悬浮液加入到预加热至77℃的搅拌缓冲聚合物溶液(在25℃，pH 5.65)中，使得在0.1M乙酸钠缓冲液中最终溶质浓度为0.83％的锌结晶胰岛素、18.5％的聚乙二醇3350、0.7％的 氯化钠。随着结晶胰岛素溶解，最初浑浊的混合物在三分钟内变为澄清。澄清后立即将所述溶液转移到用作换热器的玻璃制水夹套色谱柱中(柱内径：25mm，长度：600mm；Ace Glass Incorporated，Vineland，NJ)。垂直放置所述玻璃柱，热交换流体在柱底部进入水套，并在顶端流出。为了记录体系的热交换性能，在所述柱顶部和底部的胰岛素配方液体中心放置热电偶(类型J，Cole Parmer)，并在初步试运行期间获得冷却温度分布图。进行该实验的六个批次期间移去热电偶，以便不引入外部表面变化。 

将换热器预加热到65℃，并以某种方式将胰岛素缓冲聚合物溶液转移，所述方式使溶液温度不下降到低于65℃，并且没有气泡被引入所述溶液。在换热器中平衡透明溶液4分钟，使其达到65℃后，将热交换流体从65℃供应转换到15℃供应。经过20分钟将换热器中胰岛素配方平衡到15℃。随着温度从60℃下降到55℃，形成胰岛素小球形颗粒，产生均匀、稳定的乳白色悬浮液。 

用透滤法(A/G Technologies，750,000 MWCO超滤柱)以5体积的0.16％醋酸钠-0.026％氯化锌缓冲液，pH7.0，从聚乙二醇分离胰岛素小球形颗粒，随后浓缩至初始体积的五分之一。进一步通过透滤法以5体积的去离子水洗涤胰岛素小球形颗粒悬浮液，随后冷冻干燥以除去水。透滤法期间(来自膜表面上颗粒的极化填充)和冷冻干燥期间(来自冷冻之前小球形颗粒的沉淀)，小心防止小球形颗粒聚集。干燥小球形颗粒是易流动和随时可使用的，不需要脱聚集或筛分。 

胰岛素的小球形颗粒 

上述公开的方法从锌结晶胰岛素不加入赋形剂的情况下制备均匀尺寸的球形颗粒。用该方法制备的小球形颗粒具有用飞行时间(Aerosizer^TM)和安得生级联碰撞仪测量的优异空气动力学特性，当从简单广泛使用的干燥粉末吸入器(Cyclohaler^TM)递送时，具有肺深部递送的高可吸入部分指标。通过使用胰岛素作为模板蛋白质，我们还能 使用现有的U.S.P.方法检查所述过程对蛋白质化学完整性的影响。 

用偏振光显微术(Leica 

，Buffalo，NY)和扫描电子显微镜(AMRAY 1000，Bedford，MA)成像干燥粉末胰岛素小球形颗粒。使用 Model 3292颗粒分选系统进行粒度分析，该系统包括Model 3230 干燥粉末分散器，用于将粉末引入至仪器(TSI Incorporated，St.Paul，MN)。通过比较Aerosizer产物与电子显微照片，可确定单个颗粒的尺寸。 

依据Insulin Human(USP 26)的USP专题论文，用HPLC测定过程前后胰岛素的化学完整性。利用等浓度SEC HPLC方法，使用紫外线检测在276nm测量胰岛素和高分子量蛋白质含量。为了测量胰岛素、A-21脱酰氨胰岛素和其它胰岛素相关物质，利用USP渐变反相HPLC方法分析样品。使用紫外线检测在214nm测量胰岛素含量。分析高分子量蛋白质、脱酰氨胰岛素和其它胰岛素相关物质，以数量测定由过程引起的任何化学降解。 

使用 

仪器，检查胰岛素小球形颗粒的空气动力学特性。使用具有低剪力、中等进料速度和标准解凝聚作用的AeroDisperser附件对胰岛素干燥粉末进行粒度分布测量。仪器的软件将飞行时间数据转换为尺寸，并将其放入对数坐标范围。每个尺寸库中检测的颗粒数用于统计分析，每个尺寸库中检测的颗粒总体积也用于统计分析。体积分布比数量分布更着重于较大的颗粒，因此在检测非分散颗粒聚集体和较大的颗粒时更灵敏。 

安得生级联碰撞计装置由预隔板、九个载物台、八个收集板和备用过滤器组成。载物台标记为-1，-0，1，2，3，4，5，6，F。载物台-1仅为孔板载物台。载物台F包含载物台6的收集板和备用过滤器。用食用级硅氧烷薄层涂布所述不锈钢收集板，以防止颗粒″弹起″。将经过取样器60 LPM空气流速的样品流用于分析。称重大约10mg的 准确称重样品至每个淀粉胶囊(Vendor)，使粉末在4秒钟内从Cyclohaler以气溶胶递送。依据对于人胰岛素的USP 26分析，用反相HPLC在214nm检测，测定每个板上沉积的胰岛素粉末量。 

用Sigma绘图软件，使用累积小于质量百分数对有效截止直径(ECD)的概率拟合，计算质量中值空气动力学直径(MMAD)。喷射量(ED)测定为沉积进入级联碰撞仪的胰+素的总观测质量。这表示为载入Cyclohaler胶囊的胰岛素小球形颗粒的质量百分数。 

结果表明小心控制过程参数与相转变配方可以产生：1)直径约2μm的主要为球形的颗粒；2)窄粒度分布；3)每批次间可重现的空气动力学特性；和4)由超过95％的活性药物(人胰岛素)组成的除去残留水分的小球形颗粒。我们确定可以用溶解温度、pH、聚合物浓度和离子强度控制锌结晶胰岛素的溶解度。我们还发现控制相转变期间的冷却速度是能够形成在窄尺寸范围内主要为球形颗粒的重要参数。 

图2是该实施例方法的冷却温度分布图。使用垂直放置的水套型色谱柱测量所述分布，换热流体在柱底部进入水套，并在顶部流出。在柱中放置两个热电偶，并与所述溶液接触。一个热电偶放置在柱顶部，第二个在柱底部。温度曲线将时间温度图分为不同的区域，其中在前优化实验确定高于或低于最佳温度变化速度引发的相转变倾向于导致较宽的颗粒尺寸范围和非球形形状。在大于60℃的温度，胰岛素保留可溶于缓冲聚合物溶液(区域A；图2)。当温度以约8.6℃/分钟至26.5℃/分钟的速度降低时，形成最佳的均匀尺寸，有利于球形颗粒(区域B；图2)。如果对所述配方施加快于25.6℃/分钟的冷却速度，存在产生非常细(小于0.5微米)的胰岛素非球形颗粒的倾向，该胰岛素的非球形颗粒易于聚集(区域C；图2)。慢于8.6℃/分钟的冷却速度倾向于产生较宽的胰岛素小球形颗粒粒度分布，以及非球形形状和无定形的絮状沉淀(区域D；图2)。 

当换热器中胰岛素缓冲聚合物溶液的温度落在图2的区域B内时，出现相转变产生胰岛素小球形颗粒乳白色稳定的悬浮液。随着温度降低至低于60℃，开始出现表明形成微球体的相分离，当温度达到40℃时看起来结束。在用透滤法洗涤以移去PEG聚合物之前，随着配方冷却至15℃，在观察的悬浮液中没有进一步的变化。 

而起始人锌结晶胰岛素原料的SEM显示出非均匀尺寸和颗粒尺寸大约5至40μm的结晶形状，该实施例一个批次的SEM照片显示出球形和均匀尺寸的胰岛素小球形颗粒(图3b)。由SEM图解的颗粒形状和尺寸表示该实施例制备的其它五个批次。 

然后通过透滤法洗涤和从去离子水悬浮液冷冻干燥，从缓冲聚合物分离，干燥粉末胰岛素小球形颗粒是相对易流动的，并且容易称重和处理。与起始锌结晶胰岛素原料的12％相比，胰岛素小球形颗粒水分含量为2.1至4.4％水份。用HPLC化学分析胰岛素小球形颗粒表明胰岛素极少由于该方法化学降解(图4)，高分子化合物没有增加。尽管二聚物％、A₂₁脱酰氨胰岛素％、后洗脱峰％和其它化合物％增加(相对于起始胰岛素原料)，但全部六个批次结果均在USP限定范围内。与起始原料28.7IU/mg相比，胰岛素效能保持为28.3至29.9IU/mg。该方法中使用的聚合物(聚乙二醇)残余浓度低于0.13％至检测不到，这表明聚合物不是胰岛素小球形颗粒的重要成分。 

胰岛素小球形颗粒空气动力学特性的批次间可重现性 

由Aerosizer和安得生级联碰撞仪数据表明，六个单独的胰岛素批次具有优异的空气动力学特性可重现性。对于全部六个批次，Aerosizer数据表明超过99.5％的颗粒在0.63至3.4μm尺寸范围内，最少60％的小球形颗粒在1.6至2.5μm的窄尺寸范围内(图5)。统计上，数据表明制备的至少99％胰岛素小球形颗粒批次具有至少96.52％的颗粒在0.63至3.4μm尺寸范围内的置信度为95％(-68.5％至70％的目标直径2μm)。 

安得生级联碰撞计数据较好地符合Aerosizer数据，除了从Cyclohaler传递的平均17.6％的量沉积在装置的开口和预隔板/喉管中(图6)。该数据说明Aerosizer粉末的分散效率大于Cyclohaler设备。然而，六个批次的平均喷射量为来自Cyclohaler的71.4％，72.8％的喷射量沉积在冲击器的载物台3上。如果肺深部递送的可吸入部分估计是ECD在1.1至3.3微米之间的部分，那么平均60.1％的吸入胰岛素小球形颗粒可以有效用于肺深部递送和随后的系统吸收。该方法的优异可重现性列于表1，其中六个单独批次的MMAD和GSD平均值的标准偏差值非常低。这表明过程变量在严格控制之下，导致批次间的空气动力学特性均匀。 

表1：胰岛素小球形颗粒的空气动力学特性 

参数	MMAD(μm)	GSD(μm)	载物台2-F％  (ECD 3.3μm)	载物台3-F％  (ECD 2.0μm)	喷射剂量  (％)
						平均值	2.48	1.51	88.8	72.8	71.4
SD	0.100	0.064	4.58	4.07	5.37

表1显示出胰岛素小球形颗粒的空气动力学特性。从在安得生级联碰撞仪上分析单独的胰岛素小球形颗粒批次(N＝6)计算得到结果(平均值+/-SD)。MMAD和GSD非常低的标准偏差表明该方法的可重现性很好。 

表1中空气动力学数据证明，用该冷却方法制备的胰岛素小球形颗粒显示出很小的聚集倾向。 

实施例5：制备胰岛素小球形颗粒的搅拌容器法 

将2880mL缓冲聚合物溶液(18.5％聚乙二醇3350、0.7％氯化钠，在0.1M醋酸钠缓冲液中，在2℃ pH5.65)加入到玻璃制3升水套搅拌容器，其预加热至75℃。用声波振荡在80mL缓冲聚合物溶液中悬浮2.4克人锌结晶胰岛素，以确保完全分散。将胰岛素悬浮液加入到 搅拌预热的缓冲聚合物溶液中，并再搅拌5分钟。在该过程澄清的混合物表明锌结晶胰岛素已经溶解。将来自设置为10℃的冷却器的水经由容器夹套泵出，直至胰岛素聚合物溶液下降至15-20℃。以pH为7.0的5体积0.16％醋酸钠-0.026％氯化锌缓冲液、随后用5体积去离子水透滤得到的悬浮液，随后冷冻干燥以除去水。对冷冻干燥粉末的SEM分析显示出用TSI Aerosizer飞行时间分析，均匀小球形颗粒的空气动力学直径为1.433微米。安得生级联碰撞仪分析得到73％喷射量沉积在载物台3上至过滤器，MMAD 2.2，GSD 1.6，全部都表明粉末的优异空气动力学特性。 

实施例6：通过调节小球形颗粒制备配方的离子强度，减少形成胰岛素降解产物 

还可以在更低的起始温度例如75℃，将胰岛素溶解在溶液中，没有延长时间周期或酸性环境，但是通过将NaCl加入至溶液，产生明显的聚集。 

使用下列技术实现改进胰岛素小球形颗粒制造方法。将锌结晶胰岛素的浓缩浆液(在室温下)加入(同时搅拌)至16.7％聚乙二醇在0.1M醋酸钠中的溶液，pH 5.65，预热至约85至90℃。在5分钟内该温度范围下胰岛素晶体完全溶解。随着溶液温度降低，形成胰岛素小球形颗粒。 

由于在85-90℃的起始温度出现的化学反应，通过升温显著形成A₂₁脱酰氨胰岛素和胰岛素二聚物。然而，这要求在75℃下延长时间周期。该延长时间还产生明显的胰岛素降解。在酸性环境中预溶解胰岛素还导致大部分胰岛素不希望地转化为A₂₁脱酰氨胰岛素降解产物。 

实验中，将氯化钠加入至缓冲聚合物反应混合物，以减少通过化学方式形成胰岛素二聚物。尽管加入的氯化钠没有明显减少形成脱酰 氨或二聚物胰岛素降解产物，但加入氯化钠极大地减少了形成低聚物(高分子量胰岛素产物)(表2)。 

表2： 

此外，锌结晶胰岛素在NaCl的存在下比没有NaCl的对照物溶解快许多。这说明加入氯化钠改进胰岛素的溶解速度，并可以降低用于最初溶解胰岛素锌晶体的温度。该假设在试验中得到证实，表明将0.7％NaCl加入至配方，可以令锌结晶胰岛素原料以75℃在5分钟内溶解，该温度是比没有NaCl加入预先要求的87℃明显较低的温度。在75℃，没有NaCl时，胰岛素在13分钟后还没有完全溶解。 

一系列实验表明增加氯化钠浓度(2.5mg/ml、5.0mg/ml、10.0mg/ml和20.0mg/ml)进一步降低胰岛素晶体溶解的温度，也降低了小球形颗粒开始形成的温度(图10a-d)。另外，确定配方中NaCl的浓度增加很快地溶解高浓度的锌结晶胰岛素。因此证实通过调节初始连续相的氯化钠浓度，可以小心地控制在指定温度下胰岛素的溶解度。这使得可以在不利于形成降解产物的温度下进行该方法。 

为了确定氯化钠是否具有可以降低溶解胰岛素温度的独特化学性质，将氯化铵和硫酸钠的当量分子浓度与具有氯化钠的对照物比较。NH₄Cl和Na₂SO₄都类似地降低溶解锌结晶胰岛素原料需要的温度。高离子强度看起来增加胰岛素在微球体制备配方中的溶解度，随着溶液温度降低，不会影响形成小球形颗粒的能力。 

实施例7：研究PEG浓度对产率和胰岛素浓度和胰岛素小球形颗粒尺寸的影响 

聚乙二醇(3350)滴定数据表明PEG-3350的增加也增加了小球形颗粒的产率。然而，当PEG浓度过高时，颗粒损失其球形度，这抵消了产率的轻微增加。 

胰岛素浓度数据表现出与PEG相反的趋势，其中胰岛素浓度增加导致小球形颗粒的产率降低。 

我们确实观察到这样的一般趋势，即，高浓度胰岛素产生大直径小球形颗粒。该实验中，高浓度也导致非球形颗粒与小球形颗粒的混合。 

实施例8：用狗研究胰岛素小球形颗粒 

该实验研究的目的是对沉积在长耳短腿小猎犬肺中的雾化胰岛素粉末进行定量和可视化实验。根据此处公开方法制备^99mTc示踪的胰岛素颗粒。使用γ闪烁法评估雾化胰岛素的肺沉积。 

五只长耳短腿小猎犬用于该研究，每只动物接受^99mTc放射性同位素示踪的胰岛素颗粒烟雾剂给药。狗标示号码是101、102、103、104和105。 

烟雾剂给药之前，通过麻醉注入线用异丙酚麻醉动物，并在每个烟雾剂递送用动物中放置气管内导管。 

每只狗放置在用于吸入放射性同位素示踪的烟雾剂的″Spanglerbox″腔中。放射性同位素示踪的烟雾剂给药后，立即获得胸部前面和后面的γ照相机计算机图像。 

评估两个体外级联式碰撞仪收集物，一个在第一只动物(101)烟雾剂给药之前，另一个在最后一只动物(105)给药之后，以确定^99mTc放射性同位素示踪的胰岛素粉末的稳定性。 

结果图解于图11。两种情况的级联碰撞仪收集物表现出一致的模式分布。 

图12显示出全部动物的P/I比率计算结果。P/I比率是沉积在肺外围部分(即肺深部)中的^99mTc胰岛素粉末的比例度量。典型的P/I比率可能是约0.7。高于0.7的P/I比率表明与肺中央或支气管区域相比，在外围肺中明显沉积。 

图13中闪烁图像表明呼吸系统内胰岛素沉积位置，并且与P/I数据一致。(图12)狗101的闪烁图像代表该研究中的全部五只狗。 

狗101的闪烁图像显示出很少的气管或支气管沉积，外围肺中沉积明显增加。肺外部放射性应归于^99mTc迅速吸收肺深部沉积的雾化粉末。 

P/I比率和图像数据表明^99mTc放射性同位素示踪的胰岛素主要沉积在肺深部中。沉积进入肺外围的放射性同位素示踪胰岛素量表现出低水平的颗粒聚集。 

实施例9：用含锌的缓冲液进行透滤法，以从胰岛素小球形颗粒除去聚合物 

在PSEA溶液中制造胰岛素小球形颗粒后，合乎需要的是冷冻干燥之前从悬浮液除去全部PSEA。即使一些百分率的残余PSEA可以作为粘合剂，以形成不易碎的小球形颗粒聚集体。该聚集将不利地影响从DPI设备传递的粉末的喷射量和空气动力学特性。此外，肺组织暴露至重复剂量的PSEA可能增加毒理学问题。 

冷冻干燥之前，考虑三种技术用于从PSEA分离小球形颗粒。过滤可用于收集少量颗粒。然而，大量小球形颗粒快速阻塞过滤介质的细孔，使得洗涤并回收几毫克以上颗粒不切实际。 

离心收集颗粒，随后通过包括在洗涤溶剂中再悬浮和再离心的几个洗涤循环，以成功地除去PSEA。去离子水用作洗涤溶剂，因为胰岛素小球形颗粒不易于溶解，并且PSEA保留在溶液中。离心的一个缺点是小球形颗粒通过旋转降低颗粒所需的高g-力压缩成小球。各自连续洗涤后，变得更加难以将小球再悬浮成为离散颗粒。胰岛素颗粒的聚集经常是离心方法所不希望有的副作用。 

使用空心纤维处理柱的透滤法用作洗涤胰岛素小球形颗粒的离心法的替代方法。常规的透滤法装置中，在密封容器中放置缓冲PSEA/胰岛素颗粒悬浮液，并用足够的背压使悬浮液再循环通过纤维，使滤液通过空心纤维膜。最优化再循环速率和背压，以防止阻塞(极化)薄膜的细孔。通过虹吸洗涤溶剂进入搅拌的密封容器，连续补充从悬浮液除去的滤液体积。透滤法期间，悬浮液中PSEA的浓度逐渐降低，在1小时左右时间内，用5-7倍的洗涤溶剂交换悬浮液原始体积后，胰岛素小球形颗粒悬浮液基本上没有PSEA。 

尽管透滤法除去聚合物非常有效，并且按比例增加至商业量非常可行，但胰岛素小球形颗粒缓慢溶解在最初用作洗涤溶剂的去离子水中。实验证实胰岛素逐渐损失在滤液中，并且在交换相当于20倍悬浮液原始体积的去离子水后，胰岛素颗粒将完全溶解。尽管发现胰岛素小球形颗粒微溶于去离子水中，但透滤法高效不断地从悬浮液除去可溶胰岛素，并可能除去锌离子。因此，伴随着透滤法没有出现指定体积去离子水中不溶和可溶胰岛素浓度之间的平衡，该情况有利于溶解胰岛素。 

表3显示出评估作为可能的洗涤介质的多种溶液。在1mL每种溶液中悬浮10毫克干燥胰岛素小球形颗粒，并在室温下温和地混合48小时。在24和48小时测量可溶胰岛素的百分比。发现胰岛素微溶于去离子水，在少于24小时内，在胰岛素总重量1％以下刚好达到平衡。然而，如预先注释，高效率透滤法连续除去可溶胰岛素(和锌)，使得总不能达到平衡，并且胰岛素小球形颗粒继续溶解。因此，理想洗液中胰岛素溶解度将低于在水中的溶解度。因为胰岛素在其等电位点附近可溶性最小，测试在2摩尔浓度和pH 5.65的乙酸酯缓冲剂。发现胰岛素的溶解度取决于缓冲液的摩尔浓度，并且在低摩尔浓度时可与水相比较。乙醇极大地降低了胰岛素的溶解度，但是仅在无水浓度附近。当透滤法最初阶段中，乙醇与水溶液混合用于PSEA/胰岛素小球形颗粒悬浮液时，实际上胰岛素溶解度将增加。 

表3胰岛素小球形颗粒在多种洗涤溶液中的溶解度 

洗涤溶液	24小时后溶解的胰岛素  ％	48小时后溶解的胰岛素  ％
			去离子水	0.91	0.80
0.1M乙酸钠，pH 5.65	2.48	2.92
			0.001M乙酸钠，pH 5.65	0.54	0.80
0.16％乙酸钠-0.016％ZnO，pH 5.3	0.14	0.11
			0.16％乙酸钠-0.027％ZnCl<sub>2</sub>，pH 7.0	0.09	0.06
50％乙醇/去离子水(v/v)	9.47	9.86
			100％无水乙醇	0.05	0.04

注射用商业锌-结晶胰岛素悬浮液的缓冲溶液还在溶液中包含锌。用胰岛素小球形颗粒测试这两种溶液，并发现与去离子水相比极大地降低胰岛素溶解度。依据该文献，锌结晶胰岛素应该具有2至4个锌离子结合至每个胰岛素六聚物。对于用作制备胰岛素小球形颗粒原料的多种锌结晶胰岛素制剂每六聚物锌离子为1.93至2.46。这相当于每指定重量的原料锌结晶胰岛素0.36至0.46％的锌。在形成胰岛素小球形颗粒并以去离子水透滤后，处理期间损失58至74％的锌。从胰岛素颗粒损失锌将增加胰岛素的溶解度和透滤期间的损失。 

以pH7.0，0.16％醋酸钠-0.027％ZnCl₂透滤胰岛素小球形颗粒，几乎消除了滤液中胰岛素损失。然而令人吃惊地，胰岛素小球形颗粒的锌含量增至接近2％，远远超过起始锌结晶胰岛素原料测量的0.46％。对包含锌缓冲剂进行透滤法的另一个意外结果是从CyclohalerDPI设备观察到的喷射量显著改善(以去离子水透滤68％，相对于锌缓冲液透滤后的84至90％)，并且沉积在安得生级联碰撞仪喉管中的胰岛素颗粒量减少。锌缓冲透滤法改善胰岛素小球形颗粒干燥粉末的分散性并减少颗粒的聚集，导致更低的MMAD和在碰撞仪下一级上更高的沉积。这说明锌缓冲透滤法和胰岛素小球形颗粒中高的锌含量可以改善沉积在肺深部中的剂量百分率。 

当悬浮在推进剂HFA-134a中不加入赋形剂以用于MDI应用时，没有明显的锌缓冲洗涤的胰岛素小球形颗粒的不可逆聚集。胰岛素颗粒在不到一分钟内从悬浮液絮凝出，但是当使用前摇动时易于再悬浮。使用前摇动MDI容器通常是使用任何MDI产物说明的一部分。实际上，留在MDI容器底部的松散絮凝颗粒实际上可以抑制胰岛素颗粒的长期聚集(除了由于其球形的最少接触)，因为颗粒没有沉到MDI加压容器底部上的致密填充层。因此，由胰岛素小颗粒的锌缓冲透滤法赋予的性能可以改善用于胰岛素和其它芯结合化合物的MDI制品的长期贮藏寿命和分散性。 

因为用XRPD分析发现胰岛素小球形颗粒是非结晶的，所以，锌结合与胰岛素单体的锌离子配合形成六聚物无关。因此，离子的非特定结合和可能产生的益处可扩展到除锌以外的离子结合。没有结合锌的不同蛋白质可以结合其它离子，这可降低透滤过程中的溶解度，并赋予类似的有益效果。 

以10mg/mL的浓度在Hydro Fluro Alkane(HFA)134a推进剂中悬浮小球形颗粒。在HFA 134a中储存0时间和一个月后评估胰岛素的 化学稳定性。图28中显示数据就单体胰岛素、胰岛素二聚物、胰岛素低聚物、胰岛素主峰和A₂₁-脱酰氨胰岛素表明胰岛素微球体的保存。 

下列研究中，使用安得生级联碰撞仪比较根据实施例4的方法制备的胰岛素小球形颗粒在三种不同吸入设备中的性能。Cyclohaler设备是商业的干粉吸入器(DPI)，Disphaler是另一种干粉吸入器，定量吸入器(MDI)是其中微球悬浮在该实施例中描述的HFA 134a中，并推进通过100微升或其他尺寸计量阀的设备。图29中结果清楚地表明碰撞安得生级联碰撞计仪载物台的小球形颗粒沉积在载物台3和4上。这说明不管实用何种设备用作吸入器，小球形颗粒具有非常好的可重现性。DPI和MDI设备间的唯一主要差异是使用MDI明显更大量的小球形颗粒沉积在安得生级联碰撞仪的喉部剖面。MDI设备推进小球形颗粒向Andersen撞击仪喉管的高速度说明与DPI设备相比，胰岛素微球体沉积比例更高。本领域技术人员可以假定具有减弱或改进出口速度的MDI设备可用于降低沉积在喉管中的小球形颗粒的数量。在MDI结束时其他的测量可为使用间隔设备。 

根据该实施例中公开的方法从冷冻干燥胰岛素原料制备胰岛素小球形颗粒(批号YQ010302)。在25℃和37℃胰岛素小球形颗粒的一年储存稳定性与冷冻干燥胰岛素原材料比较。通过检验全部相关胰岛素化合物、胰岛素二聚物和低聚物以及A₂₁-脱酰氨胰岛素，比较胰岛素的稳定性。 

图30-35表明经过一年时间，胰岛素小球形颗粒显示出胰岛素二聚物和低聚物A₂₁-脱酰氨胰岛素和全部相关胰岛素化合物的数量明显降低，并与相同条件下储存的胰岛素原材料比较。这表明微球体形式的胰岛素明显比原材料对化学变化更稳定。 

在制备后0时间和10个月时在安得生级联碰撞仪中测试胰岛素小球形颗粒。长期储存后，Cyclohaler DPI设备用于测定空气动力稳 定性。图36表明10个月储存后空气动力性能明显保持一致。 

进行拉曼分光镜研究以说明未加工胰岛素样品和该实施例中制备的小球形颗粒中胰岛素之间的结构差异。结果表明小球形颗粒中的胰岛素基本上具有比它们本来未加工的胰岛素样品更高的β-薄片含量，和因而更低的α-螺旋状物含量。这些发现与小球形颗粒中聚集微纤维结构的形成一致。然而，当溶解在含水介质中时，光谱揭示由未加工微球体或胰岛素产生基本上相同的蛋白质结构，表明溶解时微球体中任何结构变化完全是可逆的。 

使用拉曼光谱学测试两批胰岛素：A)未加工的胰岛素USP(Intergen，Cat N.4502-10，批号XDH 1350110)和B)小球形颗粒中的胰岛素(JKPL072502-2 NB 32：P.64)。将粉末状样品或胰岛素溶液(约15mg/mL，在0.01M HCl中)装入标准玻璃毛细管，并恒温在12℃用于拉曼分析。通常，2-15μL等分试样足够填充暴露于激光照射的样品毛细管部分。在514.5nm用氩激光器(Coherent Innova 70-4Argon Ion Laser，Coherent Inc，Santa Clara，CA)激发光谱，并记录在具有光子计数检测器(型号R928P，Hamamatsu，Middlesex，NJ)的双重扫描光谱计上(Ramalog V/VI，Spex Industries，Edison，NJ)。以1.5秒的积分时间和8cm^-1的谱隙宽，以1.0cm^-1间距收集数据。重复扫描样品，平均之前显示并检查单一扫描。通常，收集每个样品的至少4次扫描。用茚和四氯化碳校准光谱计。使用SpectraCalc和GRAMS/AI第7版软件(Thermo Galactic，Salem，NH)，以数字差分法比较光谱。校正溶剂(如果存在)和背景对光谱的贡献。通过在相同条件下获得0.01M HCl的光谱，并用位于倾斜背景的一系列五个重叠Gaussian-Lorentzian作用进行拟合来校正溶液光谱[S.-D.Yeo，P.G.Debenedetti，S.Y.Patro，T.M.Przybycien，J.Pharm.Sci.，1994，83，1651-1656]。在1500-1800cm^-1区域进行拟合。 

获得粉末状胰岛素样品和其各自溶液的拉曼光谱(图10i)。未加工 样品的光谱很好地符合预先公开的商业胰岛素样品光谱。[S.-D.Yeo，P.G.Debenedetti，S.Y.Patro，T.M.Przybycien，J.Pharm.Sci.，1994，83，1651-1656；J.L.Lippert，D.Tyminski，P.J.Desmueles，J.Amer.Chem.Soc.，1976，98，7075-7080]。小球形颗粒样品显示出在酰胺I模式的明显迁移(约+10至+15cm^-1)，表明蛋白质的二级结构显著扰动。然而特别是，当样品溶解在含水介质中时，商品粉末和小球形颗粒的光谱基本上是相同的，表明加工时二级结构的变化是完全可逆的。 

使用运算法则估算次级结构参数，其中运算法则包括平滑、减去荧光和芳族背景，以及酰胺I带去卷积法。如在别处公开的基本上减去荧光指数衰变[S.-D.Yeo，P.G.Debenedetti，S.Y.Patro，T.M.Przybycien，J.Pharm.Sci.，1994，83，1651-1656]。在表4中收集估算的结构参数。 

表4从拉曼光谱估算的胰岛素样品结构参数。 

样品	总α-螺旋结构含 量，％	总β-薄片含 量，％	β-反转， ％	随机卷曲，  ％
					未加工粉末	44	31	14	11
溶液中未加工胰岛素	44	28	11	17
					小球形颗粒，粉末	11	67	15	7
溶液中小球形颗粒	44	30	11	15

实施例10：用等温方法制备人胰岛素小球形颗粒 

在NaCl和PEG(MW 3350，Spectrum批号RP0741)溶液中分散人胰岛素USP(Intergen)，产生0.86mg/mL的最终胰岛素浓度，和0.7wt％NaCl和8.3wt％PEG浓度。通过加入微量冰醋酸和1M NaOH溶液，将pH调节至5.65。加热至T₁＝77℃后，获得澄清蛋白质溶液，产生胰岛素浓度C_eq。然后以预定速度冷却溶液至温度T₂＝37℃。在T₂，观察到蛋白质沉淀。通过离心(13,000xg，3分钟)除去沉淀，在温度37℃再次离心，用bicinchoninic蛋白质分析测定得到的上层清液中胰岛 素浓度(C^*)为0.45mg/mL。保持在37℃的如此制备的胰岛素溶液称为溶液A。 

通过在0.7wt％NaCl/8.3wt％PEG(通过加入HCl使pH为约2.1)中溶解人胰岛素制备溶液B，产生2mg/mL胰岛素浓度。在37℃搅拌下培养溶液7小时，随后超声处理2分钟。将得到的溶液B等分试样加入至溶液A，产生1mg/mL的总胰岛素浓度。将得到的混合物在强烈搅拌下保持在37℃过夜，产生胰岛素沉淀，使用薄膜滤器(有效孔径，0.22μm)将其从液体温和地除去。然后在液氮中急速冷冻得到的蛋白质微粒，并冷冻干燥。 

B.α-1-Antitrvpsin(AAT)的小球形颗粒 

本发明还可以用于制备AAT的小球形颗粒，其特别适用于肺递送。 

实施例11：AAT小球形颗粒(10-300mg规格)的夹套柱间歇制备 

在夹套烧杯中用磁性搅拌条混合pH6.0的缓冲溶液和包含16％PEG 3350与0.02％Pluronic F-68的10mM乙酸铵，并加热至30℃。使用循环水浴控制烧杯温度。将重组体AAT(rAAT)的浓溶液加入至该溶液，同时搅拌，并将pH调节至6.0。最终溶液中rAAT浓度是2mg/mL。在该温度下rAAT完全溶解于该溶液组合物中。将容器的全部内容物转移到夹套柱，并加热至25-30℃。柱循环水浴设为倾斜降到-5℃。以大约1℃/分钟将柱和内容物冷却至约4℃。冷却步骤期间形成rAAT小球形颗粒。在玻璃结晶皿中冷冻微球体悬浮液，并冷冻干燥以除去水和缓冲剂。 

冷冻干燥后，为了从蛋白质小球形颗粒提取PEG，用二氯甲烷(MeCl₂)洗涤PEG/蛋白质滤饼。另一个使用的洗涤介质是二氯甲烷∶丙酮1∶1，或二氯甲烷∶戊烷1∶1。重复洗涤过程总共3倍原始体积洗涤。在小体积丙酮或戊烷中再悬浮最终的颗粒状物，并通过直接 暴露至氮气或旋转蒸发，进行干燥。 

实施例12：AAT小球形颗粒(200-2000mg规格)夹套容器间歇制备 

进行这类制备使用与夹套柱相同的配方组合物，但是能够容纳更大的体积，并更适用于规格扩大。在该规格，在夹套式容器(通常500-1000ml)中用A-形桨型桨叶以75rpm混合配方，并加热至30℃。使用循环式水浴控制容器温度。在相同容器中保持溶液，水浴源从30℃浴转换为2℃浴。以大约1℃/分钟将容器和内容物冷却至约4℃。冷却步骤期间形成rAAT小球形颗粒。使用热电偶监测温度，并当悬浮液达到4℃时，在接近该温度再保持30分钟。保持步骤后，通过以约4℃透滤浓缩小球形颗粒悬浮液，以除去大约75％的聚合物和体积。在预先冷却的冷冻干燥托盘中将残留的小球形颗粒悬浮液冷冻成为薄层，并冷冻干燥以除去水和残留的缓冲剂。 

通过用有机溶剂离心(如实施例10公开的)或用超临界流体(SCF)萃取，从残留干燥聚合物分离蛋白质小球形颗粒。对于SCF萃取，将干燥材料转移进入高压提取室，其用CO₂加压到2500psi(在室温下)。一旦达到工作压力，将乙醇以CO₂∶乙醇为70∶30的混合物引入入口流体料流。该超临界流体溶解聚合物，留下小球形颗粒。在过程结束时，体系注满乙醇并缓慢减压。 

实施例13：过程产率-rAAT转变成小球形颗粒的转化百分率 

按照实施例10和11的描述制备小球形颗粒。冷却过程完成后，除去悬浮液的小等分试样，并通过0.2μm注射过滤器过滤，以除去固体小球形颗粒。在280nm使用紫外线分光光度计测定滤出液的吸收，其中滤出液是溶液中残留的rAAT。然后根据标准曲线计算rAAT浓度。按照下式计算转化百分率： 

(起始rAAT浓度-滤出液rAAT浓度)/起始rAAT浓度×100％＝转化百分率 

规格	转化为小球形颗粒的百分数
		100-200mg(n＝9，柱)	91.7±4.4
300mg(n＝4，柱)	93.4±1.6
		2g(n＝5，容器)	90.4±1.8

如上述表中所示，不管工业规格如何，高百分数的AAT蛋白质转变为小球形颗粒。 

实施例14：以不同工业规格Aerosizer数据的AAT颗粒的粒度分布 

在TSI Aerosizer 3225(其通过飞行时间测量粒度)中分析最终的AAT干燥粉末小球形颗粒样品。根据这些测量，计算体积直径的不同比率，以表明AAT小球形颗粒的粒度分布，并用于与本发明以外方法制备的颗粒相比较。 

规格	d90/d10(体积)	d80/d20(体积)	(d90-d10)/d50(体积)
				5-10mg(n＝12，柱)	1.88±0.20	1.49±0.10	0.67±0.14
100-200mg(n＝5，柱)	1.83±0.05	1.41±0.05	0.66±0.05
				300mg(n＝3，柱)	2.05±0.17	1.61±0.11	0.77±0.06
1-2g(n＝4，容器)	2.21±0.30	1.60±0.11	0.86±0.19

安得生数据 

称重5-10mg样品放入凝胶胶囊，并使用Cyclohaler干燥粉末吸入器以60升/分种(LPM)的流速送入安得生级联碰撞仪。从所有撞击器载物台收集小球形颗粒，溶解在0.2M Tris-HCl缓冲剂中(pH8.0)，并使用反相HPLC测定。按照United States Pharmacopeia(USP)中的描述分析数据，并计算几何标准偏差(GSD)。数据表现出窄粒度分布。 

规格	GSD
		100-200mg(n＝5，柱)	1.74±0.22
300mg(n＝3，柱)	1.77±0.40
		2g(n＝5，容器)	1.70±0.09

上述所有分布参数表明本发明制造方法产生优异的粒度分布。 

实施例15：保持AAT生物活性 

为了测定比活性，在室温下将rAAT小球形颗粒溶解在0.2MTris-HCl中，pH8.0。通过测量rAAT抑制猪胰腺弹性蛋白酶(PPE)水解合成缩氨酸的能力的试验分析得到的溶液，所述合成缩氨酸在其C-端包含对硝基苯胺基团。然后使用Bicinchoninic Acid(BCA)验定法对相同的rAAT小球形颗粒溶液分析蛋白质浓度。对对照rAAT原材料溶液也用两种试验方法进行分析。因为开发活性验定法基于每个样品1mg/ml蛋白质的浓度测定活性，那么基于用BCA测定的实际蛋白质浓度校准活性值，得到比活性值： 

样品活性值/实际蛋白质浓度＝样品比活性 

用rAAT抑制猪胰腺弹性蛋白酶 

规格	小球形颗粒IU/mg	对照物IU/mg
			100-300mg(n＝12，柱)	64.19±5.01	64.34±4.95
200-300mg(n＝8，容器)	62.53±5.29	65.87±0.98

该比活性表明AAT加工成为小球形颗粒后生物活性的保持。 

实施例16：AAT结构完整性的保持 

受控相分离(CPS)技术的一个重要区别点是颗粒形成期间利用水性体系在温和条件下形成颗粒，并避免其它引发应力的条件，例如温度上升、剪切力等。颗粒工程领域中，主要问题是加工期间蛋白质的稳定性和储存稳定性。主降解路径例如蛋白质的氧化、脱酰胺化，特别是聚集被认为是蛋白质配方副作用包括免疫原性的原因。因此，调节问题要求在最终的颗粒配方中降解产物的浓度非常低。使用HPLC，物理化学表征例如CD和DSC测定形成期间发生的蛋白质改性。 

圆二色性(CD)是最通常使用的方法，用于评估经历扰动的蛋白质结构的变化，或比较设计的蛋白质与根源蛋白质间的结构。CD方法 评估蛋白质弯曲和蛋白质次级和三级结构。 

″远紫外线″光谱区(190-250nm)中可以用CD光谱测定二级结构。在这些波长，当它位于固定的弯曲环境时，生色团是肽键。α-螺旋状物、β-薄片和无规卷曲结构各自产生特征形状和圆二色性谱值。因此可以通过分析其远紫外线圆二色性谱，以各自结构类型的参考光谱的部分和，测定存在于任何蛋白质中的每个二级结构的近似份数。 

″近紫外线″光谱区(250-350nm)中的蛋白质圆二色性谱可能对某些方面的三级结构敏感。在这些波长，生色团是芳香族胺基酸和二硫键，它们产生的CD信号对蛋白质的总体三级结构敏感。在250-270nm区域的信号可归因于苯丙氨酸残留物，270-290nm信号可归因于酪氨酸，280-300nm信号可归因于色氨酸。二硫键产生贯穿近紫外谱的宽弱信号。 

rAAT储备液和从磷酸盐缓冲液(pH7.4，T＝25℃，蛋白质浓度0.05mg/mL)中小球形颗粒释放的AAT远紫外线圆二色性谱显示于图13。每个光谱代表10次扫描的平均值。 

远紫外线圆二色性谱是难分辨的，表明AAT加工成为小球形颗粒后，通过随后释放产生结构与起始AAT材料相同的AAT分子。 

RP-HPLC 

在0.2M Tris-HCl中在pH为8.0时溶解小球形颗粒，并用反相HPLC分析。当与起始rAAT蛋白质的对照液比较时，色谱外观没有明显的差异。 

HPLC体系： 

HPLC Column-Pheomenex Jupiter，5微米，C4，300A，250×4.6mmWaters Alliance 2965泵/自动取样器 

波长-280nm 

注射体积-75ul 

浓度梯度： 

流动相1：在水中0.1％的TFA 

流动相2：在90％(c/v)乙腈的水溶液中0.085％的TFA 

运行时间-60分钟 

流速-1.0ml/分钟 

DSC 

产生DSC图。参见图15-25b。 

实施例17：AAT小球形颗粒相对于其AAT原材料的储存稳定性 

在室温和4℃下储存1周、1个月、2个月、3个月、6个月和12个月后，分析小球形颗粒生物活性(使用实施例15中公开的验定法)的保持。(图14b和14c)基体材料是rAAT起始溶液，其已经渗析，然后冷冻干燥。对于每个时间点和储藏条件，存在备份样品，每次分析双份。 

C.人生长激素(hGH)的小球形颗粒 

本发明还可以用于制备hGH的小球形颗粒。 

实施例18：hGH小球形颗粒的测试管间歇制备(20-50mg规格) 

将pH 5.6(50mM乙酸铵/50mM碳酸氢铵)的缓冲溶液(包含18％PEG 3350)与溶液中最终浓度为1mg/ml的hGH在50ml的锥形管中混合，并在静止水浴中加热至58℃。在这些条件下hGH溶解在溶液中。然后从水浴除去试管，并在冰浴中冷却，直到溶液达到10℃。冷却速度保持在4-6℃/分钟。冷却步骤期间形成hGH蛋白质小球形颗粒。当溶液温度达到约40℃时，开始形成小球形颗粒。颗粒形成后，用如下所述两种方法中的一种，从PEG分离hGH蛋白质小球形颗粒。 

有机溶剂洗涤要求在冷却步骤和颗粒形成后，用液氮快速冷冻小球形颗粒悬浮液，并冷冻干燥以除去水和缓冲剂。为了在冷冻干燥后从PEG分离蛋白质小球形颗粒，在二氯甲烷(MeCl₂)中悬浮PEG/蛋白质滤饼。PEG在MeCl₂中是可溶的，而蛋白质小球形颗粒是不溶的。在室温下混合悬浮液5分钟。因为hGH小球形颗粒的密度接近于MeCl₂(d＝1.335g/ml)，需要第二溶剂降低液体密度，以便于离心分离。以与MeCl₂等体积加入与MeCl₂可混溶的丙酮。然后以3300rpm在室温下离心小球形颗粒悬浮液5分钟。抛弃上层清液，并在MeCl₂中再悬浮颗粒状物，并在室温下再次混合5分钟。重复该洗涤步骤总共重复5次。最终洗涤后，在小体积MeCl₂中再悬浮颗粒状物，并通过旋转蒸发干燥，留下最终的hGH小球形颗粒粉末。 

锌缓冲剂洗涤要求冷却步骤和颗粒形成后，在4℃以4000rpm离心小球形颗粒悬浮液10分钟，以从PEG分离小球形颗粒。除去上层清液，并在包含50mM乙酸锌的冷缓冲液中再悬浮颗粒状物，体积等于除去的上层清液体积。Zn²⁺离子降低hGH的溶解性，并防止洗涤期间溶解。洗涤缓冲剂保持在冰上。然后立即在4℃以3000rpm离心悬浮液5分钟。除去上层清液，并重复锌缓冲剂洗涤总共3次。3次锌缓冲剂洗涤后，在水中洗涤颗粒状物2次，并在4℃以3000rpm离心5分钟，以除去过量的锌。最终水洗后，在小体积水中再悬浮颗粒状物，并使用液氮快速冷冻。然后冷冻干燥冷冻的颗粒状物以除去水，留下最终的hGH小球形颗粒粉末。 

实施例19：hGH小球形颗粒的夹套式容器间歇制备(100mg规格) 

使用实施例18的类似配方成分进行该类型制备，但是可以适应较大的体积，并且更适合于规模扩大。 

在夹套烧杯中利用顶置叶轮，混合缓冲至pH为6.1包含18％PEG3350和0.02％Pluronic F-68的溶液(80mM乙酸铵/10mM碳酸氢铵)，并加热至58℃。使用循环水浴控制混合物温度。搅拌的同时，将hGH 的浓溶液加入至该溶液。溶液中hGH的最终浓度是1mg/ml。在该温度下的该溶液组合物中，hGH是完全可溶的。然后以8℃/分钟的速度冷却容器和内容物至约10℃的温度。冷却步骤期间形成hGH小球形颗粒。在约40℃开始形成小球形颗粒，进一步冷却继续处理的悬浮液。冷却步骤后，用实施例20a中描述的两种方法中的一种从PEG分离小球形颗粒。 

实施例20：hGH完整性的保留 

以下列处理步骤评估小球形颗粒中hGH的蛋白质完整性：后颗粒形成、后PEG萃取和后溶剂除去或后干燥。使用HPLC分析(尺寸排阻色谱法(SEC)，反相(RP))测定加工成为小球形颗粒后的聚集体和降解产物数量，以测量hGH的化学完整性。结果表明小球形颗粒配方加工期间，没有明显的聚集体或其它相关物质积聚。 

a.有机溶剂洗涤 

通过尺寸排阻色谱法测定的hGH聚集：相对于原材料聚集体增加 

方法阶段	二聚物增加％	HMW物种增加％
			形成颗粒后	1.17	0
PEG萃取并干燥后	2.67	0.43

通过反相hGH测定的相关物质：相对于原材料的降解增加 

方法阶段	早期洗脱物种的增加％	脱酰氨的增加％	后洗脱物种的增加％
				形成颗粒后	0.22	0.66	0
PEG萃取并干燥后	1.29	2.93	0

b.锌缓冲洗涤 

通过尺寸排阻法测定hGH聚集：相对于原材料聚集体增加 

方法阶段	二聚物的增加％	HMW物种的增加％
			形成颗粒后	0.88	0
PEG萃取后	2.25	0
			颗粒干燥后	2.51	0

通过反相hGH测定的相关物质：相对于原材料降解增加 

方法阶段	早期洗脱物种增加％	脱酰氨增加％	后洗脱物种增加％
				形成颗粒后	0.38	1.91	0.26
PEG萃取后	0.19	1.34	0.26
				颗粒干燥后	0.34	1.58	0.37

实施例21：hGH小球形颗粒的粒度分布 

用空气动力学飞行时间测量法，使用TSI Aerosizer(图26)和扫描电子显微术(图27)测定小球形颗粒的粒度分布特性。 

实施例22：hGH小球形颗粒的溶解动力学 

比较经历两种不同萃取过程的hGH小球形颗粒的溶解动力学。 

用有机溶剂洗涤的hGH小球形颗粒立即溶解在含水介质中，类似于hGH原材料。 

当用锌缓冲液洗涤hGH小球形颗粒时，溶解度降低(图28)。在10mM Tris、154mM NaCl、0.05％Brij 35中于pH 7.5、37℃下进行hGH小球形颗粒的溶解。在其它体外介质中已经实现更完全的蛋白质释放。溶解动力学表明在第一个15分钟内大约全部hGH的30％释放，第一个24小时内释放大约50％。在1个月时蛋白质完全释放。小球形颗粒以两相方式溶解的事实可能导致在活体内某种释放延迟。 

D.溶菌酶小球形颗粒 

实施例23溶菌酶小球形颗粒的制备 

溶液：1.6mg/ml溶菌酶、13.2％PEG 3350、55mM乙酸铵(pH9.5)、53mM硫酸铵、263mM氯化钠、26mM氯化钙。 

将PEG和缓冲剂加热至40℃(pH9.55)。在液氮中快速冷冻得到的悬浮液，并在歧管冷冻干燥器上冷冻干燥。形成小球形颗粒。 

E.脱氧核糖核酸酶小球形颗粒 

实施例24制备脱氧核糖核酸酶小球形颗粒 

配方实例：溶液：0.18mg/ml脱氧核糖核酸酶(现货1mg/ml)，18.2％PEG 3350(现货25％)，9mM乙酸铵，pH 5.15(现货1M)。 

在-80℃冷却器中冷却悬浮液，冷冻后，在歧管冷冻干燥器上冷冻干燥，随后用MeCl₂/丙酮离心洗涤。 

测试起始浓度是0.1mg/ml脱氧核糖核酸酶和20％PEG 3350。但是从37℃冷却至0℃后，没有得到沉淀物，加入又一个数量的脱氧核糖核酸酶，以获得上述浓度。在-80℃冷却器中冷却该溶液，冷冻后，在歧管冷冻干燥器上冷冻干燥。用MeCl₂/丙酮离心洗涤。测试起始浓度是0.1mg/ml脱氧核糖核酸酶和20％PEG 3350。但是从37℃冷却至0℃后，没有得到沉淀物，加入又一个数量的脱氧核糖核酸酶，以获得上述浓度。在-80℃冷却器中冷却该溶液，冷冻后，在歧管冷冻干燥器上冷冻干燥。用MeCl₂/丙酮离心洗涤。(图37，38)。 

活性(使用购自Sigma的DNA-甲基绿，分析脱氧核糖核酸酶-I) 

原材料理论活性列为775Ku/mg蛋白质。测定原液为0.145mg/ml蛋白质。将该浓度稀释为5ml，最终浓度为0.0199mg/ml。活性应为775Ku/mg*0.0199mg/ml＝15.46Ku/ml。 

孔尼茨单位/溶液毫升数＝每分钟未知的ΔA640×40×稀释因子/每分钟已知的ΔA640 

Ku/ml＝-0.0004×40×1/-0.0011＝14.55Ku/ml 

与理论值比较： 

小球形颗粒/理论×100％＝活性％ 

14.55Ku/ml/15.46Ku/ml×100％＝94.1％ 

F.过氧化物歧化酶小球形颗粒 

实施例25制备过氧化物歧化酶小球形颗粒 

0.68mg/ml SOD(现货5mg/ml)、24.15％PEG 3350(现货31.25％)、9.1mM乙酸铵(现货1M)的溶液，用氢氧化铵和乙酸调节最终pH＝4.99。经过50分钟从40℃冷却溶液至0℃(-0.8℃/分钟)，并在约25℃引发沉淀。在液氮中快速冷冻悬浮液，并在歧管冷冻干燥器上冷冻干燥，随后用MeCl₂/丙酮离心洗涤。(图39，40)。 

经过50分钟从40℃冷却到0℃(约0.8℃/分钟)。在约25℃开始沉淀。在液氮中快速冷冻，并在歧管冷冻干燥器上冷冻干燥。用MeCl₂/丙酮离心洗涤。形成小球形颗粒，并保留大部分丙酮。 

G.枯草溶菌素小球形颗粒 

实施例26：使用非聚合物相分离增强剂的枯草溶菌素小球形颗粒 

初始体系的连续相可以包含非聚合物相分离增强剂，以引发冷却期间蛋白质的相分离。依据本发明可以使用丙二醇和乙醇的混合物形成枯草溶菌素小球形颗粒，不使用任何聚合物。在该体系中，丙二醇作为凝固点降低剂，乙醇作为相分离增强剂。此外丙二醇有助于形成球形小球形颗粒。 

制备在35％丙二醇-10％甲酸酯-0.02％CaCl₂中的20mg/mL枯草溶菌素溶液。然后在混合的同时，使35％丙二醇-枯草溶菌素溶液接触67％乙醇。在室温下溶液仍然是澄清的。然而，当冷却至-20℃一个小时时，形成颗粒悬浮液。离心收集颗粒并用90％乙醇洗涤后，进行Coulter粒度分析，纯乙醇作为悬浮液。产生的颗粒Coulter结果与平均直径2.2微米的离散颗粒一致，并且95％的颗粒为0.46至3.94微米。光学显微镜评估证实这些结果显示出基本上为球形颗粒。颗粒的SEM分析证实Coulter结果。 

形成小球形颗粒后保持枯草溶菌素酶活性 

通过比色分析证实溶液中枯草溶菌素转化为枯草溶菌素小球形颗粒后，保持酶活性。通过从冷却前在乙醇-枯草溶菌素-丙二醇溶液中分析的枯草溶菌素总单元减去上层清液中发现的总单元(分离枯草溶菌素颗粒后)计算小球形颗粒的理论总单元活性。枯草溶菌素小球形颗粒的实际总单元除以理论单元表示为颗粒形成后枯草溶菌素活性保持的百分数。通过该计算，形成枯草溶菌素小球形颗粒后，保持107％的理论枯草溶菌素活性。 

H.碳水化合物小球形颗粒 

实施例27：形成碳水化合物小球形颗粒 

本发明可以应用于制备碳水化合物小球形颗粒。冷却体系期间，可以在PEG相和右旋糖苷相之间引发相分离。可以使用多种分子量的右旋糖苷，例如，5K、40k、144k和500k。在30％PEG 300中的5mg/ml右旋糖苷40K混合物在35℃平衡，然后冷却混合物至0℃，并冷冻干燥。通过用二氯甲烷∶丙酮(1∶1)洗涤混合物并离心获得颗粒。如从图49可以看到，形成小球形颗粒。可以使用该方法将其它碳水化合物，例如淀粉、羟乙基淀粉、海藻糖、乳糖、甘露糖醇、山梨醇、hylose、硫酸葡聚糖等配制成为小球形颗粒。 

I.预制小球形颗粒的微囊化 

实施例28制备PLGA封装预制胰岛素小球形颗粒 

a)通过在二氯甲烷中溶解1600mg聚交酯-共-乙交酯(PLGA，MW35k)制备20％(w/v)的聚合物溶液(8ml)。向该溶液加入100mg胰岛素小球形颗粒(INSms)，使用转子/定子均化器以11k rpm强力混合介质，获得均匀悬浮液。连续相由二氯甲烷饱和的甲基纤维素的0.02％水溶液(24ml)组成。使用相同的均化器以11k rpm混合连续相，并将所述悬浮液逐渐注射至介质，以产生有机相初期微囊密封的颗粒。该乳液的O/W比率为1∶3。继续乳化5分钟。然后，立即将乳液转移进入由150ml去离子(DI)水组成的硬化介质，同时以400rpm搅拌介质。 在-0.7巴减压下萃取有机溶剂1小时。通过过滤收集硬化的微囊化颗粒，并用水洗涤。冷冻干燥洗涤的微囊化颗粒，以除去过量水。得到的微囊化颗粒具有约30μm的平均粒度，大多数颗粒小于90μm，并包含5.7％(w/w)的胰岛素。 

b)通过在二氯甲烷中溶解1200mg 50∶50聚交酯-共-乙交酯(PLGA，MW 35k)，制备30％(w/v)聚合物溶液。然后使用均化器在所述聚合物溶液中制备100mg INSms的悬浮液。该悬浮液用于在实施例28公开的12ml甲基纤维素0.02％水溶液中产生O/W乳液(W/O比率＝1∶3)。按照与实施例28相同的方法制备最终的微囊化颗粒。形成的微囊化颗粒具有25μm的平均粒度，从0.8至60μm。微囊化颗粒的胰岛素含量是8.8％(w/w)。 

替代地，使用10％(w/v)聚合物溶液，在所述相同条件下进行微囊化过程。该过程产生平均粒度约12μm的微囊化颗粒，大部分颗粒小于50μm，胰岛素载荷为21.1％(w/w)。 

活体外释放方法： 

通过将10ml释放缓冲剂(10mM Tris、0.05％Brij 35、0.9％NaCl，pH 7.4)加入含3mg当量封装胰岛素的小玻璃管中，在37℃培养，实现从胰岛素从微囊化颗粒活体外释放(IVR)。在指定时间间隔将400uLIVR介质转移进入微量离心管，并以13k rpm离心2分钟。除去顶部300μL上层清液，并在-80℃储存直至分析。用300uL新鲜的介质代替取出体积，其用于重组球形颗粒，以及保留上层清液(100pL)。将悬浮液转移回到相应的活体外释放介质。 

实施例29在PLGA/PLA合金基质体系中微囊化预制胰岛素小球形颗粒的方法 

在二氯甲烷(4ml)中制备PLGA/PLA合金的30％(w/v)溶液。合金由50∶50PLGA(MW 35k)、D，L-聚乳酸(PLA，MW19k)和聚L- PLA(PLLA，MW 180k)分别为40、54和6％(0.48、0.68和0.07g)组成。按照与实施例28b相同的方法制备最终的微囊化颗粒。微囊化颗粒的实施例具有0.8-120μm的粒度范围，平均值40μm，大多数颗粒小于90μm。 

实施例30在PLGA基质体系中微囊化预制的胰岛素小球形颗粒的方法，在连续和不连续相中都使用PEG 

在二氯甲烷中制备4ml 10％50∶50PLGA(0.4g)和25％聚乙二醇(PEG，MW 8k)的溶液。使用转子/定子均化器，在该溶液中以11k rpm悬浮100mg INSms。连续相由用二氯甲烷饱和的0.02％(w/v)甲基纤维素和25％PEG(MW 8k)的水溶液(12ml)组成。使用相同的均化器以11krpm混合连续相，并将所述悬浮液逐渐注射至介质，以产生有机相的初期微囊化颗粒。该乳液具有1∶3的O/W比率。继续乳化5分钟。然后，立即将乳液转移进入由150ml去离子水组成的硬化剂，同时以400rpm搅拌介质。在-0.7巴减压下萃取有机溶剂1小时。通过过滤收集硬化的微囊化颗粒，并用水洗涤。冷冻干燥洗涤的微囊化颗粒，以除去过量水。该实施例的微囊化颗粒具有30μm的平均粒度，从2至90μm，大多数颗粒小于70μm。这些微球体的胰岛素含量是16.0％(w/w)。 

实施例31在PLGA基质体系中以连续相变化的pH微囊化预制的胰岛素小球形颗粒的方法，使用磷酸盐缓冲液 

在二氯甲烷中制备4ml 20％ 50∶50 35kD PLGA(0.8g)的溶液。使用转子/定子均化器，在该溶液中以11k rpm悬浮100mg INSms。连续相包含0.1％(w/v)甲基纤维素和50mM磷酸盐缓冲液(pH 2.5、5.4和7.8)的水溶液。使用连续设备(图41A)进行微囊化。以11k rpm混合连续相，并以12毫升/分钟进料至乳化室。以2.7毫升/分钟将分散相注射进入该室，以产生初期的微囊化颗粒。从该腔室移出产生的乳液，并以连续方式转移进入硬化浴。以400rpm搅拌硬化剂。在-0.4巴减压下萃取有机溶剂1小时。通过过滤收集硬化的微囊化颗粒，并用水 洗涤。冷冻干燥洗涤的微囊化颗粒，以除去过量水分。 

在pH为2.5、5.4和7.8时制备的微囊化颗粒的胰岛素含量分别估算为12.5、11.5和10.9。微囊化颗粒的粒度分布分析结果概括于表5。 

表5.以不同pH的连续相制备的胰岛素加载-PLGA微囊化颗粒的粒度分布。 

活体外释放方法： 

通过将10ml释放缓冲剂(10mM Tris、0.05％Brij 35、0.9％NaCl，pH 7.4)加入含3mg当量封装胰岛素的小玻璃管，在37℃下培养，实现胰岛素从微囊化颗粒活体外释放(IVR)。在指定时间间隔将400μLIVR介质转移进入微量离心管，并以13k rpm离心2分钟。除去顶部300μL上层清液，并在-80℃储存直至分析。用300μL新鲜的介质代替取出体积，其用于重组球形颗粒，以及保留上层清液(100μL)。将悬浮液转移回到相应的活体外释放介质。 

上述制剂的活体外释放(IVR)结果显示于图44，并表明连续相的pH对胰岛素从配方释放的动力学影响明显。 

实施例32在PLLA或PLLA/PEG基质体系中微囊化预制的人血清白蛋白(HSA)小球形颗粒的方法 

在二氯甲烷中制备2ml 25％(w/v，500mg)PEG(MW 3k或8k)的溶液。使用转子/定子均化器，以11k rpm将PEG溶液或2ml二氯甲 烷用于形成50mg预制的人血清白蛋白小球形颗粒(HSAms)悬浮液。向该悬浮液加入2ml在二氯甲烷中的4％PLLA(80mg，MW 180k)，并以11-27k rpm均化介质，以产生有机相。连续相由用二氯甲烷饱和的甲基纤维素的12ml 0.02％水溶液组成。通过以11k rpm强力混合连续相引发乳化，随后逐渐注射有机相。乳化介质5分钟，然后将乳液转移进入150ml DI-水，以400rpm混合。全部所述过程在4℃进行。然后将硬化剂转移到室温，并在-0.7巴减压下萃取有机溶剂1小时。通过过滤收集硬化的微囊化颗粒，并用水洗涤。冷冻干燥洗涤的微囊化颗粒，以除去过量水。PEG对HSA从上述配方的IVR的沟道效应显示于图42。 

活体外释放方法： 

通过将15ml释放缓冲剂(20mM HEPES、0.01％Tween-80、0.1MNaCl、1mM CaCl₂，pH7.4)加入到含2.5mg当量的封装HSA的15ml聚丙烯离心管，在37℃培养，实现HSA从封装的微囊化颗粒活体外释放(IVR)。取样方法公开于实施例31。 

实施例33制备PLGA-封装的预制亮丙瑞林/葡聚糖硫酸酯小球形颗粒 

通过在二氯甲烷中溶解1200mg 50∶50聚交酯-共-乙交酯(PLGA，MW 35k)，制备30％(w/v)聚合物溶液。然后使用均化器在所述聚合物溶液中悬浮含50mg亮丙瑞林的65.9mg预制leuprilide/葡聚糖硫酸酯小球形颗粒(LDS)。该悬浮液用于在12ml实施例28公开的0.02％甲基纤维素水溶液中产生O/W乳液(W/O比率＝1∶3)。按照与实施例28b相同的方法制备最终的微囊化颗粒。 

微囊化颗粒具有20μm的平均粒径，其中大多数低于50μm。亮丙瑞林从微囊化颗粒IVR的结果示于图43。 

活体外释放方法： 

通过将15ml释放缓冲剂(10mM磷酸钠缓冲液、0.01％Tween-80、0.9％NaCl、0.04％NaN₃，pH7.4)加入到含2.5mg当量封装亮丙瑞林的15ml聚丙烯离心管中，在37℃培养，实现亮丙瑞林从封装微囊密封颗粒活体外释放(IVR)。取样方法公开于实施例28。 

实施例34制备PLGA封装的预制重组体人生长激素小球形颗粒 

通过在二氯甲烷中溶解0.4g PLGA-PEG，制备10％(w/v)聚合物溶液(4ml)。然后使用均化器，在所述聚合物溶液中悬浮100mg预制的重组体人生长激素小球形颗粒(hGHms)。连续相由0.1％(w/v)甲基纤维素和50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)的水溶液组成。使用连续设备(图41A)如实施例31所述进行微囊化。这些微囊化颗粒的平均粒度是25μm，范围为从1至60μm。hGH从聚合物基体的IVR分布显示于图45。 

活体外释放方法： 

如实施例28所述实现hGH从微囊化颗粒IVR。 

实施例35测定微囊化预制胰岛素小球形颗粒的完整性 

为了评估微囊化过程对封装预制的胰岛素小球形颗粒完全性的影响，使用两相双重萃取法分离(deformulated)含预制INSms的聚合微囊化颗粒。在二氯甲烷中悬浮称重的封装INSms样品，并温和地混合以溶解聚合物基质。为了萃取蛋白质，加入0.01N的HCl，并混合两相以产生乳液。然后，分离两相，除去水相并用相同溶液更新，并重复萃取过程。用尺寸排阻色谱法(SEC)测定萃取胰岛素的完全性。该方法鉴别萃取介质中INS单体、二聚物和高分子量(HMW)物种的延伸。使用适当的对照物鉴别分离(deformulation)过程对INS完全性的影响。结果表明该过程对INS完全性没有明显的影响。 

取决于微囊化过程的条件和含量，与初始INSms(非封装)中99.13％单体含量比较，封装INSms包含97.5-98.94％蛋白质的单体。 封装INSms中二聚物物种的含量与初始INSms中0.85％相比为1.04％至1.99％。封装INSms的HMW含量为0.02％至0.06％，相比初始INSms中为0.02％。结果概括于表6。聚合物基体的影响描述于图46和47。 

表6微囊化过程对封装预制的胰岛素小球形颗粒完全性的影响。 

	单体(％)	二聚物(％)	HMW(％)
				未封装INSms	99.13	0.85	0.02
封装INSms	97.5-98.94	1.04-1.99	0.02-0.06

实施例36.从微囊化预制小球形颗粒活体内释放胰岛素 

在Sprague Dawley(SD)小鼠中研究胰岛素从预制胰岛素小球形颗粒的微囊化颗粒的活体内释放。动物接受初始1 IU/kg皮下剂量的非封装或封装预制的胰岛素小球形颗粒。使用ELISA测定收集样品中重组体人胰岛素(rhINS)的血清水平。结果图解于图48。 

虽然已经图解并描述了具体实施方式，但在不偏离本发明主旨的情况下能够预见到多种变化，并且保护范围仅由权利要求的范围限定。 

Claims (71)

1.一种制备活化剂小球形颗粒的方法，包括：

提供单一液相的溶液，包括活化剂、相分离增强剂和第一溶剂，和，以受控速度在溶液中引发相转变，以导致活化剂液固相分离，形成固相和液相，固相包含活化剂的固体小球形颗粒，液相包含相分离增强剂和第一溶剂，小球形颗粒基本上是球形，其中所述引发包括冷却溶液。

2.权利要求1的方法，其中溶液具有相转变温度，第一温度和第二温度，并且将溶液从第一温度冷却至第二温度，其中第一温度高于溶液的相转变温度，而第二温度低于溶液的相转变温度。

3.权利要求1或2的方法，进一步包括选自以下的步骤：

调节活化剂的浓度，调节相分离增强剂的浓度，调节溶液的离子强度，调节pH，以及调节溶液的渗透压浓度。

4.权利要求1或2的方法，进一步包括改变活化剂的浓度。

5.权利要求1或2的方法，进一步包括改变相分离增强剂的浓度。

6.权利要求2的方法，其中第二温度高于溶液的凝固点。

7.权利要求2的方法，其中第二温度低于溶液的凝固点。

8.权利要求1或2的方法，其中冷却步骤是以从0.2℃/分钟至50℃/分钟的受控速度进行的。

9.权利要求8的方法，其中受控速度包括从0.2℃/分钟至30℃/分钟。

10.权利要求1或2的方法，其中提供溶液的步骤包括：在第一溶剂中溶解相分离增强剂，以形成混合物；并将活化剂加入至混合物，以形成溶液。

11.权利要求10的方法，进一步包括在将活化剂加入至混合物之前，在第一溶剂或第二溶剂中溶解活化剂的步骤，其中第二溶剂与第一溶剂是可混溶的。

12.权利要求6的方法，其中溶液进一步包括凝固点降低剂，以降低溶液的凝固点。

13.权利要求12的方法，其中凝固点降低剂选自聚乙二醇和丙二醇。

14.权利要求1或2的方法，其中相分离增强剂是水可溶性或水可混溶性的试剂。

15.权利要求1或2的方法，其中相分离增强剂选自线性或支化聚合物、碳水化合物基聚合物、聚脂肪醇、聚乙烯基聚合物、聚丙烯酸、聚有机酸、聚氨基酸、共聚物、叔聚合物、聚醚、天然存在聚合物、聚酰亚胺、表面活性剂、聚酯、支化和环聚合物、聚醛、乙醇、丙酮和异丙醇。

16.权利要求1或2的方法，其中相分离增强剂选自淀粉、取代淀粉、聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮和泊洛沙姆。

17.权利要求1或2的方法，其中相分离增强剂是聚乙二醇。

18.权利要求1或2的方法，其中小球形颗粒进一步包含赋形剂，以增强小球形颗粒的稳定性，以提供活化剂从小球形颗粒的受控释放，或增强活化剂通过生物组织的渗透性。

19.权利要求18的方法，其中赋形剂选自：碳水化合物、阳离子、阴离子、氨基酸、类脂、脂肪酸、表面活性剂、三酸甘油酯、胆汁酸或其盐、脂肪酸酯和聚合物。

20.权利要求19的方法，其中阳离子选自Zn²⁺、Mg²⁺和Ca²⁺。

21.权利要求19的方法，其中胆汁酸是胆酸或其盐。

22.权利要求1或2的方法，进一步包含获得小球形颗粒的步骤。

23.权利要求22的方法，其中获得小球形颗粒的步骤是，在使活化剂不溶于液体介质而相分离增强剂可溶于液体介质的温度下，用液体介质洗涤颗粒。

24.权利要求23的方法，其中洗涤步骤是通过透滤或离心。

25.权利要求23的方法，其中液体介质是含水的或有机的。

26.权利要求23的方法，其中液体介质是超临界流体或是超临界流体和超临界流体可混溶溶剂的混合物。

27.权利要求25的方法，其中有机液体介质选自：二氯甲烷、氯仿、乙腈、乙酸乙酯、乙醇和戊烷。

28.权利要求23的方法，其中液体介质进一步包含降低活化剂在液体介质中溶解度的试剂。

29.权利要求28的方法，其中降低活化剂在液体介质中溶解度的试剂包含络合离子。

30.权利要求29的方法，其中络合离子是阳离子，选自：Zn²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Na⁺和NH₄ ⁺。

31.权利要求23的方法，进一步包含除去液体介质的步骤。

32.权利要求31的方法，其中除去液体介质的步骤是通过冷冻干燥、干燥或蒸发。

33.权利要求23的方法，其中液体介质进一步包含赋形剂。

34.权利要求33的方法，其中赋形剂增强小球形颗粒的稳定性，提供活化剂从小球形颗粒的受控释放，或增强活化剂通过生物组织的渗透性。

35.权利要求34的方法，其中赋形剂选自：碳水化合物、阳离子、阴离子、氨基酸、类脂、脂肪酸、表面活性剂、三酸甘油酯、胆汁酸或其盐、脂肪酸酯和聚合物。

36.权利要求35的方法，其中阳离子选自Zn²⁺、Mg²⁺和Ca²⁺。

37.权利要求35的方法，其中赋形剂是胆酸或其盐。

38.权利要求37的方法，其中相分离增强剂选自泊洛沙姆，聚乙二醇及其混合物。

39.权利要求1或2的方法，其中溶液包含含水的或水可混溶的溶剂。

40.权利要求39的方法，其中水可混溶的溶剂选自：N-甲基-2-吡咯烷酮、2-吡咯烷酮、1，3-二甲基-2-咪唑烷酮、二甲亚砜、二甲基乙酰胺、乙酸、乳酸、甲醇、乙醇、异丙醇、3-戊醇、正丙醇、苯甲醇、丙三醇、聚乙二醇，聚乙二醇酯、聚乙二醇山梨聚糖、聚乙二醇-20山梨聚糖异硬脂酸酯、聚乙二醇单烷基醚、聚丙二醇、聚丙烯藻酸酯、聚丙二醇-10丁二醇、聚丙二醇-10甲基葡萄糖醚、聚丙二醇-20甲基葡萄糖醚、聚丙二醇-15硬脂酰基醚、丙二醇二辛酸酯/二癸酸酯、丙二醇月桂酸酯、和四氢呋喃聚乙二醇醚或其组合物。

41.权利要求1或2的方法，其中活化剂是药用活化剂。

42.权利要求41的方法，其中药用活化剂选自治疗剂、诊断剂、美容剂、营养增补剂和杀虫剂。

43.权利要求1或2的方法，其中活化剂是大分子。

44.权利要求43的方法，其中大分子选自蛋白质、多肽、碳水化合物、多聚核苷酸、病毒和核酸。

45.权利要求44的方法，其中蛋白质选自凝血级联的蛋白质、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、枯草溶菌素、卵白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、过氧化物歧化酶、溶菌酶、核糖核酸酶、透明质酸酶、胶原酶、生长激素、促血红细胞生长素、类胰岛素生长因子或其类似物、干扰素、格拉替雷、粒性细胞-巨噬细胞菌落-刺激因子、粒性细胞菌落-刺激因子、抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、Fab片段、单链抗体、聚乙二醇化的蛋白质、糖基化的蛋白质或强糖基化的蛋白质、去氨加压素、LHRH激动剂、LHRH对抗剂、加压素、环孢素、降血钙素、甲状旁腺激素、甲状旁腺激素肽和胰岛素。

46.权利要求44的方法，其中蛋白质是选自亮丙瑞林、戈舍瑞林、那法瑞林和布舍瑞林的LHRH激动剂。

47.权利要求1或2的方法，其中颗粒适用于活体内递送给需要活化剂的患者。

48.权利要求47的方法，其中活体内递送选自可注射的、吸入剂、局部给药、口服和经眼的。

49.权利要求47的方法，其中活体内递送选自肠胃外给药、直肠给药、经鼻的、经肺的、经阴道的、口腔的、舌下的、经皮的、经粘膜的、耳的、眼内的和眼睛的。

50.权利要求47的方法，其中活体内递送方法是通过肺部递送。

51.权利要求50的方法，其中颗粒适用于沉积在患者肺部的中央或周围区域中。

52.权利要求50的方法，其中用选自干燥粉末吸入器、定量吸入气雾器和喷雾器的设备递送颗粒。

53.权利要求47的方法，其中以稳定液体悬浮液递送颗粒。

54.权利要求1或2的方法，其中颗粒具有0.01μm至200μm的平均粒度。

55.权利要求1或2的方法，其中颗粒具有0.5μm至10μm的平均粒度。

56.权利要求1或2的方法，其中活化剂是颗粒重量的0.1％至100％。

57.权利要求1或2的方法，其中活化剂是颗粒重量的75％至100％。

58.权利要求1或2的方法，其中活化剂等于或大于颗粒重量的90％。

59.权利要求1或2的方法，其中小球形颗粒具有窄粒度分布。

60.权利要求59的方法，其中90百分位点小球形颗粒的容积直径与10百分位点容积直径的比率小于或等于5。

61.权利要求1或2的方法，其中小球形颗粒是半结晶或非结晶的。

62.一种制备活化剂小球形颗粒的方法，该方法包括如下步骤：

在含水或水可混溶性的溶剂中溶解活化剂和相分离增强剂，以形成单一连续相的溶液，和

引发相转变，从而使活化剂发生液固相分离，以形成包含固体、活化剂小球形颗粒的固相和包含相分离增强剂的液相，其中所述引发包括冷却溶液。

63.权利要求62的方法，其中溶液具有相转变温度，第一温度和第二温度，并且将溶液从第一温度冷却至第二温度，其中第一温度高于相转变温度，第二温度低于相转变温度。

64.权利要求62或63的方法，其中冷却步骤以从0.2℃/分钟至50℃/分钟的受控速度进行。

65.权利要求1的方法，其中所述引发包括将溶液冷却至高于该溶液凝固点的温度。

66.权利要求65的方法，其中所述冷却以大于25.6℃/分钟的受控速度进行。

67.权利要求1的方法，其中相分离增强剂包括泊洛沙姆和聚乙二醇的混合物。

68.权利要求1的方法，其中第一溶剂是水。

69.权利要求1的方法，其中小球形颗粒的几何标准偏差小于2.5。

70.权利要求69的方法，其中几何标准偏差小于1.8，以及90百分位点小球形颗粒的容积直径与10百分位点容积直径的比率小于3。

71.权利要求1的方法，进一步包括使颗粒封装在成壁材料的基体内部。

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