CN1764842B - 微芯片、用于提取核酸的试剂盒以及核酸的提取方法 - Google Patents

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Abstract

提供了一种新的技术手段，其可以以低成本进行生产和制备，并且，其中，可以抑制在液体样品的流动过程中产生停滞，可以平稳简单地注射、填充和输送微珠，并且也可以抑制灰尘产生；并提供了一种新的核酸提取方法，其采用了所述的新技术手段。微芯片具有一个微通道(3)，由在上下基底(1，2)的连接面中形成的沟槽部(11，21)界定。在微通道(3)中，设有使得在截面的上下、左右或上下左右的中间部的使通道截面减小的间隙部(31)，从而拦截了微珠。

Description

微芯片、用于提取核酸的试剂盒以及核酸的提取方法
技术领域
本发明涉及微芯片、用于提取核酸的试剂盒以及核酸的提取方法。
本申请要求以于2003年3月24日在日本提交的日本专利申请2003-081605为优先权，通过参考将其应用于本申请。
背景技术
通常，已知微芯片技术采用微细加工技术如平板蚀刻(lithography)等，在基底如玻璃的表面上形成深100μm且宽约500μm或更小的沟槽，该沟槽被用作液体或气体的微通道，以便进行化学反应、生化反应、溶剂萃取、气液分离，以及在此基础上进一步进行微量组分化学分析或非接触式光学分析。
就微芯片技术而言，本申请的发明人也提出一种测量方法，将作为反应载体的微珠插入微通道，并在微通道中设有坝型检测部(文献1)。
随着分子遗传学或分子生物学的最新进展，以及其应用扩展到医疗保健领域，从液体样品中提取核酸已成为一个非常重要的问题。因此，已经研究采用微芯片技术来提取核酸。迄今，已提出采用二氧化硅珠的方法、采用二氧化硅微柱的方法或采用二氧化硅膜的方法(文献2-4)。
然而，在常规的微芯片技术中，例如通过采用二氧化硅微柱或二氧化硅过滤器来提取核酸的方法，都具有这样的的基本问题，即不期望的高成本，并且当二氧化硅微柱或二氧化硅过滤器被污染时，它们不能用新的微柱或新的二氧化硅膜来代替。此外，在现有的采用微珠诸如二氧化硅等的方法中，高压是必需的，以便将微珠注入微通道。因此，微通道不能轻易地用珠填满。
在采用坝型检测部拦截微珠的常规方法中，在液体样品的流动过程中容易引起停滞，因而难以平稳方便地输送诸如二氧化硅等的微珠。
此外，通常情况下，当通过采用以玻璃或石英作为微芯片的基底而形成微通道时，在通道中容易产生灰尘，并且特别难以清除灰尘。
下面显示了相关的文献。这些文献作为参考应用于本申请。
1：K.Sato et al.，Anal.Chem.72，1144-1147(2000)。
2：L.Ceriotti et al.，(2002)Proceedings of the micro TAS 2002 symposiumNara，pp.175-177。
3：J.Kim et.al.，(2002)Proceedings of the micro TAS 2002 symposium，Nara，pp.224-226。
4：Q.Wu et al.，(2002)Proceedings of the micro TAS 2002 symposium，Nara，pp.198-200。
发明内容
因此，为了解决相关领域的上述问题，本发明的一个目的就是提供一种新技术的微芯片，以及一种采用该微芯片的核酸提取新方法，其中所述新技术作为采用微珠的微芯片技术可以以低成本进行生产和制备，可以抑制在液体样品流动过程中的停滞(stagnation)产生，可以平稳简单地注射、填充和输送微珠，并且也可以抑制灰尘的产生，其中所述微珠不仅能有效地用于提取核酸，而且也可用作各种类型的反应载体。
为实现上述目的，根据本发明的微芯片具有由设在上下基底的连接面中的沟槽部形成的微通道，该微通道设有间隙部，所述间隙部使得在截面的上下、左右以及上下左右的中间部的通道截面减小。该间隙部可由沟槽部中的凸出部形成。此外，该间隙部可以由分别设在上下基底内的沟槽部中的对向设置的凸出部形成。而且，间隙部可以通过将一个基底的凸出部插入到另一基底的沟槽部中而形成。此外，间隙部的截面尺寸可以通过上下基底的至少一个可移动凸出部而改变。
更进一步，间隙部的截面尺寸为可以拦截插入微通道中的微珠所需的尺寸。微通道的内壁表面可以用表面处理剂修饰。
更进一步，根据本发明的用于提取核酸的试剂盒包括：上述微芯片和具有表面羟基的微珠。具有表面羟基的微珠为直径10μm或更小的二氧化硅微珠、中空的二氧化硅微珠和树脂微珠中的至少一种。在内壁表面上具有表面羟基的微芯片的微通道中，表面羟基可以通过表面处理剂进行被覆处理。该表面处理剂为一种硅烷偶联剂(coupling agent)，其含有三烷基卤代硅烷作为一种主要组分。
此外，一种用于核酸的提取方法采用了用于提取核酸的上述试剂盒。待处理液体中的核酸被吸附到微芯片的微通道中的微珠表面上。更进一步，在存在离液序列高的离子的条件下，核酸可以被吸附到微珠表面上。
附图说明
图1的分解透视图，示意性地显示了一个微芯片。
图2A和2B为从图1中的方向A和B所观察到的间隙部31的截面图。
图3A-3C的截面图显示了其它实例的间隙部31。
图4A和4B的截面图显示了另一间隙部31的一个实例。
图5为光学显微镜照片的示意图，其示例作为一种实施例的DNA的吸附。
具体实施方式
现在将参照附图描述根据本发明的微芯片、用于提取核酸的试剂盒以及核酸提取方法的一种实施式。
图1和2示意性地显示了根据本发明的微芯片的局部结构。图1显示了下基底1与上基底2分开的状态。图2显示了从图1所示的箭头A和B标记的方向观察，间隙部31的局部截面图，其中当上下基底1和2连接在一起时，该间隙部设在微通道3中。
例如，在图1和2所示的微芯片中，微通道3由设在上下基底1和2的连接面中的沟槽部11和21形成。在微通道3中，设有使得截面的上下的中央部的通道截面减小的间隙部31。
更具体地，在图1和2所示的实施例中，上下基底1和2的沟槽部11和21相互对向设置以形成微通道3。分别设在沟槽部11和21中的凸出部12和22相互对向设置以形成间隙部31。
间隙部31可以位于微通道3截面的中间部分，所述间隙部不仅可以位于截面上下的中间部分，如同图2所示的狭缝型孔，而且也可以位于截面左右的中间部分，例如，如图3A示意性地显示的那样，或者在截面上下左右的中间部分，如图3B所示。应当理解，间隙部31的截面可以为各种形状。例如，如图3C所示，间隙部的截面可以为圆形。通过用于形成微芯片的沟槽部11和21以及其凸出部12和22的微细加工方法或其条件，以及注入微通道等中的微珠的种类或尺寸，可以确定这些形状。
间隙部31可以不由分别设在上下基底1、2的各沟槽部中11和21中的凸出部12和22形成。例如，如图4所示，微通道3本身例如由设在下基底1中的沟槽部11形成。上基底2设置成一个盖板。在微通道3的结构中，设在上基底2中的凸出部23插入沟槽部11中。凸出部23与沟槽11中的凸出部12相互对向以形成间隙部31。
应当理解，除了由上述凸出部12、22和23组成的结构外，间隙部31可以具有各种结构。
而且，这些凸出部12、22和23不仅可采用微细加工方法通过对基底1和2进行平板蚀刻(lithography etching)形成，而且也可以例如通过聚合物的硬化而形成。此外，可以由相对于微通道3在外部的微型元件的作用，或者可以将微通道3本身变形来形成间隙部31。
在任一种情况下，在根据本发明的微芯片中，微通道3或间隙部31可以简单地以低成本来生产和制备。而且，由于间隙部31设在微通道3截面的中间部分，当将微珠注入微通道3时，可以抑制在流体如液体或气体的流动过程中产生停滞，可以平稳简单地注射微珠，并且也可以拦截微珠。
当如上所述使用微珠时，设在微通道3中的间隙部31具有可拦截注入微通道3的微珠的截面尺寸。此外，例如可考虑移动上述凸出部或与凸出部具有相同功能的元件，从而可以改变间隙部的截面尺寸31。在其截面尺寸发生改变的间隙部31中，拦截微通道3中的微珠后，截面可大大增加，从而微珠可以移动到下游区域。通常，为了排出微珠，需要从与注射方向相反的方向排出微珠。然而，在其截面可改变的间隙部31中，可以在与注射方向相同的前进方向排出微珠。
例如，在如上所述的根据本发明的微芯片中，根据其使用目的、物体的类型或性能，内壁表面可以采用表面处理剂修饰，从而使得样品原料、杂质、灰尘等不粘附到微通道3。例如，在由玻璃或石英制成的微芯片的情况下，表面羟基通常存在于微通道3的内壁表面上。因此，表面羟基有可能连接到核酸，从而使原料诸如核酸等很难被提取和分离。在这种情况下，将表面羟基用表面处理剂有效地被覆，以使表面羟基失活。根据本发明的微芯片与微珠结合以获得一种特别有用的试剂盒，所述试剂盒可用于常见的化学合成或分析。具体是，在本发明中，提供了一种这样的试剂盒，其为用于提取核酸的试剂盒，该试剂盒包括上述微芯片和具有表面羟基的微珠。
在这种情况下，对于具有表面羟基的微珠，优选直径为10μm或更小的二氧化硅微珠、中空的二氧化硅微珠以及由树脂诸如表面上添加有羟基的聚苯乙烯等制成的珠。根据其比重水平，直径为10μm或更大的二氧化硅微珠几乎不能在微通道3中得以输送。
而且，在根据本发明的用于提取核酸的试剂盒中，对于具有表面羟基的微通道内壁表面，表面羟基优选用硅烷偶联剂被覆处理。
最优选带有一个卤素原子的三烷基卤代硅烷，其为一种硅烷偶联剂，采用了由下述通式所代表的一种化合物。
通式：
Figure S04808284319950405D000051
在这里，公式中的R1、R2和R3代表相同或不同的烷基。X代表卤素原子，如氯原子。在硅烷化合物具有两个或多个卤素原子诸如氯原子等的情况下，有可能产生灰尘，不仅是由于卤素原子作为反应基团与内壁表面上的羟基发生反应，而且由于分子的聚合反应。因此，制约着上述硅烷化合物的用途。
作为一种核酸提取方法，例如，在图1和2所示的微芯片的实例中，从液体导入部4注射包含微珠的液体。在微通道3中，在间隙部31中拦截包含微珠的液体。随后，从液体导入部5导入样品以允许微珠吸附核酸。残留的液体从排放部6排出，通过吸附使核酸得以提取。通过导入解吸液，可以使被吸附的核酸从微珠解吸。随后，优选在存在离液序列高的离子的条件下提取核酸。
根据本发明，可以简单高效地提取核酸。
现在，下面显示了实施例并进行了更具体地描述。应当理解，本发明不局限于下述实施例。
(实施例1)输送微珠
准备一个由玻璃制成的微芯片(图1)，其具有直径为50μm且长60mm的微通道，并在中间部分含有一个检测结构。由微通道的上部和下部中的凸出部形成具有坝型拦截结构的间隙部。位于微通道中间部分的该间隙部形成垂直长度为2μm、水平长度为50μm的狭缝形状。微通道的一部分用作注射部，并且另一部分用作排放部。在注射部设置一个液体容器，并且将一个微量管连接到排放部。组装一个实验系统，其中，注射泵连接到排放部的微量管，并且注入液体容器中的液体可以通过操作注射泵而吸出并注入微通道。在这里，将悬浮在纯水中的微珠注入液体容器，并采用光学显微镜观察微珠在微通道中的输送。制备了二氧化硅微珠(直径为10μm或更小)、二氧化硅微珠(直径为10μm或更大)、中空的二氧化硅微珠(直径为2-20μm)和表面添加有羟基的聚苯乙烯微珠(直径为20μm)作为微珠。以10μl/分的流速吸取包含微珠的液体。除二氧化硅微珠(直径为10μm或更大)之外，所有微珠都令人满意地在微通道中输送并且可以在紧接拦截结构的间隙部前方的部分中形成珠柱。另一方面，当采用直径为10μm或更大的二氧化硅微珠进行相同实验时，输送在微通道的半途中停止，从而不能充分地形成柱。特别是，中空的二氧化硅微珠和表面添加有羟基的聚苯乙烯微珠可以令人满意地得以输送，如同二氧化硅纳米珠(珠直径为1μm或更小)那样。
当将纯水放入液体容器并注入微通道时，除二氧化硅微珠(直径为10μm或更大)之外，所述微珠可以在微通道中输送并排放到注射泵。
(实施例2)微通道内壁的表面修饰处理过程
由玻璃或石英制作的微芯片的情况下，为防止核酸粘附到微通道的内壁表面，微通道内壁上的表面羟基需要被被覆。为了被覆表面羟基，广泛采用一种通过具有可与烷基反应的反应基团的硅烷偶联剂进行的表面修饰处理方法。因此，在微通道内壁的处理过程中，可通过采用硅烷偶联剂实现表面修饰过程。然而，常用的十八烷基三氯硅烷具有三个氯原子作为用于修饰表面的反应基团，而且其不仅与微通道内壁上的表面羟基反应，还通过分子聚合形成聚合物。因此，十八烷基三氯硅烷分子相互反应形成聚合物，从而产生灰尘。不是在微通道而是在平的基底如幻灯片玻璃的表面修饰过程中产生的灰尘可采用溶剂冲洗，不会产生问题。然而，在微通道内壁的修饰过程中产生的灰尘不能轻易地被洗掉。当将拦截结构设在微通道中时，灰尘特别难清除。在微通道中残留的灰尘不仅阻碍在微通道中输送液体或珠，而且在核酸的吸附过程中引起麻烦。此外，也广泛采用了二氯二甲基硅烷，其具有两个氯原子作为反应基团。然而，二氯二甲基硅烷具有低沸点(70℃)和高挥发性，因而其安全性很低。而且，由于二氯二甲基硅烷具有两个反应基团，不能完全防止由于分子聚合而产生聚合物。
因此，研究了一种含有单个反应基团的表面修饰剂，原则上不产生聚合物，沸点高且挥发性低，具有高安全性，并且该液体在常温下可轻易地被处理。例如，三乙基氯硅烷具有一个氯作为反应基团部分，并且原则上不产生聚合物。此外，由于三乙基氯硅烷的沸点为145℃且熔点为-50℃，在常温下，三乙基氯硅烷具有低挥发性。而且，由于三乙基氯硅烷为液体，三乙基氯硅烷很容易用溶剂如甲苯稀释，并且很容易被处理。
采用三乙基氯硅烷或十八烷基三氯硅烷进行了微通道内壁的表面修饰过程。以无水甲苯作为溶剂，分别制备它们的5％溶液。采用实施例1中描述的实验系统，比较两种溶液。将制备的溶液注入液体容器中并由注射泵抽吸，以便将溶液注入微通道。流动速率设10μl/分，并且注射50μl溶液以进行表面修饰。随后，在表面处理后，注射50μl或更多的无水甲苯以洗涤微通道。洗涤期间，采用光学显微镜观察微通道。在十八烷基三氯硅烷中，微通道内生产灰尘，然而，在三乙基氯硅烷中，不生产灰尘。在三乙基氯硅烷中，将浓度进一步增加到10％并进行相同的过程。随后，未产生灰尘。
(实施例3)在微通道中提取核酸
在实施例1中描述的实验系统被用于设法吸附核酸。以与实施例2中描述的相同方式，采用10％三乙基氯硅烷处理微通道内壁的表面。ColE1 DNA被用作核酸。饱和碘化钠溶液被用作离液序列高的离子溶液。使0.2g在实施例1中描述的微珠悬浮在1升碘化钠溶液中。从液体容器中将25μl获得的溶液注入微通道以形成一个柱。作为一种溶剂，用碘化钠制备1％DNA溶液，并且从液体容器将DNA溶液注入微通道。接着，将SYBRGreen I溶液作为DNA的荧光燃料，从液体容器注入微通道。当采用光学显微镜观察微通道时，辨认出仅二氧化硅微珠41的柱部分42发射荧光，如图5所示。辨认出DNA被实施例1中使用的二氧化硅微珠41吸附。除柱部分42之外，在微通道中未发现荧光，并且确定DNA未吸附到微通道的内壁表面上。
采用在实施例1中描述的实验系统检测了核酸的吸附和解吸。该实验系统和如上所述的相同。将在实施例1中描述的微珠注入微通道以形成柱，并随后注射核酸。将Lambda DNA用作核酸。采用光学显微镜确定LambdaDNA到微珠的吸附。准备60℃或更高温度的热纯水，并从液体容器注入微通道。随后确定Lambda DNA从微珠解吸。
如上所述，由于确定核酸可吸附到微珠并从微珠解吸，发现可以在微通道中实现核酸的提取。
本领域普通技术人员应当理解，本发明不局限于上述参照附图描述的实施例和例子，并且在不背离附属的权利要求及其主旨的前提下，可以进行各种改变、替代或等同实验。
工业实用性
如上详细描述的，根据本发明，可以提供一种新的技术手段，其可以作为采用微珠的微芯片技术以低成本进行生产和制备，所述微珠不仅有效地用于提取核酸，而且可用作各种反应载体，并且所述新的技术方法可以抑制在液体样品的流动过程中产生停滞，可以平稳简单地注射、填充和输送微珠，并且也可以抑制产生灰尘。此外，可以提供一种采用该新技术手段的新的核酸提取方法。

Claims (18)

1.一种微芯片，其含有一个微通道，所述微通道由设在上下基底的连接面中的沟槽部形成，其中，所述微通道设有使得截面的上下、左右或上下左右的中间部的通道截面减小的间隙部，所述间隙部由分别设在上下基底内的沟槽部中的对向凸出部形成。
2.根据权利要求1的微芯片，其中，所述间隙部是通过将一个基底的凸出部插入另一基底的沟槽部中而形成。
3.根据权利要求1的微芯片，所述间隙部的截面尺寸可通过上下基底的至少一个可移动凸出部而改变。
4.根据权利要求2的微芯片，所述间隙部的截面尺寸可通过上下基底的至少一个可移动凸出部而改变。
5.根据权利要求1的微芯片，其中，所述间隙部的截面尺寸为拦截插入微通道的微珠所需的尺寸。
6.根据权利要求2的微芯片，其中，所述间隙部的截面尺寸为拦截插入微通道的微珠所需的尺寸。
7.根据权利要求3的微芯片，其中，所述间隙部的截面尺寸为拦截插入微通道的微珠所需的尺寸。
8.根据权利要求4的微芯片，其中，所述间隙部的截面尺寸为拦截插入微通道的微珠所需的尺寸。
9.根据权利要求1-8中任一项的微芯片，其中，微通道的内壁表面用表面处理剂修饰。
10.根据权利要求9的微芯片，其中，所述表面处理剂为一种硅烷偶联剂，该硅烷偶联剂含有三烷基卤代硅烷作为一种主要组分。
11.根据权利要求10的微芯片，其中所述三烷基卤代硅烷是三乙基氯硅烷。
12.一种用于提取核酸的试剂盒，包括：
根据权利要求1-11中任一项的微芯片；以及
具有表面羟基的微珠。
13.根据权利要求12的用于提取核酸的试剂盒，其中，具有表面羟基的微珠为直径为10μm或更小的二氧化硅微珠、中空的二氧化硅微珠和树脂微珠中的至少一种。
14.根据权利要求12或13的用于提取核酸的试剂盒，其中，在内壁表面上具有表面羟基的微芯片的微通道中，所述表面羟基被覆有表面处理剂。
15.根据权利要求14的用于提取核酸的试剂盒，其中，所述表面处理剂为一种硅烷偶联剂，该硅烷偶联剂含有三烷基卤代硅烷作为一种主要组分。
16.根据权利要求15的试剂盒，其中所述三烷基卤代硅烷是三乙基氯硅烷。
17.一种核酸提取方法，采用了根据权利要求12-16中任一项的用于提取核酸的试剂盒，其中，待处理液体中的核酸被吸附到微芯片的微通道中的微珠表面。
18.根据权利要求17的核酸提取方法，其中，在存在离液序列高的离子的条件下，核酸被吸附到微珠表面。
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