CN1745173B

CN1745173B - 能赋予除草剂抗性的基因

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Publication number: CN1745173B
Application number: CN2003801092570A
Authority: CN
Inventors: P·E·哈默; N·B·达克
Original assignee: Athenix Corp
Current assignee: Athenix Corp
Priority date: 2002-12-18
Filing date: 2003-12-18
Publication date: 2012-11-28
Anticipated expiration: 2023-12-18
Also published as: EP1581642A4; WO2004056179A9; CA2510446C; WO2004056179A2; CN1745173A; US7399621B2; WO2004056179A3; DE60336849D1; US7405347B2; US20080312419A1; EP1581642A2; US20070004907A1; AU2003299832B2; US7659376B2; CA2510446A1; BR0317579A; ATE506438T1; US20040177399A1; AU2003299832A1; BRPI0317579B1

Abstract

本发明提供了能向植物、植物细胞、组织和种子赋予除草剂抗性的组合物和方法。提供的组合物包含能赋予对草甘膦除草剂的抗性或耐受性的多肽的编码序列。该编码序列可以用于在植物中转化和表达的DNA构建体或表达盒中。组合物中还含有转化的植物、植物细胞、组织和种子。更具体地，提供了分离的与草甘膦抗性核酸序列相对应的核酸分子。另外，也包括了与多核苷酸相对应的氨基酸序列。更具体地，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列或SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

Description

能赋予除草剂抗性的基因

技术领域

本发明提供了能编码除草剂抗性的新基因，其可以用于植物生物学、作物育种和植物细胞培养。

背景技术

N-膦酰基甲基甘氨酸(通常称作草甘膦)是一种重要的农用化学物质。草甘膦能抑制将磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和3-磷酸基莽草酸转化成5-烯醇丙酮基-3-磷酸基莽草酸的酶。对该酶(5-烯醇丙酮基莽草酸(酯)-3-磷酸(酯)合酶；在本文中称作″EPSP合酶″)的抑制会通过关闭莽草酸(酯)途径来杀死植物细胞，由此抑制芳族酸的生物合成。

由于草甘膦类除草剂能抑制芳族氨基酸的生物合成，它们不但会杀死植物细胞，而且对于细菌细胞也是有毒性的。草甘膦能抑制许多细菌EPSP合酶，因而对这些细菌是有毒性的。但是，某些细菌EPSP合酶对草甘膦具有较高的耐受性。以前已经分离出了几种这样的细菌EPSP合酶。分析已有的草甘膦抗性的和敏感性的EPSP合酶的序列，无法预测下述结果：给定的EPSP合酶是草甘膦抗性的还是草甘膦敏感性的，或者任意氨基酸序列对草甘膦抑制的抗性水平。而且，由已知的EPSP合酶的序列不能预测能编码EPSP合酶活性的所有序列，也不能预测氨基酸序列对草甘膦的抗性水平。

通过转化植物细胞，使其表达草甘膦抗性的细菌EPSP合酶，可以生产能抗草甘膦毒性的植物细胞。特别地，已经用来自根瘤农杆菌株CP4的细菌基因而在植物中表达以向植物细胞赋予除草剂抗性。来自鼠伤寒沙门氏菌株CT7的突变的EPSP合酶能在细菌细胞中赋予草甘膦抗性，并向植物细胞赋予草甘膦抗性(美国专利号4,535,060；4,769,061；和5,094,945)。但是，仍然需要其它的除草剂抗性基因。

发明内容

本发明提供了能向植物、植物细胞、组织和种子赋予除草剂抗性的组合物和方法。提供了组合物，其中包含能赋予对草甘膦除草剂的抗性或耐受性的多肽的编码序列。该编码序列可以用于在植物和其它生物体中转化和表达的DNA构建体或表达盒中。组合物中还含有转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。

更具体地，提供了分离的与草甘膦抗性核酸序列相对应的核酸分子。另外，也包括与多核苷酸相对应的氨基酸序列。更具体地，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列或SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列、以及它们的突变体和变体。

附图说明

图1显示了GRG-1蛋白(SEQ ID NO：2)与相关蛋白的比对。

图2A和B显示了GRG-1蛋白(SEQ ID NO：2)与相关蛋白的比对。

图3A和3B显示了GRG-1蛋白(SEQ ID NO：2)与相关蛋白的比对。

发明详述

本发明涉及用于调节生物体、特别是植物或植物细胞中的除草剂抗性的组合物和方法。该方法包括用编码本发明草甘膦抗性基因的核苷酸序列转化生物体。更具体地，本发明的核苷酸序列可以用于制备表现出增强的对除草剂草甘膦的耐受性的植物。因而，提供了转化的植物、植物细胞、植物组织和种子。本发明的组合物包含与植物的草甘膦耐受性有关的核酸和蛋白。更具体地，公开了草甘膦抗性基因(glyphosate resistance gene，GRG)的核苷酸序列和由其编码的蛋白质的氨基酸序列。该序列可以用于构建表达载体，以便随后转化进目标植物中，作为分离其它草甘膦抗性基因的探针、作为选择标记等。

定义

″草甘膦″包括N-膦酰基甲基甘氨酸(包括其任意盐)的任意除草剂形式和能在植物中引起草甘膦阴离子生成的其它形式。″草甘膦抗性基因″或″GRG″或″编码草甘膦抗性的核酸序列″包括编码全部或部分草甘膦抗性蛋白的DNA片段。它包括能在细胞中表达草甘膦抗性蛋白的DNA片段，例如基因。

″草甘膦抗性蛋白″包括能向细胞赋予下述能力的蛋白：使其比不表达该蛋白的细胞耐受更高浓度的草甘膦，或者使其比不表达该蛋白的细胞耐受更长时间的特定浓度的草甘膦。这种在存在草甘膦情况下的存活能力是由于具有″草甘膦抗性活性″的蛋白所致。″耐受″是指能存活，或能实现基本的细胞功能，例如蛋白质合成和呼吸作用。

″植物细胞″包括所有已知形式的植物，包括未分化的组织(例如愈伤组织)、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、植物种子、花粉、繁殖体、胚等。″植物表达盒″包括DNA构建体，其能在植物细胞中引起从开放阅读框表达蛋白。典型地，它们含有启动子和基因。通常，这样的构建体还会含有3′非翻译区。应当理解，如果构建体本身不含有3′转录终止信号，转录仍然会通过最临近的可接受序列的转录装置的识别来终止。通常，这样的构建体可以含有′信号序列′或′前导序列′，以促进肽向某些细胞内结构的共翻译或翻译后运输，所述结构例如叶绿体(或其它质体)、内质网或高尔基体。

″信号序列″包括已知或怀疑能导致穿过细胞膜的共翻译或翻译后肽转移的序列。在真核细胞中，其通常涉及向高尔基体中的分泌，有些会导致糖基化。″先导序列″包括在翻译时能产生足以触发肽链向亚细胞细胞器共翻译地转运的氨基酸序列的任意序列。因而，其包含靶向转运和/或糖基化，通过进入内质网、液泡质体，包括叶绿体、线粒体等质体的前导序列。

″植物转化载体″包括对于有效转化植物细胞必需的DNA分子。这样的分子可以含有一个或多个植物表达盒，且可以组织成超过1个“载体”DNA分子。例如，二元载体是使用2个非邻接的DNA载体来编码转化植物细胞的所有必需顺式和反式作用功能的植物转化载体(Hellens和Mullineaux(2000)Trends in Plant Science 5：446-451)。

″载体″是指设计成在不同的宿主细胞之间进行转移的核酸构建体。″表达载体″是指能在外来细胞中掺入、整合和表达异源DNA序列或片段的载体。

″转基因植物″或″转化的植物″或″稳定地转化的植物或细胞或组织″是指已经整合或掺入了“未转化的”植物或植物细胞中不存在的外源核酸序列或DNA片段的植物。

″异源的″通常是指核酸序列，其对于细胞不是内源的、或不是它们存在于其中的天然基因组的一部分，且已经通过感染、转染、显微注射、电穿孔、显微轰击(microprojection)等添加到细胞中。

″启动子″是指起指导下游基因转录的作用的核酸序列。启动子与其它的转录和翻译调节核酸序列(也称作″控制序列″)一起都是表达目标基因所必需的。

这里提供了能赋予草甘膦抗性的新基因。而且提供了该基因的DNA序列。另外提供了GRG-1蛋白的氨基酸序列。由该基因翻译出的蛋白使得细胞能在原本对细胞(包括植物细胞和细菌细胞)有毒性的草甘膦浓度存在的情况下发挥作用。

优选的本发明的草甘膦抗性蛋白具有基本上与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相同的氨基酸序列。术语“基本上相同”在本文中用于指第一氨基酸或核苷酸序列含有足够的或最小数目的与第二氨基酸或核苷酸序列相同的或等同的(例如具有类似的侧链)氨基酸残基或核苷酸，使得第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有至少约45％、约55％、或约65％相同性，优选至少约75％相同性，更优选至少约85％、最优选至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％相同性。

基本上相同的序列具有共同的功能活性，且可以具有一个或多个共同的结构域或基序，例如如图3A、B和C中所示的那些。通过本领域已知的方法，可以确定除草剂抗性蛋白的功能活性。参见，例如，Osuna等，(2001)Pest Manag.Sci.59：1210-1216；Ye等，(2001)Plant J.25：261-270。

为了确定2个氨基酸序列或2个核酸之间的相同性百分比，对序列进行了最佳对比目的的比对。2个序列之间的百分比同一性是序列之间共有的相同位点数目的函数(即，百分比同一性＝相同位点的数目/位点(例如重叠位点)的总数目×100)。在一个实施方案中，2个序列是相同的长度。使用与下述所述类似的技术，允许或不允许缺口，可以检测2个序列之间的百分比同一性。在计算百分比同一性时，通常计算准确匹配。

使用数学算法，可以确定2个序列之间的百分比同一性。用于比较2个序列的数学算法的一个优选的、非限制性的实例是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264的算法，并按照Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中所述进行了改进。将这样的算法并入Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLASTN和BLASTX程序。使用BLASTN程序可以进行BLAST核苷酸搜索，其中分数＝100、字长＝12，从而得到与本发明的GRG-样核酸分子同源的核苷酸序列。使用BLASTX程序可以进行BLAST蛋白搜索，其中分数＝50、字长＝3，从而得到与本发明的草甘膦抗性蛋白分子同源的氨基酸序列。为了得到有缺口的比对以用于比较目的，可以使用有缺口的BLAST，如Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389所述。或者，可以使用PSI-Blast进行重复搜索，其可以检测分子之间的距离关系。参见Altschul等，(1997)上文。当使用BLAST、有缺口的BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用各程序的默认参数(例如，BLASTX和BLASTN)。见，www.ncbi.nlm.nih.gov。用于比较序列的数学算法的另一个优选的、非限制性的实例是ClustalW算法(Higgins等，(1994)Nucleic Acids Res.22：4673-4680)。ClustalW可以比较序列，并比对完整的氨基酸或DNA序列，从而可以提供关于完整氨基酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法已被用于几种商业上可获得的DNA/氨基酸分析软件包中，例如载体NTi程序组(Informax，Inc)的ALIGNX模块。使用ClustalW比对氨基酸序列后，可以评价氨基酸同一性百分比。可用于分析ClustalW比对的软件程序的一个非限制性的实例是GeneDoc^TM。Genedoc^TM(KarlNicholas)可以评价多个蛋白之间的氨基酸(或DNA)的相似性和同一性。用于比较序列的数学算法的另一个优选的、非限制性的实例是Myers和Miller(1988)CABIOS4：11-17的算法。这样的算法被引入到ALIGN程序(2.0版)中，它是GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120加权残基表，缺口长度罚分为12，缺口罚分为4。

″分离的″或″纯化的″核酸分子或蛋白、或其生物学活性部分基本上不含有其它的细胞物质，或者当通过重组技术生产时，基本上不含有培养基，或者当化学合成时，基本上不含有化学前体或其它化合物。优选地，″分离的″核酸中不含有该核酸的来源生物体的基因组DNA中天然位于所述核酸侧翼(即，位于该核酸的5′和3′末端的序列)上的序列(优选地蛋白编码序列)。为了本发明的目的，当提及核酸分子时，″分离的″不包括分离的染色体。例如，在不同的实施方案中，分离的编码草甘膦抗性的核酸分子可以含有该核酸的来源细胞中基因组DNA内天然位于该核酸分子侧翼的小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列。基本上不含有细胞物质的草甘膦抗性蛋白包括含有小于约30％、20％、10％、或5％(以干重计)非草甘膦抗性蛋白(在本文中也称作″污染蛋白″)的蛋白质制剂。在下面的部分中更详细地描述了本发明的各个方面。

分离的核酸分子

本发明的一个方面涉及分离的核酸分子，其中包含编码草甘膦抗性蛋白和多肽或其生物学活性片段的核苷酸序列，以及足以用作杂交探针以鉴别编码草甘膦抗性的核酸的核酸分子。如本文所使用的，术语″核酸分子″意在包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如，mRNA)和使用核苷酸类似物生成的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链的或双链的，但是优选是双链的DNA。

编码本发明蛋白质的核苷酸序列包含如SEQ ID NO：1所示的序列和其互补体。″互补体″是指这样的核苷酸序列，其与特定的核苷酸序列基本上互补，使得它可以与该特定的核苷酸序列杂交，由此形成稳定的双链体。由这些核苷酸序列编码的草甘膦抗性蛋白的对应氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明也包括包含编码部分长度的草甘膦抗性蛋白的核苷酸序列的核酸分子，包括如SEQ ID NO：1所示的序列和其互补体。

本发明也包括这样的核酸分子，其是这些编码草甘膦抗性的核苷酸序列的片段。″片段″是指编码草甘膦抗性蛋白的核苷酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码草甘膦抗性蛋白的生物学活性片段，或者它可以是可以用作使用下述方法的杂交探针或PCR引物的片段。根据目的用途，作为草甘膦抗性核苷酸序列的片段的核酸分子含有至少约15、20、50、75、100、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250个核苷酸，或高达本文公开的全长草甘膦抗性编码核苷酸序列中的核苷酸数目(例如，SEQ ID NO：1的1293个核苷酸)。

本发明的编码草甘膦抗性的核苷酸序列的片段(其编码本发明蛋白的生物学活性片段)可以编码至少约15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、或400个毗邻的氨基酸，或高达本发明的全长草甘膦抗性蛋白中存在的氨基酸的总数目(例如，本发明蛋白的432个氨基酸)。

本发明还包括变体核酸分子。编码草甘膦抗性的核苷酸序列的″变体″包括编码本文公开的草甘膦抗性蛋白、但是因为遗传密码的简并性而有保守性差异的那些序列。使用众所周知的分子生物学技术，例如聚合酶链式反应(PCR)和如下所述的杂交技术，可以鉴别出这些天然存在的等位基因变体。变体核苷酸序列还包括合成地衍生的核苷酸序列，其是例如通过定位诱变产生的，但是仍然编码本发明公开的草甘膦抗性蛋白，这在下文中有进一步讨论。通常，本发明的核苷酸序列变体与本文所述的特定核苷酸序列会具有至少约45％、55％、65％、75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。变体核苷酸序列将编码草甘膦抗性蛋白，其氨基酸序列与本文所述的草甘膦抗性蛋白的氨基酸序列具有至少约45％、55％、65％、75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。如通过本领域已知的方法(例如实施例8所述的那些)所测定的，这些变体也会保留功能活性。

技术人员还能明白，通过突变可以向本发明的核苷酸序列中导入改变，由此造成所编码的草甘膦抗性蛋白的氨基酸序列中的改变，而不改变蛋白质的生物学活性。因而，通过向本文所述的对应的核苷酸序列中导入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失，可以建立分离的变体核酸分子，使得将一个或多个氨基酸取代、添加或缺失导入所编码的蛋白质中。通过标准技术，例如定位诱变和PCR-介导的诱变，可以导入突变。这样的变体核苷酸序列也包括在本发明中。

例如，优选地，可以在一个或多个预测的、优选非必需的氨基酸残基处生成保守的氨基酸取代。″非必需的″氨基酸残基是可以在草甘膦抗性蛋白的野生型序列中改变、而不改变生物学活性的残基，而″必需的″氨基酸残基是生物学活性所需要的。″保守的氨基酸取代″是这样的，其中氨基酸残基被替换为具有类似侧链的氨基酸残基。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙胺酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支的侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。可以在非保守区(例如如图3A、B和C所示的那些)产生氨基酸取代，其保留了功能。通常，并不对保守的氨基酸残基、或者位于保守基序中的氨基酸残基(例如表6所示的残基，其中这样的残基是蛋白活性所必需的)进行这样的取代。但是，本领域的技术人员能够明白，功能变体也可以在保守性结构域中具有微小的保守性或不保守性改变。

或者，通过沿着所有的或部分的编码序列随机导入突变，例如通过饱和诱变，可以产生变体核苷酸序列，可以对得到的突变体筛选赋予草甘膦抗性活性的能力，以鉴别保留活性的突变体。诱变后，可以重组地表达所编码的蛋白，并且可以使用标准测试技术测定蛋白质的活性。

使用PCR、杂交等方法，可以鉴别出对应的草甘膦抗性序列，这样的序列与本发明的序列基本上相同。参见，例如，Sambrook J.，和Russell，D.W.(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)和Innis，等，(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications(Academic Press，NY)。

在杂交方法中，全部或部分草甘膦抗性核苷酸序列可以用于筛选cDNA或基因组文库。构建这样的cDNA和基因组文库的方法是本领域普遍已知的，且公开在Sambrook和Russell，2001，上文中。所谓的杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段、或其它寡核苷酸，且可以标有可检测的基团，例如³²P，或任何其它的可检测标记，例如其它的放射性同位素、荧光化合物、酶、或酶辅因子。基于本文所示的已知的草甘膦抗性编码核苷酸序列，通过标记合成的寡核苷酸，可以制备出杂交探针。还可以使用依据核苷酸序列或所编码的氨基酸序列中的保守性核苷酸或氨基酸残基而设计的简并引物。探针典型地包含这样的核苷酸序列区域，其能在严格条件下与本发明的草甘膦抗性编码核苷酸序列或其片段或变体的至少约12、优选约25、更优选约50、75、100、125、150、175、200、250、300、35、或400个连续核苷酸杂交。杂交探针的制备是本领域普遍已知的，且公开在Sambrook和Russell，2001，上文中，其在这里引作参考。

在杂交技术中，将已知核苷酸序列的全部或部分用作探针，其能选择性地与来自选定生物体的克隆基因组DNA片段或cDNA片段群(即基因组或cDNA文库)中存在的其它相应核苷酸序列杂交。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段、或其它寡核苷酸，且可以标记上可检测的基团，例如³²P，或任何其它的可检测标记。因而，例如，通过标记基于本发明的GRG序列的合成寡核苷酸，可以制备出杂交探针。制备杂交探针以及构建cDNA和基因组文库的方法通常是本领域已知的，且公开在Sambrook等，(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)中。

例如，本文所述的整个GRG序列、或其一个或多个片段，可以用作能特异性地与对应的GRG-样序列和信使RNA杂交的探针。为了实现在多种条件下的特异性杂交，这样的探针包含独特的、且优选至少约10个核苷酸长、最优选至少约20个核苷酸长的序列。这样的探针可以用于通过PCR从选择的生物体中扩增对应的GRG序列。该技术可以用于从目的生物体分离额外的编码序列，或者作为检测生物中是否存在编码序列的诊断实验。杂交技术包括涂布的DNA文库(噬菌斑或菌落；参见，例如，Sambrook等，1989，上文)的杂交筛选。

可以在严格条件下进行这种序列的杂交。″严格条件″或″严格的杂交条件″是指探针能以比其它序列可检测性地更强的程度(例如，至少超过背景2倍)与其靶序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，且随不同环境而异。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴别出与探针100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可以调节严格性条件，允许序列中存在一些错配，以便检测更低程度的相似性(异源探测)。通常，探针的长度小于约1000个核苷酸，优选小于500个核苷酸。

典型地，严格条件是这样的，其中盐浓度小于约1.5M Na离子，典型地约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，pH 7.0-8.3，且对于短探针(例如，10至50个核苷酸)而言温度是至少约30℃，对于长探针而言(例如，大于50个核苷酸)温度是至少约60℃。通过加入去稳定剂例如甲酰胺，也可以实现严格条件。示例性的低严格性条件包括：在37℃用30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液进行杂交，在50至55℃用1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)洗涤。示例性的中等严格性条件包括：在37℃，在40至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交，在55至60℃，在0.5X至1X SSC中洗涤。示例性的高严格性条件包括：在37℃，在50％甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS中杂交，在60至65℃，在0.1X SSC中洗涤。任选地，洗涤缓冲液可以含有约0.1％至约1％SDS。杂交时间通常小于约24小时，一般约4至约12小时。

特异性通常是杂交后洗涤的函数，关键因素是离子强度和最终洗涤液的温度。对于DNA-DNA杂合体，可以从Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284的方程Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L估算出Tm，其中，M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中的鸟嘌呤核苷和胞嘧啶核苷的百分比，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，L是以碱基对为单位的杂合体的长度。Tm是(在特定的离子强度和pH下)50％的互补靶序列与完全匹配的探针发生杂交的温度。对于每1％的错配，Tm降低约1℃；因而，可以调节Tm、杂交和/或洗涤条件，以与具有所需同一性的序列杂交。例如，如果想得到具有≥90％同一性的序列，可以使Tm降低10℃。通常，选择严格的条件，使之比所述特定序列和其互补体在给定的离子强度和pH下的热熔点(Tm)低约5℃。但是，非常严格的条件可以使用比热熔点(Tm)低1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以使用比热熔点(Tm)低6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可以使用比热熔点(Tm)低11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。使用该方程、杂交和洗涤组合物以及所需的Tm，本领域的普通技术人员能够明白，杂交和/或洗涤溶液的严格性可以固有地变化。如果需要的错配度会导致Tm小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC的浓度，以便可以使用更高的温度。关于核酸杂交的一般指导，参见Tijssen(1993)Laboratory Techniques inBiochemistry和Molecular Biology-Hybridization with NucleicAcid Probes，Part I，Chapter 2(Elsevier，New York)；和Ausubel等，eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology，Chapter2(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)。参见，Sambrook等，1989，上文。

分离的蛋白质

草甘膦抗性蛋白也包括在本发明中。″草甘膦抗性蛋白″或″草甘膦耐受性蛋白″是指具有如SEQ ID NO：2所述氨基酸序列的蛋白及其片段、生物学活性部分和变体。

″片段″或″生物学活性部分″包括含有基本上与如SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列相同的氨基酸序列、且表现出草甘膦抗性活性的多肽片段。草甘膦抗性蛋白的生物学活性片段可以是多肽，其长度为例如10、25、50、100或更多的氨基酸。通过重组技术可以制备出这样的生物学活性片段，并评价其草甘膦抗性活性。如这里所使用的，片段包含SEQ ID NO：2中的至少约8个连续氨基酸。但是，本发明包括其它的片段，例如该蛋白中大于约10、20、30、50、100、150、200、250和300个氨基酸的任何片段。

″变体″是指这样的蛋白或多肽，其具有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列有至少约45％、55％、65％、优选约75％、约85％、最优选约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％相同性的氨基酸序列，且保留了草甘膦抗性活性。变体还包括由能在严格条件下与SEQ ID NO：1的核酸分子或其互补体杂交的核酸分子编码的多肽。变体包括由于诱变而发生氨基酸序列变化的多肽.

GRG-1可以用作转化报告物和选择标记

在本发明的一个方面，GRG-1基因可用作评价细菌或植物细胞的转化的标记。通过本领域已知的众多技术中的一种，但不限于电穿孔或化学转化(参见，例如Ausubel(ed.)，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley和Sons，Inc.(1994))，可以完成细菌细胞的转化。能赋予对毒性物质的抗性的标记可以用于从未转化的细胞(其不含有或不表达测试DNA)中鉴别出转化的细胞(已经摄入且表达测试DNA)。通过将GRG-1设计成：(1)由已知能在待测试的生物体中刺激转录的细菌启动子表达，(2)合适地翻译，产生完整的GRG-1肽，和(3)将细胞置于原本有毒性的草甘膦浓度中，则可借助于已经转化了DNA的细胞对草甘膦的抗性而将它们鉴别出来。

GRG-1可以用作植物转化的选择标记/报告物

可以以类似的方式实现植物细胞的转化。首先，以使其能在植物细胞中表达的方式加工GRG-1基因。典型地，表达这样的蛋白的构建体会含有启动子以驱动基因转录，并含有3’非翻译区以便使转录终止和多聚腺苷酸化。这样的构建体的结构是本领域熟知的。在一些情况下，可以设计基因，使得产生的肽能被分泌，或者在植物细胞中定位。例如，可以将基因设计成含有信号肽，以促进肽向内质网的转移。还可以优选地加工植物表达盒，使之含有内含子，从而其表达需要内含子的mRNA加工。

典型地，将该′植物表达盒′插入′植物转化载体′中。该植物转化载体可以含有一个或多个实现植物转化所需的DNA载体。例如，本领域的通常作法是使用含有多个连续DNA片段的植物转化载体。这些载体在本领域中通常称作′二元载体′。二元载体和带有辅助质粒的载体最常用于土壤杆菌介导的转化中，其中实现有效转化所需的DNA片段的大小和复杂度都是非常大的，且将功能分开到分离的DNA分子上是有利的。二元载体典型地含有质粒载体，其中含有T-DNA转移所需的顺式作用序列(例如左边界和右边界)，设计成能在植物细胞中表达的选择标记，和目标基因(设计成能在需要用其生成转基因植物的植物细胞中表达的基因)。该质粒载体中还存在细菌复制所需的序列。顺式作用序列以能有效地转移进植物细胞并在其中表达的方式排列。例如，选择标记基因和目标基因位于左右边界之间。第2种质粒载体一般含有反式作用元件，能介导T-DNA从土壤杆菌转移到植物细胞中。该质粒经常含有毒力功能(Vir基因)，能使土壤杆菌感染植物细胞、通过在边界序列处的切割和vir-介导的DNA转移而转移DNA，如本领域所理解的(Hellens和Mullineaux(2000)Crends in Plant Science 5：446-451)。几种类型的土壤杆菌属菌株(例如，LBA4404，GV3101，EHA101，EHA105，等)可以用于植物转化。第2种质粒载体不是通过其它方法(例如显微映象、显微注射、电穿孔、聚乙二醇等)转化植物所必需的。许多种类的载体可以用于转化植物细胞，实现草甘膦抗性。

通常，植物转化方法包括将异源的DNA转移进靶植物细胞(例如，未成熟的或成熟的胚胎、悬浮液培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)，然后应用最大阈值水平的适当选择(取决于选择标记基因，在此情况下是″草甘膦″)，从未转化的大量细胞中回收转化的植物细胞。典型地，将外植体转移到新供应的相同培养基中，并常规培养。随后，在置于添加了最大阈值水平的选择试剂(例如，″草甘膦″)的再生培养基中之后，使转化的细胞分化成嫩芽。然后将嫩芽转移到选择性生根培养基中，回收生根的芽或苗。然后使转基因苗生长成成熟的植物，并产生能繁殖的种子(例如，Hiei等，(1994)The Plant Journal 6：271-282；Ishida等，(1996)Nature Biotechnology 14：745-750)。通常将外植体转移到新供应的相同培养基中，并常规培养。关于生产转基因苗的技术和方法的一般描述，参见Ayres和Park，1994(Critical Reviews in Plant Science 13：219-239)和Bommineni和Jauhar，1997(Maydica 42：107-120)。由于转化的材料中含有许多细胞，在任何一片目标愈伤组织或组织或细胞群中都存在转化的和未转化的细胞。由于杀死未转化的细胞、并使转化的细胞繁殖的能力，得到了转化的植物培养物。通常，去除未转化的细胞的能力会限制转化的植物细胞的快速回收和转基因植物的成功生产。

通过许多方法中的一种，包括但不限于通过土壤杆菌将异源DNA导入植物细胞(土壤杆菌介导的转化)、用粘附有异源的外来DNA的颗粒轰击植物细胞(颗粒轰击)、和各种其它的非颗粒定位-介导的方法(例如，Hiei等，(1994)The Plant Journal 6：271-282；Ishida等，(1996)Nature Biotechnology 14：745-750；Ayres和Park(1994)Critical Reviews in Plant Science 13：219-239；Bommineni和Jauhar(1997)Maydica 42：107-120)来转移DNA，可以生成转基因植物。

转化方法和将核苷酸序列导入植物的方法可以随待转化的植物或植物细胞种类(即，单子叶植物或双子叶植物)而变化。将核苷酸序列导入植物细胞和随后插入植物基因组中的合适的方法包括显微注射(Crossway等，(1986)Biotechniques 4：320-334)、电穿孔(Riggs等，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606，土壤杆菌介导的转化(美国专利号5,563,055；美国专利号5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski等，(1984)EMBO R 3：2717-2722)、和射击颗粒加速(参见，例如，美国专利号4,945,050；美国专利号5,879,918；美国专利号5,886,244；美国专利号5,932,782；Tomes等，(1995)″Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells viaMicroprojectile Bombardment，″in Plant Cell，Tissue，and OrganCulture：Fundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe等，(1988)Biotechnology 6：923-926)；和Lecl转化(WO 00/28058)。也参见，Weissinger等，(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford等，(1987)ParticulateScience and Technology 5：27-37(洋葱)；Christou等，(1988)PlantPhysiol.87：671-674(大豆)；McCabe等，(1988)BiolTechnology6：923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(大豆)；Singh等，(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(大豆)；Datta等，(1990)Biotechnology 8：736-740(稻)；Klein等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉米)；Klein等，(1988)Biotechnology 6：559-563(玉米)；美国专利号5,240,855；美国专利号5,322,783和5,324,646；Tomes等，(1995)′Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells viaMicroprojectile Bombardment，″in Plant Cell，Tissue，and OrganCulture：Fundamental Methods，ed.Gamborg(Springer-Verlag，Berlin)(玉米)；Klein等，(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm等，(1990)Biotechnology 8：833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等，(1984)Nature(London)311：763-764；美国专利号5,736,369(cereals)；Bytebier等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(Liliaceae)；De Wet等，(1985)inThe Experimental Manipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman等，(Longman，New York)，pp.197-209(花粉)；Kaeppler等，(1990)Plant Cell Reports 9：415-418和Kaeppler等，(1992)Theor.ApplGenet.84：560-566(晶须-介导的转化)；D′Halluin等，(1992)PlantCell 4：1495-1505(电穿孔)；Li等，(1993)Plant Cell Reports12：250-255和Christou和Ford(1995)Annals of Botany 75：407-413(稻)；Osjoda等，(1996)Nature Biotechnology 14：745-750(经根瘤土壤杆菌转化玉米)；它们都在这里引作参考。

将异源的外来DNA整合进植物细胞中后，然后在培养基中应用最大阈值水平的草甘膦，以杀死未转化的细胞，并通过定期地转移到新鲜培养基中而分离和繁殖能在该选择处理中存活的推定发生了转化的细胞。通过连续传代和用草甘膦处理，可以鉴别和繁殖经质粒载体转化的细胞。然后，可以用分子和生物化学方法来确认异源的目标基因是否整合在转基因植物的基因组中。

可根据常规方法将已经转化的细胞培养成植物。参见，例如，McCormick等，(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。然后可以培养这些植物，并与相同的转化株或不同的株授粉，并鉴定能组成性地表达目标表型特征的杂合体。可以培养2代或多代，以确保目的表型特征的表达得到稳定维持和遗传，然后收获种子，以确保已经实现了理想的表型特征的表达。以此方式，本发明提供了含有稳定地整合在其基因组中的本发明核苷酸构建体(例如本发明的表达盒)的转化种子(也称作″转基因种子″)。

本发明可以用于转化任意植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目标植物的实例包括但不限于稻、玉米、苜蓿、向日葵(sunflower)、芸苔属、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟和烟草。优选地，本发明的植物是农作物。

本发明的GRG序列可以提供在用于在目标植物中表达的表达盒中。该盒包含可操作地连接到本发明的序列上的5′和3′调节序列。″可操作地连接″是指启动子和第二序列之间的功能连接，其中启动子序列启动并介导与第二序列相对应的DNA序列的转录。通常，可操作地连接意味着连接的核酸序列是毗邻的，且在需要连接2个蛋白编码区时，是则是毗邻并处在同一阅读框中的。该盒还可以含有至少1个要共转化进生物体中的额外基因。或者，该额外基因可以提供在多个表达盒中。

在这样的表达盒中提供了许多限制性位点，以用于将GRG序列插入到处于调节区的转录调节下。

表达盒按5’-3’转录方向将包含在在植物中起作用的转录和翻译起始区(即，启动子)、本发明的DNA序列以及转录和翻译终止区(即，终止区)。启动子可以是天然的或类似的，或对植物宿主和/或本发明DNA序列是外来的或异源的。另外，启动子可以是天然序列或合成序列。当启动子对于植物宿主而言是″外来的″或″异源的″时，是指启动子在该启动子所导入的天然植物中并不存在。当启动子对于本发明的DNA序列是″外来的″或″异源的″时，是指启动子不是可操作地连接的本发明DNA序列的天然或自然产生的启动子。

终止区可以是对于转录起始区而言为天然的，可以是对于可操作地连接的目标DNA序列而言为天然的，可以是对于植物宿主而言为天然的，或可以源自其它来源(即，对于启动子、目标DNA序列、植物宿主或其任意组合而言是外来的或异源的)。方便的终止区可以从根瘤农杆菌的Ti-质粒得到，例如章鱼肉碱合酶和胭脂碱合酶终止区。也参见，Guerineau等，(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon等，(1991)GenesDev.5：141-149；Mogen等，(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe等，(1990)Gene 91：151-158；Ballas等，(1989)NucleicAcids Res.17：7891-7903；和Joshi等，(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639。

当合适时，可以优化基因，以实现在转化植物中的增强表达。也就是说，可以使用植物偏爱型密码子合成基因，以提高表达。参见，例如，Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11中关于宿主-偏爱型密码子用法的讨论。本领域可以得到关于合成植物偏爱型基因的方法。参见，例如，美国专利号5,380,831，和5,436,391，和Murray等，(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498，其在这里引作参考。

在一个实施方案中，将目标核酸靶向定位在叶绿体中进行表达。以此方式，当目标核酸不是直接插入到叶绿体中时，表达盒将额外含有编码转移肽的核酸，以指导目标基因产物到达叶绿体。这样的转运肽是本领域已知的。参见，例如，Von Heijne等，(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126；Clark等，(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa等，(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer等，(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；和Shah等，(1986)Science 233：478-481。其它的转运肽包括美国申请号20020073443和美国申请号20020178467中所述的转运肽。在其它的实施方案中，目标核酸可以被靶向定位到细胞外或其它的细胞内组分处，例如核、线粒体或内质网。

靶向叶绿体的序列是本领域已知的，包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)的叶绿体小亚基(de Castro Silva Filho等，(1996)Plant Mol.Biol.30：769-780；Schnell等，(1991)J.Biol.Chem.266(5)：3335-3342)；5-(烯醇丙酮基)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(Archer等，(1990)J.Bioenerg.Biomemb.22(6)：789-810)；色氨酸合酶(Zhao等，(1995)J.Biol.Chem.270(11)：6081-6087)；质体蓝素(Lawrence等，(1997)J.Biol.Chem.272(33)：20357-20363)；分支酸合酶(chorismate synthase)(Schmidt等，(1993)J.Biol.Chem.268(36)：27447-27457)；和捕光叶绿素a/b结合蛋白(LHBP)(Lamppa等，(1988)J.Biol.Chem.263：14996-14999)。还参见，Von Heijne等，(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126；Clark等，(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa等，(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer等，(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；和Shah等，(1986)Science 233：478-481。

转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见，例如，Svab等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：913-917；Svab和Maliga(1993)EMBO J.12：601-606。该方法依赖于颗粒枪递送含有选择标记的DNA，且通过同源重组将DNA靶向定位到质体基因组中。另外，通过核编码的、质体定位的RNA聚合酶的组织偏爱型表达，反式活化质体携带的沉默转基因，可以完成质体转化。这样的系统已经报道在McBride等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7301-7305中。

可以优化要定位到叶绿体中的目标核酸，以利用植物核和该细胞器之间的密码子用法的差异在叶绿体中表达。以此方式，可以使用叶绿体偏好的密码子合成目标核酸。参见，例如，美国专利号5,380,831，其在这里引作参考。

植物转化的评价

将异源的外来DNA导入植物细胞后，通过多种方法，例如分析核酸、蛋白质以及与整合的基因有关的代谢物，可以确认异源基因在植物基因组中的转化或整合。

PCR分析：PCR分析是在移植到土壤中之前的早期阶段筛选转化的细胞、组织或芽是否存在所整合的基因的快速方法(Sambrook和Russell，2001，上文)。使用对目标基因或土壤杆菌载体背景等特异的寡核苷酸引物，可以进行PCR。

Southern分析：通过基因组DNA的Southern印迹分析确认植物转化(Sambrook和Russell，2001，上文)。一般而言，从转化体中提取总DNA，用合适的限制酶消化，在琼脂糖凝胶上分级分离，并转移到硝酸纤维素或尼龙膜上。然后根据标准技术(Sambrook和Russell，2001，上文)，用例如放射标记的³²P靶DNA片段探测膜或“印迹”，以确认所导入的基因在植物基因组中的整合。

RNA分析：根据本领域常用的标准方法，从转化体的特定组织中分离出RNA，在甲醛琼脂糖凝胶上分离，印迹到尼龙滤膜上(Sambrook和Russell，2001，上文)。然后通过本领域已知的方法(Sambrook和Russell，2001，上文)，使滤膜与来自GRG的放射活性探针杂交，测试GRG编码的RNA的表达。

Western印迹和生化实验：可以对转基因植物进行蛋白印迹和生化实验等，使用能结合草甘膦抗性蛋白上的一个或多个表位的抗体，通过标准方法(Sambrook和Russell，2001，上文)，确认或检测草甘膦抗性基因所编码的蛋白的存在情况。

GRG-1可以用于向植物提供除草剂抗性

在本发明的其它方面，可以生成能表达GRG-1的转基因植物，其与未转化的植物相比更能抗高浓度的草甘膦。上述的方法可以作为实例用于生产转基因植物，但是生产转基因植物细胞的方式对于本发明不是至关重要的。本领域已知的或记载的方法，例如土壤杆菌介导的转化、生物弹转化和非颗粒介导的方法均可以供实验人员选择。通过本领域记载的普通方法，例如通过转化愈伤组织、分离转化的愈伤组织、和从这样的转基因愈伤组织再生能繁殖的植物，可以分离出能表达GRG-1的植物。在这样的方法中，GRG-1可以用作选择标记。或者，可以使用任意的基因作为选择标记，只要它在植物细胞中的表达能赋予鉴别或筛选转化细胞的能力即可。本领域熟知能有效地在植物转化中起选择标记作用的基因。

可以测试表达GRG-1的能繁殖的植物抵抗不同浓度的草甘膦或类似除草剂的能力，并选择表现出最佳抗性的植物用于进一步育种。

GRG-1可以用作生产改变的或提高的变体的模板

现已认识到，可以通过多种方法改变GRG-1的DNA序列，且这些改变生成的DNA序列编码的蛋白具有与GRG-1所编码的蛋白不同的氨基酸序列。可以以多种反式改变该蛋白，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。这些操作的方法通常是本领域已知的。例如，通过DNA中的突变，可以制备出GRG-1蛋白的氨基酸序列变体。这也可以通过多种形式的诱变中的一种和/或定位进化来实现。在某些方面，在氨基酸序列中编码的变化基本上不会影响蛋白的功能。这样的变体将具有需要的除草剂抗性活性。但是，应当明白，使用这样的依赖于本发明组合物的技术，可以提高GRG-1赋予草甘膦抗性的能力。例如，可以在在DNA复制过程中表现出高比率的碱基错误掺入的宿主细胞、例如XL-1 Red(Stratagene)中表达GRG-1。在这样的株中繁殖后，可以分离GRG-1 DNA(例如通过制备质粒DNA，或通过PCR扩增和将得到的PCR片段克隆进载体)，在非诱变性株中培养GRG-1突变体，并且例如通过使细胞在递增浓度的草甘膦中生长、并测试能赋予耐受增高浓度草甘膦的能力的克隆而鉴定出对草甘膦的抗性提高的突变GRG-1基因。

细菌基因，例如本发明的GRG-1基因，在开放阅读框的起点附近经常具有多个甲硫氨酸起始密码子。通常，在这些起始密码子中的一个或多个处的翻译起始会导致功能蛋白的产生。这些起始密码子可以包含ATG密码子。但是，细菌(例如芽孢杆菌属)也能识别密码子GTG作为起始密码子，在GTG密码子处开始翻译的蛋白在第一个氨基酸处含有甲硫氨酸。而且，经常无法确定在细菌中正常使用哪一(些)密码子。因而，应当明白，使用一种替代的甲硫氨酸密码子可以导致编码杀虫活性的GRG-1(SEQ ID NO：2)的变体的产生。因而，由使用这样的起始密码子得到的改变的变体也包括在本发明中。或者，可以在许多蛋白的氨基酸序列的氨基或羧基末端进行改变，而基本上不影响活性。这可以包括通过现代分子方法导入的插入、缺失或改变，例如PCR，包括PCR扩增，后者能通过在用于PCR扩增的寡核苷酸中包含进氨基酸编码序列来改变或延长蛋白编码序列。或者，添加的蛋白序列可以包含能编码完整蛋白的序列，例如在本领域经常用于生产蛋白融合体的那些。这样的融合蛋白经常被用于：(1)增加目标蛋白的表达，(2)导入结合域、酶活性或表位，以促进蛋白纯化、蛋白检测或本领域已知的其它实验用途，(3)向亚细胞性细胞器靶向分泌或翻译蛋白，例如革兰氏阴性菌的周质间隙、或真核细胞的内质网，后者经常导致蛋白的糖基化。

提供了下面的实施例来进行解释而不是限制。

实验

实施例1.分离能抗草甘膦的菌株

通过将土壤样品涂布到含有草甘膦作为唯一磷源的富集的最低培养基(EMM)(EMM+G)上，分离出了草甘膦抗性的细菌。由于EMM+G不含有芳族氨基酸，菌株必须是对草甘膦抗性的，才能在该培养基上生长。

富集的最低培养基(EMM)，每升

10g蔗糖

1g NH₄Cl

0.2g Mg₂SO₄·7H₂O

0.01g FeSO4·7H₂O

0.007g MnSO4·H₂O

EMM+G

80ml EMM

20ml 50mM草甘膦

调节pH至8.5

筛选出了一个具体的菌株，命名为ATX1398，因为它能在高草甘膦浓度下生长。ATX1398是从蘑菇样品中分离出来的。将约1g样品加到10ml EMM+G中，在25℃孵育过夜。将100ul培养物加入装有1ml EMM+G的新试管中，孵育过夜。用该培养物取一环(1μl)接种1ml新鲜的EMM+G。通过在EMM琼脂(含有15g/L琼脂的EMM上重新划线，重新测试草甘膦存在时的生长能力，从而纯化ATX1398株。将ATX1398株或JM101株在含有5mM草甘膦的EMM琼脂平板上划线。该实验的结果如表1所示。

表1.ATHX1398在草甘膦存在时的生长

株	0 mM	5mM草甘膦
			ATX1398	+++	+++
JM101(大肠杆菌)	+++	-

实施例2.构建粘粒文库

在EMM中培养株ATX1398，离心沉淀细胞。从ATX1398提取基因组DNA，用酶Sau3A I部分地消化，连接到粘粒载体(来自Stratagene的Supercos 1)上，使用本领域熟知的技术包装进噬菌体颗粒中。将等分试样的噬菌体转染进大肠杆菌株JM101(已知对草甘膦敏感的菌株)中，并涂布到含有50ug/ml卡那霉素的LB琼脂培养基上，选择含有粘粒的菌落。

实施例3.分离向大肠杆菌赋予草甘膦抗性的克隆

将约700个卡那霉素抗性的来自ATX1398株的基因组文库的菌落影印复制到LB-卡那霉素琼脂、含有50ug/ml卡那霉素和2mM草甘膦的MOPS琼脂、以及含有50ug/ml卡那霉素和5mM草甘膦的MOPS琼脂平板上。4个克隆在2mM草甘膦的存在下生长。发现粘粒ATX1398(4)在5mM草甘膦存在下生长。从克隆ATX1398(4)纯化出粘粒DNA，并使用标准技术重新转化进JM101细胞中。所有得到的含有完整粘粒的菌落对5mM草甘膦都是有抗性的。

将另一等分试样的包装噬菌体转染进JM101细胞中，并直接涂布到含有50mg/ml卡那霉素和2mM草甘膦的MOPS琼脂培养基上。选择几个草甘膦抗性菌落。鉴别出了能赋予抗性的一个克隆，即粘粒ATX1398(11)。限制性消化分析克隆ATX1398(11)，并与来自粘粒ATX1398(4)的限制消化数据进行比较，表明ATX1398(4)和ATX1398(11)是独立的粘粒克隆，它们含有相同基因组区域的重叠部分。

表2.来自ATHX1398的粘粒克隆赋予的草甘膦抗性

粘粒克隆	0mM	2mM草甘膦	5mM草甘膦
				ATX1398(4)	+++	+++	+++
ATX1398(11)	+++	+++	ND
				单独的载体	+++	-	-

实施例4.通过转座子诱变鉴别GRG-1

为了鉴别负责粘粒ATX1398(4)表现出的草甘膦抗性的基因，用转座因子诱变了来自该克隆的DNA。在该方法中，鉴别出已经经历了转座子插入且已经丧失了赋予草甘膦抗性的能力的克隆。由转座子插入的位置可以鉴别出负责草甘膦抗性表型的开放阅读框。

使用引物岛试剂盒(PE Biosystems)，对来自粘粒ATX1398(4)的DNA进行体外转座子诱变，并通过电穿孔转化进大肠杆菌株XL1 BlueMRF′(Stratagene)中。通过涂布含有50ug/ml羧苄青霉素+50ug/ml三甲氧苄二氨嘧啶的LB琼脂，选择出了含有转座子插入物的克隆，然后复制到含有羧苄青霉素、三甲氧苄二氨嘧啶和2mM草甘膦的MOPS琼脂培养基平板上。鉴别出了3个菌落，其含有单个的转座子插入物，且不能在存在2mM草甘膦时生长，但是在没有草甘膦时则能生长，表明该插入物很可能是在负责草甘膦抗性的基因中或附近。使用本领域熟知的方法确定转座子插入物周围的DNA序列。发现转座子插入物都位于一个开放阅读框中，后者在本文中被称作GRG-1。

还通过体外转座和如上所述的选择性涂布平板分析了粘粒ATX1398(11)。

表3.通过转座子插入突变GRG-1，导致草甘膦抗性的丧失

克隆	0mM	2mM草甘膦
			ATX1398(4)	+++	+++
ATX1398(4)::Tn5(4a17)	+++	-
			ATX1398(4)::Tn5(4a19)	+++	-
ATX1398(11)	+++	+++
			ATX1398(11)::Tn5(1)	+++	-
ATX1398(11)::Tn5(2)	+++	-
			ATX1398(11)::Tn5(3)	+++	-
单独的载体	+++	-

实施例5.GRG-1的序列

整体确定了GRG-1开放阅读框的序列。在从转座子插入的末端序列得到的序列的基础上，合成了寡核苷酸引物。使用这些寡核苷酸引物，对克隆ATX1398(4)DNA进行了测序反应，通过本领域已知的方法，在ABI 3700自动测序仪上分析了得到的反应物。装配重叠的测序反应物，得到了开放阅读框的DNA序列，我们将其命名为GRG-1。

类型地，我们确定了来自克隆ATX1398(11)中的多个转座子插入物的DNA序列。这些插入物已经丧失了赋予草甘膦抗性的能力(表3)。来自转座子插入区的DNA序列与从ATX1398(4)得到的GRG-1序列相同。因而，克隆ATX1398(11)也含有GRG-1基因，在该基因中进行插入将会消除其赋予草甘膦抗性的能力。

实施例6.比对GRG-1和同源蛋白

我们使用BLAST2算法(Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Gish和States(1993)Nature Genet.3：266-272)，对比了GRG-1的预测氨基酸序列和国家生物技术信息中心(NCBI)维护的序列非冗余数据库。BLAST算法可以对比查询序列与已知序列的数据库的相似性，并鉴别出数据库中具有最高相似性分数概率的序列。由BLAST搜索结果鉴别出预测的GRG-1开放阅读框(SEQ ID NO：2)和几种已知蛋白之间的同源性。使用ClustalW算法(Higgins等，(1994)NucleicAcids Res.22：4673-4680)(整合在载体NTi程序组的程序ALIGNX模块中，Informax，Inc.)，将从该搜索得到的最高评分的氨基酸序列与GRG-1比对。用ClustalW比对后，评价氨基酸同一性百分比。鉴别出的最高的蛋白质同源性是与来自丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)的EPSP合酶有34％的氨基酸同一性。对NCBI的专利数据库的类似搜索也鉴别出了与GRG-1同源的蛋白，尽管在该搜索中鉴别出的蛋白质与GRG-1不太相关。在该搜索中与GRG-1最同源的蛋白是流感嗜血杆菌的EPSP合酶(美国专利号5,627,061中的SEQ IDNO：61)，其与GRG-1有25％的相同性。

这些搜索的结果表明，GRG-1能编码新蛋白。由GRG-1编码的蛋白与细菌EPSP合酶家族的几个成员具有较低的同源性。GRG-1与几种同源蛋白的比对如图1所示。尽管并不在使用GRG-1进行BLAST搜索得到的最高评分结果内，但是还是认识到了GRG-1与美国专利号5,627,061中的几个序列也具有同源性，所述序列在该专利中被称作“II类”EPSP合酶，即SEQ ID NO：3(土壤杆菌菌株CP4；21％同一性)、SEQ IDNO：5(Achomobacter菌株LBAA)、SEQ ID NO：7(假单胞菌菌株PG2982)、SEQ ID NO：42(枯草芽孢杆菌；24％同一性)、和SEQ ID NO：44(金黄色葡萄球菌)。因而，GRG-1表现出与多种EPSP合酶有同源性。

表4.GRG-1与搜索翻译的NCBI″nr″数据库得到的具有最高评分的EPSP合酶之间的氨基酸同一性

生物体	与GRG-1的氨基酸同一性
		丙酮丁醇梭菌	34％
产气荚膜梭菌	34％
		梅氏甲烷八叠球菌(Methanosarca mazei)	32％
Aeropyrum pernix	31％
		盐杆菌NRC-1	31％
噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)	31％
		詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannushii)	31％
坎氏甲烷嗜热菌(Methanopyrus kandleri)	31％
		具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatuna)	29％
Methanothermobacter thermautotrophicus	28％
		闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)	27％
大肠杆菌	25％
		枯草芽孢杆菌	24％
土壤杆菌属的种(菌株CP4)	21％

表5.GRG-1与搜索NCBI专利数据库得到的最高评分蛋白之间的氨基酸同一性

生物体	SEQ ID NO.	专利号	与GRG-1的％氨基酸同一性
				流感嗜血菌	61	US5627061	25％
鼠伤寒沙门氏菌	4	EP0293358	25％
				鼠伤寒沙门氏菌	3	US4769061	25％
大肠杆菌	8	US5627061	25％
				鸡沙门氏菌	57	US5627061	25％
肺炎克雷伯氏菌	59	US5627061	25％

使用ClustalW算法，将GRG-1的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)与从GenBank得到的5种EPSP合酶的预测氨基酸序列进行了比对。与GRG-1比对的5个序列代表了来自不同种类生物的EPSP合酶蛋白；单子叶植物玉米(GenBank登记号X63374.1)，双子叶植物拟南芥(GenBank登记号NM-103780.2)，细菌大肠杆菌(GenBank登记号NC-000913.1)和根癌土壤杆菌(GenBank登记号Q9R4E4)和酿酒酵母(GenBank登记号NC-00136.2的一部分)。比对如图3所示。该比对，以及如图1和图2所示的比对中显出了在所示的EPSP合酶和GRG-1中保守的几种氨基酸。这些残基列在表6中。

表6.GRG-1与来自图3的5种相关蛋白的比对

氨基酸	在GRG-1中的位置	在比对中的位置
			P	17	101
K	20	104
			S	21	105
R	25	109
			G	35	119
D	47	131
			G	76	163
G	87	180
			R	94	187
R	118	216
			P	119	217
L	127	225
			G	131	229
P	142	242
			S	162	265
T	196	299
			F	203	306
G	204	307
			D	237	340
S	239	342
			L	245	348
L	274	380
			D	307	425
A	316	434
			T	323	448
K	334	459
			E	335	460
R	338	463
			G	350	475
D	378	513
			H	379	514
R	380	515
			A	382	517
M	383	518
			P	509	553

实施例7.GRG-1在大肠杆菌中的表达

以下述方式在大肠杆菌中表达GRG-1。首先，设计与该基因的每个末端同源的寡核苷酸引物，使得PCR反应(由本领域的技术人员完成)能产生基本上含有GRG-1的全部编码区的DNA。该PCR产物可以含有其它的信号区，例如核糖体结合位点、启动子或限制酶识别位点等。将得到的PCR产物克隆进能实现可诱导型蛋白表达的载体，例如pQE60(Invitrogen)中。将PCR产物和克隆实验设计成所产生的克隆含有合适的核糖体结合位点和ATG(或GTG)起始密码子，其位置与载体上的细菌启动子(例如Tac启动子)相对应。然后通过本领域已知的方法，将PCR产物插入表达载体中，构建能表达GRG-1的克隆。将得到的克隆置于大肠杆菌细胞中(例如通过电穿孔)，并通过本领域已知的方法，例如利用质粒中存在的抗生素抗性基因(例如氨苄青霉素抗性基因)进行选择，鉴别出含有该克隆的菌落。通过将细胞涂布到含有GRG-1转录诱导物(例如IPTG)和0mM、2mM或5mM草甘膦的培养基上，并评价表达GRG-1的克隆在含有草甘膦的培养基上相对于载体对照的生长能力，测试GRG-1的表达。在某些情况中，优选地使用基本上更高浓度的草甘膦进行该实验，例如10mM、20mM或甚至高达50mM。当表达的克隆能生产显著定量的酶时，这特别适用。在这些情况中，可能需要高浓度的草甘膦来实现对照基因(例如大肠杆菌的野生型aroA)对草甘膦的敏感性。通过将表达GRG-1的克隆和表达大肠杆菌aroA的克隆单个地涂布到平板上，所述平板(1)允许蛋白表达(例如通过添加IPTG诱导基于1ac的启动子的转录)、且(2)含有不同量的草甘膦(例如，0-50mM，以5mM递增)，可以迅速确定草甘膦的优选浓度。

实施例8.测试表达GRG-1的克隆和aroA的草甘膦抗性

按照下面所述，加工菌株使之表达GRG-1或处理野生型大肠杆菌aroA。构建了定制的表达载体pPEH304Cm。pPEH304Cm的基本特征是来自pBR322的复制起点、氯霉素乙酰基转移酶基因(用于筛选和维持质粒)、1acI基因、Ptac启动子和rrnB转录终止子。如实施例7所述扩增GRG-1开放阅读框。将用于PCR扩增GRG-1的寡核苷酸设计成与GRG-1的起始密码子重叠，使得得到的PCR产物能将GRG-1的天然GTG起始密码子转换成ATG密码子。通过PCR，从大肠杆菌株XL1 Blue MRF′(Stratagene)扩增aroA开放阅读框。在PCR过程中，添加了限制位点，以有利于克隆进pPEH304Cm。

将GRG-1和aroA的PCR产物克隆进表达载体pPEH304Cm，分别产生质粒pPEH306和pPEH307，并转化进大肠杆菌XL1 Blue MRF′。通过本领域已知的标准方法鉴别出正确的克隆。通过DNA测序确认了pPEH306和pPEH307的表达克隆中GRG-1和aroA开放阅读框的序列。

使菌株在Luria肉汤(Sambrook和Russell，2001，上文)中生长至饱和(过夜)，然后在含有0至30mM草甘膦、且添加了10g葡萄糖、10mg维生素B1-HCl和25mg L-脯氨酸的M9液体培养基(配制)中1∶100稀释。通过在培养物亚群中包含0.1mM IPTG(在表7中记作+IPTG)而刺激Ptac启动子的高水平转录。

5X M9培养基

30g Na₂HPO₄

15g KH₂PO₄

5g NH₄Cl

2.5g NaCl

15mg CaCl₂

在培养轮上，使每种培养物在37℃、在3ml管中生长。每种处理重复3管。生长8小时后，取出310ul培养物，置于96-孔板中。在Spectramax 96孔板读数仪上，测定培养物在600nm的吸光度。实验一式三份，表7中的值反映了3个培养物的平均值。

表7.表达GRG-1的菌株对高水平的草甘膦的抗性(在Luria肉汤中8小时)

表7中的数据表明，GRG-1编码对高水平的草甘膦的抗性，不仅仅能存活，而且能使大肠杆菌在存在30mM草甘膦的情况下生长。相反，表达aroA的细胞的生长被10mM和更高浓度的草甘膦抑制。

另外，在含有多达150mM的草甘膦浓度的其它最低培养基M63中测试了这些加工成表达GRG-1或野生型大肠杆菌aroA的菌株。在1XM63中添加了10g葡萄糖、10mg维生素B1-HCl和25mg L-脯氨酸。使菌株在Luria肉汤(Sambrook和Russell，2001，上文)中生长至饱和(过夜)，然后在M63培养基(根据Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York中的方法适当调整)中洗涤2次，再在含有0至150mM草甘膦的新鲜M63液体培养基中1∶100稀释。通过在所有培养物中包含0.1mM IPTG，刺激Ptac启动子的高水平转录。

5X M63

68g KH₂PO₄

10g (NH₄)₂SO₄

2.5mg FeSO₄·7H₂O

12mg MgCl₂

在摇床中，使每种培养物在37℃、在10ml管内的2ml培养基中生长。在24小时，取出300ul培养物，置于96-孔实验板中。在Spectramax 96孔板读数仪上，测定培养物在600nm的吸光度。表8中的值反映了在24小时时的实验(NT＝未检测)。

表8.表达GRG-1的菌株对高水平的草甘膦的抗性(在M63中，24小时)

实施例9.GRG-1弥补了大肠杆菌XL-1MRF′细胞中的aroA突变

使用PCR和本领域已知的重组方法，如Datsenko和Wanner(Datsenko和Wanner(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97：6640-6645)所述，建立了大肠杆菌XL-I MRF′(Stratagene)的aroA敲除株。该系统是基于Red系统，能实现对定位序列的染色体破坏。aroA基因编码EPSP合酶，即草甘膦的靶酶。因此，通过破坏该基因，可以筛选EPSP合酶活性的弥补情况。

使用该系统，破坏了aroA编码区的1283个碱基中的1067个碱基。通过PCR，并如下所述通过用野生型aroA基因弥补该缺失，证实了aroA编码区的缺失。

EPSP合酶可以催化微生物和植物中芳族氨基酸的生物合成的第6步，因此缺少芳族氨基酸的最低培养基不能支持缺少EPSP合酶的生物体的生长(Pittard和Wallace(1966)J.Bacteriol.91：1494-508)。

上面产生的aroA敲除体能在LB培养基上生长，但是不能在M63最低培养基上生长。而且，敲除体确实能在添加了苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的M63培养基上生长。这些结果表明，aroA基因已经被破坏了。另外，测试了互补性，以确保该基因功能可以恢复。通过传统方法，制备了敲除的aroA株的电感受态细胞。将克隆pPEH307(含有aroA基因的表达载体)转化进敲除的细胞，并涂布到LB培养基、M63和添加了氨基酸的M63平板上。得到的转化体能在所有3种培养基上生长。

为了测试GRG-1弥补aroA的能力，将质粒pPEH306(含有GRG-1的表达载体)转化进aroA敲除细胞，并涂布到上述的3种培养基平板上。得到的转化体能在所有3种培养基上生长。作为对照，将载体pPEH304转化进aroA敲除细胞，并涂布到LB、M63和添加了氨基酸的M63平板上。这些细胞能在LB和添加了芳族氨基酸的M63上生长，但是不能在单独的M63上生长。这表明，表达载体本身不具有弥补aroA突变的必要组分。

在本说明书中提及的所有出版物和专利申请表明了本发明所属领域的技术人员的水平。所有出版物和专利申请都在本文中引作参考，其程度与将每篇单独的出版物或专利申请特别地和单独地引作参考时相同。

尽管为清楚理解的目的已经通过解释和实施例的方式较详细地描述了前面的发明，但是显然可以在所附权利要求书的范围内进行某些改变和改进。

Claims

1.一种编码草甘膦抗性5-烯醇丙酮基莽草酸(酯)-3-磷酸(酯)合酶蛋白的分离的核酸分子，其选自下列核酸分子，但不是中国专利申请号02117991.3中SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的核酸分子：

a)由SEQ ID NO：1的核苷酸序列组成的核酸分子，其中SEQ ID NO：1的1位核苷酸处的鸟嘌呤残基已经被腺嘌呤取代；

b)编码由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列组成的多肽的核酸分子，其中所述核酸分子的前三个核苷酸为ATG。

2.一种植物转化载体，其包含权利要求1的核酸分子。

3.一种宿主细胞，其含有权利要求2的载体。

4.权利要求3的宿主细胞，其是细菌宿主细胞。

5.权利要求3的宿主细胞，其是植物宿主细胞。

6.一种分离的多肽，其由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列组成。

7.抗体，其选择性地结合权利要求6的多肽。

8.细菌细胞，其包含至少一个选自下述的、编码草甘膦抗性5-烯醇丙酮基莽草酸(酯)-3-磷酸(酯)合酶蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列不是中国专利申请号02117991.3中的SEQ ID NO：1或SEQID NO：2：

a)由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列组成的核酸分子，其中SEQ IDNO：1的1位核苷酸处的鸟嘌呤残基已经被腺嘌呤取代；

9.向植物赋予对草甘膦的抗性的方法，其包括：

a)将DNA构建体稳定地整合进植物细胞的基因组中，所述的DNA构建体包含可操作地连接到编码草甘膦抗性5-烯醇丙酮基莽草酸(酯)-3-磷酸(酯)合酶蛋白的目标核苷酸序列上的启动子，其中所述的目标核苷酸序列选自：

i)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，其中SEQ ID NO：1的1位核苷酸处的鸟嘌呤残基已经被腺嘌呤取代；以及

ii)编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列的前三个核苷酸为ATG；和

b)使所述的细胞再生成植株。

10.向植物细胞赋予对草甘膦的抗性的方法，其包括将DNA构建体稳定地整合进所述植物细胞的基因组中，所述的DNA构建体包含可操作地连接到编码草甘膦抗性5-烯醇丙酮基莽草酸(酯)-3-磷酸(酯)合酶蛋白的目标核苷酸序列上的启动子，其中所述的目标核苷酸序列选自：

a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，其中SEQ ID NO：1的1位核苷酸处的鸟嘌呤残基已经被腺嘌呤取代；和

b)编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列的前三个核苷酸为ATG。