CN1668767A - 用于高分辨率光刻合成dna阵列的抗反射涂层 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了聚合物阵列以及生成聚合物阵列的方法,所述方法通过提供带有第一层和置于第一层上的第二层的基质而实施,所述第一层包括位于固相支持物上的一种或多种介电涂层,所述第二层包括多种聚合物。本发明还提供了采用光引导合成在基质上生成聚合物阵列的方法,所述方法实施如下:提供带有第一层的基质,所述第一层包括位于固相支持物上的一种或多种介电涂层;通过将第一层与硅烷化试剂接触,对第一层衍生化,将第二层置于所述第一层上,其中第二层包括以对光不稳的保护基保护的官能基。
Description
相关申请
本申请是2002年6月20日提交的美国申请10/177,169的继续。上述申请的全部教导在此引为参考。
发明背景
本发明涉及用于高分辨率光刻合成寡核苷酸阵列的改进方法。该改进方法涉及改进的基质涂布和硅烷化工艺,所述工艺提供了更高的光刻对比分辨率,由此提高了阵列的质量和信息密度。
已有开发出在固体基质上生产聚合物序列的大型阵列的方法。这些聚合物序列的大型阵列具有广泛的应用,并对药学、生物技术和医学产业具有相当的重要性。例如,该阵列可用于筛选大量生物活性分子,所述生物活性即受体结合能力。此外,寡核苷酸探针阵列可用于鉴定已知序列中的突变,以及用于靶核酸的从头测序方法中。
需要特别指出的是美国专利5,143,854(Pirrung等)和PCT申请92/10092中描述的开创性工作,公开了改进的采用光引导技术的分子合成方法。根据这些方法,将光引导至基质的选定区域,从而将保护基从基质的选定区域除去。然后,将选定分子偶联至基质,再进行另外的辐射和偶联步骤。通过活化基质的选定区域,并以精确顺序偶联选定的单体,可合成具有许多不同序列的分子阵列,其中每个不同序列位于基质表面上不同的已知位置处。通常在聚合分子,尤其是多肽和寡核苷酸的固相合成中,这些阵列清楚地包含下一步骤。
美国专利5,959,098提供了聚合物序列的阵列的有效大规模制备工艺,其中每一阵列包括多种不同的、位置上有区别的、具有已知单体序列的聚合物序列。在一个实施方案中,其提供了带有第一表面和第二表面的基质,所述第一表面涂布有以对光不稳(photolabile)保护基进行保护的官能基,而第二表面位于反面,带有一个层,所述层包括指数匹配化合物(index matching compound),光吸收化合物和抗反射化合物中的一种或多种。在曝光步骤过程中,由于两种材料的折光指数的不匹配,穿过基质的一定量的光仍从玻璃-聚合物界面反射回基质的前(合成)端面上。
发明概述
本发明通常提供了有效制备聚合物序列的阵列的新颖工艺,其中每一阵列包括多种不同的、位置上有区别的、带有已知单体序列的聚合物序列。在一个实施方案中,本发明通过提供在一固相支持物上带有第一层并在第一层上置有第二层的基质,从而提供了用于生成聚合物阵列的方法。第一层包括以介电材料堆积而成的介电涂层,所述介电材料具有抗反射、指数匹配和/或光吸收属性。第二层包括置于所述第一层上的许多聚合物。然后,本方法通过引导基质表面处的活化辐射,从而在基质表面不同选定区域中为单体提供有序活化和偶联,以在基质表面不同的已知位置上生成许多不同的聚合物序列。在另一实施方案中,本发明采用光引导合成提供了在基质上生成聚合物阵列的方法,所述方法通过如下步骤而实现:提供固相支持物上带有第一层的基质,所述第一层包括一种或多种介电涂层;通过将所述第一层与硅烷化试剂接触,衍生化所述第一层,以及将第二层置于所述第一层上面,其中所述第二层包括以对光不稳保护基保护的官能基。然后,本方法通过从所述第一选定区域的所述官能基去除所述保护基,从而为所述基质的所述表面上的第一选定区域提供活化;将第一单体偶联至所述第一选定区域的所述官能基;通过从所述第二选定区域的所述官能基去除所述保护基,从而活化所述基质的所述表面上的第二选定区域;将第二单体偶联至所述第二选定区域内的所述官能基;以及重复所述活化和偶联步骤,以生成多种不同的聚合物序列,所述不同聚合物序列各自偶联至所述基质的所述表面的不同已知位置处。
本发明还在基质表面上提供聚合物阵列,所述基质包含位于固相支持物上的第一层和置于所述第一层上的第二层,所述第一层包括一种或多种介电材料的堆积物,而所述第二层包括多种聚合物。
附图简述
如附图所例解,本发明的前述和其他目的、特征和优点从如下本发明优选实施方案的更具体描述中可明显看出,其中相同的标号表示不同视图中的相同部分。没有必要确定附图的比例,重点应在于例述本发明的原理。
图1.熔融石英基质上反面抗反射涂层(ARC)和正面抗反射涂层(ARC)的示意图。
图2.Bis和Bis-B连接至熔融石英上的示意图。
图3A-3B.比较反面ARC和正面ARC晶片,以评价其光刻对比度。图3(a)所示为反面ARC对正面ARC晶片,12微米特征尺寸(featuresize),以1.5微米像素尺寸扫描,Sybr Green对图象着色,Dev-Val掩膜装置。图3(b)所示为图3(a)底部左侧区域的放大图。
图4.前景与背景的对比。12微米特征尺寸微芯片的Sybr Green着色图象的前景与背景对比,以1.5微米像素尺寸扫描,Dev-val掩膜。
图5.Sybr-Green着色图象:前景与背景的对比。
图6.反面ARC对正面ARC芯片的20微米特征探针图象。
发明详述
本发明有许多优选实施方案,并依赖于许多本领域人员已知的专利、申请和其他参考。因而,当下文引述或重述专利、申请或其他参考时,应当理解在所有场合以及为了所陈述的命题,均以其全部引为参考。
如本申请中所使用的单数形式,如果上下文没有另外明确指示的话,均包括复数含义。例如,术语“一种试剂”包含多种试剂,包括其混合物。
个体并不限于人体,也可以是其他生物体,包括但不限于哺乳动物,植物,细菌或从上述任一种衍生出的细胞。
通观本公开内容,本发明的各方面可以范围形式进行介绍。应当理解,以范围形式描述仅仅是为了方便和简短,不应解释为对本发明范围的限制。相应地,对某一范围的描述应认为已特别公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如,对诸如1-6范围的描述应认为已特别公开了诸如1-3,1-4,1-5,2-4,2-6,3-6等的子范围,以及该范围内的单个数值,例如1,2,3,4,5和6。该应用与范围的宽度无关。
I.DNA阵列的合成
之前已有描述用于各种聚合物类型的固相合成的通用方法。在单个基质上合成大量聚合物序列的阵列的方法也已有描述,所述聚合物序列包括寡核苷酸和肽。参见美国专利5,143,854和5,384,261以及公布的PCT申请WO92/10092,所有场合下这些文献均在此以其全部引为参考。
如之前所述,基质表面上寡核苷酸的合成可采用光引导方法实施,如美国专利5,143,854和5,384,261以及公布的PCT申请WO92/10092所述,或者采用机械合成方法实施,如美国专利5,384,261,6,040,193和公布的PCT申请93/09668所述,所有这些文献均在此引为参考。优选地,采用光引导合成方法实施合成。特别地,这些光引导或光刻合成方法包含光解步骤和化学步骤。按此处描述制备的基质表面,其上含有官能基。这些官能基被对光不稳的保护基所保护(“光保护”)。在光解步骤过程中,部分基质表面暴露于光照或其他活化剂下,以活化该部分内的官能基,即去除光保护基。然后对基质进行化学步骤,其中在至少一个官能基处受光保护的化学单体与基质表面接触。这些单体通过未保护的官能基结合至基质的活化部分。
随后的活化和偶联步骤将单体偶联至其他预选定区域,所述预选定区域可与第一区域的全部或部分相交叠。基质上每一区域处的活化和偶联序列决定了其上合成的聚合物序列。特别地,通过光刻掩膜来显示光照,所述光刻掩膜被设计和选择成用来曝光并由此活化基质的第一特定预选定部分。然后将单体偶联至基质上该部分的全部或部分。可对每一步骤中所采用的掩膜和所偶联的单体进行选择,以产生带有期望序列范围的聚合物阵列,每一序列均偶联至基质上不同的空间位置,那个位置也指代了聚合物的序列。重复光解步骤和化学步骤,直到基质表面上合成了期望的序列。
基本的光刻方法也描述于美国专利5,143,854,美国专利5,489,678和公布的PCT申请WO94/10128,所有场合下这些文献均在此以其全部引为参考。修饰有光敏保护基的基质表面通过光刻掩膜照亮,从而在照亮区域获得具有反应活性的羟基。然后将选定的核苷酸呈递至表面,并在暴露于光照的位点发生偶联,所述选定的核苷酸典型的形式为3’-O-亚磷酰胺活化的脱氧核苷(5’羟基处用光敏保护基保护)。加盖并氧化后,洗涤基质,表面通过第二张掩膜照亮,以暴露另外偶联用的羟基。将第二个选定的核苷酸(如5’-保护的3’-O-亚磷酰胺活化的脱氧核苷)呈递至表面。重复选择性去保护和偶联循环,直至获得所期望的一组产物。Pease等,Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91:5022-5026。由于采用了光刻法,该工艺可容易地微型化以产生寡核苷酸探针的高密度阵列。此外,每一位点处的寡核苷酸序列是已知的。
在一个优选实施方案中,采用光引导合成,通过如下方法在基质上合成聚合物阵列:提供固相支持物上带有第一层的基质,所述第一层包括一种或多种介电材料的堆积物;通过将所述第一层与硅烷化试剂接触,衍化所述第一层,将第二层置于所述第一层上,其中所述第二层包括以对光不稳的保护基保护的官能基。该方法然后通过从所述第一选定区域内的所述官能基除去所述保护基,从而为所述基质的所述表面上的第一选定区域提供活化;将第一单体偶联至所述第一选定区域内的所述官能基;通过从所述第二选定区域的所述官能基除去所述保护基,从而活化所述基质的所述表面上的第二选定区域;将第二单体偶联至所述第二选定区域内的官能基;以及重复所述活化和偶联步骤,以生成许多不同的聚合物序列,每一个所述不同聚合物序列均偶联至不同的已知位置处的所述基质表面。
采用上述方法,可制备带有给定长度的所有聚合物序列的阵列,所述聚合物序列由单体基组(basis set)构成。例如,由四核苷酸基组组成的寡核苷酸阵列,在其表面含有高达4n的寡核苷酸,其中n是寡核苷酸探针的期望长度。对于8聚体或10聚体寡核苷酸,这种阵列可分别带有约65,536和1,048,576以上不同的寡核苷酸。通常,当期望生产带有长度为n的所有可能聚合物的阵列时,可采用简单的二元掩膜(binary masking)方法,如美国专利5,143,854所述。
备用的掩膜法产生的探针阵列含有聚合物序列亚组,即带有给定单体子序列的聚合物,但是在每一位置用单体基组的每一成员系统取代。就寡核苷酸探针而言,这些备用合成法则可用来铺设或“平铺”一定范围的探针,所述探针与给定的已知核酸区段互补,并且跨越给定的已知核酸区段的长度。平铺法也包括在每一探针群序列内,用核苷酸基组的每一成员取代一个或多个单独位置。这些位置称为“询问位置(interogation positions)”。通过阅读靶核酸的杂交图,可确定序列内是否存在突变以及存在于何处,并且通过鉴定询问位置内存在哪种碱基,还可确定特定的突变是什么。平铺方法和路线在美国专利6,027,880中有相当详细的讨论,所有场合下均在此以其全文引为参考。
平铺阵列可用于各种应用中,例如鉴定已知寡核苷酸序列或“靶标”内的突变。特别地,阵列上的探针将带有与已知核酸序列互补的子序列,但其中该序列中至少一个位置已被其他三种核苷酸系统取代。
II.基质制备
术语“基质”指带有刚性或半刚性表面的材料,聚合物以诸如连接或结合的方式置于其表面上。单体或构件(building block)是小分子组的成员,所述小分子可结合在一起形成大分子或聚合物。单体组包括但不限于,例如通常的L-氨基酸组,D-氨基酸组,天然或合成氨基酸组,核苷酸组(核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸,天然的和非天然的)以及戊糖和己糖的组。如此处所用,单体是指用于大分子合成的基组的任一成员。选定的单体组形成单体基组。例如,核苷酸基组包括A,T(或U),G和C。另一实例中,20种天然存在的L-氨基酸的二聚体形成400个单体的基组用于多肽合成。在聚合物的合成中,不同的单体基组可以按任意的连续步骤使用。此外,每一组可包括合成后被修饰的受保护成员。
在许多实施方案中,基质的至少一个表面基本是平坦或平面的,尽管在一些实施方案中,将不同聚合物的合成区域用诸如孔,隆起区域,蚀沟等物理分开则是较理想的。根据其他实施方案,可在表面上配备小珠,所述小珠可在合成完成后释放。优选的基质通常含有平面晶体基质,例如基于硅石的基质(例如玻璃,石英等),或者半导体或微处理器工业中所使用的晶体基质,例如硅,砷化镓等。这些基质通常可耐各种可能遭受的合成及分析条件。特别优选的基质是透明的,以使基质从任一方向均可光刻曝光。其他基质参见美国专利5,143,854。
也可采用硅石气凝胶作为基质。气凝胶基质可作为自立式基质,或作为另一刚性基质的表面涂层使用。气凝胶基质提供的优点为用于聚合物合成的较大表面积,例如400-1000m2/gm,或者一块1cm2气凝胶基质片的总有用表面积为100-1000cm2。这样的气凝胶基质通常可通过本领域已知方法进行制备,所述已知方法例如室温下乙醇/水溶液中(MeO)4Si或(EtO)4Si的碱催化聚合。可采用本领域已知方法通过改变反应条件来调节孔隙度。
单个平面基质通常的存在形式为可带有不同尺寸的晶片。术语“晶片”一般指基本平坦的基质样品,从该基质样品可制作多种单个阵列或芯片。术语“阵列”或“芯片”用以指代聚合物序列单个阵列的最终产物,带有多种偶联至基质表面的不同位置上有区别的聚合物序列。基质晶片的尺寸通常由从晶片制作的阵列的数量和性质来加以规定。例如,更复杂的阵列,如由单体基组产生的带有各种可能聚合物序列并带有给定长度的阵列,通常会采用更大面积并由此采用更大基质,而更简易的阵列可采用更小的表面积,并由此采用较小的基质。
典型地,基质晶片的尺寸范围为从约1”×1”至约12”×12”,厚度为从约0.5mm至约5mm。包括单个阵列的单个基质段,或者某些情况下期望的阵列集合,则典型地比晶片小得多,量度为从0.2cm×0.2cm至约5cm×5cm。在特别优选的方面,基质晶片为约5”×5”而基质段为近似1.28cm×1.28cm。虽然晶片可用来制造单个大型基质段,但典型地是从单个晶片制备大量的基质段。例如,5”×5”的晶片可用来制造49个以上单独的1.28cm×1.28cm基质段。从单个晶片制备的基质段数量通常依赖于阵列的复杂性,以及所期望的特征尺寸而变化。
III.抗反射涂层
A.反面涂层
如上所述,采用光刻方法活化基质表面上的选定区域。特别地,基质表面上或者存在于基质表面的生长聚合物上面的官能基被对光不稳的保护基保护。基质选定区域的活化的实施方法为:将基质表面的选定区域曝光于活化辐射,例如有效波长范围内的光照。选择性曝光典型的实施方法使光源发光穿过光刻掩膜。
特征(feature)定义为基质表面上的选定区域,给定的聚合物序列被设计含在所述选定区域中。由此,如果单个基质上任一阵列含有例如100,000个不同位置上有区别的聚合物序列,则将有100,000个特征。边缘定义为基质表面上两个特征之间的边界。该边缘的清晰度,即根据从一个特征到另一个特征的渗出的减少,称为两个特征的分辨率“对比”。由于根据此处所述工艺制备的基质,其表面一侧单个特征尺寸典型的范围为低至1-10μm,基质表面处衍射、反射或散射光作用可对曝光和活化该尺寸特征的能力具有明显效果。减少光解光源的衍射、折光和散射的潜在有害作用的一个方法是:对基质反面施用涂层,即给基质的非合成表面施用涂层。涂层典型地在基质制备工艺之后但在衍生化之前施用。典型地选择该涂层以履行一种或多种如下功能:(1)与基质的折光指数相匹配,以防止基质/涂层界面处的光反射,所述光反射可干扰光解作用;以及(2)吸收光解过程中所用光的波长的光,以防止涂层/空气或固定界面的背向反射,所述背向反射也可干扰光解作用。
典型地,合适的涂层材料可选自诸多折光指数与基质近似相等和/或吸收合适波长的光的合适材料。特别地,典型地选择指数匹配的涂层,以使其折光指数处于基质折光指数的约25%内,更优选为处于基质折光指数的约10%内,更优选为约5%内。类似地,典型地选择光吸收涂层,从而使处于光解波长的光被吸收,更优选的是处于紫外范围的光,例如280nm-400nm之间的光。光吸收涂层和指数匹配涂层可相结合,以提供组合的抗折光和抗反射保护,或可选择同时具有这两种所期望属性的单个涂层材料。
典型地,选择优选的聚合物以相容于合成过程中遭遇到的各种反应条件,例如在整个合成过程中不溶于合成试剂并与其不具有反应活性,以及对机械应力具有抗性,所述机械应力涉及对基质的处理和操作。另外,优选的涂层材料在合成过程完成时,例如在最后的去保护步骤或最后的涂层去除步骤中是容易可去除的。
合适涂层材料的实例包括本领域众所已知且通常可市售的抗反射涂料,例如在所期望的波长范围内具有光吸收性的氟化镁化合物,具有可比较于玻璃基质的折光指数的聚甲基异丁烯酸酯涂料(PMMA),以及在所期望的波长范围内具有光吸收性,且折光指数接近于玻璃基质的聚酰亚胺涂料。其他实例参见光学手册,基本原理,方法和设计(Handbook of Optics,Fundamentals,Techniques and Designs),第二版,Michael Bass(总编辑),McGraw-Hill,Inc.(1995)。
涂层材料的应用可通过各种方法来实施,包括例如气相沉积,喷涂应用等等。在优选情况中,采用旋转涂布方法将涂料溶液施用于基质。典型地,这包含涂层溶液在待涂布的基质表面上沉积时使基质旋转。基质的旋转可导致涂层溶液在基质表面上径向向外铺展。其他的涂层方法可见于,例如薄膜光学滤光器(Thin-film Optical Filters),第三版,H.Angus Macleod,Institute of Physics Publishing(2001)。这样的方法是本领域众所已知的。例如,参见Laser Focus World,2002 BuyersGuide,38卷第1期,Section 7:Finished Optics and Coatings,445-582页。
利用旋转涂布工艺施用涂层材料通常采用基质的双速旋转。涂层材料施用于基质表面及涂层溶液的初始铺展通常在低旋转速度下实施并持续相对较短时间。例如,要将1ml的12%固体重量体积比的聚合物涂层溶液施用于4.3”×4.3”基质,初始铺展在500r.p.m.下实施10秒种。除去多余的聚合物溶液,以高旋转速度使聚合层变平坦并且基本上持续较长时间。例如在上述施用过程中,第二旋转步骤在近于3000r.p.m.下实施30秒。本领域人员可以理解,用于旋转涂布的上述参数可在本发明范围内变换。例如,如果使用更高浓度(w/v)聚合物溶液,则提高一种或两种旋转速度以及给定速度下的时间是较为理想的。类似地,如果聚合物溶液中聚合物浓度减少,则可使用较低速度和更短的旋转时间。
施用之后,可使聚合物涂层在基质表面上固化。典型地通过加热涂布的基质来实施固化。在优选工艺中,固化过程包含两步骤的加热过程。第一个步骤包含涂布基质的“软烤”加热以初始固化聚合物涂层。该软烤步骤典型地在相对低温下操作相对较短时段,即85℃下操作5分钟。固化过程的第二步骤是聚合物涂层的最终固化,典型地在较高温度下实施更长时段,即220-360℃下持续近60分钟。在优选的方面,施用于基质反面的聚合物涂层为约1-50μm厚,更优选地为约5-20μm厚,而最优选的聚合物涂层厚度为约5μm。涂布后,将基质进行衍生化,洗涤并烘烤,如美国专利5,959,098中所述,所有场合下该文献均在此以其全部引为参考。
B.正面涂布
光解步骤中使用的光刻掩膜典型地包括透明区域和非透明区域,以使在给定的光解步骤中只曝光基质的选定部分。典型地,掩膜由玻璃制作而成,所述玻璃涂布有光反射或吸收材料,例如铬层。对光反射或吸收层进行蚀刻,以得到掩膜的透明区域。当光照穿过掩膜时,这些透明区域与基质表面上待曝光的区域相对应。
通常,生产更小特征尺寸的阵列,使得在更小基质面积内引入更大量的信息,允许更大样品询问(interogation)由一个询问可得到更确定结果,以及更大的微型化可能性,则是较为理想的。替代性地,通过减少特征尺寸,从单个基质晶片可得到更大量的阵列,每一阵列具有给定数目的特征。其结果是对给定工艺而言实质上更高的产品收率。
为了寻求减少特征尺寸,在给定的光解过程中,使基质的曝光区域与仍保持阴暗或未曝光的区域之间的对比度最大化是较为重要的。该边缘的清晰度,依据从一个特征到另一个特征的渗出的减少,称为两个特征之间的“对比度”。
对比度减少的一个原因是在特定光解步骤过程中从曝光区域到非曝光区域的“渗出(bleed-over)”。光渗出的最根本原因是光的照准性较差。采用反面聚酰亚胺涂层,作为熔融石英和反面涂层之间折光指数的不完全匹配的结果,约有1.3%的光线从涂层界面被反射,如图1所示。通过提供正面涂层,晶片反面的光反射基本上减少,例如低至少于0.05%,0.01%,0.005%或减少更多。由此带有正面涂层减少了反射,使光刻对比度提高至能够制造更小特征尺寸的阵列的程度。在一个实施方案中,通过采用带有介电化合物的正面涂层,有可能制造特征尺寸小于约20μm的聚合物阵列。在另一实施方案中,有可能制造特征尺寸小于约10,5,4,2,1或0.5μm的聚合物阵列。
用于光学应用的介电涂层通常通过在合适玻璃,陶瓷或金属基质材料上的真空蒸发,溅射或低温溶液沉积而生成。这样的介电涂料可包括具有抗反射,指数匹配和/或光吸收属性的材料。特定的光学功能和波长或用于光学涂层的波长规定涂层的设计。这里术语“涂层设计”是指待沉积材料的离散层的数量,这些层以及制成层的材料的厚度。形成离散层的材料之间的折光指数的差别是与涂层设计相结合可赋予涂层独特功能的物理属性。例如,涂层可设计成起反射镜、抗反射器、起偏器以及其他光学元件的作用。在一个实施方案中,介电涂层是低反射性紫外吸收介电涂层。在另一实施方案中,涂层为二色抗反射涂层。二色抗反射涂层兼具抗反射性和二色性,即吸收部分波长而透过其他波长。
抗反射涂层的范围可以从只在一个波长处几乎具有零反射比的简单的单层,到数个倍频范围上都几乎具有零反射比的12层以上的多层系统。任一特定应用中所使用的类型依赖于各种因素,包括基质材料,波长区,所需性能及成本。在某些情况下,在涂层的一个或多个层中使用金属是较为理想的。
非常有前景的设计可通过计算机精炼而得以改进。抗反射涂层的最简单形态为可调节参数数量有限的单层。适合用作为薄膜的材料数量有限,设计者只能使用可利用的材料。替代性实施方案是使用更多层,规定开始对于所有层均可获得的折光指数,由此通过改变厚度来获得零反射比。大部分这种设计工作通过自动化方法来实施。自动化设计技术若提供有良好的起始设计(starting designs)则可行使得更有效率。本领域人员根据所需说明书将能设计并实施涂层。
抗反射层的基本规格是光刻曝光过程中,所有光化背散射光源强度必须不大于直接透过铬掩膜的光强度。背散射光包括所有来自曝光工具上的晶片涂层和安装晶片的金属固定物的镜面反射和漫反射。固定物的UV反射比可接近100%。
在一个优选实施方案中,名义上的光解波长是365纳米。然而,对光不稳的MeNPOC保护基的吸收光谱和光解灯的发射谱都不是单色的。407nm的Hg发射谱线显著光化,大约作用光谱的总面积落有7%在400nm以上。因此涂层的吸收和反射性可同时指定为365nm和406nm水银发射波长处。假设对406nm谱线给出约低10倍的光化功率,则衰减和反射比规格的设置可按比例低于365规格。同样,一些其他的光组和/或光致抗蚀过程在长于365nm的波长处有应答。
在另一优选实施方案中,光刻掩膜上铬层的光密度在近UV处近似3.5。为了保持所有杂散光源低于铬透过强度,单程光密度和正面抗反射涂层的内部反射比可各自规定为:365nm波长下是1.75或更高及0.0003或更低,以及406nm波长下是1.25或更高及0.003或更低。
在另一优选实施方案中,正面涂层的通用规格设置为:在“光反应”UV波长区域中高于75%吸收,在可见波长区域中低于约40%吸光度,且在“光反应”UV波长区域中低于约10%反射率。UV吸收越高,到达合成表面的背反射光就越少,对比度也就越高。
在进一步优选实施方案中,涂层带有由SiO2组成的最外层,所述SiO2提供了保护层,从而对于在阵列制作过程中遭遇到的苛刻化学条件起稳定涂层的作用,并且还提供了化学上类似于未处理的熔融石英基质的表面。由此SiO2层使得表面适合于以硅烷化试剂进行化学官能化。SiO2的厚度优选为50-1000nm之间。在另一优选实施方案中,涂层还带有由SiOx组成的最外层,其中x是数字或O和2之间的分数。
在一个优选实施方案中,涂层带有由提供了具有反应活性的官能基的表面组成的最外层,所述官能基例如羟基,羧基,氨基,巯基,卤烷基,1,2-二醇,醛,丙烯酰基,马来酰亚胺基,N-琥珀酰亚胺基羧酸酯基团等等,聚合物序列中的第一单体可连接至这些官能基上。这种官能化的表面提供了用于在该表面上合成各种聚合物序列的位点。参见美国专利5,959,098。
与反面涂层形成对照,正面涂层是永久性地留在晶片上的,因为,与反面涂层不同,正面涂层旨在非常均一,且在可见波长处大部分是透明的,以用于扫描/检测。
除了改进对比度,正面涂层还提供了“无颗粒”的处理过程,由此提高了维持质量制造操作的置信度。
IV.硅烷化
基质表面涂布后,将表面衍生化以在基质表面上提供位点或官能基,用于在该表面合成各种聚合物序列。特别地,衍生化提供了具有反应活性的官能基,例如羟基、羧基、氨基等等,聚合物序列中的第一单体可连接至这些官能基。作为优选,采用水或乙醇中的硅烷对基质表面进行衍生化。另一优选情况是,通过将涂布的表面与硅烷化试剂溶液接触,而对涂布的表面进行衍生化。进一步优选的情况是,通过硅烷化试剂在基质表面的可控气相沉积,从而实施表面与硅烷化试剂的接触。
本领域已开发有硅烷化试剂,所述硅烷化试剂与诸如硅石表面的表面反应并涂布表面。例如,已经开发出在高效色谱填料中使用的、用于修饰硅石的硅烷化试剂。已使用单官能硅烷化试剂来生成单层表面涂层,而双功能和三功能硅烷化试剂则已被用来生成硅石表面的聚合涂层。然而,许多硅烷化试剂产生的涂层带有不期望的属性,包括对光解作用的不稳定性以及对可能含有残留酸性硅烷醇的硅石表面遮罩能力不足。参见美国专利6,262,216和美国专利申请US2001/0021506A1。
已经开发有用于诸如玻璃基质的固相基质硅烷化的硅烷化试剂,包含可通过进一步共价反应衍生化的官能基。硅烷化试剂固定在诸如玻璃的基质表面上,并用来制备高密度固定化的寡核苷酸探针阵列。例如,在基质上寡核苷酸阵列的光化学合成之前,已采用N-(3-(乙氧基甲硅烷基)-丙基)-4-羟基丁酰胺(PCR Inc.,Gainesville,FL和Gelest,Tullytown,PA)来对玻璃基质硅烷化,如McGall等,J.Am.Chem.Soc.,119:5081-5090(1997),该文献公开内容此处引为参考。
羟基烷基甲硅烷基化合物已用来制备羟基烷基化物质,例如玻璃基质。已利用N,N-双(羟乙基)氨丙基-三乙氧基硅烷来处理玻璃基质,以允许高密度寡核苷酸阵列的合成。McGall等,Proc.Natl.Acad.Sci..93:13555-13560(1996);以及Pease等,Proc.Natl.Acad.Sci.,91:5022-5026(1994),所述文献的内容在此引为参考。已利用乙酰氧基丙基-三乙氧基硅烷来处理玻璃基质,以制备用于寡核苷酸阵列合成的玻璃基质,如PCT WO97/39151中所述,该文献公开内容在此引为参考。已利用3-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷来处理玻璃基质,以提供用于寡核苷酸合成的连接。欧洲专利申请号89 120696.3。
本领域已开发出用于稳定化表面结合的硅化合物的方法。空间位阻的硅烷化试剂的使用描述于Kirkland等,Anal.Chem.61:2-11(1989);以及Schneider等,Synthesis,1027-1031(1990)。然而,这些表面结合的硅烷化试剂的使用是不利的,因为它们通常需要非常强制性的条件以实现结合至玻璃,这是由于他们的位阻性质使其与基质的反应活性较低。
另外,可制备带有被保护或“遮罩”的羟基且具有显著挥发性的硅烷。如所指地,这些硅烷可容易地通过诸如蒸馏而纯化,并且可容易地在硅烷化基质表面的气相沉积方法中被采用。将这些硅烷涂布至基质表面上后,可采用诸如稀酸或稀碱的简单化学处理对羟基去保护,所述稀酸或稀碱不会攻击基质-硅烷键,从而基质然后可用于聚合物合成。这种硅烷的实例包括乙酰氧基烷基硅烷,例如乙酰氧基乙基三氯硅烷,乙酰氧基丙基三甲氧基硅烷,这些硅烷可在施用后去保护,去保护所采用的试剂为诸如例如气相氨和甲胺或液相氨水或乙醇氨及烷基胺。也可使用环氧烷基硅烷,例如环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷,可采用诸如汽相HCl,三氟乙酸等或者液相稀HCl进行去保护。
基质硅烷化的物理操作通常包含将基质蘸入或浸入硅烷溶液。浸入后,一般将基质按基质汽提工艺所述进行旋转,即侧向旋转,以得到硅烷溶液穿越基质表面的均匀散布。这就保证了反应活性官能基在基质表面的更平均的分布。施用硅烷层后,可对硅烷化的基质进行烘烤,以聚合基质表面上的硅烷,并改进硅烷试剂和基质表面之间的反应。烘烤典型地在90-120℃的温度范围下操作,最优选为110℃,持续时段为约1-10分钟,最优选为5分钟。
在替代性情况下,如上所指出,可采用可控汽相沉积法或喷布法将硅烷与基质表面接触。这些方法包含:将硅烷溶液挥发或雾化进入气相或者喷涂物,然后将气相或喷涂物沉积在基质表面上,所述沉积通常通过将基质表面于周围环境下暴露于气相或喷涂物。与仅仅将基质浸入溶液相比较,气相沉积典型地可导致衍化溶液的施用更为均匀。
衍生化过程的效力,例如基质表面官能基的密度和均一性,通常可通过加入与反应活性基团相结合的荧光团,并察看基质表面对面的相对荧光来评测,所述荧光团例如荧光亚磷酰胺(phosphoramidite),如Pharmacia,Corp生产的FluoreprimeTM,Millipore,Corp生产的FluorediteTM,或者ABI生产的FAMTM。
在一个优选实施方案中,使用双-羟乙基-3-氨丙基三乙氧基硅烷(Bis)作为硅烷化试剂。在另一优选实施方案中,使用N(2-羟乙基)-N,N-双(三甲氧基甲硅烷基丙基)胺(Bis-B)作为硅烷化试剂。Bis硅烷和Bis-B硅烷结合至熔融石英,如图2中所图示。从化学结构上看,Bis-B提供了两个Si位点用于连接至熔融石英,而Bis仅提供一个Si位点,因而Bis-B较之Bis更为稳定。
BTMSE(双(三甲氧基甲硅烷基)-乙烷)可用来交联Bis硅烷涂层,以强化表面结合。在另一优选实施方案中,通过将Bis硅烷和BTMSE以可变的比率混合,以制备Bis/BTMSE混合物,其中Bis硅烷的摩尔百分比优选为50%-95%,更优选为75%-95%,而最优选为80%-90%。
在一个优选实施方案中,硅烷化试剂可共价连接至固相基质表面,以得到基质上含有可衍生化官能基的涂层,从而使得固定化寡聚物的阵列可经由与反应活性官能基的共价反应而共价连接至基质。诸如多肽或核酸的固定化寡聚物可用于各种结合分析中,包括生物结合分析在内。在另一实施方案中,可在基质上形成固定化核酸探针的高密度阵列,然后可筛选一种或多种含有不同靶序列的靶核酸,用于结合至含有各种不同潜在互补探针序列的核酸探针的高密度阵列。例如,用于玻璃基质上DNA阵列的光引导合成的方法描述于McGall等,J.Am.Chem.Soc.,119:5081-5090(1997),该文献的公开内容在此引为参考。
V.光解步骤
光解步骤过程中使用的光刻掩膜典型地包括透明区域和不透明区域,以用于在给定的光解步骤中只曝光基质给定部分。典型地,掩膜由玻璃制作而成,所述玻璃已涂布有诸如铬层的光反射性或吸收性材料。对光反射性或吸收性层进行蚀刻,以得到掩膜的透明区域。当光照亮穿过掩膜时,这些透明区域与基质表面待曝光的区域相对应。
如上所述,采用光刻方法来活化基质表面上的选定区域。特别地,基质表面上或者存在于基质表面生长聚合物上的官能基为对光不稳的保护基所保护。如之前所述,基质选定区域的活化的实施方式为将基质表面的选定区域曝光于活化辐射,所述活化辐射例如有效波长范围内的光照。选择性曝光典型地通过将光源照亮穿过光刻掩膜而得以实施。在一个实施方案中,基质的首层被衍生化并涂布有以对光不稳的保护基保护的官能基。在优选实施方案中,对光不稳的保护基是MeNPOC。
根据此处所述工艺制备的基质,由于其表面上的单个特征尺寸范围在一面上典型地为低至1-10μm,基质表面处的反射光或折射光作用可对曝光和活化该尺寸特征的能力起到显著效果。
对用于光解的光源进行选择,以得到对所用特定保护基起光解作用的光波长,但不会破坏所形成的聚合物序列。典型地采用产生具有UV范围光谱光的光源。例如,在寡核苷酸合成中,光源典型地提供波长在340nm以上的光,以实现对光不稳的保护基的光解而不会破坏形成的寡核苷酸。这种光源通常由采用340nm截留滤波器(即波长大于340-350nm的光通行)的Hg-Arc灯提供。典型的光解曝光在所用保护基曝光半衰期的约6-10倍下实施,优选为半衰期的8-10倍。例如,优选的对光不稳保护基MeNPOC所具有的半衰期近于6秒,转化成曝光时间即近似36-60秒。
VI.化学步骤
经过各自的光解步骤后,将单体构件块引入或与基质合成表面相接触。典型地,所添加的单体包括单活性官能基,例如对于寡核苷酸情况则为3’-羟基。涉及连接聚合物序列内的单体的剩余官能基,例如核苷酸的5’-羟基,通常是光保护的。然后,单体结合至位于前述光解步骤过程中被活化的基质表面上,或者位于合成在基质上的连接分子或聚合物的末端处的反应活性部分。
典型地,化学步骤包含本领域众所已知的固相聚合物合成法。例如,通过亚磷酰胺,亚磷酸三酯,磷酸三酯以及H-膦酸酯化学用于寡核苷酸固相合成步骤的详细描述可广泛获得。例如参见Itakura,美国专利号4,401,796;Caruthers等,美国专利号4,458,066及4,500,707;Beaucage等,Tetrahedron Lett.,22:1859-1862(1981);Matteucci等,J.Amer.Chem.Soc.,103:3185-3191(1981);Caruthers等,GeneticEngineering,4:1-17(1982);Jones,第2章,Atkinson等,第3章,及Sproat等,第4章,Gait编,寡核苷酸合成:实践入门(Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach),IRL Press,Washington D.C.(1984);Froehler等,Tetrahedron Lett.,27:469-472(1986);Froehler等,Nucleic Acids Res.,14:5399-5407(1986);Sinha等,Tetrahedron Lett.,24:5843-5846(1983);以及Sinha等,Nucl.Acids Res.,12:4539-4557(1984)。
基质晶片上所需聚合物的全部合成完成后,永久性保护基典型地仍存在于合成寡核苷酸的核碱基和磷酸主链上,所述永久性保护基例如在各自合成步骤未被除去的保护基。这些保护基的去除通常用氨水浓溶液来完成。虽然该方法对于保护基的去除有效,但这些条件也会通过水解寡聚物和结合至支持物的硅烷衍生物之间的酯键而使合成寡聚物从支持物断裂开。在寡核苷酸阵列中,最终去保护步骤之后,保存将寡核苷酸连接至玻璃的键是较为理想的。硅烷化试剂Bis,Bis-B和Bis/BTMSE提供了将寡核苷酸连接至玻璃的如此稳定键。
VII.应用
此处公开的方法和组合物可用于各种应用中。可制作带有第一层和第二层的基质,所述第一层位于固相支持物,包括一种或多种介电涂料及抗反射材料,而所述第二层位于第一层之上,包括生物聚合物。在一些实施方案中,基质基本上是平面的。在一些实施方案中,采用诸如沟、凹槽、孔等等可将基质物理分成数个区域。基质的实例包括玻片、玻璃珠及固体芯片。固体基质可以是诸如生物的、非生物的、有机的、无机的或者其组合,并且其形式根据所预期的用途可包括颗粒、细条、凝胶、薄片、管状、球形、容器、毛细管、垫料、切片、薄膜、平皿以及玻片。在一个实施方案中,可在基质上形成固定化核酸探针的高密度阵列,然后可筛选一种或多种含有不同靶序列的靶核酸,以用于结合至含有各种不同的潜在互补探针序列的核酸探针的高密度阵列。例如,用于玻璃基质上DNA阵列的光引导合成的方法描述于McGall等,J.Am.Chem.Soc.,119:5081-5090(1997),该文献公开内容在此引为参考。
筛选靶分子以用于特异性结合至固定于固体基质上诸如核酸的聚合物阵列的方法,公开于诸如美国专利5,510,270的文献中,该文献公开内容在此引为参考。固体基质上诸如核酸的聚合物阵列的制作,以及阵列在不同分析中的使用方法,也描述于:美国专利5,774,101,5,677,195,5,624,711,5,599,695,5,445,934,5,451,683,5,424,186,5,412,087,5,405,783,5,384,261,5,252,743及5,143,854;PCT WO92/10092,上述全部公开内容于此引为参考。采用高密度DNA阵列存取遗传信息进一步描述于Chee,Science 274:610-614(1996),该文献公开内容于此引为参考。光刻和制作方法的结合使得每一探针序列只在支持物上占据很小的一个位点。所述位点可以如几微米或者甚至如小分子那般大小。这样的探针阵列其类型可以称为极大规模固定化聚合物合成(Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis,VLSIPS)阵列,如美国专利5,631,734中所述,该文献公开内容于此引为参考。
在核酸阵列固定于表面上的实施方案中,可对核酸序列的数量进行选择,以用于不同的应用中,而且所述数量可以是例如约100或更多,或者例如在一些实施方案中,可高于105或108。在一个实施方案中,表面含有至少100种各自优选地带有不同序列的探针核酸,每一探针容纳于不到约0.1cm2的面积内,或者例如介于约1μm2到10,000μm2之间,并且表面上的每一核酸均带有确定的序列和位置。在一个实施方案中,表面上至少提供有1,000种不同的核酸,其中每一核酸容纳于不到约10-3cm2的面积内,例如美国专利5,510,270中所述,该文献在此引为参考。
基因表达监测中使用的核酸阵列描述于PCT WO97/10365中,该文献公开内容于此引为参考。在一个实施方案中,核酸探针阵列固定于表面上,其中的阵列含有100种以上不同的核酸,并且其中每一不同核酸均定位于表面上的预定区域,并且不同核酸的密度约为每平方厘米60种以上不同核酸。
可使用的固定于表面上的核酸阵列还详细描述于美国专利5,744,305中,该文献的公开内容于此引为参考。如该文献所公开,在基质上,带有不同序列的核酸各自固定于表面上的预定区域。例如,基质上可提供10,50,60,100,103,104,105,106,107或108种不同的单体序列。基质的预定区域内提供有特定序列的核酸,所述基质具有诸如约1cm2至10-10cm2的表面积。在一些实施方案中,各区域所具有的面积低于约10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8,10-9或10-10cm2。例如,在一个实施方案中,提供带有至少第一表面的平面无孔支持物,及连接至第一表面的许多不同核酸,密度为每平方厘米超过约400种不同核酸,其中每一不同核酸连接至固相支持物表面不同的预定区域内,并且具有不同的可确定的序列,并且是例如至少4个核苷酸的长度。核酸可以是诸如约4-20个核苷酸的长度。不同核酸的数量可以是例如1000或更多。在基质已知位置处合成已知化学序列的寡核苷酸,互补核苷酸的结合被检测,并且其中检测的是荧光标记,对上述实施方案而言,可通过将光引导至基质上相对较小且准确已知的位置处来实施检测。例如,将基质置于显微检测设备中,以用于鉴定发生了结合的位置。显微检测设备包括用于引导基质处光照的单色或多色光源,用于检测来自基质的荧光的手段,以及用于确定荧光位置的手段。在一些实施方案中,用于检测基质上所发荧光的手段包括光子计数器。用于确定所发荧光位置的手段可包括用于基质的x/y转换表。基质和数据采集的转换通过合适的程序性数字计算机进行记录和管理,如美国专利5,510,270中所述,该文献公开内容于此引为参考。
可采用用于并行处理多重生物芯片分析的设备,如美国专利5,545,531中所述,该文献的公开内容于此引为参考。用于检测固相支持物上的样品标记物的方法和系统描述于美国专利5,578,832中,该文献公开内容于此引为参考,其中的标记材料在与激发波长不同的波长处发射出辐射,通过会聚光学将辐射进行聚积,并在检测器上成像,从而产生样品的图象。用于检测荧光标记材料的方法和设备进一步描述于美国专利5,631,734和5,324,633中,该文献的公开内容于此引为参考。
此处描述的方法和组合物可用于一系列的应用中,包括生物医学和遗传学研究及临床诊断。可对诸如核酸的聚合物序列进行筛选,以用于特定结合至诸如互补核苷酸的靶,例如在筛选研究中用于确定结合亲和性,以及用于诊断分析。在一个实施方案中,可对多核苷酸进行测序,如美国专利5,547,839中所述,该文献的公开内容于此引为参考。核酸阵列可用于许多其他应用中,包括遗传疾病的检测,例如囊性纤维症,糖尿病以及诸如癌症的获得性疾病,如美国专利申请号08/143,312中所述,该文献的公开内容于此引为参考。通过杂交进行测序,可以检测遗传突变。在一个实施方案中,采用IIs型限制性内切酶可对遗传标记进行测序并作图,如美国专利5,710,000中所述,该文献的公开内容于此引为参考。
其他应用包括基于芯片的基因型鉴定、物种鉴定及表型表征,如1997年2月7日提交的美国专利申请08/797,812及1996年4月8日提交的美国专利申请08/629,031中所述,该文献的公开内容于此引为参考。
采用高密度核酸阵列,通过大量mRNAs的并行杂交,可对细胞中的基因表达进行监测,所述细胞例如酵母的微生物,如Lockhart等,Nature B1otechnology,14:1675-1680(1996)中所述,该文献的公开内容于此引为参考。通过将全部RNA杂交至核酸阵列,可对细菌转录实施成像,如Saizieu等,Nature Biotechnology,16:45-48(1998)中所述,该文献的公开内容于此引为参考。
此处引用的所有出版物均在此以其全部引为参考。
通过如下非限制性实施例可进一步理解本发明。
VIII.实施例
实施例1
对比实施例
对比一个反面抗反射涂布(ARC)的晶片和一个正面抗反射涂布的晶片,以评价其光刻对比度。采用新的掩膜装置Dev-Val合成寡核苷酸,所述掩膜装置在芯片内有不同特征尺寸的微芯片。用Sybr Green对芯片染色并分析。图3(a)所示为以1.5微米象素尺寸扫描的12微米特征尺寸微芯片的放大部分,光点尺寸3微米。图(3)所示是图3(a)底部左侧区域的放大图。这些Sybr Green染色的图象显示,与反面抗反射涂布(ARC)的晶片相比,正面抗反射涂布(ARC)的晶片具有更低的背景,对比度和分辨率均有改进。
实施例2
前景与背景的对比度
使用Sybr Green染色来评价对比度,因为它对所有的DNA碱基染色,从而能在预期的合成(前景)与没有预期合成的区域(背景)形成比较。以Dev-Val作掩膜,1.5微米象素尺寸扫描的12微米特征尺寸微芯片的Sybr Green染色图象,其前景与背景的对比率如图4所示。结果显示,正面ARC晶片比反面ARC晶片的对比度高2.5倍。
实施例3
正面ARC晶片对反面ARC晶片
图5所示为带有反面ARC的芯片对带有正面ARC的芯片的20微米特征图象。左图中,有合成于反面ARC晶片上的2微米和1微米微芯片图象。右图中,同样的图象是用正面ARC晶片处理到的。微芯片是合成的25聚体探针块。微芯片周围的光晕效果或薄雾指示轻微的“噪音”或边缘效应。反射光对探针边缘附近区域曝光,从而引起不需要的探针的部分合成。正面ARC芯片显示从活性到非活性区域的明显过渡,表明对比度的改进。
实施例4
正面ARC说明
由于抗反射涂层位于前表面并且是永久性的,因而正面ARC芯片在若干波长处的光学属性将影响产品的总性能。MenPOC化学在365nm和405nm处活化。用于封装芯片的粘合剂在365nm和436nm处固化。从水银灯发出来的相对光照量产生近于365nm处1/3的能量和436nm处2/3的能量。
488nm,530nm和570nm处可见波长的光学属性很重要,因为这些是扫描仪读取芯片的波长。扫描仪的Ar离子激光的激发波长是488nm。荧光素Sybr Green检测波长为530nm,而藻红素的检测波长为570nm。对于正面ARC晶片,这些可见波长是衰减的,由此对于扫描前除去抗反射涂层的地方,相比较于反面ARC晶片,其荧光信号是降低的。正面ARC晶片的理想光学属性的实例列于下表。
波长 | %R | %T |
365 | <5 | <5 |
405 | <5 | <30 |
436 | N/A | >30 |
488 | N/A | >60 |
530 | N/A | >70 |
实施例5
表面荧光分析
采用表面荧光分析显示,强度的增加与分析缓冲液中硅烷涂层的水解稳定性的增加相关联。采用扫描激光共焦荧光显微镜对表面荧光的图案和强度进行成像,所述显微镜采用488nm Ar离子激光器的激发光束聚焦至基质表面处的2微米光点尺寸。通过带有530(+/-15)nm通带滤波器的共焦光学仪收集发射光,并以装备有光子计数器电子设备的PMT进行检测。输出强度值(光子计数/秒)与表面结合荧光素的量成比例,从而通过直接对比观察表面荧光素强度,即可确定基质不同基质区域内自由羟基的相对产量。由于非特异性的背景荧光,因而对所有强度值进行矫正,所述非特异性背景荧光认为是基质非照明区域内的表面荧光。
检测表面反应活性位点相对密度。对每一试验的硅化合物,在用乙二胺的乙醇溶液进行去保护后,立即通过比较多种基质观察到的初始表面荧光强度,可估测每单位面积能达到的可利用表面合成位点的数量。
为了确定硅化合物涂层的相对稳定性,于45℃及pH7.3的5×SSPE缓冲水溶液(Bio Whittacker Products,Walkersville,MD)中将基质在旋转振摇器上轻微搅动。定期使基质从缓冲液移出并重新扫描,以测量仍结合至表面的荧光素的量。
如表面荧光素分析结果显示,与Bis硅烷相比较,Bis-B提供了可比较或改进的产品性能。
虽然本发明通过参考优选实施方案进行具体展示和描述,然而本领域人员可以理解,可对发明中的形式和细节作各种变换,而不会背离权利要求所包含的本发明范围。
Claims (36)
1.一种在基质表面生成聚合物阵列的方法,包含:
提供固相支持物上带有第一层的基质,所述第一层包括一种或多种介电涂层;所述第一层上置于包括多种聚合物的第二层;
按顺序在所述基质的不同选定区域内活化并偶联单体,从而在所述基质的所述表面上的不同已知位置处生成多种不同的聚合物序列,其中所述活化步骤包含将活化辐射引导至所述基质的所述表面处。
2.根据权利要求1的方法,其中所述介电涂层是二色抗反射涂层。
3.根据权利要求1的方法,其中所述聚合物阵列是寡核苷酸阵列。
4.根据权利要求1的方法,其中所述第一层的最外涂层是SiO2。
5.根据权利要求1的方法,其中所述第一层的最外涂层是含有羟基、羧基、氨基、巯基、卤烷基、1,2-二醇、醛、丙烯酰基,马来酰亚胺基或N-琥珀酰亚胺基羧酸酯基团的表面。
6.根据权利要求1的方法,其中所述基质的所述表面上的特征尺寸小于约20μm。
7.根据权利要求1的方法,其中所述基质的所述表面上的特征尺寸小于约10μm。
8.根据权利要求1的方法,其中通过将所述第一层与硅烷化试剂接触从而衍生化所述第一层。
9.根据权利要求8的方法,其中所述硅烷化试剂选自双-羟乙基-3-氨丙基三乙氧基硅烷,N(2-羟乙基)-N,N-双(三甲氧基甲硅烷基丙基)胺和双(三甲氧基甲硅烷基)-乙烷。
10.根据权利要求8的方法,其中所述硅烷化试剂是N(2-羟乙基)-N,N-双(三甲氧基甲硅烷基丙基)胺。
11.根据权利要求8的方法,其中所述硅烷化试剂是双-羟乙基-3-氨丙基三乙氧基硅烷和双(三甲氧基甲硅烷基)-乙烷的混合物。
12.根据权利要求1的方法,其中对所述第一层衍生化,并用以对光不稳的保护基保护的官能基进行涂布。
13.根据权利要求12的方法,其中所述对光不稳的保护基是MeNPOC。
14.一种在基质表面上生成聚合物阵列的方法,包含:
提供固相支持物上带有第一层的基质,所述第一层包括一种或多种介电涂层;通过将所述第一层与硅烷化试剂接触而衍生化所述第一层;
所述第一层上置有第二层,其中所述第二层包括以对光不稳的保护基保护的官能基;
通过从所述第一选定区域内的所述官能基除去所述保护基,从而活化所述基质的所述表面上的第一选定区域;
将第一单体偶联至所述第一选定区域内的所述官能基;通过从所述第二选定区域内的所述官能基除去所述保护基,从而活化所述基质的所述表面上的第二选定区域;
将第二单体偶联至所述第二选定区域内的所述官能基;
重复所述活化与偶联步骤,以生成多种不同的聚合物序列,所述不同的聚合物序列各自偶联至所述基质的所述表面的不同已知位置内。
15.根据权利要求14的方法,其中所述偶联步骤内偶联的所述第一和第二单体含有活性亚磷酰胺基。
16.根据权利要求14的方法,其中所述第一和第二单体含有核苷或核苷酸。
17.根据权利要求14的方法,其中所述硅烷化试剂选自双-羟乙基-3-氨丙基三乙氧基硅烷,N(2-羟乙基)-N,N-双(三甲氧基甲硅烷基丙基)胺和双(三甲氧基甲硅烷基)-乙烷。
18.根据权利要求14的方法,其中所述硅烷化试剂是N(2-羟乙基)-N,N-双(三甲氧基甲硅烷基丙基)胺。
19.根据权利要求14的方法,其中所述硅烷化试剂是双-羟乙基-3-氨丙基三乙氧基硅烷和双(三甲氧基甲硅烷基)-乙烷的混合物。
20.根据权利要求14的方法,其中所述衍生化步骤中,通过所述硅烷化试剂在所述表面上的可控气相沉积,从而实施所述基质的所述表面与硅烷化试剂的所述接触。
21.根据权利要求14的方法,其中所述多种不同聚合物序列包含多种不同的寡核苷酸序列。
22.一种位于基质表面上的聚合物阵列,包含位于固相支持物上的第一层及置于所述第一层上的第二层,所述第一层包括位于所述固相支持物上的一种或多种介电涂层,所述第二层包括多种聚合物。
23.根据权利要求22的阵列,其中所述介电涂层是二色抗反射涂层。
24.根据权利要求22的阵列,其中所述多种聚合物包含多种寡核苷酸。
25.根据权利要求22的阵列,其中所述第一层的最外涂层是SiO2。
26.根据权利要求22的阵列,其中所述第一层的最外涂层是包含羟基、羧基、氨基、巯基、卤烷基、1,2-二醇、醛、丙烯酰基,马来酰亚胺基或N-琥珀酰亚胺基羧酸酯基团的表面。
27.根据权利要求22的阵列,其中所述基质的所述表面上的特征尺寸小于约20μm。
28.根据权利要求22的阵列,其中所述基质的所述表面上的特征尺寸小于约10μm。
29.根据权利要求22的阵列,其中通过将所述第一层与硅烷化试剂接触从而衍生化所述第一层。
30.根据权利要求29的阵列,其中所述硅烷化试剂选自双-羟乙基-3-氨丙基三乙氧基硅烷,N(2-羟乙基)-N,N-双(三甲氧基甲硅烷基丙基)胺和双(三甲氧基甲硅烷基)-乙烷。
31.根据权利要求29的阵列,其中所述硅烷化试剂是N(2-羟乙基)-N,N-双(三甲氧基甲硅烷基丙基)胺。
32.根据权利要求29的阵列,其中所述硅烷化试剂是双-羟乙基-3-氨丙基三乙氧基硅烷和双(三甲氧基甲硅烷基)-乙烷的混合物。
33.根据权利要求22的阵列,其中对所述第一层衍生化,并用以对光不稳的保护基保护的官能基进行涂布。
34.根据权利要求33的阵列,其中所述对光不稳的保护基是MeNPOC。
35.根据权利要求22的阵列,其中所述多种聚合物包含多种多肽。
36.一种在基质表面上生成聚合物阵列的方法,包含:
提供固相支持物上带有第一层的基质,所述第一层包括一种或多种介电涂层;所述第一层上置于包括多种聚合物的第二层。
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