CN1630724A - 抑制靶基因表达的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抑制靶基因在细胞中表达的方法，包括下面的步骤：以足以抑制靶基因表达的量导入至少一种双链核糖核酸(dsRNA I)。该dsRNA I具有最多由49个连续核苷酸对组成的双链结构。所述双链结构的一条链(as1)或者所述一条链(as1)的至少一个片段与靶基因的有义链互补。该dsRNA I的一个末端(E1)具有一个由1－4个核苷酸组成的突出端。

Description

抑制靶基因表达的方法
本发明涉及抑制靶基因表达的方法，用途，和药物。
从WO 99/32619和WO 00/44895已知使用双链核糖核酸(dsRNA)抑制医学或生物技术上令人感兴趣的基因的方法。尽管该已知的方法有高效率，但是勿庸置疑对于进一步提高它们的效率仍然存在着需求。
本发明的目的是克服现有技术的缺陷。特别地，公开了一种方法，应用，和药物，通过它们可实现对靶基因表达的更有效的抑制。
通过权利要求1，41，和81的特征实现该目的。有利的实施方案来自权利要求2-40，42-80，和82-120的特征。
令人惊奇地，根据本发明要求的特征，体外和体内靶基因表达的抑制效率实现大大提高。作为dsRNA末端特定形成的结果，能以定向的方式实现它们在介导对靶基因的表达的抑制作用以及它们的稳定性的效率。作为这种提高的稳定性的结果提高了细胞中的活性浓度。
在本发明的术语中，″靶基因″理解意思是细胞中双链DNA的DNA链，它与包括所有的作为转录模板的被转录区的DNA链互补。换句话说，″靶基因″一般是有义链。一条链，或反义链(as1)能与RNA转录物或者其在靶基因表达期间形成的加工产物例如mRNA互补。术语″导入″理解是指摄取到细胞中。利用细胞本身可以进行摄取。但是，辅助试剂或装置也可以介导摄取。″突出端″理解指位于一端的突出物，它不是沃森-克里克碱基配对多核苷酸。″双链结构″理解是指一般根据沃森-克里克碱基配对的各条链的核苷酸结构。在本发明的术语中，双链结构也可以具有各个错配。
在特别有利的实施方案中，dsRNA I在一条链或反义链as1的3′-端和/或另一条链或反义链ss1的3′-端有突出端。dsRNA I还可以在一段是平端。在这种情况下，平端有利地位于具有一条链(反义链；as1)的5′-端的dsRNA I的这一侧上。在该实施方案中，在生物活体中dsRNA I具有非常好的效率和大的稳定性。总体内效率是出色的。突出端有利地由1-4个核苷酸组成，优选1或2个核苷酸。
根据另一个实施方案，当向细胞中导入相应于本发明的dsRNA I的至少一条另外的dsRNA II时本发明的效率能被进一步提高，其中dsRNA I的双链结构的一条链，或一条链的至少一个片段与靶基因的有义链的第一区互补，并且dsRNA II的双链结构的另一条链，或另一条链的至少一个片段与靶基因的有义链的第二区互补。在这种情况下靶基因表达的抑制作用被大大增强。第一和第二区片段能重叠，彼此连接，或是分开的。
进一步证明当dsRNA I和/或另外的dsRNA II长度少于25个连续的核苷酸对时是有利的。已经证明19和23个核苷酸对长度是特别有效的。当优选19-23个核苷酸对形成的双链中存在包含1-4个核苷酸的单链突出的时效率被进一步提高。
根据另一个实施方案，靶基因具有所附序列表中所示序列SQ001-SQ140之一。它可以选自下组：癌基因，细胞因子基因，Id蛋白质基因，朊病毒基因，来自诱导血管生成分子的基因，来自粘附分子的基因，和来自细胞表面受体的基因；来自转移和/或侵入过程中涉及的蛋白质的基因；来自蛋白酶和调节编程性细胞死亡和细胞周期的分子的基因；表达EGF受体的基因。特别地，靶基因可以是MDR1基因。因此可以使用序列SQ141-173之一或者合成整体反义-(as)和有义序列(ss)的组合之一组成的dsRNA I/II。
根据另一个有利的实施方案，根据RNA干扰原理抑制表达。
靶基因有利地在致病生物体，优选疟原虫中表达。它可以是病毒或类病毒特别是在人体中是致病性的病毒或类病毒的成分。病毒或类病毒也可以是在动物或植物中呈致病性的病毒或类病毒。
在另一个实施方案中，未配对的核苷酸被硫代磷酸核苷取代。
dsRNA I/II的至少一个末端可以被修饰来阻止在细胞中分解或者各条链解离。有利地，通过至少一个化学键增强互补核苷酸对产生的双链结构的内聚性。通过共价键或离子键，氢键，疏水作用可以实现化学键，优选利用范德华作用或堆积作用，或利用金属离子配位作用。另外，还证明了如果在一端附近存在化学键则是有利的并且提高稳定性。在权利要求24-30中关于化学键给出了其它有利的实施方案，不需要再进一步解释。
当dsRNA I/II被围绕在微团结构优选脂质体中时，它可以特别容易地被导入细胞中。对于将dsRNA I/II转运到细胞中，发现它们与至少一种病毒外壳蛋白质结合，与至少一种病毒外壳蛋白质缔合，或者被至少一种病毒外壳蛋白质围绕，所述病毒外壳蛋白质源于病毒，或者来自病毒，或者是合成制备的。所述外壳蛋白可以来自多瘤病毒。特别地，所述外壳蛋白可以含有多瘤病毒的病毒蛋白质1(VP1)和/或病毒蛋白质2(VP2)。根据另一个优选的实施方案，提出在从外壳蛋白形成壳体或壳体样结构时，一侧转向壳体或壳体样结构内部。此外，有利的是，dsRNA I/II的一条链(as1/as2)与靶基因的初始的或加工过的RNA转录物互补。所述细胞可以是脊椎动物细胞或人细胞。
此外，已经证明可以对哺乳动物优选对人施用dsRNA I/II，甚至以每天每千克体重5毫克的最大剂量。即使在该低剂量下功效也是出色的。令人惊奇地，已经证明dsRNA I/II可以在缓冲液中混合，然后口服或者注射或灌注给药，通过静脉内，肿瘤内，腹膜内，或者吸入给药。
此外，本发明提供一种双链核糖核酸(dsRNA I)抑制靶基因在细胞中表达的用途，其中dsRNA I具有最多由49个连续核苷酸对组成的双链结构，而且其中所述双链结构的一条链(反义链，as1)或者所述该条链的至少一个片段与靶基因的有义链互补，并且其中dsRNA I在一端具有一个由1-4个核苷酸组成的突出端。
根据本发明的另一个实施方案，提供含有足以抑制靶基因在细胞中表达的量的双链核糖核酸(dsRNA I)的药物，其中dsRNA I具有最多由49个连续核苷酸对组成的双链结构，而且其中所述双链结构的一条链(as1)或者一条链(as1)的至少一个片段与靶基因的有义链互补，并且其中dsRNA I在一端至少具有一个由1-4个核苷酸组成的突出端。
参照上面的讨论，可以得到dsRNA I/II的其它有利实施方案。
根据下面的附图和实施例解释本发明。这些是：
图1a，b第一和第二双链RNA图，
图2靶基因图，
图3NIH/3T3细胞中施用各种dsRNAs之后相对YFP荧光(第一个实验)，
图4NIH/3T3细胞中施用各种dsRNAs之后相对YFP荧光(第二个实验)，
图5NIH/3T3细胞中施用各种dsRNAs之后相对YFP荧光(第三个实验)，
图6NIH/3T3  胞中施用各种dsRNAs之后相对YFP荧光(第四个实验)，
图7Hela-S3细胞中施用各种dsRNAs之后相对YFP荧光(第五个实验)，
图8pcDNA-YFP转染之后或pcDNA-YFP和各种ds RNAs共转染之后NIH/3T3细胞的荧光显微成像，
图9pcDNA-YFP转染之后或pcDNA-YFP和各种dsRNAs共转染之后HeLa-S3细胞的荧光显微成像，
图10在小鼠血清中温育之后S1的凝胶电泳分离，
图11在人血清中温育之后S1的凝胶电泳分离，
图12在小鼠血清中温育之后S7的凝胶电泳分离，
图13在人血清中温育之后S7的凝胶电泳分离，
图14在小鼠血清中温育之后K3的凝胶电泳分离，
图15在小鼠血清中温育之后PKC1/2的凝胶电泳分离，
图16在人血清中温育之后S1A/S4B的凝胶电泳分离，
图17在人血清中温育之后K2的凝胶电泳分离，和
图18来自转基因GFP小鼠的肾石蜡切片的GFP-特异性免疫过氧化物酶染色，
图19来自转基因GFP小鼠的心脏石蜡切片的GFP-特异性免疫过氧化物酶染色，
图20来自转基因GFP小鼠的胰腺石蜡切片的GFP-特异性免疫过氧化物酶染色，
图21血浆中GFP表达的蛋白质印迹分析，
图22肾中GFP表达的蛋白质印迹分析，
图23心脏中GFP表达的蛋白质印迹分析，
图24U-87MG成胶质细胞瘤细胞中EGFR表达的蛋白质印迹分析，
图25a结肠癌细胞系LS174T中MDRI mRNA水平的RNA印迹分析，其中在74小时之后收集细胞，
图25b图25a泳带的定量分析，其中平均值由两个值得出的，
图26a结肠癌细胞系LS174T中MDRI mRNA水平的RNA印迹分析，其中在48小时之后收集细胞，
图26b图26a泳带的定量分析，其中代表两个值的平均值，
图27 175nM dsRNA(表4中序列R1)转染作用的发射光-和荧光显微成像之比较。
图1a和1b中图示说明的双链核酸dsRNA I和dsRNA II具有第一末端(E1)和第二末端(E2)。第一和第二核糖核酸dsRNA I/dsRNA II在两端(E1，E2)具有单链片段，由大约1-4个未配对的核苷酸形成。给出了两种可能的变体(变体1和2)，其中变体2具有平端(E2)。然而平端也可以位于其它变体的另一端(E1)。
图2图示说明位于DNA上的靶基因。用黑线表示靶基因。其具有第一区(B1)和第二区(B2)。
在各种情况下，第一dsRNA I(as1)或第二dsRNA II(as2)的一条链分别与靶基因中相应的B1或B2区互补。
当dsRNA I/dsRNA II在其末端(E1，E2)具有单链片段时靶基因的表达被特别有效地抑制。单链片段可以位于as1链或as2链上，或者位于反义链(ss1或ss2)上，或者位于链as1，as2，和反义链上。
如图2所示B1和B2区可以彼此分开，然而它们也可以连接或重叠。
I.成纤维细胞中YFP基因表达的抑制作用：
双链RNAs衍生自黄色荧光蛋白质(YFP)的序列，一种来自Aequoria victoria藻类的GFP(绿色荧光蛋白质)的变体，并且和YFP-编码质粒一起微注射到成纤维细胞中。接着，分析与没有dsRNA的细胞相比荧光的减少。
实验方案：
利用RNA合成仪(Expedite 8909，Applied Biosystems，Weiterstadt，德国)和常规化学方法从序列表SQ148，SQ149和SQ159合成单链RNA和它们的互补单链。这些接着用HPLC纯化。通过将10mM磷酸钠缓冲液，pH6.8，和100mM NaCl中单链的化学计量混合物加热至90℃然后使其缓慢冷却6小时达到室温，使各条链杂交成双链。将用这种方法获得的dsRNA微注射到试验细胞中。
用于该细胞培养实验的试验系统是鼠成纤维细胞系NIH/3T3，ECACC No.93061524(欧洲动物细胞培养物保藏中心)。pcDNA-YFP质粒，其在pcDNA3载体的相应限制位点包含800bp Bam HI/Eco RI-YFP片段，被用于微注射。研究同时转移的序列同源dsRNA的影响下YFP的表达。最早注射3小时之后在荧光显微镜下进行绿荧光分析。
细胞培养物的制备：
在培养箱中在37℃下在含有5％CO2的大气中细胞在DMEM中与4.5g/l葡萄糖和10％胎牛血清(FCS)，2mM L-谷酰胺，和青霉素/链霉素(100IU/100μg/ml，Biochrom)温育。为了将细胞保持在指数生长状态，细胞每三天传代。在转染之前的一天，使细胞受胰蛋白酶作用(10x胰蛋白酶/TEDTA，Biochrom)并且放在包被的培养皿(CORNING细胞培养皿，35mm，Corning Inc.，Corning NY)中，细胞密度是0.3×105。该培养皿在37℃ 下与0.2％明胶(Biochrom)温育至少30分钟，用PBS洗涤一次，并且立即用于培养细胞。为了再次发现各细胞，使用CELLocate盖玻片(55μm见方大小，Eppendorf)。
微注射：
在微注射之前大约10分钟从培养箱中取出培养皿。对于每个培养皿和每次培养微注射大约50个细胞(FemtoJet，Micromanipulator5171，Eppendorf)。使用内顶端直径是0.5μm的玻璃毛细管(FemtoTip，Eppendorf)。30hPA压力下注射时间是0.8秒。在装有荧光检测装置的Olympus IX50显微镜下进行微注射。使用的注射缓冲液由含有0.01μg/μl pcDNA-YFP的14mM NaCl，3mM KCl，和10mMKH2PO4，pH7.0，组成。为了微注射成功，向试验加入0.08％(w/v)偶联有葡聚糖70000的Texas红(Molecular Probes，Leiden，Nether lands)注射液。为了分析特异dsRNA对YFP表达的抑制作用，向注射液中加入dsRNAs：试验1：0.01μM dsRNA(序列表SQ148/149)；试验2：0.01μM dsRNA(序列表SQ148/159)；试验3：没有RNA。微注射之后，细胞在培养箱中温育至少又3小时。然后在显微镜下分析胞内YFP荧光：细胞同时发出红色和绿色荧光：微注射是成功的，没有观察到作为dsRNA的结果的YFP表达的抑制作用；或者有其中没有注射dsRNA的对照细胞；只有红色荧光细胞：微注射是成功的，dsRNA抑制YFP表达。
结论：
与没有具有单一突出链的末端的dsRNA相比较，0.1μg dsRNA浓度下，使用具有在两个3′-端均具有由两个核苷酸组成的突出端的单链区的dsRNA(序列表SQ148/159)大大提高成纤维细胞中YFP基因表达的抑制作用(表1)。
使用短dsRNA分子，该分子包含带有由几个，优选1-3个非碱基配对单链核苷酸组成的突出端的19-25个碱基对，使得有可能在相同RNA浓度下比使用具有相同数目的碱基对而没有相应的单链突出端的dsRNAs相对更强地抑制哺乳动物细胞中的基因表达。
试验 名称 序列表序号No. 0.1μM
1 S1A/S1B SQ148SQ149 +
2 S1A/S4B SQ148(突出端)SQ159 +++
3 没有RNA -
表1：符号给出没有-或弱-荧光细胞的相对比例(+++＞90％；++60-90％-+30-60％；-＜10％)。
II.dsRNA时培养的HELA-S3细胞和小鼠成纤维细胞中靶基因的 基因表达的抑制：
通过操作碱基对区的3′-端和长度可以调节以RNA干扰为基础的dsRNA对YFP-编码质粒的瞬时转染之后YFP表达的抑制有效性。
实施例：
为了测定基因表达的特异抑制中dsRNA的有效性，使用瞬时转染的NIH/3T3细胞(来自NIH瑞士小鼠胚胎的成纤维细胞，ECCAC[欧洲动物细胞培养物保藏中心]No.93061524)和HELA-S3(人宫颈癌细胞，DSMZ[德国微生物和细胞培养中心]No.ACC 161)。转染使用pcDNA-YFP质粒，其在载体pcDNA 3的相应切割位点包含800-bp BamHI/Eco RI-YFP片段。制备从黄色荧光蛋白质(YFP)的序列来源的双链RNAs(dsRNAs)，并且和pcDNA-YFP质粒一起瞬时转染到成纤维细胞中(使用的特异dsRNAs的反义链与YFP和GFP基因序列的相应片段互补)。48小时之后定量测定荧光的减少。只转染了pcDNA-YFP或pcDNA-YFP和对照dsRNA(不是从YFP序列来源的)的细胞被用作对照物。
试验方案：
dsRNA合成：
利用RNA合成仪(Expedite 8909，Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)，以及通过常规化学方法，合成序列表中给出的各RNA链以及它们的互补单链。然后借助于HPLC进行粗合成产物的纯化。使用NucleoPac PA-100，9×250柱(Dionex)，20mM tris，10mM NaClO4，pH6.8，10％乙腈用作低盐缓冲液，并且20mM tris，400mM NaClO4，pH6.8，10％乙腈用作高盐缓冲液。流速是每分钟3ml。通过将10mM磷酸钠缓冲液，pH6.8，和100mM NaCl中单链的化学计量混合物加热至80-90℃，然后使其缓慢冷却6小时达到室温，使单链杂交成双链。
接种细胞：
在合适的工作台(HS18/Hera Safe，Kendro，Heraeus)在无菌条件下进行所有的细胞培养。对于小鼠成纤维细胞在DMEM(Dulbecco′smodified eagle medium，Biochrom)中，对于HELA细胞在Ham′s F12中，在饱和的大气湿度下，在37℃，5％CO2，在培养箱(CO2-培养箱T20，Hera Cell，Kendro，Heraeus)中，用10％FCS(胎牛血清，Biochrom)，2mM L-谷酰胺(Biochrom)，和青霉素/链霉素(100IU/100μg/ml，Biochrom)培养NIH/3T3细胞和HELA-S3。为了将细胞保持在指数生长状态，细胞每三天传代。在转染之前24小时，使细胞受胰蛋白酶作用(10x胰蛋白酶/EDTA，Biochrom，德国)，并且放在96-孔板(Multiwell Schalen 96-孔，平底，Schubert & Weiss Laboratories，GmbH)中，细胞密度是1.0×104细胞/孔，并且在150μl生长培养基中培养。
实施瞬时转染：
使用Lipofectamine PlusTM试剂(Life Technologies)根据生产商说明进行转染。0.15μg pcDNA-YFP质粒放在各个孔中。整个转染体积是60μl。在各种情况下，开始使用3个样品。首先，质粒DNA与dsRNA一起复合。在没有血清的培养基中稀释质粒DNA和dsRNA，每0.1μg质粒DNA(体积10μl)使用1μl PLUS试剂。混合15分钟之后在室温下温育。温育期间对于每0.1μg质粒DNA在10μl没有血清的培养基中稀释0.5μl脂质转染胺试剂，充分混合，加给质粒/dsRNA/PLUS-混合物，并且再温育15分钟。在温育期间更换培养基。细胞用200μl没有血清的培养基洗涤一次，然后在培养箱中与40μl没有血清的培养基温育，直到加入DNA/dsRNA/PLUS/脂质转染胺试剂。每孔加入20μl DNA/dsRNA/PLUS/脂质转染胺试剂之后，细胞在培养箱中温育2.5小时。温育之后，用200μl生长培养基将细胞洗涤一次，并且在培养箱中在200μl生长培养基中温育24小时，然后进行荧光检测。
荧光检测：
最后一次更换培养基之后24小时，使用带有USH I02D汞灯(Ushio Inc.，东京，日本)，安装有WIB荧光管和数字CCD照相机(Orca IIIm，Hamamatsu)，和C4742-95预览监视器的荧光显微镜(IX50-S8F2，U-ULS100Hg荧光部件，Brenner U-RFL-T200，Olympus)对细胞荧光照像。使用分析软件3.1(Soft Imaging System GmbH，德国)分析荧光成像。为了使YFP荧光度与细胞密度相关，进行细胞核染色(Hoechst染色)。为此将细胞固定，首先在100μl甲基卡诺氏液(methylcarnoy)(75％甲醇，25％冰醋酸)中固定5分钟，然后再在甲基卡诺氏液中固定10分钟。空气风干之后，固定的细胞避光下每孔与100μl Hoechst染剂(75ng/ml)温育30分钟。用PBS(DulbeccoPBS w/o Ca2+，Mg2+，Biochrom)洗涤两次之后，在荧光显微镜(Olympus，用于Hoechst的WU荧光管)下对已经Hoechst染色的细胞照像。
图3-9中总结了dsRNA对培养的细胞中YFP表达的抑制结果：表3，4，5和6中总结了瞬时转染之后NIH/3T3小鼠成纤维细胞中YFP-特异性dsRNAs和对照dsRNAs对YFP表达的效果。根据试验方案所述进行实验。dsRNA的浓度与在转染反应期间培养基中的浓度相关。dsRNA命名可以见表2。它给出以表面百分比表示的每个成像的相对荧光度。对每个孔分析三个不同的成像。从三个成像获得平均值。
图7和9给出HELA-S3细胞中YFP-基因表达的特异性抑制作用。图7说明不同浓度的不同构型的dsRNA构建体(表2)对HeLa细胞中YFP表达的抑制作用。图8给出没有dsRNA和有特异性抗-YFP-定向dsRNAs(100倍放大)下，YFP瞬时转染的NIH/3T3小鼠成纤维细胞的代表性荧光显微照片。
8A：YFP对照
8B：S1，10nM
8C：S4，10nM
8D：S7，10nM
8E：S7/S11，1nM
8F：S7/S12，1nM
图9给出没有dsRNA和有特异性抗-YFP-定向dsRNAs(100培放大)下，YFP瞬时转染的HELA-3S细胞的代表性荧光显微照片。
9A：K2对照，10nM
9B：S1，10nM
9C：S4，10nM
9D：S7，10nM
9E：S7/11，1nM
9F：S7/12，1nM
9G：S1A/S4B，10nM
9H：YFP对照
结论：
图3说明当含有22-和19-碱基对的dsRNAs区的3′-端具有由2个核苷酸(nt)组成的单链片段时，YFP质粒和特异性抗-YFP-序列-定向dsRNAs共同瞬时转染小鼠成纤维细胞之后YFP表达能被特别有效地抑制。而带有3′-平端的S1 dsRNA在1nM浓度下(相对于转染期间细胞培养基中的浓度)对YFP表达没有抑制作用，S7 dsRNA(19个核苷酸对)和S4(22个核苷酸对)，各自在两个3′-端带有2nt突出端，分别将YFP表达抑制50％和70％，与相应对照dsRNAs(K3和K2)比较而言。在10nM浓度下，命名为S1的带有平端的dsRNA抑制YFP表达约65％，而S4 dsRNA抑制YFP表达～93％(图4)。命名为S4和S7的dsRNAs的抑制作用是浓度依赖性的(图3和4；也参见图7)。
图4说明YFP基因表达的有效表达不需要两个(有义和反义链)3′-端有单链构型。为了实现YFP表达的有效抑制，只需要反义链的3′-端有2nt突出端，因此，对于S4 dsRNAs(两个3′-端带有2nt突出端)和S1A/S4B(反义链的3′-端有一个2nt突出端)，1nM浓度下的YFP表达的抑制是～70％。不过，如果另一方面，2nt突出端位于有义链的3′-端(并且反义链的3′-端不具有单链区)，YFP基因表达的抑制是50％。类似地，当反义链的3′-端至少带有2nt突出端，则较高浓度下抑制作用好得多。
当碱基对区具有21个核苷酸对而不是22(S1和S4)，20(S13或S13/14，或19(S7)(图5，6，和7)，则实现更显著的YFP表达的抑制作用。因此，在5nM浓度下，S1(带有平端的22个碱基对)对YFP表达的抑制是～40％，而也是5nM下，S7/S12(带有平端的21个碱基对)的抑制作用是约92％。如果带有21个碱基对的dsRNA在反义链3′-端带有另一个2nt突出端(S7/S11)，则抑制作用是～97％(比较而言，S4是约73％抑制，S7是～70％抑制)。
III.双链RNA(dsRNA)的血清稳定性分析：
目的是利用细胞培养物中发现的dsRNAs介导的的对靶基因基因表达的抑制作用的有效性并且强化其体内应用。通过提高dsRNA在血清中的稳定性，并且通过延长分子在血液循环中的滞留时间，或者通过由上述产生的功能分子的有效浓度，实现该目的。
实施例：
离体对鼠和人血清测试抑制GFP-表达的dsRNAs的血清稳定性。
试验方案：
37℃下温育人和鼠血清与相应的dsRNA。在各种情况下，85μl血清与15μl 100μNM dsRNA温育。温育一段时间之后(30分钟，1小时，2小时，4小时，8小时，12小时，24小时)，样品在-80℃下冷冻。0时间的没有血清的dsRNA+85μl ddH2O)和有血清的dsRNA被用作对照物。
为了从培养物中分离dsRNA，在冰上进行，向个培养物加入400μl0.1％ SDS，然后用苯酚萃取：500μl苯酚∶氯仿∶异戊醇(IAA，25∶24∶1，Roti phenol，Roth，Karlsruhe)，然后在最高设置下涡旋30秒(Vortex Genie-2，Scientific Industries)。在冰上温育10分钟之后，通过在12,000xg，4℃下离心10分钟进行相分离(Sigms 3K30，Rotor 12131-H)。收集上层水相(大约200μl)，然后进行消化：首先用DNA酶I然后用蛋白酶K：20μl 10x DNA酶缓冲液(100mM tris，pH7.5，25mM MgCl2，1mM CaCl2)和10U DNA酶I(D7291，Sigma-Aldrich)，加入，在37℃下温育30分钟，然后再加入6U DNA酶I，在37℃ 下再温育20分钟。然后加入5μl蛋白酶K(20mg/ml，04-1075，Peqlab，德国)，在37℃下温育30分钟。然后进行苯酚萃取。向其中加入500μl苯酚∶氯仿∶IAA(25∶24∶1)，最高设置下涡旋30秒，然后在4℃ 下以12,000xg离心10分钟。去除上清液并且依次换成40μl 3M Na-Ac(乙酸钠)，pH5.2，和1ml 100％EtOH；充分混合并且在-80℃下沉淀至少1小时。在4℃下以12,000xg离心30分钟使沉淀物成颗粒状物，用70％EtOH洗涤，再次离心(10分钟，12,000xg，4℃)。然后将风干的颗粒状物混合在30μl RNA凝胶应用缓冲液(7M脲，1x TBE[0.09M三硼酸盐，0.002M EDTA，0.02％[w/v]溴酚蓝，0.2％[w/v]二甲苯苯胺)中，并且在凝胶应用之前保存在-20℃下。
为了表征dsRNA，进行分析，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(分析PAGE)。在电泳之前制备脲凝胶：搅拌下7M脲(21g)溶解于25ml 40％丙烯酰胺/双丙烯酰胺水溶液(Rotiphoresis凝胶，A515.1，Roth)和5ml 10x TBE(每升蒸馏水108g tris，55g硼酸，3.9g EDTA)，并且用蒸馏水稀释至50ml。倒入之前，加入50μl TEMED(N，N，N′，N′-四甲基乙二胺)和500μl 10％APS(硫酸过氧化氨)。聚合作用之后，将凝胶放在垂直电泳仪器(Merck，Darmstadt)中，在恒定的安培数40mA下流出第一级分30分钟。1x TBE缓冲液用作洗脱缓冲液。在将它们应用到凝胶上之前，将RNA样品在100℃加热5分钟，在冰上冷却，然后在台式离心机(Eppendorf Minispin)上离心20。对凝胶加15μl的各种样品。试验在40mA的恒定安培数下进行大约2小时。电泳之后，用全染剂溶液(20ml全染剂溶液[200mg全溶剂溶解于200ml甲醛]和200ml蒸馏水和100ml甲酰胺)对凝胶染色，然后通过用蒸馏水淋洗45分钟去除本底染剂。使用Pharmacia的Image MasterVDS光文件编制系统对凝胶照像。图10至17说明与人或鼠血清温育，接着在20％ 7M脲凝胶中电泳分离之后dsRNA的血清稳定性。
图10：小鼠血清中S1(0-22-0)的温育
1.0时间(没有血清)
2.0时间
3.30分钟
4.1小时
5.2小时
6.4小时
7.12小时
8.2μl 100μM S1，没有温育
S1A)有义链S1(10μl 20μM S1A)
S1B)反义链S1(10μl 20μM S1B)
图11：人血清中S1(0-22-0)的温育
1.没有处理的2μl 100μM S1(没有温育)
2.30分钟
3.2小时
4.4小时
5.6小时
6.8小时
7.12小时
8.24小时
S1A)有义链S1(10μl 20μM S1A)
S1B)反义链S1(10μl 20μM S1B)
图12：小鼠血清中S7(2-19-2)的温育
1.0时间(没有血清)
2.30分钟
3.4小时
4.12小时
图13：人血清中S7(2-19-2)的温育
1.有义链S7(10μl 20μM S7A)
2.反义链S7(10μl 20μM S7B)
3.30分钟
4.1小时
5.2小时
6.4小时
7.6小时
8.12小时
9.24小时
10.0时间(没有血清)
图14：小鼠血清中K3(2-19-2)的温育
1.有义链K3(10μl 20μM K3A)
2.反义链K3(10μl 20μM K3B)
3.0时间(没有血清)
4.0时间(有血清)
5.30分钟
6.1小时
7.2小时
8.4小时
9.12小时
图15：小鼠血清中PKC1/2(0-22-2)的温育
1.30分钟
2.1小时
3.2小时
4.4小时
5.12小时
6.2μl 100μM PKC1/2(没有处理的)
图16：人血清中S1A/S4B(0-22-2)的温育
1.0时间(没有血清)
2.24小时
3.12小时
4.8小时
5.6小时
6.4小时
7.2小时
8.30分钟
9.有义链S1A(10μl 20μM S1A)
10.反义链S4B(10μl 20μM S4B)
图17：人血清中K2(2-22-2)的温育
1.有义链K2(10μl 20μM K2A)
2.反义链K2(10μl 20μM K2B)
3.0时间(没有血清)
4.30分钟
5.2小时
6.4小时
7.6小时
8.8小时
9.12小时
10.24小时
结果：
与3′-端有单链2nt突出端的dsRNAs相比，在人和小鼠血清中，3′-端没有单链区的dsRNAs稳定得多(图10-14和17)。各自在鼠血清和人血清中温育S1 12和24小时之后，原来大小的一条泳带几乎保持完全完整。相反，两个3′-端有2nt突出端的dsRNAs的稳定性在人和鼠血清中大大降低。即使在S7(图12和13)或K3(图14)只温育4小时之后，仍然检测不到原来大小的泳带。
为了提高dsRNA在血清中的稳定性，如果dsRNA带有一个平头端就足够了。当与S7(4小时之后完全分解；图12，泳道3)相比较时，温育4小时之后，在所有的小鼠血清中，原来大小的带几乎没有破碎(图15，泳道4)。
关于dsRNA的生物有效性的最佳折中方案可以是利用带有一个平端和一个2nt单链区的dsRNA，其中单链突出端位于反义链的3′-端。
这里使用的序列在下面表2中和在序列表SQ148-151和153-167中重复表示。
名称  序列表No. dsRNA-序列
S1  SQ148SQ149 (A)5′-CCACAUGAAGCAGCACGACUUC-3′(B)3′-GGUGUACUUCGUCGUGCUGAAG-5′ 0-22-0
S7  SQ150SQ151 (A)5′-CCACAUGAAGCAGCACGACUU-3′(B)3′-CUGGUGUACUUCGUCGUGCUG-5′ 2-19-2
K1  SQ153SQ154 (A)5′-ACAGGAUGAGGAUCGUUUCGCA-3′(B)3′-UGUCCUACUCCUAGCAAAGCGU-5′ 0-22-0
K3  SQ155SQ156 (A)5′-GAUGAGGAUCGUUUCGCAUGA-3′(B)3′-UCCUACUCCUAGCAAAGCGUA-5′ 2-19-2
K2 SQ157SQ158 (A)5′-ACAGGAUGAGGAUCGUUUCGCAUG-3′(B)3′-UCUGUCCUACUCCUAGCAAAGCGU-5′ 2-22-2
S1A/S4B  SQ148SQ159 (A)5′-CCACAUGAAGCAGCACGACUUC-3′(B)3′-CUGGUGUACUUCGUCGUGCUGAAG-5′ 0-22-2
PKC1/2  SQ160SQ161 (A)5′-CUUCUCCGCCUCACACCGCUGCAA-3′(B)3′-GAAGAGGCGGAGUGUGGCGACG    -5′ 2-22-0
S7/S12  SQ150SQ162 (A)5′-CCACAUGAAGCAGCACGACUU-3′(B)3′-GGUGUACUUCGUCGUGCUGAA-5′ 0-21-0
S7/S11  SQ150SQ163 (A)5′-CCACAUGAAGCAGCACGACUU-3′(B)3′-CUGGUGUACUUCGUCGUGCUGAA-5′ 0-21-2
S13  SQ164SQ165 (A)5′-CCACAUGAAGCAGCACGACU-3′(B)3′-CUGGUGUACUUCGUCGUGCUGA-5′ 0-20-2
S13/14  SQ164SQ166 (A)5′-CCACAUGAAGCAGCACGACU-3′(B)3′-GGUGUACUUCGUCGUGCUGA-5′ 0-20-0
S4  SQ167SQ159 (A)5′-CCACAUGAAGCAGCACGACUUCUU-3′(B)3′-CUGGUGUACUUCGUCGUGCUGAAG-5′ 2-22-2
K1A/K2B SQ153SQ158 (A)5′-ACAGGAUGAGGAUCGUUUCGCA-3′(B)3′-UCUGUCCUACUCCUAGCAAAGCGU-5′ 0-22-2
K1B/K2A  SQ154SQ157 (A)5′-ACAGGAUGAGGAUCGUUUCGCAUG-3′(B)3′-UGUCCUACUCCUAGCAAAGCGU-5′ 2-22-0
S1B/S4A  SQ149SQ167 (A)5′-CCACAUGAAGCAGCACGACUUCUU-3′(B)3′-GGUGUACUUCGUCGUGCUGAAG-5′ 2-22-0
表2
IV.体内研究：
对蛋白质生物合成中涉及的所有细胞中表达绿色荧光蛋白(GFP)的″GFP实验室小鼠″的尾静脉注射分别从GFP序列和非特异性dsRNA来源的双链RNA(dsRNA)。在实验结束时杀死动物并且分析组织切片和血浆GFP表达。
实验方案：
dsRNA合成：
利用RNA合成仪(Expedite 8909，Applied Biosystems，Weiterstadt，德国)，并通过常规化学方法，合成序列表中给出的各RNA链和它们的各互补链。然后借助HPLC对粗合成产物进行纯化。使用NucleoPac PA-100，9×250柱(Dionex)：20mM tris，10mMNaClO4，pH6.8，10％乙腈被用作低盐缓冲液，而20mM tris，400mMNaClO4，pH6.8，10％乙腈被用作高盐缓冲液。流速是每分钟3ml。通过将10mM磷酸钠缓冲液，pH6.8，100mM NaCl中各条链的化学计量混合物加热至80-90℃，然后使其经6小时缓慢冷却到室温，使各条链杂交成双链。
试验动物条件和实验过程：
使用转基因实验小鼠品种TgN(GFPU)5Nagy(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)；该品种已显示在所有以前的试验细胞中表达GFP(带有β-肌动蛋白启动子和CMV中间体早期增强子)，(Hadjantonakis AK等，1993，Mech Dev.76：79-90；HadjantonakisAK等.，1998，Nature Genetics 19：220-222)。根据荧光(使用手持UV灯)容易从相应的野生型(WT)区分GFP-转基因小鼠。为了繁殖的目的，相应的WT总是与杂合GFP型相配对。根据德国动物权利法进行实验。每组有3-5只动物，动物被放在III型Makrolon笼(Ehret，Emmendingen)中，处在控制环境下，恒温22℃和12小时昼/夜节律。使用8/15细粒化木屑(Altomin，Lage)。动物随意接受自来水和标准饲料(Altormin 1324颗粒状物)。
实验中使用的杂合GFP动物如上所述，3只动物一组放在笼子中。12小时一周期(5:30-7:00和17:30-19:00)，历经5天时间对尾静脉静脉内(i.v.)注射dsRNA溶液。注射体积是每10g体重注射60μl，剂量分别是每千克体重2.5mg dsRNA或50μg。如下分组：
A组：PBS(磷酸缓冲盐水)每10g体重各60μl，
B组：每千克体重2.5mg非特异性对照dsRNA(有平端和一个由22个核苷酸对组成的双链区的K1对照)，
C组：每千克体重2.5mg另一种非特异性对照dsRNA(在两个3′-端有2nt突出端和一个由19个核苷酸对组成的双链区的K3对照)，
D组：每千克体重2.5mg dsRNA(特异性抗-GFP定向的，下面称作S1，有平端和一个由22个核苷酸对组成的双链区)，
E组：每千克体重2.5mg dsRNA(特异性抗-GFP定向的，下面称作S7，在两条链的两个3′-端有2nt突出端和一个由19个核苷酸对组成的双链区)，
F组：每千克体重50μg S1 dsRNA(换句话说是D组剂量的1/50)。
总计注射10次之后，14-20小时之后杀死动物，根据所述取出器官和血样。
器官取出：
利用CO2吸入杀死动物之后马上取出血样和各种器官(胸腺，还有，心脏，脾脏，胃，肠，胰腺，脑，肾，和肝)。用冷的无菌PBS将器官快速淋洗，并且使用消毒解剖刀切片。一部分在甲基卡诺氏液(MC，60％甲醇，30％氯仿，10％冰醋酸)中固定24小时用于免疫组织化学染色；一部分在液氮中速冻并且保存在-80℃下用于制备冷冻切片和用于蛋白质分离；另一较小部分在RNAeasy Protect(Qiagen)中在-80℃下冷冻用于RNA分离。血液取出后立即放在冰上30分钟，混合，以2000rpm(Mini spin，Eppendorf)离心5分钟。吸取上清液(这里称之为血浆)并且保存在-80℃下。
进行活组织检查：
组织在MC中固定24小时之后，组织切片在室温递增醇系列中脱水：每次40分钟，70％甲醇，80％甲醇，2×96％甲醇和3×100％异丙醇。之后，组织在培养箱中在100％异丙醇中在60℃下温热，在异丙醇/石蜡混合物中在60℃下温育1小时并且在石蜡中温育2小时三次，然后包埋在石蜡中。对于免疫过氧化物酶染色，制备厚度是3μm的组织切片，使用旋转切片机(Leica)，放在载玻片上(Superfrost，Vogel)，并且在培养箱中在60℃下温育30分钟。
对GFP的免疫过氧化物酶染色：
在二甲苯中将切片去石蜡3×5分钟，在递减醇系列(3×3分钟，100％乙醇，2×2分钟，95％乙醇)中再水合，然后在3％H2O2/甲醇中温育以封闭内源过氧化物酶。下面所有的温育步骤都在潮湿室内进行。用PBS冲洗3×3分钟之后，用一抗(山羊抗-GFP，sc-5384，SantaCruz Biotechnology)1∶500在1％BSA/PBS中在4℃下进行温育。然后在室温下用生物素化二抗(驴抗-山羊；Santa CruzBiotechnology；稀释度1∶2000)温育30分钟，其然后用抗生物素蛋白D过氧化物酶(稀释度1∶2000，Vector Laboratories)温育。每次抗体温育之后，切片在PBS中洗涤3×3分钟，从切片去除缓冲液残留物和细胞碎屑。所有的抗体在1％牛血清白蛋白(BSA)/PBS中稀释。使用DAB底物试剂盒(Vector Laboratories)根据生产商说明用3，3′-二氨基联苯胺(DAB)染色。对于核酸计数染色使用Gill′s苏木精III(Merck)。在递增醇系列和3×5分钟二甲苯中脱水之后，用Entellan(Merck)盖住切片。使用安装有CCD照相机(Hamamatsu)的OlympusIX50显微镜对染色进行显微镜分析。
从组织切片分离蛋白质：
向仍然冷冻着的切片加入800μl分离缓冲液(50mM HEPES，pH7.5；150mM NaCl；1mM EDTA；2.5mM EGTA；10％甘油；0.1％Tween；1mM DDT；10mM β-磷酸甘油酯；1mM NaF；0.1mMNa3VO4和Roche生产的″完全″蛋白酶抑制剂片剂)，然后使用Ultraturrax(DIAX 900，6G粉碎器，Heidolph)匀化2×30秒，并且在匀化步骤之间在冰上冷却。在冰上温育30分钟之后，混合，并且以10,000xg，在4℃下(3K30，Sigma)离心20分钟。然后上清液再在冰上温育10分钟，混合，以15,000xg离心20分钟。然后根据Zor & Selinger，1996改进的Bradford，1976的方法，使用Roth生产的Roti-Nanoquant系统，根据生产商说明，对上清液进行蛋白质测定。使用BSA(牛血清白蛋白)在浓度范围是10-100μg/ml内对蛋白质校准。
SDS凝胶电泳：
在Biometra生产的Multigel-Long电泳池中对蛋白质进行电泳分离，根据Lmmli(Nature 277：680-685，1970)使用变性的，不连续15％SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)。向顶部倒入分离凝胶达厚度为1.5mm∶7.5ml丙烯酰胺/双丙烯酰胺(30％，0.9％)，3.8ml 1.5M tris/HCl，pH8.4，150μl 10％ SDS，3.3ml双蒸馏水，250μl过硫酸铵[10％]，9μl TEMED(N，N，N′，N′-四亚甲基二胺)并且加一层0.1％SDS，直到发生聚合作用。然后收集的凝胶倒入：0.83μl丙烯酰胺/双丙烯酰胺(30％/0.9％)，630μl 1M tris/HCl，pH6.8，3.3ml双蒸馏水，50μl 10％SDS，50μl 10％过硫酸铵，5μl TEMED。
在施加给凝胶之前，向蛋白质加入相应量的4x样品缓冲液(200mM tris，pH6.8，4％SDS，100mM DTT[二硫苏糖醇]，0.02％溴酚蓝，20％甘油)，在100℃加热封闭变性。在冰上冷却之后，将其快速离心并且加到凝胶上。对各条泳道使用相同量的血浆或蛋白质(3μl血浆或25μg总蛋白质)。室温下恒压50V进行水冷却电泳。来自BioRad(Kaleidoscope预染色标准物)被用作标准长度。
蛋白质印迹和免疫检测：
使用Kyhse-Anderson(J.Biochem.Biophys.Methods10：203-210，1984)的半干燥方法，在室温下和恒定安培数0.8mA/cm2下将蛋白质从SDS-PAGE转移至PVDF(聚二氟乙烯)膜(Hybond-P，Amersham)，进行1.5小时。使用tris/甘氨酸缓冲液(39mM Gly，46mM tris，0.1％SDS，和20％甲醇)作为转移缓冲液。为了分析电泳转移，使用考马斯蓝(0.1％考马斯G250，45％甲醇，10％冰醋酸)免疫检测之后对印迹后凝胶和印迹膜染色。为了让非特异性键饱和，转移之后印迹膜在1％脱脂奶粉/PBS中在室温下温育1小时。之后，用0.1％Tween-20/PBS将其洗涤三次三分钟。所有的下面的抗体温育和洗涤都使用0.1％ Tween-20/PBS进行。室温下以1∶1000的稀释度温育一抗(山羊抗-GFP，sc-5384，Santa Cruz Biotechnology)1小时。之后，洗涤3×5分钟，室温下以1∶10000的稀释度用二抗(驴抗-山羊IgG辣根过氧化物酶，Santa Cruz Biotechnology)标记1小时。然后使用Amersham的ECL系统根据生产商说明进行检测。
图18-20表示在3-μm石蜡切片上，静脉内注射用抗-GFP免疫过氧化物酶染色的特异性抗-GFP定向dsRNA之后GFP表达的抑制作用。在试验进行中，在历经5天的12小时循环中使用具有没有3′-端突出端的22个核苷酸对组成的双链区的抗-GFP定向dsRNA(D)和相应的非特异性对照dsRNA(B)，以及具有3′-端有2nt突出端的19个核苷酸对组成的双链区的特异性抗-GFP定向dsRNA(E)和相应的非特异性对照dsRNA(C)。(F)接受D组剂量的1/50。没有接受dsRNA(A)的动物和野生型动物也用作进一步对照试验。图18说明肾切片中GFP表达的抑制作用，图19是心脏组织切片，图20是胰腺组织。图21-23给出血浆和组织中GFP表达的蛋白质印迹分析。图21说明血浆中GFP表达的抑制作用；图22是肾组织，图23是心脏组织。图23说明来自不同动物的总蛋白质分离物的使用。对各条泳道使用相同量的总蛋白质。在接受非特异性对照dsRNA的动物中(B和C组的动物)，无论怎样与没有接受dsRNA的动物相比，GFP表达没有减弱。与没有处理的动物相比(图18-23)，接受了包含位于两条链的3′-端的2nt突出端和19个核苷酸对组成的双链区的特异性抗-GFP定向dsRNA的动物，在检查的组织(心脏，肾脏，胰腺，和血液)中表现出GFP表达的显著抑制。在给与了具有平端和22个核苷酸对组成的双链区的特异性抗-GFP定向dsRNA的D和F组的动物中，只有接受每天每千克体重50μg剂量的那些动物才表现出GFP表达的特异性抑制作用，但是比E组中的动物小得多。
概括组织切片和蛋白质印迹上GFP抑制作用分析表明GFP表达抑制作用在血液和肾中最强(图18，21，和22)。
V.dsRNA对EGF受体基因表达的抑制作用作为EGFR过量表达或 EGFR-诱导的增殖为特征的癌症的治疗方案：
表皮生长因子(＝EGF)受体(＝EGFR)属于酪氨酸激酶受体，是在一系列细胞过程控制中涉及的具有固有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，所述一系列细胞过程是例如细胞生长，细胞分化，迁移过程，和细胞存活(综述见：Van der Geer等，1994)。EGFR家族由4个成员组成，EGFR(ErbB1)，HER2(ErbB2)，HER3(ErbB3)，和HER4(ErbB4)，带有跨膜区，半胱氨酸富集胞外区，和催化性胞内区。EGFR序列，一种170-kDa蛋白质，自从1984年就是已知的了(Ullrich等，1984)。
EGFR被肽生长因子激活，例如EGF，TGFα(转化生长因子)，双调蛋白，β动物纤维素，HB-EGF(肝素结合EGF-样生长因子)，和神经调节蛋白。  配体结合诱导形成同型二聚体或异二聚体，接着进行细胞质酪氨酸的自磷酸化作用(Ullrich & Schlessinger，1990；Alroy& Yarden，1997)。磷酸化氨基酸形成复杂网络中信号传递近端阶段中涉及的多种蛋白质的结合位点。在大多数各种各样的肿瘤病灶中涉及EGFR，因此是治疗方法的合适的靶物(Huang & Harari，1999)。导致异常EGFR活性的机理可能与突变受体形式的过量表达，扩增，组成型激活，或自分泌环有关(Voldberg等，1997)。对于一系列肿瘤有人描述过EGFR的过量表达，例如乳房癌(Walker & Dearing，1999)，非小细胞肺癌(Fontaninii等，1998)，胰腺癌，结肠癌(Salomon等，1995)，和成胶质细胞瘤(Rieske等，1998)。对于恶性成胶质细胞瘤，特别地，迄今为止还没有有效而特异性的治疗剂。
实施例：
为了检测dsRNA在EGFR基因表达特异性抑制中的有效性，使用U-87 MG细胞(人成胶质细胞瘤细胞)，ECCAC(欧洲动物细胞培养物保藏中心)No.89081402，用特异性抗-EGF-受体定向dsRNA(序列表SQ 51)转染。温育大约72小时之后，收集细胞，分离蛋白质，通过蛋白质印迹分析EGFR表达。
试验方案：
dsRNA合成：
使用RNA合成仪(Expedite 8909，Applied Biosystems，Weiterstadt，德国)，以及通过传统化学方法合成序列表中给出的各RNA链和它们各自的互补链。然后借助HPLC将粗合成产物纯化。使用NucleoPac PA-100，9×250柱(Dionex)，20mM tris；10mM NaClO4，pH6.8，10％乙腈用作低盐缓冲液，而20mM tris，400mM NaClO4，pH6.8，10％乙腈用作高盐缓冲液。流速是每分钟3ml。通过在10mM磷酸钠缓冲液，pH6.8，100mM NaCl中将各条链的化学计量混合物加热至80-90℃，然后再经6小时将它们缓慢冷却至室温，使各条链杂交成双链。
接种细胞：
所有的细胞培养都在合适的工作台(HS18/Hera Safe，Kendro，Heraeus)在无菌条件下进行。U-87MG细胞的培养在培养箱中(CO2-培养箱T20，Hera细胞，Kendro，Heraeus)在37℃，5％ CO2和饱和大气湿度下在DMEM(Dulbecco′s改进的eagle培养基，Biochrom)中用10％ FCS(胎牛血清，Biochrom)，2mM L-谷酰胺(Biochromone)mM丙酮酸钠(Biochrom)，1×NEAA(非必需氨基酸，Biochrom)，和青霉素/链霉素(100IU/100μg/ml，Biochrom)进行。为了将细胞保持在指数生长期，细胞每三天传代。利用转染使用dsRNA之前24小时，使细胞受胰蛋白酶作用(10x胰蛋白酶/EDTA，Biochrom，德国)，并且放在1.5μl生长培养基中在6-孔板上(6-孔板，Schubert & WeissLaboratories，GmbH)。
培养的U-87MG细胞中dsRNA的应用：
使用OLIGOFECTAMINETM试剂(Life Technologies)，根据生产商说明，通过转染进行dsRNA施用。总的转染体积是1ml。首先，dsRNA稀释在无血清培养基中：每孔0.5μl的20μM特异性抗EGFR定向dsRNA储液和9.5μl的20μM用175μl无血清培养基稀释的非特异性dsRNA(K1A/K2B)储液(转染温育物中200nM dsRNA或10M特异性EGFR-dsRNA)。OLIGOFECTAMINETM试剂也在无血清培养基中稀释：3μl，每孔12μl，然后室温下温育10。然后将稀释的OLIGOFECTAMINETM试剂加给稀释的dsRNA培养基，混合，并且在室温下又温育20分钟。温育期间更换培养基。用1ml无血清培养基洗涤细胞1x，并且在培养箱中用800μl无血清培养基连续温育，直到加入dsRNA/OLIGOFECTAMINETM试剂。每孔加入200μl dsRNA/OLIGOFECTAMINETM试剂之后，将细胞在培养箱中连续培养直到分离蛋白质。
蛋白质分离：
转染之后大约72小时，收集细胞并且分离蛋白质。去除培养基，并且用PBS冲洗细胞单层一次。加入200μl蛋白质分离缓冲液(1x″完全″蛋白酶抑制剂，Roche，50mM HEPES，pH7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，2.5mM EGTA，10％甘油，0.1％Tween-20，1mM DTT，10mM β-磷酸甘油酯，1mM NaF，0.1mM Na3VO4)之后，借助细胞刮刀取出细胞，在冰上温育10分钟，转移至Eppendorf试管，并且在-80℃下贮存至少30分钟。解融之后，用分散仪(DIAX 900，6G分散仪，Heidolph Instruments GmbH，Schwabach)在第三设置下将溶胞产物匀化10秒，在冰上温育10分钟，然后以14,000xg，4℃(3K30，Sigma)离心15分钟。使用来自Roth(Roth GmbH，Karlsruhe)的Roti-Nanoquant系统根据生产商说明对上清液进行Bradford蛋白质检测。合适的稀释度的200μl蛋白质溶液与800μl 1x工作液混合，然后在贝克曼分光光度计(DU 250)中用蒸馏水在450nm和590nm下在半微量比色池中测定消光度。BSA稀释液用于校正(液滴BSA，Sigma)。
SDS凝胶电泳：
根据Lmmli(Nature 277：68 0-685，1970)，在Biometra的Multigel-Long电泳池中用变性不连续7.5％SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)对蛋白质进行电泳分离。在上面倒入分离凝胶达1.5mm厚度：3.75ml丙烯酰胺/双丙烯酰胺(301％，0.9％)，3.8ml 1Mtris/HCl，pH8.4，150μl 10％ SDS，7.15ml蒸馏水，150μl过硫酸铵(10％)，9μl TEMED(N，N，N′，N′-四亚甲基二胺)，并且加一层0.1％SDS，直到发生聚合作用.然后，倒入收集的凝胶：0.83ml丙烯酰胺/双丙烯酰胺(30％/0.9％)，630μl 1M tris/HCl，pH6.8，3.4ml蒸馏水，50μl 10％SDS，50μl 10％过硫酸铵，5μl TEMED。
在施加给凝胶之前，以1∶3的比例向蛋白质加入4x样品缓冲液(200mM tris，pH6.8，4％SDS，100mM DTT[二硫苏糖醇]，0.02％溴酚蓝，20％甘油)量，在100℃加热变性5分钟。在冰上冷却之后，将其快速离心并且加到凝胶上。对各条泳道使用相同量的蛋白质(35μg总蛋白质)。室温下恒压50V进行水冷却电泳。Kaleidoscope预染色标准物(BioRad)被用作标准长度。
蛋白质印迹和免疫检测：
使用Kyhse-Anderson(J.Biochem.Biophys.Methods10：203-210，1984)的半干燥方法，在室温下和恒定安培数0.5mA/cm2下将蛋白质从SDS-PAGE转移至PVDF(聚二氟乙烯)膜(Hybond-P，Amersham)，进行1.5小时。阴极缓冲液(30mM tris，40mM甘氨酸，10％甲醇，and 0.01％ SDS，pH9.4)，阳极缓冲液I(300mM tris，pH10.4，10％甲醇)，和阳极缓冲液II(30mM tris，pH10.4，10％甲醇)用作转移缓冲液。在用3MM Whatman纸(Schleicher & Schüll)装在印迹泳道之前，凝胶在阴极缓冲液中，PVDF膜(事先在100％甲醇中温育30秒)在阳极缓冲液II(5分钟)中温育：2层3MM纸(阳极缓冲液I)，1层3MM纸(阳极缓冲液II)，PVDF膜，凝胶，3层3MM纸(阴极缓冲液)。为了分析电泳转移，免疫检测之后用考马斯蓝(0.1％考马斯G250，45％甲醇，10％冰醋酸)对印迹后凝胶和印迹膜染色。
转移之后，印迹膜在室温下在1％脱脂奶粉/PBS/0.1％Tween-20中温育1小时。之后，用0.1％Tween-20/PBS将其冲洗3分钟。所有的接下来的抗体温育和清洗都使用0.1％ Tween-20/PBS进行。在摇动器上在室温下以1.5μg/ml的浓度用一抗(人EGFR胞外域，特异性山羊IgG，目录号AF231，R&D Systems)温育2小时。然后冲洗3×5分钟，并且在室温下与1∶10,000稀释度的二抗(标记的驴抗-山羊IgG辣根过氧化物酶，Santa Cruz Biotechnology)温育1小时。冲洗之后(3×3分钟，用PBS/0.1％ Tween-20)，利用ECL反应(增强的化学光)立即检测。向18ml蒸馏水吸移200μl A溶液(250mM鲁米诺，Roth，溶解于DMSO)，89μl B溶液(90mM p-香豆酸，Sigma，溶解于DMSO)，和2ml 30％H2O2溶液。根据膜的大小，直接将4-6ml吸移至膜上，室温下温育1分钟，然后立刻层铺到x-射线膜上(BiomaxMS，Kodak)。
下面表3中，以及序列表SQ153，157，158，168-173，包括这里使用的序列。
ES-7  SQ168SQ169 (A)5′-AACACCGCAGCAUGUCAAGAU-3′(B)3′-UUUUGUGGCGUCGUACAGUUC-5′ 2-19-2
ES-8  SQ170SQ171 (A)5′-AAGUUAAAAUUCCCGUCGCUAU-3′(B)3′-CAAUUUUAAGGGCAGCGAUAGU-5′ 25-19-25
ES2A/ES5B  SQ172SQ173 (A)5′-AGUGUGAUCCAAGCUGUCCCAA-3′(B)3′-UUUCACACUAGGUUCGACAGGGUU-5′ 0-22-2
K2  SQ157SQ158 (A)5′-ACAGGAUGAGGAUCGUUUCGCAUG-3′(B)3′-UCUGUCCUACUCCUAGCAAAGCGU-5′ 2-22-2
K1A/K2B  SQ153SQ158 (A)5′-ACAGGAUGAGGAUCGUUUCGCA-3′(B)3′-UCUGUCCUACUCCUAGCAAAGCGU-5′ 0-22-2
表3
U-87 MG成胶质细胞瘤细胞中EGFR表达的抑制：
接种细胞24小时之后，用指出的10nM dsRNA转染(oligofectamine)。72小时之后，收集细胞并且分离蛋白质。蛋白质的分离在7.5％ SDS-PAGE中进行。对每一条泳道加35μg总蛋白质。图24给出相应的蛋白质印迹分析，它表明，与相应的对照物相比，使用反义链的3′-端有2nt突出端的特异性抗-EGFR定向dsRNA，在U-87MG细胞中转染之后EGFR表达被大大抑制。利用特异性dsRNA的内源基因表达的该抑制作用证实了实施例II的结果，即瞬时转染之后插入到细胞中的人工基因的表达的抑制。ES-7和ES-8介导的EGFR表达的抑制明显更小。表3给出图24中使用的dsRNAs。
VI.抑制多药物抗性基因1(MDR1)的表达：
试验方案：
使用结肠癌细胞系LS174T(ATCC-美国典型培养物保藏中心；Tom等，1976)对MDR1表达的封闭进行体外检测。已知该细胞系MDR1的表达是由向培养基加入利福平诱导的(Geick等，2001)。使用各种商售转染试剂盒进行转染(Lipofectamine，Oligofectamine，都来自Invitrogen；TransMessenger，Qiagen)，其中TransMessenger试剂盒被证实对于这种细胞系最合适。
使用四种短双链核糖核酸(R1-R4)进行RNA干扰实验。它们的序列见表4。该核糖核酸与MDR1(序列表SQ 30)的编码序列的片段是同源的。序列R1-R3由22体有义和24体反义链组成，其中得到的双链在3′-端具有2-核苷酸突出端(0-22-2)。序列R4相应于R1；但是它由19体双链组成，每一个都在各自的3′-端具有2-核苷酸突出端(2-19-2)。
 名称  序列表NO. 序列 数据库中的位置-#AF016535
 SeqR1  SQ141SQ142 5′-   CCA UCU CGA AAA GAA GUU AAG A-3′3′-UG GGU AGA GCU UUU CUU CAA UUC U-5′ 1320-13421335-1318
 SeqR2  SQ143SQ152 5′-   UAU AGG UUC CAG GCU UGC UGU A-3′3′-CG AUA UCC AAG GUC CGA ACG ACA U-5′ 2599-26212621-2597
 SeqR3  SQ144SQ145 5′-   CCA GAG AAG GCC GCA CCU GCA U-3′3′-UC GGU CUC UUC CGG CGU GGA CGU A-5′ 3778-37993799-3776
 SeqR4  SQ146SQ147 5′-   CCA UCU CGA AAA GAA GUU AAG-3′3′-UG GGU AGA GCU UUU CUU CAA U  -5′ 1320-13411339-1318
数据库中的位置-#AF402779
 K1A/K2B  SQ153SQ158 5′-   ACA GGA UGA GGA UCG UUU CGC A-3′3′-UC UGU CCU ACU CCU AGC AAA GCG U-5′ 2829-28082808-2831
表4
表4中给出的序列在序列表中指定为序列SQ141-147，152，153，和158。各种情况下dsRNA被作为双份试验转染到细胞中，浓度是175nM，细胞在前一天接种到12-孔板上，3.8×105细胞/孔。对于各转染分析，将93.3μl EC-R缓冲液(TransMessenger试剂盒，Qiagen，Hilden)与3.2μl Enhancer R混合，然后加入3.5μl特定20μMdsRNA，充分混合，室温下温育5分钟。加入6μl TransMessenger转染试剂之后，将转染试验剧烈混合10秒，然后在室温下温育10分钟。同时，从细胞中提取培养基，用PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗涤一次，然后向各孔的细胞加入200μl没有FCS的新鲜培养基。温育10-分钟之后，将100μl没有FCS的培养基吸移至各转染试验，混合，并且逐滴吸移混合物到细胞上(175μM的dsRNA浓度与400μl培养基总体积相关)。dsRNA/TransMessenger复合体在没有FCS的培养基中在37℃下与细胞温育4小时。然后变换培养基；新鲜培养基含有10μM利福平和10％FCS。与MDR1基因序列没有同源性的非特异dsRNA序列(K)被用作对照物，进行模拟转染，其含有除了dsRNA之外的所有的试剂。
24，48，和72小时之后收集细胞，用Qiagen的RNeasy小试剂盒提取总RNA。10μg来自各样品的总蛋白质然后在1％琼脂糖-甲醛凝胶上电泳分离，在尼龙膜上印迹，然后杂交，作为内部对照，特异性探针随机用5′-α32p-dCTP标记，首先对MDR1，印迹被剥离之后，对GAPDH，然后在x-射线膜上曝光。
使用Image-Quant软件对x-射线膜数字化处理(Image Master，VDS，Pharmacia)并定量测定。此时，进行MDR1-特异性泳带和相应的GAPDH泳带之间的校正。
结果：
图25和26说明用相应的GAPDH值(图25b，26p)校正之后MDR1-特异性泳带的定量分析的RNA印迹(图26a，26a)。与模拟转染相比较，MDR1-mRNA减少55％，与非特异性对照转染相比较，有45％。48小时之后，指定为R1，R2，和R3(表4)的dsRNA构建体中MDR1-mRNA水平显著减少。使用R4 dsRNA构建体，与对照相比较，48小时之后，没有发现显著减少(图26a和26b)。74小时之后，与48小时的值相比较，R1，R2，和R3 MDR1-mRNA水平相对于对照物减少得明显更多(图25a和26b)。此时R4也是可见到MDR1-mRNA水平显著减少。因此，与两条链(反义链和有义链)的3′-端具有2nt突出端和具有由19个核苷酸对组成的双链区的构建体相比，反义链3′-端具有2nt突出端和具有由22个核苷酸对组成的双链区的构建体更有效减小MDR1-mRNA水平，各种情况下相对独立于与MDR1基因同源的序列区(48小时之后；图26b)。结果强调了实施例IV中的发现，其中描述了在U-87MG细胞中转染之后利用特异性dsRNAs对EGFR基因表达的抑制。
在另一项实验中借助用Texas红(TexRed-A[GATC]5T；也用175nM转染)标记的DNA寡核苷酸测定转染效率(图27a，27b；400x放大，转染之后48小时)。与总细胞数相比，以红色荧光细胞为基础，转染效率大约是50％。如果考虑到细胞的转染比例大约是50％，则看起来合理地得出结论，观察到MDR1-mRNA水平降低大约45-55％(与对照物相比较)，在成功转染了特异性dsRNA的所有的细胞中MDR1-mRNA几乎完全地特异地破坏。
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                                序列表
<110>里伯药品公司
<120>抑制靶基因表达的方法
<130>
<140>
<141>
<160>142
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>2955
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<300>
<302>Eph A1
<310>NM00532
<300>
<302>ephrin A1
<310>NM00532
<400>1
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<210>2
<211>3042
<212>DNA
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<300>
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<400>2
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<210>3
<211>2953
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<300>
<302>ephrin A3
<310>NM005233
<400>3
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cagatggctg catatttcgg attttctgta gctgccactg acattaatgg agatgattat 960
gcagatgtgt ttattggagc acctctcttc atggatcgtg gctctgatgg caaactccaa 1020
gaggtggggc aggtctcagt gtctctacag agagcttcag gagacttcca gacgacaaag 1080
ctgaatggat ttgaggtctt tgcacggttt ggcagtgcca tagctccttt gggagatctg 1140
gaccaggatg gtttcaatga tattgcaatt gctgctccat atgggggtga agataaaaaa 1200
ggaattgttt atatcttcaa tggaagatca acaggcttga acgcagtccc atctcaaatc 1260
cttgaagggc agtgggctgc tcgaagcatg ccaccaagct ttggctattc aatgaaagga 1320
gccacagata tagacaaaaa tggatatcca gacttaattg taggagcttt tggtgtagat 1380
cgagctatct tatacagggc cagaccagtt atcactgtaa atgctggtct tgaagtgtac 1440
cctagcattt taaatcaaga caataaaacc tgctcactgc ctggaacagc tctcaaagtt 1500
tcctgtttta atgttaggtt ctgcttaaag gcagatggca aaggagtact tcccaggaaa 1560
cttaatttcc aggtggaact tcttttggat aaactcaagc aaaagggagc aattcgacga 1620
gcactgtttc tctacagcag gtccccaagt cactccaaga acatgactat ttcaaggggg 1680
ggactgatgc agtgtgagga attgatagcg tatctgcggg atgaatctga atttagagac 1740
aaactcactc caattactat ttttatggaa tatcggttgg attatagaac agctgctgat 1800
acaacaggct tgcaacccat tcttaaccag ttcacgcctg ctaacattag tcgacaggct 1860
cacattctac ttgactgtgg tgaagacaat gtctgtaaac ccaagctgga agtttctgta 1920
gatagtgatc aaaagaagat ctatattggg gatgacaacc ctctgacatt gattgttaag 1980
gctcagaatc aaggagaagg tgcctacgaa gctgagctca tcgtttccat tccactgcag 2040
gctgatttca tcggggttgt ccgaaacaat gaagccttag caagactttc ctgtgcattt 2100
aagacagaaa accaaactcg ccaggtggta tgtgaccttg gaaacccaat gaaggctgga 2160
actcaactct tagctggtct tcgtttcagt gtgcaccagc agtcagagat ggatacttct 2220
gtgaaatttg acttacaaat ccaaagctca aatctatttg acaaagtaag cccagttgta 2280
tctcacaaag ttgatcttgc tgttttagct gcagttgaga taagaggagt ctcgagtcct 2340
gatcatatct ttcttccgat tccaaactgg gagcacaagg agaaccctga gactgaagaa 2400
gatgttgggc cagttgttca gcacatctat gagctgagaa acaatggtcc aagttcattc 2460
agcaaggcaa tgctccatct tcagtggcct tacaaatata ataataacac tctgttgtat 2520
atccttcatt atgatattga tggaccaatg aactgcactt cagatatgga gatcaaccct 2580
ttgagaatta agatctcatc tttgcaaaca actgaaaaga atgacacggt tgccgggcaa 2640
ggtgagcggg accatctcat cactaagcgg gatcttgccc tcagtgaagg agatattcac 2700
actttgggtt gtggagttgc tcagtgcttg aagattgtct gccaagttgg gagattagac 2760
agaggaaaga gtgcaatctt gtacgtaaag tcattactgt ggactgagac ttttatgaat 2820
aaagaaaatc agaatcattc ctattctctg aagtcgtctg cttcatttaa tgtcatagag 2880
tttccttata agaatcttcc aattgaggat atcaccaact ccacattggt taccactaat 2940
gtcacctggg gcattcagcc agcgcccatg cctgtgcctg tgtgggtgat cattttagca 3000
gttctagcag gattgttgct actggctgtt ttggtatttg taatgtacag gatgggcttt 3060
tttaaacggg tccggccacc tcaagaagaa caagaaaggg agcagcttca acctcatgaa 3120
aatggtgaag gaaactcaga aacttaa                                     3147
<210>13
<211>402
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<300>
<302>CaSm(癌症相关SM-样癌基因)
<310>AF000177
<400>13
atgaactata tgcctggcac cgccagcctc atcgaggaca ttgacaaaaa gcacttggtt 60
ctgcttcgag atggaaggac acttataggc tttttaagaa gcattgatca atttgcaaac 120
ttagtgctac atcagactgt ggagcgtatt catgtgggca aaaaatacgg tgatattcct 180
cgagggattt ttgtggtcag aggagaaaat gtggtcctac taggagaaat agacttggaa 240
aaggagagtg acacacccct ccagcaagta tccattgaag aaattctaga agaacaaagg 300
gtggaacagc agaccaagct ggaagcagag aagttgaaag tgcaggccct gaaggaccga 360
ggtctttcca ttcctcgagc agatactctt gatgagtact aa                    402
<210>14
<211>1923
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<300>
<302>c-myb
<310>NM005375
<400>14
atggcccgaa gaccccggca cagcatatat agcagtgacg aggatgatga ggactttgag 60
atgtgtgacc atgactatga tgggctgctt cccaagtctg gaaagcgtca cttggggaaa 120
acaaggtgga cccgggaaga ggatgaaaaa ctgaagaagc tggtggaaca gaatggaaca 180
gatgactgga aagttattgc caattatctc ccgaatcgaa cagatgtgca gtgccagcac 240
cgatggcaga aagtactaaa ccctgagctc atcaagggtc cttggaccaa agaagaagat 300
cagagagtga tagagcttgt acagaaatac ggtccgaaac gttggtctgt tattgccaag 360
cacttaaagg ggagaattgg aaaacaatgt agggagaggt ggcataacca cttgaatcca 420
gaagttaaga aaacctcctg gacagaagag gaagacagaa ttatttacca ggcacacaag 480
agactgggga acagatgggc agaaatcgca aagctactgc ctggacgaac tgataatgct 540
atcaagaacc actggaattc tacaatgcgt cggaaggtcg aacaggaagg ttatctgcag 600
gagtcttcaa aagccagcca gccagcagtg gccacaagct tccagaagaa cagtcatttg 660
atgggttttg ctcaggctcc gcctacagct caactccctg ccactggcca gcccactgtt 720
aacaacgact attcctatta ccacatttct gaagcacaaa atgtctccag tcatgttcca 780
taccctgtag cgttacatgt aaatatagtc aatgtccctc agccagctgc cgcagccatt 840
cagagacact ataatgatga agaccctgag aaggaaaagc gaataaagga attagaattg 900
ctcctaatgt caaccgagaa tgagctaaaa ggacagcagg tgctaccaac acagaaccac 960
acatgcagct accccgggtg gcacagcacc accattgccg accacaccag acctcatgga 1020
gacagtgcac ctgtttcctg tttgggagaa caccactcca ctccatctct gccagcggat 1080
cctggctccc tacctgaaga aagcgcctcg ccagcaaggt gcatgatcgt ccaccagggc 1140
accattctgg ataatgttaa gaacctctta gaatttgcag aaacactcca atttatagat 1200
tctttcttaa acacttccag taaccatgaa aactcagact tggaaatgcc ttctttaact 1260
tccacccccc tcattggtca caaattgact gttacaacac catttcatag agaccagact 1320
gtgaaaactc aaaaggaaaa tactgttttt agaaccccag ctatcaaaag gtcaatctta 1380
gaaagctctc caagaactcc tacaccattc aaacatgcac ttgcagctca agaaattaaa 1440
tacggtcccc tgaagatgct acctcagaca ccctctcatc tagtagaaga tctgcaggat 1500
gtgatcaaac aggaatctga tgaatctgga tttgttgctg agtttcaaga aaatggacca 1560
cccttactga agaaaatcaa acaagaggtg gaatctccaa ctgataaatc aggaaacttc 1620
ttctgctcac accactggga aggggacagt ctgaataccc aactgttcac gcagacctcg 1680
cctgtgcgag atgcaccgaa tattcttaca agctccgttt taatggcacc agcatcagaa 1740
gatgaagaca atgttctcaa agcatttaca gtacctaaaa acaggtccct ggcgagcccc 1800
ttgcagcctt gtagcagtac ctgggaacct gcatcctgtg gaaagatgga ggagcagatg 1860
acatcttcca gtcaagctcg taaatacgtg aatgcattct cagcccggac gctggtcatg 1920
tga                                                               1923
<210>15
<211>544
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<300>
<302>c-myc
<310>J00120
<400>15
gacccccgag ctgtgctgct cgcggccgcc accgccgggc cccggccgtc cctggctccc 60
ctcctgcctc gagaagggca gggcttctca gaggcttggc gggaaaaaga acggagggag 120
ggatcgcgct gagtataaaa gccggttttc ggggctttat ctaactcgct gtagtaattc 180
cagcgagagg cagagggagc gagcgggcgg ccggctaggg tggaagagcc gggcgagcag 240
agctgcgctg cgggcgtcct gggaagggag atccggagcg aatagggggc ttcgcctctg 300
gcccagccct cccgctgatc ccccagccag cggtccgcaa cccttgccgc atccacgaaa 360
ctttgcccat agcagcgggc gggcactttg cactggaact tacaacaccc gagcaaggac 420
gcgactctcc cgacgcgggg aggctattct gcccatttgg ggacacttcc ccgccgctgc 480
caggacccgc ttctctgaaa ggctctcctt gcagctgctt agacgctgga tttttttcgg 540
gtag                                                              544
<210>16
<211>618
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<300>
<302>ephrin-A1
<310>NM004428
<400>16
atggagttcc tctgggcccc tctcttgggt ctgtgctgca gtctggccgc tgctgatcgc 60
cacaccgtct tctggaacag ttcaaatccc aagttccgga atgaggacta caccatacat 120
gtgcagctga atgactacgt ggacatcatc tgtccgcact atgaagatca ctctgtggca 180
gacgctgcca tggagcagta catactgtac ctggtggagc atgaggagta ccagctgtgc 240
cagccccagt ccaaggacca agtccgctgg cagtgcaacc ggcccagtgc caagcatggc 300
ccggagaagc tgtctgagaa gttccagcgc ttcacacctt tcaccctggg caaggagttc 360
aaagaaggac acagctacta ctacatctcc aaacccatcc accagcatga agaccgctgc 420
ttgaggttga aggtgactgt cagtggcaaa atcactcaca gtcctcaggc ccatgtcaat 480
ccacaggaga agagacttgc agcagatgac ccagaggtgc gggttctaca tagcatcggt 540
cacagtgctg ccccacgcct cttcccactt gcctggactg tgctgctcct tccacttctg 600
ctgctgcaaa ccccgtga                                               618
<210>17
<211>642
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>17
atggcgcccg cgcagcgccc gctgctcccg ctgctgctcc tgctgttacc gctgccgccg 60
ccgcccttcg cgcgcgccga ggacgccgcc cgcgccaact cggaccgcta cgccgtctac 120
tggaaccgca gcaaccccag gttccacgca ggcgcggggg acgacggcgg gggctacacg 180
gtggaggtga gcatcaatga ctacctggac atctactgcc cgcactatgg ggcgccgctg 240
ccgccggccg agcgcatgga gcactacgtg ctgtacatgg tcaacggcga gggccacgcc 300
tcctgcgacc accgccagcg cggcttcaag cgctgggagt gcaaccggcc cgcggcgccc 360
ggggggccgc tcaagttctc ggagaagttc cagctcttca cgcccttctc cctgggcttc 420
gagttccggc ccggccacga gtattactac atctctgcca cgcctcccaa tgctgtggac 480
cggccctgcc tgcgactgaa ggtgtacgtg cggccgacca acgagaccct gtacgaggct 540
cctgagccca tcttcaccag caataactcg tgtagcagcc cgggcggctg ccgcctcttc 600
ctcagcacca tccccgtgct ctggaccctc ctgggttcct ag                    642
<210>18
<211>717
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<300>
<302>ephrin-A3
<310>XM001787
<400>18
atggcggcgg ctccgctgct gctgctgctg ctgctcgtgc ccgtgccgct gctgccgctg 60
ctggcccaag ggcccggagg ggcgctggga aaccggcatg cggtgtactg gaacagctcc 120
aaccagcacc tgcggcgaga gggctacacc gtgcaggtga acgtgaacga ctatctggat 180
atttactgcc cgcactacaa cagctcgggg gtgggccccg gggcgggacc ggggcccgga 240
ggcggggcag agcagtacgt gctgtacatg gtgagccgca acggctaccg cacctgcaac 300
gccagccagg gcttcaagcg ctgggagtgc aaccggccgc acgccccgca cagccccatc 360
aagttctcgg agaagttcca gcgctacagc gccttctctc tgggctacga gttccacgcc 420
ggccacgagt actactacat ctccacgccc actcacaacc tgcactggaa gtgtctgagg 480
atgaaggtgt tcgtctgctg cgcctccaca tcgcactccg gggagaagcc ggtccccact 540
ctcccccagt tcaccatggg ccccaatatg aagatcaacg tgctggaaga ctttgaggga 600
gagaaccctc aggtgcccaa gcttgagaag agcatcagcg ggaccagccc caaacgggaa 660
cacctgcccc tggccgtggg catcgccttc ttcctcatga cgttcttggc ctcctag    717
<210>19
<211>606
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<300>
<302>ephrin-A3
<310>XM001784
<400>19
atgcggctgc tgcccctgct gcggactgtc ctctgggccg cgttcctcgg ctcccctctg 60
cgcgggggct ccagcctccg ccacgtagtc tactggaact ccagtaaccc caggttgctt 120
cgaggagacg ccgtggtgga gctgggcctc aacgattacc tagacattgt ctgcccccac 180
tacgaaggcc cagggccccc tgagggcccc gagacgtttg ctttgtacat ggtggactgg 240
ccaggctatg agtcctgcca ggcagagggc ccccgggcct acaagcgctg ggtgtgctcc 300
ctgccctttg gccatgttca attctcagag aagattcagc gcttcacacc cttctccctc 360
ggctttgagt tcttacctgg agagacttac tactacatct cggtgcccac tccagagagt 420
tctggccagt gcttgaggct ccaggtgtct gtctgctgca aggagaggaa gtctgagtca 480
gcccatcctg ttgggagccc tggagagagt ggcacatcag ggtggcgagg gggggacact 540
cccagccccc tctgtctctt gctattactg ctgcttctga ttcttcgtct tctgcgaatt 600
ctgtga                                                            606
<210>20
<211>687
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<300>
<302>ephrin-A5
<310>NM001962
<400>20
atgttgcacg tggagatgtt gacgctggtg tttctggtgc tctggatgtg tgtgttcagc 60
caggacccgg gctccaaggc cgtcgccgac cgctacgctg tctactggaa cagcagcaac 120
cccagattcc agaggggtga ctaccatatt gatgtctgta tcaatgacta cctggatgtt 180
ttctgccctc actatgagga ctccgtccca gaagataaga ctgagcgcta tgtcctcgac 240
atggtgaact ttgatggcta cagtgcctgc gaccacactt ccaaagggtt caagagatgg 300
gaatgtaacc ggcctcactc tccaaatgga ccgctgaagt tctctgaaaa attccagctc 360
ttcactccct tttctctagg atttgaattc aggccaggcc gagaatattt ctacatctcc 420
tctgcaatcc cagataatgg aagaaggtcc tgtctaaagc tcaaagtctt tgtgagacca 480
acaaatagct gtatgaaaac tataggtgtt catgatcgtg ttttcgatgt taacgacaaa 540
gtagaaaatt cattagaacc agcagatgac accgtacatg agtcagccga gccatcccgc 600
ggcgagaacg cggcacaaac accaaggata cccagccgcc ttttggcaat cctactgttc 660
ctcctggcga tgcttttgac attatag                                     687
<210>21
<211>2955
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>21
atggccctgg attatctact actgctcctc ctggcatccg cagtggctgc gatggaagaa 60
acgttaatgg acaccagaac ggctactgca gagctgggct ggacggccaa tcctgcgtcc 120
gggtgggaag aagtcagtgg ctacgatgaa aacctgaaca ccatccgcac ctaccaggtg 180
tgcaatgtct tcgagcccaa ccagaacaat tggctgctca ccaccttcat caaccggcgg 240
ggggcccatc gcatctacac agagatgcgc ttcactgtga gagactgcag cagcctccct 300
aatgtcccag gatcctgcaa ggagaccttc aacttgtatt actatgagac tgactctgtc 360
attgccacca agaagtcagc cttctggtct gaggccccct acctcaaagt agacaccatt 420
gctgcagatg agagcttctc ccaggtggac tttgggggaa ggctgatgaa ggtaaacaca 480
gaagtcagga gctttgggcc tcttactcgg aatggttttt acctcgcttt tcaggattat 540
ggagcctgta tgtctcttct ttctgtccgt gtcttcttca aaaagtgtcc cagcattgtg 600
caaaattttg cagtgtttcc agagactatg acaggggcag agagcacatc tctggtgatt 660
gctcggggca catgcatccc caacgcagag gaagtggacg tgcccatcaa actctactgc 720
aacggggatg gggaatggat ggtgcctatt gggcgatgca cctgcaagcc tggctatgag 780
cctgagaaca gcgtggcatg caaggcttgc cctgcaggga cattcaaggc cagccaggaa 840
gctgaaggct gctcccactg cccctccaac agccgctccc ctgcagaggc gtctcccatc 900
tgcacctgtc ggaccggtta ttaccgagcg gactttgacc ctccagaagt ggcatgcact 960
agcgtcccat caggtccccg caatgttatc tccatcgtca atgagacgtc catcattctg 1020
gagtggcacc ctccaaggga gacaggtggg cgggatgatg tgacctacaa catcatctgc 1080
aaaaagtgcc gggcagaccg ccggagctgc tcccgctgtg acgacaatgt ggagtttgtg 1140
cccaggcagc tgggcctgac ggagtgccgc gtctccatca gcagcctgtg ggcccacacc 1200
ccctacacct ttgacatcca ggccatcaat ggagtctcca gcaagagtcc cttcccccca 1260
cagcacgtct ctgtcaacat caccacaaac caagccgccc cctccaccgt tcccatcatg 1320
caccaagtca gtgccactat gaggagcatc accttgtcat ggccacagcc ggagcagccc 1380
aatggcatca tcctggacta tgagatccgg tactatgaga aggaacacaa tgagttcaac 1440
tcctccatgg ccaggagtca gaccaacaca gcaaggattg atgggctgcg gcctggcatg 1500
gtatatgtgg tacaggtgcg tgcccgcact gttgctggct acggcaagtt cagtggcaag 1560
atgtgcttcc agactctgac tgacgatgat tacaagtcag agctgaggga gcagctgccc 1620
ctgattgctg gctcggcagc ggccggggtc gtgttcgttg tgtccttggt ggccatctct 1680
atcgtctgta gcaggaaacg ggcttatagc aaagaggctg tgtacagcga taagctccag 1740
cattacagca caggccgagg ctccccaggg atgaagatct acattgaccc cttcacttat 1800
gaggatccca acgaagctgt ccgggagttt gccaaggaga ttgatgtatc ttttgtgaaa 1860
attgaagagg tcatcggagc aggggagttt ggagaagtgt acaaggggcg tttgaaactg 1920
ccaggcaaga gggaaatcta cgtggccatc aagaccctga aggcagggta ctcggagaag 1980
cagcgtcggg actttctgag tgaggcgagc atcatgggcc agttcgacca tcctaacatc 2040
attcgcctgg agggtgtggt caccaagagt cggcctgtca tgatcatcac agagttcatg 2100
gagaatggtg cattggattc tttcctcagg caaaatgacg ggcagttcac cgtgatccag 2160
cttgtgggta tgctcagggg catcgctgct ggcatgaagt acctggctga gatgaattat 2220
gtgcatcggg acctggctgc taggaacatt ctggtcaaca gtaacctggt gtgcaaggtg 2280
tccgactttg gcctctcccg ctacctccag gatgacacct cagatcccac ctacaccagc 2340
tccttgggag ggaagatccc tgtgagatgg acagctccag aggccatcgc ctaccgcaag 2400
ttcacttcag ccagcgacgt ttggagctat gggatcgtca tgtgggaagt catgtcattt 2460
ggagagagac cctattggga tatgtccaac caagatgtca tcaatgccat cgagcaggac 2520
taccggctgc ccccacccat ggactgtcca gctgctctac accagctcat gctggactgt 2580
tggcagaagg accggaacag ccggccccgg tttgcggaga ttgtcaacac cctagataag 2640
atgatccgga acccggcaag tctcaagact gtggcaacca tcaccgccgt gccttcccag 2700
cccctgctcg accgctccat cccagacttc acggccttta ccaccgtgga tgactggctc 2760
agcgccatca aaatggtcca gtacagggac agcttcctca ctgctggctt cacctccctc 2820
cagctggtca cccagatgac atcagaagac ctcctgagaa taggcatcac cttggcaggc 2880
catcagaaga agatcctgaa cagcattcat tctatgaggg tccagataag tcagtcacca 2940
acggcaatgg catga                                                  2955
<210>22
<211>3168
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>22
atggctctgc ggaggctggg ggccgcgctg ctgctgctgc cgctgctcgc cgccgtggaa 60
gaaacgctaa tggactccac tacagcgact gctgagctgg gctggatggt gcatcctcca 120
tcagggtggg aagaggtgag tggctacgat gagaacatga acacgatccg cacgtaccag 180
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<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<300>
<302>端粒酶逆转录酶
<310>AF015950
<400>28
atgccgcgcg ctccccgctg ccgagccgtg cgctccctgc tgcgcagcca ctaccgcgag 60
gtgctgccgc tggccacgtt cgtgcggcgc ctggggcccc agggctggcg gctggtgcag 120
cgcggggacc cggcggcttt ccgcgcgctg gtggcccagt gcctggtgtg cgtgccctgg 180
gacgcacggc cgccccccgc cgccccctcc ttccgccagg tgtcctgcct gaaggagctg 240
gtggcccgag tgctgcagag gctgtgcgag cgcggcgcga agaacgtgct ggccttcggc 300
ttcgcgctgc tggacggggc ccgcgggggc ccccccgagg ccttcaccac cagcgtgcgc 360
agctacctgc ccaacacggt gaccgacgca ctgcggggga gcggggcgtg ggggctgctg 420
ctgcgccgcg tgggcgacga cgtgctggtt cacctgctgg cacgctgcgc gctctttgtg 480
ctggtggctc ccagctgcgc ctaccaggtg tgcgggccgc cgctgtacca gctcggcgct 540
gccactcagg cccggccccc gccacacgct agtggacccc gaaggcgtct gggatgcgaa 600
cgggcctgga accatagcgt cagggaggcc ggggtccccc tgggcctgcc agccccgggt 660
gcgaggaggc gcgggggcag tgccagccga agtctgccgt tgcccaagag gcccaggcgt 720
ggcgctgccc ctgagccgga gcggacgccc gttgggcagg ggtcctgggc ccacccgggc 780
aggacgcgtg gaccgagtga ccgtggtttc tgtgtggtgt cacctgccag acccgccgaa 840
gaagccacct ctttggaggg tgcgctctct ggcacgcgcc actcccaccc atccgtgggc 900
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tgtcccccgg tgtacgccga gaccaagcac ttcctctact cctcaggcga caaggagcag 1020
ctgcggccct ccttcctact cagctctctg aggcccagcc tgactggcgc tcggaggctc 1080
gtggagacca tctttctggg ttccaggccc tggatgccag ggactccccg caggttgccc 1140
cgcctgcccc agcgctactg gcaaatgcgg cccctgtttc tggagctgct tgggaaccac 1200
gcgcagtgcc cctacggggt gctcctcaag acgcactgcc cgctgcgagc tgcggtcacc 1260
ccagcagccg gtgtctgtgc ccgggagaag ccccagggct ctgtggcggc ccccgaggag 1320
gaggacacag acccccgtcg cctggtgcag ctgctccgcc agcacagcag cccctggcag 1380
gtgtacggct tcgtgcgggc ctgcctgcgc cggctggtgc ccccaggcct ctggggctcc 1440
aggcacaacg aacgccgctt cctcaggaac accaagaagt tcatctccct ggggaagcat 1500
gccaagctct cgctgcagga gctgacgtgg aagatgagcg tgcgggactg cgcttggctg 1560
cgcaggagcc caggggttgg ctgtgttccg gccgcagagc accgtctgcg tgaggagatc 1620
ctggccaagt tcctgcactg gctgatgagt gtgtacgtcg tcgagctgct caggtctttc 1680
ttttatgtca cggagaccac gtttcaaaag aacaggctct ttttctaccg gaagagtgtc 1740
tggagcaagt tgcaaagcat tggaatcaga cagcacttga agagggtgca gctgcgggag 1800
ctgtcggaag cagaggtcag gcagcatcgg gaagccaggc ccgccctgct gacgtccaga 1860
ctccgcttca tccccaagcc tgacgggctg cggccgattg tgaacatgga ctacgtcgtg 1920
ggagccagaa cgttccgcag agaaaagagg gccgagcgtc tcacctcgag ggtgaaggca 1980
ctgttcagcg tgctcaacta cgagcgggcg cggcgccccg gcctcctggg cgcctctgtg 2040
ctgggcctgg acgatatcca cagggcctgg cgcaccttcg tgctgcgtgt gcgggcccag 2100
gacccgccgc ctgagctgta ctttgtcaag gtggatgtga cgggcgcgta cgacaccatc 2160
ccccaggaca ggctcacgga ggtcatcgcc agcatcatca aaccccagaa cacgtactgc 2220
gtgcgtcggt atgccgtggt ccagaaggcc gcccatgggc acgtccgcaa ggccttcaag 2280
agccacgtct ctaccttgac agacctccag ccgtacatgc gacagttcgt ggctcacctg 2340
caggagacca gcccgctgag ggatgccgtc gtcatcgagc agagctcctc cctgaatgag 2400
gccagcagtg gcctcttcga cgtcttccta cgcttcatgt gccaccacgc cgtgcgcatc 2460
aggggcaagt cctacgtcca gtgccagggg atcccgcagg gctccatcct ctccacgctg 2520
ctctgcagcc tgtgctacgg cgacatggag aacaagctgt ttgcggggat tcggcgggac 2580
gggctgctcc tgcgtttggt ggatgatttc ttgttggtga cacctcacct cacccacgcg 2640
aaaaccttcc tcaggaccct ggtccgaggt gtccctgagt atggctgcgt ggtgaacttg 2700
cggaagacag tggtgaactt ccctgtagaa gacgaggccc tgggtggcac ggcttttgtt 2760
cagatgccgg cccacggcct attcccctgg tgcggcctgc tgctggatac ccggaccctg 2820
gaggtgcaga gcgactactc cagctatgcc cggacctcca tcagagccag tctcaccttc 2880
aaccgcggct tcaaggctgg gaggaacatg cgtcgcaaac tctttggggt cttgcggctg 2940
aagtgtcaca gcctgtttct ggatttgcag gtgaacagcc tccagacggt gtgcaccaac 3000
atctacaaga tcctcctgct gcaggcgtac aggtttcacg catgtgtgct gcagctccca 3060
tttcatcagc aagtttggaa gaaccccaca tttttcctgc gcgtcatctc tgacacggcc 3120
tccctctgct actccatcct gaaagccaag aacgcaggga tgtcgctggg ggccaagggc 3180
gccgccggcc ctctgccctc cgaggccgtg cagtggctgt gccaccaagc attcctgctc 3240
aagctgactc gacaccgtgt cacctacgtg ccactcctgg ggtcactcag gacagcccag 3300
acgcagctga gtcggaagct cccggggacg acgctgactg ccctggaggc cgcagccaac 3360
ccggcactgc cctcagactt caagaccatc ctggactga                        3399
<210>29
<211>567
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<300>
<302>K-ras
<310>M54968
<400>29
atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gcttgtggcg taggcaagag tgccttgacg 60
atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac 120
aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt 180
caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt 240
gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt 300
aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg 360
ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct 420
tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag ggtgttgatg atgccttcta tacattagtt 480
cgagaaattc gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag 540
tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa                                     567
<210>30
<211>3840
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<300>
<302>mdr-1
<310>AF016535
<400>30
atggatcttg aaggggaccg caatggagga gcaaagaaga agaacttttt taaactgaac 60
aataaaagtg aaaaagataa gaaggaaaag aaaccaactg tcagtgtatt ttcaatgttt 120
cgctattcaa attggcttga caagttgtat atggtggtgg gaactttggc tgccatcatc 180
catggggctg gacttcctct catgatgctg gtgtttggag aaatgacaga tatctttgca 240
aatgcaggaa atttagaaga tctgatgtca aacatcacta atagaagtga tatcaatgat 300
acagggttct tcatgaatct ggaggaagac atgaccaggt atgcctatta ttacagtgga 360
attggtgctg gggtgctggt tgctgcttac attcaggttt cattttggtg cctggcagct 420
ggaagacaaa tacacaaaat tagaaaacag ttttttcatg ctataatgcg acaggagata 480
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aagattaatg aaggaattgg tgacaaaatt ggaatgttct ttcagtcaat ggcaacattt 600
ttcactgggt ttatagtagg atttacacgt ggttggaagc taacccttgt gattttggcc 660
atcagtcctg ttcttggact gtcagctgct gtctgggcaa agatactatc ttcatttact 720
gataaagaac tcttagcgta tgcaaaagct ggagcagtag ctgaagaggt cttggcagca 780
attagaactg tgattgcatt tggaggacaa aagaaagaac ttgaaaggta caacaaaaat 840
ttagaagaag ctaaaagaat tgggataaag aaagctatta cagccaatat ttctataggt 900
gctgctttcc tgctgatcta tgcatcttat gctctggcct tctggtatgg gaccaccttg 960
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gcttatgaaa tcttcaagat aattgataat aagccaagta ttgacagcta ttcgaagagt 1140
gggcacaaac cagataatat taagggaaat ttggaattca gaaatgttca cttcagttac 1200
ccatctcgaa aagaagttaa gatcttgaag ggtctgaacc tgaaggtgca gagtgggcag 1260
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aatgtaaggt ttctacggga aatcattggt gtggtgagtc aggaacctgt attgtttgcc 1440
accacgatag ctgaaaacat tcgctatggc cgtgaaaatg tcaccatgga tgagattgag 1500
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accctggttg gagagagagg ggcccagttg agtggtgggc agaagcagag gatcgccatt 1620
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gacacagaaa gcgaagcagt ggttcaggtg gctctggata aggccagaaa aggtcggacc 1740
accattgtga tagctcatcg tttgtctaca gttcgtaatg ctgacgtcat cgctggtttc 1800
gatgatggag tcattgtgga gaaaggaaat catgatgaac tcatgaaaga gaaaggcatt 1860
tacttcaaac ttgtcacaat gcagacagca ggaaatgaag ttgaattaga aaatgcagct 1920
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ctaataagaa aaagatcaac tcgtaggagt gtccgtggat cacaagccca agacagaaag 2040
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aatcttggga caggaataat tatatccttc atctatggtt ggcaactaac actgttactc 2580
ttagcaattg tacccatcat tgcaatagca ggagttgttg aaatgaaaat gttgtctgga 2640
caagcactga aagataagaa agaactagaa ggtgctggga agatcgctac tgaagcaata 2700
gaaaacttcc gaaccgttgt ttctttgact caggagcaga agtttgaaca tatgtatgct 2760
cagagtttgc aggtaccata cagaaactct ttgaggaaag cacacatctt tggaattaca 2820
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gcacagaaag gcatctattt ttcaatggtc agtgtccagg ctggaacaaa gcgccagtga 3840
<210>31
<211>1318
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<300>
<302>UPAR(尿激酶型纤溶酶原激活剂受体)
<310>XM009232
<400>31
atgggtcacc cgccgctgct gccgctgctg ctgctgctcc acacctgcgt cccagcctct 60
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cagtaccgca gtggggctgc tcctcagcct ggccctgccc atctcagcct caccatcacc 960
ctgctaatga ctgccagact gtggggaggc actctcctct ggacctaaac ctgaaatccc 1020
cctctctgcc ctggctggat ccgggggacc cctttgccct tccctcggct cccagcccta 1080
cagacttgct gtgtgacctc aggccagtgt gccgacctct ctgggcctca gttttcccag 1140
ctatgaaaac agctatctca caaagttgtg tgaagcagaa gagaaaagct ggaggaaggc 1200
cgtgggccaa tgggagagct cttgttatta ttaatattgt tgccgctgtt gtgttgttgt 1260
tattaattaa tattcatatt atttatttta tacttacata aagattttgt accagtgg   1318
<210>32
<211>636
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<300>
<302>Bak
<310>U16811
<400>32
atggcttcgg ggcaaggccc aggtcctccc aggcaggagt gcggagagcc tgccctgccc 60
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<210>33
<211>579
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<300>
<302>Bax alpha
<310>L22473
<400>33
atggacgggt ccggggagca gcccagaggc ggggggccca ccagctctga gcagatcatg 60
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gagtgtctca agcgcatcgg ggacgaactg gacagtaaca tggagctgca gaggatgatt 240
gccgccgtgg acacagactc cccccgagag gtctttttcc gagtggcagc tgacatgttt 300
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gtgctcaagg ccctgtgcac caaggtgccg gaactgatca gaaccatcat gggctggaca 420
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ctcaccgcct cgctcaccat ctggaagaag atgggctga                        579
<210>34
<211>657
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<300>
<302>Bax beta
<310>L22474
<400>34
atggacgggt ccggggagca gcccagaggc ggggggccca ccagctctga gcagatcatg 60
aagacagggg cccttttgct tcagggtttc atccaggatc gagcagggcg aatggggggg 120
gaggcacccg agctggccct ggacccggtg cctcaggatg cgtccaccaa gaagctgagc 180
gagtgtctca agcgcatcgg ggacgaactg gacagtaaca tggagctgca gaggatgatt 240
gccgccgtgg acacagactc cccccgagag gtctttttcc gagtggcagc tgacatgttt 300
tctgacggca acttcaactg gggccgggtt gtcgcccttt tctactttgc cagcaaactg 360
gtgctcaagg ccctgtgcac caaggtgccg gaactgatca gaaccatcat gggctggaca 420
ttggacttcc tccgggagcg gctgttgggc tggatccaag accagggtgg ttgggtgaga 480
ctcctcaagc ctcctcaccc ccaccaccgc gccctcacca ccgcccctgc cccaccgtcc 540
ctgccccccg ccactcctct gggaccctgg gccttctgga gcaggtcaca gtggtgccct 600
ctccccatct tcagatcatc agatgtggtc tataatgcgt tttccttacg tgtctga    657
<210>35
<211>432
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<300>
<302>Bax delta
<310>U19599
<400>35
atggacgggt ccggggagca gcccagaggc ggggggccca ccagctctga gcagatcatg 60
aagacagggg cccttttgct tcaggggatg attgccgccg tggacacaga ctccccccga 120
gaggtctttt tccgagtggc agctgacatg ttttctgacg gcaacttcaa ctggggccgg 180
gttgtcgccc ttttctactt tgccagcaaa ctggtgctca aggccctgtg caccaaggtg 240
ccggaactga tcagaaccat catgggctgg acattggact tcctccggga gcggctgttg 300
ggctggatcc aagaccaggg tggttgggac ggcctcctct cctactttgg gacgcccacg 360
tggcagaccg tgaccatctt tgtggcggga gtgctcaccg cctcgctcac catctggaag 420
aagatgggct ga                                                     432
<210>36
<211>495
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<300>
<302>Bax epsolin
<310>AF007826
<400>36
atggacgggt ccggggagca gcccagaggc ggggggccca ccagctctga gcagatcatg 60
aagacagggg cccttttgct tcagggtttc atccaggatc gagcagggcg aatggggggg 120
gaggcacccg agctggccct ggacccggtg cctcaggatg cgtccaccaa gaagctgagc 180
gagtgtctca agcgcatcgg ggacgaactg gacagtaaca tggagctgca gaggatgatt 240
gccgccgtgg acacagactc cccccgagag gtctttttcc gagtggcagc tgacatgttt 300
tctgacggca acttcaactg gggccgggtt gtcgcccttt tctactttgc cagcaaactg 360
gtgctcaagg ctggcgtgaa atggcgtgat ctgggctcac tgcaacctct gcctcctggg 420
ttcaagcgat tcacctgcct cagcatccca aggagctggg attacaggcc ctgtgcacca 480
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<300>
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<212>DNA
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<300>
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<300>
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<302>TGFbeta2
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<302>TGFbeta3
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<400>48
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gaagccatta ggggacagat cttgagcaag ctcaggctca ccagcccccc tgagccaacg 180
gtgatgaccc acgtccccta tcaggtcctg gccctttaca acagcacccg ggagctgctg 240
gaggagatgc atggggagag ggaggaaggc tgcacccagg aaaacaccga gtcggaatac 300
tatgccaaag aaatccataa attcgacatg atccaggggc tggcggagca caacgaactg 360
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accaggatgg cccgagaccc accacggtat ctggtcataa agagagagag tgggcctgga 1740
atagcccctg ggccagagcc ccatggtctg acaaacaaga agctagagga agtagagctg 1800
gagccagaac tagacctaga cctagacttg gaagcagagg aggacaacct ggcaaccacc 1860
acactgggct ccgccctcag cctaccagtt ggaacactta atcggccacg tgggagccag 1920
agccttttaa gtccatcatc tggatacatg cccatgaacc agggtaatct tggggttctt 1980
ccttag                                                            1986
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atgatgtacc tggaagaaag acgactcgtt catcgggatt tggcagcccg taatgtctta 60
gtgaaatctc caaaccatgt gaaaatcaca gattttgggc tagccagact cttggaagga 120
gatgaaaaag agtacaatgc tgatggagga aagatgccaa ttaaatggat ggctctggag 180
tgtatacatt acaggaaatt cacccatcag agtgacgttt ggagctatgg agttactata 240
tgggaactga tgacctttgg aggaaaaccc tatgatggaa ttccaacgcg agaaatccct 300
gatttattag agaaaggaga acgtttgcct cagcctccca tctgcactat tgacgtttac 360
atggtcatgg tcaaatgttg gatgattgat gctgacagta gacctaaatt taaggaactg 420
gctgctgagt tttcaaggat ggctcgagac cctcaaagat acctagttat tcagggtgat 480
gatcgtatga agcttcccag tccaaatgac agcaagttct ttcagaatct cttggatgaa 540
gaggatttgg aagatatgat ggatgctgag gagtacttgg tccctcaggc tttcaacatc 600
ccacctccca tctatacttc cagagcaaga attgactcga ataggagtga aattggacac 660
agccctcctc ctgcctacac ccccatgtca ggaaaccagt ttgtataccg agatggaggt 720
tttgctgctg aacaaggagt gtctgtgccc tacagagccc caactagcac aattccagaa 780
gctcctgtgg cacagggtgc tactgctgag atttttgatg actcctgctg taatggcacc 840
ctacgcaagc cagtggcacc ccatgtccaa gaggacagta gcacccagag gtacagtgct 900
gaccccaccg tgtttgcccc agaacggagc ccacgaggag agctggatga ggaaggttac 960
atgactccta tgcgagacaa acccaaacaa gaatacctga atccagtgga ggagaaccct 1020
tttgtttctc ggagaaaaaa tggagacctt caagcattgg ataatcccga atatcacaat 1080
gcatccaatg gtccacccaa ggccgaggat gagtatgtga atgagccact gtacctcaac 1140
acctttgcca acaccttggg aaaagctgag tacctgaaga acaacatact gtcaatgcca 1200
gagaaggcca agaaagcgtt tgacaaccct gactactgga accacagcct gccacctcgg 1260
agcacccttc agcacccaga ctacctgcag gagtacagca caaaatattt ttataaacag 1320
aatgggcgga tccggcctat tgtggcagag aatcctgaat acctctctga gttctccctg 1380
aagccaggca ctgtgctgcc gcctccacct tacagacacc ggaatactgt ggtgtaa    1437
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atgtggaaat ggatactgac acattgtgcc tcagcctttc cccacctgcc cggctgctgc 60
tgctgctgct ttttgttgct gttcttggtg tcttccgtcc ctgtcacctg ccaagccctt 120
ggtcaggaca tggtgtcacc agaggccacc aactcttctt cctcctcctt ctcctctcct 180
tccagcgcgg gaaggcatgt gcggagctac aatcaccttc aaggagatgt ccgctggaga 240
aagctattct ctttcaccaa gtactttctc aagattgaga agaacgggaa ggtcagcggg 300
accaagaagg agaactgccc gtacagcatc ctggagataa catcagtaga aatcggagtt 360
gttgccgtca aagccattaa cagcaactat tacttagcca tgaacaagaa ggggaaactc 420
tatggctcaa aagaatttaa caatgactgt aagctgaagg agaggataga ggaaaatgga 480
tacaatacct atgcatcatt taactggcag cataatggga ggcaaatgta tgtggcattg 540
aatggaaaag gagctccaag gagaggacag aaaacacgaa ggaaaaacac ctctgctcac 600
tttcttccaa tggtggtaca ctcatag                                     627
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tttctacctc caggcgaatc ccgacggaag catccagggc accccagagg ataccagctc 300
cttcacccac ttcaacctga tccctgtggg cctccgtgtg gtcaccatcc agagcgccaa 360
gctgggtcac tacatggcca tgaatgctga gggactgctc tacagttcgc cgcatttcac 420
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tctctaccgc cagcgtcgtt ctggccgggc ctggtacctc ggcctggaca aggagggcca 540
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cctggaggtg gccatgtacc aggagccttc tctccacagt gtccccgagg cctccccttc 660
cagt ccccct gccccctga                                             679
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atggctgcgg cgatagccag ctccttgatc cggcagaagc ggcaggcgag ggagtccaac 60
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ccggtgaggc ggagaccaga accccagctc aaagggattg tgacaaggtt attcagccag 240
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gtgaaggcta gcctctatgt ggccatgaat ggtgaaggct atctctacag ttcagatgtt 420
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gattcaacat ag                                                     732
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atggcagagg tggggggcgt cttcgcctcc ttggactggg atctacacgg cttctcctcg 60
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atgggagccg cccgcctgct gcccaacctc actctgtgct tacagctgct gattctctgc 60
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atgcggagcg ggtgtgtggt ggtccacgta tggatcctgg ccggcctctg gctggccgtg 60
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<213>人(Homo sapiens)
<400>63
atggctgaag gggaaatcac caccttcaca gccctgaccg agaagtttaa tctgcctcca 60
gggaattaca agaagcccaa actcctctac tgtagcaacg ggggccactt cctgaggatc 120
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ctggaaaggc tggaggagaa ccattacaac acctatatat ccaagaagca tgcagagaag 360
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ggccagaaag caatcttgtt tctccccctg ccagtctctt ctgattaa              468
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atggctccct tagccgaagt cgggggcttt ctgggcggcc tggagggctt gggccagcag 60
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cacggcatcc tgcgccgccg gcagctctat tgccgcaccg gcttccacct gcagatcctg 240
cccgacggca gcgtgcaggg cacccggcag gaccacagcc tcttcggtat cttggaattc 300
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gagcagtttg aagagaactg gtataacacc tattcatcta acatatataa acatggagac 480
actggccgca ggtattttgt ggcacttaac aaagacggaa ctccaagaga tggcgccagg 540
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gcagcgcagc ccaaggaggc ggccgtccag agcggcgccg gcgactacct gctgggcatc 240
aagcggctgc ggcggctcta ctgcaacgtg ggcatcggct tccacctcca ggcgctcccc 300
gacggccgca tcggcggcgc gcacgcggac acccgcgaca gcctgctgga gctctcgccc 360
gtggagcggg gcgtggtgag catcttcggc gtggccagcc ggttcttcgt ggccatgagc 420
agcaagggca agctctatgg ctcgcccttc ttcaccgatg agtgcacgtt caaggagatt 480
ctccttccca acaactacaa cgcctacgag tcctacaagt accccggcat gttcatcgcc 540
ctgagcaaga atgggaagac caagaagggg aaccgagtgt cgcccaccat gaaggtcacc 600
cacttcctcc ccaggctgtg a                                           621
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atgtcccggg gagcaggacg tctgcagggc acgctgtggg ctctcgtctt cctaggcatc 60
ctagtgggca tggtggtgcc ctcgcctgca ggcacccgtg ccaacaacac gctgctggac 120
tcgaggggct ggggcaccct gctgtccagg tctcgcgcgg ggctagctgg agagattgcc 180
ggggtgaact gggaaagtgg ctatttggtg gggatcaagc ggcagcggag gctctactgc 240
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tttggagtga gaagtgccct cttcgttgcc atgaacagta aaggaagatt gtacgcaacg 420
cccagcttcc aagaagaatg caagttcaga gaaaccctcc tgcccaacaa ttacaatgcc 480
tacgagtcag acttgtacca agggacctac attgccctga gcaaatacgg acgggtaaag 540
cggggcagca aggtgtcccc gatcatgact gtcactcatt tccttcccag gatctaa    597
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<300>
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gaggtctgct catgcacctc tggggcatcc tctcccccgg gggccccagg cccactggtg 1740
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<300>
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<212>DNA
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<300>
<302>MTMMP
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<300>
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<300>
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cctggttacc ctcatgactt gataaccctt ggaagtggaa ttccccctca tggtattgat 1320
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gaaagagatg aagaagccgt taaaacaatc agtccatcaa caagcaataa tattccgcta 1200
atgagggttg tacaatccat caagcacaca aagaggaaga gcagcacaat ggtgaaggaa 1260
gggtggatgg tccattacac cagcagggat aacctgagaa agaggcatta ttggagactt 1320
gacagcaaat gtctaacatt atttcagaat gaatctggat caaagtatta taaggaaatt 1380
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gtgcttggtt caggccagtt tggcatcgtt tatggaggaa aacatagaaa gactgggagg 1800
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acacagatac ttgttgcttt gaggaatctg cattttaaga atattgtgca ctgtgattta 2100
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cctaatccag atgatatgga agaagatcct taa                              2673
<210>119
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<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<300>
<302>PKC tau
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atgtcgccat ttcttcggat tggcttgtcc aactttgact gcgggtcctg ccagtcttgt 60
cagggcgagg ctgttaaccc ttactgtgct gtgctcgtca aagagtatgt cgaatcagag 120
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gatgcccata tcaacaaggg aagagtcatg cagatcattg tgaaaggcaa aaacgtggac 240
ctcatctctg aaaccaccgt ggagctctac tcgctggctg agaggtgcag gaagaacaac 300
gggaagacag aaatatggtt agagctgaaa cctcaaggcc gaatgctaat gaatgcaaga 360
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ctcaacggag gggacttaat gtaccacatc caaagctgcc acaagttcga cctttccaga 1440
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<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<300>
<302>PKC zeta
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<302>VEGF
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<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<300>
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<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<300>
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gttcattcca ttattagacg ttccctgcca gcaacactac cacagtgtca ggcagcgaac 720
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<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<300>
<302>VEGF D
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atattcaaaa tgtacagaga gtgggtagtg gtgaatgttt tcatgatgtt gtacgtccag 60
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cactctgagg actggaagct gtggagatgc aggctgaggc tcaaaagttt taccagtatg 240
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<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<300>
<302>E2F
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atggccttgg ccggggcccc tgcgggcggc ccatgcgcgc cggcgctgga ggccctgctc 60
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gagctgctga gccactcggc tgacggtgtc gtcgacctga actgggctgc cgaggtgctg 480
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<212>DNA
<213>丙肝病毒
<300>
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ggacagccgt tgccctagtg gtttcggaca caccgccaac gctcagtgcg gtgctaccga 60
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<213>丙肝病毒
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atggaccggg agatggcagc atcgtgcgga ggcgcggttt tcgtaggtct gatactcttg 60
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atcaccaggg ccgaggcaca cttgcaagtg tggatccccc ccctcaacgt tcgggggggc 180
cgcgatgccg tcatcctcct cacgtgcgcg atccacccag agctaatctt taccatcacc 240
aaaatcttgc tcgccatact cggtccactc atggtgctcc aggctggtat aaccaaagtg 300
ccgtacttcg tgcgcgcaca cgggctcatt cgtgcatgca tgctggtgcg gaaggttgct 360
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<300>
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<310>AJ238799
<400>129
gcacctgggt gctggtaggc ggagtcctag cagctctggc cgcgtattgc ctgacaacag 60
gcagcgtggt cattgtgggc aggatcatct tgtccggaaa gccggccatc attcccgaca 120
gggaagtcct ttaccgggag ttcgatgaga tggaagagtg c                     161
<210>130
<211>783
<212>DNA
<213>丙肝病毒
<300>
<302>NS4B
<310>AJ238799
<400>130
gcctcacacc tcccttacat cgaacaggga atgcagctcg ccgaacaatt caaacagaag 60
gcaatcgggt tgctgcaaac agccaccaag caagcggagg ctgctgctcc cgtggtggaa 120
tccaagtggc ggaccctcga agccttctgg gcgaagcata tgtggaattt catcagcggg 180
atacaatatt tagcaggctt gtccactctg cctggcaacc ccgcgatagc atcactgatg 240
gcattcacag cctctatcac cagcccgctc accacccaac ataccctcct gtttaacatc 300
ctggggggat gggtggccgc ccaacttgct cctcccagcg ctgcttctgc tttcgtaggc 360
gccggcatcg ctggagcggc tgttggcagc ataggccttg ggaaggtgct tgtggatatt 420
ttggcaggtt atggagcagg ggtggcaggc gcgctcgtgg cctttaaggt catgagcggc 480
gagatgccct ccaccgagga cctggttaac ctactccctg ctatcctctc ccctggcgcc 540
ctagtcgtcg gggtcgtgtg cgcagcgata ctgcgtcggc acgtgggccc aggggagggg 600
gctgtgcagt ggatgaaccg gctgatagcg ttcgcttcgc ggggtaacca cgtctccccc 660
acgcactatg tgcctgagag cgacgctgca gcacgtgtca ctcagatcct ctctagtctt 720
accatcactc agctgctgaa gaggcttcac cagtggatca acgaggactg ctccacgcca 780
tgc                                                               783
<210>131
<211>1341
<212>DNA
<213>丙肝病毒
<300>
<302>NS5A
<310>AJ238799
<400>131
tccggctcgt ggctaagaga tgtttgggat tggatatgca cggtgttgac tgatttcaag 60
acctggctcc agtccaagct cctgccgcga ttgccgggag tccccttctt ctcatgtcaa 120
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gcacagatca ccggacatgt gaaaaacggt tccatgagga tcgtggggcc taggacctgt 240
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ccgtgtcagg ttccggcccc cgaattcttc acagaagtgg atggggtgcg gttgcacagg 480
tacgctccag cgtgcaaacc cctcctacgg gaggaggtca cattcctggt cgggctcaat 540
caatacctgg ttgggtcaca gctcccatgc gagcccgaac cggacgtagc agtgctcact 600
tccatgctca ccgacccctc ccacattacg gcggagacgg ctaagcgtag gctggccagg 660
ggatctcccc cctccttggc cagctcatca gctagccagc tgtctgcgcc ttccttgaag 720
gcaacatgca ctacccgtca tgactccccg gacgctgacc tcatcgaggc caacctcctg 780
tggcggcagg agatgggcgg gaacatcacc cgcgtggagt cagaaaataa ggtagtaatt 840
ttggactctt tcgagccgct ccaagcggag gaggatgaga gggaagtatc cgttccggcg 900
gagatcctgc ggaggtccag gaaattccct cgagcgatgc ccatatgggc acgcccggat 960
tacaaccctc cactgttaga gtcctggaag gacccggact acgtccctcc agtggtacac 1020
gggtgtccat tgccgcctgc caaggcccct ccgataccac ctccacggag gaagaggacg 1080
gttgtcctgt cagaatctac cgtgtcttct gccttggcgg agctcgccac aaagaccttc 1140
ggcagctccg aatcgtcggc cgtcgacagc ggcacggcaa cggcctctcc tgaccagccc 1200
tccgacgacg gcgacgcggg atccgacgtt gagtcgtact cctccatgcc cccccttgag 1260
ggggagccgg gggatcccga tctcagcgac gggtcttggt ctaccgtaag cgaggaggct 1320
agtgaggacg tcgtctgctg c                                           1341
<210>132
<211>1772
<212>DNA
<213>丙肝病毒
<300>
<302>NS5B
<310>AJ238799
<400>132
tcgatgtcct acacatggac aggcgccctg atcacgccat gcgctgcgga ggaaaccaag 60
ctgcccatca atgcactgag caactctttg ctccgtcacc acaacttggt ctatgctaca 120
acatctcgca gcgcaagcct gcggcagaag aaggtcacct ttgacagact gcaggtcctg 180
gacgaccact accgggacgt gctcaaggag atgaaggcga aggcgtccac agttaaggct 240
aaacttctat ccgtggagga agcctgtaag ctgacgcccc cacattcggc cagatctaaa 300
tttggctatg gggcaaagga cgtccggaac ctatccagca aggccgttaa ccacatccgc 360
tccgtgtgga aggacttgct ggaagacact gagacaccaa ttgacaccac catcatggca 420
aaaaatgagg ttttctgcgt ccaaccagag aaggggggcc gcaagccagc tcgccttatc 480
gtattcccag atttgggggt tcgtgtgtgc gagaaaatgg ccctttacga tgtggtctcc 540
accctccctc aggccgtgat gggctcttca tacggattcc aatactctcc tggacagcgg 600
gtcgagttcc tggtgaatgc ctggaaagcg aagaaatgcc ctatgggctt cgcatatgac 660
acccgctgtt ttgactcaac ggtcactgag aatgacatcc gtgttgagga gtcaatctac 720
caatgttgtg acttggcccc cgaagccaga caggccataa ggtcgctcac agagcggctt 780
tacatcgggg gccccctgac taattctaaa gggcagaact gcggctatcg ccggtgccgc 840
gcgagcggtg tactgacgac cagctgcggt aataccctca catgttactt gaaggccgct 900
gcggcctgtc gagctgcgaa gctccaggac tgcacgatgc tcgtatgcgg agacgacctt 960
gtcgttatct gtgaaagcgc ggggacccaa gaggacgagg cgagcctacg ggccttcacg 1020
gaggctatga ctagatactc tgccccccct ggggacccgc ccaaaccaga atacgacttg 1080
gagttgataa catcatgctc ctccaatgtg tcagtcgcgc acgatgcatc tggcaaaagg 1140
gtgtactatc tcacccgtga ccccaccacc ccccttgcgc gggctgcgtg ggagacagct 1200
agacacactc cagtcaattc ctggctaggc aacatcatca tgtatgcgcc caccttgtgg 1260
gcaaggatga tcctgatgac tcatttcttc tccatccttc tagctcagga acaacttgaa 1320
aaagccctag attgtcagat ctacggggcc tgttactcca ttgagccact tgacctacct 1380
cagatcattc aacgactcca tggccttagc gcattttcac tccatagtta ctctccaggt 1440
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gtaggggtag gcatctatct actccccaac cg                               1772
<210>133
<211>1892
<212>DNA
<213>丙肝病毒
<300>
<302>NS3
<310>AJ238799
<400>133
cgcctattac ggcctactcc caacagacgc gaggcctact tggctgcatc atcactagcc 60
tcacaggccg ggacaggaac caggtcgagg gggaggtcca agtggtctcc accgcaacac 120
aatctttcct ggcgacctgc gtcaatggcg tgtgttggac tgtctatcat ggtgccggct 180
caaagaccct tgccggccca aagggcccaa tcacccaaat gtacaccaat gtggaccagg 240
acctcgtcgg ctggcaagcg ccccccgggg cgcgttcctt gacaccatgc acctgcggca 300
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gtccactgct ctgcccctcg gggcacgctg tgggcatctt tcgggctgcc gtgtgcaccc 480
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aagggtataa ggtgcttgtc ctgaacccgt ccgtcgccgc caccctaggt ttcggggcgt 720
atatgtctaa ggcacatggt atcgacccta acatcagaac cggggtaagg accatcacca 780
cgggtgcccc catcacgtac tccacctatg gcaagtttct tgccgacggt ggttgctctg 840
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ccaccgctac gcctccggga tcggtcaccg tgccacatcc aaacatcgag gaggtggctc 1020
tgtccagcac tggagaaatc cccttttatg gcaaagccat ccccatcgag accatcaagg 1080
gggggaggca cctcattttc tgccattcca agaagaaatg tgatgagctc gccgcgaagc 1140
tgtccggcct cggactcaat gctgtagcat attaccgggg ccttgatgta tccgtcatac 1200
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atttcgactc agtgatcgac tgcaatacat gtgtcaccca gacagtcgac ttcagcctgg 1320
acccgacctt caccattgag acgacgaccg tgccacaaga cgcggtgtca cgctcgcagc 1380
ggcgaggcag gactggtagg ggcaggatgg gcatttacag gtttgtgact ccaggagaac 1440
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ggtacgagct cacgcccgcc gagacctcag ttaggttgcg ggcttaccta aacacaccag 1560
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catgcatgtc ggctgacctg gaggtcgtca cg                               1892
<210>134
<211>822
<212>DNA
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<300>
<302>stmn细胞因子
<310>M59964
<400>134
atgaagaaga cacaaacttg gattctcact tgcatttatc ttcagctgct cctatttaat 60
cctctcgtca aaactgaagg gatctgcagg aatcgtgtga ctaataatgt aaaagacgtc 120
actaaattgg tggcaaatct tccaaaagac tacatgataa ccctcaaata tgtccccggg 180
atggatgttt tgccaagtca ttgttggata agcgagatgg tagtacaatt gtcagacagc 240
ttgactgatc ttctggacaa gttttcaaat atttctgaag gcttgagtaa ttattccatc 300
atagacaaac ttgtgaatat agtcgatgac cttgtggagt gcgtcaaaga aaactcatct 360
aaggatctaa aaaaatcatt caagagccca gaacccaggc tctttactcc tgaagaattc 420
tttagaattt ttaatagatc cattgatgcc ttcaaggact ttgtagtggc atctgaaact 480
agtgattgtg tggtttcttc aacattaagt cctgagaaag attccagagt cagtgtcaca 540
aaaccattta tgttaccccc tgttgcagcc agctccctta ggaatgacag cagtagcagt 600
aataggaagg ccaaaaatcc ccctggagac tccagcctac actgggcagc catggcattg 660
ccagcattgt tttctcttat aattggcttt gcttttggag ccttatactg gaagaagaga 720
cagccaagtc ttacaagggc agttgaaaat atacaaatta atgaagagga taatgagata 780
agtatgttgc aagagaaaga gagagagttt caagaagtgt aa                    822
<210>135
<211>483
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<300>
<302>TGFalpha
<310>AF123238
<400>135
atggtcccct cggctggaca gctcgccctg ttcgctctgg gtattgtgtt ggctgcgtgc 60
caggccttgg agaacagcac gtccccgctg agtgcagacc cgcccgtggc tgcagcagtg 120
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cgctgtgagc atgcggacct cctggccgtg gtggctgcca gccagaagaa gcaggccatc 300
accgccttgg tggtggtctc catcgtggcc ctggctgtcc ttatcatcac atgtgtgctg 360
atacactgct gccaggtccg aaaacactgt gagtggtgcc gggccctcat ctgccggcac 420
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tga                                                               483
<210>136
<211>1071
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<300>
<302>GD3合酶
<310>NM003034
<400>136
atgagcccct gcgggcgggc ccggcgacaa acgtccagag gggccatggc tgtactggcg 60
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gtgctgcaac agggcacggc gtggaggagg aaccagaccg cggccagagc gttcaggaaa 240
caaatggaag actgctgcga ccctgcccat ctctttgcta tgactaaaat gaattcccct 300
atggggaaga gcatgtggta tgacggggag tttttatact cattcaccat tgacaattca 360
acttactctc tcttcccaca ggcaacccca ttccagctgc cattgaagaa atgcgcggtg 420
gtgggaaatg gtgggattct gaagaagagt ggctgtggcc gtcaaataga tgaagcaaat 480
tttgtcatgc gatgcaatct ccctcctttg tcaagtgaat acactaagga tgttggatcc 540
aaaagtcagt tagtgacagc taatcccagc ataattcggc aaaggtttca gaaccttctg 600
tggtccagaa agacatttgt ggacaacatg aaaatctata accacagtta catctacatg 660
cctgcctttt ctatgaagac aggaacagag ccatctttga gggtttatta tacactgtca 720
gatgttggtg ccaatcaaac agtgctgttt gccaacccca actttctgcg tagcattgga 780
aagttctgga aaagtagagg aatccatgcc aagcgcctgt ccacaggact ttttctggtg 840
agcgcagctc tgggtctctg tgaagaggtg gccatctatg gcttctggcc cttctctgtg 900
aatatgcatg agcagcccat cagccaccac tactatgaca acgtcttacc cttttctggc 960
ttccatgcca tgcccgagga atttctccaa ctctggtatc ttcataaaat cggtgcactg 1020
agaatgcagc tggacccatg tgaagatacc tcactccagc ccacttccta g          1071
<210>137
<211>744
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<300>
<302>FGF14
<310>NM004115
<400>137
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ttgcggcgcc aagatcccca gctcaagggt atagtgacca ggttatattg caggcaaggc 240
tactacttgc aaatgcaccc cgatggagct ctcgatggaa ccaaggatga cagcactaat 300
tctacactct tcaacctcat accagtggga ctacgtgttg ttgccatcca gggagtgaaa 360
acagggttgt atatagccat gaatggagaa ggttacctct acccatcaga actttttacc 420
cctgaatgca agtttaaaga atctgttttt gaaaattatt atgtaatcta ctcatccatg 480
ttgtacagac aacaggaatc tggtagagcc tggtttttgg gattaaataa ggaagggcaa 540
gctatgaaag ggaacagagt aaagaaaacc aaaccagcag ctcattttct acccaagcca 600
ttggaagttg ccatgtaccg agaaccatct ttgcatgatg ttggggaaac ggtcccgaag 660
cctggggtga cgccaagtaa aagcacaagt gcgtctgcaa taatgaatgg aggcaaacca 720
gtcaacaaga gtaagacaac atag                                        744
<210>138
<211>1503
<212>DNA
<213>人免疫缺陷病毒
<300>
<302>gag(HIV)
<310>NC001802
<400>138
atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgatggga aaaaattcgg 60
ttaaggccag ggggaaagaa aaaatataaa ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag 120
ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg ttagaaacat cagaaggctg tagacaaata 180
ctgggacagc tacaaccatc ccttcagaca ggatcagaag aacttagatc attatataat 240
acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa aggatagaga taaaagacac caaggaagct 300
ttagacaaga tagaggaaga gcaaaacaaa agtaagaaaa aagcacagca agcagcagct 360
gacacaggac acagcaatca ggtcagccaa aattacccta tagtgcagaa catccagggg 420
caaatggtac atcaggccat atcacctaga actttaaatg catgggtaaa agtagtagaa 480
gagaaggctt tcagcccaga agtgataccc atgttttcag cattatcaga aggagccacc 540
ccacaagatt taaacaccat gctaaacaca gtggggggac atcaagcagc catgcaaatg 600
ttaaaagaga ccatcaatga ggaagctgca gaatgggata gagtgcatcc agtgcatgca 660
gggcctattg caccaggcca gatgagagaa ccaaggggaa gtgacatagc aggaactact 720
agtacccttc aggaacaaat aggatggatg acaaataatc cacctatccc agtaggagaa 780
atttataaaa gatggataat cctgggatta aataaaatag taagaatgta tagccctacc 840
agcattctgg acataagaca aggaccaaag gaacccttta gagactatgt agaccggttc 900
tataaaactc taagagccga gcaagcttca caggaggtaa aaaattggat gacagaaacc 960
ttgttggtcc aaaatgcgaa cccagattgt aagactattt taaaagcatt gggaccagcg 1020
gctacactag aagaaatgat gacagcatgt cagggagtag gaggacccgg ccataaggca 1080
agagttttgg ctgaagcaat gagccaagta acaaattcag ctaccataat gatgcagaga 1140
ggcaatttta ggaaccaaag aaagattgtt aagtgtttca attgtggcaa agaagggcac 1200
acagccagaa attgcagggc ccctaggaaa aagggctgtt ggaaatgtgg aaaggaagga 1260
caccaaatga aagattgtac tgagagacag gctaattttt tagggaagat ctggccttcc 1320
tacaagggaa ggccagggaa ttttcttcag agcagaccag agccaacagc cccaccagaa 1380
gagagcttca ggtctggggt agagacaaca actccccctc agaagcagga gccgatagac 1440
aaggaactgt atcctttaac ttccctcagg tcactctttg gcaacgaccc ctcgtcacaa 1500
taa                                                               1503
<210>139
<211>1101
<212>DNA
<213>人免疫缺陷病毒
<300>
<302>TARBP2
<310>NM004178
<400>139
atgagtgaag aggagcaagg ctccggcact accacgggct gcgggctgcc tagtatagag 60
caaatgctgg ccgccaaccc aggcaagacc ccgatcagcc ttctgcagga gtatgggacc 120
agaataggga agacgcctgt gtacgacctt ctcaaagccg agggccaagc ccaccagcct 180
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aaggcagcca agcacaaggc agctgaggtg gccctcaaac acctcaaagg ggggagcatg 300
ctggagccgg ccctggagga cagcagttct ttttctcccc tagactcttc actgcctgag 360
gacattccgg tttttactgc tgcagcagct gctaccccag ttccatctgt agtcctaacc 420
aggagccccc ccatggaact gcagccccct gtctcccctc agcagtctga gtgcaacccc 480
gttggtgctc tgcaggagct ggtggtgcag aaaggctggc ggttgccgga gtacacagtg 540
acccaggagt ctgggccagc ccaccgcaaa gaattcacca tgacctgtcg agtggagcgt 600
ttcattgaga ttgggagtgg cacttccaaa aaattggcaa agcggaatgc ggcggccaaa 660
atgctgcttc gagtgcacac ggtgcctctg gatgcccggg atggcaatga ggtggagcct 720
gatgatgacc acttctccat tggtgtgggc ttccgcctgg atggtcttcg aaaccggggc 780
ccaggttgca cctgggattc tctacgaaat tcagtaggag agaagatcct gtccctccgc 840
agttgctccc tgggctccct gggtgccctg ggccctgcct gctgccgtgt cctcagtgag 900
ctctctgagg agcaggcctt tcacgtcagc tacctggata ttgaggagct gagcctgagt 960
ggactctgcc agtgcctggt ggaactgtcc acccagccgg ccactgtgtg tcatggctct 1020
gcaaccacca gggaggcagc ccgtggtgag gctgcccgcc gtgccctgca gtacctcaag 1080
atcatggcag gcagcaagtg a                                           1101
<210>140
<211>219
<212>DNA
<213>人免疫缺陷病毒
<300>
<302>TAT(HIV)
<310>U44023
<400>140
atggagccag tagatcctag cctagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaagact 60
gcttgtacca cttgctattg taaagagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcataaca 120
aaaggcttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag aactcctcaa 180
ggtcatcaga ctaatcaagt ttctctatca aagcagtaa                        219
<210>141
<211>22
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：与MDR1序列同源的dsRNA的有义链(R1A)
<400>141
 ccaucucgaa aagaaguuaa ga                                         22
<210>142
<211>24
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：dsRNA的反义链(R1B)，与MDR1序列互补
<400>142
ucuuaacuuc uuuucgagau gggu                                        24
<210>143
<211>22
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：与MDR1序列同源的dsRNA的有义链(R2A)
<400>143
uauagguucc aggcuugcug ua                                          22
<210>144
<211>22
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：与MDR1序列同源的dsRNA的有义链(R3A)
<400>144
ccagagaagg ccgcaccugc au                                             22
<210>145
<211>24
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：与MDR1序列互补的dsRNA的反义链(R3B)
<400>145
augcaggugc ggccuucucu ggcu                                           24
<210>146
<211>21
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：与MDR1序列同源的dsRNA的有义链(R4A)
<400>146
ccaucucgaa aagaaguuaa g                                              21
<210>147
<211>21
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：与MDR1序列互补的dsRNA的反义链(R4B)
<400>147
uaacuucuuu ucgagauggg u                                              21
<210>148
<211>22
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：分别与YFP-和GFP序列同源的dsRNA的有义链(S1A)
<400>148
ccacaugaag cagcacgacu uc                                             22
<210>149
<211>22
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：分别与YFP-和GFP序列互补的dsRNA的反义链(S1B)
<400>149
gaagucgugc ugcuucaugu gg                                             22
<210>150
<211>21
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：分别与YFP-和GFP序列同源的dsRNA的反义链(S7A)
<400>150
ccacaugaag cagcacgacu u                                              21
<210>151
<211>21
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：分别与YFP-和GFP序列互补的dsRNA的反义链(S7B)
<400>151
gucgugcugc uucauguggu c                                              21
<210>152
<211>24
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：与MDR-1序列互补的dsRNA的反义链(R2B)
<400>152
uacagcaagc cuggaaccua uagc                                           24
<210>153
<211>22
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：与新霉素序列的5`-UTR同源的dsRNA的有义链(K1A)
<400>153
 acaggaugag gaucguuucg ca                                            22
<210>154
<211>22
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：与新霉素序列的5`-UTR互补的dsRNA的反义链(K1B)
<400>154
 ugcgaaacga uccucauccu gu                                            22
<210>155
<211>21
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：与新霉素序列的5`-UTR同源的dsRNA的有义链(K3A)
<400>155
 gaugaggauc guuucgcaug a                                             21
<210>156
<211>21
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：与新霉素序列的5`-UTR互补的dsRNA的反义链(K3B)
<400>156
augcgaaacg auccucaucc u                                              21
<210>157
<211>24
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：与新霉素序列的5`-UTR同源的dsRNA的有义链(K2A)
<400>157
acaggaugag gaucguuucg caug                                           24
<210>158
<211>24
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：与新霉素序列的5`-UTR互补的dsRNA的反义链(K2B)
<400>158
ugcgaaacga uccucauccu gucu                                           24
<210>159
<211>24
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：分别与YFP-和GFP序列互补的dsRNA的反义链(S4B)
<400>159
gaagucgugc ugcuucaugu gguc                                           24
<210>160
<211>24
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：与蛋白质激酶C序列同源的dsRNA的有义链(PKC1 A)
<400>160
cuucuccgcc ucacaccgcu gcaa                                           24
<210>161
<211>22
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：与蛋白质激酶C序列互补的dsRNA的反义链(PKC2 B)
<400>161
 gcagcggugu gaggcggaga ag                                            22
<210>162
<211>21
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：分别与YFP-和GFP序列互补的dsRNA的反义链(S12B)
<400>162
aagucgugcu gcuucaugug g                                              21
<210>163
<211>23
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：分别与YFP-和GFP序列互补的dsRNA的反义链(S11B)
<400>163
aagucgugcu gcuucaugug guc                                            23
<210>164
<211>20
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：分别与YFP-和GFP序列同源的dsRNA的有义链(S13A)
<400>164
ccacaugaag cagcacgacu                                                20
<210>165
<211>22
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：分别与YFP-和GFP序列互补的dsRNA的反义链(S13B)
<400>165
agucgugcug cuucaugugg uc                                             22
<210>166
<211>20
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：分别与YFP-和GFP序列互补的dsRNA的反义链(S14B)
<400>166
agucgugcug cuucaugugg                                                20
<210>167
<211>24
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：分别与YFP-和GFP序列同源的dsRNA的有义链(S4A)
<400>167
ccacaugaag cagcacgacu ucuu                                           24
<210>168
<211>21
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：与人EGFR序列同源的dsRNA的有义链(ES-7A)
<400>168
aacaccgcag caugucaaga u                                              21
<210>169
<211>21
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：与人EGFR序列互补的dsRNA的反义链(ES-7B)
<400>169
cuugacaugc ugcgguguuu u                                              21
<210>170
<211>22
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：与人EGFR序列同源的dsRNA的有义链(ES-8A)
<400>170
aaguuaaaau ucccgucgcu au                                             22
<210>171
<211>22
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：与人EGFR序列互补的dsRNA的反义链(ES-8B)
<400>171
ugauagcgac gggaauuuua ac                                             22
<210>172
<211>22
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：与人EGFR序列同源的dsRNA的有义链(ES-2A)
<400>172
agugugaucc aagcuguccc aa                                             22
<210>173
<211>24
<212>RNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列说明：与人EGFR序列互补的dsRNA的反义链(ES-5B)
<400>173
uugggacagc uuggaucaca cuuu

Claims (240)

1.抑制靶基因在细胞中表达的方法，包括下面的步骤：
以足以抑制靶基因表达的量导入至少一种双链核糖核酸(dsRNAI)，
其中dsRNA I具有最多由49个连续核苷酸对组成的双链结构，而且其中所述双链结构的一条链(as1)或者所述一条链(as1)的至少一个片段与靶基因互补，
并且其中dsRNA I的至少一个末端(E1，E2)具有一个由1-4个核苷酸组成的突出端。
2.根据权利要求1的方法，其中dsRNA I在一条链(as1)的3′-端和/或另一条链(ss1)的3′-端有突出端。
3.根据权利要求1或2的方法，其中dsRNA I在一端(E1，E2)具有平端构型。
4.根据权利要求3的方法，其中平端(E1，E2)包含一条链(as1)的5′-端。
5.根据前面权利要求之一的方法，其中突出端由1-4个核苷酸，优选1或2个核苷酸组成。
6.根据前面权利要求之一的方法，其中向细胞中导入至少另外一个具有前面权利要求中定义的dsRNA I的构型的双链核糖核酸(dsRNAII)，其中所述dsRNA I的一条链(as1)与靶基因的第一区(B1)互补，并且其中dsRNA II的另一条链(as2)或所述另一条链(as2)的至少一个片段与靶基因的第二区(B2)互补。
7.根据前面权利要求之一的方法，其中dsRNA I和/或dsRNA II具有短于25个连续核苷酸对的长度，优选19至23个连续核苷酸对的长度。
8.根据前面权利要求之一的方法，其中第一(B1)和第二(B2)区部分重叠或者彼此连接。
9.根据前面权利要求之一的方法，其中第一(B1)和第二(B2)区彼此分开。
10.根据前面权利要求之一的方法，其中靶基因具有序列SQ001至SQ140之一。
11.根据前面权利要求之一的方法，其中靶基因选自：癌基因，细胞因子基因，Id蛋白质基因，朊病毒基因，来自诱导血管生成分子的基因，来自粘附分子的基因，和来自细胞表面受体的基因；来自转移和/或侵入过程中涉及的蛋白质的基因；来自蛋白酶和调节编程性细胞死亡和细胞周期的分子的基因。
12.根据前面权利要求之一的方法，其中靶基因是MDR1基因。
13.根据前面权利要求之一的方法，其中序列SQ141-173之一或合成整体并且属于序列SQ141-173的两个反义-(as1/2)和有义序列(ss1/2)组成的dsRNA构建体被用作dsRNA I/II。
14.根据前面权利要求之一的方法，其中根据RNA干扰原理抑制表达。
15.根据前面权利要求之一的方法，其中靶基因在致病生物体，优选疟原虫中表达。
16.根据前面权利要求之一的方法，其中靶基因是病毒或类病毒的成分。
17.根据权利要求16的方法，其中所述病毒是人致病病毒或类病毒。
18.根据权利要求16的方法，其中所述病毒或类病毒是动物或植物中致病病毒或类病毒。
19.根据前面权利要求之一的方法，其中没有配对的核苷酸被硫代磷酸核苷取代。
20.根据前面权利要求之一的方法，其中为了阻止在细胞中的分解或者各条链中的解离而修饰dsRNA I/II的至少一个末端(E1，E2)。
21.根据前面权利要求之一的方法，其中通过至少一个化学键增强互补核苷酸对实现的双链结构的内聚性。
22.根据前面权利要求之一的方法，其中通过共价键或离子键，氢键，疏水作用，优选利用范德华作用或堆积作用，或利用金属离子配位作用实现化学连接。
23.根据前面权利要求之一的方法，其中在一个末端(E1，E2)附近形成化学连接。
24.根据前面权利要求之一的方法，其中由一个或几个键合基团建立化学连接，其中键合基团优选是聚-(氧磷酸亚基-氧-1，3-丙二醇)和/或寡乙二醇链。
25.根据前面权利要求之一的方法，其中通过使用支化核苷酸类似物代替核苷酸形成化学连接。
26.根据前面权利要求之一的方法，其中通过嘌呤类似物形成化学连接。
27.根据前面权利要求之一的方法，其中通过氮杂苯单元形成化学连接。
28.根据前面权利要求之一的方法，其中在产生化学连接中使用下面基团至少之一：亚甲基蓝；双官能基团，优选双-(2-氯乙基)-胺；N-乙酰基-N’-(p-乙醛酰-苯甲酰基)-胱胺；4-硫尿嘧啶；补骨脂素。
29.根据前面权利要求之一的方法，其中通过在双链区末端(E1，E2)附近连接的硫代磷酰基团形成化学连接。
30.根据前面权利要求之一的方法，其中通过末端(E1，E2)附近存在的三链螺旋键形成化学连接。
31.根据前面权利要求之一的方法，其中dsRNA I/II被围绕在微团结构中，最有利地被围绕在脂质体中。
32.根据前面权利要求之一的方法，其中dsRNA I/II结合于至少一种病毒外壳蛋白质，与至少一种病毒外壳蛋白质缔合，或者被至少一种病毒外壳蛋白质围绕，所述蛋白质源于病毒，或者来自病毒，或者是合成制备的。
33.根据前面权利要求之一的方法，其中所述外壳蛋白来自多瘤病毒。
34.根据前面权利要求之一的方法，其中所述外壳蛋白含有多瘤病毒的病毒蛋白质1(VP1)和/或病毒蛋白质2(VP2)。
35.根据前面权利要求之一的方法，其中在形成病毒壳体或病毒壳体样结构时，一侧转向壳体或壳体样结构内部。
36.根据前面权利要求之一的方法，其中dsRNA I/II的一条链(as1，as2)与靶基因的初始的或加工过的RNA转录物互补。
37.根据前面权利要求之一的方法，其中细胞是脊椎动物细胞或人细胞。
38.根据前面权利要求之一的方法，其中以每天每千克体重5毫克的最大剂量对哺乳动物，优选对人施用dsRNA I/II。
39.根据前面权利要求之一的方法，其中dsRNA I/II在缓冲液中混合用于施用。
40.根据前面权利要求之一的方法，其中口服dsRNA I/II或者通过静脉内，肿瘤内，或腹膜内注射或灌注，或者通过吸入给药。
41.一种双链核糖核酸(dsRNA I)抑制靶基因在细胞中表达的用途，其中dsRNA I具有最多由49个连续核苷酸对组成的双链结构，而且其中所述双链结构的一条链(as1)或者所述一条链(as1)的至少一个片段与靶基因互补，
并且其中dsRNA I的至少一个末端(E1，E2)具有一个由1-4个核苷酸组成的突出端。
42.根据权利要求41的用途，其中dsRNA I在一条链(as1)的3′-端和/或另一条链(ss1)的3′-端有突出端。
43.根据权利要求41或42的用途，其中dsRNA I在一端(E1，E2)具有平端构型。
44.根据权利要求43的用途，其中平端(E1，E2)包含一条链(as1)的5′-端。
45.根据权利要求41-44之一的用途，其中突出端由1-4个核苷酸，优选1或2个核苷酸组成。
46.根据权利要求41-45之一的用途，其中向细胞中导入至少另外一个具有权利要求41-45中定义的dsRNA I的构型的双链核糖核酸(dsRNA II)，其中所述dsRNA I的双链结构的所述一条链(as1)或该链(as1)的至少一个片段与靶基因的有义链的第一区(B1)互补，并且其中dsRNA II的双链结构的另一条链(as2)或所述另一条链(as2)的至少一个片段与靶基因的第二区(B2)互补。
47.根据权利要求41-46之一的用途，其中dsRNA I和/或dsRNAII具有短于25个连续核苷酸对的长度，优选19至23个连续核苷酸对的长度。
48.根据权利要求41-47之一的用途，其中第一(B1)和第二(B2)区部分重叠或者彼此连接。
49.根据权利要求41-48之一的用途，其中第一(B1)和第二(B2)区彼此分开。
50.根据权利要求41-49之一的用途，其中靶基因具有序列SQ001至SQ140之一。
51.根据权利要求41-50之一的用途，其中靶基因选自：癌基因，细胞因子基因，Id蛋白质基因，朊病毒基因，来自诱导血管生成分子的基因，来自粘附分子的基因，和来自细胞表面受体的基因；来自转移和/或侵入过程中涉及的蛋白质的基因；来自蛋白酶和调节编程性细胞死亡和细胞周期的分子的基因。
52.根据权利要求41-51之一的用途，其中靶基因是MDR1基因。
53.根据权利要求41-52之一的用途，其中序列SQ141-173之一或合成整体并且属于序列SQ141-173的两个反义-(as1/2)和有义序列(ss1/2)组成的dsRNA构建体被用作dsRNA I/II。
54.根据权利要求41-53之一的用途，其中根据RNA干扰原理抑制表达。
55.根据权利要求41-54之一的用途，其中靶基因在致病生物体，优选疟原虫中表达。
56.根据权利要求41-55之一的用途，其中靶基因是病毒或类病毒的成分。
57.根据权利要求56的用途，其中所述病毒是人致病病毒或类病毒。
58.根据权利要求56的用途，其中所述病毒或类病毒是动物或植物中致病病毒或类病毒。
59.根据权利要求41-58之一的用途，其中没有配对的核苷酸被硫代磷酸核苷取代。
60.根据权利要求41-59之一的用途，其中为了阻止在细胞中的分解或者各条链中的解离而修饰dsRNA的至少一个末端(E1，E2)。
61.根据权利要求41-60之一的用途，其中通过至少一个化学键增强互补核苷酸对实现的双链结构的内聚性。
62.根据权利要求41-61之一的用途，其中通过共价键或离子键，氢键，疏水作用，优选利用范德华作用或堆积作用，或利用金属离子配位作用实现化学连接。
63.根据权利要求41-62之一的用途，其中在一个末端(E1，E2)附近形成化学连接。
64.根据权利要求41-63之一的用途，其中由一个或几个键合基团建立化学连接，其中键合基团优选是聚-(氧磷酸亚基-氧-1，3-丙二醇)和/或寡乙二醇链。
65.根据权利要求41-64之一的用途，其中通过使用支化核苷酸类似物代替核苷酸形成化学连接。
66.根据权利要求41-65之一的用途，其中通过嘌呤类似物形成化学连接。
67.根据权利要求41-66之一的用途，其中通过氮杂苯单元形成化学连接。
68.根据权利要求41-67之一的用途，其中在产生化学连接中使用下面基团至少之一：亚甲基蓝；双官能基团，优选双-(2-氯乙基)-胺；N-乙酰基-N’-(p-乙醛酰-苯甲酰基)-胱胺；4-硫尿嘧啶；补骨脂素。
69.根据权利要求41-68之一的用途，其中通过在双链区末端(E1，E2)附近连接的硫代磷酰基团形成化学连接。
70.根据权利要求41-69之一的用途，其中通过末端(E1，E2)附近存在的三链螺旋键形成连接。
71.根据权利要求41-70之一的用途，其中dsRNA I/II被围绕在微团结构中，最有利地被围绕在脂质体中。
72.根据权利要求41-71之一的用途，其中dsRNA I/II结合于至少一种病毒外壳蛋白质，与至少一种病毒外壳蛋白质缔合，或者被至少一种病毒外壳蛋白质围绕，所述蛋白质源于病毒，或者来自病毒，或者是合成制备的。
73.根据权利要求41-72之一的用途，其中所述外壳蛋白来自多瘤病毒。
74.根据权利要求41-73之一的用途，其中所述外壳蛋白含有多瘤病毒的病毒蛋白质1(VP1)和/或病毒蛋白质2(VP2)。
75.根据权利要求41-74之一的用途，其中在形成病毒壳体或病毒壳体样结构时，一侧转向壳体或壳体样结构内部。
76.根据权利要求41-75之一的用途，其中dsRNA I/II的一条链(as1，as2)与靶基因的初始的或加工过的RNA转录物互补。
77.根据权利要求41-76之一的用途，其中细胞是脊椎动物细胞或人细胞。
78.根据权利要求41-77之一的用途，其中以每天每千克体重5毫克的最大剂量对哺乳动物，优选对人施用dsRNA I/II。
79.根据权利要求41-78之一的用途，其中dsRNA I/II在缓冲液中混合用于施用。
80.根据权利要求41-79之一的用途，其中口服dsRNA I/II或者通过静脉内，肿瘤内，或腹膜内注射或灌注，或者通过吸入给药。
81.抑制靶基因在细胞中表达的药物，含有足以抑制靶基因表达剂量的双链核糖核酸(dsRNA I)，
其中dsRNA I具有最多由49个连续核苷酸对组成的双链结构，
而且其中所述双链结构的一条链(as1)或者所述一条链(as1)的至少一个片段与靶基因互补，
并且其中dsRNA I的的至少一个末端(E1，E2)具有一个由1-4个核苷酸组成的突出端。
82.根据权利要求81的药物，其中dsRNA I在一条链(as1)的3′-端和/或另一条链(ss1)的3′-端有突出端。
83.根据权利要求81或82的方法，其中dsRNA I在一端(E1，E2)具有平端构型。
84.根据权利要求83的药物，其中平端(E1，E2)包含一条链(as1)的5′-端。
85.根据权利要求81-84的药物，其中突出端由1-4个核苷酸，优选1或2个核苷酸组成。
86.根据权利要求81-85之一的药物，其中至少另外一个双链核糖核酸(dsRNA II)具有根据权利要求75或76中定义的dsRNA I的构型，并且其中dsRNA I的一条链(as1)与靶基因的第一区(B1)互补，并且其中dsRNA II的另一条链(as2)或所述另一条链(as2)的至少一个片段与靶基因的第二区(B2)互补。
87.根据权利要求81-86之一的药物，其中dsRNA I和/或dsRNAII具有短于25个连续核苷酸对的长度，优选19至23个连续核苷酸对的长度。
88.根据权利要求81-87之一的药物，其中第一(B1)和第二(B2)区部分重叠或者彼此连接。
89.根据权利要求81-88之一的药物，其中靶基因具有序列SQ001至SQ140之一。
90.根据权利要求81-89之一的药物，其中靶基因选自：癌基因，细胞因子基因，Id蛋白质基因，朊病毒基因，来自诱导血管生成分子的基因，来自粘附分子的基因，和来自细胞表面受体的基因；来自转移和/或侵入过程中涉及的蛋白质的基因；来自蛋白酶和调节编程性细胞死亡和细胞周期的分子的基因。
91.根据权利要求81-90之一的药物，其中靶基因是MDR1基因。
92.根据权利要求81-91之一的药物，其中序列SQ141-173之一或合成整体并且属于序列SQ141-173的两个反义-(as1/2)和有义序列(ss1/2)组成的dsRNA构建体被用作dsRNA I/II。
93.根据权利要求81-92之一的药物，其中根据RNA干扰原理抑制表达。
94.根据权利要求81-93之一的药物，其中靶基因在致病生物体，最有利地在疟原虫中表达。
95.根据权利要求81-94之一的药物，其中靶基因是病毒或类病毒的成分。
96.根据权利要求95的药物，其中所述病毒是人致病病毒或类病毒。
97.根据权利要求95的药物，其中所述病毒或类病毒是动物或植物中致病病毒或类病毒。
98.根据权利要求81-97之一的药物，其中没有配对的核苷酸被硫代磷酸核苷取代。
99.根据权利要求81-98之一的药物，其中为了阻止在细胞中的分解或者各条链中的解离而修饰dsRNAI/II的至少一个末端(E1，E2)。
100.根据权利要求81-99之一的药物，其中通过至少一个化学键增强互补核苷酸对实现的双链结构的内聚性。
101.根据权利要求81-100之一的药物，其中通过共价键或离子键，氢键，疏水作用，优选利用范德华作用或堆积作用，或利用金属离子配位作用实现化学连接。
102.根据权利要求81-101之一的药物，其中在一个末端(E1，E2)附近形成化学连接。
103.根据权利要求81-102之一的药物，其中由一个或几个键合基团建立化学连接，其中键合基团优选是聚-(氧磷酸亚基-氧-1，3-丙二醇)和/或寡乙二醇链。
104.根据权利要求81-103之一的药物，其中通过使用支化核苷酸类似物代替核苷酸形成化学连接。
105.根据权利要求81-104之一的药物，其中通过嘌呤类似物形成化学连接。
106.根据权利要求81-105之一的药物，其中通过氮杂苯单元形成化学连接。
107.根据权利要求81-106之一的药物，其中在产生化学连接中使用下面基团至少之一：亚甲基蓝；双官能基团，优选双-(2-氯乙基)-胺；N-乙酰基-N’-(p-乙醛酰-苯甲酰基)-胱胺；4-硫尿嘧啶；补骨脂素。
108.根据权利要求81-107之一的药物，其中通过在双链区末端(E1，E2)附近连接的硫代磷酰基团形成化学连接。
109.根据权利要求81-108之一的药物，其中通过末端(E1，E2)附近存在的三链螺旋键形成连接。
110.根据权利要求81-109之一的药物，其中dsRNA I/II被围绕在微团结构中，最有利地被围绕在脂质体中。
111.根据权利要求81-110之一的药物，其中dsRNA I/II结合于至少一种病毒外壳蛋白质，与至少一种病毒外壳蛋白质缔合，或者被至少一种病毒外壳蛋白质围绕，所述蛋白质源于病毒，或者来自病毒，或者是合成制备的。
112.根据权利要求81-111之一的药物，其中所述外壳蛋白来自多瘤病毒。
113.根据权利要求81-112之一的药物，其中所述外壳蛋白含有多瘤病毒的病毒蛋白质1(VP1)和/或病毒蛋白质2(VP2)。
114.根据权利要求81-113之一的药物，其中在形成病毒壳体或病毒壳体样结构时，一侧转向壳体或壳体样结构内部。
115.根据权利要求81-114之一的药物，其中dsRNA I/II的一条链(as1，as2)与靶基因的初始的或加工过的RNA转录物互补。
116.根据权利要求81-115之一的药物，其中细胞是脊椎动物细胞或人细胞。
117.根据权利要求81-116之一的药物，其中所述第一(B1)和第二(B2)区彼此分开。
118.根据权利要求81-117之一的药物，其中以每剂5毫克的最大量施用dsRNA。
119.根据权利要求81-118之一的药物，其中dsRNA在缓冲液中混合用于施用。
120.根据权利要求81-119之一的药物，其中口服dsRNA或者通过静脉内，肿瘤内，或腹膜内注射或灌注，或者通过吸入给药。
121.抑制靶基因在细胞中表达的方法，包括下面的步骤：
以足以抑制靶基因表达的量导入至少一种双链核糖核酸(dsRNAI)，
其中dsRNA I具有最多由49个连续核苷酸对组成的双链结构，而且其中所述双链结构的一条链(as1)或者所述一条链(as1)的至少一个片段与靶基因互补，
并且其中dsRNA I的至少一个末端(E1，E2)具有一个由1-4个核苷酸组成的突出端。
122.根据权利要求1的方法，其中dsRNA I在一条链(as1)的3′-端和/或另一条链(ss1)的3′-端有突出端。
123.根据权利要求1或2的方法，其中dsRNA I在一端(E1，E2)具有平端构型。
124.根据权利要求3的方法，其中平端(E1，E2)包含一条链(as1)的5′-端。
125.根据前面权利要求之一的方法，其中突出端由1-4个，核苷酸优选1或2个核苷酸组成。
126.根据前面权利要求之一的方法，其中向细胞中导入至少另外一个具有前面权利要求中定义的dsRNA I的构型的双链核糖核酸(dsRNA II)，其中所述dsRNA I的一条链(as1)与靶基因的第一区(B1)互补，并且其中dsRNA II的另一条链(as2)或所述另一条链(as2)的至少一个片段与靶基因的第二区(B2)互补。
127.根据前面权利要求之一的方法，其中dsRNA I和/或dsRNA II具有短于25个连续核苷酸对的长度，优选19至23个连续核苷酸对的长度。
128.根据前面权利要求之一的方法，其中第一(B1)和第二(B2)区部分重叠或者彼此连接。
129.根据前面权利要求之一的方法，其中第一(B1)和第二(B2)区彼此分开。
130.根据前面权利要求之一的方法，其中靶基因具有序列SQ001至SQ140之一。
131.根据前面权利要求之一的方法，其中靶基因选自：癌基因，细胞因子基因，Id蛋白质基因，朊病毒基因，来自诱导血管生成分子的基因，来自粘附分子的基因，和来自细胞表面受体的基因；来自转移和/或侵入过程中涉及的蛋白质的基因；来自蛋白酶和调节编程性细胞死亡和细胞周期的分子的基因。
132.根据前面权利要求之一的方法，其中靶基因是MDR1基因。
133.根据前面权利要求之一的方法，其中序列SQ141-173之一或合成整体并且属于序列SQ141-173的两个反义-(as1/2)和有义序列(ss1/2)组成的dsRNA构建体被用作dsRNA I/II。
134.根据前面权利要求之一的方法，其中根据RNA干扰原理抑制表达。
135.根据前面权利要求之一的方法，其中靶基因在致病生物体，优选疟原虫中表达。
136.根据前面权利要求之一的方法，其中靶基因是病毒或类病毒的成分。
137.根据权利要求16的方法，其中所述病毒是人致病病毒或类病毒。
138.根据权利要求16的方法，其中所述病毒或类病毒是动物或植物中致病病毒或类病毒。
139.根据前面权利要求之一的方法，其中没有配对的核苷酸被硫代磷酸核苷取代。
140.根据前面权利要求之一的方法，其中为了阻止在细胞中的分解或者各条链中的解离而修饰dsRNA I/II的至少一个末端(E1，E2)。
141.根据前面权利要求之一的方法，其中通过至少一个化学键增强互补核苷酸对实现的双链结构的内聚性。
142.根据前面权利要求之一的方法，其中通过共价键或离子键，氢键，疏水作用，优选利用范德华作用或堆积作用，或利用金属离子配位作用实现化学连接。
143.根据前面权利要求之一的方法，其中在一个末端(E1，E2)附近形成化学连接。
144.根据前面权利要求之一的方法，其中由一个或几个键合基团建立化学连接，其中键合基团优选是聚-(氧磷酸亚基-氧-1，3-丙二醇)和/或寡乙二醇链。
145.根据前面权利要求之一的方法，其中通过使用支化核苷酸类似物代替核苷酸形成化学连接。
146.根据前面权利要求之一的方法，其中通过嘌呤类似物形成化学连接。
147.根据前面权利要求之一的方法，其中通过氮杂苯单元形成化学连接。
148.根据前面权利要求之一的方法，其中在产生化学连接中使用下面基团至少之一：亚甲基蓝；双官能基团，优选双-(2-氯乙基)-胺；N-乙酰基-N’-(p-乙醛酰-苯甲酰基)-胱胺；4-硫尿嘧啶；补骨脂素。
149.根据前面权利要求之一的方法，其中通过在双链区末端(E1，E2)附近连接的硫代磷酰基团形成化学连接。
150.根据前面权利要求之一的方法，其中通过末端(E1，E2)附近存在的三链螺旋键形成化学连接。
151.根据前面权利要求之一的方法，其中dsRNA I/II被围绕在微团结构中，最有利地被围绕在脂质体中。
152.根据前面权利要求之一的方法，其中dsRNA I/II结合于至少一种病毒外壳蛋白质，与至少一种病毒外壳蛋白质缔合，或者被至少一种病毒外壳蛋白质围绕，所述蛋白质源于病毒，或者来自病毒，或者是合成制备的。
153.根据前面权利要求之一的方法，其中所述外壳蛋白来自多瘤病毒。
154.根据前面权利要求之一的方法，其中所述外壳蛋白含有多瘤病毒的病毒蛋白质1(VP1)和/或病毒蛋白质2(VP2)。
155.根据前面权利要求之一的方法，其中在形成病毒壳体或病毒壳体样结构时，一侧转向壳体或壳体样结构内部。
156.根据前面权利要求之一的方法，其中dsRNA I/II的一条链(as1，as2)与靶基因的初始的或加工过的RNA转录物互补。
157.根据前面权利要求之一的方法，其中细胞是脊椎动物细胞或人细胞。
158.根据前面权利要求之一的方法，其中以每天每千克体重5毫克的最大剂量对哺乳动物，优选对人施用dsRNA I/II。
159.根据前面权利要求之一的方法，其中dsRNA I/II在缓冲液中混合用于施用。
160.根据前面权利要求之一的方法，其中口服dsRNA I/II或者通过静脉内，肿瘤内，或腹膜内注射或灌注，或者通过吸入给药。
161.一种双链核糖核酸(dsRNA I)抑制靶基因在细胞中表达的用途，其中dsRNA I具有最多由49个连续核苷酸对组成的双链结构，而且其中所述双链结构的一条链(as1)或者所述一条链(as1)的至少一个片段与靶基因互补，并且其中dsRNA I的至少一个末端(E1，E2)具有一个由1-4个核苷酸组成的突出端。
162.根据权利要求41的用途，其中dsRNA I在一条链(as1)的3′-端和/或另一条链(ss1)的3′-端有突出端。
163.根据权利要求41或42的用途，其中dsRNA I在一端(E1，E2)具有平端构型。
164.根据权利要求43的用途，其中平端(E1，E2)包含一条链(as1)的5′-端。
165.根据权利要求41-44的用途，其中突出端由1-4个核苷酸，优选1或2个核苷酸组成。
166.根据权利要求41-45的用途，其中向细胞中导入至少另外一个具有权利要求41-45中定义的dsRNA I的构型的双链核糖核酸(dsRNA II)，其中所述dsRNA I的双链结构的所述一条链(as1)或该链(as1)的至少一个片段与靶基因的有义链的第一区(B1)互补，并且其中dsRNA II的双链结构的另一条链(as2)或所述另一条链(as2)的至少一个片段与靶基因的第二区(B2)互补。
167.根据权利要求41-47之一的用途，其中dsRNA I和/或dsRNAII具有短于25个连续核苷酸对的长度，优选19至23个连续核苷酸对的长度。
168.根据权利要求41-47之一的用途，其中第一(B1)和第二(B2)区部分重叠或者彼此连接。
169.根据权利要求41-48之一的用途，其中第一(B1)和第二(B2)区彼此分开。
170.根据权利要求41-49之一的用途，其中靶基因具有序列SQ001至SQ140之一。
171.根据权利要求41-50之一的用途，其中靶基因选自：癌基因，细胞因子基因，Id蛋白质基因，朊病毒基因，来自诱导血管生成分子的基因，来自粘附分子的基因，和来自细胞表面受体的基因；来自转移和/或侵入过程中涉及的蛋白质的基因；来自蛋白酶和调节编程性细胞死亡和细胞周期的分子的基因。
172.根据权利要求41-51之一的用途，其中靶基因是MDR1基因。
173.根据权利要求41-52之一的用途，其中序列SQ141-173之一或合成整体并且属于序列SQ141-173的两个反义-(as1/2)和有义序列(s s1/2)组成的dsRNA构建体被用作dsRNA I/II。
174.根据权利要求41-53之一的用途，其中根据RNA干扰原理抑制表达。
175.根据权利要求41-54之一的用途，其中靶基因在致病生物体，优选疟原虫中表达。
176.根据权利要求41-55之一的用途，其中靶基因是病毒或类病毒的成分。
177.根据权利要求56的用途，其中所述病毒是人致病病毒或类病毒。
178.根据权利要求56的用途，其中所述病毒或类病毒是动物或植物中致病病毒或类病毒。
179.根据权利要求41-58之一的用途，其中没有配对的核苷酸被硫代磷酸核苷取代。
180.根据权利要求41-59之一的用途，其中为了阻止在细胞中的分解或者各条链中的解离而修饰dsRNA的至少一个末端(E1，E2)。
181.根据权利要求41-60之一的用途，其中通过至少一个化学键增强互补核苷酸对实现的双链结构的内聚性。
182.根据权利要求41-61之一的用途，其中通过共价键或离子键，氢键，疏水作用，优选利用范德华作用或堆积作用，或利用金属离子配位作用实现化学连接。
183.根据权利要求41-62之一的用途，其中在一个末端(E1，E2)附近形成化学连接。
184.根据权利要求41-63之一的用途，其中由一个或几个键合基团建立化学连接，其中键合基团优选是聚-(氧磷酸亚基-氧-1，3-丙二醇)和/或寡乙二醇链。
185.根据权利要求41-64之一的用途，其中通过使用支化核苷酸类似物代替核苷酸形成化学连接。
186.根据权利要求41-65之一的用途，其中通过嘌呤类似物形成化学连接。
187.根据权利要求41-66之一的用途，其中通过氮杂苯单元形成化学连接。
188.根据权利要求41-67之一的用途，其中在产生化学连接中使用下面基团至少之一：亚甲基蓝；双官能基团，优选双-(2-氯乙基)-胺；N-乙酰基-N’-(p-乙醛酰-苯甲酰基)-胱胺；4-硫尿嘧啶；补骨脂素。
189.根据权利要求41-68之一的用途，其中通过在双链区末端(E1，E2)附近连接的硫代磷酰基团形成化学连接。
190.根据权利要求41-69之一的用途，其中通过末端(E1，E2)附近存在的三链螺旋键形成连接。
191.根据权利要求41-70之一的用途，其中dsRNA I/II被围绕在微团结构中，最有利地被围绕在脂质体中。
192.根据权利要求41-71之一的用途，其中dsRNA I/II结合于至少一种病毒外壳蛋白质，与至少一种病毒外壳蛋白质缔合，或者被至少一种病毒外壳蛋白质围绕，所述蛋白质源于病毒，或者来自病毒，或者是合成制备的。
193.根据权利要求41-72之一的用途，其中所述外壳蛋白来自多瘤病毒。
194.根据权利要求41-73之一的用途，其中所述外壳蛋白含有多瘤病毒的病毒蛋白质1(VP1)和/或病毒蛋白质2(VP2)。
195.根据权利要求41-74之一的用途，其中在形成病毒壳体或病毒壳体样结构时，一侧转向壳体或壳体样结构内部。
196.根据权利要求41-75之一的用途，其中dsRNA I/II的一条链(as1，as2)与靶基因的初始的或加工过的RNA转录物互补。
197.根据权利要求41-76之一的用途，其中细胞是脊椎动物细胞或人细胞。
198.根据权利要求41-77之一的用途，其中以每天每千克体重5毫克的最大剂量对哺乳动物，优选对人施用dsRNA I/II。
199.根据权利要求41-78之一的用途，其中dsRNA I/II在缓冲液中混合用于施用。
200.根据权利要求41-79之一的用途，其中口服dsRNA I/II或者通过静脉内，肿瘤内，或腹膜内注射或灌注，或者通过吸入给药。
201.抑制靶基因在细胞中表达的药物，含有足以抑制靶基因表达剂量的双链核糖核酸(dsRNA I)，
其中dsRNA I具有最多由49个连续核苷酸对组成的双链结构，
而且其中所述双链结构的一条链(as1)或者所述一条链(as1)的至少一个片段与靶基因互补，
并且其中dsRNA I的至少一个末端(E1，E2)具有一个由1-4个核苷酸组成的突出端。
202.根据权利要求81的药物，其中dsRNA I在一条链(as1)的3′-端和/或另一条链(ss1)的3′-端有突出端。
203.根据权利要求8 1或82的方法，其中dsRNA I在一端(E1，E2)具有平端构型。
204.根据权利要求83的药物，其中平端(E1，E2)包含一条链(as1)的5′-端。
205.根据权利要求81-84的药物，其中突出端由1-4个核苷酸，优选1或2个核苷酸组成。
206.根据权利要求81-85之一的药物，其中至少另外一个双链核糖核酸(dsRNA II)具有根据权利要求75或76中定义的dsRNA I的构型，并且其中dsRNA I的一条链(as1)与靶基因的第一区(B1)互补，并且其中dsRNA II的另一条链(as2)或所述另一条链(as2)的至少一个片段与靶基因的第二区(B2)互补。
207.根据权利要求81-86之一的药物，其中dsRNA I和/或dsRNAII具有短于25个连续核苷酸对的长度，优选19至23个连续核苷酸对的长度。
208.根据权利要求81-87之一的药物，其中第一(B1)和第二(B2)区部分重叠或者彼此连接。
209.根据权利要求81-88之一的药物，其中靶基因具有序列SQ001至SQ140之一。
210.根据权利要求81-89之一的药物，其中靶基因选自：癌基因，细胞因子基因，Id蛋白质基因，朊病毒基因，来自诱导血管生成分子的基因，来自粘附分子的基因，和来自细胞表面受体的基因；来自转移和/或侵入过程中涉及的蛋白质的基因；来自蛋白酶和调节编程性细胞死亡和细胞周期的分子的基因。
211.根据权利要求81-90之一的药物，其中靶基因是MDR1基因。
212.根据权利要求81-91之一的药物，其中序列SQ141-173之一或合成整体并且属于序列SQ141-173的两个反义-(as1/2)和有义序列(ss1/2)组成的dsRNA构建体被用作dsRNA I/II。
213.根据权利要求81-92之一的药物，其中根据RNA干扰原理抑制表达。
214.根据权利要求81-93之一的药物，其中靶基因在致病生物体，最有利地在疟原虫中表达。
215.根据权利要求81-94之一的药物，其中靶基因是病毒或类病毒的成分。
216.根据权利要求95的药物，其中所述病毒是人致病病毒或类病毒。
217.根据权利要求95的药物，其中所述病毒或类病毒是动物或植物中致病病毒或类病毒。
218.根据权利要求81-97之一的药物，其中没有配对的核苷酸被硫代磷酸核苷取代。
219.根据权利要求81-98之一的药物，其中为了阻止在细胞中的分解或者各条链中的解离而修饰dsRNAI/II的至少一个末端(E1，E2)。
220.根据权利要求81-99之一的药物，其中通过至少一个化学键增强互补核苷酸对实现的双链结构的内聚性。
221.根据权利要求81-100之一的药物，其中通过共价键或离子键，氢键，疏水作用，优选利用范德华作用或堆积作用，或利用金属离子配位作用实现化学连接。
222.根据权利要求81-101之一的药物，其中在一个末端(E1，E2)附近形成化学连接。
223.根据权利要求81-102之一的药物，其中由一个或几个键合基团建立化学连接，其中键合基团优选是聚-(氧磷酸亚基-氧-1，3-丙二醇)和/或寡乙二醇链。
224.根据权利要求81-103之一的药物，其中通过使用支化核苷酸类似物代替核苷酸形成化学连接。
225.根据权利要求81-104之一的药物，其中通过嘌呤类似物形成化学连接。
226.根据权利要求81-105之一的药物，其中通过氮杂苯单元形成化学连接。
227.根据权利要求81-106之一的药物，其中在产生化学连接中使用下面基团至少之一：亚甲基蓝；双官能基团，优选双-(2-氯乙基)-胺；N-乙酰基-N’-(p-乙醛酰-苯甲酰基)-胱胺；4-硫尿嘧啶；补骨脂素。
228.根据权利要求81-107之一的药物，其中通过在双链区末端(E1，E2)附近连接的硫代磷酰基团形成化学连接。
229.根据权利要求81-108之一的药物，其中通过末端(E1，E2)附近存在的三链螺旋键形成连接。
230.根据权利要求81-109之一的药物，其中dsRNA I/II被围绕在微团结构中，最有利地被围绕在脂质体中。
231.根据权利要求81-110之一的药物，其中dsRNA I/II结合于至少一种病毒外壳蛋白质，与至少一种病毒外壳蛋白质缔合，或者被至少一种病毒外壳蛋白质围绕，所述蛋白质源于病毒，或者来自病毒，或者是合成制备的。
232.根据权利要求81-111之一的药物，其中所述外壳蛋白来自多瘤病毒。
233.根据权利要求81-112之一的药物，其中所述外壳蛋白含有多瘤病毒的病毒蛋白质1(VP1)和/或病毒蛋白质2(VP2)。
234.根据权利要求81-113之一的药物，其中在形成病毒壳体或病毒壳体样结构时，一侧转向壳体或壳体样结构内部。
235.根据权利要求81-114之一的药物，其中dsRNA I/II的一条链(as1，as2)与靶基因的初始的或加工过的RNA转录物互补。
236.根据权利要求81-115之一的药物，其中细胞是脊椎动物细胞或人细胞。
237.根据权利要求81-116之一的药物，其中所述第一(B1)和第二(B2)区彼此分开。
238.根据权利要求81-117之一的药物，其中以每剂5毫克的最大量施用dsRNA。
239.根据权利要求81-118之一的药物，其中dsRNA在缓冲液中混合用于施用。
240.根据权利要求81-119之一的药物，其中口服dsRNA或者通过静脉内，肿瘤内，或腹膜内注射或灌注，或者通过吸入给药。
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