CN1612861B - 非特异性结合特性改善的ecl标记物、其使用方法以及包含该标记物的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
介绍了包含一些配体的发光的金属络合物,所述配体为带有防止非特异性结合的官能团(特别是在用于通过酰胺键结合生物试剂的标准条件下不受影响的带负电荷的官能团)的联吡啶或菲咯啉配体。在电化学发光分析中使用包含所述配体的发光钌和锇络合物显示:相对于使用类似标记物标记的试剂进行分析,使用上述标记物能够显著减少非特异性结合的数量,所述类似标记物不含减少非特异性结合的官能团。
Description
相关申请的交叉引用
引用以下已批准的专利:美国专利5,310,687;5,591,581;5,597,910;5,705,402;5,846,485;6,066,448;6,214,552;6,207,369。上述文献的公开内容通过引用结合到本文。
发明领域
本发明涉及用于分析的标记物,优选含金属的标记物。本发明具体涉及含有被亲水性基团和/或带电基团取代的配体的金属标记物,所述基团防止标记的物质与其它物质的非特异性结合(“NSB”)。本发明还涉及实施使用上述标记物的分析、优选发光分析的方法,还涉及包含上述标记物的试剂盒和组合物。
发明背景
本申请引用的文献与涉及本发明的现有技术有关。所有这些文献的公开内容通过引用结合到本文。
电化学发光(ECL)检测已成为一种重要的分析技术并且应用于常规分析和诊断过程。电化学发光涉及电解产生的物质和光的发射。举例来讲,电化学发光可能涉及如下过程产生的发光:一种或多种反应物由电化学产生并经过一种或多种化学反应产生发光的物质,优选可反复进行所述过程。
在实践中,大多数基于ECL的分析涉及使用电化学发光化合物作为标记物。通过检测ECL标记物的电化学发光确定结合反应中标记物质的存在或标记物质的参与。基于使用对目的分析物特异性的标记性结合试剂进行分析物的检测可能实质上同源的(参见美国专利第5,591,581号和公开的PCT申请WO87/06706),或者可能涉及在固相(如磁性颗粒)(参见美国专利第5,705,402号)或在电极表面(参见美国专利6,066,448和6,207,369以及公开的PCT申请WO98/12539)发生的结合反应。
一种重要类型的ECL标记物是具有一个或多个多配位基杂环含氮配体(例如联吡啶、菲咯啉、联吡嗪、联嘧啶等,或其取代的衍生物)的钌、锇或铼的有机金属络合物,例如美国专利5,310,687;5,597,910;5,591,581以及公开的PCT申请WO87/06706中介绍的络合物。由于这类标记物的稳定性以及产生ECL的效能,发现它们非常有用。
商业ECL仪器操作中,上述标记物的ECL通常在ECL共反应剂如三丙胺存在下通过氧化标记物产生。ECL共反应剂也在电极被氧化产生强还原剂(参见例如美国专利5,846,485)。所述还原剂和被氧化的标记物的高能反应导致标记物被还原并激发到发光激发状态。光子的发射使标记物重新回到其最初的状态并允许标记物的检测。
电化学发光是非常灵敏的检测技术。然而,对于某个具体分析的灵敏度,检测技术的灵敏度往往不是决定因素。在涉及标记性结合试剂和结合配偶体(例如分析物)间特异性作用的分析中,灵敏度常常受到背景信号的限制,背景信号是由标记结合试剂与非结合配偶体的物质的非特异性结合(NSB)产生,非结合配偶体有例如粗制样品的其它组分、其它分析试剂,或者在固相结合分析时,固相本身。在某些情况下,NSB还通过试剂在容器、移液管等表面的损失导致信号减弱。虽然ECL标记物通常比其它类型标记物有更好的NSB特性,但是在某些条件下NSB可能是分析灵敏度的限制因素。例如在以下条件下可能存在:i)用标记性结合试剂进行ECL分析,其中结合试剂本身具有很高的NSB水平;ii)用大量标记物标记的结合试剂进行ECL分析;iii)用低浓度的NSB封闭剂进行ECL分析或不使用这样的封闭剂进行ECL分析。
发明概述
本发明涉及含至少一个取代基、优选两个取代基的取代的联吡啶和菲咯啉,所述取代基包含负电荷基团,优选硫酸根或磺酸根。上述取代的联吡啶和菲咯啉作为金属络合物的配体存在时,相对于类似的未取代的联吡啶或菲咯啉减少所述络合物的NSB。此外,本发明涉及包含所述配体的有机金属络合物以及包含这样的有机金属络合物的标记分析试剂。
本发明还涉及具有以下结构的发光金属络合物
ML1L2 2
其中
M为Os或Ru;
L1为如下所述的L2或取代的联吡啶或菲咯啉配体,所述配体含至少一个取代基共价连接至i)用于分析的生物物质和/或分析试剂或者ii)能够参加与用于分析的生物物质和/或分析试剂的反应,从而形成这样的共价键的部分;
L2为取代的联吡啶或菲咯啉配体,该配体包含一个带负电荷的基团,优选硫酸根或磺酸根,相对于L2是未取代的联吡啶或菲咯啉的类似络合物,所述基团用作减少络合物的NSB。或者,L2为取代的联吡啶或菲咯啉配体,该配体包含中性亲水基团,优选羟基或甲酰胺基,或带正电荷的基团,优选胍鎓基团。
本发明还涉及具有以下结构的发光金属络合物
ML1L2 2
其中
M为Os或Ru;
L2是选自以下的金属配体:
其中,
T是连接基,包括烷基、链烯基、炔基或苯基连接基或者它们的组合,任选其一个或多个链碳被杂原子取代;
Z为-SO3 -、-SO3H、-OSO3 -、-OSO3H、-PO3 2-、-PO3H-、-PO3H2、-OPO3 2-、-OPO3H-、-OPO3H2、-OP(R)O2 -、-OP(R)O2H、-[NHC(NH2)2]+或-NHC(NH)NH2;
R为烷基;
L1为取代的联吡啶或菲咯啉配体,该配体具有至少一个取代基共价连接至i)用于分析的生物物质和/或分析试剂或者ii)能够参加与用于分析的生物物质和/或分析试剂的反应,从而形成这样的共价键的部分;L1优选自:
其中,
X是连接基,包括烷基、链烯基、炔基或苯基连接基或者它们的组合,任选其一个或多个链碳被杂原子取代;
Y是H或烷基;
W是连接生物分子、结合试剂、酶底物或其它分析试剂的官能团,或者W是存在于配体时适合使所述配体结合至生物物质、结合试剂、酶底物或其它分析试剂的官能团。
本发明还涉及连接至一种物质的具有一个或多个本发明金属络合物、优选发光金属络合物的标记物质。一个实施方案中,本发明涉及具有结构[A]i[B]j的标记物质,其中A为本发明发光金属络合物,B为共价连接至一个或多个A的物质(优选用于分析的生物物质和/或分析试剂),i为大于0的整数,j为大于0的整数(优选1)。优选A为与具有上述ML1L2 2结构的金属络合物,A和B经过L1上官能团共价连接。
本发明还涉及使用本发明发光金属络合物发光。所述络合物可以用于基于发光的分析,例如基于检测以下发光的分析:光照发光强度、时间分辨光照发光、发光能量转移、发光猝灭、发光时限、发光偏振、化学发光或优选电化学发光。本发明还包括在非发光分析例如电化学分析(即涉及测量与所述络合物氧化或还原反应有关的电流或电压的分析)中使用本发明络合物,所述电化学分析包括使用金属络合物作氧化还原标记物的电化学分析以及使用金属络合物作为测量分析物(例如DNA)的还原或氧化作用的氧化还原介质的电化学分析。优选本发明金属络合物的使用使得本发明络合物相对于没有低NSB官能团的类似络合物的非特异性结合低,从而改善分析性能。
本发明还涉及检测本发明的标记物质的方法,该方法包括以下步骤:i)使标记物质与结合试剂以及任选性固相载体接触;ii)形成包含所述结合试剂、标记物质以及任选固相载体的结合络合物;iii)诱导标记的物质产生信号、优选发光、更优选ECL;iv)检测所述信号以测量发光金属络合物。优选本发明金属络合物的使用使得本发明络合物相对于没有低NSB官能团的类似金属络合物的非特异性结合低,从而改善分析性能。
本发明还涉及检测样品中分析物的方法,该方法包括以下步骤:i)使样品与标记性结合试剂以及任选性固相载体接触;ii)形成包含所述结合试剂、分析物以及任选固相载体的结合络合物;iii)诱导标记性结合试剂中的标记物产生信号、优选发光、更优选ECL;iv)检测所述信号以测量样品中的分析物;其中标记性结合试剂包含一个或多个与分析物特异性结合试剂共价结合的上述低NSB标记物。优选本发明标记物的使用使得本发明标记物相对于没有低NSB官能团的类似标记物的非特异性结合低,从而改善分析性能。
本发明还涉及检测样品中分析物的方法,该方法包括以下步骤:i)使样品与分析物的标记类似物、结合试剂以及任选性固相载体接触;ii)形成包含分析物的标记类似物、结合试剂以及任选固相载体的结合络合物;iii)诱导分析物的标记类似物中的标记物产生信号、优选发光、更优选ECL;iv)检测所述信号以测量样品中的分析物;其中分析物的标记类似物包含共价连接分析物的类似物的一个或多个上述低NSB标记物,并且所述分析物的类似物与分析物竞争性结合至结合试剂。优选本发明标记物的使用使得所述络合物相对于没有低NSB官能团的类似标记物的非特异性结合低,从而改善分析性能。
本发明还涉及测量样品的分析物或者化学或生物活性的方法,该方法包括以下步骤:i)使包含分析物或者化学或生物活性的样品(或包含所述活性的底物或产物的样品)与本发明低NSB金属络合物接触;ii)诱导金属络合物产生信号、优选发光、更优选电化学发光;iii)检测信号以检测或测量化学或生物活性。
本发明还涉及改进已有的使用金属络合物的分析方法的方法,该方法包括用本发明的低NSB标记物或配体置换所述金属络合物或所述金属络合物上的配体。
本发明进一步涉及包含本发明低NSB配体和金属络合物的试剂盒和组合物。
附图简述
图1显示用络合物20、8和10标记的抗体在碳复合电极上的基于ECL的夹心免疫分析的对比结果。图中显示作为每个抗体的标记物数量的函数的非特异性信号和特异性信号。
图2显示用络合物20、2、15、12、17和15标记的抗体在碳复合电极上的基于ECL的夹心免疫分析的对比结果。图中显示作为每个抗体的标记物数量的函数的非特异性信号和特异性信号。
图3显示用络合物20和2标记的抗体在磁性颗粒上进行的基于ECL的夹心免疫分析的对比结果。图中显示作为每个抗体的标记物数量的函数的非特异性信号和特异性信号。
发明详述
本发明涉及用于检测目的分析物的分析方法中使用的改进的标记物。本文使用的术语“检测”是指定量以及定性测量。“检测”应当理解为包括相对于一个或多个阀值或标准进行数量上的比较以及为确定存在某些物质和/或出现某种情况进行的测量(例如溶液中分析物或标记物的存在或者发光)。本发明的一个优选实施方案涉及在ECL分析中用作标记物的发光有机金属络合物。所述络合物包含一个或多个取代的菲咯啉或联吡啶金属配体,至少一个金属配体具有防止配体非特异性结合的取代基(这样的配体在下文中称为低NSB配体)。优选的低NSB取代基包括带负电荷的基团。带负电荷的基团应当理解为包括可以在水中去质子化成为带负电荷状态的中性或带正电荷的基团(即pKas在0-14)。合适的带负电荷基团包括羧酸根、磷酸根、膦酸根、硫酸根和磺酸根(以及它们的质子化形式)。优选带负电荷基团在胺和羧酸通过酰胺键偶合的条件下不反应。优选的带负电荷基团包括硫酸根,最优选磺酸根,因为它们具有高度稳定性、低pKa以及对用于胺和羧酸形成酰胺键的偶合反应的条件和试剂相对不敏感(例如金属络合物的一个配体上的磺酸根不会干扰用碳二亚胺使另一配体上的羧酸与含胺试剂的偶合。磷酸根和膦酸根同样有效,尽管它们将会与部分羧酸活化试剂例如碳二亚胺反应,但是当这些反应在水溶液条件下进行,这些反应的产物通常不稳定并且不会影响最终的共轭反应结果。在本发明的另一实施方案中,联吡啶或菲咯啉配体被包括以下的取代基取代:中性亲水性基团,优选羟基或甲酰胺基;或带正电荷基团,优选胍鎓基团(这样的配体也是最优选的,以使其对产生酰胺键的标准条件不敏感)。
设计配体使得包含该配体的有机金属络合物相对于包含未取代的联吡啶或菲咯啉的类似有机金属络合物产生更低的非特异性结合,同时还优选基于每个标记物产生相当(在2倍以内)或更好的ECL信号。带负电荷的基团优选不直接连接到菲咯啉环或联吡啶环,而是通过诸如烷基、链烯基、炔基和/或苯基的连接基连接,这样不会对包含所述配体的有机金属络合物的ECL特性产生有害的影响(例如影响氧化还原特性、发光的量子产量、能量的激发状态或标记物稳定性)。这样的连接基可包括连接链中的杂原子或作为取代基,但是这些杂原子优选不直接连接到联吡啶环或菲咯啉环(例如烷基连接链中的碳可以被氧原子置换形成一个或多个烷基醚键或低聚乙二醇连接基)。优选的连接基为苯基和烷基。尤其优选短(1-5个碳)烷基,因为当结合到连接蛋白的有机金属标记物时,对ECL的影响相对较少并且展开或变性所述蛋白的能力相对较差。最优选单碳连接基,因为它们既屏蔽联吡啶或菲咯啉部分从而隔离低NSB官能团,又不会提供额外的疏水表面积或者显著增加标记物的体积。
对于联吡啶基配体优选在5和5’位被二取代或最优选在4和4’位被二取代,对于菲咯啉基配体优选在3和8位被二取代或最优选在4和7位被二取代;在金属络合物中,这些位置具有很高的可溶性并具有有限的空间位阻。以下为在4和4’位取代的联吡啶和在4和7位取代的菲咯啉的示例性低NSB配体。其它取代形式没有列出但是可以通过类似方法定义。
其中
T=连接基,优选为烷基、链烯基、炔基或苯基连接基或它们的组合,任选其一个或多个链碳被杂原子置换;
Z=-SO3 -、-SO3H、-OSO3 -、-OSO3H、-PO3 2-、-PO3H-、-PO3H2、-OPO3 2-、-OPO3H-、-OPO3H2、-OP(R)O2 -、-OP(R)O2H、-[NHC(NH2)2]+、或-NHC(NH)NH2
n=整数,优选1-5,最优选1
R=烷基,优选甲基。
本发明涉及包含一个前述低NSB配体的有机金属络合物,所述配体螯合了金属原子例如Co、Ni、Cu、Ru、Rh、Pd、Ag、Re、Os、Ir、Pt、Fe、Tc、Cr、Mo和W。这样的络合物的重要类型是Ru和Os、优选Ru(II)或Os(II)氧化状态的发光ECL活性络合物。本发明包括具有式ML2 3的络合物,其中L2为本发明低NSB配体,M为Ru或Os,优选为Ru(II)或Os(II)氧化状态。应当理解的是本文使用的如ML2 3或ML1L2 2的符号并不排除整体带净电荷的络合物(由配体的带电状态和金属的氧化状态确定),并且这样的络合物可以与相反离子结合形成整体为中性的合成物。ML2 3类络合物尤其在这样的情况下有用:使用游离未轭合的ECL活性化合物(参见例如美国专利5,641,623)并且应该减少络合物对大多数电极表面的吸附。
在使用ECL活性络合物为标记物的情况下,特别有用的络合物类型是具有式ML1L2 2的络合物,其中M为Ru或Os(优选为Ru(II)或Os(II)氧化状态),L2为上述的低NSB配体,L1为共价连接以下物质的取代的联吡啶或菲咯啉:生物分子、结合试剂、酶底物或其它分析试剂(即形成标记试剂,其中“标记物”是指标记试剂的金属络合物组分),或者具有一个能够共价连接以下物质形成标记试剂的取代基:生物分子、结合试剂、酶底物或其它分析试剂。这样的配体在此可以被称为连接配体。本文中生物物质是指生物来源的物质或其合成类似物,例如氨基酸、核苷、蛋白质、肽(和拟肽)、核酸(以及具有修饰的碱基或非天然键的类似物,例如PNA)、激素、维生素、糖、第二信使、多糖、类固醇、脂质、磷脂、细胞、细胞器、亚细胞片断、病毒、朊病毒等。结合试剂为能够参与与另一种物质特异性结合作用的试剂。结合试剂的实例包括:酶、抗体(及其片断)、受体、生物受体的配体、金属配体、核酸、核酸嵌入剂、核酸大沟及小沟结合剂、半抗原、抗生物素蛋白、链酶抗生素、生物素、纯化标签(例如FLAG、myc、谷胱甘肽S-转移酶、His标签等)、纯化标签结合配偶体(例如特异性抗体、谷胱甘肽、氮三乙酸、亚氨二醋酸等)等。酶底物包括在酶催化反应中转化的分子,并且包括辅因子、通过酶结合或切割的核酸以及通过酶结合或切割的蛋白。
在配体上存在时适合使配体结合到生物物质、结合试剂、酶底物或其它分析试剂的官能团实例包括共轭化学领域已知的官能团,例如胺、硫醇、酰肼、羧酸、活化的羧酸(例如酰基氯和活性酯如N-羟基丁二酰亚胺酯)、羟基、烷基卤、异氰酸酯、异硫氰酸酯、磺酰氯、活化磷酸酯、膦酸酯或氨基磷酸酯(phosphoramidite)、链烯、炔烃、活性氨基甲酸酯和碳酸酯、醛、酮、马来酰亚胺、二硫化物、α,β不饱和羰基、连接离去基团如卤化物、甲磺酰基、甲苯磺酰基、tresyl等的碳。关于结合标记物至试剂的有用官能团以及有用的共轭技术的详细信息,参阅文献G.Hermanson,A.Mallia和P.Smith,Immobilized Affinity Ligand Techniques(Academic Press,San Diego,1992)以及G.Hermanson,Bioconjugate Techniques(Academic Press,San Diego,1996),这些参考文献通过引用结合到本文。优选的官能团包括胺、羧酸、活性酯,最优选N-羟基丁二酰亚胺酯。优选这样的官能团经由连接基链连接到联吡啶环或菲咯啉环以限制官能团对ECL的影响,所述连接基链包括烷基、链烯基、炔基和/或苯基。这样的连接基可包括连接链中的杂原子或作为取代基,但是这些杂原子优选不直接连接到联吡啶环或菲咯啉环(例如烷基连接链中的碳可以被氧原子置换形成烷基醚或低聚乙二醇连接基)。对于联吡啶基配体优选在5和/或5’位或者最优选在4和/或4’位被取代,对于菲咯啉基配体优选在3和/或8位或最优选在4和/或7位被取代;在金属络合物中,这些位置具有有限的空间位阻。以下为合适的连接配体实例。列出的配体为在4和4’位取代的联吡啶或者在4和7位取代的菲咯啉,然而,其它取代形式的配体结构显然可类推得到。
其中
X=连接基,优选为烷基、链烯基、炔基或苯基连接基或它们的组合,任选链碳被杂原子置换;
Y=H或烷基,优选-CH3;
W=连接至以下物质的官能团:生物分子、结合试剂、酶底物或其它分析试剂,或者存在于配体上时适合结合配体至生物物质、结合试剂、酶底物或其它分析试剂的官能团;
m=整数,优选1-5。
在本发明某些实施方案中,本发明的标记物共价连接另一物质(例如生物物质、结合试剂、酶底物或其它分析试剂)并且用作标记物允许进行所述物质的检测。一个优选实施方案涉及具有[A]i[B]j结构的标记物,其中A为本发明发光金属络合物,B为共价连接至一个或多个A的物质(优选生物物质、结合试剂、酶底物或其它分析试剂),i为大于0的整数,j为大于0的整数(优选1)。共价键可以为共轭化学领域已知的各种共价键,例如酰胺键、胺键、醚、硫醚、氨基甲酸酯、脲、硫脲、Schiff碱、碳碳键、酯、磷酸酯、胺磺酰等。最优选A是具有ML1L2 2结构的金属络合物,其中M为Ru或Os(优选为Ru(II)或Os(II)氧化状态),L2为上述的本发明低NSB配体,并且A和B经由上述连接配体L1上官能团共价连接。本发明的另一个实施方案涉及具有ML1L2 2结构的标记物质,其中其中M为Ru或Os(优选为Ru(II)或Os(II)氧化状态),L2为本发明低NSB配体,L1为连接另一物质(优选生物分子、结合试剂、酶底物或其它分析试剂)的连接配体。以下列出根据本发明该方面的合适L1的实例。列出的配体为在4和4’位取代的联吡啶或者在4和7位取代的菲咯啉,然而,其它取代形式的配体结构显然可类推得到。
其中
X=连接基,优选为烷基、链烯基、炔基或苯基连接基或它们的组合,任选链碳被杂原子置换;
Y=H或烷基,优选-CH3;
B=一种物质,优选生物分子、结合试剂、酶底物或其它分析试剂;
W=与B连接的官能团;
m=整数,优选1-5。
本发明的另一实施方案包括含本发明低NSB配体的发光Re(I)络合物,例如Re(I)(CO)3L3L2,其中L2为以上定义的低NSB配体,优选为带负电荷的官能团,更优选为硫酸根,最优选为磺酸根,L3为Re的单价配体,例如卤离子、CO、有机异腈、炔基、含氮杂环、吡啶或取代的吡啶。优选L3为连接到以下物质的Re的单价配体:生物物质、结合试剂、酶底物或其它分析试剂,或者存在于配体上时适合结合所述配体至以下物质的官能团:生物物质、结合试剂、酶底物或其它分析试剂(这样的试剂、键和官能团具有所述Ru和Os络合物的特性)。L3最优选取代的异腈或吡啶,吡啶优选在3或4位被取代。
本发明的标记物和标记物质可以用于许多使用金属络合物、优选发光金属络合物的已知分析形式,例如基于检测光照发光强度、时间分辨光照发光、发光能量转移、发光猝灭、发光时限、发光偏振、化学发光或优选电化学发光的分析。关于进行ECL分析的方法的例子,参见以下文献:美国专利5,591,581;5,641,623;5,643,713;5,705,402;6,066,448;6,165,708;6,207,369;6,214,552以及公开的PCT申请WO87/06706和WO98/12539,上述文献通过引用结合到本文。优选本发明发光金属络合物的使用使得本发明络合物相对于没有低NSB官能团的类似络合物的非特异性结合低,从而改善分析性能。本发明发光金属络合物的使用优选导致给定分析法改善,特异性与非特异性信号之比大于或等于系数2,或者更优选大于或等于系数5。
在某些应用中,本发明发光金属络合物用作标记物使得可监测分析试剂例如酶底物或结合试剂。我们发现用本发明发光金属络合物标记的试剂相对于用没有低NSB官能团的类似络合物标记的试剂,非特异性结合明显减少。使用本发明发光金属络合物显著降低用于减少非特异性结合的封闭剂的需求量、减少试剂在容器表面和流体内衬的损失以及减少因为标记结合试剂的非特异性作用产生的非特异性信号。当试剂例如抗体和其它蛋白质连接多个标记物时,上述效果最明显。我们制备了连接4-7、7-10、10-15、15-20以及超过20个的标记物,仅观察到少量的非特异性结合。通过增至更高的标记物数/试剂,分析信号可增强(相对于用没有低NSB官能团的发光金属络合物的分析)2-5倍、5-10倍或更高,同时特异性信号对非特异性信号的比例保持不变或显著增加。或者,在获得相同特异性信号的条件下,特异性信号对非特异性信号的比例大大提高。
许多分析形式使用固相载体以使分析物或活性的检测与标记试剂分离进入溶液相和固相支撑部分的分离联系起来。例子包括检测以下内容的固相结合分析:一种物质和其特异性结合配偶体的络合物的形成(这对物质中一种固定在或能够固定在固相载体上)、夹心络合物的形成(包括固定在或能够固定在固相载体上的捕获剂)、两种竞争物质对一种结合配偶体的竞争(结合配偶体或竞争物质之一固定在或能够固定在固相载体上)、标记物(或标记的物质)从固定在或能够固定在固相载体上的试剂酶裂解或化学裂解以及标记物(或标记的物质)酶连接或化学连接至固定在或能够固定在固相载体上的试剂。分析物或活性的量可以通过测量在固相载体上和/或溶液中的标记物数量确定,测量通常经由表面选择性技术、溶液选择性技术或者在分离所述两相后进行。本文使用的术语“能够固定”是指可以在溶液中参与反应并且在随后的检测步骤期间或之前被捕获到固相的试剂。例如,所述试剂可以用其固定在固相上的特异性结合配偶体捕获。或者,所述试剂连接一个捕获部分,而捕获部分的特异性结合配偶体固定在固相上。有用的捕获部分-结合配偶体对的例子包括生物素-链霉抗生物素(或抗生物素蛋白)、抗体-半抗原、受体-配体、核酸-互补核酸等。
在固相结合分析中特别重要的是标记的试剂不会非特异性结合固相,因为该类结合可能导致非特异性信号并且显著降低分析的灵敏度。我们已经在两种ECL分析中测试了用本发明标记物标记的试剂,包括使用磁性颗粒作为固相载体的ECL分析以及使用电极作为固相载体的ECL分析。在两种情况下,与没有低NSB官能团的标记物的分析相比,结果显示使用本发明标记物的分析具有以下优势:用有更多标记物的试剂进行分析(例如4-7、7-10、10-15、15-20以及大于20个标记物/试剂);获得更强的信号(例如增强2-5倍、5-10倍或更多);特异性对非特异性信号的比例更高(例如提高1-2倍,2-5倍或大于5倍)。已经证明本发明标记物特别有利于防止标记物和标记的试剂与含碳电极的非特异性结合,所述含碳电极用作固相分析的载体和/或用作诱发ECL的电极。这样的电极包括含碳纤维或其它碳颗粒的电极,例如含有碳纤维或聚合基质中分散碳颗粒的塑料复合电极。在含有载于某种载体上的薄层碳素墨水的电极上进行的分析中也观察到有益的效果(在同时申请的标题为“Assay Plates,ReaderSystems and Methods for Luminescence Test Measurements”的专利申请中介绍,通过引用结合到本文)。
本发明的另一方面涉及用于进行分析、优选发光分析、更优选电化学发光分析的试剂盒,该试剂盒包含本发明的配体和/或金属络合物以及至少一种选自以下的分析组分:(a)至少一种电化学发光共反应剂;(b)一种或多种结合试剂;(c)一种或多种pH缓冲剂;(d)一种或多种封闭剂;(e)一种或多种防腐剂;(f)一种或多种稳定剂;(g)一种或多种酶;(h)一种或多种酶底物;(i)一种或多种磁性颗粒;(j)一种或多种适合诱发ECL的电极;(k)一种或多种洗涤剂。优选至少一种所述分析组分共价连接本发明的配体或金属络合物。
优选所述试剂盒包含本发明的配体和/或金属络合物以及至少一种分析组分并且装于一个或一个以上、优选两个或两个以上、更优选三个或三个以上的容器中。
根据一个实施方案,试剂盒包含本发明的配体和/或金属络合物以及一种或多种分析组分并且以干燥形式装于一个或多个容器中。
根据一个实施方案,本发明的配体和/或金属络合物以及分析组分装于单独的容器中。
一个优选的实施方案涉及用于电化学发光分析的试剂盒,该试剂盒包含至少一种本发明标记物以及至少一种电化学发光共反应剂。
根据一个优选实施方案,试剂盒包含本发明标记物并进一步包含至少一种选自以下的生物试剂:抗体、抗体片断、蛋白质、酶、酶底物、抑制剂、辅因子、抗原、半抗原、脂蛋白、脂糖(liposaccharide)、细胞、亚细胞组分、细胞受体、病毒、核酸、抗原、脂质、糖蛋白、糖类、肽、氨基酸、激素、蛋白结合配体、药学试剂或它们的组合物。
本发明的另一方面涉及组合物,该组合物包含连接一种分析性物质的本发明金属配体或金属络合物。
本发明的一个实施方案涉及用于检测样品中目的分析物的组合物,该组合物包含:
(i)含官能团的本发明金属络合物;
(ii)连接至所述官能团的分析性物质,所述分析性物质能够结合目的分析物或者已结合目的分析物。
优选所述组合物进一步包含至少一种选自以下的物质:
(i)所加入的目的分析物或所加入的所述分析物的类似物;
(ii)所述分析物的结合配偶体或所述类似物的结合配偶体;
(iii)能够结合(i)或(ii)的反应性组分。
本发明的另一实施方案涉及用于检测样品中目的分析物的组合物,该组合物包含:
(a)本发明金属络合物;
(b)连接所述络合物的分析性物质,其中所述分析性物质包含至少一种选自以下的物质:
(i)所加入的目的分析物或所加入的所述分析物的类似物;
(ii)所述分析物的结合配偶体或所述分析物的类似物的结合配偶体;
(iii)能够结合(i)或(ii)的反应性组分。
本发明的又一实施方案涉及在分析中用作试剂的物质的组合物,该组合物包含结合分析性物质的本发明金属配体或金属络合物以及至少一种选自以下的其它组分:
(a)电解质;
(b)目的分析物或目的分析物的类似物;
(c)目的分析物或其类似物的结合配偶体;
(d)能与(b)或(c)反应的反应性组分;
(e)ECL共反应剂;
但是,条件是任何试剂组合物中不包含这样的两种组分:在贮存期间彼此间具有反应性以至于损害它们在所述预定分析中的功能。
实施例
ECL仪器操作
本文出现的ECL例子通过不同ECL仪器操作完成。使用磁性颗粒作为结合分析的固相载体的某些方法参见美国专利5,935,779;6,133,043;6,200,531。这样的ECL检测涉及收集铂电极上的磁性颗粒、在所述电极上应用电能以及检测发出的光。使用含有分散于聚合基质的碳纤维的复合电极作为结合分析的固相载体以及作为引发ECL的电极的其它例子参见美国专利6,207,369和公开的PCT申请WO98/12539)。上述参考文献中列出的ECL方法和仪器操作通过引用结合到本文。因为电极、仪器操作、光检测器、检测器倍率等不同,所以在不同实施例中报告的ECL信号不应该直接比较。
实施例1合成配体1
将亚硫酸钠(1.3g)加入含1.7g 4,4′-双溴甲基联吡啶(Fraser等,J.Org.Chem.1997,62,9314-9317)的250mL 7∶3水/甲醇混合物的悬浮液中。将混合物回流60min,冷却,然后通过旋转蒸发浓缩至~50%其原体积。剩余的水溶液用2×20mL乙酸乙酯洗涤。将水相通过旋转蒸发浓缩至干。剩余的固体物质进一步高真空干燥。将产物从固体物质萃取到3×100mL沸腾的1%水/甲醇中(在各部分中搅拌固体5min,然后过滤收集上清液)。合并滤液,旋转蒸发浓缩得到粗制固体产物。将产物用水/异丙醇重结晶纯化,用1∶4水/异丙醇、异丙醇和乙醚洗涤获得纯净白色固体。通常产率为约50%,但是可以从重结晶上清液回收产物提高产率。
实施例2.合成络合物2
合成第一步涉及制备配体4-(4-甲基-2,2-联吡啶-4′-基)-丁酸与RuCl3的络合物,采用改进的Anderson等的方法(J.Chem.Research(S)1979,74-75)。将RuCl3水合物(0.94g)与4mL 1N HCl和8mL水混合,通过剧烈搅拌溶解。在混合所得溶液时,加入1.02g配体4-(4-甲基-2,2-联吡啶-4′-基)-丁酸(公开的PCT申请WO87/06706)。将混合物剧烈搅拌36h,在此期间配体-RuCl3络合物从溶液中沉淀。冷却产物悬浮液,过滤收集产物,用1N HCl、水和乙醚洗涤,真空干燥。通常产率为约60%。
将所得络合物(0.47g)与0.78g含磺酸根的联吡啶配体1在75mL乙二醇中混合。回流溶液,通过在455nm的可见吸附监测,以确定产物是否完全形成(少于2.5h)。旋转蒸发除去溶剂(浴温<100℃),将残余物溶于15mL 1N NaOH,在黑暗中保温2h,以水解可能在形成络合物期间形成的任何酯。将溶液用10mM甲酸稀释至750mL,装载于100mL QAE-Sephadex A-25柱(预先用500mM NaCl,10mM甲酸平衡,然后用大量10mM甲酸洗涤)。用0-250mM NaCl的10mM甲酸溶液梯度洗脱产物。通过旋转蒸发浓缩产物部分。大部分的盐通过将固体产物萃取到5×10mL冷甲醇而除去(如果需要可加入少量水),浓缩萃取液,重复萃取过程一次。然后用5∶95∶0.1乙腈/水/三氟醋酸作为洗脱液在反相二氧化硅提纯产物。将反相纯化产物溶于~2mL水中,用1N氢氧化钠调节pH至6-8。将所得溶液应用到100mLSephadex G-15柱,用水洗脱。冷冻干燥产物部分获得纯净橙色固体产物。通常的产率为~50%。三个色谱法步骤可以用单一的QAE-Sephadex A-25纯化步骤替代,其中采用挥发性盐例如醋酸铵梯度。
实施例3合成络合物3
通过以下步骤将络合物2活化为NHS酯。将络合物2(22mg)溶于1mL 40mM HCl。在混合时,加入5.8mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS),然后加入39mg N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)。将反应物在室温下保温30min,随后立即将其通过30mLSephadex G-15柱(在4℃于水中预平衡),用水洗脱。立即冷冻产物部分,并且冷冻干燥至获得纯净橙色固体产物。
实施例4合成配体7
从化合物4经过两个单独烷基化步骤制备中间体5。在惰性气氛下,制备含1.38g 4,4-二甲基-2,2-联吡啶的60mL无水THF溶液,冷却至0℃。在搅拌下滴加5.25mL二异丙基氨化锂(LDA,1.5M的环己烷溶液),在0℃保温30min。加入1.4mL 2-(3-溴代丙氧基)四氢-2H-吡喃,在0℃保温3h。将反应物用饱和NH4Cl猝灭,减压浓缩除去THF。剩余的水溶液用二氯甲烷萃取。有机部分用MgSO4干燥,浓缩,通过二氧化硅色谱法纯化,使用4%甲醇/二氯甲烷作为洗脱液,以95%产率获得单烷基化的产物。将单烷基化产物(1.925g)溶于无水THF,在用于第一步烷基化的条件下与4mL LDA和1.05mL 2-(3-溴代丙氧基)四氢-2H-吡喃反应。反应物逐步用饱和NH4Cl猝灭,用碳酸钾调节pH至~8,将产物萃取到二氯甲烷中,用硫酸镁干燥,用碱性氧化铝(活性I)色谱法纯化,用10%醋酸乙酯/己烷作洗脱剂。从初始原料4至二烷基化中间体5的整体收率为73%。
在酸性条件下将中间体5脱去保护获得二醇6。将中间体5(1.277g)溶于17mL 1∶1 1N HCl/甲醇。将溶液在室温下保温过夜。用浓氢氧化铵将溶液的pH调节至~9,将产物萃取到二氯甲烷中,用硫酸镁干燥,用碱性氧化铝色谱法纯化,用3%甲醇/二氯甲烷作洗脱剂。收集二醇6,产率为84%。
通过二醇6与二氯亚磷酸甲酯反应实现二膦酸酯7的制备。将二醇6(60mg)溶于~8mL吡啶。将大多数吡啶蒸馏除去,剩下~1mL溶液。将剩余溶液在搅拌下滴加到含106mg二氯亚磷酸甲酯和0.5mL二氯甲烷的冷却(0℃)溶液。让反应在0℃进行45min。加入2mL2M碳酸钾猝灭反应。旋转蒸发将溶液浓缩至干。加入水并蒸发除去几次,以除去所有的吡啶。产物通过C18反相柱的HPLC色谱法提纯,采用含0.1%三氟乙酸(TFA)的乙腈水溶液的梯度。
实施例5合成络合物
用配体7、配体4-(4-甲基-2,2-联吡啶-4′-基)-丁酸和RuCl3通过用于从配体1制备络合物2的类似方法制备络合物8。通过反相二氧化硅色谱法(用30%乙腈/水+0.1%TFA作为洗脱剂)、QAE-SephadexA25的离子交换色谱法(用梯度三乙基醋酸铵,pH5.5作为洗脱剂)以及在反相二氧化硅柱脱盐(用梯度乙腈的水溶液+0.1%TFA作为洗脱剂)实现纯化获得TFA盐。
实施例6合成配体9
将含1.02g 4,4′-二羧基-2,2′-联吡啶二甲酯和200mL甲醇的悬浮液加热至沸腾,以溶解尽可能多的二甲酯。在让溶液冷却至室温后,溶液中通入氨气。让反应进行直到TLC显示初始原料消失。过滤收集不溶产物9。
实施例7合成络合物10
将配体9(300mg)与162mg RuCl3水合物的DMF溶液混合,回流过夜。过滤收集不溶的RuL2Cl2中间体,用丙酮和水洗涤。将一部分中间体(49.8mg)与21.8mg配体4-(4-甲基-2,2-联吡啶-4′-基)-丁酸的~100-150mL 1∶1甲醇/水混合,将混合物回流过夜。将所得溶液倾析除去不溶杂质,然后旋转蒸发浓缩。用饱和氯化钠的甲醇溶液作为洗脱剂通过二氧化硅色谱法实现提纯。旋转蒸发除去溶剂后,将产物溶于浓六氟磷酸铵中。将溶液应用于C18二氧化硅柱。用水洗去过量的盐。然后用乙腈洗脱纯净产物10(PF6盐)。
实施例8合成配体11
由4,4′-双羟基甲基-2,2′-联吡啶(在回流乙醇中用硼氢化钠还原4,4′-双-羧基-2,2联吡啶二甲酯制备)与三氧化硫吡啶络合物(SO3pyr)反应制备配体11。将SO3pyr(107mg)加入35.3mg 4,4′-双-羟基甲基-2,2′-联吡啶的0.75mL DMF溶液。在1.5h后,将产物用氯仿沉淀,然后重新溶解于水中。水溶液用氯仿洗涤,用NaOH溶液中和,然后冷冻干燥至粉末。用C18柱和梯度的乙腈水溶液(含0.1%TFA)的反相HPLC提纯产物。
实施例9合成络合物12
将RuCl3水合物(11.7mg)与37.6mg配体11的75mL4∶1甲醇/水溶液混合。将混合物回流4h。加入配体4-(4-甲基-2,2-联吡啶-4′-基)-丁酸(10.3mg),将混合物回流过夜。过滤溶液,通过旋转蒸发浓缩滤液。通过反相色谱法(用乙腈的水溶液梯度)和硅胶色谱法(用甲醇的乙腈溶液作为洗脱剂)提纯产物。
实施例10合成络合物13
将配体4,4′-双-羟基甲基-2,2′-联吡啶(58.7mg)和58.1mg 4-(4-甲基-2,2-联吡啶-4′-基)-丁酸配体与RuCl3(参见实施例2)的络合物在50mL 1∶1甲醇/水中混合。将溶液回流过夜。然后过滤溶液,真空浓缩。将产物溶于5%乙腈/水,填装到C18二氧化硅柱,用66%乙腈/水洗脱。将产物重新溶于含六氟磷酸铵的5%乙腈/水中,装载到C18二氧化硅柱,用40%乙腈/水洗脱获得纯净络合物,收率45%。
实施例11合成络合物14
将RuCl3水合物与2当量4,7-二苯基菲咯啉的DMF溶液混合,回流过夜获得黑色固体沉淀双-二苯基菲咯啉二氯化钌中间体。过滤收集沉淀,干燥,与1当量4-(4-甲基-2,2-联吡啶-4′-基)-丁酸在1∶1二噁烷/水中混合,回流过夜。用乙腈的水溶液(含0.1%TFA)梯度在C18二氧化硅反相HPLC提纯产物。
实施例12合成络合物15
用4,7-二苯基-1,10-菲咯啉二磺酸(钠盐)和[4-(4-甲基-2,2-联吡啶-4′-基)-丁酸]RuCl3按照上述用于制备络合物2的类似方法,除了提纯通过一次反相HPLC(用C18二氧化硅柱和乙腈的水溶液(含0.1%TFA)梯度)实现提纯外,由此制备络合物15。
实施例13合成配体16
将配体4,4′-双-羟基甲基-2,2′-联吡啶(108mg)与520mg N,N′-双-丁氧基羰基-胍以及393mg三苯基膦的20mL 1∶1THF/甲苯溶液混合,冷却至0℃。在30分钟内加入氮杂二羧酸二异丙酯(300μL)。将混合物在0℃搅拌3小时,在室温搅拌3小时。将反应物用5mL水猝灭,真空除去溶剂。用1∶1的甲醇和乙腈混合物研磨获得白色固体。直接使用产物无需再提纯。产物的结构显示胍经由未保护的氮连接至联吡啶;可能已经通过一个受保护的氮键合。
实施例14合成络合物17
将配体16(28.8mg)在0.8mL 1∶1TFA/CH2Cl2中脱去保护。减压除去溶剂,直接使用脱除保护的配体无需再提纯。将脱除保护的配体与络合物[4-(4-甲基-2,2-联吡啶-4′-基)-丁酸]Ru(II)(DMSO)2Cl2(由4.8mg 4-(4-甲基-2,2-联吡啶-4′-基)-丁酸与10.2mg Ru(DMSO)4Cl2在0.6mL甲醇中于室温下反应过夜)在1.0mL乙醇中混合,将反应混合物回流4h。通过SP Sephadex C25离子交换树脂(用TFA的水溶液梯度)以及反相二氧化硅的反相色谱法(用含0.1%TFA的乙腈/水混合物作洗脱剂)提纯产物。
实施例15合成络合物18
将1g(NH4)2OsCl2和4,7-二苯基-1,10-菲咯啉二磺酸(钠盐)在40mL 3N HCl中混合。将混合物在80℃加热2h。冷却溶液,加入碳酸钾水溶液直到pH达到约~9。真空浓缩溶液至干。将另一当量的4,7-二苯基-1,10-菲咯啉二磺酸(钠盐)加入20mL DMF中。将溶液回流8h。在冷却后,将200mg连二亚硫酸钠加入少量水中。将溶液真空浓缩至约10mL,在此之后加入丙酮沉淀出双-二苯基菲咯啉二氯化锇中间体。通过加入丙酮使产物从甲醇中沉淀出来,从而再提纯一次。
将一部分(266mg)双-二苯基菲咯啉二氯化锇中间体与60mg 4-(4-甲基-2,2-联吡啶-4′-基)-丁酸在1∶1二噁烷/水中混合,回流18h。真空浓缩溶液至干,将残余物重新溶于10mL水。在加入200mg六氟磷酸铵后,将溶液再次浓缩至干,残余物用10mL乙腈洗涤。用甲醇作为洗脱剂通过反相二氧化硅提纯产物。
实施例16合成NHS酯
获得[4-(4-甲基-2,2-联吡啶-4′-基)-丁酸]Ru(II)[bpy]2的NHS酯(络合物19)的纯化形式(NHS TAG,IGEN International),或者用相应的羧酸(络合物20)通过下述的一种方法制备其粗制形式。根据实施例3制备含NHS酯的络合物3的纯化形式,或者通过下述的一种方法用络合物2制备其粗制形式。在质子惰性条件下或水中可以制备NHS酯的粗制形式。通常,如果可能则使用质子惰性条件。在通常的质子惰性溶剂中不溶的水溶性络合物可以在水溶液条件下制备。
质子惰性条件:将含羧酸的络合物溶于二氯甲烷,向其中加入稍微过量的NHS和EDC。不溶于二氯甲烷的部分络合物在乙腈或DMF或这些溶剂的混合物中与二氯甲烷反应。在反应完全后(通过HPLC或TLC确定),真空除去溶剂,将粗制产物重新溶于DMF或DMSO,获得用于标记反应的母液。
水溶液条件:20mM含羧酸的络合物的水溶液中依次加入:i)100mM吗啉乙磺酸(MES)缓冲液,pH6.0,50mM NHS和200mMEDC HCl。将反应物保温15-30min。NHS酯产物可以原样使用。在某些试验中,制备NHS酯后立即通过以下一种方法将过量EDC除去:i)用水作为洗脱剂通过Sephadex G-15大小排阻色谱法提纯产物;ii)使产物以钠盐形式通过SP-Sephadex C25短柱,用水洗脱;或者iii)将产物装载于反相色谱法介质,用水/乙腈洗脱。在上述其中一种水溶液条件下制备的NHS酯在制备/提纯后立即使用(如实施例17所述)。
实施例17用NHS酯标记抗体
将抗体以大于或等于2mg/mL的浓度溶于PBS-1缓冲液(150mM磷酸钾,150mM NaCl,pH7.8)。将NHS酯(按照实施例16制备)官能化的ECL标记物加入水、DMF或DMSO中(有机溶剂的最终浓度应该保持在<20%),在室温下反应至少2h。将标记的蛋白质通过Sephadex G-25大小排阻色谱法(带正电和或中性络合物)或SephadexG-50大小排阻色谱法(带负电荷络合物)提纯。由于偶合反应的效率可能因为标记物的不同而变化,所以通常要尝试标记物与蛋白质的不同摩尔比。通过使用比色蛋白质分析法(BCA Assay或CoomassieBlue Assay,Pierce Chemicals)检测蛋白质浓度以及可见吸光度(用于基于钌的标记物通常在455nm)检测标记物的浓度,从而确定纯化产物中每个蛋白质的平均标记物数量
实施例18.用络合物20、8和10标记的抗体在碳电极上进行夹心免
疫测定比较
将含有分散于乙烯-醋酸乙烯(EVA)的碳纳米管(纤维)的塑料复合电极用氨/氮等离子体处理,使纤维暴露在表面,引入胺基团。用SMCC(Pierce Chemical)处理表面,然后使表面与链霉抗生物素(用Traut氏试剂标记以引入巯基)反应,从而引入链霉抗生物素的固定层。
用包被链霉抗生物素的电极的3/16″圆盘作为固相载体,用Elecsys AFP Assay(Roche Diagnostics)的抗体、抗体稀释液和校正稀释剂进行α-胎蛋白(AFP)的夹心免疫测定。Roche试剂盒使用生物素标记的捕获抗体以及络合物20标记的检测抗体。为了比较本发明的标记物,所述试剂盒的标记检测抗体用除了标记用不同量标记物20、8和10(参见实施例17)的同一种抗体替代。使包被链霉抗生物素的电极与捕获抗体、其中一种标记的检测抗体以及含添加了1864ng/mLAFP的校正稀释剂(含牛血清白蛋白和牛IgG的人工血清替代品)的样品接触。使用未添加的校正稀释剂进行阴性对照的操作。使用电极保温分析混合物以使夹心络合物形成,在此之后,所述圆盘用磷酸盐缓冲液洗涤,转移到ECL电池。使复合电极与含三丙基胺的溶液(ORIGEN Assay Buffer,IGEN)接触,扫描复合电极的电势至~2.3V,由此检测ECL。
图1显示非特异性信号(即没有分析物的信号)以及特异性信号(存在分析物的信号和不存在分析物信号的差)。图中显示标记物8(带负电荷膦酸酯基团)和10(带中性亲水性甲酰胺基)获得与常规ECL标记物20大致相同的特异性信号,并且特异性信号对每个蛋白质的标记物数量大致呈线性增加的关系。然而各标记物显示在非特异性结合数量上出人意料的显著不同。标记物20的非特异性信号随每个蛋白质的标记物数量增加呈指数增长。相反,带中性亲水性甲酰胺基的标记物10显示更少的NSB,而带负电荷的标记物8甚至在每个蛋白质的标记物数量很高时也显示可以忽略的NSB。分析信号(S)以及分析信号与背景信号的比(S/B)可以通过使用标记物8改善,这是因为每个抗体的标记物数量可以被提高(相对于常规标记物)而不会增加NSB信号。用标记物8测量的峰S/B比用标记物20测量的相应峰大两倍。使用最优的标记物对蛋白质的比例(通过S/B确定),用标记物8测量的信号比用标记物20的信号强8倍。
实施例19用络合物20、2、15、12、17和15标记的抗体在碳电极
上进行夹心免疫测定的比较
AFP分析按照实施例18的介绍进行,除了在进行分析之前将捕获抗体直接吸附在氧等离子体处理的纤维-EVA复合电极并且校正剂(0和2200ng/mL)在人血清中制备。图2显示用络合物20、2和15标记的抗体的特异性信号大致近似,用含红菲咯啉的络合物15高度标记的抗体除外;我们推测在高标记比例时,大平面芳族结构能够空间位阻结合或变性抗体并且影响其活性。如同在实施例18中也观察到的结果,图2显示用带负电荷配体的络合物标记的抗体的非特异性信号甚至在每个抗体的标记物数量很高时也很弱,然而常规标记物20的非特异性信号随着每个抗体的标记物数量增加呈指数上升。用标记物2获得的最优化S/B比用标记物20获得最优化S/B大5倍。用最优化标记物对蛋白质比例(通过S/B确定),用标记物测定的信号比用标记物20测得的信号大3倍。在类似的分析中(没有列出数据),带硫酸根的络合物(络合物12)标记的抗体表现类似于用络合物2标记的抗体。总的来讲,用络合物15的Os类似物标记的抗体显示类似的低非特异性结合,虽然其特异性信号大致为Ru络合物的30-50%。一般来讲,用非磺酸化的络合物15(即络合物14)标记的抗体甚至在低的标记物对蛋白质的比例下也产生较高的背景信号以及较低的分析信号。我们推测高度疏水性络合物干扰抗体功能。在类似分析中,带大量正电荷的络合物17产生非常高的非特异性信号(在每个抗体~5-6个标记物时,非特异性信号超过络合物2标记的抗体的非特异性信号100倍)。此结果显示带负电荷的络合物的优异特性不仅仅是由于具有亲水性带电基团,而且电荷的正负也很重要。我们推测络合物17可挑选用于某些情况,其中分析在接近带大量正电荷的表面进行(在这些情况下正电荷将有助于防止NSB)。络合物17和含配体16的其它络合物也可能在需要发光标记物吸附到电极上的情况下应用(例如在基于发光传感器、基于ECL的HPLC检测器或ECL显示器使用吸附在电极上的ECL标记物,或者沉积在电极上的薄膜(例如Nation薄膜)中的ECL标记物)。
实施例20用络合物20和2标记的抗体在磁性颗粒上进行夹心免疫
测定的比较
用Elecsys AFP Assay(Roche Diagnostics)试剂进行AFP分析,除了标准检测抗体用不同量20或2标记的同一种抗体替代外。在含封闭蛋白的缓冲溶液中的含已知浓度AFPA(0或1000ng/mL)的样品(0.007mL)与0.035mL生物素标记的捕获抗体(0.0045mg/mL)和0.035mL检测抗体(0.012mg/mL)混合。将反应混合物在室温下保温15min,在此之后加入0.035mL包被链霉抗生物素的磁性颗粒(0.72mg/mL)和0.139mL三丙基胺缓冲溶液(ORIGEN Assay Buffer,IGEN International)。将反应混合物再保温15分钟,此后用ORIGENM-8 Instrument(IGEN International)和ECL检测分析悬浮液。图3显示标记物2产生比标记物20略少的特异性信号,但是产生的非特异性信号则很明显少得多,尤其是高标记数的抗体的非特异性信号更少。用标记物2获得的最佳S/B比用标记物20获得的最佳S/B大两倍。
Claims (61)
1.一种选自以下的联吡啶或菲咯啉配体:
其中,
T是C1-5烷基连接基,任选其一个或多个链碳被杂原子取代;
Z为-SO3H、-OSO3H、-OPO3H2、-OP(R)O2H或-NHC(NH)NH2;
R为甲基。
2.权利要求1的配体,其中T为-(CH2)n-,n为整数1-5。
3.权利要求1或2的配体,其中Z为-SO3H。
4.权利要求1或2的配体,其中Z为-OSO3H。
5.权利要求1或2的配体,其中Z为-OPO3H2或-OP(Me)O2H。
6.权利要求1或2的配体,其中Z为-NHC(NH)NH2。
8.权利要求7的发光金属络合物,其中Z是-SO3H。
9.权利要求7的发光金属络合物,其中Z是-OSO3H。
10.权利要求7的发光金属络合物,其中Z是-OPO3H2或-OP(Me)O2H。
11.权利要求7的发光金属络合物,其中Z是-NHC(NH)NH2。
12.权利要求7的发光金属络合物,其中M是Os(II)。
13.权利要求7的发光金属络合物,其中W是活性酯基。
14.权利要求7的发光金属络合物,其中M是Ru(II)。
15.权利要求7的发光金属络合物,其中T为-(CH2)n-,X为-(CH2)m-,n和m各自为整数1-5。
16.权利要求7的发光金属络合物,其中L2是在4和7位被取代的菲咯啉配体或者L2是在4和4’位被取代的联吡啶配体。
19.权利要求18的发光金属络合物,其中W是活化的羧基。
20.权利要求18的发光金属络合物,其中W为
21.一种包含具有以下结构的发光金属络合物的标记物质:
ML1L2 2
其中
M为Os(II)或Ru(II);
L1选自
L2是选自以下的金属配体:
其中,
T是C1-5烷基连接基,任选其一个或多个链碳被杂原子取代;
W是羧酸基团或选自酰氯和活性酯的活化羧基,并且通过酰胺键与选自氨基酸、核苷、核苷酸、蛋白质、肽、拟肽、核酸和肽核酸的物质键合;
X是C1-5烷基连接基,任选其一个或多个链碳被杂原子取代;
Y是H或甲基;
Z为-SO3H、-OSO3H、-OPO3H2、-OP(R)O2H或-NHC(NH)NH2;
R为甲基。
22.权利要求21的标记物质,其中Z是-SO3H。
23.权利要求21的标记物质,其中Z是-OSO3H。
24.权利要求21的标记物质,其中Z是-OPO3H2或-OP(Me)O2H。
25.权利要求21的标记物质,其中Z是NHC(NH)NH2。
26.权利要求21的标记物质,其中M是Os(II)。
27.权利要求21的标记物质,其中所述物质连接5个或5个以上的所述发光金属络合物。
28.权利要求21的标记物质,其中所述物质连接10个或10个以上的所述发光金属络合物。
29.一种进行基于发光的分析的方法,该方法包括以下步骤:
a)使用包含具有以下结构的发光金属络合物的标记物质:
ML1L2 2
其中
M为Os(II)或Ru(II);
L1选自
L2是选自以下的金属配体:
其中,
T是C1-5烷基连接基,任选其一个或多个链碳被杂原子取代;
W是羧酸基团或选自酰氯和活性酯的活化羧基,并且通过酰胺键与选自氨基酸、核苷、核苷酸、蛋白质、肽、拟肽、核酸和肽核酸的物质键合;
X是C1-5烷基连接基,任选其一个或多个链碳被杂原子取代;
Y是H或甲基;
Z为-SO3H、-OSO3H、-OPO3H2、-OP(R)O2H或-NHC(NH)NH2;
R为甲基;
b)诱导所述金属络合物发光;并
c)检测所述发光。
30.权利要求21的标记物质,其中M是Ru(II)。
31.权利要求21的标记物质,其中T为-(CH2)n-,X为-(CH2)m-,n和m各自为整数1-5。
32.权利要求21的标记物质,其中L2是在4和7位被取代的菲咯啉配体或者L2是在4和4’位被取代的联吡啶。
33.权利要求29的方法,其中
Z为-SO3H。
35.权利要求34的标记物质,其中所述物质连接5个或5个以上的所述发光金属络合物。
36.权利要求34的标记物质,其中所述物质连接10个或10个以上的所述发光金属络合物。
38.一种检测样品中分析物、化学活性或生物活性的方法,该方法包括以下步骤:i)使包含所述分析物、化学活性、生物活性、所述生物活性的产物或所述化学活性的产物的样品与权利要求8的发光金属络合物接触;ii)诱导所述金属络合物发光;iv)检测所述发光以测量所述化学或生物活性。
39.权利要求38的方法,其中所述发光为电化学发光。
40.一种检测标记物质的方法,该方法包括以下步骤:i)使标记物质与结合试剂以及任选性固相载体接触;ii)形成包含所述结合试剂、标记物质以及任选固相载体的结合络合物;iii)诱导标记物质发光;iv)检测所述发光以测量标记物质;其中标记物质用权利要求8的发光金属络合物标记。
41.权利要求40的方法,其中所述标记物质与所述固相接触并且所述结合络合物在所述固相上形成。
42.权利要求40的方法,其中所述发光为电化学发光。
43.一种检测样品中分析物的方法,该方法包括以下步骤:i)使样品与标记性结合试剂以及任选性固相载体接触;ii)形成包含结合试剂、分析物以及任选固相载体的结合络合物;iii)诱导标记性结合试剂中的标记物发光;iv)检测所述发光以测量样品中的分析物;其中所述标记性结合试剂用权利要求8的发光金属络合物标记。
44.权利要求43的方法,其中所述结合络合物在所述固相上形成。
45.权利要求43的方法,其中所述标记性结合试剂与所述固相接触并且所述结合络合物在所述固相上形成。
46.权利要求43的方法,其中所述发光为电化学发光。
47.权利要求43的方法,其中所述分析为夹心分析。
48.权利要求43的方法,其中所述分析为竞争性分析。
49.一种检测样品中分析物的方法,该方法包括以下步骤:i)使样品与分析物的标记类似物、结合试剂以及任选性固相载体接触;ii)形成包含分析物的标记类似物、结合试剂以及任选固相载体的结合络合物;iii)诱导分析物的标记类似物中的标记物发光;iv)检测所述发光以测量样品中的分析物;其中所述分析物的标记类似物用权利要求8的发光金属络合物标记;并且所述分析物类似物与所述分析物竞争结合到所述结合试剂上。
50.权利要求49的方法,其中所述分析物的标记类似物与所述固相接触并且所述结合络合物在所述固相上形成。
51.权利要求49的方法,其中所述发光为电化学发光。
52.一种试剂盒,该试剂盒包括装于一个或多个容器中的:包含具有以下结构的发光金属络合物的标记物质:
ML1L2 2
其中
M为Os(II)或Ru(II);
L1选自
L2为选自以下的金属配体:
其中,
W是羧酸基团或选自酰氯和活性酯的活化羧基,并且通过酰胺键与选自氨基酸、核苷、核苷酸、蛋白质、肽、拟肽、核酸和肽核酸的物质键合;
T是C1-5烷基连接基,任选其一个或多个链碳被杂原子取代;
X是C1-5烷基连接基,任选其一个或多个链碳被杂原子取代;
Y是H或甲基;
Z为-SO3H、-OSO3H、-OPO3H2、-OP(R)O2H或-NHC(NH)NH2;
R为甲基;
以及至少一种选自以下的分析组分:
(a)电化学发光共反应剂;
(b)一种或多种结合试剂;和
(c)一种或多种pH缓冲剂。
53.权利要求52的试剂盒,该试剂盒进一步包含选自以下的一种或多种分析组分:
(a)一种或多种封闭剂;
(b)一种或多种防腐剂;
(c)一种或多种稳定剂;
(d)一种或多种酶;
(e)一种或多种洗涤剂。
54.一种在分析中用作试剂的组合物,该组合物包含以下物质:
(a)一种包含具有以下结构的发光金属络合物的标记物质:
ML1L2 2
其中
M为Os(II)或Ru(II);
L2为选自以下的金属配体:
其中,
W是羧酸基团或选自酰氯和活性酯的活化羧基,并且通过酰胺键与选自氨基酸、核苷、核苷酸、蛋白质、肽、拟肽、核酸和肽核酸的物质键合;
T是C1-5烷基连接基,任选其一个或多个链碳被杂原子取代;
X是C1-5烷基连接基,任选其一个或多个链碳被杂原子取代;
Y是H或甲基;
Z为-SO3H、-OSO3H、-OPO3H2、-OP(R)O2H或-NHC(NH)NH2;
R为甲基;
(b)至少一种选自以下的分析组分:
(i)电解质;
(ii)目的分析物或目的分析物的类似物;
(iii)目的分析物或其类似物的结合配偶体;
(iv)能与(ii)或(iii)反应的反应性组分;
(v)ECL共反应剂;
但是,条件是任何试剂组合物中不包含这样的两种组分:在贮存期间彼此间具有反应性以至于损害它们在所述预定分析中的功能;
其中所述分析物类似物与所述分析物竞争结合到所述结合试剂上。
55.一种用于检测样品中存在的目的分析物的物质的组合物,该组合物包含标记物质,该标记物质包含具有以下结构的发光金属络合物:
ML1L2 2
其中
M为Os(II)或Ru(II);
L2为选自以下的金属配体:
其中,
W是羧酸基团或选自酰氯和活性酯的活化羧基,并且通过酰胺键与选自氨基酸、核苷、核苷酸、蛋白质、肽、拟肽、核酸和肽核酸的物质键合;
T是C1-5烷基连接基,任选其一个或多个链碳被杂原子取代;
X是C1-5烷基连接基,任选其一个或多个链碳被杂原子取代;
Y是H或甲基;
Z为-SO3H、-OSO3H、-OPO3H2、-OP(R)O2H或-NHC(NH)NH2;
R为甲基;
所述分析性物质能够结合至目的分析物或已结合目的分析物。
56.权利要求54的物质组合物,其中所述组合物包含至少一种选自以下的物质:
(i)所加入的目的分析物或所加入的所述分析物的类似物;
(ii)所述分析物的结合配偶体或所述类似物的结合配偶体;
(iii)能够结合(i)或(ii)的反应性组分;
其中所述分析物类似物与所述分析物竞争结合到所述结合试剂上。
57.权利要求2的配体,其中n为1且Z为SO3H。
58.一种发光金属络合物,该络合物由权利要求57的配体和钌原子(II)组成,所述钌原子(II)结合至所述配体的环氮上。
59.权利要求8的发光络合物,其中M为Os(II)。
60.权利要求22的标记物质,其中M为Os(II)。
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