CN1610694A - 淋巴因子制剂和用其局部或局部和系统地控制细胞增生性疾病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开含有有效量的IL－2或其他淋巴因子和具有热可逆性凝胶化性质的生物可降解聚合载体的治疗制剂和使用其局部或局部和系统地控制增生性疾病的方法。该制剂可以肿瘤内/肿瘤周围的施用并且形成一种含有IL－2的贮库制剂。该含有IL－2的贮库制剂提供了IL－2的连续的、持久的释放，足够刺激局部和系统地起作用的细胞毒性T淋巴细胞而不会引起不可接受的副作用。

Description

淋巴因子制剂和用其局部或局部和系统地控制细胞增生性疾病的方法
发明领域
本发明属于定位持续递送淋巴因子到温血动物的领域。具体地讲，本发明涉及治疗用制剂和用其局部或局部和系统地控制细胞增生性疾病的方法。
发明背景
对免疫系统认识的最新发展已经导致了免疫应答的重要调节剂的鉴定，这些免疫调节剂通常称为细胞因子，或者，如果是由淋巴细胞产生，则称为淋巴因子。Rosenberg，Steven A.″The Immunotherapy and GeneTherapy of Cancer.″J.Clin.Oncology 10：180-199(1992)。细胞因子是主要、但不只是由免疫系统的细胞分泌的小蛋白，它们促进其他细胞的增生和/或分化功能。细胞因子的例子包括白介素、干扰素、生血性集落刺激因子(CSF)和促炎因子，如肿瘤坏死因子(TNF)。细胞因子和相关肿瘤调节剂的施用可以使患各种类型肿瘤的病人产生客观肿瘤应答。Sarna，Gregory等，″A Pilot Study of Intralymphatic Interleukin-2.II.Clinical andBiological Effects″，J.Biol.Response Modifiers，9：81-86(1990)。然而，目前的细胞因子施用方式通常伴随着毒性，从而限制了这些药物的治疗价值。
白介素-2(IL-2)是一种由正常外周血淋巴细胞在暴露于植物凝集素、抗原或其他刺激物后产生的淋巴因子，其诱导抗原或有丝分裂原刺激的T细胞的增生，白介素-2首先由Morgan，D.A.等，Science(1976)，193：1007-1008报道。IL-2作用于三种主要类型的淋巴细胞：T细胞、B细胞和NK细胞，刺激它们增生和增强它们的分化功能。IL-2不但通过刺激NK细胞而增强先天性的或天然的宿主防御功能，而且通过刺激T细胞和B细胞增强抗原特异性获得的免疫反应。IL-2最初通过培养人外周血淋巴细胞(PBL)或其他生产IL-2的细胞系得到，描述于，例如美国专利号4,401,756。重组DNA技术提供了PBL和其他细胞系的替代物以生产IL-2。Taniguchi，T.等，Nature(1983)，302：305-310和Devos，R.，Nucleic AcidsResearch(1983)，11：4307-4323报道了在微生物中人IL-2基因的克隆和表达。
美国专利号4,518,584描述并要求保护突变的IL-2蛋白，其中通常在野生型或天然分子的125位发生的半胱氨酸被中性氨基酸(如丝氨酸或丙氨酸)所替代。美国专利号4,530,787和4,569,790公开并要求保护纯化重组天然IL-2及其突变蛋白的方法以及纯化形式的IL-2。美国专利号4,604,377公开了合适于在药学上可接受的水性载体中复制的IL-2组合物，该组合物含有氧化的、微生物生产的重组IL-2。
一些称为辅助T细胞的淋巴细胞亚群在应答肿瘤抗原时分泌少量的IL-2。该种IL-2局部作用于肿瘤抗原刺激位置以激活介导系统性肿瘤细胞破坏的细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞。静脉内、淋巴内和疾病部位内施用IL-2可以使某些癌症患者体内产生临床上重要的应答。已经表明，高剂量的系统性施用重组IL-2导致在小鼠中已经形成的转移性癌的退化，并且在人体内刺激淋巴因子激活的杀伤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞。Rosenberg等，J.Exp.Med.(1985)161：1169-1188；Rosenberg，S.等，NewEng J.Med.(1985)313：1485-1492；Rosenberg等，Science(1986)233：1318-1321)。然而，严重毒性(低血压和水肿)限制了静脉内和淋巴内施用IL-2的剂量和功效。Hoover，H.C.Jr.等.Cancer Res.(1984)，44(4)：1671-6。系统性施用淋巴因子的毒性并不奇怪，因为这些药物介导局部细胞相互作用且它们通常只是微量分泌。此外，其他淋巴因子，如白介素-4(IL-4)、干扰素α(α-INF)和干扰素γ(γ-INF)已被用于刺激肿瘤细胞的免疫应答。像IL-2一样，现今的施用方式具有不利的副作用。
为了解决系统性施用IL-2的毒性问题，一些研究人员已经试验了IL-2的疾病部位内注射。该方法消除了伴随着系统性IL-2施用的毒性。然而，需要多次疾病部位内注射以优化疗效。Bubenik，J.等，ImmunologyLetters.23：287-292(1989/1990)；Borden，Ernest C.和Sondel，Paul MCancer.1990 Feb 1；65(3 Suppl)：800-14；Rosenberg，Steven A.等，108：853-864(1988)。所以，这些注射对许多病人是不切实际的，特别是当没有潜在的发病率并且肿瘤位置无法注射时尤其如此。
美国专利号6,045,788中述及，低剂量的天然和重组IL-2可以连续的施用于病人以延长作用时间，例如长于3月，以激活和/或刺激他们的免疫系统同时又不产生显著的毒性。然而，需要经常施用以延长作用时间，或者，需要最优的缓释制剂，但是在上述专利中没有描述该种缓释制剂。
除了潜在的毒性外，系统性施用IL-2的另一个问题是快速的肾清除。当IL-2被静脉施用时，其很快被清除，最初清除半衰期和末期清除半衰期分别为6到12分钟和40到80分钟。
因此，需要一种IL-2制剂，其在被局部施用于温血动物后形成含IL-2的贮库制剂。该含有IL-2的贮库制剂提供了IL-2的连续的、长期的释放，足以刺激局部或局部和系统地起作用的细胞毒性T淋巴细胞(CTTL)而不产生不可接受的副作用。本发明制剂中另一种用作可注射的或可植入的聚合药物载体的最佳材料应该是可生物降解的和可与药物配伍的，并且施用后能和简单的、安全溶剂(如水)组合，而不需要额外聚合或其他共价键形成的反应。
发明概述
本发明提供了含有具有热可逆性明胶性质的生物可降解的嵌段共聚药物载体和有效量的淋巴因子的治疗制剂，所述制剂可以肿瘤内/肿瘤周围施用并且形成含有淋巴因子的贮库制剂。该含有淋巴因子的贮库制剂提供了连续的、长期释放的淋巴因子(如IL-2)以足够产生局部或局部和系统性作用的细胞毒性T淋巴细胞而不会导致任何显著的不需要的系统性副作用。术语“淋巴因子”指具有IL-2或其他白介素活性的药物，包括天然的、重组的和突变的IL-2或其他白介素及其类似物和衍生物。优选的细胞因子可选自白介素-2(IL-2)、白介素-4、白介素-12和它们的衍生物。
本发明还提供了将高毒性药物，即IL-2或其他淋巴因子转化成具有最小的不可接受的副作用的完全有效的药物的方法，该方法包括将IL-2或其他细胞因子整和到生物可降解药物载体中，局部施用后该载体能够形成含有药物的贮库制剂。优选地，该生物可降解药物载体具有热可逆性明胶的性质，即这些药物载体在体温以下处于液体状态，但当它们受热时转变成凝胶或固态状态，并且在体温或接近体温时以凝胶的形式存在。在该公开的其余部分，将其统称为IL-2，除非另外说明，本发明扩展到此处包括的所有药物。优选IL-2是重组人IL-2。
本发明还提供治疗或预防温血动物宿主肿瘤的方法，该方法包括对所述宿主局部施用含有有效量的IL-2或其他细胞因子的制剂，该制剂用具有热可逆性明胶性质的生物可降解药物载体配制。
本发明可用于治疗/治愈细胞增生性疾病(如癌症或疣)。当局部施用时，本发明制剂提供了直接对待治疗的患病组织，即肿瘤或疣，的高水平IL-2或其他淋巴因子的局部缓释(相对于系统性暴露仍然是较低的总剂量)，刺激在局部位置和全身攻击细胞毒性T淋巴细胞的产生而不会导致不可接受的系统性副作用。如果没有本制剂中使用的药物载体，则由于在CTTL刺激发生前，IL-2从注射位点被快速清除而导致大部分的失效。因为该药，即IL-2或其他淋巴因子，可以刺激机体自身的防御功能从而攻击患病组织，消除了抗药性的潜在问题。因此，本发明提供了通过简单的、低剂量局部注射治疗多种类型的局部和转移性癌症的制剂和方法。本发明制剂可以在每日到每月的范围内间隔地施用。本发明制剂还从定位注射某个剂量的IL-2而提供局部的或局部和系统性的抗癌治疗，如果采用系统施用，该IL-2将是亚治疗的。
附图简述
考虑到下面的详细说明和附图，本发明的其他特征和优点将变得显而易见：
根据实施例1，图1A阐明了IL-2制剂的IL-2体外释放，通过ELISA分析和监测。
根据实施例1，图1B阐明了IL-2制剂的IL-2体外释放，通过细胞增生测定法分析和监测。
根据实施例1，图2阐明了IL-2制剂的细胞毒性测定结果，通过特异性细胞裂解百分比测量。
根据实施例1，图3阐明了施用IL-2制剂对纤维肉瘤肿瘤生长的影响，通过肿瘤大小随时间发生的改变测量。
根据实施例4，图4阐明了IL-2制剂的体外IL-2释放，通过ELISA监测。
根据实施例4，图5阐明了施用IL-2制剂剂量递增对肿瘤生长的影响，通过肿瘤大小随时间发生的改变测量。
根据实施例4，图6阐明了反复施用IL-2制剂对肿瘤生长的影响，通过肿瘤大小随时间的发生的改变测量。
根据实施例4，图7阐明了反复施用IL-2制剂对MetA纤维肉瘤肿瘤模型中小鼠存活率的影响。
根据实施例4，图8阐明了反复施用IL-2制剂对B16黑素瘤肿瘤模型中小鼠存活率的影响。
发明详述
在公开和描述该治疗制剂及用于药物递送(尤其是用于IL-2递送)的使用方法之前，应该明白本发明并不限于此处公开的这些特定的方式、方法步骤和材料。这些方式、方法步骤和材料可以有一定的改变，这些改变均包括在本发明范围内。还应该明白此处所用的术语只是用于描述特定实施方案而并不是要限定本发明的范围，因为本发明的范围只被所附的权利要求书及与其等同物所限定。
必须注意到，该说明书和所附的权利要求书中所用的单数形式包括复数，除非上下文明确地表示单数形式。所以，例如，递送“一种药物”的组合物包括一种、两种或多种药物。在描述和要求保护本发明时，将根据下面列出的定义使用下列术语。
“肠胃外的”指肿瘤内的、肿瘤周围的、疾病部位内的、疾病部位周围的、鞘内的、腹膜内的和腹内的。
术语“细胞增生疾病”包括细胞增生和分化疾病，通常认为是瘤的或恶性的，如癌。癌包括，例如癌、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤等等。术语“癌”还包括前癌组织和细胞，如果不进行治疗的话，它们会发展成真正的癌。细胞增生疾病的其他例子是疣。
术语“治疗性的”治疗指在用本领域的任何方法检测病人患癌后(即确定了患有肿瘤后)，对病人施用一种药物(特别是IL-2)以期减轻或消除存在的肿瘤。
术语“预防性的”治疗指在进行了治疗性治疗后的预防癌症复发的施用。
术语“药理学有效量”指此处的方法或组合物的每种活性成分的量，该量足够显示出对病人有意义的好处，即，延长生命和/或减轻疾病和/或任何临床上显著性的改善。当使用此处定义的有效量时，用组合比单独施用每种成分更有功效。如对患者单独施用一种活性成分，那么该术语只指该成分；当组合使用时，该术语指有治疗或预防效果的制剂中的组合的量。
术语“重组的”指由重组DNA技术生产的药物，其中，对于IL-2这一特例，用已知的重组DNA技术克隆编码IL-2的基因。
术语“药学上可接受的”指一种载体介质，其不干扰药物的生物学活性的有效性且对所施用的宿主没有毒性。
“凝胶化温度”指生物可降解嵌段共聚物经历热可逆性凝胶化的温度。换句话说，低于该温度时，该嵌段共聚物明显是可溶的或以在水中均一的胶状系统存在和以自由流动的液体存在，高于该温度时，该嵌段共聚物经历相变而增加粘度或形成半固态凝胶。术语“凝胶化温度”和“热可逆性凝胶化温度”等等将可以互换使用，表示凝胶化温度。
“聚合物溶液”，“水性溶液”，“溶液”，“均匀溶液”等等当用于表示包含于这样的溶液中的生物可降解嵌段共聚物时，指一种基于水的溶液，该溶液含有功能浓度的溶解于其中的或均一胶状状态的嵌段共聚物，并且该溶液保持在该嵌段共聚物凝胶化温度以下的温度。它们包括没有添加剂的水或含有在制备药物组合物中常用的添加剂或赋形剂(如pH缓冲剂、张力调节组分、抗氧化剂、防腐剂、药物稳定剂等)的水性溶液。
“热可逆性凝胶化”是一种当溶液温度升高到嵌段共聚物的凝胶化温度以上时，该嵌段共聚物溶液自发地增加粘度，许多情况下转变成半固态凝胶。在本发明中，术语“凝胶”包括半固态凝胶和在凝胶化温度以上存在的高粘度状态。当冷却至低于凝胶化温度时，该凝胶在几分钟到几小时之内自发逆转而重新形成较低粘度的自由流动的液体。产生该凝胶的所有相互作用都是物理的，并且不涉及共价键的形成或断裂。
“药物递送液体”或“具有热可逆性凝胶性质的药物递送液体”指含有适合施用于温血动物的药物(药物本身可以溶解、分散或是胶状的)的聚合物溶液。当温度升高到或高于药物递送液体的凝胶化温度时，该含有药物的聚合物溶液形成一种凝胶化药物贮库制剂。
“贮库制剂”指身体中含有浓缩活性物质或药物的局部化位点。形成贮库制剂的制剂的例子为凝胶、植入剂、微球体、基质、微粒等。
“凝胶”指半固相，随着“聚合物溶液”或“药物递送液体”温度升高至或高于嵌段共聚物的凝胶温度，半固相状态自发形成。
“凝胶混合物”或“三嵌段共聚物混合物”指含有两种或两种以上的ABA或BAB三嵌段共聚物组分的热可逆性凝胶系统。通过简单混合两种或两种以上单独合成的三嵌段共聚物组分或者通过在一个合成容器中合成两种或两种以上类型的共聚物系统产生的混合物。用上面两种方法制备的混合物可以与水组合形成聚合物溶液，该聚合物溶液可有相同或不同的凝胶特性和凝胶质量。
“溶液”，“溶解的”和所有其他术语指一种溶液或溶解状态，包括均匀溶液、微束溶液或任何表观上均一的胶体状态，如乳液或悬液。
“生物可降解的”指在身体内可化学分解或降解形成无毒组分的嵌段共聚物。降解的速率可以和药物释放速率相同或不同。
“药物”指可以采用或用于治疗目的的具有生物或药理学活性的任何有机或无机化合物或物质。
“肽”，“多肽”，“寡肽”和“蛋白质”当表示肽或蛋白药物时，将可以互换地使用，并且不限于任何特定的分子量、肽序列或长度、生物活性领域或治疗用途，除非专门说明。
“白介素”指具有白介素活性、特别是IL-2和IL-12活性的任何蛋白质/多肽药物或其衍生物、类似物或模拟物，包括天然和重组IL-2和IL-12，天然和重组白介素的药学上可接受的融合蛋白、它们的衍生物和混合物。
“hIL-2”指显示出具有人白介素-2活性特征的蛋白。特别地，该蛋白必须能够刺激hIL-2依赖的细胞溶解和辅助T细胞系的增生，如S.Gillis等，J.Immunol.(1978)120：2027-2032和J.Watson，J.Exp.Med.(1979)150：1510-1519中的标准测定方法所列出的那样。修饰的IL-2和IL-12也包括在该定义中，只要该修饰没有破坏生物学活性。
“PLGA”指从缩合共聚乳酸和乙醇酸或者通过开环共聚乳酸酯和乙醇酸酯得到的共聚物或共聚物基。术语乳酸和乳酸酯可互换使用；乙醇酸和乙醇酸酯也可互换使用。
“PLA”指通过缩合乳酸或通过开环聚合乳酸酯得到的聚合物。
“PGA”指通过缩合乙醇酸或通过开环聚合乙醇酸酯得到的聚合物。
“生物可降解的聚酯或聚(原酸酯)”指任何生物可降解的聚酯或聚(原酸酯)，其中聚酯优选由选自D，L-乳酸酯、D-乳酸酯、L-乳酸酯、D，L-乳酸、D-乳酸、L-乳酸、乙醇酸酯、乙醇酸、∈-己内酯、∈-羟基己酸、γ-丁内酯、γ-羟基丁酸、δ-戊内酯、δ-羟基戊酸、羟基丁酸、苹果酸和它们的共聚物的单体合成。
“ReGel”是MacroMed Incorporated公司的一类具有热可逆性凝胶性质的低分子量的、生物可降解嵌段共聚物的商品名，如美国专利号6,004,573，6,117,949，6,201,072和6,287,588所述，此处引入作为参考。它还包括待审美国专利申请序号09/906,041和09/559,799公开的组合物，此处将这些专利申请引入作为参考。生物可降解药物载体包含ABA型或BAB型三嵌段共聚物或其混合物，其中A嵌段相对疏水且包含生物可降解聚酯或聚(原酸酯)，B嵌段相对亲水且包含聚乙二醇(PEG)，所述共聚物具有的疏水含量在50.1到83％(重量)之间，亲水含量在17％到49.9％(重量)之间，总嵌段共聚物分子量在2000到8000之间。该药物载体在正常哺乳动物体温以下时显示水溶性，在等于哺乳动物生理体温的温度时，经历热可逆性凝胶化，然后以凝胶存在。该生物可降解的、疏水A聚合物嵌段含有聚酯或聚(原酸酯)，其中聚酯由选自D，L-乳酸酯、D-乳酸酯、L-乳酸酯、D，L-乳酸、D-乳酸、L-乳酸、乙醇酸酯、乙醇酸、ε-己内酯、ε-羟基己酸、γ-丁内酯、γ-羟基丁酸、δ-戊内酯、δ-羟基戊酸、羟基丁酸、苹果酸和它们的共聚物的单体合成且其平均分子量在约600到3000之间。疏水B嵌段片段优选为聚乙二醇(PEG)且其平均分子量在约500到2200之间。
在低于凝胶化温度的温度下，嵌段共聚物是可溶的浓度可以认为是功能浓度。一般来说，可以使用低至3％，高至约50％(重量)的嵌段共聚物浓度，且该浓度仍然是有功能的。然而，优选约5％到40％(重量)的浓度，最优选约10％到30％的浓度。在较低的功能浓度范围内，相变可导致形成稀的凝胶或粘稠的液体，然而对于本发明的目的而言，这些系统仍然是有功能的。
本发明的制剂也可以含有重构增强和可实施试剂，其含有液体聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇衍生物，或PEG和PEG衍生物的混合物，所述PEG或PEG衍生物的分子量在150到1100道尔顿之间。PEG衍生物包含由用选自D，L-乳酸酯、D-乳酸酯、L-乳酸酯、D，L-乳酸、D-乳酸、L-乳酸、乙醇酸酯、乙醇酸它们的共聚物的成员衍生的PEG。该PEG衍生物也可以用R1-CO-O-(PEG)-CO-R2或R1-O-(PEG)-R2表示，其中R1和R2独立选自H和C1到C10的烷基。
生物可降解的共聚物和药物(如IL-2的混合物)可以制备成低于凝胶化温度时的共聚物水性溶液或均一胶体以形成一种IL-2递送液体，其中IL-2可以部分或全部溶解。然后通过递送的局部途径(如肿瘤内或肿瘤周围)对病人施用该IL-2递送液体，于是该IL-2递送液体经历热可逆性凝胶化，因为体温将高于凝胶化温度。这样可以显著减少或者在大多数情况下消除IL-2的系统性毒性并且使得免疫系统对癌细胞的应答最大化。其他对本发明IL-2制剂的可能的施用方式包括在手术介入/肿瘤切除的部位局部施用以杀死术后剩余的癌细胞。治疗恶性肿瘤的其他可能的局部递送途径包括对位于腹膜内的肿瘤/转移进行腹膜内的施用，以及对位于颅内的肿瘤进行颅内的施用。
本发明还提供了将高毒性细胞因子和相关药物(如淋巴因子，包括IL-2、IL-4、IL-12及其衍生物和模拟物)转化成有效的抗癌药物，而使不利的副作用最小化的通用方法。本发明制剂提供了局部贮库制剂的持续递送，该贮库制剂在单个或几个局部化肿瘤位点于肿瘤内/肿瘤周围形成，本发明制剂可使局部的或局部和系统产生免疫应答。
通过在肿瘤内/肿瘤周围形成局部持续的长效药物递送，在肿瘤位点得到了相对高的局部细胞因子稳态浓度。该高局部浓度的IL-2刺激肿瘤特异CTTL的激活和产生，CTTL局部地和全身地供给攻击肿瘤组织，而整个系统的IL-2水平却足够低以避免任何显著的、不可接受的副作用。
本发明的制剂和方法可用于治疗代表以癌症出现的任何肿瘤，包括癌、肉瘤、黑素瘤、骨髓瘤等等，该种癌症可以由任何恶性或前癌组织形成。本发明的制剂和方法提供了将高毒性药物(尤其是细胞因子，如IL-2、IL-4、IL-12和它们的衍生物和模拟物)转变成有效治疗制剂而没有显著的不需要的副作用的一种途径。尽管与系统性治疗所需的IL-2或其他淋巴因子的剂量相比，所施用的总的淋巴因子的剂量降低了一个数量级，但是本发明的制剂仍然提供了更好的或相当的药效。
在本发明的一个实施方案中，IL-2被结合入生物可降解的嵌段共聚物药物载体中，该药物载体具有热可逆性凝胶化性质(ReGel)，该药物载体为可溶形式或以悬液或其他胶体的形式存在且在低于其凝胶化温度下保存。在将该制剂肿瘤内或肿瘤周围地施用于体温高于ReGel凝胶化温度的病人或患病动物(温血哺乳动物宿主)后，其形成局部贮库制剂，能够连续、持续地释放IL-2。该IL-2/ReGel制剂还可以含有各种添加剂，如多元醇，包括糖、表面活性剂、氨基酸、其他蛋白和缓冲盐。这些添加剂可作为特定细胞因子(包括IL-2、IL-4、IL-12和它们的衍生物和模拟物)的注射前(液态)的或注射后(凝胶中位于局部IL-2贮库制剂位点)的功能的和/或生理的稳定剂。
本发明制剂可以施用一次，但优选在每天到每月的基础上反复施用以提供改善的疗效，如肿瘤大小的衰退，这样可长期的控制癌症或使肿瘤完全消失或不再出现。由于生物可降解嵌段共聚物的自发地、体内的、化学的降解而从注射位点快速清除制剂使得在同一注射位点反复施用成为可能，消除制剂的时间从几天到4周，这取决于药物载体的类型。
一般地，本发明的制剂可以肿瘤周围地或肿瘤内地施用于肿瘤位点，该肿瘤位点已经通过成熟的诊断成像技术确诊。一种需要精确定位肿瘤的治疗恶性肿瘤的本发明IL-2制剂的特定途径是对颅内肿瘤的颅内施用。另一种不需要精确定位肿瘤的治疗恶性肿瘤的本发明IL-2制剂的特定途径是对位于腹膜内的原发肿瘤和肿瘤转移的腹膜内IL-2施用。另一种不需要任何复杂成像技术的特定施用途径是皮下注射本发明IL-2制剂到接近位于皮肤的肿瘤，例如原发和转移黑素瘤。另一个特定施用途径是局部施用IL-2制剂于手术介入/肿瘤切除的位点以杀死术后剩余癌细胞。
所施用的最适剂量将取决于癌的类型、宿主类型、肿瘤位置、途径、施用时间表和顺序、已经存在的肿瘤(疾病状态)、细胞因子的类型(尤其是IL-2、IL-4、IL-12和它们的衍生物和模拟物)或者所用的其他淋巴因子。然而，对于本发明的IL-2制剂，通常的范围在1000I.U.到1×108I.U.之间。
本发明的方法包括将药理学有效量的药物(特别是IL-2)施用于温血哺乳动物宿主，包括小鼠、大鼠、兔、灵长类动物、猪或人宿主，优选病人。该系统将不会对周围产生不可接受的毒性或机械伤害，因为该物质的生物相容性和凝胶的柔软性，并且将在特定的时间段内被完全生物降解成乳酸、乙醇酸或其他相应的单体和聚乙二醇。通过适当的设计方案和制备各种药物载体可以控制IL-2的释放速率、凝胶强度、凝胶化温度和降解速度。例如，可以更改A嵌段和B嵌段的重量、含有A嵌段的单体的摩尔百分比、ABA或BAB三嵌段共聚物的分子量和多分散性。还可通过调整药物递送液体中的聚合物浓度来控制IL-2的释放。
将含有IL-2的聚合物溶液，即药物递送液体的剂量形式施用于机体。然后由于嵌段共聚物的热可逆性凝胶化性质，当制剂的温度升高到体温时，该制剂自发地凝胶化而形成药物贮库制剂。在大多数情况下，该IL-2将制成约1000I.U.到1×108I.U./ml的药物递送液体。在某些情况下，可以通过向水性溶液或悬浮液中加入各种添加剂来提高白介素的功能性或物理稳定性。可以使用添加剂，如多元醇(包括糖)、氨基酸、表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、张力调节剂、其他蛋白和一些盐。这些添加剂可以结合进药物递送液体中。
似乎最有效的剂量是可以使肿瘤体积减小、完全消失或不再出现的，并且对宿主无毒或有可接受的毒性的剂量。这个最优剂量水平将取决于许多因素，例如，宿主类型和癌类型、施用途径、时间表和顺序、存在的肿瘤、IL-2的类型和毒性的定义。
在本发明的一个实施方案中，IL-2(20×106I.U.)与ReGel组合形成一种液体制剂，然后该液体制剂注射于肿瘤周围。当IL-2/ReGel的温度上升到体温时，其在注射部位形成凝胶，该贮库制剂提供了延长的释放，其中IL-2缓慢而持续的释放若干天。从凝胶释放的IL-2具有活性并局部和系统地刺激CTTL。相反，传统制剂(即没有ReGel载体)中的IL-2的单次注射已被证明在控制肿瘤生长中是无效的。因此，本发明IL-2/ReGel制剂提供了局部或局部和系统地抗癌治疗，而如果系统地给药，局部注射IL-2剂量将是亚治疗的。
下面的实施例用以阐明本发明组合物的制备方法和使用该组合物的方法。
实施例1
本实施例阐明本发明的IL-2制剂的IL-2的体外释放。
本实施例中的生物可降解嵌段共聚物载体是嵌段共聚物的23wt％的溶液，该嵌段共聚物的PLG/PEG-1000的重量比为2.4，L/G摩尔比为75/25，分子量为4,000道尔顿，凝胶化温度为14℃。
将一定体积(1mL)的含有50,000I.U.(3μg)IL-2(Proleukin，可从Chiron购得)无菌IL-2制剂以一式两份置于50mL组织培养瓶的底部。在存在25mL组织培养液(RPMI 1640，Bio Whittaker，Inc.)的条件下于37℃孵育摇瓶。在预先选取的时间点取出等份试样(0.5mL)的释放培养液并且在适当稀释后分析IL-2含量。通过特异性酶联免疫测定(OptEIAHuman IL-2 Set，Pharmingen)和(在3H-胸腺嘧啶掺入细胞后用CTTL-20指示细胞的)定量细胞增生测定(37℃孵育24小时)分析IL-2含量。对于定量细胞增生测定，用IL-2的标准系列稀释液制作剂量反应曲线。所得结果以累积的IL-2的释放随时间改变的函数表示(图1A，IL-2用ELISA测量，图1B，IL-2用细胞增生测定测量)。两种方法都表明，IL-2的释放是定量的，延续3到4天，并且释放的IL-2具有完全的生物活性。
实施例2
用与实施例1中描述的相同IL-2制剂，该实施例阐明了从本发明制剂释放的IL-2诱导细胞毒性淋巴细胞的能力。
将含有递增剂量的IL-2(Proleukin；12,500I.U.；25,000I.U.；50,000I.U.)的如实施例1所述的一定体积(0.5mL)的无菌IL-2制剂以一式两份置于25mL组织培养瓶的底部。在存在25mL含有鼠脾细胞的组织培养液(RPMI 1640，Bio Whittaker，Inc.)的条件下于37℃孵育摇瓶3天。收获活化的淋巴细胞并在51Cr释放测定法中分析它们杀死RD-995纤维肉瘤肿瘤细胞的能力，结果以测定肿瘤细胞溶解的百分比(％)表示。如图2所示，与在释放开始时加至释放介质中的游离IL-2相比，由ReGel中释放的IL-2具有完全生物活性。图2中的E∶T的比代表效应细胞(活化的淋巴细胞)与靶细胞(RD-995肿瘤细胞)的比，每个样品(104)中靶细胞的数量保持恒定。总之，从本发明制剂中释放的IL-2具有完全的生物活性，并且该制剂可用作持续的局部肿瘤周围的IL-2体内递送的有效递送系统。
实施例3
该实施例通过在小鼠中单次肿瘤周围注射本发明IL-2制剂阐明了肿瘤的退化。
对小鼠(C3H/HEN)皮下植入RD-995纤维肉瘤肿瘤细胞。当实体瘤的大小生长至4-5mm时，对小鼠(分成每组6只)注射0.2mL如实施例1的IL-2制剂，肿瘤周围的对侧每一侧0.1mL。该IL-2制剂含有递增剂量即100,000I.U.；250,000I.U.或500,000I.U.的IL-2。在对照组中，仅注射药物载体。每隔1天连续3周测量肿瘤大小(图3)。相对于对照组，每组中肿瘤的生长受到了阻滞。
实施例4
该实施例阐明了从凝胶化温度高于20℃的药物载体中IL-2的体外释放。
该实施例中的生物可降解聚合物载体是嵌段共聚物的13wt％的溶液，该嵌段共聚物的PEG(1000)/PEG(1450)的重量比为20/80，PLG/PEG的重量比为2.06，L/G摩尔比为85/15，分子量为4,800道尔顿，凝胶化温度为26℃。
将一定体积(1mL)的含有50,000I.U.(3μg)IL-2(Proleukin)无菌IL-2制剂以一式两份置于50mL组织培养瓶的底部。在存在25mL组织培养液(RPMI 1640，Bio Whittaker，Inc.)的条件下于37℃孵育摇瓶。在预先选取的时间点取出等份试样(0.5mL)的释放培养液并且在适当稀释后分析IL-2含量。通过特异性酶联免疫测定(OptEIA Human IL-2 Set，Pharmingen)分析IL-2含量。用IL-2的累积释放对时间作图(图4)。在4天内，负载于ReGel中的IL-2以生物活性形式从凝胶贮库制剂中定量的体外释放。
实施例5
该实施例阐明了在小鼠中单次肿瘤周围注射IL-2制剂的肿瘤退化。该IL-2制剂和实施例4中描述的相同。
对小鼠(C3H/HEN)皮下植入RD-995纤维肉瘤肿瘤细胞。当实体瘤的大小生长至4-5mm时，对小鼠(分成每组10只)注射0.2mL IL-2制剂(肿瘤周围的对侧每一侧0.1mL)。该IL-2制剂含有递增剂量的IL-2(500,000I.U.；2,000,000I.U.或4,000,000I.U.)。在对照组中，肿瘤周围注射只有ReGel的制剂(无药物)或传统的IL-2制剂(500,000I.U.)。每隔1天、连续26天测量肿瘤大小(图5)。相对于对照组，每个ReGel/IL-2组中肿瘤的生长受到阻滞约3周。施用后在第3天和第5天测量每组动物的血压。所有血压值都保持在生理范围内，并且没有检测到不利的血压降低作用，这表明本发明的IL-2制剂没有产生不利的副作用。
实施例6
该实施例阐明了在小鼠中每周肿瘤周围注射IL-2制剂引起的肿瘤退化。该IL-2制剂和实施例4描述的相同。
对小鼠(C3H/HEN)皮下植入RD-995纤维肉瘤肿瘤细胞。当实体瘤的大小生长至4-5mm时，对小鼠(分成每组10只)注射0.2mL IL-2制剂(肿瘤周围的对侧每一侧0.1mL)。该IL-2制剂含有2,000,000I.U.的IL-2。在对照组中，肿瘤周围注射只有药物载体的制剂(无药物)或传统的IL-2制剂(500,000I.U.)。用传统的IL-2制剂(180,000I.U.)系统施用(S.C)，一天两次(B.I.D)，连续5天(小鼠中系统性IL-2的最大耐受剂量)，治疗另一个对照组。除了传统的系统性B.I.D组外，该施用在第7、14和21天重复一次。每隔1天测量肿瘤大小(图6)。相对于对照组，在IL-2制剂组中肿瘤的生长受到阻滞约41/2周。在第一次施用后的第8天测量每组动物的血压。所有血压值都保持在生理范围内，并且没有检测到不利的血压降低作用。
实施例7
该实施例阐明在MethA腹膜内肿瘤小鼠模型中IL-2制剂的每周腹膜内注射的作用。该IL-2制剂和实施例4中的相同。
用106 MethA纤维肉瘤肿瘤细胞腹膜内注射小鼠(Balb C)。3天后(第0天，图7)，用0.2mL含有递增剂量的IL-2(100,000I.U.；500,000I.U.或2,000,000I.U.)的IL-2制剂腹膜内注射小鼠(分成每组10只)。对照组由有肿瘤没治疗的小鼠、无药制剂注射的小鼠、用传统系统性IL-2(180,00I.U.S.C.B.I.D.x5天)治疗的小鼠和用500,000I.U.传统IL-2腹膜内注射的小鼠组成。除了传统的系统性B.I.D.组之外，在第7、14、21、28和35天每周重复注射。跟踪小鼠的存活(图7)。结果表明，与用传统IL-2制剂的阳性对照相比，施用本发明的IL-2制剂得到较好的存活数据。
实施例8
该实施例阐明了对有B16黑素瘤实体瘤的小鼠每周肿瘤周围注射本发明IL-2制剂的存活率。该IL-2制剂和实施例4中描述的相同。
对小鼠(C57/B16)皮下植入B16黑素瘤肿瘤细胞。当实体瘤的大小生长至4-5mm时，对小鼠(分成每组8只)注射0.2mL本发明IL-2制剂(肿瘤周围的对侧每一侧0.1mL)。该IL-2制剂含有2,000,000I.U.的IL-2。在对照组中，肿瘤周围注射只有药物载体的制剂(无药物)或传统的IL-2制剂(2,000,000I.U.)。在第7、14、21、28和35天重复施用。跟踪小鼠的肿瘤生长和存活率。在第1、2、3、4和5天(第一次施用后)测量血压并在第14、15、16、17和18天(第三次施用后)在每个动物组中重复测量。所有血压值都保持在生理范围内，并且没有检测到不利的血压降低作用。然而和对照组相比，用本发明IL-2制剂的组中的肿瘤生长不仅显著地延缓，而且与用传统IL-2制剂的阳性对照相比，施用本发明的IL-2制剂得到较好的存活数据(图8)。
实施例9
该实施例阐明了在小鼠中每周肿瘤周围注射IL-2制剂引起的系统性免疫性活化作用，药物载体和实施例1中描述的相同。
对小鼠(C3H/HEN)皮下植入两个肿瘤，用RD-995纤维肉瘤肿瘤细胞在每胁植入一个肿瘤。当实体瘤的大小生长至4-5mm时，对小鼠(分成每组10只)注射0.2mL实施例1中所述的制剂，仅在右侧肿瘤(5只小鼠)或左侧肿瘤(5只小鼠)注射含有2,000,000I.U.的IL-2，肿瘤周围对侧每一侧0.1ml。对照组由含有两个肿瘤而没有治疗的小鼠、只注射药物载体的小鼠(5只小鼠在左侧肿瘤注射，5只小鼠在右侧肿瘤注射)和用传统IL-2制剂(2,000,000I.U.)肿瘤周围注射的小鼠(5只小鼠在左侧肿瘤注射，5只小鼠在右侧肿瘤注射)组成。在每组中，在相同的预先选择的肿瘤位点每周重复施用，连续8周。在IL-2/制剂组中，治疗的和未治疗的肿瘤的生长都受到阻滞(或肿瘤完全退化)，而在对照组中，两个肿瘤都继续生长。因此，IL-2制剂组的存活数据比对照组(包括肿瘤周围用传统IL-2治疗组)得到的数据要优，这表明用本发明IL-2制剂才得到了系统性免疫应答。
实施例10
该实施例阐明了在小鼠中每周肿瘤周围注射IL-2制剂对系统性免疫性活化作用。药物载体和实施例4中描述的相同。
对小鼠(C3H/HEN)皮下植入两个肿瘤，用RD-995纤维肉瘤肿瘤细胞在每胁植入一个肿瘤。当实体瘤的大小在4-5mm时，对小鼠(分成每组10只)注射0.2mL实施例4所述的IL-2制剂，仅在右侧肿瘤(5只小鼠)或左侧肿瘤(5只小鼠)注射含有2,000,000I.U.的IL-2，肿瘤周围对侧每一侧0.1ml。对照组由含有两个肿瘤而没有治疗的小鼠、只注射药物载体的小鼠(5只小鼠在左侧肿瘤注射，5只小鼠在右侧肿瘤注射)和用传统IL-2制剂(2,000,000I.U.)肿瘤周围注射的小鼠(5只小鼠在左侧肿瘤注射，5只小鼠在右侧肿瘤注射)组成。在每组中，在相同的预先选择的肿瘤位点每周重复施用，连续8周。在IL-2制剂组中，治疗的和未治疗的肿瘤的生长都受到阻滞(或肿瘤完全退化)，而在对照组中，两个肿瘤都继续生长。因此，IL-2制剂组的存活数据比对照组(包括肿瘤周围用传统IL-2治疗组)得到的数据要优，这表明用本发明IL-2制剂才得到了系统性免疫应答。
上面的实施例只是用于阐明的目的，而不是也不应解释为以任何方式对本发明的限制。在本发明的精神和范围内可以对本发明的化合物和方法做各种修改。对本领域技术人员显而易见的是，在本发明范围内可以作各种修改，本发明范围仅仅由下面的权利要求书和等同物所限制。

Claims (10)

1.一种局部施用一种淋巴因子予温血动物以提供局部的或局部和系统的疗效的制剂，该制剂含有
a)有效量的一种淋巴因子；
b)生物可降解的ABA-或BAB-型三嵌段共聚物，它包含：
i)含有生物可降解的聚酯或聚(原酸酯)的51到83％(重量)的生物可降解的疏水A嵌段，和
ii)含有聚乙二醇(PEG)的17％到49％(重量)的亲水B嵌段，所述三嵌段共聚物平均分子量在约2000到4990之间，并且具有热可逆性凝胶化性质；和
c)一种重构增强和可实施剂，其含有聚乙二醇(PEG)、PEG衍生物或PEG与PEG衍生物的混合物，所述PEG或PEG衍生物的平均分子量为150到1100道尔顿；
其中所述制剂在施用后形成一种含有淋巴因子的贮库制剂并连续地、持久地释放淋巴因子。
2.根据权利要求1的制剂，其中所述淋巴因子选自白介素-2(IL-2)、白介素-4、白介素-12、它们的衍生物和模拟物。
3.根据权利要求1的制剂，其中在施用前该制剂是可注射的液体。
4.根据权利要求1的制剂，该制剂还含有生物相容性添加剂，所述添加剂选自包括糖的多元醇、表面活性剂、氨基酸、蛋白质、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲盐和它们的等价试剂。
5.根据权利要求1的制剂，其中PEG衍生物由被选自D，L-乳酸酯、D-乳酸酯、L-乳酸酯、D，L-乳酸、D-乳酸、L-乳酸、乙醇酸酯、乙醇酸和它们的共聚物的成员衍生的PEG组成。
6.根据权利要求1的制剂，其中PEG衍生物由R1-CO-O-(PEG)-CO-R2或R1-O-(PEG)-R2代表，其中R1和R2独立选自H和C1到C10的烷基。
7.一种局部地或局部地和系统地控制温血动物中增生性疾病的方法，该方法包括：
a)制备权利要求1到6的淋巴因子制剂，
b)将所述制剂施用于所述温血动物的增生性疾病发生的部位附近或之中，
c)使所述制剂形成含有淋巴因子的贮库制剂，该贮库制剂提供了淋巴因子的连续、持久的释放而得到局部的和系统性的疗效同时没有产生不可接受的副作用。
8.根据权利要求7的方法，其中所述增生性疾病是癌或疣。
9.根据权利要求7的方法，其中该施用通过选自肿瘤内、肿瘤周围、疾病部位周围、疾病部位内、鞘内、腹膜内和腹腔内的肠胃外的方式进行。
10.根据权利要求7的方法，其中该制剂每天或每月施用。
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