CN1578836A

CN1578836A - 可溶性吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶变异体

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Publication number: CN1578836A
Application number: CNA018212158A
Authority: CN
Inventors: P·克拉茨施; R·施穆克; D·邦克; Z·邵; D·蒂姆; W·-R·克纳佩
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2000-10-27
Filing date: 2001-10-20
Publication date: 2005-02-09
Anticipated expiration: 2021-10-20
Also published as: PL205561B1; US20030104595A1; EP1332216A1; AU1596602A; WO2002034919A1; JP2004512047A; EP1332216B1; BRPI0114962B1; KR20030048447A; JP3845618B2; US20060148056A1; CA2427029C; PL362548A1; CN1288246C; AU2002215966B2; KR100519902B1; HK1074217A1; ATE520777T1; US20040005683A1; US7132270B2

Abstract

本发明涉及可溶性吡咯并喹啉醌(PQQ)依赖性葡萄糖脱氢酶(s－GDH)的改良变异体、编码突变型s－GDH的基因、对葡萄糖具有改进的底物专一性的s－GDH突变蛋白以及这些s－GDH变异体的不同应用，特别是用来测定样品中的糖、尤其是葡萄糖的浓度。

Description

可溶性吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶变异体

本发明涉及可溶性吡咯并喹啉醌(PQQ)依赖性葡萄糖脱氢酶(s-GDH)的改良变异体、编码突变型s-GDH的基因、对葡萄糖具有改进的底物专一性的s-GDH突变蛋白以及这些s-GDH变异体的不同应用，特别是可用来测定样品中的糖、尤其是葡萄糖的浓度。

两种类型的PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.99.17)已被表征：一种是膜结合葡萄糖脱氢酶(m-GDH)，另一种是可溶性葡萄糖脱氢酶(s-GDH)。两种类型均不共享任何显著的序列同源性(Cleton-Jansen，A.M.等，Mol Gen Genet 217(1989)430-6；Cleton-Jansen，A.M.等，AntonieVan Leeuwenhoek 56(1989)73-9；Oubrie，A.等，Proc Natl Acad Sci USA96(1999)11787-91)。它们在其动力学以及其免疫学特性方面也是不同的(Matsushita，K.等，Bioscience Biotechnology & Biochemistry 59(1995)1548-1555)。

醌蛋白利用醌作为辅因子以使醇、胺和醛糖氧化成它们相应的内酯、醛和醛糖酸(Duine，J.A.Energy generation and the glucosedehydrogenase pathway in Acinetobacter(不动杆菌属中的能量产生和葡萄糖脱氢酶途径)，载于″The Biology of Acinetobacter″(1991)295-312，New York，Plenum Press；Duine，J.A.，Eur J Biochem 200(1991)271-84，Davidson，V.L.，″Principles and applications of quinoproteins″(1993)全书，New York，Marcel Dekker；Anthony，C.，Biochem J 320(1996)697-711；Anthony，C.和Ghosh，M.，Current Science 72(1997)716-727；Anthony，C.，Biochem Soc Trans 26(1998)413-7；Anthony，C.和Ghosh，M.，Prog Biophys Mol Biol 69(1998)1-21)。在醌蛋白中，含有非共价结合辅因子2，7，9-三羧基-1H-吡咯并[2，3-f]喹啉-4，5-二酮(PQQ)的那些醌蛋白构成最大的亚组(Duine 1991，参见上文)。迄今为止已知的所有细菌葡萄糖脱氢酶都属于该亚组，其中PQQ为辅基(Anthony和Ghosh1997，参见上文，Goodwin和Anthony 1998，参见上文)。

在细菌中，存在两种完全不同类型的PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶(EC1.1.99.17)：可溶性类型(s-GDH)和膜结合类型(m-GDH)(Duine等，1982；Matsushita等，1989a，b)。m-GDH广布于革兰氏阴性细菌中，然而，仅仅在不动杆菌属(Acinetobacter)菌株如乙酸钙不动杆菌(A.calcoaceticus)(Duine，1991a；Cleton-Jansen等，1988；Matsushita和Adachi，1993)和鲍氏不动杆菌(A.baumannii)(JP 11243949)的壁膜间隙中发现了s-GDH。

通过搜索序列数据库，在大肠杆菌(E.coli)K-12和Synechocystis sp.中鉴定出两个与全长乙酸钙不动杆菌s-GDH同源的序列。另外，分别在铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和百日咳博德特氏菌(Bordetellspertussis)的基因组中也发现了两个与乙酸钙不动杆菌s-GDH同源的不完全序列(Oubrie等1999a)。这四种尚未表征的蛋白质导出的氨基酸序列与乙酸钙不动杆菌s-GDH密切相关，其中位于推定活性位点的许多残基是绝对保守的。这些同源蛋白可能具有相似的结构并且催化相似的PQQ依赖性反应(Oubrie等，1999a)。

已经发现细菌s-GDH和m-GDH具有相当不同的序列和不同的底物专一性。例如，乙酸钙不动杆菌含有两种不同的PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶—一种是在体内有活性的m-GDH，另一种被称为s-GDH，仅可以显示体外活性。Cleton-Jansen等(1988；1989a，b)克隆出编码所述两种GDH酶的基因并且测定了这两种GDH基因的DNA序列。在m-GDH和s-GDH之间没有明显的同源性，证实m-GDH和s-GDH代表两种完全不同的分子的事实。

已经将得自乙酸钙不动杆菌的s-GDH基因在大肠杆菌中克隆在前导序列和强启动子之后。在所述细胞中合成后，s-GDH穿过细胞质膜被转运到壁膜间隙(Duine，J.A.Energy generation and the glucosedehydrogenase pathway in Acinetobacter(不动杆菌属中的能量产生和葡萄糖脱氢酶途径)，载于″The Biology of Acinetobacter″(1991)295-312，New York，Plenum Press，Matsushita，K.和Adachi，O.Bacterialquinoproteins gluscose dehydrogenase and alcohol dehydrogenase(细菌醌蛋白葡萄糖脱氢酶和醇脱氢酶)，载于″Principles and applications ofQuinoproteins″(1993)47-63，New York，Marcel Dekker)。同得自乙酸钙不动杆菌的天然s-GDH一样，在大肠杆菌中表达的s-GDH也是一种同二聚体，其中每个单体具有一个PQQ分子和三个钙离子(Dokter等，1986，参见上文，1987，参见上文，1988，参见上文；Olsthoorn，A.和J.Duine，J.A.，Arch Biochem Biophys 336(1996)42-8；Oubrie，A.等，J MolBiol 289(1999)319-33，Oubrie，A.等，Proc Natl Acad Sci USA 96(1999)11787-91，Oubrie，A.等，Embo J 18(1999)5187-94)。s-GDH将各种各样的单糖和二糖氧化成相应的酮，酮再进一步水解成醛糖酸，并且s-GDH也能够将电子提供给PMS(吩嗪硫酸甲酯)、DCPIP(2，6-二氯酚靛酚)、WB(Wurster氏蓝)和短链泛醌例如泛醌Q1和泛醌Q2(Matsushita，K.等，Biochemistry 28(1989)6276-80；Matsushita，K.等，Antonie VanLeeuwenhoek 56(1989)63-72)、若干人工电子受体例如N-甲基二甲基苯基吡唑酮鎓硫酸甲酯(Olsthoorn，A.J.和Duine，J.A.，Arch BiochemBiophys 336(1996)42-8；Olsthoorn，A.J.和Duine，J.A.，Biochemistry 37(1998)13854-61)和导电聚合物(Ye，L.等，Anal.Chem.65(1993)238-41)。

鉴于s-GDH针对葡萄糖的高比活(Olsthoorn，A.J.和Duine，J.A.，Arch Biochem Biophys 336(1996)42-8)及其广泛的人工电子受体特异性，所述酶非常适合于各种分析应用，特别适合用于诊断应用中葡萄糖测定的(生物)传感器或试纸条中(Kaufmann等，1997，参见上文)。

葡萄糖氧化可以被至少三组相当不同的酶即NAD依赖性葡萄糖脱氢酶、与染料连接的葡萄糖脱氢酶、黄素蛋白葡萄糖氧化酶或醌蛋白GDH催化(Duine 1995)。已经观察到还原型s-GDH的相当慢的自动氧化，证明对于s-GDH而言，氧是一种非常差的电子受体(Olsthoorn和Duine 1996)。s-GDH可以有效地将电子提供给PMS、DCPIP、WB和短链泛醌例如Q1和Q2，但是它不可以有效地将电子直接提供给氧。

用于监测例如糖尿病患者血液、血清和尿中葡萄糖水平的传统试纸条和传感器使用葡萄糖氧化酶。然而，由于葡萄糖氧化酶可将其电子传递给氧，因此氧对基于该酶的葡萄糖测量结果可能有负面影响是已知的。PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶的主要优点是其与氧无关。这一重要的特征例如在US 6,103,509中有论述，在所述专利中，对膜结合GDH的某些特征进行了研究。

对该领域的一个重要贡献是将s-GDH与合适的底物在一起使用。基于s-GDH的测定方法和试纸条装置的细节公开于US5,484,708。该专利也包括关于建立测定和用于葡萄糖测量的基于s-GDH的试纸条生产的详细信息。其中所述方法以及所引用的文献中所述的方法都通过引用结合到本文中。

与该领域相关并且包括关于具有葡萄糖脱氢酶活性的酶的各种应用模式的具体信息的其它专利或申请是US 5,997,817、US 6,057,120、EP 620 283和JP 11-243949-A。

使用s-GDH和当发生反应时产生颜色变化的指示剂的商业系统(Kaufmann等1997)是由Roche Diagnostics GmbH提供的Glucotrend^系统。

尽管有以上讨论的重要优点，但是s-GDH也存在重大的固有问题。与m-GDH相比，s-GDH具有相当广的底物谱。也就是说，s-GDH不仅氧化葡萄糖，而且氧化若干其它糖类，包括麦芽糖、半乳糖、乳糖、甘露糖、木糖和核糖(Dokter等1986a)。针对除葡萄糖以外的糖类的反应性在某些情况下可能削弱测定某些糖尿病患者血葡萄糖水平的准确度。具体地说，用艾考糊精(葡萄糖聚合物)治疗的腹膜透析患者可能在其体液例如血液中含有高水平的其它糖、尤其是麦芽糖(Wens，R.等，Perit Dial Int 18(1998)603-9)。

因此，临床样品例如得自糖尿病患者、尤其是肾脏并发症患者且尤其是透析中的患者的临床样品可能含有显著水平的其它糖、尤其是麦芽糖。对得自这类临界患者的样品进行葡萄糖测定可能因麦芽糖而削弱。

在文献中有关试图产生表现出底物专一性改变的、经修饰的PQQ依赖性s-GDH的报道极其罕见。由于得到阴性结果，因此这些研究中的大多数尚未发表。Igarashi，S.等(1999)报道了，在位置Glu277上引入一个点突变产生底物专一性分布改变的突变体。然而，这些突变体中没有一个产生例如与木糖、半乳糖或麦芽糖相比对葡萄糖改进的专一性至少增加至两倍。

可以总结出，已知本领域目的在于改进s-GDH特性、尤其是改进其针对葡萄糖专一性的尝试尚未成功地达到用于准确监测也具有高水平的除葡萄糖以外的糖的患者体内葡萄糖水平所需的程度。

因此，非常需要并且临床要求特征为对葡萄糖作为底物的专一性改进的s-GDH的突变形式。

本发明的任务是提供与对其它所选糖分子例如半乳糖或麦芽糖相比对葡萄糖的底物专一性得到显著改进的s-GDH的新型突变体或变异体。

令人惊奇地发现，与对其它糖的底物专一性相比，显著改进s-GDH对葡萄糖的底物专一性并且至少部分克服本领域已知的上述问题是可能的。

与对其它所选糖分子相比对葡萄糖的底物专一性通过提供如下文和所附权利要求书中所述的、按照本发明的突变型s-GHD而得到显著改进。由于新形式的s-GDH改进的底物专一性，因此在各种应用领域中对葡萄糖测定的显著技术进步是可行的。

发明概述：

现在令人惊奇地发现，提供与其它所选糖相比针对葡萄糖作为底物的底物专一性改进的s-GDH突变体是可能的。公开了表现出对葡萄糖的底物专一性明显更高(尤其与麦芽糖相比)的新型s-GDH变异体。

也公开了突变型s-GDH分子，与野生型酶相比，所述突变型s-GDH分子表现出对葡萄糖作为底物的比活基本相等，但对其它所选糖分子的活性显著降低。

突变体对各种其它底物分子之一的比活的这种比较，基于野生型酶例如从乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)分离的酶的原始酶活性，并且相对于所述原始酶活性进行计算。

也提供表现出改进的特性、尤其是增加对葡萄糖的专一性的s-GDH突变蛋白以及编码这类蛋白的多核苷酸序列。

已经发现，在对应于已知来自乙酸钙不动杆菌的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：24)、选自位置348和428的位置的氨基酸位置上包含至少一个氨基酸取代的s-GDH突变体，提供具有改进的特性、尤其对葡萄糖具有改进的专一性的s-GDH酶。在位置348上包含一个取代的变异体对葡萄糖专一性表现出惊人的正面影响。

可以使用所述经改进的s-GDH突变体，对于具体检测或测定生物样品中的葡萄糖、尤其在试纸条装置或生物传感器中测定生物样品中的葡萄糖具有有很大好处。

提供以下实施例、参考文献、序列表和附图以有助于理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求书中叙述。不用说在不违背本发明精神的情况下，可以对所述方法进行各种修改。

附图说明

图1：乙酸钙不动杆菌PQQ依赖性可溶性葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸(DNA)序列和相应的氨基酸序列(SEQ ID NO：23)。

图2：按照序列同源性比对的乙酸钙不动杆菌PQQ依赖性s-GDH(上面)和鲍氏不动杆菌s-GDH(下面)的蛋白质序列。

图3：在实施例1中提及的、含有可溶性PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶的野生型或突变型DNA序列的pACSGDH载体的说明。

图4：在实施例1中提及的、含有可溶性PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶的野生型DNA序列的pACSGDH载体的核苷酸(DNA)序列(SEQ IDNO：25)。

发明详述：

在第一个实施方案中，本发明涉及也称为PQQ依赖性可溶性葡萄糖脱氢酶(s-GDH)的可溶性形式EC 1.1.99.17的突变体，所述突变体的特征为与相应的野生型酶相比并且相对于至少一种其它所选糖底物而言，所述突变体具有至少两倍对葡萄糖的改进底物专一性。

本发明中给出的说明可容易地应用于任何已知或者甚至尚未了解的s-GDH分离物。可以使用这些野生型分离物来评价在对由其产生的变异体的专一性方面的相对改进。

对应于SEQ ID NO：24的乙酸钙不动杆菌型菌株LMD 79.41的野生型酶是熟知的并且已被充分地表征。在正在研究中的不同野生型酶尚未充分地表征的情况下，最好使用来自乙酸钙不动杆菌型菌株LMD79.41的s-GDH作为参比对照。在再一个优选的实施方案中，将s-GDH改良变异体的特性与该野生型酶进行比较。因此，本发明也涉及s-GDH突变体，所述突变体的特征为与SEQ ID NO：24的野生型酶相比并且相对于至少一种其它所选糖底物而言，所述突变体对葡萄糖的底物专一性至少增加两倍。

如上所述，在EC1.1.99.17之下被分组在一起的、具有葡萄糖脱氢酶活性的两个完全不同的酶家族迄今已被表征。然而，这两个酶家族似乎互不相关。

对于本发明而言，只有可溶性形式的GDH(s-GDH)是有关的并且其改良变异体将在下文中论述。

本领域知道，可溶性PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶的野生型DNA序列可以从不动杆菌属的菌株中分离出来。最优选的是从乙酸钙不动杆菌型菌株LMD 79.41中分离出来。该野生型s-GDH(成熟蛋白)的序列在图1和SEQ ID NO：24中给出。不动杆菌属的其它LMD菌株也可以用作野生型s-GDH的来源。可以将这类序列与从乙酸钙不动杆菌中获得的序列进行序列比对，并且可以进行序列比较(参见图2)。筛选其它细菌菌株的DNA文库也似乎是可行的，如例如以上关于大肠杆菌K-12所述的(Oubrie，A.等，J Mol Biol 289(1999)319-33)，然后鉴定在这类基因组中与s-GDH相关的序列。可以用这类序列和尚未鉴定的同源序列来产生对葡萄糖具有改进的底物专一性的s-GDH突变体。

在本发明意义上，术语“突变体”或“变异体”是指与相应的野生型序列相比表现出至少一个氨基酸取代的s-GDH蛋白。本领域的专家将会认识到，有以产生编码这种突变型s-GDH的多肽序列的多核苷酸的各种各样的可能性。当然产生包含氨基酸的一个或多个添加或缺失的突变体也是可能的。

按照本发明的突变体的特征为与相应的野生型酶相比，所述突变体与对至少一种其它所选糖底物相比对葡萄糖的底物专一性至少增加两倍。

为了计算底物专一性或交叉反应性，一种容易的方法是将用葡萄糖作为底物测量的活性定为100％并且将用其它所选糖所测量的活性对葡萄糖的数值进行比较。有时为了不累赘，仅仅使用术语专一性，而不一方面特别提及葡萄糖，另一方面特别提及所选其它糖底物。

本领域的专家将会认识到，最好采用严格限定的测定条件以等摩尔浓度的所研究底物分子进行(反应性)活性的比较。否则必须对浓度方面的差异进行校正。

必须选择标准化和严格限定的测定条件，以便评价专一性(在专一性方面的改进)。s-GDH对葡萄糖作为底物以及对其它所选糖底物的酶活性如实施例6所述进行测量。

根据这些测量结果，评价交叉反应性和专一性(在专一性方面的改进)。

s-GDH对所选糖的(交叉)反应性的百分比如下计算：

交叉反应性[％]＝(对所选糖的活性/对葡萄糖的活性)×100％。

按照以上公式，野生型s-GDH对麦芽糖的(交叉)反应性测定为约105％。野生型s-GDH对半乳糖的(交叉)反应性测定为约50％(参见表1)。

按照以下公式，计算(改进的)专一性：

与野生型酶相比，相对于对麦芽糖而言对葡萄糖(麦芽糖/葡萄糖)的专一性具有至少两倍改进的s-GDH形式，用麦芽糖作为底物测定的活性至多为用葡萄糖作为底物测定的活性的52.5％。或者，如果例如突变型s-GDH对麦芽糖的交叉反应性为20％(如上所述测定和计算)，则与野生型s-GDH相比，该突变体具有5.25倍的改进底物专一性(麦芽糖/葡萄糖)。

术语对底物的“底物专一性”是本领域众所周知的，最好用来描述每蛋白质量的酶活性。采用葡萄糖或其它糖作为底物来测定GDH分子比活的各种方法对本领域而言是已知的(Igarashi，S.等，BiochemBiophys Res Commun 264(1999)820)。实施例部分将详细描述其中一种可用于该测量的方法。

当选择许多不同的糖分子并且研究在与任一种这样的所选糖分子相比时s-GDH的葡萄糖专一性是可能的情况下，最好选择临床上相关的糖分子进行这样的比较。优选的所选糖选自甘露糖、阿洛糖、半乳糖、木糖和麦芽糖。更优选选择麦芽糖或半乳糖，然后测试突变型s-GDH对葡萄糖与半乳糖或麦芽糖相比的改进的底物专一性。在一个更优选的实施方案中，所选糖为麦芽糖。

令人惊奇地发现，突变型s-GDH在例如对麦芽糖与葡萄糖的葡萄糖专一性方面的改进相当大。因此，更优选与对所选其它糖底物中的至少一种的底物专一性相比，对葡萄糖的所述底物专一性至少改进3倍。其它优选的实施方案包括特征为对葡萄糖的改进的底物专一性为对其它所选糖分子相比的底物专一性的至少5倍或者更优选至少10倍的s-GDH突变体。

s-GDH中的突变在许多情况下产生对底物葡萄糖的比活显著降低的酶变异体。然而，对底物葡萄糖的这种在(绝对或总体)比活方面的减少对于常规应用可能是重要的。令人惊奇地发现，对葡萄糖的改进的专一性不一定会以显著降低总体比活为代价。因此，优选针对底物葡萄糖具有改进的专一性的s-GDH表现出用野生型酶测量的对葡萄糖比活的至少10％。当然更优选这样的突变型酶表现出野生型s-GDH的相应葡萄糖活性的至少20％或者更优选至少50％。

在一个更优选的实施方案中，本发明涉及可溶性形式EC1.1.99.17也称为PQQ依赖性可溶性葡萄糖脱氢酶(s-GDH)的突变体，所述突变体的特征为

a)针对葡萄糖的底物比反应性基本上等于野生型酶对葡萄糖的底物比反应性，且

b)针对麦芽糖的底物比反应性为与野生型酶相比的30％或30％以下。

如果维持野生型酶对葡萄糖的原始酶活性的至少50％，则认为针对葡萄糖的底物比反应性(也称为比活)基本上等于野生型酶针对葡萄糖的底物比反应性。另外，优选表现出测定的野生型酶对葡萄糖的比活的至少80％或更优选至少90％的突变体。

十分令人惊奇地发现，有可能获得与野生型s-GDH相比表现出基本上等于对葡萄糖的酶活性、但却显著降低针对其它所选糖、尤其针对麦芽糖的底物比反应性的这类s-GDH突变体或变异体。优选特征为针对葡萄糖的底物比反应性基本上等于野生型酶针对葡萄糖的底物比反应性以及特征为针对麦芽糖的底物比反应性为与野生型酶相比的20％或20％以下的突变体。更优选这样的突变体：对于麦芽糖的比活为用相应的野生型酶测定的麦芽糖比活的15％或者甚至只有10％或10％以下，而对葡萄糖的比反应性基本上等于相应的野生型酶对葡萄糖的比活。

在野生型酶尚未充分表征的情况下，优选使用来自乙酸钙不动杆菌型菌株LMD 79.41作为参比物。在一个更优选的实施方案中，将s-GDH的改良变异体的特性与该野生型酶进行比较，因此，本发明涉及s-GDH的突变体，所述突变体的特征为与SEQ ID NO：24的野生型酶相比，所述突变体表现出对葡萄糖的基本相等的酶活性，但是却显著降低(至少70％以下)针对至少一种其它所选糖底物的底物比反应性。

意外发现了产生具有改进的底物专一性的s-GDH突变体是可能的，甚至更意外地发现了在该方面只有几个充分确定的氨基酸位置具有重要相关性。

本发明的成就通过参考已知来自SEQ ID NO：24—从乙酸钙不动杆菌型菌株LMD 79.41分离出来的s-GDH的野生型序列的氨基酸位置进行更加详细地描述。在对应于SEQ ID NO：24位置的不同s-GDH分离物中的氨基酸位置，通过合适的序列比较可容易地鉴定出来。优选运用PileUp程序来评价这类序列之间的同源性或同一性。下文给出的氨基酸位置应该理解为SEQ ID NO：24的氨基酸位置或在其它s-GDH分子中与其相应位置的氨基酸位置，除非具体参考不同的SEQ ID NO或不同的s-GDH分离物。为了避免累赘，仅在几种情况下，具体在下文给出在可以以同样方式修饰的不同分离物中的相应位置，而为了方便起见，在大多数情况下，仅仅使用SEQ ID NO：24的相应位置。

已经发现在对应于s-GDH的位置348的位置上包含一个氨基酸取代的突变体对葡萄糖的专一性表现出惊人的效应。如表1中所证明的，可以鉴定并且产生对葡萄糖具有改进的专一性的各种各样的s-GDH变异体，只要至少在位置苏氨酸348中的氨基酸—对应于来自乙酸钙不动杆菌的野生型s-GDH的序列位置—被一个合适的其它氨基酸取代。

因此，本发明的一个优选实施方案涉及一种PQQ依赖性s-GDH突变蛋白，所述突变蛋白在对应于已知来自乙酸钙不动杆菌的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：24)的348位的氨基酸位置上包含一个氨基酸残基取代。

也发现在对应于SEQ ID NO：24的位置348和428的氨基酸位置上的氨基酸的组合取代，对于产生对葡萄糖具有显著改进专一性的s-GDH突变体或变异体是有利的。

从现有技术并未了解到从乙酸钙不动杆菌型菌株LMD 79.41分离的s-GDH的残基348或428影响归因于s-GDH的底物结合(Oubrie，A.等，Embo J 18(1999)5187-94，；Oubrie，A.和Dijkstra，B.W.，Protein Sci 9(2000)1265-73)。对于这些氨基酸残基的取代为何能改变s-GDH对葡萄糖与其它感兴趣的糖分子相比的底物专一性没有现成的化学或物理学解释。

另外还发现，76号氨基酸的取代也对s-GDH的葡萄糖专一性有正面影响。

在一个更优选的实施方案中，突变型s-GDH的特征为348位的氨基酸残基苏氨酸被选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸的氨基酸残基取代。在一个最优选的实施方案中，用甘氨酸来取代348位的苏氨酸。

按照本发明的一组优选的s-GDH变异体在位置348和以下位置76、143、168、169和428中的至少一个位置包含一个氨基酸残基的取代。

在再一个更优选的实施方案中，PQQ依赖性s-GDH的突变蛋白在来自乙酸钙不动杆菌的相应野生型序列的位置428包含一个氨基酸残基取代，其中野生型序列的天冬酰胺残基被其它合适的氨基酸残基取代。这样的氨基酸残基最好选自亮氨酸、脯氨酸和缬氨酸。优选428位的天冬酰胺被脯氨酸取代。

再者，已经证明76位的氨基酸谷氨酰胺可以被取代，以解决s-GDH与其它糖分子的交叉反应性所带来的问题。通过基于SEQ IDNO：3的同源性搜索，可容易地鉴定出其它s-GDH分离物中对应于该序列位置的序列位置。因此，在另一个优选的实施方案中，按照本发明的突变体在来自乙酸钙不动杆菌的相应野生型序列的位置76包含一个谷氨酰胺的取代。

在对应于SEQ ID NO：24中的位置76的位置上在这种取代中所用的氨基酸最好选自丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和丝氨酸。

如上所述，可以用在对应于从乙酸钙不动杆菌中分离的野生型序列的s-GDH序列的348位的氨基酸取代，来显著提高s-GDH的葡萄糖专一性。通过提供包含至少两个氨基酸取代的s-GDH突变蛋白，获得进一步改良的突变体，其中对应于SEQ ID NO：24的氨基酸位置348的氨基酸被取代。

因此，本发明的再一个实施方案是在对应于已知来自乙酸钙不动杆菌的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：24)的位置的氨基酸位置上包含至少两个氨基酸残基取代的突变型s-GDH，所述取代氨基酸位置选自位置16、22、76、116、120、127、143、168、169、171、177、227、230、231、245、255、277、295、299、308、317、341、348、349、355、422、428和438，其中氨基酸残基T348被取代。更优选的是具有所述至少两个取代氨基酸残基的s-GDH变异体包含一个348位的取代和至少一个额外的、选自位置76、143、168、169和428的取代。

在一个更优选的实施方案中，在突变型s-GDH中被取代的至少两个氨基酸位置选自氨基酸位置76、348和/或428。

已经发现在对应于位置348和428的氨基酸残基上包含取代的突变体，对于改进s-GDH对葡萄糖与其它糖底物相比的专一性是非常有利的。尤其优选的是设计并选择s-GDH的突变体，所述突变体在位置348和428上均包含一个取代。最优选的是在这两个位置上包含如上所述的优选取代的突变体。最优选包含T348G和N428P的s-GDH变异体。

本领域已知术语T348G和N428P是指348位的苏氨酸被甘氨酸取代以及428位的谷氨酰胺被脯氨酸取代。

除包含348和428位的取代外，也包含76、127和143位的取代的s-GDH突变蛋白也代表本发明的优选实施方案。

按照本发明的s-GDH突变蛋白的其它优选实例包含76和348位的氨基酸取代，并且这类突变体也包含76和428位的取代。在再一个优选实施方案中，按照本发明的s-GDH突变蛋白包含76、348和428位的氨基酸残基的取代。

在再一个更优选的实施方案中，按照本发明的s-GDH变异体包含至少三个氨基酸取代，所述至少三个取代氨基酸残基对应于已知来自乙酸钙不动杆菌的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：24)的氨基酸位置，所述取代氨基酸位置选自位置171、227、230、245、341、348、349和428，其中氨基酸残基T348和N428均被取代。这类三重突变体优选包含以下取代中的至少一个：Y171G、H227F、P230H、E245D或M341V。

对葡萄糖具有高度改进的专一性的优选s-GDH变异体包含348和428位的取代以及245或341位或者它们两者的取代。

氨基酸序列分析揭示出，一方面来自乙酸钙不动杆菌以及另一方面来自鲍氏不动杆菌的野生型s-GDH中发现的序列基序，似乎在本发明所鉴定的对于改进对葡萄糖的专一性非常重要的位置周围是非常保守的，所述位置即对应于来自乙酸钙不动杆菌的野生型s-GDH的位置76、348和428(参见图2)。

因此，按照本发明的一个优选实施方案是一种PQQ依赖性s-GDH的突变蛋白，所述突变蛋白包含WPXaaVAPS的氨基酸序列(SEQ IDNO：1)，其中所述Xaa残基为一个除苏氨酸以外的氨基酸残基。SEQ IDNO：1对应于乙酸钙不动杆菌野生型s-GDH的位置346-352或者对应于鲍氏不动杆菌野生型s-GDH的位置347-353。

更优选的是这样的s-GDH突变体，其中SEQ ID NO：1中的所述Xaa为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸，最优选Xaa为甘氨酸。

本发明的另一个优选实施方案是PQQ依赖性s-GDH的突变体，所述突变体包含TAGXaaVQK的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述Xaa残基为一个除天冬酰胺以外的氨基酸残基。SEQ ID NO：2对应于乙酸钙不动杆菌野生型s-GDH的位置425-431或者对应于鲍氏不动杆菌野生型-GDH的位置426-432。

包含SEQ ID NO：2的s-GDH突变体的特征最好为所述Xaa残基选自亮氨酸、脯氨酸和缬氨酸，最优选Xaa为脯氨酸残基。

本领域知道产生突变蛋白的多种可能性。根据本发明公开了氨基酸位置348和428非常重要以及位置76的效用的重大发现，技术人员现在可以容易地产生s-GDH的其它合适的变异体。这样的变异体例如可以通过称为随机诱变(Leung，D.W.等，Technique 1(1989)11-15)和/或定向诱变(Hill，D.E.等，Methods Enzymol 155(1987)558-68)的方法获得。产生具有所需特性蛋白的一种替代方法是提供含有来自至少两种不同来源的序列元件的嵌合构建体，或者全合成合适的s-GDH基因。本领域已知的这些方法可以与本发明中公开的信息联合使用，以提供在对应于SEQ ID NO：24的位置348和/或428的序列位置上包含至少一个氨基酸取代的s-GDH突变体或变异体。

按照本发明的s-GDH变异体可以例如通过从分离自乙酸钙不动杆菌型菌株LMD 79.41的s-GDH基因开始以及通过从同源序列开始来产生。在本申请的正文中，术语“同源的”是指包含从其它微生物中分离的野生型s-GDH，条件是与SEQ ID NO：24相比的序列同源性为至少90％。换句话说，在运用PileUp程序进行合适的序列比对后，该s-GDH的至少90％氨基酸与SEQ ID NO：24中所述的氨基酸相同。

人们将会知道，DNA序列和氨基酸序列的变异是天然存在的或者可以采用本领域已知的方法有意引入。这些变异可以在总体序列中导致至多10％氨基酸差异，所述差异是由于与SEQ ID NO：24相比所述序列中一个或多个氨基酸残基的缺失、取代、插入、倒位或添加所致。这样的氨基酸取代可以例如基于所涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质方面的相似性来进行。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有不带电荷的极性头基或非极性头基、具有相似的亲水性数值的氨基酸包括下述氨基酸：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸。考虑的其它变异包括前述多肽的盐和酯以及前述多肽的前体，例如具有N末端取代(例如用作前导序列的甲硫氨酸)的前体、N-甲酰甲硫氨酸。在无需偏离本发明的范围和精神的情况下，可以制备这样的变异。

按照现有技术中已知的方法或者按照实施例部分给出的方法，有可能获得编码如上讨论的任一s-GDH突变体的多核苷酸序列。因此，本发明也包括编码如上所述的s-GDH突变蛋白的分离多核苷酸序列。

本发明还包括包含有效连接能够指导其在宿主细胞中表达的启动子序列的按照本发明的核酸序列的表达载体。

本发明还包括包含有效连接能够指导其在宿主细胞中表达的启动子序列的按照本发明的核酸序列的表达载体。优选的载体是诸如图3和图4所示pACSGDH的质粒。

可用于本发明的表达载体通常含有一个复制起点、一个位于所述DNA序列上游的启动子，后接编码全部或部分s-GDH变异体的DNA序列。编码全部或部分所述s-GDH变异体的DNA序列后接转录终止序列和其余的载体部分。所述表达载体也可以包括本领域已知的其它DNA序列，例如为表达产物提供稳定性的稳定性前导序列、为表达产物提供分泌的分泌性前导序列、允许调节结构基因表达的序列(例如通过在生长培养基中存在或不存在营养素或其它诱导物)，制备能够在转化宿主细胞中提供表型选择的序列以及为限制性内切核酸酶的切割提供位点的序列。

使用的实际表达载体的特征必须与待使用的宿主细胞匹配。例如，当在大肠杆菌细胞系统中克隆时，表达载体应该含有从大肠杆菌细胞基因组中分离的启动子(例如lac或trp)。各种大肠杆菌宿主中的合适复制起点包括例如ColEl质粒复制起点。合适的启动子包括例如lac和trp。也优选所述表达载体包括编码选择标记的序列。所述选择标记最好是抗生素抗性基因。作为选择标记，可以方便地使用氨苄青霉素抗性或卡那霉素抗性。所有这些材料是本领域已知的并且是市售的。

含有所需编码序列和控制序列的合适表达载体可以采用本领域已知的标准重组DNA技术来构建，所述技术中的许多技术在Sambrook等(1989)中有描述。

另外，本发明还涉及含有表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含编码全部或部分突变型s-GDH的DNA序列。所述宿主细胞最好含有包含具有表1中所示的一个或多个突变的所述DNA序列之一的全部或部分的表达载体。更优选的是含有包含能够指导编码全部或部分突变型s-GDH的DNA序列的复制和/或表达的一个或多个调节DNA序列并且与其有效连接的表达载体的宿主细胞。合适的宿主细胞包括例如大肠杆菌HB101(ATCC 33694)(可得自Pomega(2800 Woods HollowRoad，Madison，WI，USA))、XL1-Blue MRF(可得自Stratagene(11011North Torrey Pine Road，La Jolla，CA，USA))等。

可以通过本领域已知的各种方法，将表达载体导入宿主细胞中。例如，通过聚乙二醇介导的原生质体转化法(Sambrook等，1989)，可以实施用表达载体转化宿主细胞。然而，也可以使用用于将表达载体导入宿主细胞的其它方法，例如电穿孔、基因枪注射(biolistic injection)或原生质体融合。

一旦将含有s-GDH变异体的表达载体导入合适的宿主细胞中，则可以在允许所需s-GDH变异体表达的条件下培养所述宿主细胞。含有含编码全部或部分突变型s-GDH的DNA序列的表达载体的宿主细胞例如可通过以下通用方法中的一个或多个进行鉴定：DNA杂交、标记基因功能存在与否、根据在宿主细胞中s-GDH mRNA转录物的产生所测定转录水平的评价以及用免疫学方法检测基因产物。转化宿主细胞最好通过酶测定例如比色检测来鉴定。

本发明也公开了s-GDH变异体的产生和筛选。随机诱变和饱和诱变按照本领域已知的方法来进行。分析变异体对葡萄糖、麦芽糖以及其它糖的底物专一性。修改所选择的测定条件，以确保可以测定例如由一个氨基酸取代引起的预期小的增加。通过调节测定条件，使得野生型(或亲代)酶活性接近检出下限，做到这一点。合适突变体的一种选择或筛选模式在实施例3中给出。用这种方法可以清楚地检测出与野生型酶相比的任何变化或改进。

当然，应当理解，并不是所有的表达载体和DNA调节序列都同样好地用来表达本发明的DNA序列。对于同一种表达系统而言，也不是所有的宿主细胞都可以同样好地起作用。然而，在不需过度的实验并且也不会偏离本发明的范围的情况下，本领域技术人员可以采用本文中提供的指南在表达载体、DNA调节序列和宿主细胞中做出选择。

本发明也涉及产生本发明s-GDH变异体的方法，所述方法包括在适合于产生本发明的突变型s-GDH的条件下，培养本发明的宿主细胞。对于细菌宿主细胞而言，常用的培养条件是含有合适抗生素和诱导剂的液体培养基。常用的合适抗生素包括氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素等。常用的诱导剂包括IPTG、葡萄糖、乳糖等。

优选本发明的多肽通过在表达编码所述突变型s-GDH的DNA序列的宿主细胞中进行生产来获得。本发明的多肽也可通过体外翻译由编码突变型s-GDH的DNA序列编码的mRNA来获得。例如，可以如上所述合成所述DNA序列，将其插入到合适的表达载体中，所述表达载体进而可以用于体外转录/翻译系统中。

包含与能够在无细胞肽合成系统中启动其表达的启动子序列有效连接的以上限定和描述的分离多核苷酸的表达载体，代表本发明的另一个优选实施方案。

然后，可以采用各种常规蛋白质纯化技术，分离并纯化例如通过如上所述的方法产生的多肽。例如可以使用色谱法，例如离子交换色谱、凝胶过滤色谱和亲和色谱。

本发明的改良s-GDH变异体的主要应用之一是用于试纸条，以监测糖尿病患者的血葡萄糖水平。由于PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶对氧的不敏感性，因此使用改进的s-GDH变异体的系统往往比基于葡萄糖氧化酶的系统受氧的干扰少。更为重要的是，由于所述s-GDH变异体对葡萄糖具有改进的专一性而对其它糖的相对酶活性显著降低，因此由于待分析样品中可能存在的麦芽糖、半乳糖和/或其它相关糖引起的干扰会被显著降低。当然，可以对各种各样的样品进行研究。体液如血清、血浆、肠液或尿液是这类样品的优选来源。

本发明也包括采用按照本发明的s-GDH突变体检测、测定或测量样品中葡萄糖的方法。尤其优选用于检测样品中葡萄糖的改进方法的特征为使用传感器或试纸条装置进行葡萄糖的所述检测、测定或测量。

另外，在本发明范围内有用于检测或测量样品中葡萄糖的装置，所述装置包含按照本发明的s-GDH突变体以及所述测量所需的其它试剂。

本发明的具有改进底物专一性的s-GDH变异体也可以非常有利地用于生物传感器中(D′Costa，E.J.等，Biosensors 2(1986)71-87；Laurinavicius，V.等，Analytical Letters 32(1999)299-316；Laurinavicius，V.等，Monatshefte fuer Chemie 130(1999)1269-1281)，以在线监测样品中或反应器中的葡萄糖。为此，所述s-GDH变异体可以例如用来涂敷含有氧化还原导电环氧化物网络的锇络合物的氧不敏感玻璃电极(Ye等，1993，参见上文)，以更加准确地测定葡萄糖浓度。

本发明的具有改进底物专一性的s-GDH变异体也有其它可能的应用。例如这些s-GDH变异体可以用于醛糖酸生产工艺。野生型s-GDH在产生葡糖酸和其它醛糖酸的底物氧化方面的转换率高。通过使用对葡萄糖更具特异性的所述s-GDH变异体，葡糖酸的产生将导致副产物少得多。就具有不同底物专一性的其它s-GDH变异体而言，根据需要产生不同醛糖酸是可能的。

在以下实施例中，所有的试剂、限制性酶和其它材料都得自RocheDiagnostics Germany，除非具体说明其它商业来源，并且按照供应商提供的说明来使用。DNA纯化、表征和克隆所使用的操作和方法是本领域众所周知的(Ausubel，F.等，″Current protocols in molecular biology″(1994)，Wiley Verlag)，并且可以根据技术人员的需要进行修改。

以下实施例进一步说明本发明。这些实施例不是用来限制本发明范围，而是提供对本发明的进一步理解。

实施例1

野生型乙酸钙不动杆菌可溶性PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌中的克隆和表达

按照标准方法，从乙酸钙不动杆菌菌株LMD 79.41中分离出s-GDH基因。将野生型s-GDH基因亚克隆到含有用于可调节表达的mgl启动子的质粒中(参见专利申请WO 88/09373)。将新的构建体称为pACSGDH(参见图3和图4)。将所述重组质粒导入选自大肠杆菌组的宿主生物体中。然后在合适条件下培养这些生物体，选择显示s-GDH活性的菌落。

采用QLAGEN Plasmid Maxi Kit(Qiagen)，按照生产商的方案，从200ml上述克隆的过夜培养物分离质粒pACSGDH。将该质粒重悬于1ml双蒸水中。使用Beckman DU 7400 Photometer测定质粒的浓度。产量为600μg。然后，通过琼脂糖凝胶电泳测定质粒的质量。

实施例2：

诱变PCR

为了在所述s-GDH基因中产生随机突变，进行诱变PCR(聚合酶链式反应)。pACSGDH质粒和编码突变酶(来自诱变PCR的PCR产物)的DNA序列用限制性酶Sph I和Eco RI消化。凝胶纯化所述产物。连接经消化的DNA序列，用等份连接反应混合物转化感受态大肠杆菌细胞。随后在含有氨苄青霉素的LB平板上选择转化体。

为了测定，挑选单菌落，让其在含有氨苄青霉素的LB培养基中生长过夜，然后进行筛选(参见实施例3)。

诱变PCR反应混合物：

40ng pACSGDH

1x不含MgCl2的缓冲液(Roche Diagnostics GmbH，Cat.1699 105)

dCTP，dTTP 1mM

dATP，dGTP 0.2mM(Roche Diagnostics GmbH，Cat.1969 064)

40pmol GF23引物(5′-CGC GCA CGC GCA TGC CGC CGA TGTTC)(＝SEQ ID NO：4)

40pmol GR23(5′-GAC GGC CAG TGA ATT CTT TTC TA)(＝SEQID NO：5)

7mM MgCl2

0.6mM MnCl2

5U Taq DNA聚合酶(Roche Diagnostics GmbH，Cat.1146 165)

Gene Amp PCR System 2400(Perkin Elmer)，30个循环：95℃ 1min，45℃ 2min，72℃ 2min

-采用得自Roche Diagnostics GmbH的the High Pure PCR ProductPurification Kit(高纯度PCR产物纯化试剂盒)(Cat.1 732 676)，按照生产商的方案，纯化PCR产物

-PCR片段用25U Sph1(Roche Diagnostics GmbH，Cat.606 120)在1x缓冲液H(Roche Diagnostics GmbH，Cat.1 417 991)中于37℃消化过夜；加入25U EcoRI(Roche Diagnostics GmbH，Cat.703 737)，再消化3.5小时

-50μg pACSGDH用180U SphI和180U EcoRI在1x缓冲液H中于37℃消化4小时。

-采用琼脂糖凝胶(0.8％)将经消化的pACSGDH和经消化的片段进行凝胶电泳

-采用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAquick凝胶提取试剂盒)(Qiagen，Cat.28706)，按照生产商的方案，提取所述DNA分子

-使用Beckman DU 7400 Photometer，测定片段和消化载体的浓度

-通过琼脂糖凝胶电泳，测定纯化产物的质量

-将100ng经消化的载体与140ng mPCR片段使用1U T4-DNA连接酶(Roche Diagnostics GmbH，Cat.481 220)在20μl的体积中于16℃连接过夜

-使用BioRad E.coli Pulser(BioRad大肠杆菌脉冲仪)(BioRad)，将电感受态XL1F细胞(Stratagene)用1μl连接反应物以2.5KV在0.2cm比色杯中进行电穿孔

-在1ml LB中于37℃生长1小时后，将细菌平板接种到LB-氨苄青霉素琼脂平板(100μg/ml氨苄青霉素)上，于37℃生长过夜。

-采用以下筛选方法，这些表达突变型s-GDH的克隆的50％是有活性的。

实施例3：

筛选

挑出上述琼脂平板上的突变型菌落，置于含有200μl LB-氨苄青霉素-培养基/孔的微量滴定板(mtp)中，于37℃保温过夜。这些平板称为主平板。

从每个主平板，转移5μl样品/孔至含有5μl/孔B(B＝BacterialProtein Extraction Reagent(细菌蛋白提取试剂)；Pierce No.78248)的mtp中，进行细胞破碎，然后加入240μl 0.0556mM吡咯并-喹啉醌(PQQ)；50mM Hepes；15mM CaCl2 pH 7.0/孔，用以活化s-GDH。为达到全酶的形成，将mtp于25℃保温2小时，然后于10℃保温过夜。该平板称为工作平板。

从工作平板，转移2×10μl样品/孔至两个空的mtp中。此后，一个用葡萄糖作为底物进行测试，另一个用麦芽糖或其它所选糖分子作为底物进行测试。所有糖分子以等摩尔浓度使用。

计算dE/min，使用葡萄糖作为底物的数值设定为100％活性。将用其它糖获得的数值与葡萄糖数值进行比较，以活性百分率计算((dE/min麦芽糖/dE葡萄糖)*100)。这相当于(突变型)酶的交叉反应性。

实施例4：

对得自诱变PCR的突变型s-GDH基因测序

分离含有产生50％麦芽糖/葡萄糖活性的突变型s-GDH基因的质粒(High Pure Plasmid Isolation Kit(高纯度质粒分离试剂盒)，RocheDiagnostics GmbH，No.1754785)，采用ABI Prism Dye TerminatorSequencing Kit(ABI Prism染料终止测序试剂盒)和ABI 3/73和3/77测序仪(Amersham Pharmacia Biotech)对该质粒测序。

使用以下引物：

有义链：GDH F2：5′-TTA ACG TGC TGA ACA GCC GG-3′(＝SEQ ID NO：6)

GDH F3：5′-GAT GCT GAT GGG CAG AAT GG-3′(＝SEQ ID NO：7)

GDH F4：5′-ATA TGG GTA AAG TAC TAC GC-3′(＝SEQ ID NO：8)

GDH F5：5′-ACG ATC CAA CTT GTG GAG AG-3′(＝SEQ ID NO：9)

反义链：GDH R1：5′-CGA TTA AGT TGG GTA ACG CC-3′(＝SEQ ID NO：10)

GDH R2：5′-ATA CGG AAA ATG ACA CCA CG-3′(＝SEQ ID NO：11)

GDH R3：5′-GGG CCT TGT TCA GAC TGC AA-3′(＝SEQ ID NO：12)

GDH R4：5′-CAA GAC GAC CTG ACT GAT GG-3′(＝SEQ ID NO：13)

GDH R5：5′-CAT AAC AAC GCG TGC GGC TT-3′(＝SEQ ID NO：14)

结果：

＝＞在DNA序列水平上6个突变

→在氨基酸水平上4个突变：

340位(成熟酶)从E变为G

348位(成熟酶)从T变为S

369位(成熟酶)从N变为H

413位(成熟酶)从S变为N

实施例5：

通过饱和诱变获得的s-GDH突变体

使用the QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(QuickChange定点诱变试剂盒)(Stratagene，Cat.200518)，用其它随机氨基酸连续取代所述s-GDH蛋白或s-GDH突变体(如上所述的质粒纯化物)的限定位置上的野生型氨基酸。

用于诱变的5′-引物和3′-引物相互互补并且在中心位置含有NNN。这些核苷酸在每个末端邻接12-16个核苷酸。所述核苷酸的序列与cDNA链相同，或者与邻接必须被取代的氨基酸密码子的互补cDNA链相同。除所述密码子外，引物还含有NNN，因此所述寡核苷酸编码每个密码子。

对于每一限定位置，进行一个PCR反应。

按照手册进行PCR反应和DpnI消化。

此后，用1μl每个反应物进行XL1F细胞的电穿孔。让细胞生长，如上所述测定所述克隆的s-GDH活性。

为了在统计学上确保筛选出所有20种氨基酸的变异体，对每一位置测试200个克隆。

其中使用以下引物：

对于位置340 有义链EGF 5′-TCC AAC TTG TGG ANN N ATGAC CTA CAT TT-3′(＝SEQ ID NO：15)

反义链EGR 5′-AAA TGT AGG TCA TNN NTC CAC AAG TTGGA-3′(＝SEQ ID NO：16)

对于位置348 有义链TSF 5′-CAT TTG CTG GCC ANN NGTTGC ACC GTC AT-3′(＝SEQ ID NO：17)

反义链 TSR 5′-ATG ACG GTG CAA CNN NTG GCCAGC AAA TG-3′(＝SEQ ID NO：18)

对于位置369 有义链NHF 5′-TAC TGG TTG GGA ANN NACATT ATT GGT TC-3′(＝SEQ ID NO：19)

反义链 NHR 5′-GAA CCA ATA ATG TNN NTT CCCAAC CAG TA-3′(＝SEQ ID NO：20)

对于位置413 有义链SNF 5′-TGA TGT GAT TGC ANN NCCAGA TGG GAA TG-3′(＝SEQ ID NO：21)

反义链 SNR 5′-CAT TCC CAT CTG GNN NTG CAATCA CAT CA-3′(＝SEQ ID NO：22)

结果：

340、369和413位的氨基酸变化不改变底物专一性。只有348位的摆动的确产生底物专一性为25-100％(麦芽糖/葡萄糖)的克隆。

进行多轮诱变PCR和饱和诱变。发现并证实位置348和428最为重要，而其它氨基酸的交换可以进一步改进突变型s-GDH对葡萄糖的专一性。代表性数据和位置在表1中给出。

表1：对葡萄糖具有改进专一性的s-GDH变异体的实例

缩写：n.t.＝未测试

SA＝用葡萄糖作为底物的比活(U/mg蛋白)

相对于野生型序列改变的氨基酸	葡萄糖转化率	麦芽糖转化率	半乳糖转化率	SA
相对于野生型序列改变的氨基酸	葡萄糖转化率	麦芽糖转化率	半乳糖转化率	SA	野生型	100％	105％	50％	1000
340E至G348T至S369N至H413S至N	100％	50％	25％	700	野生型	100％	105％	50％	1000
340E至G348T至S369N至H413S至N	100％	50％	25％	700	22I至L295Q至L422L至I	100％	123％	14％	178
348T至D	100％	80％	n.t.	n.t.	22I至L295Q至L422L至I	100％	123％	14％	178
348T至D	100％	80％	n.t.	n.t.	348T至A	100％	67％	n.t.	n.t.
348T至G	100％	22％	20％	910	348T至A	100％	67％	n.t.	n.t.
348T至G	100％	22％	20％	910	428N至P348T至G	100％	8％	25％	n.t.
428N至V348T至G	100％	22％	22％	n.t.	428N至P348T至G	100％	8％	25％	n.t.
428N至V348T至G	100％	22％	22％	n.t.	127T至M143D至Q348T至G428N至P	100％	1％	32％	n.t.
76Q至A348T至G	100％	17％	n.t.	n.t.	127T至M143D至Q348T至G428N至P	100％	1％	32％	n.t.
76Q至A348T至G	100％	17％	n.t.	n.t.	76Q至M348T至G	100％	18％	n.t.	n.t.
76Q至D348T至G	100％	17％	n.t.	n.t.	76Q至M348T至G	100％	18％	n.t.	n.t.
76Q至D348T至G	100％	17％	n.t.	n.t.	76Q至P348T至G	100％	17％	n.t.	n.t.
76Q至S348T至G	100％	17％	n.t.	n.t.	76Q至P348T至G	100％	17％	n.t.	n.t.

76Q至G348T至G	100％	20％	n.t.	n.t.
76Q至G348T至G	100％	20％	n.t.	n.t.	76Q至E348T至G	100％	17％	n.t.	n.t.
143D至E348T至G	100％	17％	n.t.	n.t.	76Q至E348T至G	100％	17％	n.t.	n.t.
143D至E348T至G	100％	17％	n.t.	n.t.	171Y至H348T至G308K至N	100％	19％	n.t.	n.t.
171Y至D348T至G317F至V	100％	18％	n.t.	n.t.	171Y至H348T至G308K至N	100％	19％	n.t.	n.t.
171Y至D348T至G317F至V	100％	18％	n.t.	n.t.	127T至S169L至H348T至G355Y至H	100％	11％	n.t.	n.t.
16N至D120T至S177Q至R277Y至H348T至G	100％	22％	n.t.	n.t.	127T至S169L至H348T至G355Y至H	100％	11％	n.t.	n.t.
16N至D120T至S177Q至R277Y至H348T至G	100％	22％	n.t.	n.t.	116I至T255N至T299K至R348T至G	100％	20％	n.t.	n.t.
227H至Y348T至G438N至S	100％	18％	n.t.	n.t.	116I至T255N至T299K至R348T至G	100％	20％	n.t.	n.t.
227H至Y348T至G438N至S	100％	18％	n.t.	n.t.	341M至V348T至G	100％	20％	n.t.	n.t.
348T至G349V至G428N至P	100％	10％	n.t.	n.t.	341M至V348T至G	100％	20％	n.t.	n.t.
348T至G349V至G428N至P	100％	10％	n.t.	n.t.	171Y至G230P至H348T至G	100％	3％	n.t.	n.t.

428N至P
428N至P					230P至H348T至G428N至P	100％	10％	n.t.	200
227H至F230P至H348T至G428N至P	100％	6％	n.t.	n.t.	230P至H348T至G428N至P	100％	10％	n.t.	200
227H至F230P至H348T至G428N至P	100％	6％	n.t.	n.t.	143D至E348T至G	100％	17％	n.t.	n.t.
143D至E348T至G428N至P	100％	1％	32％	n.t.	143D至E348T至G	100％	17％	n.t.	n.t.
143D至E348T至G428N至P	100％	1％	32％	n.t.	169G至X230P至H348T至G428N至P	100％	2％	n.t.	n.t.

实施例6：

突变型s-GDH T348G的纯化

收获生长的细胞(LB-Amp.37℃)，将其重悬于磷酸钾缓冲液(pH7.0)中。通过弗氏压碎器(700-900巴)进行细胞破碎。离心后，将上清液加样至用10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡的S-Sepharose(Amersham Pharmacia Biotec)柱。洗涤后，用盐梯度0-1M NaCl洗脱s-GDH。合并显示s-GDH活性的流分，针对磷酸钾缓冲液(pH 7.0)透析，在再次平衡的S-sepharose柱上再进行色谱分离。合并活性流分，采用Superdex^200柱(Amersham Pharmacia Biotec)进行凝胶过滤。合并活性流分，于-20℃贮存。

突变型T348G和野生型s-GDH的酶测定和蛋白质测定

采用Pierce的the Protein Assay Reagent no.23225(用BSA的校准曲线，30Min.37℃)进行蛋白质测定。

GDH样品用0.0556mM吡咯并-喹啉醌(PQQ)、50mM Hepes、15mM CaCl2 pH 7.0稀释至1mg蛋白/ml，于25℃保温30分钟，进行重建或活化。

活化后，加入50μl样品至1000μl含有0.315mg(4-(二甲基膦基甲基)-2-甲基-吡唑并[1.5a]-咪唑-3-基)-(4-亚硝基苯基)-胺(参见美国专利5,484,708)/ml作为介质和33mM糖)的0.2M柠檬酸缓冲液(pH 5.8；于25℃)中。

在前5分钟期间于25℃监测620nm的消光。

1单位酶活性相当于在上述测定条件下1mMol介质/分钟的转化率

计算：活性＝(总体积*dE/分钟[U/ml])∶(ε*样品体积*1)

(ε＝消光系数；在本实施例中ε_620nm＝30[1*mmol^-1*cm^-1])。

用葡萄糖、麦芽糖和半乳糖(Merck，Germany)进行该测定。

结果：

样品	比活U/mg蛋白(葡萄糖作为底物)	麦芽糖/葡萄糖转化率(％)	半乳糖/葡萄糖转化率(％)
样品	比活U/mg蛋白(葡萄糖作为底物)	麦芽糖/葡萄糖转化率(％)	半乳糖/葡萄糖转化率(％)	野生型	1000	105％	50％
突变型T348G	910	22％	20％	野生型	1000	105％	50％

实施例7：在麦芽糖存在或不存在时葡萄糖的测定

用s-GDH的野生型和突变型T348G进行葡萄糖测定。参比样品含有65mg葡萄糖/dl。“试验”样品含有65mg葡萄糖/dl和130mg/dl麦芽糖。每一测定使用相同量的GDH活性(U/ml，参见酶测定)。

在比色杯中混合：

1ml 0.315mg(4-(二甲基膦基甲基)-2-甲基-吡唑并[1.5a]-咪唑-3-基)-(4-亚硝基苯基)-胺ml/0.2M柠檬酸pH 5.8

0.015ml样品(葡萄糖或者葡萄糖+麦芽糖)

加入0.050ml 90U/ml s-GDH开始该测定。监测620nm的吸光度变化。5分钟后，观察到恒定值，计算dE/5分钟。用野生型s-GDH测量参比样品获得的数值设定为100％。将其它数值与该参比值进行比较，计算百分率。

结果：

	65mg/dl葡萄糖	65mg/dl葡萄糖和130mg/dl麦芽糖
	65mg/dl葡萄糖	65mg/dl葡萄糖和130mg/dl麦芽糖	野生型s-GDH	100％	190％
突变型s-GDH T348G	100％	130％	野生型s-GDH	100％	190％

可以清楚地看出，所测量的“葡萄糖数值”当在该测定中使用突变型s-GDH时明显地几乎未被削弱。

参考文献一览表

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EP 0 620 283

JP 11243949

US 5,484,708

US 5,997,817

US 6,057,120

US 6,103,509

WO 92/07953

WO 99/30152

WO 88/09373

序列表

<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司(F.Hoffmann-La Roche AG

Roche Diagnostics GmbH)

<120>新形式的可溶性吡咯并喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶

<130>19139 WO

<140>

<141>

<150>EP 00123512.6

<151>2000-10-27

<150>EP 00127294.7

<151>2000-12-19

<160>25

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>7

<212>PRT

<213>乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)

<400>1

Trp Pro Xaa Val Ala Pro Ser

1 5

<210>2

<211>7

<212>PRT

<213>乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)

<400>2

Thr Ala Gly Xaa Val Gln Lys

1 5

<210>3

<211>7

<212>PRT

<213>乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)

<400>3

Ala Asp Gly Xaa Asn Gly Leu

1 5

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：有义引物GF23

<400>4

cgcgcacgcg catgccgccg atgttc 26

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：反义引物GR23

<400>5

gacggccagt gaattctttt cta 23

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：有义引物GDH F2

<400>6

ttaacgtgct gaacagccgg 20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：有义引物GDH F3

<400>7

gatgctgatg ggcagaatgg 20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：有义引物GDH F4

<400>8

atatgggtaa agtactacgc 20

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：有义引物GDH F5

<400>9

acgatccaac ttgtggagag 20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：反义引物GDH R1

<400>10

cgattaagtt gggtaacgcc 20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：反义引物GDH R2

<400>11

atacggaaaa tgacaccacg 20

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：反义引物GDH R3

<400>12

gggccttgtt cagactgcaa 20

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：反义引物GDH R4

<400>13

caagacgacc tgactgatgg 20

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：反义引物GDH R5

<400>14

cataacaacg cgtgcggctt 20

<210>15

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：有义引物EGF

<400>15

tccaacttgt ggannnatga cctacattt 29

<210>16

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：反义引物EGR

<400>16

aaatgtaggt catnnntcca caagttgga 29

<210>17

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：有义引物TSF

<400>17

catttgctgg ccannngttg caccgtcat 29

<210>18

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：反义引物TSR

<400>18

atgacggtgc aacnnntggc cagcaaatg 29

<210>19

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：有义引物NHF

<400>19

tactggttgg gaannnacat tattggttc 29

<210>20

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：反义引物NHR

<400>20

gaaccaataa tgtnnnttcc caaccagta 29

<210>21

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：有义引物SNF

<400>21

tgatgtgatt gcannnccag atgggaatg 29

<210>22

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：反义引物SNR

<400>22

cattcccatc tggnnntgca atcacatca 29

<210>23

<211>1362

<212>DNA

<213>乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1362)

<400>23

gat gtt cct cta act cca tct caa ttt gct aaa gcg aaa tca gag aac 48

Asp Val Pro Leu Thr Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn

1 5 10 15

ttt gac aag aaa gtt att cta tct aat cta aat aag ccg cac gcg ttg 96

Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu

20 25 30

tta tgg gga cca gat aat caa att tgg tta act gag cga gca aca ggt 144

Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly

35 40 45

aag att cta aga gtt aat cca gag tcg ggt agt gta aaa aca gtt ttt 192

Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe

50 55 60

cag gta cca gag att gtc aat gat gct gat ggg cag aat ggt tta tta 240

Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu

65 70 75 80

ggt ttt gcc ttc cat cct gat ttt aaa aat aat cct tat atc tat att 288

Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile

85 90 95

tca ggt aca ttt aaa aat ccg aaa tct aca gat aaa gaa tta ccg aac 336

Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn

100 105 110

caa acg att att cgt cgt tat acc tat aat aaa tca aca gat acg ctc 384

Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu

115 120 125

gag aag cca gtc gat tta tta gca gga tta cct tca tca aaa gac cat 432

Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His

130 135 140

cag tca ggt cgt ctt gtc att ggg cca gat caa aag att tat tat acg 480

Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr

145 150 155 160

att ggt gac caa ggg cgt aac cag ctt gct tat ttg ttc ttg cca aat 528

Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn

165 170 175

caa gca caa cat acg cca act caa caa gaa ctg aat ggt aaa gac tat 576

Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn Gly Lys Asp Tyr

180 185 190

cac acc tat atg ggt aaa gta cta cgc tta aat ctt gat gga agt att 624

His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile

195 200 205

cca aag gat aat cca agt ttt aac ggg gtg gtt agc cat att tat aca 672

Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr

210 215 220

ctt gga cat cgt aat ccg cag ggc tta gca ttc act cca aat ggt aaa 720

Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys

225 230 235 240

tta ttg cag tct gaa caa ggc cca aac tct gac gat gaa att aac ctc 768

Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu

245 250 255

att gtc aaa ggt ggc aat tat ggt tgg ccg aat gta gca ggt tat aaa 816

Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys

260 265 270

gat gat agt ggc tat gct tat gca aat tat tca gca gca gcc aat aag 864

Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ala Asn Lys

275 280 285

tca att aag gat tta gct caa aat gga gta aaa gta gcc gca ggg gtc 912

Ser Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Val Lys Val Ala Ala Gly Val

290 295 300

cct gtg acg aaa gaa tct gaa tgg act ggt aaa aac ttt gtc cca cca 960

Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro

305 310 315 320

tta aaa act tta tat acc gtt caa gat acc tac aac tat aac gat cca 1008

Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro

325 330 335

act tgt gga gag atg acc tac att tgc tgg cca aca gtt gca ccg tca 1056

Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser

340 345 350

tct gcc tat gtc tat aag ggc ggt aaa aaa gca att act ggt tgg gaa 1104

Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile Thr Gly Trp Glu

355 360 365

aat aca tta ttg gtt cca tct tta aaa cgt ggt gtc att ttc cgt att 1152

Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile

370 375 380

aag tta gat cca act tat agc act act tat gat gac gct gta ccg atg 1200

Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Val Pro Met

385 390 395 400

ttt aag agc aac aac cgt tat cgt gat gtg att gca agt cca gat ggg 1248

Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly

405 410 415

aat gtc tta tat gta tta act gat act gcc gga aat gtc caa aaa gat 1296

Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys Asp

420 425 430

gat ggc tca gta aca aat aca tta gaa aac cca gga tct ctc att aag 1344

Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Lys

435 440 445

ttc acc tat aag gct aag 1362

Phe Thr Tyr Lys Ala Lys

450

<210>24

<211>454

<212>PRT

<213>乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)

<400>24

Asp Val Pro Leu Thr Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn

1 5 10 15

Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu

20 25 30

Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly

35 40 45

Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe

50 55 60

Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu

65 70 75 80

Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile

85 90 95

Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn

100 105 110

Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu

115 120 125

Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His

130 135 140

Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr

145 150 155 160

Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn

165 170 175

Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn Gly Lys Asp Tyr

180 185 190

His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile

195 200 205

Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr

210 215 220

Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys

225 230 235 240

Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu

245 250 255

Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys

260 265 270

Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ala Asn Lys

275 280 285

Ser Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Val Lys Val Ala Ala Gly Val

290 295 300

Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro

305 310 315 320

Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro

325 330 335

Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser

340 345 350

Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile Thr Gly Trp Glu

355 360 365

Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile

370 375 380

Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Val Pro Met

385 390 395 400

Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly

405 410 415

Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys Asp

420 425 430

Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Lys

435 440 445

Phe Thr Tyr Lys Ala Lys

450

<210>25

<211>4373

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：载体pACSGDH

<400>25

cactaactga ttacgcaccg catgtaaccg ttttcaatct gtgagtaaat tcacagttta 60

ttaacattgt gatagctatg atgacaacgt ttgtcgcact gtaactaacg tgtaacagtt 120

agttgtcagt tttgctgggg tatttcgctt ataaaaaccg ttatcacaat atcccgcgac 180

taccggacaa aaataaagag ttgaataaga gcttatccca ttagggctat tttacttgcc 240

attttggacc tgggcagtgc tcgccaaaac gcgttagcgt tttgaacgcg ctagcggcgg 300

cccgaagggc gagcgtagcg agtcaaacct cacgtactac gtgtacgctc cggtttttgc 360

gcgctgtccg tgtccaaact gctgcgccaa taacgcctgg tgggataggc tctaaatacg 420

cttcggcgtt cagtaacacg cgttaacgtg ctgaacagcc gggcattttt ttacgctata 480

ccctacataa taaaaccgga gctaccatga ataagaaggt actgaccctt tctgccgtga 540

tggcaagtct gttattcggc gcgcacgcgc atgccgccga tgttcctcta actccatctc 600

aatttgctaa agcgaaatca gagaactttg acaagaaagt tattctatct aatctaaata 660

agccgcacgc gttgttatgg ggaccagata atcaaatttg gttaactgag cgagcaacag 720

gtaagattct aagagttaat ccagagtcgg gtagtgtaaa aacagttttt caggtaccag 780

agattgtcaa tgatgctgat gggcagaatg gtttattagg ttttgccttc catcctgatt 840

ttaaaaataa tccttatatc tatatttcag gtacatttaa aaatccgaaa tctacagata 900

aagaattacc gaaccaaacg attattcgtc gttataccta taataaatca acagatacgc 960

tcgagaagcc agtcgattta ttagcaggat taccttcatc aaaagaccat cagtcaggtc 1020

gtcttgtcat tgggccagat caaaagattt attatacgat tggtgaccaa gggcgtaacc 1080

agcttgctta tttgttcttg ccaaatcaag cacaacatac gccaactcaa caagaactga 1140

atggtaaaga ctatcacacc tatatgggta aagtactacg cttaaatctt gatggaagta 1200

ttccaaagga taatccaagt tttaacgggg tggttagcca tatttataca cttggacatc 1260

gtaatccgca gggcttagca ttcactccaa atggtaaatt attgcagtct gaacaaggcc 1320

caaactctga cgatgaaatt aacctcattg tcaaaggtgg caattatggt tggccgaatg 1380

tagcaggtta taaagatgat agtggctatg cttatgcaaa ttattcagca gcagccaata 1440

agtcaattaa ggatttagct caaaatggag taaaagtagc cgcaggggtc cctgtgacga 1500

aagaatctga atggactggt aaaaactttg tcccaccatt aaaaacttta tataccgttc 1560

aagataccta caactataac gatccaactt gtggagagat gacctacatt tgctggccaa 1620

cagttgcacc gtcatctgcc tatgtctata agggcggtaa aaaagcaatt actggttggg 1680

aaaatacatt attggttcca tctttaaaac gtggtgtcat tttccgtatt aagttagatc 1740

caacttatag cactacttat gatgacgctg taccgatgtt taagagcaac aaccgttatc 1800

gtgatgtgat tgcaagtcca gatgggaatg tcttatatgt attaactgat actgccggaa 1860

atgtccaaaa agatgatggc tcagtaacaa atacattaga aaacccagga tctctcatta 1920

agttcaccta taaggctaag taatacagtc gcattaaaaa accgatctat aaagatcggt 1980

ttttttagtt ttagaaaaga attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa 2040

ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa 2100

tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg 2160

gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatggtg 2220

cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac 2280

acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt 2340

gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag 2400

acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc 2460

ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt 2520

ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata 2580

atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt 2640

tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc 2700

tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat 2760

ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct 2820

atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca 2880

ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg 2940

catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa 3000

cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg 3060

ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga 3120

cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg 3180

cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt 3240

tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg 3300

agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc 3360

ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca 3420

gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc 3480

atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat 3540

cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc 3600

agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg 3660

ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct 3720

accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct 3780

tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct 3840

cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg 3900

gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc 3960

gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga 4020

gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg 4080

cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 4140

tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 4200

ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 4260

ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat 4320

taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgacggggc ccg 4373

Claims

1.一种也称为PQQ依赖性可溶性葡萄糖脱氢酶(s-GDH)的可溶性形式EC 1.1.99.17的突变体，所述突变体的特征为与相应的野生型酶相比并且相对于至少一种其它所选糖底物而言，所述突变体对葡萄糖的底物专一性至少增加至两倍。

2.权利要求1的突变体，其特征还在于所述所选糖选自麦芽糖和半乳糖。

3.权利要求1或2的突变体，其特征还在于所述所选糖为麦芽糖。

4.权利要求1的PQQ依赖性s-GDH突变体，其特征还在于所述对葡萄糖的底物专一性改进至少3倍。

5.权利要求1的PQQ依赖性s-GDH突变体，其特征还在于所述对葡萄糖的底物专一性改进至少5倍。

6.一种也称为PQQ依赖性可溶性葡萄糖脱氢酶(s-GDH)的可溶性形式EC 1.1.99.17的突变体，所述突变体的特征为：

a)针对葡萄糖的底物比反应性基本上等于所述野生型酶对葡萄糖的底物比反应性，且

b)针对麦芽糖的底物比反应性与所述野生型酶相比为30％或30％以下。

7.权利要求6的突变体，其特征还在于所述针对麦芽糖的底物比反应性与所述野生型酶相比为20％或20％以下。

8.权利要求1-7中任一项的PQQ依赖性s-GDH突变体，其特征还在于所述野生型s-GDH从包括乙酸钙不动杆菌(A.calcoaceticus)和鲍氏不动杆菌(A.baumannii)的不动杆菌(Acinetobacter species)的菌株中分离出来。

9.一种PQQ依赖性s-GDH突变蛋白，所述突变蛋白在对应于已知来自乙酸钙不动杆菌的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：24)的位置348的氨基酸位置上包含一个氨基酸残基取代。

10.一种PQQ依赖性s-GDH突变蛋白，所述突变蛋白在对应于已知来自乙酸钙不动杆菌的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：24)位置的氨基酸位置上包含至少两个氨基酸残基取代，所述取代氨基酸的位置选自位置16、22、76、116、120、127、143、168、169、171、177、227、230、231、245、255、277、295、299、308、317、341、348、349、355、422、428和438，其中氨基酸残基T348被取代。

11.权利要求10的突变体，其特征还在于在对应于已知来自乙酸钙不动杆菌的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：24)位置的氨基酸位置上，位置348的氨基酸以及以下氨基酸残基16、116、120、127、169、171、177、227、255、277、299、317、355和438中的至少一个被取代。

12.权利要求10的突变蛋白，所述突变蛋白包含位置348和428上氨基酸残基的取代。

13.一种PQQ依赖性s-GDH突变蛋白，所述突变蛋白在对应于已知来自乙酸钙不动杆菌的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO：24)位置的氨基酸位置上包含至少三个氨基酸残基取代，所述取代氨基酸的位置选自位置171、227、230、245、341、348、349和428，其中氨基酸残基T348和N428均被取代。

14.权利要求12或13的突变体，其特征还在于位置428上的天冬酰胺被选自亮氨酸、脯氨酸和缬氨酸中的一个氨基酸残基取代。

15.权利要求9-14中任一项的突变体，其特征还在于位置348上的苏氨酸被选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸中的一个氨基酸残基取代。

16.一种PQQ依赖性s-GDH突变蛋白，所述突变蛋白包含WPXaaVAPS的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，其中所述Xaa残基为一个除苏氨酸以外的氨基酸残基。

17.权利要求16的突变蛋白，其特征还在于所述Xaa残基为甘氨酸。

18.一种PQQ依赖性s-GDH突变蛋白，所述突变蛋白包含TAGXaaVQK的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中所述Xaa残基为一个除天冬酰胺以外的氨基酸残基。

19.权利要求18的突变蛋白，其特征还在于所述Xaa残基为脯氨酸。

20.一种PQQ依赖性s-GDH突变蛋白，所述突变蛋白包含ADGXaaNGL的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)，其中所述Xaa残基为一个除谷氨酰胺以外的氨基酸残基。

21.权利要求20的突变体，其特征还在于所述Xaa残基选自天冬氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸。

22.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求9-21中任一项的s-GDH突变蛋白。

23.一种表达载体，所述表达载体包含与能够启动所述多核苷酸在宿主细胞中表达的启动子序列有效连接的、权利要求22的分离多核苷酸。

24.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求23的表达载体。

25.一种生产s-GDH变异体的方法，所述方法包括在适合于产生所述酶变异体的条件下培养权利要求24的宿主细胞。

26.一种表达载体，所述表达载体包含与能够启动所述多核苷酸在无细胞肽合成系统中表达的启动子序列有效连接的、权利要求22的分离多核苷酸。

27.一种生产s-GDH变异体的方法，所述方法包括用权利要求26的构建体在无细胞肽合成系统中在适合于产生所述酶变异体的条件下来生产所述s-GDH变异体。

28.一种应用任一前述权利要求的s-GDH突变体检测、测定或测量样品中葡萄糖的方法，所述改进包括使所述样品与所述突变体接触。

29.权利要求28的方法，其特征还在于使用传感器或试纸条装置来进行葡萄糖的所述检测、测定或测量。

30.一种用于检测或测量样品中的葡萄糖的装置，所述装置包括权利要求1-29中任一项的s-GDH突变体和所述测量所需的其它试剂。