CN1498274A - 基于转录的核酸扩增方法和组合物 - Google Patents

Abstract

公开了靶多核苷酸等温指数级扩增的方法。该方法应用两个转录组件，第一组件提供产生RNA转录本的线性扩增，且第二组件提供进一步的(通常为循环的)产生更多RNA转录本的扩增。一方面，第一组件的扩增基于复合引物。第二方面，第一组件的扩增基于靶转换，以产生包含启动子序列的引物延伸产物。在所有的方面中，第一转录组件的RNA转录本通过产生包含可启动转录的双链启动子区域的中间产物而进行进一步的扩增。本发明还提供了用于实践所述方法的组合物和试剂盒，并提供了使用扩增结果的方法。

Description

基于转录的核酸扩增方法和组合物

相关申请的相互参照

本申请要求美国临时专利申请(系列号60/213,908，2000年6月26日申请，和系列号60/277,748，2001年3月21日申请)的优先权，该所述专利申请的全部内容在此引用作为参考。

技术领域

本发明涉及多核苷酸扩增领域。更具体地，本发明提供了用于扩增(即产生多拷贝)靶多核苷酸序列的方法、组合物和试剂盒，其中所述扩增涉及转录，并使用了RNA/DNA复合引物和/或靶转换多核苷酸。

领域背景

近年来，用于核酸扩增和扩增产物检测的方法的发展已促进了核酸的检测、鉴定、定量和序列分析。这些方法的应用已经引起了基因组学、细胞生物学、分子医学、遗传学等领域的快速发展。

核酸分析广泛应用于病原体的检测和鉴定、导致特定表型的基因改变的检测、遗传性疾病诊断或对这些疾病的易感性，还用于对发育、疾病和对特定刺激的反应所引起的基因表达的评估，并用于各种基因组项目。其它核酸扩增方法的应用包括稀有细胞的检测、病原体的检测和对恶性疾病中已改变的基因表达的检测等。核酸扩增潜在地可用于定性分析(如特定核酸序列存在的检测)，也可用于特定基因序列的定量。后者用于评估和确定在样本中致病序列的量，以及用于确定基因增殖和缺失，其中所述基因增殖和缺失在细胞从正常转化为恶性类型时经常会出现。

尽管特定核酸序列的检测及其序列分析可通过直接将探针与靶核酸序列杂交而得以进行，但当试验样本中靶核酸序列少量存在时，该方法往往缺乏敏感性。这一问题的一种解决方法是开发产生多拷贝特定核酸序列的方法，以使它们可用于进一步的分析。产生在样本中特定核酸序列的多拷贝的方法通常称为靶扩增方法。其它用于增加杂交分析检测敏感性的方法基于由杂交探针产生多条产物，例如将杂交探针切割以形成多条产物或连接邻近的探针以形成独特的依赖杂交的产物。类似地，可通过放大由杂交事件产生信号的方法例如基于分支DNA探针杂交的方法来增加杂交反应的敏感性。

近年来已经描述了多种靶核酸扩增的方法。可通过多循环的在不同温度下孵育(热循环)或者等温过程进行靶核酸扩增。热稳定核酸修饰酶的发现也对核酸扩增技术的快速发展作出了贡献。热稳定核酸修饰酶，如DNA聚合酶和RNA聚合酶、连接酶、核酸酶等均用于依赖热循环的扩增和等温扩增的方法中。例如，在WO/070095A2(Liu等)中描述了“应用模板转换寡核苷酸进行核酸的均一等温扩增和检测”的方法。

最常应用的靶扩增方法是聚合酶链反应(PCR)，该方法基于多个循环的变性、两条寡核苷酸引物的杂交(每条引物与双链靶中的一条杂交)、以及通过核苷酸聚合酶进行引物延伸，以产生多个靶序列的双链拷贝。对PCR的许多变更方法已有描述，且方法被用于进行DNA或RNA核酸序列的扩增、序列测定、突变分析等。(参见PCR手册：方法和应用指南(PCRProtocols：A Guide to Methods and Applications)，(Innis，M.，Gelfand，D.，Sninsky，J.和White，T.编辑)，学院出版社(Academic Press)(1990)；Mullis等，酶学方法(Methods in Enzymology)，155：335-350(1987))。应用单引物的基于热循环的方法也已描述。其它依赖热循环的方法包括连接酶链反应(LCR)和相关的修复链反应(RCR)。

基于链置换的等温核酸扩增方法已有描述。参见在例如Fraiser等，美国专利号5,648,211；Cleuziat等，美国专利号5,824,517；以及Walker等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，89：392-396(1992)中的描述。其它等温靶扩增方法是基于转录的扩增方法，其中在扩增的早期阶段将RNA聚合酶启动子序列掺入引物延伸产物中(WO/01050)，其进一步通过转录和消化DNA/RNA杂合中间产物中的RNA链而扩增靶序列或靶互补序列。参见例如美国专利号5,169,766和4,786,600。靶核酸的扩增可通过多循环的不同温度下的孵育(即热循环)或同一温度(等温过程)下的孵育得以进行。这些方法包括转录介导的扩增(TMA)、自持续的序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)及其变更方法。参见例如Guatelli等，美国国家科学院院报，87：1874-1878(1990)；美国专利号5,766,849(TMA)和5,654,142(NASBA)。其它扩增方法应用模板转换寡核苷酸(TSOs)和阻断寡核苷酸。例如，应用嵌合DNA引物的模板转换扩增方法已在美国专利5,679,512和Patel等(美国国家科学院院报93：2969-2974(1996))中公开，应用阻断寡核苷酸的方法由Laney等在美国专利号5,679,512中公开。

由于等温靶扩增方法不需要热循环仪，因此这些方法更易于适应普通仪器平台。但先前已知的等温靶扩增方法有严重的弊端。根据链置换扩增(SDA)方法的扩增需要特定限制性酶位点的存在，因此限制了它的可应用性。另一方面，已存在的基于转录的扩增方法如NASBA和TMA需要通过引物在扩增产物中掺入RNA聚合酶启动子序列，由于此过程容易引起非特异扩增，因此限制了它的应用。此外，通过这些基于转录的扩增方法来扩增DNA靶的机制并未完全确定。

许多基因组测序(特别是人类基因组测序)的完成对分子和细胞生物学且特别是分子医学的发展具有极大的意义。等温基因测序方法的研发将极大促进该信息在多种试验设施中的应用，因为与目前需要热循环仪的方法相比，等温测序极大简化了基因鉴定方法。

本发明的方法提供用于等温、高效的核酸序列扩增，并提供了使用这些扩增方法和产物的方法(例如在序列测定中)。

所有在此引用的参考文献，包括专利申请和出版物，均全文引用作为参考。

本发明的公开

本发明提供了用于扩增多核苷酸序列的方法、组合物和试剂盒。方法通常包括引物(在本发明的一些方面为RNA/DNA复合引物)、任选地终止序列和前启动子寡核苷酸序列的应用。

因此，本发明一方面提供了产生多拷贝目的核酸序列的方法，其包括的步骤有：(a)将包含目的核酸序列的单链靶多核苷酸与第一引物杂交，其中所述第一引物为包含RNA部分和3′DNA部分的复合引物；(b)任选地将包含终止多核苷酸序列的多核苷酸与靶多核苷酸5′的区域杂交，其中所述靶多核苷酸5′的区域为相对于第一引物与靶多核苷酸的杂交而言；(c)用DNA依赖的DNA聚合酶延伸第一引物，以产生包含第一引物延伸产物和靶多核苷酸的复合体；(d)应用从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶从第一引物延伸产物和靶多核苷酸复合体的复合引物上切除RNA部分，以使另一复合引物(其通常且优选地与第一引物相同)可与靶多核苷酸杂交，并通过链置换重复引物延伸，以产生置换的引物延伸产物；(e)杂交前启动子多核苷酸，其中所述前启动子多核苷酸包含前启动子并包含与置换的引物延伸产物在允许通过RNA聚合酶进行转录的条件下(这些条件通常但并非必需包括延伸引物延伸产物的3’末端以产生双链启动子区域)杂交的区域，以便产生包含与置换的引物延伸产物有互补序列的RNA转录本；(f)将第二引物与步骤(e)产生的RNA转录本杂交；(g)用RNA依赖的DNA聚合酶延伸第二引物，以产生包含第二引物延伸产物和RNA转录本的复合体；(h)用可从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶切除步骤(g)形成的复合体中的RNA；(i)将单链第二引物延伸产物与前启动子多核苷酸杂交，其中前启动子多核苷酸包含前启动子并包含与单链第二引物延伸产物在允许通过RNA聚合酶进行转录的条件下(这些条件通常但并非必需包括延伸引物延伸产物3’末端，以产生双链启动子区域)杂交的区域，从而产生包含目的序列的RNA转录本；由此多拷贝目的核酸序列得以产生。

本发明的另一方面提供了产生多拷贝目的核酸序列的方法，其包括(a)组合：包含如上描述的第一引物延伸产物和靶多核苷酸的复合体；可与靶多核苷酸杂交的复合引物(其通常且优选地与第一引物相同)，其中复合引物为包含RNA部分和3′DNA部分的引物；从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶；包含前启动子并包含与置换的复合引物延伸产物杂交的区域的前启子多核苷酸；RNA聚合酶；可与包含目的序列的正义RNA转录本杂交的第二引物；RNA依赖的DNA聚合酶；以及包含前启动子并包含与第二引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸；和(b)孵育步骤(a)的混合物，孵育条件为允许引物杂交和延伸、RNA切除、包含第一引物延伸产物和靶多核苷酸的复合体在其RNA被切除且复合引物结合到复合体中的靶多核苷酸后从复合体中置换第一引物延伸产物、前启动子多核苷酸与第一引物延伸产物杂交以形成包含第一引物延伸产物和前启动子多核苷酸的复合体、将前启动子多核苷酸与第二引物延伸产物杂交以形成包含第二引物延伸产物和前启动子多核苷酸的复合体，以及RNA转录，由此多拷贝目的核酸序列得以产生。

本发明的另一方面提供了用于产生多拷贝目的核酸序列的方法，其包括(a)组合：如上所述产生的置换的引物延伸产物；包含前启动子并包含与置换的第一引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸；RNA聚合酶；可与包含目的序列的正义RNA转录本杂交的第二引物；RNA依赖的DNA聚合酶；从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶；以及包含前启动子并包含与第二引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸；和(b)孵育步骤(a)的混合物，孵育条件为允许引物杂交和延伸、RNA切除、前启动子多核苷酸与第一引物延伸产物杂交形成包含第一引物延伸产物和前启动子多核苷酸的复合体、前启动子多核苷酸和第二引物延伸产物杂交以形成包含第二引物延伸产物和前启动子多核苷酸的复合体，以及RNA转录，由此多拷贝目的核酸序列得以产生。

本发明的另一方面提供了用于产生多拷贝目的核酸序列的方法，其包括(a)组合：包含与上面描述的置换的引物延伸产物具互补序列的RNA转录本；可与包含目的序列的正义RNA转录本杂交的第二引物；RNA依赖的DNA聚合酶；从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶；包含前启动子并包含与第二引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸；以及RNA聚合酶；和(b)孵育步骤(a)的混合物，孵育条件为允许引物杂交和延伸、RNA切除、前启动子多核苷酸与引物延伸产物杂交以形成包含引物延伸产物和前启动子多核苷酸的复合体，以及RNA转录，由此多拷贝目的核酸序列得以产生。

本发明的又一方面提供了用于产生多拷贝目的核酸序列的方法，其包括(a)组合：第一引物，其中第一引物为复合引物，其可与靶多核苷酸杂交且其中复合引物包含RNA部分和3′DNA部分；任选地可与靶多核苷酸5′区域杂交的包含终止多核苷酸序列的多核苷酸，其中所述靶多核苷酸5′的区域为相对于复合引物与靶多核苷酸的杂交而言；DNA依赖的DNA聚合酶；从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶；包含前启动子并包含与第一引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸；RNA聚合酶；可与包含目的序列的正义RNA转录本杂交的第二引物；RNA依赖的DNA聚合酶；包含前启动子并包含与第二引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸；和(b)孵育步骤(a)的混合物，孵育条件为允许引物杂交和延伸、RNA切除、包含第一引物延伸产物和靶多核苷酸的复合体在其RNA被切除且复合引物结合到复合体中的靶多核苷酸后从复合体中置换第一引物延伸产物、前启动子多核苷酸与引物延伸产物杂交以形成包含引物延伸产物和前启动子多核苷酸的复合体，以及RNA转录，由此多拷贝目的核酸序列得以产生。

在另一方面，本发明提供了用于产生多拷贝目的核酸序列的方法，其包括：(a)将第二引物与RNA转录本杂交，其中所述RNA转录本产生的过程包括(i)包含目的核酸序列的单链靶多核苷酸与第一引物杂交，该第一引物为包含RNA部分和3′DNA部分的复合引物；(ii)任选地将包含终止多核苷酸序列的多核苷酸与靶多核苷酸5′的区域杂交，其中所述靶多核苷酸5′的区域为相对于第一引物与靶多核苷酸的杂交而言；(iii)用DNA依赖的DNA聚合酶延伸第一引物，以产生包含第一引物延伸产物和靶多核苷酸的复合体；(iv)用从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶切除第一引物延伸产物和靶多核苷酸复合体中的复合引物上的RNA部分，以使另一复合引物(其通常且优选地与第一引物相同)可与靶多核苷酸杂交，并通过链置换重复引物延伸以产生置换的引物延伸产物；(v)包含前启动子并包含与置换的引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸的杂交，杂交条件为允许通过RNA聚合酶进行转录(这些条件通常但并非必需包括引物延伸产物3′末端的延伸以产生双链启动子区域)，这样产生包含与置换的引物延伸产物具互补序列的RNA转录本；和(b)用RNA依赖的DNA聚合酶延伸第二引物，以产生包含第二引物延伸产物和RNA转录本的复合体；(c)用可切除RNA/DNA杂合体中RNA的酶切除步骤(b)复合体中的RNA；(d)单链第二引物延伸产物与前启动子多核苷酸杂交，其中前启动子多核苷酸包含前启动子和在允许通过RNA聚合酶进行转录的条件下(这些条件通常但并非必需包括引物延伸产物3′末端的延伸以产生双链启动子区域)与单链第二引物延伸产物杂交的区域，从而产生包含目的序列的RNA转录本；由此产生多拷贝目的核酸序列。

在此描述了基于复合引物的本发明方法中所用的复合引物的多种实施方案。例如，在一些实施方案中，复合引物的RNA部分相对于3'DNA部分而言为5’。在另外的实施方案中，5′RNA部分毗邻3′DNA部分。对于此处描述的基于复合引物的方法，可应用一条或多条复合引物。在基于复合引物的方法的优选实施方案中，第一和第二引物不同(例如第一引物是复合引物，而第二引物不是复合引物)。在第一、第二引物不同的优选实施方案中，引物可与相似的、优选地相同的序列杂交。在另外的基于复合引物方法的实施方案中，第一和第二引物可与不同的序列杂交。

在此也描述了包含终止序列的多核苷酸的多个示例性实施方案。在一些实施方案中，包含终止序列的多核苷酸为模板转换寡核苷酸(TSO)，其可以(但并非必需)包含一处或多处修饰以增加与模板的结合。因此，在一些实施方案中，TSO在与模板杂交的区域中包含修饰，其在给定的一组条件下与没有修饰的TSO相比，可以更牢固地与该区域结合。此处提供了合适修饰的实例。在一些实施方案中，包含终止序列的多核苷酸为阻断序列，其与TSO一样，可包含一处或多处修饰以增加与模板的结合。因此，在一些实施方案中，阻断子序列在与模板杂交的区域包含修饰，其中在给定的一组条件下与没有修饰的阻断子序列相比，修饰的阻断子序列可更牢固地与该区域结合。此处提供了合适修饰的实例。

此处描述了可用于本方法和组合物中的酶类。例如，切除RNA的酶可为RNaseH。

在一些方面，TSO提供了前启动子功能，并还包含与置换的引物延伸产物杂交的区域(其可与或不与启动子毗邻)。在其它的实施方案中，包含前启动子的多核苷酸在3’末端包含与置换的引物延伸产物杂交的区域，由此置换的延伸产物通过DNA聚合酶的延伸产生了可启动转录的双链启动子。在一些实施方案中，包含前启动子的多核苷酸为前启动子模板寡核苷酸(PTO)。在一些实施方案中，包含前启动子的多核苷酸为这样的多核苷酸，其包含(a)终止序列，在其可与靶多核苷酸杂交的情况下并不实现模板转换；(b)前启动子序列，其中当终止序列可与靶多核苷酸杂交的情况下，前启动子序列不可与靶多核苷酸杂交；和(c)可与该靶多核苷酸的互补序列杂交的序列。

本发明的另一方面提供了产生多拷贝目的核酸序列的方法，其包括：(a)将包含目的序列的单链靶多核苷酸与第一引物杂交；(b)前启动子模板转换寡核苷酸(TSO)的杂交，其中所述TSO包含前启动子序列和可与靶多核苷酸5’杂交的区域，其中所述靶多核苷酸的5′为相对于第一引物与靶多核苷酸的杂交而言；(c)在DNA聚合酶的作用下延伸第一引物，以产生包含与前启动子TSO的前启动子序列具互补序列的第一引物延伸产物，因此产生了第一引物延伸产物、靶多核苷酸和前启动子TSO的复合体，其中所述复合体包含双链启动子区域；(d)用DNA依赖的RNA聚合酶从双链启动子区域转录产生正义RNA转录本；(e)第二引物(其通常且优选地与第一引物相同)与步骤(d)的正义RNA转录本杂交；(f)第二引物在RNA依赖的DNA聚合酶的作用下延伸，以产生包含第二引物延伸产物和RNA转录本的复合体；(g)用从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶切除步骤(f)复合体中的RNA；(h)单链第二引物延伸产物与前启动子多核苷酸杂交，其中前启动子多核苷酸包含前启动子并包含与单链第二引物延伸产物在允许RNA聚合酶进行转录的条件下杂交的区域，这样包含目的序列的正义RNA转录本得以产生；由此产生多拷贝目的核酸序列。

另一方面，本发明提供了产生多拷贝目的核酸序列的方法，其包括(a)组合：上述第一引物延伸产物、靶多核苷酸和前启动子TSO的复合体，其中该复合体包含双链启动子区域；RNA聚合酶；可与包含目的序列的正义RNA转录本杂交的第二引物(其通常且优选地与第一引物相同)；RNA依赖的DNA聚合酶；从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶；以及包含前启动子并包含与第二引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸；和(b)孵育步骤(a)的混合物，孵育条件为允许引物的杂交和延伸、RNA切除、前启动子多核苷酸与引物延伸产物杂交以形成包含引物延伸产物和前启动子多核苷酸的复合体，以及RNA转录，由此产生了多拷贝目的核酸序列。

本发明的另一方面提供了用于产生多拷贝目的核酸序列的方法，其包括：(a)组合：按如前所述产生的正义RNA转录本；可与RNA转录本杂交的第二引物(其通常且优选地与第一引物相同)；RNA依赖的DNA聚合酶；从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶；包含前启动子并包含与第二引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸；以及RNA聚合酶；和(b)孵育步骤(a)的混合物，孵育条件为允许引物的杂交和延伸、RNA切除、前启动子多核苷酸和引物延伸产物杂交以形成包含引物延伸产物和前启动子多核苷酸的复合体，以及RNA转录，由此多拷贝的目的核酸得以产生。

本发明的另一方面提供了用于产生多拷贝目的核酸的方法，其包括：(a)组合：靶多核苷酸；可与靶多核苷酸杂交的第一引物；包含前启动子序列并包含可与靶多核苷酸5’区(相对于第一引物与靶多核苷酸的杂交而言)杂交区域的前启动子模板转换寡核苷酸；任选地DNA依赖的DNA聚合酶；RNA聚合酶；可与包含目的序列的正义RNA转录本杂交的第二引物(其通常且优选地与第一引物相同)；RNA依赖的DNA聚合酶；切除RNA/DNA杂合体中RNA的酶；以及包含前启动子并包含与第二引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸；和(b)孵育步骤(a)的混合物，孵育条件为允许引物杂交和延伸、RNA切除、前启动子多核苷酸与引物延伸产物杂交以形成包含引物延伸产物和前启动子多核苷酸的复合体，以及RNA转录，由此多拷贝的目的核酸得以产生。

在另一方面，本发明提供了产生多拷贝目的核酸的方法，其包括：(a)将第二引物与RNA转录本杂交，其中所述RNA转录本产生的过程包括(i)包含目的核酸序列的单链靶多核苷酸与第一引物(其通常且优选地与第二引物相同)杂交；(ii)杂交前启动子模板转换寡核苷酸(TSO)，其中所述TSO包含前启动子序列和可与靶多核苷酸的5’区(相对于第一引物与靶多核苷酸的杂交而言)杂交的区域；(iii)在DNA聚合酶作用下延伸第一引物，以产生包含与前启动子TSO的前启动子序列具互补序列的第一引物延伸产物，由此产生第一引物延伸产物、靶多核苷酸和前启动子TSO的复合体，其中该复合体包含双链启动子区域；(iv)在DNA依赖的RNA聚合酶作用下从双链启动子区域转录，以产生正义RNA转录本；(b)在RNA依赖的DNA聚合酶的作用下延伸第二引物，以产生包含第二引物延伸产物和RNA转录本的复合体；(c)用从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶切除步骤(b)复合体中的RNA；(d)单链第二引物延伸产物与前启动子多核苷酸杂交，其中前启动子多核苷酸包含前启动子并包含与单链第二引物延伸产物在允许RNA聚合酶发生转录的条件下杂交的区域，这样包含目的序列的正义RNA转录本得以产生；由此产生了多拷贝目的核酸序列。

在基于前启动子TSO的方法的优选实施方案中，第一引物和第二引物是相同的。在其它基于前启动子TSO的方法的实施方案中，第一引物和第二引物不相同。在第一和第二引物不同的某些实施方案中，引物可与相似的、优选地相同的序列杂交。在其它的基于前启动子TSO的方法的实施方案中，第一和第二引物可与不同的序列杂交。

该方法可用于扩增任何靶DNA或RNA，包括例如基因组DNA或RNA和cDNA。可结合和/或顺序操作一个或多个步骤(通常可以任何次序操作，只要可形成所需的产物)。

本发明也提供了使用(通常为分析)本发明扩增产物的方法，例如测序和序列变化的检测。根据本发明的一种测序方法包括：(a)应用本发明的方法在rNTPs和rNTP类似物的混合物存在下扩增靶多核苷酸，这样在rNTP类似物掺入后转录终止；和(b)分析扩增产物以确定序列。

根据本发明的另一测序方法包括：(a)用本发明的方法扩增靶多核苷酸，其中由第一引物延伸产物产生的RNA转录本在rNTPs和rNTP类似物的混合物存在下进行扩增，以使转录在rNTP类似物掺入后终止；和(b)分析扩增产物以确定序列。根据本发明的另一序列分析方法包括：(a)通过本发明的方法扩增靶多核苷酸；和(b)分析扩增产物的单链构象，其中与参考单链多核苷酸相比构象上的差异说明在靶多核苷酸序列中存在突变。

本发明提供了鉴定靶多核苷酸中目的序列的方法，其包括(i)通过本发明的方法扩增包含目的序列的靶多核苷酸，其中复合引物的RNA部分的序列已知，以及(ii)将步骤(i)的扩增产物(如果有的话)与由参考模板扩增的产物量进行比较，其中(1)从靶多核苷酸模板中扩增的可检测出的产物量少于从包含复合引物RNA部分互补区域的参考模板中扩增的产物量，说明靶多核苷酸不包含与复合引物RNA部分互补的序列，且相对于复合引物RNA部分的互补序列而言为一序列变体，或(2)从靶多核苷酸模板中扩增的可检测出的产物量多于从不包含与复合引物RNA部分互补区域的参考模板中扩增的产物量，说明靶多核苷酸包含与复合引物RNA部分互补的序列，且相对于复合引物RNA部分的互补序列而言为非序列变体。

在本发明的方法中，复合引物RNA部分的序列可包含与目的序列互补的序列，所述目的序列可为野生型序列、突变序列或等位基因变体序列。

本发明的方法可用于靶核酸序列的检测和定量。

例如，一方面，本发明提供了测定目的序列的方法，其包括核酸扩增产物的测序，其中所述核酸扩增产物由此处描述的扩增方法产生。扩增产物的测序揭示了目的序列的序列。

又在另一实例中，本发明提供了检测在样本中目的核酸序列存在的方法，该方法包括在核酸扩增产物中检测目的序列的存在，所述核酸扩增产物由此处描述的扩增方法产生。扩增产物中目的序列的检出表示在样本中存在目的序列。

在本发明方法的多个实施方案中，目的序列包含突变。在一些目的序列包含突变的实施方案中，突变为单核苷酸多态现象。在一些实施方案中，目的序列的检测包括将包含目的序列的扩增产物与核酸探针杂交，其中所述核酸探针可与该目的核酸序列杂交。在其它的实施方案中，目的序列的检测包括含目的序列的互补序列的扩增产物的杂交，杂交应用可与该互补序列杂交的核酸探针。在一些实施方案中，核酸探针包含DNA。在其它实施方案中，核酸探针包含RNA。在一些实施方案中，探针以微阵列形式提供。在一些实施方案中，微阵列包含固定在基片上的探针，基片的制作材料选自纸、玻璃、塑料、聚丙烯、尼龙、聚丙烯酰胺、硝酸纤维、硅和光纤。在一些实施方案中，目的序列或其互补序列通过进行有限引物延伸进行检测，其中有限引物延伸包括延伸与扩增产物杂交的引物，以使引物延伸产物得以产生，其中所述引物延伸产物具有证明目的序列存在或不存在的特征。

这样，本发明的方法用于靶核酸序列的检测或定量。本发明的单链核酸扩增产物也可通过探针(如固定的探针)杂交用于对靶核酸序列的检测和定量。本发明也提供了制备微阵列的方法，其包括(a)用本发明的方法扩增靶多核苷酸；和(b)将扩增产物固定到基片上，以制作包含扩增产物的微阵列。

本发明一方面提供了在样本中确定基因表达谱的方法，其包括：(a)用本发明的方法扩增样本中至少两段目的序列；和(b)确定每段目的序列扩增产物的量，其中每一所述量指示出样本中每一目的序列的量，由此确定出样本的基因表达谱。在一个实施方案中，每一靶多核苷酸均为cDNA。在另一个实施方案中，每一靶多核苷酸均为RNA。

本发明也提供了包含此处描述的扩增方法中所用的多种组分(和组分的多种组合)的组合物、试剂盒、复合体、反应混合物和体系。本发明一方面提供了用于扩增目的序列的体系，其包含：(a)第一引物(为复合引物)；(b)第二引物；(c)DNA依赖的DNA聚合酶；(d)RNA依赖的DNA聚合酶；(e)前启动子多核苷酸；(f)RNA聚合酶；和(g)从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶；和任选地(h)包含终止多核苷酸序列的多核苷酸。本发明的另一方面提供了用于扩增目的序列的体系，其包含：(a)前启动子TSO；(b)第一引物；(c)任选地DNA依赖的DNA聚合酶；(d)RNA依赖的DNA聚合酶；(e)从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶；(f)RNA聚合酶；和任选地(g)第二引物。

在另一方面，本发明提供了包含此处描述组分的多种组合的反应混合物(或包含反应混合物的组合物)。在另一方面，本发明提供了用于进行此处描述方法的试剂盒。这些试剂盒包装适宜且通常(但并非必需)包括适宜的说明书，试剂盒中包含一种或多种用于扩增方法的组分。例如，本发明提供的试剂盒包含可与靶多核苷酸杂交的复合引物(例如包含3′DNA部分和RNA部分，RNA部分可在5′且还可与3′DNA部分毗邻)、前启动子多核苷酸和根据此处描述的任一基于复合引物的方法扩增靶多核苷酸的说明书。试剂盒内的复合引物和前启动子多核苷酸可为此处描述的任何一种。试剂盒可进一步包含以下组分，如任一种(a)包含终止多核苷酸序列的多核苷酸；(b)任一种此处描述的酶，例如从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶(如RNaseH)；(c)前启动子TSO；和(d)第二引物。在另一实例中，本发明提供的试剂盒包含前启动子TSO和第一引物(其可是或不是复合引物)，二者均可与靶多核苷酸杂交，且试剂盒还包含用于根据此处描述的任一基于前启动子TSO的方法扩增靶多核苷酸的说明书。试剂盒还可包含如以下组分，如任一种(a)任一种此处所述的酶，如从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶(如RNaseH)；(b)包含前启动子并包含与第二引物延伸产物杂交的区域的多核苷酸；和(c)任选地第二引物。

附图简述

图1A-F为用阻断子序列组分作为终止多核苷酸来进行复合引物等温扩增方法的步骤图解。

图2A-E为用模板转换寡核苷酸序列作为终止多核苷酸来进行复合引物等温扩增方法的步骤图解。

图3A-B为应用模板转换进行单引物等温扩增DNA靶的步骤图解。

图4A-B为应用模板转换进行单引物等温扩增RNA靶的步骤图解。

实施本发明的模式

本发明提供了用于扩增核酸序列的方法、组合物和试剂盒。靶核酸序列的扩增可有利地用于多种情况，例如当靶多核苷酸以非常少的量存在，或可获得的靶多核苷酸分子非常少，或为了对特定靶核酸进行核苷酸序列测定时。

一方面，本发明提供了通常使用RNA/DNA复合引物和两套或轮转录步骤(每套或轮在此处称为“转录组件”)的方法，该方法基于前启动子多核苷酸与中间体多核苷酸的杂交。另一方面，本发明提供的方法包括在第一转录组件中应用前启动子模板转换寡核苷酸来产生中间体多核苷酸复合体，该复合体可转录产生正义RNA转录本，且在第二转录组件中，进一步通过转录扩增第一转录组件的RNA转录本。

一方面，扩增方法通常如下起作用：复合RNA/DNA引物和第一前启动子多核苷酸形成第一转录组件中靶多核苷酸转录的基础。在一些实施方案中，终止序列通过转向或阻断沿靶链的复制提供复制的终点。通常，终止序列包含与靶链充分互补杂交的序列。如以下所描述，在一些实施方案中，包含终止序列的多核苷酸为模板转换寡核苷酸(TSO)，其除包含与靶链充分互补杂交的序列外，还包含与靶链不能充分互补杂交的序列。DNA聚合酶利用引物开始拷贝靶多核苷酸以产生引物延伸产物。用从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶(如RNaseH)从模板链和引物延伸产物杂合体中切除(移去)RNA序列，在模板链上留出序列用以结合另一复合引物。然后第二链通过DNA聚合酶得以产生，其置换先前的复制链，产生了置换的延伸产物。包含前启动子并包含与置换的引物延伸产物杂交的区域的多核苷酸(其例如可为模板转换寡核苷酸或前启动子模板寡核苷酸)与置换的引物延伸产物杂交。

如果引物延伸产物包含前启动子序列，则前启动子多核苷酸(如模板转换寡核苷酸(TSO))与该序列的杂交产生双链启动子区域。当置换的引物延伸产物不包含合适的前启动子序列时，则使用前启动子多核苷酸(如前启动子模板寡核苷酸(PTO))掺入前启动子序列。前启动子多核苷酸结合到置换的引物延伸产物上。由置换的引物延伸产物产生的双链启动子在DNA依赖的RNA聚合酶作用下用以产生正义RNA产物(即包含靶序列的RNA，与其互补链对应)。然后第二引物与正义RNA转录本杂交，并在RNA依赖的DNA聚合酶的作用下延伸，以产生第二引物延伸产物和正义RNA转录本的复合体。可从RNA/DNA杂合体中切除RNA的核糖核酸酶(如RNaseH)切除复合体中的RNA。然后前启动子多核苷酸与单链第二引物延伸产物杂交，以产生双链启动子区域(如此处所描述，其可直接通过杂交或间接通过引物延伸产物沿前启动子多核苷酸延伸而得以产生)。从双链启动子区域转录产生包含目的序列的正义RNA转录本。

因此，本发明提供了产生至少一个拷贝的目的核酸序列的方法(通常为扩增靶多核苷酸序列的方法)，其包括下列组分的组合和反应：(a)包含靶序列的单链靶多核苷酸；(b)第一引物，为包含RNA部分和3′DNA部分的复合引物；(c)DNA聚合酶；(d)脱氧核糖核苷三磷酸或合适的类似物；(e)从RNA/DNA双链体中切除RNA的酶，如RNaseH；(f)任选地如任一种此处描述的包含终止序列的多核苷酸，其还包含与模板多核苷酸杂交的部分(或区域)；(g)包含前启动子序列(可为此处所描述的多种形式中的任一种)并包含与置换的引物延伸产物杂交区域的多核苷酸；(h)核糖核苷三磷酸或合适的类似物；(i)第二引物(其可与或不与第一引物相同)；和(j)RNA聚合酶，在适当条件下使置换链可进行转录。将该组合物置于合适的条件，以使(a)复合引物(和任选地包含终止序列的多核苷酸)与模板杂交；(b)从复合引物开始进行引物延伸，以形成双链体；(c)用RNaseH从RNA/DNA双链体中切除RNA；(d)另一复合引物(其通常且优选地与第一引物相同)与模板杂交，启动另一轮的引物延伸(由DNA聚合酶介导)，置换已由模板拷贝的链；(e)开始转录，以产生与复合引物延伸产物互补的RNA转录本；(f)第二引物与步骤(e)的RNA转录本杂交；(g)从第二引物开始引物延伸，以形成双链体；(h)核糖核酸酶(如RNaseH)从步骤(g)的双链体中切除RNA；(i)前启动子多核苷酸与步骤(h)产生的单链第二引物延伸产物杂交，以产生双链启动子区域(如此处描述的直接或间接地产生)；和(j)开始转录以产生包含目的序列的正义RNA转录本。用步骤(j)的正义转录本作为起始底物(第二引物可与之杂交)任选地重复第二组转录步骤，导致了目的序列指数级的扩增。

应当理解，有关此处描述的组合，并非必须将所有组分置于同一容器和/或同时进行反应。因此本发明提供了亚组合，只要亚组合可以清楚或含蓄地反映出此处描述的扩增操作/方法。

另一方面，作为一般性的总结，扩增方法作用方式如下：第一引物延伸过程中由于前启动子TSO与靶多核苷酸5’区(相对于第一引物与靶多核苷酸的杂交而言)杂交而发生模板转换，导致产生包含双链启动子区域的多核苷酸复合体。前启动子TSO包含可与靶多核苷酸杂交的一段序列和不能与靶多核苷酸杂交的一段序列(即在允许可杂交序列杂交的条件下也不杂交的序列)，其中不能杂交的序列包含前启动子序列。在第一转录组件中，第一引物沿靶多核苷酸的延伸，在TSO与靶多核苷酸杂交的位点处，第一引物的延伸转换到前启动子TSO的非可杂交序列。在靶多核苷酸是RNA的一些实施方案中，RNA在第一引物延伸后被切除。在靶多核苷酸为RNA的其它实施方案中，RNA在第一引物延伸后不被切除。引物延伸产物和TSO非可杂交序列的复合体包含双链启动子区域。由双链启动子区域开始转录产生正义RNA转录本。在第二转录组件中，这些正义RNA转录本用于进一步的扩增。在该第二转录组件中，第二引物(其通常且优选地与第一引物相同)与正义RNA转录本杂交，并在RNA依赖的DNA聚合酶的作用下延伸以产生第二引物延伸产物和正义RNA转录本的复合体。从RNA/DNA杂合体中切除RNA的核糖核酸酶(如RNaseH)切除复合体中的RNA。然后前启动子多核苷酸与单链第二引物延伸产物杂交，以产生双链启动子区域(如此处所述直接或间接地产生)。从双链启动子区域转录产生包含目的序列的正义RNA转录本。

因此，本发明提供了产生至少一个拷贝目的核酸序列的方法(通常为扩增靶多核苷酸的方法)，其包括下列组分的组合和反应：(a)单链靶多核苷酸；(b)可与靶多核苷酸杂交的第一引物，杂交部位在目的序列的3′端；(c)前启动子TSO；(d)DNA聚合酶；(e)脱氧核糖核苷三磷酸或合适的类似物；(f)RNA聚合酶；和(g)核糖核苷三磷酸或合适的类似物；(h)可与第一转录步骤产生的RNA转录本杂交的第二引物(其通常且优选地与第一引物相同)；(i)从RNA/DNA双链体中切除RNA的酶(如RNaseH)；(j)与第二引物延伸产物杂交的前启动子多核苷酸(可为此处描述的多种形式中的任何一种)。将该组合物置于合适的条件，以使(a)第一引物和前启动子TSO与靶多核苷酸杂交；(b)第一引物沿靶多核苷酸进行引物延伸，并在模板转换之后沿前启动子TSO的非杂交序列延伸，形成包含双链启动子区域的复合体；(c)从步骤(b)的双链启动子区域开始转录；和(d)第二引物(其通常且优选地与第一引物相同)与步骤(c)的RNA转录本杂交；(e)由第二引物开始引物延伸，以形成双链体；(f)核糖核酸酶如RNaseH切除步骤(e)的双链体中的RNA；(g)前启动子多核苷酸与单链第二引物延伸产物杂交，以产生双链启动子区域(如此处所述直接或间接地产生)；和(h)开始转录以产生包含目的序列的正义转录本。

本发明的任一方法可通过在合适的步骤掺入标记核苷酸而用于产生标记的RNA产物。这些标记产物特别适于由本领域已知的方法进行核酸的定量和/或鉴定，包括应用于阵列如cDNA微阵列和寡核苷酸阵列。

在一些实施方案中，本发明提供了对目的核酸序列进行测序的方法。对于基于此处所描述方法的测序方法，其使用了经标记或未经标记的合适rNTPs或其类似物。因此，本发明提供了基于以上描述的方法，对包含目的序列的靶多核苷酸进行测序的方法，其中使用了rNTPs和rNTP类似物，它们为标记或未标记的引物延伸终止子，且扩增产物用以分析序列信息，如以下所描述。转录测序可使用rNTPs和rNTP类似物，用于对DNA和RNA靶序列进行测序。

本发明提供了在靶序列中检测核酸序列突变的方法。在一个基于复合引物方法的实施方案中，靶多核苷酸中突变的存在与否通过扩增靶多核苷酸的能力得以检测，其中所述扩增应用本发明的方法，其采用的复合引物的RNA部分包含或缺乏突变序列。本发明方法的扩增产物也可用于鉴定目的序列。例如可对扩增产物进行测序来确定目的序列。它们也可用于检测突变，例如通过与特定探针的杂交来检测。扩增产物也可通过检测单链构象多态性用来检测和/或鉴定靶核酸序列中的序列改变或单核苷酸多态性。这样，本发明提供了鉴定(例如检测和/或定量)目的序列的方法，所述方法为用本发明的扩增方法产生RNA产物，并通过检测/定量方法(如基于阵列技术或液相技术)来分析产物。通常(但并非必需)这些扩增产物为标记的。

又在另一实施方案中，本发明提供了用本发明扩增方法的产物产生核酸(RNA)微阵列的方法。

以下提供了关于本发明各种组分的详细资料。

一般技术

本发明采用了(除非另外指出)常规分子生物学技术(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术，它们均包括在本领域内的范畴。这些技术在文献中详细阐明，如“分子克隆：实验室手册”第二版(Sambrook等，(1989))；“寡核苷酸合成”(M.J.Gait编辑，1984)；“动物细胞培养”(R.I.Freshney编辑，1987)；“酶学方法”(学院出版社)；“分子生物学最新方法”(F.M.Ausubel等编辑(1987))和更新期刊)；“PCR：聚合酶链反应”(K.Mullis等编辑(1994))。

本发明应用的引物、寡核苷酸和多核苷酸可用本领域公知的标准技术产生。本发明的引物可用本领域已知的方法制备。引物优选地通过化学方法合成。例如，Caruthers等(酶学方法，第154卷，287页(1987))描述了应用标准的磷酰胺固相化学通过磷酸二酯键加入核苷酸的方法。

定义

此处所用的“靶多核苷酸”是已知或怀疑包含目的核酸序列的多核苷酸，目的序列为需要扩增的序列。就目的核酸的实际序列而论，目的核苷酸序列可为已知或未知。通常，此处所用的“模板”为包含目的核酸序列的多核苷酸。在一些例子中，术语“靶序列”、“模板DNA”、“模板多核苷酸”、“靶核酸”及其变化的说法可以交换使用。

此处所用的“扩增”通常指产生多拷贝所需序列的方法。“多拷贝”指至少2个拷贝。“拷贝”并非必须与模板序列完全互补或相同。例如拷贝可包含核苷酸类似物(如脱氧肌苷)、特意进行的序列改变(例如通过由包含可杂交但并非与模板互补的序列的引物引入的序列改变)和/或扩增过程中发生的序列错误。

此处所用“正义”多核苷酸(例如，正义RNA转录本)指包含来自靶核酸序列的目的序列的多核苷酸，与其互补链相对应。

“多核苷酸”或“核酸”此处可互用，指任何长度的核苷酸聚合物，且包括DNA和RNA。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或可由DNA或RNA聚合酶掺入聚合物的任一底物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸及它们的类似物。如果存在修饰的话，对核苷酸结构的修饰可在多聚体装配之前或之后进行。核苷酸的序列可由非核苷酸组分打断。多核苷酸可在聚合后进一步修饰，例如与标记组分连接。其它类型的修饰包括如“加帽”、将一种或多种天然存在的核苷酸替换为其类似物、核苷酸间修饰，例如那些带有无电荷键(如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等)的多核苷酸和那些带电荷键(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的多核苷酸，那些包含悬挂部分的多核苷酸，其中所述悬挂部分如蛋白质(如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)，那些带有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的多核苷酸，那些包含螯合剂(如金属、放射活性金属、硼、氧化金属等)的多核苷酸，那些包含烷化剂的多核苷酸，那些具已改变键的多核苷酸(如α-端基异构核酸等)，以及多核苷酸的未改变形式。此外，任何通常存在于糖中的羟基可被膦酸基、磷酸基替换，可用标准保护基团保护，或可被活化以制备与其它核苷酸连接的其它键，或可被连接至固相载体。5′和3′末端的OH可被磷酸化或用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团取代。其它羟基也可被衍生为标准的保护基团。多核苷酸也可包含通常在领域内已知的核糖或脱氧核糖的类似物形式，包括如2′--O-甲基-、2′-O-烯丙基、2′-氟-或2′-叠氮基-核糖、碳环形糖类似物、α-端基异构糖、差向异构糖(如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷类似物(如甲基核苷)。一个或多个磷酸二酯键可由其它连接基取代。这些其它连接基包括但不限于以下实施方案，在实施方案中磷酸酯被P(O)S(″硫酯″)、P(S)S(″二硫酯″)、(O)NR₂(″酰胺化物″)、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH₂(″formacetal″)取代，其中每一R或R′独立地为H或者为取代或未取代烷基(1-20C)，取代或未取代烷基任选地包含醚(-O-)键、芳基、链烯基、环烷基、环链烯基或芳烷基。多核苷酸中并非所有的键都需要相同。前面的描述适用于所有此处提及的多核苷酸，包括RNA和DNA。

此处所用的“第一转录组件”指直至并包括第一转录步骤的本方法的过程。此处所用的“第二转录组件”是指从第一转录组件产生的RNA转录本的引发开始到产生DNA产物，直至并包括第二转录步骤的本方法的过程。

此处所用的“标记rNTP”分别指直接或间接地与标记结合的rNTP或其类似物。例如，“标记的”rNTP可为直接用如染料和/或可检测部分标记的rNTP，其中所述可检测部分如特异结合对(如生物素-亲和素)中的一员。“标记的”rNTP也可通过将rNTP结合到如标记可结合的部分而进行间接标记。rNTP也可包含这样一个部分(如胺基)，在rNTP掺入延伸产物后该部分可结合标记。本发明中有用的标记包括荧光染料(如异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等)、放射性同位素(如³H、³⁵S、³²P、³³P、¹²⁵I或¹⁴C)、酶(如lacZ、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、地高辛配体)和显色标记如胶体金或有色玻璃或塑胶(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠。可应用多种抗配体和配体(作为标记本身或用作结合标记的物质)。当配体具有天然抗配体(例如生物素、甲状腺素和氢化可的松)时，该配体可用于连接标记的抗配体。

此处所用的rNTP的“类型”指核苷酸的特定碱基，即腺嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或鸟嘌呤。

此处所用的“寡核苷酸”通常指短的、通常为单链、通常为合成的多核苷酸，其长度通常但并非必需少于200个核苷酸。本发明的寡核苷酸包括复合引物、TSO、PTO和阻断子序列。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不互相排斥。以上对多核苷酸的描述同样且完全适用于寡核苷酸。

“引物”通常是指带有游离3′-OH基团的核苷酸序列，其可与模板序列(如靶RNA或引物延伸产物)杂交，且能够启动与模板互补的多核苷酸的聚合。“引物”可为如一段寡核苷酸。它也可为如与模板(例如引物延伸产物)自身序列杂交(例如作为发卡环)的模板序列，且能够启动核苷酸的聚合。

此处所用的“随机引物”是指引物包含的序列并非基于特定或具体的模板序列而设计，而是基于可与模板中的一段或多段序列杂交(在特定条件下)的统计学预期序列(随机引物的序列)。随机引物的序列(或其互补序列)可为或不为天然存在的序列，或存在于目的样本的序列池中。在单一反应混合物中扩增多种RNA样本，通常需利用随机引物的多重性(优选地为大的多重性)。如本领域已经熟知，“随机引物”也可指设计为与所需和/或大量的靶序列杂交的引物群(大量的随机引物)中的一员。随机引物可在核酸序列的多个位点进行杂交。随机引物的使用提供了不需预先了解靶的确切序列而通过聚合酶产生与靶核苷酸互补的引物延伸产物的方法。

此处可互用的“终止多核苷酸序列”或“终止序列”是指使针对包含靶序列的模板通过DNA聚合酶进行的DNA复制作用被终止的多核苷酸序列。终止序列包含通常与模板在终止点(位点)的5’杂交的部分(或区域)。可杂交的部分可包含或不包含整个终止序列。此处提供了合适的终止多核苷酸序列的实例(如阻断子序列和TSOs)。合适的终止多核苷酸序列的其它实例包括如此处所描述的含有一段终止序列(其通常且优选地在终止序列可与靶多核苷酸杂交的条件下不实现模板转换)和一段前启动子序列的组合多核苷酸。

“阻断子序列”或“阻断序列”此处可互用，它们为终止序列的实例，且指与模板核酸在终止位点的5’结合(通常为高亲和力结合)的寡核苷酸，且其可终止针对包含靶序列的模板通过DNA聚合酶进行的DNA复制作用。对于用DNA聚合酶进行的延伸，阻断序列的3′末端可被或不被封闭。

“终止位点”或“终止点”此处可互用，是指在DNA聚合酶作用下聚合终止(通常为引物延伸)或模板转换之前，最后进行复制的模板位点、点或区域。例如对于TSO，终止位点为靶序列中的这样的位置或区域，其在将模板从模板多核苷酸转换到TSO的未杂交部分之前，与引物延伸产物3′末端互补的位置或区域。

此处应用的“原启动子序列”和“前启动子序列”是指单链DNA序列区域，其双链形式可介导RNA转录。在一些情况下，“原启动子序列”、“原启动子”、“前启动子序列”、“前启动子”、“启动子序列”和“启动子”可以互用。前启动子序列可由此处描述的任一前启动子多核苷酸提供，如由TSO、PTO提供，或由此处描述的包含终止序列(其通常且优选地在终止序列可与靶多核苷酸杂交的条件下不实现模板转换)和前启动子序列的组合多核苷酸提供。

此处应用的“模板转换寡核苷酸”、“靶转换寡核苷酸”或“TSO”是指这样的寡核苷酸，其包含可与模板在引物延伸终止位点的5’杂交的区域，并且通常由于不与模板杂交的序列使得引物延伸过程(在DNA聚合酶作用下)中产生模板转换。TSOs通常在领域内已知。“模板转换”是指模板核酸的变换，通常是指在单轮的引物延伸过程中从靶核酸转换到TSO的非杂交区域。

此处所用的“前启动子TSO”是指还包含不能与靶多核苷酸杂交(在一组给定的条件下，条件通常为当TSO的可杂交部分或区域与靶杂交时起作用的那些条件)的前启动子序列的TSO。前启动子序列通常(但并非必需)位于TSO的5′区域。

此处所用的“前启动子模板寡核苷酸(PTO)”指包含前启动子序列和可与引物延伸产物3′区域杂交的部分(通常为3’部分)的寡核苷酸。前启动子序列和可杂交部分可为一寡核苷酸的相同、不同或为重叠寡核苷酸。

与第二序列“相对应”的第一序列，如复合引物的RNA部分，是指第一序列与第二序列具有显著的序列同一性。该术语通常用于检测突变、或鉴定靶序列的情况下。

“抑制”是指与参考相比活性、功能和/或量的降低或减少。

“复合体”是组分的装配。复合体可稳定或不稳定，且可被直接或间接检测到。例如，如此处所述，如果给定反应的组分以及反应产物的类型，可推知复合体的存在。对本发明而言，复合体相对于最终扩增产物而言通常为一个中间产物。

多核苷酸或寡核苷酸的“部分”或“区域”(此处互用)为两个或多个碱基的相邻序列。在其它实施方案中，区域或部分至少为约3、5、10、15、20、25个相邻核苷酸中的任一种。

与另一序列“相邻的”区域、部分或序列直接毗邻该另一区域、部分或序列。例如，与复合引物的的5’DNA部分相邻的RNA部分直接与5’DNA区域毗邻。此实例的阐述见图lA-C。

“反应混合物”是组分的集合，其在合适的条件下反应并形成复合体(可为一中间体)和/或产物。

“A”、“an”和“the”等除非特别指出均表明包括复数形式。

“包含”意思是包括。

“允许”事件发生的条件或“适于”事件发生的条件(如杂交、链延伸等)或“合适的”条件为不阻止此类事件发生的条件。因此，这些条件允许、增强、促进和/或有利于事件的发生。本领域内并在此描述的这些条件取决于诸如核苷酸序列的性质、温度和缓冲液。这些条件也取决于所需进行的事件如杂交、切除、链延伸或转录。

此处使用的序列“突变”是指目的序列中与参考序列相比的任何序列改变。参考序列可为野生型序列或希望与目的序列进行对比的序列。序列突变包括由于替换、缺失或插入机制引起的序列中单核苷酸改变或多于一个核苷酸的变化。单核苷酸多态性(SNP)也为此处描述的序列突变。

此处所用的“单链构象多态性”和“SSCP”通常指单链核酸受其特定核酸序列影响的特定构象，单链多核苷酸序列的改变如单核苷酸的替换、缺失或插入导致单链多核苷酸构象的改变或多态性。多核苷酸的构象通常可用本领域已知的方法(如通过凝胶电泳、毛细管电泳测定电泳迁移率和/或对核酸内切酶消化的易感性)进行检测、鉴定和/或区别。

此处可互用的“微阵列”和“阵列”包括带有生化样本(靶，通常具有未确定的特性)推断的结合(如通过杂交)位点的阵列(优选地为规则阵列)的表面。在一个优选的实施方案中，微阵列指固定在基片特定部位的不同的多核苷酸或寡核苷酸探针的集合。阵列在基片上形成，其中制作基片的材料如纸、玻璃、塑料(如聚丙烯、尼龙)、聚丙烯酰胺、硝酸纤维、硅、光纤或任何其它合适的固体或半固体支持物，并制成二维(如玻璃片、硅芯片)或三维(例如针、纤维、珠、微粒、微滴定孔、毛细管)形状。构成阵列的探针可通过多种方式固定到基片上，包括(i)用照相平版印刷技术进行原位合成(如高密度寡核苷酸阵列)(见Fodor等，科学(1991)，251：767-773；Pease等，美国国家科学院院报(1994)，91：5022-5026；Lockhart等，自然生物技术(1996)，14：1675；美国专利号5,578,832；5,556,752和5,510,270)；(ii)以中到低密度点样/印制(如cDNA探针)到玻璃、尼龙或硝酸纤维上(Schena等，科学(1995)，270：467-470，DeRisi等，自然遗传学(1996)，14：457-460；Shalon等，基因组研究(1996)，6：639-645；和Schena等，美国国家科学院院报(1995)，93：10539-11286)；(iii)通过掩模(Maskos和Southern，核酸研究(1992)，20：1679-1684)和(iv)通过在尼龙或硝酸纤维杂交膜上斑点印迹(见例如Sambrook等编辑，1989，分子克隆：实验室手册，第二版，1-3卷，冷泉港实验室(冷泉港，纽约))。探针也可通过与锚杂交、通过磁珠或如在微滴定板或毛细管的液相中非共价固定片上。探针分子通常为核酸如DNA、RNA、PNA和cDNA，但也可包括蛋白质、多肽、寡糖、细胞、组织和其任一可特异结合靶分子的变化形式。

术语“3’”通常指这样的区域或位置，其在同一多核苷酸或寡核苷酸中为另一区域或位置的3’(下游)。

术语“5’”通常指这样的区域或位置，其在同一多核苷酸或寡核苷酸中为另一区域或位置的5’(上游)。

术语“3′-DNA部分”、“3′-DNA区域”、“3′-RNA部分”和“3′-RNA区域”是指位于朝向多核苷酸或寡核苷酸3’末端的多核苷酸或寡核苷酸部分或区域，可包括或不包括同一多核苷酸或寡核苷酸的3’最末端核苷酸或与3’最末端核苷酸连接的部分。3’最末端核苷酸优选地为从约1到约20个核苷酸，更优选地为从约3到约18个核苷酸，且更优选地为从约5到约15个核苷酸。

术语“5′DNA部分”、“5′DNA区域”、“5′ RNA部分”和“5′RNA区域”是指位于朝向多核苷酸或寡核苷酸5’末端的核苷酸或寡核苷酸的部分或区域，可包括或不包括同一多核苷酸或寡核苷酸的5’最末端核苷酸或与5’最末端核苷酸连接的部分。5’最末端核苷酸优选地为从约1到约20个核苷酸，更优选地为从约3到约18个核苷酸，且更优选地为从约5到约15个核苷酸。

“检测”包括任何检测方法，包括直接的和间接的检测。例如，“可检测到较少的”产物可直接或间接观察到，且该术语表明任何的减少(包括无产物)。同样，“可检测到更多的”产物指直接或间接观察到的增加。

扩增方法

以下是本发明的扩增方法的实例。应当理解即使提供了一般性的描述，也可应用多种其它实施方案。例如，谈到使用复合引物意指可使用此处描述的任何复合引物。

一方面，本发明的方法利用两个相连的转录组件：第一转录组件提供基于复合引物的线性核酸扩增，该扩增为基于转录的扩增(此处也称为“增强的线性扩增”)，第一转录组件接下来与第二转录组件相连，第二组件可使第一组件的扩增产物进行进一步的等温扩增。本发明的方法通常使用两条引物，对于待扩增的靶核酸链而言这两条引物均为同义。所有的扩增反应可为等温，且不需要热循环。

另一方面，产生多拷贝目的核酸的正义RNA转录本的方法基于应用前启动子模板转换寡核苷酸(TSO)以产生中间体多核苷酸产物，该产物可在第一组转录步骤(第一转录组件)中转录，以产生RNA转录本，RNA转录本由第二组转录步骤(第二转录组件)进一步扩增。

本扩增方法的产物可通过同质或异质的检测方法得以检测，包括通过凝胶电泳的大小和/或迁移特性或通过与特异序列的探针杂交进行鉴定。扩增产物的检出指示出靶核酸的存在。定量分析也是可行的。例如，通过比较来自包含未知量多核苷酸(包含靶序列)的试验样本和具有已知量多核苷酸(包含靶序列)参考样本的扩增产物量，可以确定试验样本中靶序列的量。如下所述，该扩增方法也可进一步扩展至分析序列的改变和对靶核酸测序。

随着单链DNA扩增产物的量增加，组分如游离PTO和/或其它前启动子多核苷酸的水平变得有限，因此控制了总扩增能力。这是本发明扩增方法的一个独特特性，其中可通过调节在本方法中使用的此类组分的量来精确调节用于最大检测潜在产量的扩增能力，这对进行核酸检测和定量方法是有利的。

调整扩增产物总量的能力(由反应混合物中组分如TSO的量决定)可推动更精确的靶多核苷酸的检测和/或定量。其它的已知扩增方法(如PCR、NASBA、TMA等)产生的过扩增可能会对应用两种或多种检测探针的方法进行的检测和/或定量构成影响。结合过多的分析物产生的″钩状效应″在本领域中是熟知的，并导致非线性和信号变弱而引起假阴性或信号强度减少(与预期的高分析物浓度时的水平相比)。本发明具有限制产物最大产量的优点，使产生的产物适用于选择的扩增产物检测的方法。

本发明扩增方法的其它优点是避免了启动子序列非特异掺入到引物延伸产物而导致的非特异扩增。在基于复合引物的方法中，启动子序列由此处描述的TSO和/或另一前启动子多核苷酸导入。在基于前启动子TSO的方法中，启动子序列在第一转录组件中由前启动子TSO导入，且启动子序列在第二转录组件中由另一前启动子多核苷酸如此处所述可为TSO导入。在基于前启动子TSO方法的第一转录组件中，双链功能启动子的形成依赖于引物延伸和模板转换。第二组件中功能启动子的形成需要第二引物延伸产物与前启动子多核苷酸如前启动子TSO杂交。在本发明方法中前启动子多核苷酸杂交的步骤增加了该方法的特异性。非特异延伸产物不大可能具有与前启动子多核苷酸互补的序列(如3′末端序列)，其中所述前启动子多核苷酸设计为可与引物延伸产物中特定的序列杂交。

本方法适用于DNA或RNA靶分子的扩增。例如，本发明的扩增方法可用于靶序列的检测、定量和测序。

基于复合引物的扩增方法

一方面，提供了应用复合引物产生目的核酸序列的多拷贝正义RNA转录本的方法。本发明基于复合引物的扩增方法提供了目的核酸序列的等温指数级扩增。该方法应用复合引物，并通常应用第二引物，其中第二引物通常(但并非必需)为非复合引物。在一个实施方案中，方法中也应用终止序列，例如阻断子序列(如在方法1中所描述)或TSO(如在方法2中所描述)。方法1和方法2在以下描述。

终止序列(如果使用的话，为TSO或阻断子序列成分)的加入用于产生具有明确3’末端的产物。在一些实施方案中，模板上引物结合位点5’的天然序列抑制核酸的聚合，结果引物延伸的终止得以实现。此类天然序列在领域内已知(如GC富含序列)或可由经验确定。当扩增基因组DNA以提供明确末端用于引物延伸时，终止序列的应用是特别有益的。不需要这些特性时，根据本发明方法的等温扩增也可在无终止序列时实施。

等温扩增利用三种酶：DNA聚合酶、核糖核酸酶如RNaseH和RNA聚合酶。方法1中的一个应用阻断子序列的实施方案在图1A-F中说明。方法2中的一个应用TSO的实施方案在图2A-E中说明。

本发明的基于复合引物的方法通常设计为扩增单链DNA靶。当待扩增的靶核酸为双链DNA时，首先变性靶以产生单链靶。靶变性可应用领域内已知的方法进行，如热变性或碱处理。当靶为单链RNA时(如mRNA或病毒RNA)，靶首先通过领域内已知的方法转录产生cDNA靶。

靶多核苷酸如上所述与复合引物、DNA聚合酶、核糖核酸酶如RNaseH和任选地阻断子序列成分或TSO结合。在一个实施方案中，每一扩增反应包括相同序列的复合引物。在另一实施方案中，每一扩增反应包括复合引物变体的混合物，此处的变体指两个或多个同源但不相同且都能与同一靶核酸序列杂交的序列。互补性优选地为至少约50％，更优选地至少约75％，且最优选地为至少约90％。此实施方案的优点包括将不同目的序列引入到引物延伸产物的能力。又在另一实施方案中，每一扩增反应包括复合引物的混合物，其中引物代表两个或多个具低或无同源性的不同序列，且其中引物优选地与同一靶核苷酸链上的不同靶核酸序列或不同位点杂交。此实施方案的优点包括通过在单一扩增反应中扩增多种靶核酸样本实现靶核酸的多重检测和/或分析。

应用阻断子序列的方法(或不应用终止多核苷酸的方法)导致产生置换的引物延伸产物，该产物与前启动子多核苷酸杂交形成复合体，用作RNA聚合酶的底物。利用TSO的方法导致产生独特的包含靶和模板转换寡核苷酸(TSO)相关部分的中间体扩增产物。TSO与置换的引物延伸产物杂交形成的复合体是RNA聚合酶的转录底物，转录产生与起始靶序列同义的RNA产物。

基于复合引物方法的两个示例性实施方案描述如下：

方法1：基于阻断子序列的核苷酸扩憎

在一些实施方案中，提供了基于阻断子序列的扩增方法。一个示例性实施方案在图1A-F中显示。

图1A-F阐述了以下方法的一个实施方案，该方法使用了此处所述的复合引物、阻断子序列和第三种寡核苷酸：启动子模板寡核苷酸(PTO)，其中所述阻断子序列组分为寡核苷酸或寡核苷酸类似物，如此处所描述其还可与同一与单引物杂交的靶核酸链上的序列杂交；其中所述启动子模板寡核苷酸(PTO)如此处所描述包含可杂交(且优选地为互补)到置换的延伸产物的3’末端的3’部分和包含DNA依赖的RNA聚合酶启动子序列的5’部分。至于在此处描述的TSO中，与启动子序列紧紧相邻的序列可设计为提供优选地在RNA聚合酶作用下用于本发明方法的扩增中的最佳转录活性。阻断子序列组分通常设计为与靶序列在其上游位点杂交，即相对于单引物杂交位点而言，阻断子序列的杂交位点位于靶的5’末端)。换一种说法，且如此处描述，阻断子序列与靶核酸序列的片段杂交，杂交处在靶序列的5’，与引物延伸产物的3’末端互补。阻断子序列以高亲和力结合靶，以在阻断子与靶杂交的位点处终止引物延伸。该特性提供了聚合酶作用下的引物延伸的有力终止位点，并确定了引物延伸产物的3’末端。

合适的反应介质和条件为此处所述。在一个实施方案中，转录在不同的温度进行，温度通常低于之前的步骤。在另一实施方案中，本方法的所有步骤在等温条件下进行。

单链核酸靶与复合引物、阻断子组分、前启动子模板(PTO)、DNA聚合酶、核糖核酸酶如RNaseH、DNA依赖的RNA聚合酶和核苷酸如NTPs(例如dNTPs和rNTPs)结合。复合引物和阻断子序列组分与同一靶链杂交形成三分子复合体I(图1A)。引物沿着靶延伸直至阻断子序列的杂交位点，形成复合体II(图1A)。

核糖核酸酶(例如RNaseH)切除RNA部分，通常为复合体II单复合引物的5’RNA部分，形成了复合体III(图1B)。如此处所描述，核糖核酸酶特异地切割RNA/DNA杂合体的RNA链，但并不消化单链RNA。这样，核糖核酸酶不会降解游离的复合引物。游离引物与复合体III中靶核酸的引物互补位点杂交(图1B)。此杂交导致形成复合体IV(图1B)，复合体中仅引物的5′RNA部分与靶链杂交。通过部分杂交的引物的3′DNA部分进行引物延伸产物5′最末端序列的置换，导致形成复合体V(图1C)，该复合体为DNA聚合酶的底物。引物沿靶链的延伸导致第一引物延伸产物(VI)从复合体中置换出来。循环进行RNaseH切割过程、游离复合引物的杂交和链置换产物的产生，以形成多条单链DNA产物(VII)。置换的延伸产物与靶序列完全互补且不包含不与靶互补的3’末端部分。

通过前启动子模板3′末端部分(A)与置换的引物延伸产物3’末端杂交，前启动子模板寡核苷酸(PTO)与置换的延伸产物结合形成复合体VIII(图1C)。如此处所述，PTO的3’末端可被封闭或不被封闭。当前启动子模板的3′末端不被封闭时，模板将沿置换的引物延伸产物进行延伸。置换的延伸产物的3′末端将在核苷酸(DNA)聚合酶作用下沿已杂交的前启动子模板的B部分延伸形成复合体IX(见图1D)，该复合体在一个末端包含用于DNA依赖的RNA聚合酶的双链启动子序列。复合体IX在图1D中描绘为PTO的3’末端封闭的由聚合酶延伸而产生的启动子模板寡核苷酸(PTO)杂交产物。另外，当启动子模板的3’末端不被封闭时，3’末端沿置换的引物延伸产物的延伸导致形成了完全的双链复合体。DNA依赖的RNA聚合酶将转录两种形式的复合体IX延伸的置换引物延伸产物。RNA聚合酶的选择要考虑到其转录复合体的部分双链体或完全双链体形式的能力。此转录步骤产生了多拷贝的正义单链RNA(X)(图1D)。

希望从每一引物延伸产物产生的RNA转录本的产量优选地为至少约1，更优选地至少约50，甚至更优选地至少约75，仍更优选地至少约100，且最优选地为至少约1000。

如在图IE中所示，第二组步骤(第二转录组件)使用第二寡核苷酸引物4，该引物相对于靶核酸序列而言，为与复合引物同义)、如第一组件中应用的启动子模板寡核苷酸、RNA依赖的DNA聚合酶或反转录酶(RT)、DNA依赖的DNA聚合酶、RNaseH和DNA依赖的RNA聚合酶。如本领域内已知的，DNA聚合酶、反转录酶和RNaseH酶活性可包含在同一种酶内。

这两个组件组合进行或顺序进行。为了简单起见，此处描述的步骤为顺序步骤。第一组步骤的反应混合物中的一份与包含以上提到的组分的混合物合并，且扩增反应等温进行。

第二引物4与第一组件的RNA产物的3’末端序列杂交。因此第二引物通常设计为与这样的序列互补，所述序列在第一组步骤中所用复合引物的互补序列的上游，该第二引物如为巢式引物。第二引物通常(尽管并非必需)为DNA寡核苷酸(通常但并非必需为非复合引物)。杂交引物通过反转录进行延伸形成RNA/DNA双链复合体XI(图IE)。复合体XI的RNA链经RNaseH切除产生单链DNA产物XII(图IE)，该产物相对于靶核酸序列为反义(即互补)，与第一组步骤的引物延伸产物类似。

引物延伸产物XII的3’末端通常与启动子模板寡核苷酸的3’末端互补(如第一组步骤的引物延伸产物)。产物XII与启动子模板寡核苷酸的杂交导致形成了复合体XIII(图1E)。引物延伸产物的3’末端沿启动子模板寡核苷酸通过反转录进行延伸，形成部分的双链体XIV(图IF)，该双链体在一端具有双链启动子序列。部分的双链体XIV为用于转录的底物，在DNA依赖的RNA聚合酶作用下形成正义RNA产物X(图1F)。

引物4与产物X杂交将重新启动描述为第二转录组件的过程，然后产生了循环扩增过程或指数级扩增。在第二组步骤中，目的起始序列扩增的程度将由启动子模板寡核苷酸和第二引物的浓度所限定。

作为以上描述的证据，本发明方法适用于靶核苷酸的高效扩增以及应用该扩增方法如进行此处所述的等温测序。

方法2：基于TSO的增强的线性核酸扩增

在一个实施方案中，本发明基于TSO的线性扩增方法与引物延伸产物的转录相连以提供增强的核酸扩增。该新型扩增方法(方法2)的一个实施方案的图解描述在图2A-2E中显示。

本发明的基于TSO的核酸扩增方法利用复合引物，如此处描述。本发明扩增方法中应用的第二种寡核苷酸为模板转换寡核苷酸(TSO)，如上所描述。待扩增的核酸靶可为DNA或RNA。对RNA靶的扩增，需要根据本领域已知方法的进行起始cDNA的合成步骤。本发明基于TSO的增强的线性扩增方法产生多拷贝与靶DNA序列同质(即为正义)的RNA产物。

单链靶核酸与复合引物、TSO寡核苷酸、DNA聚合酶、核糖核酸酶如RNaseH、DNA依赖的RNA聚合酶和核苷酸如脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)和核糖核苷三磷酸(rNTPs)在适合核酸杂交和扩增的反应介质中结合，这一点为本领域已知。在一个实施方案中，转录在不同的温度进行，通常在低于之前步骤的温度下进行。在另一实施方案中，本方法的所有步骤均在等温条件下进行。

在一个实施方案中，TSO作为终止序列行使功能并提供前启动子序列。在另一实施方案中，TSO不包含前启动子序列。在该实施方案中，前启动子序列由包含前启动子序列且可与引物延伸产物的3′部分杂交以使引物延伸产物的转录得以发生的另一寡核苷酸如PTO单独提供。

单复合引物和TSO然后与同一待扩增的核酸链杂交。在靶核酸变性步骤之前，这两种寡核苷酸可加到怀疑包含核酸靶的样本中。这两种寡核苷酸与靶链的杂交导致形成了三分子复合体XV(图2A)。

由DNA聚合酶进行引物延伸。引物沿复合体XV(图2A)的靶核酸链延伸并在TSO杂交位点处终止。模板从靶链转换到TSO的5′非杂交部分，且进一步沿TSO模板的引物延伸导致形成三分子复合体XVI，该复合体XVI包含靶核酸、TSO和第一引物延伸产物。第一引物延伸产物为包含靶依赖部分(即与靶核酸互补的序列)和TSO依赖部分(即与TSO非杂交部分互补的序列)的独特DNA。

复合体XVI(图2A)为RNA聚合酶和核糖核酸酶(如RNaseH)的底物。DNA依赖的RNA聚合酶结合到复合体XVI的功能性双链启动子，并转录第一引物延伸产物以产生正义RNA产物X(图2A)。可特异降解RNA/DNA异源双链体中RNA链的核糖核酸酶(如RNaseH)降解复合体XVI中引物延伸产物的5′部分，形成三分子复合体XVII(图2B)。

游离复合引物与复合体XVII(图2B)中靶核酸的引物互补位点杂交。该杂交过程导致形成了复合体XVIII(图2B)，其中仅引物的RNA部分(通常为5′RNA部分)与靶链杂交。将引物延伸产物的5′最末端序列用部分杂交引物的3′DNA部分(XVIII)替换，导致形成复合体XIX(图2B)，该复合体为DNA聚合酶的底物。引物沿靶链(XIX；图2B)的延伸导致第一引物延伸产物XX从复合体中的置换。重复引物延伸和链置换导致产生多拷贝的多核苷酸(XX；图2C)，该多核苷酸在很大程度上与靶核酸互补。

以上描述产生的引物延伸产物用作提供了包含前启动子序列的TSO的实施方案中的转录模板。置换的引物延伸产物(XX；图2C)与游离TSO寡核苷酸杂交形成部分双链体XXI(图2C)。复合体(双链体)XXI包含位于一端的双链部分和分别来源于引物延伸产物和TSO的两条非互补单链。此部分双链体中的双链部分包含一个完全的功能性双链启动子用于DNA依赖的RNA聚合酶。后者识别部分双链体XXI中的启动子，并转录引物延伸产物，以形成多拷贝的正义RNA产物X(图2C)。

如在方法1中所描述和在图2D-E中所显示的，以上描述的等温扩增通过将反应混合物和第二引物4、反转录酶、RNaseH、DNA依赖的RNA聚合酶和所需的核苷三磷酸组合，而与进一步的扩增相连。第二引物4如在方法1中所示与正义RNA产物的5′部分杂交，并通过反转录酶延伸形成RNA/DNA杂合双链体XXII(图2D)。RNaseH切除XXII的RNA链，产生单链反义DNA引物延伸产物XXIII(图2D)。该引物延伸产物的3′末端与TSO的一段序列互补。该引物延伸产物与游离TSO的杂交导致形成复合体XXIV(图2D)。DNA聚合酶沿TSO的5′末端对该引物延伸产物的3′末端进行延伸，形成部分双链体XXV(图2E)。后者为DNA依赖的RNA聚合酶的底物，因为在其一端包含双链启动子序列。引物延伸产物的转录导致产生了多拷贝的正义单链RNA产物X(图2E)。

第二引物4与RNA产物杂交，并通过反转录酶延伸重新启动如上描述的过程，这样使得如在方法1中描述的靶核酸序列得以循环扩增。

基于前启动子TSO的扩增方法

本发明基于前启动子TSO的方法以应用模板转换机制形成独特的引物延伸产物为基础。本发明的核酸扩增方法包括通过核苷酸聚合酶进行的引物延伸和不依赖于引物的转录。该方法应用单引物和可在引物延伸过程中实现模板转换的前启动子TSO。引物和前启动子TSO两者均与同一靶核酸链互补。前启动子TSO包含与靶多核苷酸互补的3’部分；以及包含不能与靶(在一组给定的条件下)杂交的5′部分，其中不能杂交的5′部分包含启动子的单链序列(其通常为TSO的5′最末端序列)，该启动子用于根据本发明方法扩增步骤中所用的DNA依赖的RNA聚合酶。在一些实施方案中，与前启动子序列紧挨的前启动子TSO的序列(如前启动子序列的3′)设计为在RNA聚合酶作用下可实现最大化转录的序列。此类序列在本领域内已知并在此描述。能够实现模板转换的TSO序列可根据本领域内已知的标准进行设计(见Patel等，美国国家科学院院报(1996)，93：2969-2974)；美国专利号5,679,512；5,683,879和6,030,774。

基于前启动子TSO的扩增方法通常使用几种酶：DNA依赖的DNA聚合酶、DNA依赖的RNA聚合酶、在RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶(如RNaseH)和RNA依赖的DNA聚合酶(如反转录酶)。酶活性可由单独的酶或由多种组合(即具有多种活性的一种或几种酶)提供。根据本发明方法扩增所用的酶可由商业渠道获得，这一点为本领域的技术人员所已知。

引物和前启动子TSO通常以高浓度提供，浓度与那些通常用于PCR方法的类似。靶多核苷酸的扩增水平通常由这些寡核苷酸的浓度限定。虽然引物通过掺入延伸产物而消耗，但前启动子TSO并不掺入延伸产物。如在图3A-B和5A-B中所描述，前启动子TSO参与起始的模板转换用以形成独特的复合体，该复合体为DNA依赖的RNA聚合酶的底物(一种转录过程)。在某些实施方案中，前启动子TSO也参与结合单链DNA产物(该单链DNA产物为从第一转录组件的RNA转录本进行反转录而产生)，以形成用于转录的第二底物，如在图3B中所示。应当理解，可以应用任何包含前启动子序列且包含可与该单链DNA产物杂交的区域的多核苷酸。例如可使用PTO。

与其它基于转录的等温扩增方案(如NASBA、TMA等)不同，本发明基于前启动子TSO的方法不需要形成完整的双链DNA产物，其中所述完整的双链DNA产物为那些先前描述的基于转录的核酸扩增方法中重要的中间体。既然不需要双链中间体DNA产物，那么就不需要应用正向和反向引物对(用于沿靶多核苷酸链及其互补链的引物延伸)。这样通过消除引物二聚体的形成降低了引物延伸反应的复杂性，所述引物二聚体为两条或多条引物杂交并延伸形成的双链底物，可用于以靶不依赖方式进行包含双链启动子的转录。应用本发明此处描述的单引物降低了该过程的复杂性。该过程通过应用不必被延伸的启动子模板而得以进一步简化，例如通过在第一引物延伸步骤和在与第二引物延伸产物的杂交中应用同一种前启动子TSO而简化该过程。

本发明基于前启动子TSO方法的一个示例性实施方案

靶核酸的扩增通常基于单链靶，因此通常使靶成为单链(如果不是单链的话)。因此，如果靶核酸是双链DNA，扩增的第一步是变性以产生单链靶。当靶核酸为RNA时，扩增可直接由单链靶RNA进行，如以下所示。另外，也可通过本领域已知的方法从RNA靶合成cDNA而进行扩增。

如在图3A-B中所示，在本发明方法的一个实施方案中，TSO和单引物与靶核酸链杂交形成三分子复合体I。复合体的靶链可为如在图3A-B所示的DNA，或为如在图4A-B所示的RNA。

DNA聚合酶沿复合体I的靶链进行引物延伸。当靶为DNA时，酶通常为DNA依赖的DNA聚合酶，但当靶为RNA时，酶通常为RNA依赖的DNA聚合酶(如反转录酶)。

如图3A-B和4A-B中所示，引物延伸从靶转换到前启动子TSO的5′非杂交部分，转换点为TSO与靶结合处，因此有效终止了靶特异序列的复制。沿TSO 5′非杂交部分的延伸导致形成了独特的延伸产物，该产物由靶相关部分和TSO相关部分组成。由靶、TSO和第一引物延伸产物形成的独特三分子复合体II(图3A和4A)包含双链启动子区域，因此使它成为DNA依赖的RNA聚合酶的底物。

如在图4A-B中所示，当靶为RNA时，复合体II的RNA链可被(但不是必需)RNaseH降解形成复合体IIa，该复合体包含前启动子TSO和第一引物延伸产物。该复合体还包含双链启动子且为RNA聚合酶的底物。

DNA依赖的RNA聚合酶与复合体II(图3)和IIa(图4)的双链启动子结合，并启动独特引物延伸产物的转录。该过程导致产生多拷贝的单链RNA产物，该产物与靶多核苷酸同义。

第二引物与正义RNA产物杂交形成复合体III(图3A和4B)。第二引物通常且优选地为与第一引物相同。在第一和第二引物不同的实施方案中，第二引物通常与第一引物的极性相同。沿RNA产物的引物延伸通过RNA依赖的DNA聚合酶(如反转录酶)进行，产生DNA/RNA的异质双链体IV(图3A和4B)。

复合体IV的RNA链用RNaseH消化，产生在RNA依赖的DNA聚合酶作用下形成的引物延伸的单链DNA产物(第二引物延伸产物)。游离的前启动子多核苷酸(在图3B中为前启动子TSO)与单链DNA产物的3′部分杂交形成复合体V(图3B)。如果用于第一步的前启动子多核苷酸为TSO，则与TSO上序列互补的位于第二引物延伸产物(DNA)上的序列可能已在模板转换过程掺入第二引物延伸产物。

前启动子多核苷酸(图3B中所示为TSO)与DNA产物的结合产生TSO的5′突出端，因此复合体V中单链DNA产物的3′末端沿前启动子多核苷酸(TSO)延伸以复制启动子序列。这导致形成了复合体VI(图3B)，该复合体包含一功能性双链启动子序列。复合体VI为DNA依赖的RNA聚合酶的底物。聚合酶与双链启动子结合并转录第二引物延伸产物以产生多拷贝的正义RNA产物。RNA产物为用于如以上描述的进一步引物杂交和延伸的底物。这样，循环扩增过程以产生多拷贝的正义RNA产物。

如果不有意终止，扩增可一直进行，直到所有游离TSO与第二引物延伸产物杂交或引物被完全消耗。

如在图3A-B中所示，在第一引物延伸产物的转录后一旦形成RNA产物，对DNA靶或RNA靶扩增而得到的该RNA产物是相同的，且从该步骤以后的扩增方案是相同的。

每个转录步骤(即第一或第二引物延伸产物的转录)预期导致产生的产物优选地至少约1、更优选地至少约100、更优选地至少约500、且最优选地至少约1000条源自起始模板的单链RNA产物的拷贝(在第一转录组件中，模板为靶多核苷酸；在第二转录组件中，模板为第一转录组件中产生的RNA转录本)。

本发明扩增方法的扩增产物为单链，因此用本领域已知的多种方法易于检测。用于单链核酸检测的同类或异类的方法是已知的，并适于本发明扩增方法中反应产物的检测和定量。

用于本发明方法中的组分和反应条件

模板核酸

待扩增的核酸靶包括任何来源的纯化或非纯化核酸，其可为DNA(dsDNA和ssDNA)或RNA(包括tRNA、mRNA、rRNA)、线粒体DNA和RNA、叶绿体DNA和RNA、DNA/RNA杂合体或它们的混合物、基因、染色体、质粒、生物材料的基因组或其片段，其中所述生物材料例如微生物(如细菌、酵母、病毒、类病毒、霉菌、真菌、植物、动物、人。核酸的获得和纯化应用本领域内的标准技术。在一些实施方案中，RNA靶的扩增需要起始的cDNA合成，这一点为本领域内已知。DNA/RNA杂合体的扩增需要杂合体的变性以获得ssDNA或ssRNA，或变性后由反转录步骤获得cDNA。靶核酸可仅为复杂混合物(如生物样本)的一小部分，且可由多种生物材料通过领域内已知的步骤获得。

靶多核苷酸扩增的起始步骤是获得单链多核苷酸。如果靶多核苷酸为双链，起始步骤为靶变性。变性步骤可为领域内已知的热变性或任一其它方法，如碱处理。

复合引物

一方面，本发明的方法使用由RNA和DNA部分组成的复合引物。如此设计引物的复合结构可使接下来通过结合新的(另外的)复合引物而置换引物延伸产物，并在聚合酶的作用下可对新引物进行延伸。此外，引物延伸产物RNA部分的切除导致产生的扩增产物不用作复合引物扩增的底物，如以下所描述。

本发明的方法和组合物中应用的复合引物包含至少一个RNA部分，该部分能够(a)与靶核酸(模板)上的序列结合(杂交)，此过程不依赖其DNA部分与靶核酸上序列的杂交；和(b)当与靶DNA杂交时可由核糖核酸酶切除。复合引物与靶核酸结合形成部分的异质双链体，其中仅引物的RNA部分在与核糖核酸酶如RNaseH接触时被切除，而靶链仍保持完整，这样使得另一复合引物可退火。

复合引物也包含能与靶核酸(模板)上的序列杂交的3′DNA部分，以至于它与靶序列(模板)的杂交优于在DNA聚合酶作用下从靶核酸置换下来的核酸链与靶序列(模板)的杂交。此类引物的合理设计基于已知的影响核酸结合亲和力的因素，如序列长度和/或同一性以及杂交条件。在一个优选的实施方案中，复合引物3′DNA部分与靶核酸上其互补序列的杂交优于置换链5′末端的同源序列与靶核酸的杂交。

产生适于通过聚合延伸的引物在领域内已知，如在PCT公开号WO99/42618(及其引用的参考文献)中所描述。复合引物包含RNA和DNA的组合(见以上的定义)，其3′末端核苷酸为适于核酸延伸的核苷酸。3′末端核苷酸当存在于引物中时在DNA聚合酶作用下可延伸的任一核苷酸或类似物。通常3′末端核苷酸具有3′-OH。合适的引物包括那些至少包含一个RNA部分和至少包含一个DNA部分的引物。例如，复合引物可包含5′RNA部分和3′DNA部分(其中RNA部分与3′-DNA部分邻近)；或5′和3′DNA部分中间间插有RNA部分。因此，在一个实施方案中，复合引物包含5′RNA部分和3′DNA部分，优选地其中RNA部分与3′DNA部分相邻。在另一实施方案中，复合引物包含5′和3′DNA部分，并具有至少一个插入的RNA部分(即RNA部分在两个DNA部分间)。又在另外的实施方案中，本发明的复合引物包含3′DNA部分和至少一个插入的RNA部分(即RNA部分在DNA部分之间)。

包含3′DNA部分和RNA部分的复合引物中RNA部分的长度可优选地从约1到约50，更优选地从约3到约20，甚至更优选地从约4到约15，且最优选地从约5到约10个核苷酸。在包含3′DNA部分和RNA部分的复合引物的一些实施方案中，RNA部分可至少为约1、3、4、5个核苷酸中的任何一种，其上限为约10、15、20、25、30、50个核苷酸中的任何一种。

包含5′RNA部分和3′DNA部分的复合引物中5′RNA部分的长度可优选地从约3到约50个核苷酸，更优选地从约5到约20个核苷酸，甚至更优选地从约7到约18个核苷酸，优选地从约8到约17个核苷酸，且最优选地从约10到约15个核苷酸。在包含5′RNA部分和3′DNA部分复合引物的其它实施方案中，5′RNA部分可至少为约3、5、7、8、10个核苷酸中的任何一种，其上限为约15、17、18、20、50个核苷酸中的任何一种。

在包含5′ RNA部分和3′DNA部分并进一步包含非5′RNA部分的复合引物的实施方案中，非5′RNA部分可优选地从约1到约7个核苷酸，更优选地从约2到约6个核苷酸，且最优选地从约3到约5个核苷酸。在包含5′RNA部分和3′DNA部分并进一步包含非5′RNA部分的复合引物的某些实施方案中，非5′RNA部分可至少为约1、2、3、5个核苷酸中的任何一种，其上限为约5、6、7、10个核苷酸中的任何一种。

在包含5′RNA部分和3′DNA部分并且5′RNA部分和3′DNA部分邻近的实施方案中，5′RNA部分的长度可优选地从约3到约50个核苷酸，更优选地从约5到约20个核苷酸，更优选地从约7到约18个核苷酸，优选地从约8到17个核苷酸，且最优选地从约10到15个核苷酸。在包含5′RNA部分和3′DNA部分并且5′RNA部分和3′DNA部分邻近的复合引物的某些实施方案中，5′RNA部分可至少为约3、5、7、8、10个核苷酸中的任何一种，其上限为约15、17、18、20、50个核苷酸中的任何一种。

在包含5′和3′DNA部分并且具有至少一个插入RNA部分的复合引物中，插入RNA部分的长度可优选地从约1到约7个核苷酸，更优选地从约2到约6个核苷酸，最优选地从约3到约5个核苷酸。在包含5′和3′DNA部分且至少具一个插入RNA部分的复合引物的一些实施方案中，插入RNA部分可至少为约1、2、3、5个核苷酸中的任何一种，其上限为约5、6、7、10个核苷酸中的任何一种。包含3′DNA部分和至少一个插入RNA部分的复合引物中，插入RNA部分的长度可优选地从约1到约7个核苷酸，更优选地从约2到约6个核苷酸，且最优选地从约3到约5个核苷酸。在包含3′DNA部分和至少一个插入RNA部分的复合引物的一些实施方案中，插入RNA部分可至少为约1、2、3、5个核苷酸中的任何一种，其上限为约5、6、7、10个核苷酸中的任何一种。在包含3′DNA部分和至少一个插入RNA部分且进一步包含5′RNA部分的复合引物中，5′RNA部分可优选地从约3到约25个核苷酸，更优选地从约5到约20个核苷酸，甚至更优选地从约7到约18个核苷酸，优选地从约8到约17个核苷酸，且最优选地从约10到约15个核苷酸。在包含3′DNA部分和至少一个插入RNA部分且进一步包含5′RNA部分的复合引物的一些实施方案中，5′RNA部分可至少为约3、5、7、8、10个核苷酸中的任何一种，其上限为约15、17、18、20个核苷酸中的任何一种。

在包含3′-DNA部分和RNA部分的复合引物中，3′-DNA部分的长度可优选地从约1至约20个核苷酸、更为优选地从约3至约18个核苷酸、甚至更为优选地从约5至约15个核苷酸、且最为优选地从约7至约12个核苷酸。在包含3′-DNA部分和RNA部分的复合引物的一些实施方案中，3′-DNA部分可至少为约1、3、5、7、10个核苷酸中的任何一种，其上限为约10、12、15、18、20、22个核苷酸中的任何一种。

包含5′-RNA部分和3′-DNA部分的复合引物中3′-DNA部分的长度可优选地从约1至约20个核苷酸、更为优选地从约3至约18个核苷酸、甚至更为优选地从约5至约15个核苷酸、以及最为优选地从约7至约12个核苷酸。在包含5′-RNA部分和3′-DNA部分的复合引物的一些实施方案中，3′DNA部分可至少为约1、3、5、7、10个核苷酸中的任何一种，其上限为约10、12、15、18、20、22个核苷酸中的任何一种。

在包含5′-RNA部分和3′-DNA部分且还包含非3′-DNA部分的复合引物的实施方案中，非3′-DNA部分可优选地从约1至约10个核苷酸、更为优选地从约2至约8核苷酸、以及最为优选地从约3至约6个核苷酸。在包含5′-RNA部分和3′-DNA部分且还包含非3′-DNA部分的复合引物的一些实施方案中，非3′-DNA部分可至少为约1、2、3、5个核苷酸中的任何一种，其上限为约6、8、10、12个核苷酸中的任何一种。

在包含5′-RNA部分和3′-DNA部分且其中5′-RNA部分邻近于3′-DNA部分的复合引物的实施方案中，3′-DNA部分的长度优选地从约1至约20个核苷酸、更为优选地从约3至约18个核苷酸、甚至更为优选地从约5至约15个核苷酸、以及最为优选地从约7至约12个核苷酸。在某些包含5′-RNA部分和3′-DNA部分且其中5′-RNA部分邻近于3′-DNA部分的复合引物的实施方案中，3′-DNA部分至少为约1、3、5、7、10个核苷酸中的任何一种，其上限为约10、12、15、18、20、22个核苷酸中的任何一种。

在包含5′-和3′DNA部分且带有至少一个插入RNA部分的复合引物中，非3′-DNA部分的长度可优选地从约1至约10个核苷酸、更为优选地从约2至约8个核苷酸、以及最为优选地从约3至约6个核苷酸。在包含5′-和3′-DNA部分且带有至少一个插入RNA部分的引物的一些实施方案中，非3′DNA部分可至少为约1、2、3、5个核苷酸中的任何一种，其上限为约6、8、10、12个核苷酸中的任何一种。

在包含5′-和3′DNA部分且带有至少一个插入RNA部分的复合引物中，3′-DNA部分的长度优选地从约1至约20个核苷酸、更为优选地从约3至约18个核苷酸、甚至更为优选地从约5至约15个核苷酸、以及最为优选地从约7至约12个核苷酸。在包含5′-和3′-DNA部分且带有至少一个插入RNA部分的复合引物的一些实施方案中，3′-DNA部分可至少为约1、3、5、7、10个核苷酸中的任何一种，其上限为约10、12、15、18、20、22个核苷酸中的任何一种。

在包含3′-DNA部分和至少一个插入RNA部分的复合引物中，非3′-DNA部分(即除3′-DNA部分之外的任何DNA部分)的长度可优选地从约1-约10个核苷酸、更为优选地从约2至约8个核苷酸、以及最为优选地从约3至约6个核苷酸。在包含3′-DNA部分和至少一个插入RNA部分的复合引物的一些实施方案中，非3′-DNA部分可至少为约1、3、5、7、10个核苷酸中的任何一种，其上限为约6、8、10、12个核苷酸中的任何一种。包含3′-DNA部分和至少一个插入RNA部分的复合引物中，3′-DNA部分的长度可优选地从约1-约20个核苷酸、更为优选地从约3-约18个核苷酸、甚至更为优选地从约5-约15个核苷酸、以及最为优选地从约7-约12个核苷酸。在包含3′-DNA部分和至少一个插入RNA部分的复合引物的一些实施方案中，3′-DNA部分可至少为约1、3、5、7、10个核苷酸中的任何一种，其上限为约10、12、15、18、20、22个核苷酸中的任何一种。据认为，不同部分的长度在本发明方法的反应条件下适当时可更长或更短。

在一些实施方案中，复合引物的5′-DNA部分包括该引物5′的最末端核苷酸。在一些实施方案中，复合引物的5′-RNA部分包括该引物5′的最末端核苷酸。在其它实施方案中，复合引物的3′-DNA部分包括该引物3′的最末端核苷酸。在其它实施方案中，3′-DNA部分邻近于5′-RNA部分，并包括该引物3′的最末端核苷酸(且5′-RNA部分包括该引物5′的最末端核苷酸)。

复合引物的总长度可优选地从约10-约50个核苷酸、更为优选地从约15-约30个核苷酸、以及最为优选地从约20-约25个核苷酸。在一些实施方案中，该长度可至少为约10、15、20、25个核苷酸中的任何一种，上限为约25、30、50、60个核苷酸中的任何一种。据认为，该长度在本发明方法的反应条件下适当时可更长或更短。

为实现与靶核酸的杂交(如本领域已众所周知和了解的一样，它取决于其它因素如离子强度和温度)，可与靶多核苷酸杂交的引物部分优选地与靶多核苷酸的互补性至少约为60％、更为优选地至少约为75％、甚至更为优选地至少约为90％、以及最为优选地至少约为95％。

如此处所述，在扩增反应中可使用一种或多种复合引物。

根据扩增方法的不同，第一引物可是或不是复合引物。基于复合引物的方法一般需要使用的第一条引物为复合引物。基于前启动子TSO的方法可使用或不使用为复合引物的第一引物。在一些实施方案中，基于前启动子TSO的方法的第一条引物由DNA组成。

第二引物

本发明方法的第二引物包含可与正义RNA转录本在转录本的一个位点杂交(在一组给定条件下)的序列(可以是或不是整条引物)，其中所述正义RNA转录本在第一转录组件中产生，这样第二引物延伸产物可包括目的序列。在一些实施方案中，第二引物的可杂交序列是根据正义RNA转录本上预期结合位点的已知序列而设计的。在其它实施方案中，可杂交序列基于随机序列。在一些实施方案中，第二引物是随机引物。

在基于前启动子TSO的方法的优选实施方案中，第一和第二引物是相同的。在基于前启动子TSO的方法的其它实施方案中，第一和第二引物是不同的。又在基于前启动子TSO的方法的其它实施方案中，第一和第二引物与不同的互补序列杂交。

为实现与正义RNA转录本的杂交(如本领域已众所周知和了解的，它取决于其它因素如离子强度和温度)，可与正义RNA转录本杂交的第二引物的序列优选地与正义RNA转录本的互补性至少约为60％、更为优选地至少约为75％、甚至更为优选地至少约为90％、以及最为优选地至少约为95％。

在一个实施方案中，第二引物包含DNA。在另一实施方案中，第二引物由DNA组成。在另一实施方案中，第二引物包含RNA。又在另一实施方案中，第二引物由RNA组成。又在另一实施方案中，第二引物包含DNA和RNA。

在一些实施方案中，第二引物通过正义RNA转录本3′末端的自我引发来提供(例如通过发夹环提供)。在这些实施方案中，正义RNA转录本的3′末端序列与转录本自身的另一段序列杂交。多核苷酸的自我引发已在例如美国专利号6,132,997中有所描述。在这些实施方案中，正义RNA转录本3′端的上述序列一般在它与转录本杂交和/或它沿着转录本延伸后被切除。

如此处所述，在扩增反应中，可使用一种或多种第二引物。

模板转换寡核苷酸(TSO)

本发明的一方面在引物沿靶多核苷酸延伸期间，采用模板转换寡核苷酸(TSO)来实现模板转换。在本发明基于复合引物方法的一些实施方案中，TSO行使终止序列的功能。在某些实施方案中，TSO行使前启动子多核苷酸的功能。

TSO包含可与靶杂交的3′部分和设计用于聚合期间链转换的5′部分。可实现链转换的TSO的设计在本领域已众所周知，如以前由Patel等，在美国国家科学院院报，93：2969-2974(1996)中所述。

在从靶多核苷酸至TSO的未杂交部分(“终止位点”)进行模板转换之前，TSO的3’部分与模板在互补于引物延伸产物3’末端的靶多核苷酸5’的位置或区域杂交。

在一个实施方案中，链转换通过在TSO片段中存在相互互补的短序列而启动，该短序列紧挨着TSO的杂交和非杂交部分间交界处的5′和3′端。不被理论所束缚，一种解释是：当引物延伸产物延伸入与TSO杂交的靶核酸部分时(通过置换TSO的杂交部分)，引物延伸产物的3′末端将包含可与TSO片段中其互补短序列结合的短序列，其中该TSO片段中的互补短序列紧挨TSO的杂交和非杂交部分的交界处。它通过增加引物延伸产物作为模板转换至TSO尾部分的可能性而增加了模板转换的有效性。短互补序列的长度优选地从约3至约20个核苷酸、更为优选地从约5至约15个核苷酸、以及最为优选地从约7至约10个核苷酸。在一些实施方案中，该长度至少为约1、3、5、7、10个核苷酸中的任何一种，其上限为约10、15、20、25个核苷酸中的任何一种。据认为，不同部分的长度在本发明方法的反应条件下适当时可更长或更短。

在一些实施方案中，TSO的5′部分(此处称为“前启动子TSO”)包含设计用于形成RNA聚合酶双链启动子的前启动子序列。TSO的该实施方案可起到终止序列的作用并同时提供启动子模板。在该实施方案中，TSO的前启动子序列作为模板，以将前启动子序列(一般与模板TSO的前启动子序列互补)掺入引物延伸产物。随后包含前启动子序列的TSO与引物延伸产物的前启动子序列的杂交导致形成可通过适当RNA聚合酶实现转录的双链启动子。允许模板DNA转录的启动子序列在本领域已众所周知，获得和/或制备它们的方法也为本领域公知。优选地，选择启动子序列以提供所使用的特定RNA聚合酶的最佳转录活性。此类选择的标准，即为特定RNA聚合酶特别喜好的特定启动子序列，也在本领域众所周知。例如，通过T7DNA依赖的RNA聚合酶和SP6转录的启动子序列在本领域中众所周知。启动子序列可来自于原核或真核来源。

在一个实施方案中，启动子序列邻近于所设计的用于提供增强的或更优化的所用RNA聚合酶转录的序列。在一些实施方案中，该序列与靶核酸不相关(即它基本上不杂交)。当由可操作地与与上述序列连接的启动子进行的聚合酶转录活性比由不是这样连接的启动子进行的聚合酶转录活性更强时，前者发生更为优化的转录。需要用于最佳转录的序列一般在本领域已众所周知，如之前在美国专利号5,766,849和5,654,142中对多种DNA依赖的RNA聚合酶的描述。

在一个优选的实施方案中，与模板DNA杂交的TSO的3′部分片段(包括与靶杂交的整个3′部分)与模板DNA结合，以至于通过实现引物延伸的聚合酶而进行的TSO的置换相当程度上被抑制，或至少被充分抑制。实现这种结合的适当方法包括本领域众所周知的技术，如使用含有G-夹的杂环修饰的胞嘧啶类似物(在Flanagan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，96(7)：3513-8中有所描述)和锁定核酸(在Kumar等，Bioorg.Med.Chem.Lett.1998，8(16)：2219-22和Wahlestedt等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000，97(10)：5633-8中有描述)。其它合适的方法包含适当时使用具高GC量和/或交联的序列。这些用于获得增强连接的方法中的任何一种可单独或组合使用。如果聚合酶从靶核酸链向TSO未杂交部分进行的模板转换为引物延伸事件的至少约25％、优选地至少约50％、更为优选地至少约75％、以及最为优选地至少约90％时，则TSO的置换相当程度上被抑制或被充分抑制。如果根据预期产物的量，该扩增方法导致满意的结果，也可由经验得出相当程度上抑制或充分抑制了TSO置换。一般地，在一组给定的条件下，与没有这样修饰的TSO相比，“修饰”的TSO与模板结合得更紧密。

与靶核酸链杂交的TSO部分的长度优选地从约15到50个核苷酸，更优选地从约20到45个核苷酸，且最为优选地从约25到40个核苷酸。在其它实施方案中，该长度至少约是下述之一：10、15、20、25、30个核苷酸；且大约小于下述之一：35、40、45、50、55个核苷酸。据认为，该长度在本发明方法的反应条件下适当时可更长或更短。据认为，该长度可更长或更短，只要在本发明方法的反应条件下是适合的。与靶核酸链杂交的TSO部分和其在靶核酸上的欲结合序列的互补性优选地至少约为25％，更为优选地至少约为50％，甚至更为优选地至少约为75％，且最为优选地至少约为90％。

包含终止多核苷酸序列的多核苷酸

在本发明方法的一些实施方案中，包括含有终止序列的多核苷酸，其实例如下所示。

(i)TSO

如上所述，TSO可作为包含终止序列的多核苷酸行使功能，以影响引物沿着靶多核苷酸延伸。

(ii)阻断子序列

在一些实施方案中，引物延伸终止序列由阻断子序列提供。阻断子序列是这样的多核苷酸，通常是合成的多核苷酸，该多核苷酸是单链的，且包含可与互补于引物延伸产物3’末端的靶序列位置(“终止位点”)5’的靶核酸序列片段杂交优选互补的序列。阻断子包含通过亲和力优选地通过高亲和力与靶核酸结合的核苷酸，以至于阻断子序列可抵抗DNA聚合酶在引物延伸过程中引起的置换，优选地抵抗引物延伸事件约30％以上，更为优选地约50％以上，甚至更为优选地约75％以上，以及最为优选地约90％以上。阻断子多核苷酸的长度和组成应避免在本发明方法的条件下过度的随机非特异杂交。阻断子多核苷酸的长度优选地为约3至约30个核苷酸，更为优选地为约5至约25个核苷酸，甚至更为优选地为约8至约20个核苷酸，以及最为优选地为约10至约15个核苷酸。在其它实施方案中，阻断子多核苷酸的长度至少约为下述之一：3、5、8、10、15个多核苷酸；且大约小于下述之一：20、25、30、35个多核苷酸。据认为，该长度可更长或更短，只要在本发明方法的反应条件下是适合的。阻断子多核苷酸和其在靶核酸上的欲结合序列的互补性优选地至少约为25％，更为优选地至少约为50％，甚至更为优选地至少约为75％，以及最为优选地至少约为90％。

在一个实施方案中，阻断子序列包含这样的与靶DNA结合的片段，以至于通过聚合酶置换阻断子序列而实现引物延伸的过程被相当程度上抑制或至少被充分地抑制。达到这样的结合并确定相当程度上的或充分的置换抑制的适当方法见如上面描述的本发明方法中使用的TSO。

在一个实施方案中，阻断子多核苷酸不能作为引物有效行使核酸延伸的功能(即从阻断子序列的延伸被降低或抑制)。阻断阻断子多核苷酸引物功能的技术包括任一阻止通过DNA聚合酶在引物的3′端添加核苷酸的技术。这样的技术在本领域中已众所周知，这样的技术包括如在阻断子多核苷酸的3′最末端位置进行3′羟基的替换或修饰，或掺入修饰的核苷酸(如双脱氧核苷酸)，从而不能通过DNA聚合酶锚定添加的核苷酸。

包含前启动子和与引物延伸产物杂交的区域的多核苷酸

一些实施方案采用包含前启动子和与引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸。在一些实施方案中，前启动子多核苷酸由PTO提供，如下更为详细的描述。在其它实施方案中，前启动子多核苷酸由TSO提供(如此处所述)。又在其它实施方案中，前启动子多核苷酸包含含有终止序列(其基本上不实现模板转换)的部分(一般为3′部分)并包含含有前启动子序列的部分(一般为5′部分)，其中包含前启动子序列的部分一般不可与靶多核苷酸杂交(在包含终止序列的部分可与靶多核苷酸杂交的条件下)。在一些实施方案中，提供了包含含有终止序列(基本上不实现模板转换)部分和含有前启动子序列部分的前启动子多核苷酸，该前启动子多核苷酸在同一扩增反应中既可实现引物延伸终止的功能，也可行使提供前启动子序列的功能。

前启动子模板寡核苷酸

在一些实施方案中，方法采用由前启动子模板寡核苷酸(PTO)提供的用于转录的启动子序列。

在本发明的方法和组合物中使用的PTO是单链多核苷酸，一般是DNA，其包含设计用于形成RNA聚合酶双链启动子的前启动子序列和可与引物延伸产物3′末端杂交的部分。在一个优选的实施方案中，前启动子序列位于该寡核苷酸的5′部分，并且杂交序列位于该寡核苷酸的3′部分。在一个实施方案中，并且最为典型的是，启动子和杂交序列是不同的序列。在另一实施方案中，启动子和杂交序列在序列同一性上有重叠。又在另一实施方案中，启动子和杂交序列是相同的序列，并因此位于PTO的同一位置。在PTO和引物延伸产物的杂交导致产生包含一个突出端双链体(不与引物延伸产物杂交的PTO的5′末端一般包含全部或部分前启动子序列)的一些实施方案中，用DNA聚合酶填平突出端，以产生可通过适当RNA聚合酶实现转录的双链启动子。

使得可转录模板多核苷酸的启动子序列在本领域中已众所周知，并在上面已讨论过。优选地，选择启动子序列以提供所使用的特定RNA聚合酶的最佳转录活性。此种选择的标准，即尤其为特定的RNA聚合酶所偏爱的特定启动子序列，在本领域中也众所周知。例如，通过T7 DNA依赖的RNA聚合酶和SP6转录的启动子序列在本领域中众所周知。启动子序列可来自于原核或真核来源。

在一些实施方案中，PTO在前启动子序列和可与引物延伸产物的3′末端杂交的部分之间包含一个插入序列。可由经验确定插入序列的合适长度，并且该长度可至少约为1、2、4、6、8、10、12、15个核苷酸。插入序列序列合适的序列组成也可由经验确定，并且与省略该序列相比，设计该序列优选地，但并非必需可增强扩增的程度。在一个实施方案中，插入序列是一段设计用于提供增强或更优化所用RNA聚合酶的转录的序列。通常该序列与靶核酸无关(即它基本上不与靶核酸杂交)。当启动子可操作地与该序列连接且从这样的启动子的进行的聚合酶转录活性高于来自没有这样连接的启动子时，更为优化的转录就发生了。需要用于优化转录的序列通常在本领域内是众所周知的，如以前对多种DNA依赖的RNA聚合酶的描述，如在美国专利号5766849和5654142中所描述的，并且也可由经验来确定。

在另一个实施方案中，PTO包含一段位于前启动子序列5′的序列，即PTO包含位于前启动子序列5′的额外核苷酸(其可以是或可以不是转录调节序列)。该序列通常但非必需不可与引物延伸产物杂交(在一组给定的条件下)。

在一个实施方案中，PTO不能有效行使引物用于核酸延伸的功能。阻断PTO引物功能的技术包括阻止DNA聚合酶在PTO的3′末端添加核苷酸的任一技术。这些技术在本领域已众所周知，包括例如在PTO的3′最末端进行置换或修饰3′羟基、或掺入修饰的核苷酸，如双脱氧核苷酸，这样使DNA聚合酶不能在PTO的3’最末端锚上额外的核苷酸。可用标记或特异结合对中一员的小分子，如生物素封闭3′末端。也可通过加入不与引物延伸产物杂交的核苷酸来使3′末端不可延伸，这归因于非互补性或不支持氢键的结构修饰。在其它实施方案中，PTO未被封闭。

与目的引物延伸产物杂交的PTO部分的长度优选地从约5个至约50个核苷酸，更优选地从约10个至约40个核苷酸，甚至更为优选地从约15个至约35个核苷酸，以及最为优选地从约20个至约30个核苷酸。在一些实施方案中，杂交部分至少约为下述之一：3、5、10、15、20个核苷酸；并小于约下述之一：30、40、50、60个核苷酸。杂交部分与它在目的引物延伸产物上预期结合序列的互补性优选地至少约25％，更为优选地至少约50％，甚至更为优选地至少约75％，以及最为优选地至少约90％。

包含终止序列和前启动子序列的组合多核苷酸

在本发明方法的一些实施方案中，终止序列和前启动子序列由单一的组合多核苷酸提供。该组合多核苷酸包含含有终止序列的部分(一般为3′部分)和含有前启动子序列的部分(一般为5′部分)，其中所述终止序列在其可与靶多核苷酸杂交的条件下不实现模板转换，其中包含前启动子序列的部分通常不可与靶多核苷酸杂交(在包含终止序列的部分与靶多核苷酸杂交的条件下)。可使用本领域公知的技术设计终止序列以使不能实现模板转换，例如确保已被熟知可促进模板转换的结构特征(如Patel等，美国国家科学院院报1996，93：2969-2974中所述)不出现在组合多核苷酸中。相对于可与引物杂交的模板序列而言，组合多核苷酸可与位于其5′方向的模板序列杂交。该多核苷酸还包含可与靶多核苷酸的互补序列杂交的序列。可与靶多核苷酸的互补序列杂交的序列可与组合多核苷酸的终止序列和/或前启动子序列不重叠、重叠或共延伸。通常且优选地，可与靶多核苷酸的互补序列杂交的序列可与靶多核苷酸的互补序列的3′部分杂交。这样，在本发明方法的一些实施方案中，包含含有终止序列部分和含有前启动子序列部分的组合多核苷酸可在同一扩增反应中实现引物延伸的终止并提供前启动子序列的功能。

DNA聚合酶、核糖核酸酶和RNA聚合酶

本发明的扩增方法使用了一部分或所有下述酶：RNA依赖的DNA聚合酶、DNA依赖的DNA聚合酶、核糖核酸酶如RNaseH，以及DNA依赖的RNA聚合酶。在单一酶中可找到和使用一种或多种的这些活性。例如，RNaseH活性可由RNA依赖的DNA聚合酶(如反转录酶)提供，或由单独的酶提供。用于本方法中的反转录酶可以有或没有RNaseH活性。

本发明的一个方面是从引物-RNA复合体中形成单链cDNA。该过程通常使用RNA依赖的DNA聚合酶的酶促活性和核糖核酸酶活性。

本发明的方法和组合物中使用的RNA依赖的DNA聚合酶可根据本发明的方法实现引物延伸。因此，优选的RNA依赖的DNA聚合酶是可沿着核酸模板延伸核酸引物的酶，其中所述模板至少主要由核糖核苷酸组成。本发明的方法和组合物中使用的合适RNA依赖的DNA聚合酶包括反转录酶。许多反转录酶如那些来源于鸟成髓细胞性白血病病毒(AMV-RT)和莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV-RT)的反转录酶包含一种以上的活性(例如聚合酶活性和核糖核酸酶活性)，并可在cDNA分子形成中发挥作用。然而，在一些例子中，优选采用无RNaseH活性的反转录酶。无RNaseH活性的反转录酶在本领域中已众所周知，此类酶包括那些在野生型反转录酶中具有可消除RNaseH活性的突变的反转录酶。在这些情况下，可采用加入其它来源的RNaseH，如分离自大肠杆菌的RNaseH，来形成cDNA。

根据本发明的方法，本发明的方法和组合物中使用的DNA依赖的DNA聚合酶可根据本发明的方法实现引物延伸。因此，优选的聚合酶是可沿着核酸模板延伸核酸引物的酶，其中所述模板至少主要包含脱氧核糖核苷酸。根据本发明的某些方法，对多核苷酸的扩增涉及到使用可从置换链结合的多核苷酸上置换该核酸链的DNA聚合酶，并且可优选显示更强链置换能力(即与其它没有如此链置换能力的聚合酶相比)的聚合酶。优选地，DNA聚合酶对杂交于核酸链的寡核苷酸的3′末端有高亲和力。优选地，DNA聚合酶不具有基本的缺口填补活性。一般地，为将引物的降解或引物延伸多核苷酸的降解减至最小，聚合酶优选地具有极少或无5′-3′核酸外切酶活性。通常该核酸外切酶活性依赖于多种因素，如pH、盐浓度、模板是双链或是单链等，所有这些是本领域熟练人员所熟悉的。5′-3′核酸外切酶活性已被删除的突变DNA聚合酶在本领域中已众所周知，并且适合于此处描述的扩增方法。优选的是，DNA聚合酶以该聚合酶和引物延伸产物的5’末端间的至少约25％的接触几率，更为优选地至少约50％，甚至更为优选地至少约75％，以及最为优选地至少约90％的接触机率从模板核酸上置换引物延伸产物。在一些实施方案中，优选使用具有链置换活性的热稳定DNA聚合酶。这些聚合酶在本领域已众所周知，如美国专利号5744312中所述(此处引用作为参考)。优选的是，该DNA聚合酶具有极小的或没有校正活性。

本发明的方法和组合物中适用的DNA聚合酶包括那些公开在美国专利号5648211和5744312中的DNA聚合酶，它们包括exo^-Vent(New EnglandBiolabs)、exo^-Deep Vent(New England Biolabs)、Bst(BioRad)、exo-Pfu(Stratagene)、Bca(Panvera)、测序级Taq(Promega)和来自Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus的热稳定DNA聚合酶。

本发明的方法和组合物中使用的核糖核酸酶可切开RNA/DNA杂合体中的核糖核苷酸。优选的是，核糖核酸酶切割核糖核苷酸，而不管被切开的核糖核苷酸邻近的核苷酸的特征和类型。核糖核酸酶的切割不依赖于序列特征是优选的。本发明的方法和组合物中适用的核糖核酸酶的实例在本领域已众所周知，包括核糖核酸酶H(RNaseH)。

本发明的方法和组合物中使用的DNA依赖的RNA聚合酶在本领域已众所周知。可使用真核或原核聚合酶。其实例包括T7、T3和SP6 RNA聚合酶。通常所选择的RNA聚合酶可从此处所述的前启动子多核苷酸提供的启动子序列进行转录。通常RNA聚合酶是DNA依赖的聚合酶，只要启动子区域是双链的，该酶优选地可从单链DNA模板进行转录。

总之，本发明的方法和组合物中所用的酶不应使所述方法和组合物的核酸成分产生相当多的降解。

反应条件和检测

实施本发明方法的合适反应介质和条件是那些根据本发明的方法允许核酸扩增的反应介质和条件。这些介质和条件已为本领域的技术人员所熟知，并且在多个公开专利中有所描述，如美国专利号5,554,516、5,716,785、5,130,238、5,194,370、6,090,591、5,409,818、5,554,517、5,169,766、5,48 0,784、5,399,491和5,679,512以及PCT公开号WO99/42618。例如缓冲液可以是Tris缓冲液，虽然也可使用其它缓冲液，但条件是只要缓冲液成分不抑制本发明方法的酶成分。pH优选地从约5至约11，更为优选地从约6至约10，甚至更为优选地从约7至约9，以及最为优选地从约7.5至约8.5。反应介质也可包括双价金属离子，如Mg²⁺或Mn²⁺，游离离子的终浓度在约从0.01至约15mM的范围内，并且最为优选地从约1至10mM。反应介质也可包括有助于介质总离子强度的其它盐，如KCl或NaCl。例如，盐如KCl的范围优选地从约0至约125mM，更为优选地从约0至约100mM，以及最为优选地从约0至约75mM。反应介质还可包括可影响扩增反应进行，但不是构成本方法酶成分活性的添加剂。这样的添加剂包括蛋白质如BSA、单链结合蛋白(例如T4基因32蛋白)，以及非离子去污剂如NP40或Triton。也可包括能维持酶活性的试剂，如DTT。这样的试剂在本领域中众所周知。适当时，也可包括不抑制本方法采用的RNase活性的RNase抑制剂(如RNasin)。本发明方法的任一方面可在相同或不同温度下进行。优选的是，在等温下进行扩增反应(尤其是引物延伸(而不是第一链和第二链cDNA合成步骤)和链置换)，这避免了烦琐的热循环过程。扩增反应在某一温度下进行，该温度使得本发明的寡核苷酸(引物和/或前启动子多核苷酸)与模板多核苷酸和引物延伸产物杂交，并且基本上不抑制所使用酶的活性。温度优选地在约25℃至约85℃，更为优选地在约30℃至约80℃，以及最为优选地在约37℃至约75℃的范围内。在一些实施方案中，转录步骤的温度低于之前步骤的温度。在这些实施方案中，转录步骤的温度优选地在约25℃至约85℃，更为优选地在约30℃至约75℃，以及最为优选地在约37℃至约70℃的范围内。

可用于合成本发明方法中的引物延伸产物的核苷酸和/或核苷酸类似物，如脱氧核糖核苷三磷酸，其供给量优选地从约50至约2500μM，更为优选地约100至约2000μM，甚至更为优选地约200至约1700μM，以及最为优选地约250至约1500μM。在一些实施方案中，包括在引物延伸链中存在可增强链置换(例如，通过引起弱于常规AT、CG碱基对的碱基配对)的核苷酸或核苷酸类似物。这样的核苷酸或核苷酸类似物包括脱氧次黄苷和其它修饰碱基，它们在本领域已众所周知。可用于合成本发明方法中的RNA转录本的核苷酸和/或类似物，如核糖核苷三磷酸，其供给量优选地从约0.25至约6mM，更为优选地从约0.5至约5mM，甚至更为优选地从约0.75至约4mM，以及最为优选地从约1至约3mM。

本发明扩增反应的寡核苷酸成分通常超过欲扩增的靶核酸序列数。它们的供给约为或至少约为下述之一：10、10²、10⁴、10⁶、10⁸、10¹⁰、10¹²倍于靶核酸的量。复合引物和前启动子多核苷酸各自的供给约为或至少约为下述浓度之一：50nM、100nM、500nM、1000nM、2500nM、5000nM。

在一个实施方案中，在扩增过程的开始阶段同时加入上述的组分。在另一实施方案中，在扩增反应需要和/或允许的情况下，于扩增过程期间的适当时间点之前或之后，按任意次序加入组分。本领域中的技术人员容易确定这样的时间点，这样的一些时间点在下面有记录。在靶核酸变性步骤之前，将用于本发明方法的核酸扩增的酶加入反应混合物，随后进行变性步骤，或在引物与靶多核苷酸杂交后，将用于本发明方法的核酸扩增的酶加入反应混合物，这由它们的热稳定性和/或其它为本领域技术人员所熟知的因素决定。在这些实施方案中，反应条件和成分在不同的反应中有所不同。因此，例如，在基于前启动子TSO的方法中，可将含有靶的样品在从双链DNA靶形成单链形式之前与引物和启动子混合。为本发明的扩增所需要的酶可在形成单链靶的起始步骤之前，或在稍后的步骤中加入样品中，这取决于所使用的扩增酶的热稳定性。在一些实施方案中，在扩增过程的早期包括核酸修饰酶(如此处所述)是所希望的，这通常需要使用热稳定的核酸修饰酶，这在本领域已众所周知。这些酶包括例如热稳定DNA连接酶(如嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(Tth)连接酶、栖热菌sp.AK16D连接酶、Aquifex aeolicus连接酶)、热稳定DNA聚合酶(如Taq、Tth或Pfu DNA聚合酶)和热稳定反转录酶(如rTth RNA依赖的DNA聚合酶)。

可在不同的时间点停止扩增过程，并稍后重新开始。本领域的熟练技术人员容易确定上述的时间点。一个时间点是在第一引物延伸结束时。另一个时间点是在第二引物延伸结束时。停止反应的方法在本领域已众所周知，包括例如将反应混合物冷却至可抑制酶活性或加热至可破坏酶的温度。重新开始反应的方法在本领域也众所周知，包括例如将反应混合物温度提高至允许酶活性的温度，或重新补充破坏(消耗)的酶。在一些实施方案中，在反应重新开始之前、开始时或之后补充反应的一种或多种组分。或者让反应没有中断地进行(即从开始至结束)。

扩增产物的检出表明存在靶序列。定量分析也是可行的。直接和间接检测方法(包括定量)在本领域广为人知。例如，通过比较从包含未知量的含有靶序列的多核苷酸的测试样品中的扩增产物量和具有已知量的靶序列的多核苷酸的参照样品的扩增产物量，可确定测试样品中靶序列的量。本发明的方法也可延伸至用于序列改变的分析和靶核酸的测序。而且可通过例如检查来自RNA扩增产物的翻译产物可实现检测。

本发明的组合物和试剂盒

本发明也提供了此处所述方法中使用的组合物和试剂盒。这些组合物可为是此处所述的任一组分、反应混合物和/或中间体以及它们的任一组合。

例如，本发明提供了包含下述任意两种，优选地三种，更优选地四种的组合物：(a)第一引物，其为复合引物；(b)第二引物；(c)DNA依赖的DNA聚合酶；(d)RNA依赖的DNA聚合酶；(e)前启动子多核苷酸；(f)RNA聚合酶；以及(g)从RNA/DNA杂合体中切割RNA的酶。在一些实施方案中，复合引物(如果包括在组合物中)包含RNA部分和3′DNA部分(在一些实施方案中，RNA部分靠近DNA部分)。在其它实施方案中，复合引物包含带有至少一个插入RNA部分的5′-和3′-DNA部分。在其它实施方案中，组合物还包含TSO(即此处所述的任一TSO实施方案，包括含有一处或多处修饰的可增强与模板结合的TSO)。在一些实施方案中，该组合物还包含含有终止多核苷酸序列的多核苷酸。

在另一实施方案中，本发明提供了包含下述任意两种，优选地三种，更优选四种的组合物：(a)前启动子TSO；(b)第一引物(可由DNA组成)；(c)DNA依赖的DNA聚合酶；(d)RNA依赖的DNA聚合酶；(e)从RNA/DNA杂合体中切割RNA的酶；(f)任选地第二引物(可由DNA组成)；以及(g)RNA聚合酶。

在此处所述的组合物的一些实施方案中，组合物还包含具有多种酶活性的单一酶。例如，DNA依赖的DNA聚合酶和RNA依赖的DNA聚合酶可是同一种酶(如反转录酶)；DNA依赖的DNA聚合酶和从RNA/DNA杂合体上切割RNA的酶可是相同的酶；RNA依赖的DNA聚合酶和从RNA/DNA杂合体上切割RNA的酶可是同一种酶；或RNA依赖的DNA聚合酶、DNA依赖的DNA聚合酶和从RNA/DNA杂合体上切割RNA的酶的所有三种活性可存在于单一酶中。

任一上述组合物还可包含模板(其包含靶序列)和/或此处所述的任一种酶(如DNA聚合酶、RNaseH和/或RNA聚合酶)。组合物通常以含水形式存在，优选地在合适的缓冲液中存在。

本发明也提供了包含此处所述扩增产物的组合物。因此，本发明提供了正义RNA分子群，这些正义RNA分子群是靶序列的拷贝，由此处所述的任一方法产生。

虽然组合物可以冷冻干燥状态存在，但它们通常溶于适当的介质中。适当的介质包括但不限于含水介质(如纯水或缓冲液)。

本发明提供了用于进行本发明方法的试剂盒。因此，以适当的包装提供了多种试剂盒。试剂盒可用于任何一种或多种此处所述的用途，并且因此应包括任何一种或多种下述用途的说明书：扩增多核苷酸(RNA和/或DNA)序列、测定目的核酸的序列和在扩增核酸序列的基础上检测序列突变。

本发明的试剂盒包含一个或多个容器，它们含有此处所述组分的任一组合，下述是此类试剂盒的实例。例如，本发明提供包含下述任意两种，优选地为三种，更为优选地四种的试剂盒：(a)第一引物，其为复合引物；(b)第二引物；(c)DNA依赖的DNA聚合酶；(d)RNA依赖的DNA聚合酶；(e)前启动子多核苷酸；(f)RNA聚合酶；和(g)从RNA/DNA杂合体上切割RNA的酶。在一些实施方案中，如果复合引物包含在试剂盒内，该复合引物包含RNA部分和3′DNA部分(在一些实施方案中，RNA部分靠近DNA部分)。在其它实施方案中，复合引物包含带有至少一个插入RNA部分的5′-和3′-DNA部分。在其它实施方案中，试剂盒还包含TSO(即此处所述的任一TSO实施方案，包括含有一处或多处修饰的TSO，所述修饰可增强与模板的结合)。在一些实施方案中，试剂盒还包含含有终止多核苷酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，试剂盒还包含使用试剂盒提供的任意组分根据此处所述基于复合引物的方法来扩增靶多核苷酸的说明书。

在另一实施方案中，本发明提供了包含下述任意两种，优选地三种，更优选地四种的试剂盒：(a)前启动子TSO；(b)第一引物(其可由DNA组成)；(c)DNA依赖的DNA聚合酶；(d)RNA依赖的DNA聚合酶；(e)从RNA/DNA杂合体上切割RNA的酶；(f)任选地第二引物(其可由DNA组成)；和(g)RNA聚合酶。在一些实施方案中，试剂盒还包含使用试剂盒提供的任意组分根据此处所述任一基于前启动子TSO的方法来扩增靶多核苷酸的说明书。

试剂盒也可任选地包括脱氧核苷三磷酸和/或核糖核苷三磷酸。试剂盒也可包括一种或多种合适的缓冲液(如此处所述)。用于核酸测序的试剂盒可任选地包括标记的或未标记的核苷酸类似物，它们在掺入引物延伸产物后实现核苷酸聚合作用的终止。试剂盒中的一种或多种试剂可以干粉的形式提供，通常是冷冻干燥粉，其中所述试剂包括赋形剂，溶解后使试剂溶液具有适当的浓度，以进行此处所述的任何方法。每一组分可包装在分开的容器中，或当交叉反应性和保存期限允许时，可将一些组分合并置于一个容器中。

本发明的试剂盒可任选地包括一套说明书，通常为与本发明方法的组分使用相关的书面说明书，用于扩增预期核酸和/或适当的话用于将扩增产物用作进行如核酸测序和检测序列突变。含有说明书的电子存储介质(如磁盘或光盘)是可接受的提供说明书的模式。也可通过将所述说明书存储在可通过广域网(WAN)如因特网进入的中央服务器来提供说明书。

包含在试剂盒内的说明书通常包括关于开展本发明方法所必需的试剂(包含或不包含在试剂盒内)、怎样使用试剂盒的说明和/或适当的反应条件的信息。例如，本发明提供了包含含有可与靶多核苷酸杂交的序列的第一复合引物和使用该引物根据本文所述的基于复合引物的方法扩增靶多核苷酸的说明书的试剂盒。在另一实例中，试剂盒还可包含第二引物且任选地包含使用该引物根据本文所述的基于复合引物的方法扩增靶多核苷酸的说明书。在其它的实例中，试剂盒可包含其它组分，如下述的任何一种组分：(a)前启动子多核苷酸(如PTO)；和(b)此处所述的任一种酶，如从RNA/DNA杂合体上切割RNA的酶(例如RNaseH)、DNA聚合酶(RNA依赖的或DNA依赖的)和RNA聚合酶，并可包含根据本文所述的基于复合引物的方法使用这些组分来扩增靶多核苷酸的说明书。

试剂盒中的组分可以任一方便适当的包装提供。组分可单独包装，或以一种或多种组合包装。当试剂盒提供用于开展本发明方法的扩增时，RNA聚合酶(如果包括的话)不与转录步骤之前的步骤中所用的组分一同提供，优选地单独提供。

试剂盒中不同组分的相对量可有很大不同，以提供相当程度上优化操作此处公开方法进行的反应的试剂浓度和/或提供进一步优化任一实验的敏感性的试剂浓度。关于本发明的组合物和试剂盒，任一组分可包含此处所述组分的任一实施方案。

本发明也提供了实现此处所述方法的体系。这些系统包括上述讨论的组分的多种组合。系统通常可包括一种或多种用于开展本发明的扩增方法的仪器。这样的仪器包括如加热设备(如加热部件或水浴)和实现此处所述方法的一步或多步的自动化仪器。

本发明也提供了包含此处所述组分的多种组合的反应混合物(或包含反应混合物的组合物)。反应混合物的一个实例是(a)第一引物延伸产物和靶多核苷酸的复合体；(b)包含前启动子序列的多核苷酸(例如PTO或TSO)；(c)RNA聚合酶和(d)第二引物。其它反应混合物如此处所述，并且包括在本发明中。

本发明也包括含有此处所述任一复合体(为此处所述方法的中间体)的组合物。这样的复合物的实例于图1-4中示意描述。

使用本发明的扩增方法和组合物的方法

本发明的方法和组合物可用于多种目的。为举例说明，描述了用本发明方法产生的扩增核酸产物测序、基因分型(核酸突变)、制备微阵列和鉴定核酸序列的方法。

使用本发明方法测定多核苷酸的序列

本发明的扩增方法用于例如目的序列的测定。用如此处所述的扩增方法进行测序过程。

使用本发明方法的测序可基于实现RNA转录的过早(故意)终止。rNTP类似物的掺入将导致产生截短的RNA产物，这是因为在类似物掺入的位点处阻断了RNA聚合酶的作用，其中所述rNTP类似物可为标记的或未标记的rNTP类似物，其在掺入RNA转录本后将实现反应混合物中rNTP聚合作用的终止。

在一个实施方案中，测序方法包括(a)通过此处所述的方法，在有rNTP和rNTP类似物的混合物存在时，扩增含有目的序列的靶多核苷酸，这样转录在掺入rNTP类似物后终止；和(b)分析扩增产物以确定序列。

在另一实施方案中，测序方法包括(a)通过此处所述的方法，扩增含有目的序列的靶多核苷酸，其中由第二引物延伸产物在有rNTP和rNTP类似物的混合物存在时产生RNA转录本，这样转录在掺入rNTP类似物后终止；和(b)分析扩增产物以确定序列。

合适的rNTP类似物包括那些通常用于其它测序方法的rNTP类似物，并在本领域已众所周知。rNTP类似物(如RNA聚合酶终止子)的例子包括3′-dNTP。Sasaki等，生物化学(Biochemistry)(1998)95：3455-3460。这些类似物可被标记，例如用荧光色素或放射性同位素。标记物也可为适用于质谱的标记物。标记物也可为特异结合对之成员的小分子，并且可在随后与特异结合对中的另一成员结合，如特异结合对分别为生物素和链亲合素，其中该结合对的后一成员与酶结合，该酶可催化产生可被诸如比色法、荧光测定法、化学发光法检测到的信号，由此可被检测到。所有上述实施例在本领域已众所周知。它们通过聚合酶掺入RNA转录本，并用于终止沿着模板序列的进一步延伸。得到的截短聚合产物被标记。累积的截短产物在长度上根据每种类似物掺入位点的不同而不同，其代表模板序列上互补核苷酸的不同序列定位。

为阐明序列信息，可使用本领域众所周知的多种方法中的任何一种进行反应产物的分析。这样的方法包括凝胶电泳并使用适当的扫描仪检测标记条带、测序凝胶电泳并使用如分子动力读数仪直接通过磷光检测放射标记的条带、装配有对反应中所使用标记物特异的检测仪的毛细管电泳等。标记物也可为结合蛋白的配体，用于检测标记物与连接有酶的结合蛋白的结合，如生物素标记的链终止子和与酶连接的链亲合素。该标记物通过酶的酶促活性检测，它产生可检测的信号。与本领域公知的其它测序方法一样，对不同核苷酸类型(A、C、G、T或U)的测序反应在单一或分开(每一容器代表不同核苷酸类型中的一种)的反应容器中进行。使用方法的选择取决于本领域技术人员相当明显的实际考虑，如使用核苷三磷酸类似物和/或使用标记物。因此，例如当每种类似物被不同标记时，测序反应可在单一容器中进行。用于优化根据本发明方法进行序列分析的试剂和反应条件的选择因素类似于其它以前描述的测序方法。试剂和反应条件为如上所述的用于本发明的核酸扩增方法。

利用本发明的扩增方法检测基于单链构象多态性的突变。

与等同于靶核酸序列且无序列改变的参照核酸序列比较，根据本发明方法产生的RNA扩增产物也适于分析靶核酸序列上任何改变的检测。

扩增方法的RNA产物适用于基于单链构象多态性(rSSCP)的突变检测。本发明的扩增方法可直接与合适的方法联合，用于检测单链构象多态性，其中所述合适的方法如电泳分离方法，其用于鉴定单链RNA产物的特异迁移模式，用于阐明特定序列特征的存在和/或与参照核酸相比用于阐明试验核酸中任何差异的存在。

基于凝胶电泳或毛细管电泳的方法可用于检测和分析多种单链构象异构体。另外也可用识别序列依赖性二级结构的核酸酶切割单链RNA产物用于确定序列特异的构象多态性。这样的二级结构特异性核酸酶在本领域众所周知，如称为Cleavase^TM酶(Third Wave)的5′-核酸酶。电泳方法潜在地更适于高通量突变或基因分型的检测方法。

对给定的核酸序列确定序列特异的电泳模式用于例如检测测试序列的特异等位基因。此外，期望不同等位基因的电泳迁移模式可有大的差异，这样使得可从单一个体的核酸样品中检测两个等位基因，这为杂合基因型或多等位基因所需要。测试核酸序列的任何改变如碱基置换、插入或缺失均可用本方法检测。本方法预期可用于检测特异的单碱基多态性、SNP和发现新SNP。因此，本发明也提供了用于检测包含单核苷酸多态性的多核苷酸的方法，其包括：(a)用此处所述的任一方法扩增靶多核苷酸；以及(b)分析扩增产物的单链构象，其中与参照的单链多核苷酸相比，构象的差异显示靶多核苷酸中的单核苷酸多态性，由此检测包含单核苷酸多态性的多核苷酸。

使用本发明基于复合引物的扩增方法检测突变

本发明的等温扩增方法所使用的复合引物的独特特性给用等温方法在靶核酸序列上检测明确的突变或多态位点(如SNP)提供了基础。本方法用于基因分型、检测导致药物抗性的突变等等。这些方法可用于鉴定通常与复合引物的RNA部分杂交的模板链某区域中的序列--因此称为“明确定义的”突变，该突变的位点是明确的。

在一个实施方案中，设计复合引物的RNA部分与其中怀疑存在序列改变的测试靶核酸的序列互补。换句话说，引物包含含有与参照序列(例如野生型序列)互补的RNA部分序列，测试靶核酸中的序列与参照序列进行比较。在一些实施方案中，改变的序列(即含有序列变化的序列)和参照序列是等位基因。序列改变可为单核苷酸置换、缺失或插入。

在另一实施方案中，设计复合引物的RNA部分与怀疑存在于测试靶核酸的改变序列互补。换句话说，引物包含含有与测试靶核酸互补的RNA部分序列，并且因此不与参照序列(例如野生型序列)互补，测试靶核酸中的序列与参照序列进行比较。在一些实施方案中，改变的序列(即含有序列改变的序列)和参照序列是等位基因。

复合引物的RNA部分通常是5′RNA部分包含与已知标准野生型序列或已知突变子或多态性基因型互补的序列。通常，如果靶核酸序列包含与复合引物RNA部分互补的序列，将此情况与如果存在错配(即引物有突变序列而靶没有，或反之亦然)的情况相比，则合适的复合引物包含使得该引物优先地与前一种情况的靶核酸杂交的RNA部分，其中靶核酸具有结合的引物延伸产物，并且引物延伸产物的5′-RNA部分已被切除。序列改变的存在一般不会阻止扩增的起始步骤。复合引物与靶序列杂交形成三分子复合体，并得到延伸。然后核糖核酸酶如RNaseH切割复合体中延伸引物的RNA部分。虽然错配碱基对的存在可能影响RNA/DNA杂交体的切割模式，但切割仍可能发生。错配将会抑制，优选地阻止下一步复合引物与复合体通过5′-RNA部分杂交而进行的结合步骤。这种作用取决于多种因素，如杂交寡核苷酸的大小和反应条件的严紧性。根据本领域众所周知的技术和常规，在设计复合引物时，这些因素得到考虑。错配也可能会抑制切割复合引物的RNA部分，因此阻止靶序列的扩增。另一种可能性是，错配将导致低效率切割引物的RNA部分，因此导致较低效率扩增或产生较少的扩增产物。在扩增的这一步，复合引物不能与靶杂交会阻止后续步骤中引物延伸链的置换和多拷贝扩增产物的产生。据认为，通过本发明的方法检测突变可基于有无扩增产物或定量比较累积的扩增产物的量而进行。例如，当复合引物包含参照序列(例如野生型)时，靶链中突变的存在可导致检测不到扩增产物；或者是，可导致能检测到产物，但产物量少于从无突变的模板链产生的量。

当复合引物包含完全与突变基因型互补的RNA部分通常是5′RNA部分时，将阻止正常基因型序列的扩增，而突变基因型靶将得到扩增。因此，在这种情况下，多拷贝扩增产物的检出和/或定量确定将表明突变基因型靶序列的存在。例如，可运行包括目的核酸样品或具野生型序列的靶核酸参照样品的平行反应。与后一个反应相比，前一反应积累较多的扩增产物表明在目的样品中存在突变基因型。另外，当复合引物包含完全与试验靶的标准基因型序列互补的5′RNA序列时，将阻止突变基因型靶序列的扩增，并且扩增产物的检出和/或定量确定表明存在标准基因型。

本发明中任一基于复合引物的扩增方法均适用于检测如上所述的突变。

制备核酸微阵列的方法

本发明扩增方法产物的单链特性尤其适用于制备包含扩增产物的微阵列。

扩增产物可附着在例如由玻璃、塑料(如聚丙烯、尼龙)、聚丙烯酰胺、硝酸纤维或其它材料制成的固相或半固相载体或表面。

几种将核酸附着在于固体基片如玻璃片的技术在本领域已众所周知。一种方法是将包含可吸附于固相基片的部分如胺类、胺类衍生物或另一带正电荷的基团的修饰碱基或类似物掺入扩增的核酸。然后将扩增产物与固相基片如玻璃片接触，该玻璃片用醛或另一的反应基包被，其中所述醛或另一反应基将与扩增产物上的反应基形成共价连接并共价附着于玻璃片。含有扩增产物的微阵列可用Biodot(BioDot，Inc.Irvine，CA)点样装置和醛包被的玻璃片(CEL Associates，Houston，TX)制备。将扩增产物点样于醛包被的载玻片上，并根据发表的步骤(Schena等，美国国家科学院院报(1996)，93：10614-10619)进行加工。阵列也可通过机器人技术打印在玻璃、尼龙(Ramsay，G.，自然生物技术(Nature Biotechnol.)(1998，16：40-44)、聚丙烯(Matson等，生物化学年鉴纪事(Anal Biochem.)(1995)，224(1)：110-6)和硅氧烷载玻片(Marshall，A和Hodgson，J.，自然生物技术，(1998)，16：27-31)上。其它阵列装配的方法包括电子领域中灵敏的微量点样(Marshall和Hodgson，同上)并直接将多核苷酸点样在带正电的包被板上。如那些使用氨基丙基硅表面化学的方法在本领域内也是公知的，如在http：//www.cmt.corning.Com和http：//cmgm.stanford.edu/pbrown/所公开的那样。

制备微阵列的一种方法是制备高密度的多核苷酸阵列。迅速沉积多核苷酸的技术已众所周知(Blanchard等，Biosensors&Bioelectronics，11：687-690)。也可使用其它制备微阵列的方法，如通过掩模制备微阵列(Maskos和Southern，核酸研究.(1992)，20：1679-1684)。原则上，如上所提到的，可使用任何类型的阵列，例如使用尼龙杂交膜上的斑点印迹。然而，如将被本领域熟练人员所认可的那样，往往优选极小的阵列，因为杂交体积将更小。

扩增的多核苷酸可以矩阵点样在包括纸、玻璃、塑料、聚丙烯、尼龙、聚丙烯酰胺、硝酸纤维、硅、光纤或任何其它合适的固相或半固相(如聚丙烯酰胺凝胶薄层(Khrapko等，DNA序列(DNA Sequence)(1991)，1：375-388))的基片表面上。

阵列可在平坦的基片上装配成二维矩阵，或者阵列可具有包括针、杆、纤维、带、细线、珠、颗粒、微量滴定孔、毛细管、圆柱体和任何其它适于杂交和检测靶分子的排列的三维构型。在一个实施方案中，扩增产物附着的基片是磁珠或颗粒。在另一实施方案中，固相基片包含光纤。又在另一实施方案中，扩增产物分散在毛细管内的流动相中，其接下来被固定于固相。

核酸的鉴定

通过本发明方法获得的扩增产物尤其适合于进一步鉴定，这部分是因为产物是单链。分析扩增产物可使用如本领域众所周知的探针杂交技术，如Northern印迹法和与探针阵列杂交。它们也可通过基于电泳的方法如差异显示和大小鉴定进行分析，这在本领域已众所周知。

扩增产物可用于确定目的序列的序列。例如，由本发明方法产生的包含目的序列的扩增产物可通过任一适当的测序方法进行测序。适当的测序方法在本领域已众所周知，并且包括如使用在掺入引物延伸产物后终止核苷酸的聚合作用的核苷酸三磷酸。

扩增产物也可用于检测样品中目的核酸序列的存在和/或对其定量。例如，可通过检测扩增产物中的目的序列而检测样品中目的核酸序列的存在，其中所述扩增产物来自于怀疑含有目的序列的样品中扩增的多核苷酸。在一些实施方案中，目的序列包含突变(例如单核苷酸多态性)、插入、缺失或置换。扩增产物中的目的序列可通过多种本领域众所周知的方法中的任何一种而得到检测，包括例如将含有(或怀疑含有)目的序列的扩增产物和可与目的序列杂交的核酸探针杂交。合适的核酸探针对本领域的技术人员是明显的，且包括如含有DNA、RNA或DNA和RNA的探针。这些探针可以任何适当的形式提供，包括如以微阵列形式提供，它可包含固定于适当基片上的探针，其中基片可由下列材料来制备，如纸、玻璃、塑料、聚丙烯、尼龙、聚丙烯酰胺、硝酸纤维、硅和光纤。扩增产物中目的序列的检测也可通过如有限引物延伸的方法而实现，这些方法在本领域已众所周知，并在如美国专利号5,888,819；6,004,744；5,882,867；5,710,028；6,027,889；6,004,745；5,763,178；5,011,769；5,185,243；4,876,187；5,882,867；WO US88/02746；WO 99/55912；WO92/15712；WO 00/09745；WO 97/32040；WO 00/56925和共同未决的美国申请系列号60/255,638，申请日：2000年12月13日中有所描述。

在一个实施方案中，本发明的扩增方法用于产生在RNA聚合期间掺入标记的核苷酸而得到标记的多拷贝单链RNA产物。例如可用合适标记的rNTPs进行本发明方法的扩增。这些标记的rNTP可直接连接于标记物上，或包含可连接于标记物上的一部分。标记物可共价或非共价连接于扩增产物。适当的标记标在本领域已众所周知，并且包括如配体，其为特异结合对之一员且其可用能检测的结合对的第二个成员来检测/定量。因此，根据本发明方法的靶多核苷酸的扩增在存在如Cye3-dATP或Cye5-dATP时，将导致这些核苷酸掺入扩增产物。

标记的扩增产物尤其适用于通过将它们与如含有适当探针如cDNA和/或寡核苷酸探针的微阵列(具有任何适合的表面，包括玻璃、芯片、塑料)、珠或颗粒接触，而进行分析(例如检测和/或定量)。因此，本发明提供了通过使用本发明的扩增方法产生标记的RNA产物并分析标记产物来鉴定(例如检测和/或定量)目的序列的方法。例如通过将标记的扩增产物与例如固定于固体或半固体基片上特定位置的探针、固定于特定颗粒上的探针或固定于斑点(如膜)上的探针如阵列杂交，可进行标记产物的分析，这在上面已描述过。其它分析标记产物的方法在本领域已众所周知，如通过将它们与含有探针的溶液接触，然后从溶液中提取含有标记扩增产物和探针的复合体。探针的特征提供了对扩增产物的序列特征，并且因此推断存在于样品中的靶多核苷酸的特性。标记产物的杂交是可检测到的，并且可检测到的特异标记物的量与特异目的序列的标记扩增产物的量成比例。这种测量方法用于例如测量样品中多种多核苷酸类型的相对量。在阵列上特定位置杂交的标记产物量(例如由与标记物相关的可检测信号指示)可显示样品中对应靶多核苷酸类型的检出和/或定量。

基因表达谱的确定

由于此处所述的方法可扩增同一样品中的多种靶多核苷酸(作为直接靶的RNA或从RNA样品中制备的cDNA)，所以本发明的扩增方法尤其适用于确定样品中多基因表达水平。如上所述，扩增产物可通过此处所述和/或本领域已众所周知的多种方法进行检测和定量。因为RNA是基因表达的产物，样品中不同RNA类型，如不同的mRNA的水平显示不同基因的相对表达水平(基因表达谱)。因此，通过定量序列扩增产物所确定的存在于样品中的目的序列的量可提供用作确定样品源中的基因表达谱。

下面的实施例提供来阐述本说明、但不用于限制本发明。

实施例

实施例1：基于复合引物方法的第一转录组件

本实施例所述的一般性方法也可用于本说明书中提供的基于复合引物方法的第一转录组件的其它实施例。

缓冲液

在所有基于复合引物的实施例中所用的缓冲液由下列物质组成：

TE缓冲液：10mM Tris-HCI，pH 8.0，1mM EDTA

TBE缓冲液：89mM Tris碱，89mM硼酸，2mM EDTA，pH 8.3

FX缓冲液：20mM Tris-SO₄，pH 9.0，20mM(NH₄)₂SO₄，0.1％NP-40

扩增方法的第一转录组件的第一个例解使用单复合引物、DNA聚合酶和RNase H

序列扩增在15μl含有20mM Tris HCl，pH 8.5、6.0mM MgCl₂、1.0mM dATP、1.0mM dCTP、1.0mM dTTP、0.8mM dGTP、0.2mM dITP(dNTP来自Amersham)、0-6％DMSO、0-8％甘油、0-100μg/ml乙酰化BSA(Ambion，Austin，TX)、0.6 U/ul重组核糖核酸酶抑制剂(rRNasin，Promega，Madison，WI)、0.5-5μM复合引物IA005和100-200nM启动子-模板寡核苷酸(PTO)IA015C的反应液中进行。复合引物IA005是具有序列ACGGAUGCGGUCUCCAGTGT(SEQ ID NO：1)的20-mer引物。启动子-模板寡核苷酸(PTO)IA015C是具有序列ggAATTCTAATACgACTCACTATAgggAgAgCggTACgCTgATCAAAgATCCgTg-生物素(SEQ ID NO：12)的55-mer寡核苷酸。

除了2种酶外，反应混合了所有组分。在可编程的热循环仪中将反应混合物加热至70℃或99℃，维持10秒后，将其冷至55℃、60℃或65℃，如在单个实施例中所述。在达到较低的温度后，加入0.05-0.24U RNase H(用稀释/存储溶液：10mM Tris-HCl，pH 8.5、30％甘油从5U/μl母液稀释；杂交酶耐热的RNase H(Epicentre Technologies，Madison，WI))和1.0-5.0U Bca DNA聚合酶(2U/μl；Panvera，Madison，WI)。反应于55℃-65℃孵育30分钟。孵育结束后，将反应冷至4℃，直至进行RNA转录步骤。

RNA转录在10μl含有2.5μl上述线性扩增反应混合物和40mMTris-HCl，pH 8.5、70mM KCl、5.0mM DTT、12mM MgCl₂、110μg/ml BSA、每一种rNTP(ATP，UTP，CTP，GTP，Amersham)3mM、7.5％DMSO、1U/μlrRNasin(Promega，Madison，WI)和20U T7 RNA聚合酶(Ambion，Austin，TX)的反应中于37℃进行3小时。

DNA模板

选择来自大肠杆菌K12的J基因区序列作为几个下述实施例的DNA模板。3种模板用于这些实验：合成的DNA靶(IA013)、由PCR扩增产生的主要为单链的DNA(351碱基)模板和大肠杆菌K12株的基因组DNA(实施例4所述的制备方法)。合成的DNA靶IA013包括：

间隔臂18-间隔臂18

      CGGTACGCTGATCAAAGATCCGTGCAACAAATGTCATGGTCATGGTCGTGTTGAGCGCAGCAAAACGCTGTCCGTTAAAATCCCGGCAGGGGTGGACACTGGAGACCGCATCCGT.间隔臂18是指聚氧乙烯间隔臂。将其加至低聚物是为了减缓100bp ssDNA产物的流动性。上述由PCR扩增产生的主要为单链的DNA(351蹦基)模板的序列是：

GCAACAAATGTCATGGTCATGGTCGTGTT

GAGCGCAGCAAAACGCTGTCCGTTAAAATCCCGGCAGGGGTGG

CTTGCGGGCGAAGGTGAAGCGGGCGAGCATGGCGCACCGGCA

GGCGATCTGTACGTTCAGGTTCAGGTTAAACAGCACCCGATITTCGAGCGTGAA

GGCAACAACCTGTATTGCGAAGTCCCGATCAACTTCGCTATGGCGGCGCTGGG

TGGCGAAATCGAAGTACCGACCCTTGATGGTCGCGTCAAACTGAAAGTGCCTG

GCGAAACCC

其中PCR引物是黑体并有下划线，以及复合引物是黑体，其中RNA部分是斜体。

从PCR扩增产物制备ssDNA靶

用引物IA006和IA004，通过PCR扩增大肠杆菌J基因的351bp片段来制备用于扩增的单链DNA模板。引物IA006有23-mer，其序列为：CGGTACGCTGATCAAAgATCCGT。引物IA004有26-mer，其序列为：CGCATACGGAATAGCTTACCGGTCT。

PCR在100μl含20mM Tris-SO₄，pH9.0、20mM(NH₄)₂SO₄、0.1％NP-40、2.0mM MgCl₂、每种dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)300μM、5 U Taq DNA聚合酶、400nM引物IA006、400nM 5′-磷酸引物IA004和0.2μl大肠杆菌K12株粗制裂解物的反应中进行。使用改良的“降落PCR”方法，参数如下：95℃5秒、68℃ 1分钟进行5个循环；94℃ 5秒、60℃ 30秒、72℃ 1分钟进行5个循环；94℃ 5秒、55℃ 30秒、72℃ 1分钟进行40循环；72℃ 15分钟，并然后无限保持于4℃。引物IA004合成有5’磷酸，以保护有义链免受λ核酸外切酶(Strandase试剂盒，Novagen，Madison，WI)的消化。Strandase的消化根据制造商的推荐进行。简而言之，通过向反应混合物中加入1/10体积的3M醋酸钠pH 5.2和0.6体积的异丙醇，于-20℃冷却1小时，在微量离心机中于最大转速离心30分钟，从反应混合物中沉淀如上所述制备的PCR产物。DNA沉淀用75％乙醇洗涤1次，然后简短风干，重悬于80μl水中。于OD260测定浓度，并加入60Uλ核酸外切酶(Strandase，Novagen)。于37℃消化20分钟，然后将反应于75℃加热10分钟，并冷至4℃。孵育在可编程的热循环仪(GeneAmp 9600，PerkinElmer)中进行。使用试剂盒(Qiagen，Valencia CA)提供的缓冲液，使用QiaQuick核苷酸去除柱(Qiagen，Valencia，CA)按照制造商的推荐纯化残留DNA。简而言之，向样品中加入10倍体积的缓冲液PN(Qiagen)。然后将全部体积加至Qiagen旋转柱，并离心(在微量离心机中于6000转/分仲离心1分钟)。弃过滤液，并用500μl缓冲液PE(Qiagen)洗涤柱子2次。然后通过在最大转速离心3分仲，使柱子完全干燥。DNA用50μl缓冲液EB(10mM Tris-HCI，pH 8.5)(Qiagen)洗脱。根据OD260估计浓度为约2.5×10¹²拷贝/5μl。凝胶分析显示仍残留显著量的双链DNA(少于总量的一半)，但浓度误差小于2倍。将DNA在TE缓冲液中稀释至10¹⁰个拷贝/5μl。根据需要，从10¹⁰个拷贝母液中制备系列稀释。基于OD测量的浓度通过有限稀释PCR分析来进一步证实。

凝胶电泳

扩增产物在Novex电泳装置(EI9001-XCell II Mini Cell，Novex)中，于1X TBE缓冲液(89mM Tris碱，89mM硼酸，2mM EDTA，pH 8.3)在Novex预灌注的4-20％聚丙烯酰胺梯度凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA；partno.EC62255)上电泳分离。将反应混合物(5μl)与1μl 6×凝胶上样液(40％蔗糖、0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯青)混合，并将全部样品立即上样于每一孔中。凝胶于250V电泳约5分钟，直至所有样品已进入凝胶，并将电压降至175V，维持45分钟。将凝胶从塑料板中移出，并在含有0.5μg/ml溴化乙锭的1X TBE缓冲液(89mM Tris碱，89mM硼酸，2mM EDTA，pH 8.3)中染色。每次凝胶运行中一个孔包括双链DNA分子大小标准(Hi-LoDNA Marker，Bionexus，San Leandro，CA)。该标准含有下列大小的16个片段：50、100、200、300、400、500、750、1000、1400、1550、2000、3000、4000、6000、8000和10000bp。一般在所用的凝胶上可分辨50-2000bp。

杂交

用于杂交实施例的寡核苷酸探针(IA010用于ssDNA产物；IA014用于ssRNA产物)用T4多核苷酸激酶(New England Biolabs，Beverly，MA)和γ-³²P-ATP(腺苷5′-[γ-³²P]三磷酸，三乙铵盐，Amersham，Piscataway，NJ；PB10218，＞5000 Ci/mmol，10mCi/ml)进行5’末端标记。引物IA010有21-met，其序列为：ATGTCATGGTCATGGTCGTGT。引物IA014有31-mer，其序列为：CTCAACACGACCATGACCATGACATTTGTTG。标记反应液(50μl总体积)含有70mM Tris-HCl，pH 7.6、10mM MgCl₂、5mM DTT、1μg寡聚物(147pmol引物IA010；101pmol引物IA014)、250μCiγ-³²P-ATP和30U T4多核苷酸激酶。在37℃孵育30分钟，然后使用QIAquick核苷酸去除试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)去除未掺入的核苷酸。在PackardMinaxi Tri-Carb 4000系列液体闪烁计数器中通过用Cherenkov计数1μl标记寡聚物确定衰减速率(cpm)。

杂交在30μl的反应液中进行。将产物DNA(或RNA)(10μl)加至20μl探针混合物中。反应含有100mM NaCl和10⁶cpm探针(用半衰期14.3天来校正衰减)。在65℃加热15秒后，让杂交在42℃进行30分钟，然后冷至4℃。这些步骤在带有加热盖的可编程热循环仪(GeneAmp 9600，Perkin Elmer)中进行。全部杂交反应体积在用1X TBE缓冲液(89mM Tris碱，89mM硼酸，2mM EDTA，pH 8.3)配制的10％聚丙烯酰胺凝胶中于150V电泳3小时。从玻璃板间移开凝胶，用塑料袋包上，并使用两个增感屏于-20℃将其曝光于放射自显影胶片过夜(约16小时)。

实施例2：基于复合引物的扩增方法的第一转录组件的第二个例证

使用单复合引物、DNA聚合酶、RNase H和TSO或阻断子进行扩增。向含有如上所述的所有反应组分的反应混合物，以及向不含有一种关键试剂如复合引物、RNase H或Bca DNA聚合酶(Panvera，Madison，WI)的反应混合物中加个1010个拷贝的合成ssDNA靶(IA010，其序列列于实施例1)。也包括含所有试剂且无靶ssDNA的阴性对照反应液。靶DNA序列的扩增按如上所述进行。靶的变性在70℃进行，并且等温扩增在65℃进行。

扩增产物通过凝胶电泳分离。在无引物、无RNase H或无Bca DNA聚合酶的反应混合物中检测不到扩增产物。

对线性扩增方法的ssDNA产物进行探针IA010杂交和放射自显影可证实扩增产物的特性。本实验中合成的寡核苷酸靶的线性扩增使用未封闭的启动子-模板寡核苷酸(IA015b)进行。启动子-模板寡核苷酸IA015b有55-mer，序列为：GGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGTACGCTGATCAAAGATCCGTG。该扩增反应使用的标准反应组分与如上所给出的一样。开始的变性步骤为在70℃进行10秒。将反应冷至65℃，进一步在该温度下孵育30分钟，然后加入Bca聚合酶和RNase H。在对照反应(无DNA、无引物、无RNase H、无Bca)中未检测到杂交。

实施例3：基于复合引物的扩增方法的基于启动子-模板寡核苷酸的第一转录组件

启动子-模板寡核苷酸(PTO)含有2个必需序列基序：T7启动子序列(5′-TAATACGACTCACTATAGGGAgGAG)和与ssDNA模板互补的序列。设计4种PTO的变体(IA012，IA012b，IA015，IA015b)。IA012 PTO有67-mer，其序列为：

GGAATTC TAATACGACTCACTATAGGGAGAGATCGAGTAGCTC CGGTACGCTG

ATCAAAGATCCGTG.

IA012 PTO除核心T7启动子外含有2个序列：5′-突出端(5′-GGAATTC)和位于启动子和与靶DNA互补的序列之间的间隔臂(5′-ATCGAGTAGCTC)。IA015是较短的PTO(48-mer)，其缺少5′-突出端和间隔臂。IA015 PTO的序列为：

TAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGTACGCTGATCAAAGATCCGTG.

IA012b PTO有60-mer，其含有间隔臂，但没有突出端。IA012b PTO序列：

TAATACGACTCACTATAGGGAGAGATCGAGTAGCTCCGGTACGCTGATCAAAG

ATCCGTG.

IA015b含有突出端，但没有间隔臂。IA015b的序列在实施例2中已公开。除了嵌合的寡核苷酸IA005、IA019和IA020外所有引物通过Keystone(国际BioSource部门，Camarillo，CA)合成，并经PAGE纯化。

通过比较合成的寡聚产物(IA009)和每种PTO之间形成的重叠-延伸产物转录后所产生的RNA的量，评估IA012、IA012b、IA015和IA015b将ssDNA模板转换成T7 RNA聚合酶底物的能力。合成的寡聚产物IA009为100-mer，其序列为：

             AGTGTCCACCCCTGCCGGGATTTTAACGGACAGCG

TTTTGCTGCGCTCA ACACGACCATGACCATGACATTTGTTGCACGGATCTTTGA

TCAGCGTACCG.

重叠-延伸在15μl含有20mM Tris-HCl，pH 8.5、6mM MgCl₂、每种dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)1mM、100nM IA009、100nM PTO和1U BcaDNA聚合酶的反应液中进行。将不含Bca DNA聚合酶的反应液加热至95℃，然后将其在10分钟的期间内冷却至60℃。加入DNA聚合酶后，将反应在60℃孵育30分钟。将反应混合物的一部分(2.5μl)加入标准RNA转录反应混合物，并通过凝胶电泳评估转录反应。

由较短PTO(IA015、IA015b)产生的转录底物所产生的RNA明显多于由IA012或IA012b产生的RNA。含有5′突出端但不含有间隔臂的PTO(IA015b)产生明显的更高产量的RNA。然而在所有的情况下，除了主要的RNA条带外，还出现了多种产物。设计具有与IA015b相同的序列，但含有3′封闭基团(生物素)以消除游离3′-OH的第五种PTO，从而证明3′-封闭的PTO的改善的性能。PTO游离3′-OH的封闭可消除它起始非特异地将功能启动子序列掺入扩增产物从而导致非特异转录产物产生的能力。使用标准条件，通过扩增合成的寡核苷酸靶来评价增强的等温线性扩增中3’-封闭和不封闭的PTO的性能。3′-封闭的PTO(IA015c)产生与IA015b不相上下的特异RNA产量，但背景明显地更低。在55℃，通过用链置换反应液中包含的IA015b或IA015c进行链置换扩增阴性对照反应液(无DNA模板)和含有10¹⁰个拷贝寡聚靶(IA013)的反应液，时间为30分钟、1小时或2小时。当3′-OH未被封闭时，在所有反应中均产生非特异RNA，并且难于确认特异RNA条带。相反，封闭的PTO主要产生单一的RNA产物。

实施例4：通过基于复合引物的扩增方法的第一转录组件来扩增大肠杆菌基因组DNA的J基因序列

DNA从25ml在胰蛋白胨-NaCl培养基中过夜生长的大肠杆菌K12(ATCC 10798)中分离。按制造商推荐的程序，通过溶菌酶消化和在离液裂解液(Bactozol试剂盒，分子研究中心，Cincinnati，OH)中溶解，分离基因组DNA。简而言之，通过在6000g离心5分钟收集细菌。将细胞沉淀重悬于溶菌酶(Bactozyme)消化缓冲液，并于50℃孵育30分钟。消化后，得到的裂解液是澄清的，没有任何可见的未消化细胞块。将裂解液与4倍体积的DNazol试剂(分子研究中心，Cincinnati，OH)混合，并于室温孵育15分钟。通过加入0.6倍体积的冰冷乙醇，从溶液中沉淀DNA。于室温孵育5分钟后，通过在微量离心机中于最大速度离心5分钟，收集沉淀的DNA。DNA沉淀用75％乙醇洗涤，再次离心，并通过在50-55℃加热30分钟，经常振荡，使之重悬于1.5ml TE缓冲液(10mM Tris-HCI，pH 8.0、1mM EDTA)。将得到的溶液反复通过22口径的注射器针尖，以剪切DNA，并降低溶液的粘性。通过加入1/10体积的5M醋酸铵和3倍体积的冰冷乙醇，再次沉淀DNA(EPI005-35)。-20℃孵育1小时后，在微量离心机中于最大速度离心，以收集DNA。沉淀用75％乙醇洗涤，再次离心，并重悬于150μl TE缓冲液。在TE缓冲液中制备2个稀释度用于OD测量(BeckmanDU640分光光度计)，根据指定的50μg/ml dsDNA在260nm处产生的OD为1，计算DNA的浓度。2个稀释度的DNA浓度是24.2μg/10μl和24.6μg/10μl。这2次测量的平均值(24.4μg/10μl)约相当于2.5×10⁹个基因组拷贝/5μl(5fg大肠杆菌基因组DNA＝1个拷贝)。

DNA扩增

DNA在TE缓冲液中系列稀释至10⁹、10⁸或10⁷个拷贝/5μl，通过加热至95℃变性5分钟，然后迅速在冰上冷却。单链模板DNA也稀释至10⁹个拷贝/5μl。组装不含DNA、含有10⁷、10⁸、10⁹或2.5×10⁹个拷贝基因组DNA的反应。

扩增在15μl含有20mM Tris-HCl，pH 8.5、6.0mM MgCl₂、1.0mMdATP、1.0mM dCTP、1.0mM dTTP、0.8mM dGTP、0.2mM dITP(dNTP购自Amersham)、6％DMSO、8％甘油、100μg/ml乙酰化BSA(Ambion，Austin，TX)、0.6U/μl重组核糖核酸酶抑制剂(rRNasin，Promega，Madison，WI)、5μM复合引物IA005(实施例1中公开的序列)、200nM启动子-模板寡核苷酸(PTO)IA015C(实施例1中公开的序列)的反应液中进行。除2种酶外，反应组装有所有的组分。在可编程可热循环仪(GeneAmp 9600，PerkinElmer)中于99℃加热10秒后，将反应在60℃孵育，当达到60℃时，加入0.6μl RNase H(从在10mM Tris-HCI，pH 8.5、30％甘油中的5U/μl的母液中稀释至0.05U)(Hybridase，Epicentre Technologies，Madison，WI)和1.0μl Bca DNA聚合酶(2.0U，Panvera，Madison，WI)，然后于60℃孵育30分钟。60℃孵育后，将反应冷至4℃。将体积为5.0μl的链置换产物加入每一个RNA转录反应中(总体积20μl)。用标准条件进行RNA的转录，并将反应体积扩大至20μl，以提供足够用于直接凝胶分析(5μl)和探针杂交(10μl)的物质。

和扩增明确表示的单链合成靶不同，根据本发明的基于复合引物的方法扩增基因组DNA通常需要形成明确的终止，以形成带有明确表示的3’末端的ssDNA产物。形成引物延伸的明确终止可通过阻断子实现，该阻断子与靶链上的明确位点杂交，且不能被聚合酶置换。另外，如本实施例中所述，引物位点上游的GC富含序列可提供引物延伸的终止点，从而导致形成带有明确表示的3’末端的ssDNA产物。

通过本发明增强的等温线性扩增方法(基于复合引物的方法的第一转录组件)，可实现基因组DNA特定序列的扩增。发现该ssRNA产物与特异的寡核苷酸探针杂交。

实施例5：评价复合引物的结构对基于复合引物的扩增方法的第一转录组件的特性的影响。

评价了本发明基于复合引物的扩增方法的第一转录组件中3种复合引物中每种引物的特性。等温线性扩增在15μl含有20mM Tris-HCl，pH 8.5、6.0mM MgCl₂、1.0mM dATP、1.0mM dCTP、1.0mM dTTP、0.8mM dGTP、0.2mM dITP(dNTP来自Amersham)、6％DMSO、8％甘油、100μg/ml乙酰化BSA(Ambion，Austin，TX)、0.6U/μl重组核糖核酸酶抑制剂(rRNasin，Promega，Madison，WI)、5μM复合引物、200nM启动子-模板寡核苷酸(PTO)IA015C的反应液中进行。PTO IA015C的序列已在实施例1中公开。复合引物IA005(20-mer)的序列已在实施例1中公开。具有字母数字名称的其它复合引物序列如下：

IA019(20-mer)ACGGAUGCGGUCUCCAGTGT

IA020(21-mer)GACGGAUGCGGUCUCCAGTGT

使用了不具有字母数字名称的4种其它复合引物序列。它们的序列分别是：

(1)GCAAGACGGAUGCGGUCUCCAGTGT

(2)GACGATGCGUCTCCAGTGT

(3)GACGGATGCGGUCTCCAGUGT

(4)GACGGATGCGGUCTCCAGUGUCCA

这些复合引物由Dharmacon Research，Inc.(Boulder，CO)合成。使用5′-甲硅烷基保护基团与酸不稳定的2′-原酸酯保护基团(2′-双(醋酸基乙氧基)-甲基醚或″2′-ACE″(Scaringe，S.A等.美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)120：11820-11821(1998)和Scaringe，S.A.用于RNA寡核苷酸合成的先进的5′-甲硅烷基-2′-原酸酯法，酶学方法(Methods in Enzymology)(待出版))来合成寡核苷酸的RNA部分。引物经PAGE纯化。

除2种酶外，反应组装有所有组分。在可编程热循环仪(GeneAmp 9600，Perkin Elmer)中于70℃加热10秒后，将反应冷至55℃-65℃。当达到较低温度后，加入0.05 U RNase H(使用稀释/储存溶液：10mM Tris-HCl，pH 8.5、30％甘油，从5U/μl的母液稀释；杂交酶热稳定RNase H(EpicentreTechnologies，Madison，WI)和2.0U Bca DNA聚合酶(2U/ul；Panvera，Madison，WI)。将反应在55℃-65℃孵育30分钟。孵育后，将反应冷至4℃，直至进行RNA转录。RNA转录在10μl含有2.5μl如上的线性扩增反应液和40mM Tris-HCl，pH 8.5、70mM KCl、5.0mM DTT、12mM MgCl₂、110μg/ml BSA、每种rNTP(ATP、UTP、CTP、GTP、Amersham)3mM、7.5％DMSO、1U/μl rRNasin(Promega，Madison，WI)以及20U T7 RNA聚合酶(Novagen，Madison，WI)的反应液中于37℃进行3小时。

由每种复合引物产生的增强线性扩增产物通过凝胶电泳分辨。所设计的复合引物与靶链的相同位点杂交，但3′-末端的脱氧核苷酸数不同。最高产量的RNA产物由引物IA020产生，然后是产生相等RNA产物的IA005和IA019。其它4种复合引物产生较少的RNA产物。如预期的那样，等温线性扩增步骤的最佳温度对不同的引物是不同的。

实施例6：使用基于复合引物的扩增方法的第一转录组件和基因型特异复合引物的基因分型

使用上述实施例所述的方法或为技术人员所熟知的其它方法，从试验细胞分离基因组DNA。对包括但不限于细菌、病毒、真菌、酵母、植物和动物的不同生物基因分型。设计的基因型特异引物包含与一种基因型的特异核酸序列杂交的3′-末端核苷酸，或与对应的基因型杂交。确定特异基因型的序列变异可能是点突变、单核苷酸多态性(sNP)、插入、缺失等等。

已明确的靶核酸序列的扩增按上述实施例中大肠杆菌基因组序列扩增中所述进行。使用基因型特异引物和无校正活性的DNA聚合酶，扩增产物的产生显示存在已明确的基因型的靶序列。阻止引物的3′-末端与靶核酸序列杂交的序列变异将阻止扩增。用于检测单链核酸序列的多种方法中的任何一种方法均可检测扩增产物，这在本领域已众所周知。例如，通过凝胶电泳检测特异标记的寡核苷酸探针与扩增产物的杂交。

在需要对二倍体细胞进行基因分型的情况下，如确定纯合子或杂合子基因型时，使用设计用于野生型和突变基因型或设计用于一种基因型和另一种基因型的特异引物来进行特异核酸靶序列的扩增是可行的。使用特异引物的扩增反应在分别的反应容器中进行。只在一个反应管中检测到扩增产物或扩增产物较少显示为纯合子基因型，即为野生型或为突变的纯合子。在两个扩增反应中均检测到扩增产物显示杂合子基因型。

实施例7：使用基于复合引物的扩增方法和基因型特异探针杂交的基因分型

通过杂交进行测序的方法在上面的实施例中有所描述。当通过本发明的方法产生的扩增产物是单链，并易于与特异探针的杂交的时候，使用本发明的等温方法通过特异探针的杂交来确定序列的特性是尤其有利的。使用本领域众所周知的方法设计已知基因型所特异的探针。可确定支持探针与扩增产物选择性杂交的杂交标准，其中所述扩增产物由扩增一种基因型而非另一种基因型所产生。少至单核苷酸的序列变异可阻止探针杂交。下述因素可考虑用于杂交标准：探针长度、杂交反应的温度和缓冲液的组分，尤其是二价离子浓度。用于分析的探针可在溶液中，或可附着在固体表面。此外，探针可直接被标记或与特异结合对中的一员结合，后者因此可特异地与可直接或间接标记的特异结合对中的另一员结合。

通过本领域众所周知的方法或如上面实施例所述的方法，从测试样品中分离基因组DNA。测试DNA与所述的扩增组分、靶特异的复合引物和前启动子序列(如PTO)组合。组合物经过此处所述的条件孵育，以产生单链RNA扩增产物。扩增产物与基因型特异探针的杂交在溶液中进行，或在附着有基因型特异探针的固相上进行。由于扩增产物是单链的，该产物理论上适用于被附着在固相如玻片上，以产生空间上可分辨的特异探针(即基因芯片)。另外，固相包含附着有特异探针的颗粒。探针与扩增产物杂交的检测可通过本领域众所周知的方法多种进行，例如Sambrook等，同上文出处中已公开的方法。特异探针被标记，并且检测由杂交引起的标记物光谱特性的改变，并通过计算机算法记录。

由于特异探针和扩增产物的杂交产生的颗粒缔合也用于检测探针的杂交。产生标记的扩增产物，检测与固定在固体表面的探针杂交的产物，并通过计算机算法记录。通过在转录步骤期间将4种rNTP中的一种用标记的rNTP类似物替换，掺入标记的rNTPs而产生标记扩增产物。标记物是染料或小分子如生物素，该标记物然后通过与特异结合物如标记的链亲和素结合而得到检测。检测在固体表面的探针杂交方法在本领域已众所周知。

实施例8：使用基于复合引物的扩增方法，通过rSSCP(RNA单链构象多态性)进行基因分型

通过使用此处所述基于复合引物的方法扩增特异靶核酸序列并通过确定反映单链构象的单链RNA产物的电泳条带模式来进行基因分型。利用SSCP检测序列改变被广泛使用。通过将样品经凝胶或毛细管电泳，确定基因型特异的单链构象。根据本发明的方法，通过扩增靶核酸序列而产生单链产物，这使该方法尤其适于通过将扩增方法和rSSCP分析结合来进行基因型的确定。

纯化的测试基因组DNA与如上所述的本发明扩增方法中的组分、靶特异的复合引物以及前启动子序列如PTO组合。该组合物于等温扩增靶序列的条件下进行反应。使用本领域众所周知的仪器和条件，对包含扩增产物的反应混合物进行凝胶电泳或毛细管电泳。确定扩增产物的电泳条带模式。通过嵌入染料，可实现寡核苷酸产物的显影。扩增产物的电泳模式与扩增从已知基因型的细胞中获得的靶核酸序列所产生的扩增产物进行比较。电泳迁移模式的任何变化显示序列的变异。将本发明的扩增方法和rSSCP结合起来可提供一个简单的方法用于发现已明确的靶序列的序列多态性和检测以前已明确的基因型。可预先确定已知核酸序列或已明确的基因型的电泳模式，并且将由扩增测试DNA的产物所产生的模式与基因型确定的已知模式进行比较。

实施例9：使用基于复合引物的方法和第一以及第二转录组件扩增大肠杆菌J基因靶序列

该实施例描述了大肠杆菌J基因已知序列的增强等温线性扩增，然后通过等温指数级扩增该序列以产生多拷贝的ssRNA。

(i)在第一个实施例中，使用3种不同结构的单复合引物，产生了增强线性等温扩增的RNA产物。评估了本发明的扩增方法中3种复合引物中每种的特性。

等温线性扩增在15μl含有20mM Tris-HCl，pH 8.5、6.0mM MgCl₂、1.0mM dATP、1.0mM dCTP、1.0mM dTTP、0.8mM dGTP、0.2mM dITP(dNTP来自Amersham)、6％DMSO、8％甘油、100μg/ml乙酰化BSA(Ambion，Austin，TX)、0.6U/μl重组核糖核酸酶抑制剂(rRNasin，Promega，Madison，WI)、5μM复合引物(IA005或IA019或IA020)、200nM启动子-模板寡核苷酸(PTO)IA015C的反应液中进行。所有反应具有10⁹个拷贝的由351个核苷酸组成的单链DNA模板。除2种酶外，反应组装有所有的组分。

在可编程热循环仪(GeneAmp 9600，Perkin Elmer)中于70℃加热10秒后，将反应冷至55℃-65℃。将复合引物IA005冷至60℃，复合引物IA019和IA020在分别的反应中分别冷至55℃、60℃和65℃。在达到较低的温度后，加入0.05U RNaseH(使用稀释/储存溶液：10mM Tris-HCl，pH 8.5、30％甘油，从5U/μl的母液中稀释；杂交酶热稳定的RnaseH，Epicentre Technologies，Madison，WI)和2.0U Bca DNA聚合酶(2U/μl；Panvera，Madison，WI)。将反应在55℃-65℃孵育30分钟。孵育后，将反应冷至4℃，直至进行RNA转录，该转录在10μl含有2.5上述的线性扩增反应液和40mM TrisHCl，pH 8.5、70mM KCl、5.0mM DTT、12mM MgCl₂、110μg/ml BSA、每种rNTP(ATP，UTP，CTP，GTP，Amersham)3mM、7.5％DMSO、1U/μl rRNasin(Promega，Madison，WI)和20U T7 RNA聚合酶(Novagen，Madison，WI)的反应液中，于37℃进行3小时。

每种复合引物产生的增强线性扩增产物通过凝胶电泳分离。3种复合引物设计为与靶链的相同位点杂交，它们的不同之处在于3′-末端的双脱氧核苷酸数不同。用引物IA020可产生最高产量的RNA产物。等温线性扩增步骤的最佳温度对不同引物是不同的，这一点与预期一致。此外，引物结构的优化预计可增强扩增的特性。

(ii)然后，将如上所述用引物IA020产生的线性扩增产物进行等温指数级扩增。

将来自如上所述用引物IA020在55℃线性扩增的包括ssDNA产物的反应混合物稀释成1∶10，并且将2.5μl这种稀释液加至5μl含有40mMTris-HCl，pH 8.5、70mM KCl、5.0mM DTT、12mM MgCl₂、110μg/ml BSA、每种rNTP(ATP、UTP、CTP、GTP、Amersham)3mM、7.5％DMSO、1U/μl rRNasin(Promega，Madison，WI)和20U T7 RNA聚合酶(Novagen，Madison，WI)、dNTPs(1.0mM dATP、1.0mM dCTP、1.0mM dTTP、0.8mM dGTP、0.2mMdITP，Amersham)，MMLV-反转录酶(200U)、RNaseH(0.05U)、PTO IA015c(200nM)和引物IA024(1μM)的转录混合物。将反应在37℃分别孵育0、5、10、20、40和60分钟。来自这些时间点的小份经过凝胶电泳(5-20％聚丙烯酰胺凝胶，Novex)，凝胶用SyberGreen^TM染色，并且利用成象系统可看到产物条带。经20分钟反应后，可清楚检测到产物。

(iii)在致力于确定优化反应效率的条件中，检查了下述条件/因素：

I、上述方法中的RNaseH是热稳定酶。推断用非热稳定、并在37℃活性可更强的大肠杆菌RNaseH置换该酶，将改善扩增条件。

II、降低反转录酶的浓度，以提高特异性(减少成片电泳条带)。

如上建立反应，该反应有下述改进：用大肠杆菌RNaseH(0.08U)和MMLV-反转录酶(25U)代替上述方法中的RNaseH和反转录酶。用这些条件测试2个靶序列：如上所述的J基因靶序列以及合成的单链DNA靶(IA009)。反应在37℃进行60分钟。在这些条件下，扩增效率显然提高，产生更多已知产物条带以及更少的杂带(杂带表明高的非特异产物的产生)。

序列：

本实施例使用的序列如下：

复合RNA/DNA引物

IA005   r{ACggAUgCggUCUCC}AgTgT    (20-mer)

IA019   r{ACggAUgCggUCUCCAg}TgT    (20-mer)

IA020   r{gACggAUgCggUCU}CCAgTgT   (21-mer)

这些引物由Dharmacon Research，Inc.(Boulder，CO)合成。使用5′-甲硅烷基保护基团与酸不稳定的2′-原酸酯保护基团(2′-双(醋酸基乙氧基)-甲基醚或″2′-ACE″(Scaringe，S.A等.美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)120：11820-11821(1998)和Scaringe，S.A.用于RNA寡核苷酸合成的先进的5′-甲硅烷基-2′-原酸酯法，酶学方法(待出版))来合成寡核苷酸的RNA部分。寡核苷酸通过聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。

除复合寡核苷酸外，所有寡核苷酸由Keystone(Division ofBioSource International，Camarillo，CA)合成。

PTO

IAO15c(55-mer)：

ggAATTCTAATACgACTCACTATAgggAgAgCggTACgCTgATCAAAgATCCgTg-生物素

J-基因靶序列(来自J基因的PCR产物)

CAACAAATgTCATggTCATggTCgTgTTgAgCgCAgCAAAACgCTgTCCgTTAAAATCCCggCAggggTgg CTTgCgggCgAAggTgAAgCgggCgAgCATggCgCACCggCAggCgATCTgTACgTTCAggTTCAggTrAAACAgCACCCgATTTTCgAgCgTgAAggCAACAACCTgTATTgCgAAgTCCCgATCAACTTCgCTATggCggCgCTgggTggCgAAATCgAAgTACCgACCCTTgATggTCgCgTCAAACTgAAAgTgCCTggCgAAACCC

PCR引物以黑体/下划线显示。嵌合引物以黑体显示，其RNA部分是斜体。

合成的寡聚链-置换产物(IA009)

IA009(100-mer)：

AgTgTCCACCCCTgCCgggATTTTAACggACAgCgTTTrgCTgCgCTCA ACACg ACCATgACCATgACATTTgTTgCACggATCTTTgATCAgCgTACCg

虽然为了清楚地理解，通过例证和实施例方式已详细描述了上述发明，但本领域技术人员显然可进行某些改变和改进。因此，此处的描述和实施例不应构成对本发明范围的限制，本发明的范围在附上的权利要求中有所描述。

Claims (67)

1.产生多拷贝目的核酸序列的方法，所述方法包括下列步骤：

(a)将包含目的核酸序列的单链靶多核苷酸与第一引物杂交，其中所述第一引物为包含RNA部分和3′DNA部分的复合引物；

(b)任选地将包含终止多核苷酸序列的多核苷酸与靶多核苷酸5′的区域杂交，其中所述靶多核苷酸5′的区域为相对于第一引物与靶多核苷酸的杂交位点而言；

(c)用DNA依赖的DNA聚合酶延伸第一引物，以产生包含第一引物延伸产物和靶多核苷酸的复合体；

(d)使用从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶从第一引物延伸产物和靶多核苷酸复合体的复合引物上切除RNA部分，以使另一复合引物可与靶多核苷酸杂交，并通过链置换重复引物延伸，以产生置换的引物延伸产物；

(e)杂交前启动子多核苷酸，其中所述前启动子多核苷酸包含前启动子并包含与置换的引物延伸产物在允许通过RNA聚合酶进行转录的条件下杂交的区域，以便产生包含与置换的引物延伸产物有互补序列的RNA转录本；

(f)将第二引物与步骤(e)的RNA转录本杂交；

(g)用RNA依赖的DNA聚合酶延伸第二引物，以产生包含第二引物延伸产物和RNA转录本的复合体；

(h)用从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶切除步骤(g)复合体中的RNA；

(i)将单链第二引物延伸产物与前启动子多核苷酸杂交，其中前启动子多核苷酸包含前启动子并包含与单链第二引物延伸产物在允许通过RNA聚合酶进行转录的条件下杂交的区域，从而产生包含目的序列的RNA转录本；

由此产生多拷贝目的核酸序列。

2.产生多拷贝目的核酸序列的方法，所述方法包括下列步骤：

(a)组合：

权利要求1步骤(c)的复合体；

可与靶多核苷酸杂交的复合引物，其中复合引物包含RNA部分和3′DNA部分；

从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶；

包含前启动子并包含与置换的复合引物延伸产物杂交的区域的前启子多核苷酸；

RNA聚合酶；

可与包含目的序列的正义RNA转录本杂交的第二引物；

RNA依赖的DNA聚合酶；以及

包含前启动子并包含与第二引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸；和

(b)孵育步骤(a)的混合物，孵育条件为允许引物杂交和延伸、RNA切除、当权利要求1步骤(c)的复合体的RNA被切除且复合引物结合到复合体中的靶多核苷酸后从权利要求1步骤(c)的复合体中置换第一引物延伸产物、前启动子多核苷酸与第一引物延伸产物杂交以形成包含第一引物延伸产物和前启动子多核苷酸的复合体、将前启动子多核苷酸与第二引物延伸产物杂交以形成包含第二引物延伸产物和前启动子多核苷酸的复合体，以及RNA转录，由此产生多拷贝目的核酸序列。

3.产生多拷贝目的核酸序列的方法，所述方法包括下列步骤：

(a)组合：

权利要求1步骤(d)的置换的引物延伸产物；

包含前启动子并包含与置换的第一引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸；

RNA聚合酶；

可与包含目的序列的正义RNA转录本杂交的第二引物；

RNA依赖的DNA聚合酶；

从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶；以及

包含前启动子并包含与第二引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸；和

(b)孵育步骤(a)的混合物，孵育条件为允许引物杂交和延伸、RNA切除、前启动子多核苷酸与第一引物延伸产物杂交以形成包含第一引物延伸产物和前启动子多核苷酸的复合体、前启动子多核苷酸与第二引物延伸产物杂交以形成包含第二引物延伸产物和前启动子多核苷酸的复合体，以及RNA转录，由此产生多拷贝目的核酸序列。

4.产生多拷贝目的核酸序列的方法，所述方法包括下列步骤：

(a)组合：

权利要求1步骤(e)的RNA转录本；

可与包含目的序列的正义RNA转录本杂交的第二引物；

RNA依赖的DNA聚合酶；

从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶；

包含前启动子并包含与第二引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸；以及

RNA聚合酶；和

(b)孵育步骤(a)的混合物，孵育条件为允许引物杂交和延伸、RNA切除、前启动子多核苷酸与引物延伸产物杂交以形成包含引物延伸产物和前启动子多核苷酸的复合体，以及RNA转录，由此产生多拷贝的目的核酸序列。

5.产生多拷贝目的核酸序列的方法，所述方法包括下列步骤：

(a)组合：

第一引物，其中第一引物为可与靶多核苷酸杂交的复合引物，且其中复合引物包含RNA部分和3′DNA部分；

任选地，可与靶多核苷酸5′区域杂交的包含终止多核苷酸序列的多核苷酸，其中所述靶多核苷酸5′区域为相对于复合引物与靶多核苷酸的杂交而言；

DNA依赖的DNA聚合酶；

从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶；

包含前启动子并包含与第一引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸；

RNA聚合酶；

可与包含目的序列的正义RNA转录本杂交的第二引物；

RNA依赖的DNA聚合酶；以及

包含前启动子并包含与第二引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸；和

(b)孵育步骤(a)的混合物，孵育条件为允许引物杂交和延伸、RNA切除、包含第一引物延伸产物和靶多核苷酸的复合体在其RNA被切除且复合引物结合到复合体中的靶多核苷酸后从复合体中置换第一引物延伸产物、前启动子多核苷酸与引物延伸产物杂交以形成包含引物延伸产物和前启动子多核苷酸的复合体，以及RNA转录，由此产生多拷贝目的核酸序列。

6.权利要求1的方法，其中5′RNA部分与3′DNA部分毗邻。

7.权利要求1的方法，其中使用了多种复合引物。

8.权利要求1的方法，其中包含终止序列的多核苷酸为模板转换寡核苷酸(TSO)。

9.权利要求8的方法，其中TSO在与模板杂交的区域内包含修饰，其中在给定的一组条件下，与没有修饰的TSO相比，该TSO与该区域结合得更紧密。

10.权利要求1的方法，其中包含终止序列的多核苷酸是阻断序列。

11.权利要求10的方法，其中阻断序列在其与靶多核苷酸杂交的区域内包含修饰，其中在给定的一组条件下，与没有修饰的阻断序列相比，该阻断序列与该区域结合得更紧密。

12.权利要求1的方法，其中切割RNA的酶为RNaseH。

13.权利要求1的方法，其中包含前启动子并包含与置换的第一引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸为模板转换寡核苷酸(TSO)。

14.权利要求1的方法，其中包含前启动子并包含与单链第二引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸为TSO。

15.权利要求1的方法，其中包含前启动子并包含与置换的第一引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸为前启动子模板寡核苷酸(PTO)。

16.权利要求1的方法，其中包含前启动子并包含与单链第二引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸为PTO。

17.产生多拷贝目的核酸序列的方法，所述方法包括下列步骤：

(a)将包含目的序列的单链靶多核苷酸与第一引物杂交；

(b)前启动子模板转换寡核苷酸(TSO)的杂交，其中所述TSO包含前启动子序列和可与靶多核苷酸5’杂交的区域，其中所述靶多核苷酸的5′区为相对于第一引物与靶多核苷酸的杂交而言；

(c)用DNA聚合酶延伸第一引物，以产生包含与前启动子TSO的前启动子序列具互补序列的第一引物延伸产物，因此产生了第一引物延伸产物、靶多核苷酸和前启动子TSO的复合体，其中所述复合体包含双链启动子区域；

(d)用DNA依赖的RNA聚合酶从双链启动子区域转录，以产生正义RNA转录本；

(e)将第二引物与步骤(d)的正义RNA转录本杂交；

(f)第二引物在RNA依赖的DNA聚合酶的作用下延伸，以产生包含第二引物延伸产物和RNA转录本的复合体；

(g)用从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶切除步骤(f)复合体中的RNA；

(h)单链第二引物延伸产物与前启动子多核苷酸杂交，其中前启动子多核苷酸包含前启动子并包含与单链第二引物延伸产物在允许RNA聚合酶进行转录的条件下杂交的区域，这样包含目的序列的正义RNA转录本得以产生；

由此产生多拷贝目的核酸序列。

18.产生多拷贝目的核酸序列的方法，所述方法包括下列步骤：

(a)组合：

权利要求17步骤(c)的复合体；

RNA聚合酶；

可与包含目的序列的正义RNA转录本杂交的第二引物；

RNA依赖的DNA聚合酶；

从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶；以及

包含前启动子并包含与第二引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸；和

(b)孵育步骤(a)的混合物，孵育条件为允许引物的杂交和延伸、RNA切除、前启动子多核苷酸与引物延伸产物杂交以形成包含引物延伸产物和前启动子多核苷酸的复合体，以及RNA转录，由此产生了多拷贝目的核酸序列。

19.产生多拷贝目的核酸序列的方法，所述方法包括下列步骤：

(a)组合：

权利要求17步骤(d)的RNA转录本；

可与RNA转录本杂交的第二引物；

RNA依赖的DNA聚合酶；

从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶；

包含前启动子并包含与第二引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸；以及

RNA聚合酶；和

(b)孵育步骤(a)的混合物，孵育条件为允许引物的杂交和延伸、RNA切除、前启动子多核苷酸和引物延伸产物杂交以形成包含引物延伸产物和前启动子多核苷酸的复合体，以及RNA转录，由此产生了多拷贝目的核酸序列。

20.产生多拷贝目的核酸序列的方法，所述方法包括下列步骤：

(a)组合：

靶多核苷酸；

可与靶多核苷酸杂交的第一引物；

包含前启动子序列并包含可与靶多核苷酸5’区杂交的区域的前启动子模板转换寡核苷酸，其中所述靶多核苷酸5’区为相对于第一引物与靶多核苷酸的杂交而言；

任选地DNA依赖的DNA聚合酶；

RNA聚合酶；

可与包含目的序列的正义RNA转录本杂交的第二引物；

RNA依赖的DNA聚合酶；

从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶；以及

包含前启动子并包含与第二引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸；和

(b)孵育步骤(a)的混合物，孵育条件为允许引物杂交和延伸、RNA切除、前启动子多核苷酸与引物延伸产物杂交以形成包含引物延伸产物和前启动子多核苷酸的复合体，以及RNA转录，由此产生多拷贝目的核酸序列。

21.权利要求17的方法，其中靶多核苷酸是DNA。

22.权利要求17的方法，其中靶多核苷酸是RNA。

23.权利要求17的方法，其中第一引物和第二引物相同；

24.权利要求17的方法，其中第一引物和第二引物不同。

25.权利要求17的方法，其中第一引物和第二条物与不同的互补序列杂交。

26.权利要求17的方法，其中RNA依赖的DNA聚合酶是反转录酶。

27.权利要求17的方法，其中靶多核苷酸是RNA，并且步骤(c)的复合物中的RNA用从RNA/DNA杂合体中切割RNA的酶切割。

28.权利要求17的方法，其中包含前启动子并包含与第二引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸是前启动子TSO。

29.权利要求17的方法，其中包含前启动子并包含与第二引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸是前启动子模板寡核苷酸(PTO)。

30.权利要求1或17的方法，其中所用rNTP中至少一种为标记的rNTP，由此产生标记的RNA产物。

31.权利要求1的方法，其中RNA依赖的DNA聚合酶和DNA依赖的DNA聚合酶是一种酶。

32.权利要求17的方法，其中步骤(c)的DNA聚合酶是DNA依赖的DNA聚合酶，并且其中DNA依赖的DNA聚合酶和RNA依赖的DNA聚合酶是一种酶。

33.权利要求1或17的方法，其中RNA依赖的DNA聚合酶和从RNA/DNA杂合体上切割RNA的酶是相同的酶。

34.权利要求1的方法，其中DNA依赖的DNA聚合酶和从RNA/DNA杂合体上切割RNA的酶是相同的酶。

35.权利要求17的方法，其中步骤(c)的DNA聚合酶是DNA依赖的DNA聚合酶，并且其中DNA依赖的DNA聚合酶和从RNA/DNA杂合体上切割RNA的酶是相同的酶。

36.权利要求1的方法，其中DNA依赖的DNA聚合酶、RNA依赖的DNA聚合酶和从RNA/DNA杂合体上切割RNA的酶是相同的酶。

37.权利要求17的方法，其中步骤(c)的DNA聚合酶是DNA依赖的DNA聚合酶，并且其中DNA依赖的DNA聚合酶、RNA依赖的DNA聚合酶和从RNA/DNA杂合体上切割RNA的酶是相同的酶。

38.测定靶多核苷酸序列的方法，所述方法包括：(a)在rNTPs和rNTP类似物的混合物存在下，通过权利要求1或17的方法扩增靶多核苷酸，这样转录在掺入rNTP类似物时终止；以及(b)分析扩增产物以确定序列。

39.测定靶多核苷酸序列的方法，所述方法包括：(a)通过权利要求1或17的方法扩增靶多核苷酸，其中在rNTPs和rNTP类似物的混合物存在下，扩增由第一引物延伸产物产生的RNA转录本，这样转录在掺入rNTP类似物时终止；以及(b)分析扩增产物以确定序列。

40.通过单链构象多态性检测靶多核苷酸中突变的方法，其包括：(a)通过权利要求1或17的方法扩增靶多核苷酸；以及(b)分析扩增产物的单链构象，其中当与参照的单链多核苷酸比较时，构象的差异表明靶多核苷酸中的突变。

41.鉴定靶多核苷酸中目的序列的方法，所述方法包括：

(i)通过权利要求1的方法扩增包含目的序列的靶多核苷酸，其中复合引物的RNA部分的序列已知，以及

(ii)如果有来自步骤(i)的扩增产物的话，将其与由参考模板扩增的产物量进行比较，其中

(1)从模板产生的可检测出的扩增产物量少于从包含复合引物RNA部分互补区域的参考模板中扩增的产物量，说明靶多核苷酸不包含与复合引物RNA部分互补的序列，且相对于复合引物RNA部分的互补序列而言为一序列变体；或

(2)从模板产生的可检测出的扩增产物量多于从不包含与复合引物RNA部分互补区域的参考模板中扩增的产物量，说明靶多核苷酸包含与复合引物RNA部分互补的序列，且相对于复合引物RNA部分的互补序列而言为非序列变体。

42.权利要求41的方法，其中复合引物RNA部分的序列包含与野生型序列互补的序列，并且通过确定野生型序列的存在或缺失来鉴定目的序列。

43.权利要求41的方法，其中复合引物RNA部分的序列包含与突变序列互补的序列，并且通过确定突变序列的存在或缺失来鉴定目的序列。

44.权利要求41的方法，其中复合引物RNA部分的序列包含与等位基因序列互补的序列，并且通过确定等位基因序列的存在或缺失来鉴定目的序列。

45.产生微阵列的方法，其包括(a)通过权利要求1或17的方法扩增靶多核苷酸；以及(b)将扩增产物固定于基片上，以制备包含扩增产物的微阵列。

46.鉴定目的序列的方法，其包括(a)通过权利要求30的方法扩增靶多核苷酸；以及(b)分析标记的RNA产物。

47.权利要求46的方法，其中步骤(b)包括将标记的RNA产物与至少一种探针接触。

48.权利要求47的方法，其中至少一种探针是以微阵列形式提供的。

49.权利要求48的方法，其中微阵列包含至少一种固定于基片上的探针，其中所述基片由选自纸、玻璃、塑料、聚丙烯、尼龙、聚丙烯酰胺、硝酸纤维、硅和光纤的材料制备。

50.权利要求49的方法，其中探针固定在二维结构或三维结构的基片上，其中二维或三维结构包括针、棒、纤维、带、细线、珠、颗粒、微量滴定孔、毛细管和圆柱体。

51.权利要求46的方法，其中分析标记RNA产物的步骤(b)包括确定所述产物的量，由此定量存在于样品中的目的序列的量。

52.确定样品中基因表达谱的方法，所述方法包括：

(a)使用权利要求1或17的方法，扩增样品中的至少两种目的序列；以及

(b)确定每一种目的序列的扩增产物的量，其中每一所述的量显示了样品中每种目的序列的量，由此确定样品中的基因表达谱。

53.权利要求52的方法，其中每一靶多核苷酸为一种cDNA。

54.扩增目的序列的体系，其包含：(a)第一引物，其为复合引物；(b)第二引物；(c)DNA依赖的DNA聚合酶；(d)RNA依赖的DNA聚合酶；(e)前启动子多核苷酸；(f)RNA聚合酶；以及(g)从RNA/DNA杂合体上切割RNA的酶。

55.权利要求54的体系，其还包含：(h)包含终止多核苷酸序列的多核苷酸。

56.扩增目的序列的体系，其包含：(a)前启动子TSO；(b)第一引物；(c)任选地DNA依赖的DNA聚合酶；(d)RNA依赖的DNA聚合酶；(e)从RNA/DNA杂合体上切割RNA的酶；(f)任选地第二引物；(g)RNA聚合酶。

57.权利要求54或56的体系，其中DNA依赖的DNA聚合酶和RNA依赖的DNA聚合酶是相同的酶。

58.权利要求54或56的体系，其中DNA依赖的DNA聚合酶和从RNA/DNA杂合体上切割RNA的酶是相同的酶。

59.权利要求54或56的体系，其中RNA依赖的DNA聚合酶和从RNA/DNA杂合体上切割RNA的酶是相同的酶。

60.权利要求54或56的体系，其中RNA依赖的DNA聚合酶、DNA依赖的DNA聚合酶和从RNA/DNA杂合体上切割RNA的酶是相同的酶。

61.试剂盒，其包含可与靶多核苷酸杂交的复合引物、前启动子多核苷酸和根据权利要求1的方法用于扩增靶多核苷酸的说明书。

62.权利要求61的试剂盒，其还包含含有终止多核苷酸序列的多核苷酸。

63.权利要求61的试剂盒，其还包含第二引物。

64.试剂盒，其包含前启动子TSO和第一引物并包含根据权利要求17的方法扩增靶多核苷酸的说明书，其中前启动子TSO和第一引物两者都可与靶多核苷酸杂交。

65.权利要求64的试剂盒，其还包含第二引物。

66.确定目的序列的序列的方法，其包括测定核酸扩增产物的序列，其中所述核酸扩增产物根据权利要求1或17的方法产生。

67.检测样品中目的核酸序列存在的方法，所述方法包括检测在核酸扩增产物中目的序列的存在，其中所述核酸扩增产物根据权利要求1或17的方法产生。

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