CN1476483A - 改良安卡拉痘苗病毒变体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种减毒病毒，它衍生自修饰的安卡拉痘苗病毒，它的特征是失去了在人类细胞系中重复复制的能力。本发明进一步描述了衍生于该病毒的重组病毒及该病毒或其重组体作为药物或疫苗的用途。此外，本发明提供了一种甚至在免疫受损患者，对疫苗病毒已有免疫力的患者或正在接受抗病毒治疗的患者中都能诱导免疫应答的方法。

Description

改良安卡拉痘苗病毒变体
本发明提供了一种减毒病毒，它衍生自改良安卡拉痘苗病毒，它的特征是失去了在人类细胞系中重复复制的能力。本发明进一步描述了衍生于该病毒的重组病毒及该病毒或其重组体作为药物或疫苗的用途。此外，本发明提供了一种甚至在免疫受损患者，对疫苗病毒已有免疫力的患者或正在接受抗病毒治疗的患者中都能诱导免疫应答的方法。
背景技术
改良安卡拉痘苗(MVA)病毒涉及痘苗病毒，它是痘病毒科正粘病毒属的一员。MVA是通过将痘苗病毒的安卡拉毒株在鸡胚成纤维细胞上连续传516代(CVA)而得到的(综述可参见Mayr，A.，等Infection 3，6-14[1975])。如此长期传代得到一种MVA病毒，其基因组序列中缺失了大约31kb，因此它被描述为对宿主细胞具有高度选择性，仅限于鸟类细胞(Meyer，H.等，J.Gen.Virol.72，1031-1038[1991])。所得MVA在多种动物模型中明显缺乏毒力(Mayr，A.&Danner，K.[1978]Dev.Biol.Stand.41：225-34)。此外，临床试验中还检验了该MVA毒株作为疫苗经免疫接种而对抗人类天花的效果(Mayr等，Zbl.Bakt.Hyg.I，Abt.Org.B 167，375-390[1987]，Stickl等，Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392[1974])。有超过120,000人(包括高危病人)参与这些研究，结果表明，与基于痘苗病毒的疫苗相比，MVA消除了毒力或感染性但保留了良好的致免疫性。
在接下来的数十年中，MVA经过改良后，被用作重组基因表达的病毒载体或被用作重组疫苗(Sutter，G.等[1994]，Vaccine 12：1032-40)。
在此方面最令人惊讶的是，尽管Mayr等在二十世纪七十年代就已经证实MVA在人和哺乳动物中是高度减毒的和无毒性的，但一些近期报道(Blanchard等，1998，J Gen Virol 79，1159-1167；Carroll & Moss，1997，Virology238，198-211；Altenberger，美国专利5,185,146；Ambrosini等，1999，J NeurosciRes 55(5)，569)称，MVA在哺乳动物和人类细胞系中并未彻底减毒，因为在这些细胞中可能有残余的复制。据假定这些报道是用MVA的不同毒株获得的结果，因为所用的病毒在它们的特性、尤其它们在各种细胞系中的生长行为方面有本质上的差异。
生长行为被认为是病毒减毒的指标。一般情况下，如果一种病毒株失去了它在宿主细胞中通过复制繁殖后代的能力或者这种能力减弱，则认为该病毒株是减毒株。上述关于MVA在人和哺乳动物细胞中并不是彻底失去复制竞争力的发现，导致对MVA作为用于人体的疫苗或作为重组疫苗的载体的绝对安全性提出疑问。
特别是，疫苗载体病毒的效力与安全性之间的平衡对于疫苗以及对于重组疫苗都是非常重要的。
发明目的
因此，本发明的一个目标是提供新的病毒株，它们的安全性增加，可用于开发安全的产品，如疫苗或药物。此外，本发明的另一目标是提供改进现有接种方案(vaccination regimen)的手段(means)。
发明详述
为了实现上述目标，本发明的一个优选实施方案中提供了新的痘苗病毒，它们能在非人的细胞和细胞系，尤其是鸡胚成纤维细胞(CEF)和幼年仓鼠肾细胞系BHK(ECACC 85011433)中进行繁殖性复制(productivereplication)，但不能在人的细胞系中进行繁殖性复制。
已知的痘苗病毒株至少能在某些人类细胞系中进行繁殖性复制，尤其是在人的角质细胞系HaCat_中(Boukamp等1988，J Cell Biol 106(3)：761-71)。能在HaCat细胞系中复制预示着能在体内，尤其是人体内复制。事实上，实施例章节已表明，所有经测试能在HaCat中有残量的繁殖性复制的已知痘苗病毒株也能在体内复制。因此，本发明优选涉及不能在人类细胞系HaCat中进行繁殖性复制的痘苗病毒。本发明最优选涉及不能在任何下述人类细胞系中进行繁殖性复制的痘苗病毒株：人类宫颈腺癌细胞系HeLa(ATCC CCL-2)，人胚肾细胞系293(ECACC 85120602)，人的骨肉瘤细胞系143B(ECACC 91112502)以及细胞系HaCat。
病毒的生长行为或扩增/复制通常表示为：感染细胞所产生的病毒量(输出量)与最初用于感染细胞的病毒量(输入量)的比例(“扩增比”)。输出量与输入量的比例为“1”表示，感染细胞产生的病毒量与最初用于感染细胞的病毒量相等的扩增状态。这种状态暗示：感染细胞容许病毒进行感染和繁殖。
扩增比小于1，即扩增水平降低至输入水平以下，表示缺乏繁殖性复制，并因此表示病毒已减毒。故，本发明人对鉴定并最终分离一种在多种人类细胞系，尤其人类细胞系143B，HeLa，293和HaCat中扩增比小于1的病毒株特别有兴趣。
术语“不能进行繁殖性复制”是指本发明的病毒在人类细胞系，如细胞系293(ECACC 85120602)、143B(ECACC 91112502)、HeLa(ATCC CCL2)和HaCat(Boukamp等1988，J Cell Biol 106(3)：761-71)中，在本发明实施例1针对某些具体的MVA病毒株所概述的条件下，扩增比小于1。优选地，本发明病毒在上述每一种人类细胞系HeLa，HaCat和143B中的扩增比为0.8更小。
实施例1和表1都详细显示了，本发明的病毒在细胞系143B，HeLa或HaCat中都不能进行繁殖性复制。本发明实施例中所用的具体病毒株已保藏在欧洲细胞培养物保藏中心，保藏号为V00083008。该病毒株在说明书全文中都被称为“MVA-BN”。
已知的MVA病毒株在所测试的至少一种人类细胞系中显示残量复制(图1，实施例1)。所有已知的痘苗病毒株在细胞系HaCat中显示至少部分复制，而本发明的MVA病毒株，尤其是MVA-BN，在HaCat细胞中不进行繁殖性复制。更具体地，MVA-BN在人胚肾细胞系293(ECACC 85120602)中显示0.05-0.2的扩增比。在人骨的骨肉瘤细胞系143B(ECACC 91112502)中，扩增比为0.0-0.6。在人的宫颈腺癌细胞系HeLa(ATCC CCL-2)和人的角质细胞系HaCat(Boukamp等1988，J Cell Biol-106(3)：761-71)中，扩增比分别为0.04-0.8和0.02-0.8。MVA-BN在非洲绿猴肾细胞(CV1：ATCCCCL-70)中的扩增比为0.01-0.06。因此，MVA-BN作为本发明的原养型病毒株，在所检测的任一种人类细胞系中都不进行繁殖性复制。
MVA-BN在鸡胚成纤维细胞(CEF：原代培养物)或幼年仓鼠肾细胞系BHK(ATCC CRL-1632)中的扩增比都明显高于1。如以上概述，扩增比高于“1”表示繁殖性复制，因为感染细胞所产生的病毒量比用于感染细胞的病毒量增加了。因此，该病毒能在CEF原代培养物中以高于500的比例或在BHK细胞中以高于50的比例进行繁殖和扩增。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明涉及保藏号为ECACCV0083008的病毒的衍生物。保藏号为ECACC V0083008的病毒的“衍生物”是指，与保藏株显示基本相同的复制特性但在其基因组中有一或多个部分不同的病毒。与保藏的病毒具有相同“复制特性”的病毒是，在CEF细胞和细胞系BHK，HeLa，HaCat以及143B中以相似的扩增比进行复制、并且在转基因小鼠模型AGR129中经测定具有相似的体内复制的那些病毒(见下文)。
在一个优选实施方案中，本发明的痘苗病毒株，尤其是MVA-BN及其衍生物，它们都以不能在体内进行复制为特征。在本发明上下文中，“不能在体内进行复制”是指，病毒不能在人类以及在小鼠模型中进行复制，解释见下文。“不能在体内进行复制”的特性优选可在不能产生成熟B细胞和T细胞的小鼠中进行测定。这样的小鼠如转基因小鼠模型AGR129(得自Mark Sutter，Institute of Virology，University of Zurich，Zurich，Switzerland)。该小鼠品种在IFN受体I型(IFN-α/β)和II型(IFN-γ)的基因中以及在RAG中都有定位基因破坏。由于这些破坏，该小鼠不具有IFN系统，且不能产生成熟的B细胞和T细胞，因此其免疫系统严重受损，对复制型病毒高度易感。除了AGR129小鼠以外，其它任何不能产生成熟B细胞和T细胞等细胞、并因此免疫力严重受损、对复制型病毒高度易感的小鼠品种都可以使用。具体地，本发明的病毒在对AGR129小鼠腹膜内注射107pfu个病毒进行感染后，至少45天内不杀死小鼠，优选至少60天内，最优选至少90天内。优选地，“不能在体内进行复制”的病毒的另一特征是，在对AGR129小鼠腹膜内注射107pfu个病毒进行感染后，至少45天不能从该小鼠的器官或组织中收获到任何病毒，优选至少60天，最优选至少90天。关于用AGR129小鼠进行感染试验的细节以及用于测定病毒能否从感染小鼠的器官和组织中回收的试验的细节可参见实施例章节。
在一个优选的实施方案中，本发明的痘苗病毒株，尤其MVA-BN及其衍生物，它们的特征在于：在致死攻击小鼠模型中测得，致免疫性高于已知病毒株MVA 575。该实验的详述见下文实施例2。简言之，在这样的模型中，未接种的小鼠被具有复制竞争力的痘苗病毒株如Westem Reserve株L929 TK+或IHD-J感染后死亡。在描述致死攻击模型的上下文中，被具有复制竞争力的痘苗病毒感染，该过程称为“攻击”。受攻击4天后，小鼠通常被杀死，卵巢中的病毒滴度用VERO细胞经标准空斑试验进行测定(详见实施例章节)。对未接种的小鼠，以及接种了本发明的痘苗病毒的小鼠，测定它们的病毒滴度。更具体地，本发明病毒的特征是，在上述检验中，接种102TCID50/ml的本发明病毒比不接种病毒，小鼠卵巢病毒滴度减少至少70％，优选至少80％，更优选至少90％。
在一个优选实施方案中，本发明的痘苗病毒，尤其MVA-BN及其衍生物，可用于通过初次/加强给药疫苗的方式进行免疫接种。已有很多报道提示：用MVA作为运送载体进行初次/加强免疫，诱导出的免疫应答很弱，效果不及用DNA进行初次免疫、再用MVA加强免疫所得的效果(Schneider等，1998，Nat.Med.4；397-402)。在所有这些研究中，所用的MVA病毒株都不同于本发明的痘苗病毒。为了解释用MVA进行初次和加强免疫时免疫应答弱的原因，有假设认为，初次免疫期间产生的抗MVA抗体在再次免疫时对给与的MVA有中和作用，从而阻止了对免疫应答的有效加强。相反，用DNA进行初次免疫、再用MVA进行加强免疫(DNA-初次/MVA-加强)的方案，据报道在产生强效应答方面占优势，因为该方案将DNA有效引发免疫应答的能力与MVA在事先不具有针对MVA的免疫力的情况下加强上述应答的特性结合起来。显然，如果事先存在对MVA的免疫力和/或痘苗病毒阻碍对免疫应答的加强作用，那么使用MVA作为疫苗或治疗药物，其效力有限，尤其是在已接受了预防天花(smallpox)的免疫接种的个体内更是如此。但是，根据另一实施方案，本发明的痘苗病毒，尤其MVA-BN及其衍生物，以及携有异源序列的相应重组病毒，可用于在未曾感染的动物体内，以及在事先对痘病毒具有免疫力的动物体内，进行有效地初次免疫并然后增强免疫应答。故，本发明的痘苗病毒在痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加强免疫的方案中，与在DNA-初次免疫/痘苗病毒加强免疫的方案中相比，诱导出至少基本相同的水平的免疫力。
将痘苗病毒视为在痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加强免疫的方案中，与在DNA-初次免疫/痘苗病毒加强免疫的方案相比，诱导出至少基本相同的水平的免疫力，作出这一判定的条件可以是：通过以下一种(优选全部两种)试验(“试验1”和“试验2”)中测定，CTL应答在痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加强免疫的方案中与在DNA-初次免疫/痘苗病毒加强免疫方案中相比，为至少基本相同。更优选，在至少一种上述试验中，痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加强免疫后的CTL应答比DNA-初次免疫/痘苗病毒加强免疫后的高。最优选，在以下两种试验中，痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加强免疫后的CTL应答比DNA-初次免疫/痘苗病毒加强免疫后的高。
试验1：为了实施痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加强免疫的方案，对6-8周龄BALB/c(H-2d)小鼠静脉给予107TCID50的本发明痘苗病毒进行初次免疫，3周后，用相同的病毒、以相同的量和相同的给予方式进行加强免疫，所述病毒能表达鼠的多表位(polytope)，如Thomson等，1988，J.Immunol.160，1717所述。为达到此目的，必须构建一种表达所述多表位的重组痘苗病毒。构建这样的重组病毒的方法为本领域已知，下文有详述。在DNA初次免疫/痘苗病毒加强免疫的方案中，初次免疫是对小鼠肌肉内注射50μg能表达与痘苗病毒相同的抗原的DNA；用痘苗病毒加强免疫是以与痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加强免疫方案完全相同的方式进行。表达所述多表位的DNA质粒也在上述Thomson等的文献中有介绍。在上述两种方案中，于加强免疫的2周后，测定针对表位SYIPSAEKI，RPQASGVYM和/或YPHFMPTNL的CTL应答。对CTL应答的测定优选用Schneider等，1998，Nat.Med.4，397-402所述的ELISPOT分析进行，该方法在下文关于一种具体的本发明病毒的实施例章节也有描述。本发明病毒在该实验中的特征是，根据对IFN-γ生成细胞的数量/106脾细胞的评估(也参见实验章节)，上述由痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加强免疫方案诱导的针对所述表位的CTL免疫应答，与由DNA初次免疫/痘苗病毒加强免疫方案诱导的基本相同，优选至少相同。
试验2：该试验基本对应于试验1。但相对于试验1中静脉给予107TCID50的痘苗病毒，在本试验中是皮下给予108TCID50的本发明痘苗病毒来进行初次免疫和加强免疫。本发明的病毒在该实验中的特征是，根据对IFN-γ生成细胞的数量/106脾细胞的评估(也参见实验章节)，上述由痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加强免疫方案诱导的针对所述表位的CTL免疫应答，与由DNA初次免疫/痘苗病毒加强免疫方案诱导的基本相同，优选至少相同。
根据上述试验之一测出的CTL应答的强度对应于保护作用的水平。
因此，本发明的病毒特别适于进行疫苗接种。
简短说，本发明的痘苗病毒的特征在于具有至少一种下列特性：
(i)能在鸡胚成纤维细胞(CEF)以及在细胞系BHK中进行繁殖性复制，但不能在人类细胞系HaCat中进行繁殖性复制，
(ii)不能在体内复制，
(iii)在致死攻击模型中比已知病毒株MVA 575(ECACC V00120707)诱导出更高的致免疫性，和/或
(iv)在痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加强免疫的方案中，与在DNA-初次免疫/痘苗病毒加强免疫的方案中相比，诱导出至少基本相同的水平的免疫力。
优选本发明的痘苗病毒具有至少两种上述特性，更优选至少三种上述特性。最优选具有上述所有特性的痘苗病毒。
在另一实施方案中，本发明涉及用于免疫接种的试剂盒，它在第一个小瓶/容器中包含用于第一次接种(初次免疫)的本发明病毒，在第二个小瓶/容器中包含用于第二次接种(加强免疫)的本发明病毒。所述病毒可以为非重组病毒，即不包含异源核苷酸序列的痘苗病毒。这种痘苗病毒的一个实例是MVA-BN及其衍生物。或者，所述病毒可以是重组痘苗病毒，它包含额外的异源核苷酸序列。如说明书其它章节所述，这样的异源序列可以编码能诱导免疫系统发生应答的表位。因此，有可能应用这种重组痘苗病毒进行免疫接种，从而对抗包含所述表位的蛋白或制剂。所述病毒可以按照下文的详述来配制。每次接种所用病毒的量已在上文中限定。
本领域技术人员已知如何获得具有至少一种下列特性的痘苗病毒：
-能在鸡胚成纤维细胞(CEF)以及在幼年仓鼠肾细胞系BHK中进行繁殖性复制，但不能在人角质细胞系HaCat中进行繁殖性复制，
-不能在体内复制，
-在致死攻击模型中比已知病毒株MVA 575诱导出更高的致免疫性，和/或
-在痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加强免疫的方案中，与在DNA-初次免疫/痘苗病毒加强免疫的方案中相比，诱导出至少基本相同的水平的免疫力。
获得这类病毒的方法可包括以下步骤：
(i)将已知的痘苗病毒株，优选MVA 574或MVA 575(ECACCV00120707)，引入能容许该病毒进行繁殖性复制的非人类细胞中，所述非人类细胞优选选自CEF细胞或BHK细胞系，
(ii)从这些细胞分离/富集病毒颗粒，和
(iii)分析所得的病毒是否具有至少一种所需的上述生物学特性，
其中上述步骤可任选地进行重复，直至获得具有所需复制特性的病毒。本发明还涉及通过本发明的这种方法获得的病毒。确定所需生物学特性的方法在本说明书的其它部分予以解释。
本发明人应用这种方法，通过多轮克隆纯化，从MVA分离物的传代物575(MVA 575)鉴定并分离了本发明的病毒株。这种新的病毒株对应于上述保藏号为ECACC V0083008的病毒株。
本发明痘苗病毒的生长行为，尤其是MVA-BN的生长行为，表明本发明的病毒株相对于迄今为止鉴定的任何其它MVA分离物，在人类细胞系中的减毒性和体内复制能力的丧失方面，具有很大的优势。本发明的病毒株因此是开发更安全的产品(如疫苗或药物)的理想候选者，参见下文。
在一个实施方案中，本发明的病毒，特别是MVA-BN及其衍生物，被作为疫苗，用于对抗人类痘病毒疾病，如天花。在另一实施方案中，本发明的病毒可以是重组病毒，即可以将异源基因表达为，例如，异源于该病毒的抗原或表位，并因此可作为疫苗，用于诱导针对异源抗原或表位的免疫应答。
术语“免疫应答”是指外来物质或微生物进入生物体时免疫系统的反应。根据定义，免疫应答可分为特异性反应和非特异性反应，这两者密切交错。非特异性免疫应答是针对广泛多种外来物质和感染因子的应急防御。特异性免疫应答是在生物体受到一种物质的第一次攻击之后，经过较长的一段时间后产生的防御反应。特异性免疫应答是高效的，而且负责使从一种具体感染中恢复的个体获得对抗这种具体感染的保护作用。当相同或非常相似的感染因子再次感染时，由于已经具有了针对该因子的“事先存在的免疫力”，因此仅引起温和得多的症状，或者根本不出现症状。这样的免疫力和免疫记忆将分别持续较长时间，在某些情况中，将持续终生。因此，对免疫记忆的诱导可以用于预防接种。
术语“免疫系统”是指参与生物体对抗外来物质和微生物的防御反应的一组器官。免疫系统包括细胞部分和体液部分，其中细胞部分包括多种细胞，如淋巴细胞和其它衍生自白细胞的细胞；体液部分包括小分子肽和补体因子。
“接种”是指用感染因子(如减毒或灭活的感染因子)攻击生物体，从而诱导出特性免疫力。本发明中，该术语还包括用本发明重组痘苗病毒，尤其是重组的MVA-BN及其衍生物攻击生物体，所述重组病毒表达异源于该病毒的抗原或表位。这类表位的实例可参见说明书其它章节，例如有来自诸如登革热病毒、丙型肝炎病毒、HIV等其它病毒的蛋白的表位，或来自与肿瘤和癌症进展相关的蛋白的表位。将重组痘苗病毒给药至机体内以后，所述表位被表达并被呈递给免疫系统，从而可能诱导出针对这些表位的特异性免疫应答。生物体因此针对含有由重组痘苗病毒编码的表位的因子/蛋白而被免疫。
“免疫力”是指，由于成功消除了感染因子或其特征性部分所致的在先感染，而使生物体获得对抗该感染因子所致疾病的部分或完全保护作用。免疫力的基础在于免疫系统的特化细胞的存在、诱导和活化。
正如上文一个本发明实施方案中提到，本发明的重组病毒，尤其重组MVA-BN及其衍生物，包括至少一种异源核酸序列。本文中术语“异源”是指，在天然状态下，通常并非与所述病毒密切相关的核酸序列的任意组合，而这样的病毒也称为“重组病毒”。
根据本发明另一实施方案，异源序列优选抗原性表位，所述表位选自任何非痘苗病毒来源。最优选，重组病毒表达一或多种来自下列来源的抗原性表位：Plasmodium falciparum，分支杆菌，流感病毒，选自黄病毒科、副粘病毒属、肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒的病毒，或者引起出血性发热的病毒如汉坦病毒(Hantaviruses)或丝状病毒(Filoviruses)，即埃博拉病毒(Ebola)或马堡(Marburg)病毒。
根据另一实施方案，以及除了上述对抗原性表位的选择以外，异源序列可选自另一种痘病毒或痘苗病毒来源。这些病毒序列可用于修饰宿主适应谱或病毒的致免疫性。
在另一实施方案中，本发明的病毒可编码能表达治疗性化合物的异源基因/核酸。病毒中异源核酸所编码的“治疗性化合物”可以是，例如，治疗性核酸，如反义核酸，或具有所需生物活性的肽或蛋白。
根据另一优选的实施方案，异源核酸序列的表达优选在痘病毒启动子的转录控制之下，更优选受控于痘苗病毒启动子，但不排除其它情况。
根据另一实施方案，异源核酸序列优选插入病毒基因组的非必需区域。在本发明另一优选实施方案中，将异源核酸序列插入MVA基因组的天然缺失位点(见PCT/EP96/02926)。将异源序列插入痘病毒基因组的方法为本领域已知。
根据另一优选实施方案，本发明还包括病毒基因组，其重组体或其功能性部分。所述病毒序列可用于通过，例如PCR、杂交技术、或成熟的ELISA试验，来鉴定或分离病毒或其重组体。此外，所述病毒序列可以由表达载体来表达，以便产生编码蛋白或肽，它们然后可以对那些缺乏包含在所述表达载体中的病毒序列的病毒缺失突变体进行弥补。
病毒基因组的“功能性部分”是指完整基因组序列中编码物理实体(如蛋白，蛋白区，蛋白表位)的部分。病毒基因组的功能性部分还指完整基因组序列中，编码调节元件或它们的单独具有活性的部分(如启动子、增强子、顺式或反式作用元件)的部分。
本发明的重组病毒可用于将异源核酸序列引入靶细胞，所述序列对于靶细胞而言可以是同源的，也可以是异源的。通过将异源核酸序列引入靶细胞，可在体外产生异源的肽或多肽和/或由这些序列编码的完整病毒。该方法包括：用重组MVA感染宿主细胞，在适当的条件下培养已被感染的宿主细胞，分离和/或富集由所述宿主细胞产生的肽、蛋白和/或病毒。
此外，将同源或异源序列引入细胞的方法还可以应用于体外治疗，优选应用于体内治疗。进行体外治疗时，将已事先(回体)感染了病毒的分离的细胞给药至动物活体，以便诱导免疫应答。进行体内治疗时，将病毒或其重组体直接给药至动物活体以诱导免疫应答。在该情况中，接种部位周围的细胞在体内被本发明的病毒或其重组体直接感染。
由于本发明病毒在人类细胞和猴细胞中的生长受到严格限制，因此是高度减毒的，用于治疗包括人在内的广泛多种哺乳动物较为理想。因此，本发明还提供了用于，例如，在动物活体，包括人体内诱导免疫应答的药用组合物和疫苗。本发明的病毒在任何其它基因治疗方案中也是安全的。
药用组合物通常包括一或多种可药用和/或经核准的载体，添加剂，抗生素，防腐剂，辅助剂，稀释剂和/或稳定剂。这类辅助物质可以是水，盐水，甘油，乙醇，增湿剂或乳化剂，pH缓冲物质，等等。适当的载体通常是分子量较大、代谢较慢的分子，如蛋白、多糖、多聚乳酸，多聚乙醇酸，多聚氨基酸，氨基酸共聚物，脂质聚集物，等等。
为了制备疫苗，本发明的病毒或其重组体被转变为生理可接受的形式。这可以依据用于天花预防性接种的痘病毒疫苗的制备经验来进行(参见Stickl，H.等[1974]Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392)。例如，将纯化的病毒以5×108TCID50/ml的浓度配制在约10mM Tris，140mM NaCI pH7.4中，-80℃保存。为了制备疫苗注射剂(vaccine shot)，将102-108的病毒颗粒，在有2％蛋白胨和1％人白蛋白存在的情况下，冻干在安瓿(优选玻璃安瓿)内的100ml磷酸盐缓冲液(PBS)中。或者，可通过将病毒在配制剂中逐步冻干的方式来制备疫苗注射剂。这种配制剂可包含适于体内给药的额外添加剂，如甘露醇，葡聚糖，糖，甘氨酸，乳糖，或聚乙烯吡硌烷酮，或其它添加剂，如抗氧化剂或惰性气体，稳定剂或重组蛋白(如人血清白蛋白)。然后将玻璃安瓿密封，在介于4℃和室温之间的温度中保存数月。但是，只要不必使用，优选将安瓿保存在-20℃以下。
为了进行免疫接种或治疗，可将冻干品溶于0.1-0.5ml水溶液中，优选生理盐水或Tris缓冲液，经过系统途径或局部途径给药，即通过本领域技术人员已知的胃肠道外途径、肌肉途径或任何其它给药途径来给药。给药方式、给药剂量以及给药次数可由本领域技术人员通过已知的方式最优化。
此外，根据另一实施方案，本发明的病毒特别有效于在免疫受损的动物，如感染了SIV的猴(CD4＜400/μl血液)，或免疫受损的人体内诱导免疫应答。术语“免疫受损”描述的是个体免疫系统的一种状态，它仅有不完全的免疫应答或用于抵抗感染因子的防御效力减弱。更令人感兴趣的另一实施方案中，本发明的病毒可在免疫受损的动物或人体内增强免疫应答，甚至当这些动物或人具有事先存在的针对痘病毒的免疫力时也是如此。特别有趣的是，本发明的病毒还可以在接受抗病毒(如抗逆转录病毒)治疗的动物或人体内增强免疫应答。“抗病毒治疗”包括为了消除或抑制病毒感染而进行的治疗，例如(i)核苷类似物的应用，(ii)病毒酶活性或病毒装配过程的抑制剂的应用，或(iii)影响宿主免疫应答的细胞因子的应用。
根据另一实施方案，所述病毒尤其可应用于兽医领域，例如，用于免疫动物使之抵抗痘感染(pox infection)，但也不限于此。对小型动物而言，免疫接种优选通过胃肠道外方式或鼻内方式进行，而对大型动物或人而言，优选以皮下、肌肉内或口服方式进行接种。
本发明人发现，含有有效剂量仅为102TCID50(组织培养感染剂量)的本发明病毒的疫苗注射剂就足以在小鼠体内诱导出对抗野生型痘苗病毒攻击的完整免疫力。这特别令人惊讶，因为预计减毒程度如此之高的本发明病毒将不利于，并因此减弱其致免疫性。这样的预计是基于以下认识：为了诱导出免疫应答，必需有足够量的抗原性表位被呈递给免疫系统。已高度减毒并因此不能复制的病毒仅能呈现出极少量的抗原性表位，与它自身掺入的一样多。一般不认为病毒颗粒上携带的如此量的抗原足以诱导出有效的免疫应答。但本发明的病毒即使在仅为102TCID50的极低有效剂量之下，也能在小鼠/痘苗病毒攻击模型中刺激出有力的保护性免疫应答。本发明的病毒因此而显示出意外的、甚至相对于现有MVA病毒株而言增强的致免疫性。这种强致免疫性使本发明的病毒以及由它衍生出的任何疫苗都特别有效于在免疫受损的动物或人体内应用。
根据另一实施方案，本发明的病毒可作为佐剂来使用。在本说明书上下文中，“佐剂”是指疫苗中能增强特异性免疫应答的物质。“将病毒用作佐剂”是指在已有的疫苗中纳入病毒，以便使接受该疫苗的患者的免疫系统受到额外的刺激。大多数疫苗中抗原性表位的免疫效应常常能通过添加所谓佐剂而被增强。佐剂通过引起针对疫苗的抗原性表位的更强的特异性免疫反应而对免疫系统产生共刺激。这种刺激可通过非特异性免疫系统的因子，如干扰素和白细胞介素来调节。
因此，在本发明另一实施方案中，所述病毒在哺乳动物包括人体中用于激活、支持或抑制免疫系统，并优选激活对抗任何抗原决定簇的免疫应答。所述病毒还可用于在感染的危险增加的情况中，如在压力(stress)之下支持免疫系统。
用作佐剂的病毒可以为非-重组病毒，即在其基因组中不含异源DNA的那些病毒。这类病毒的一个实例是MVA-BN。另一种情况是，用作佐剂的病毒是在其基因组中包含天然状态下不存在于该病毒基因组的异源DNA序列的病毒。为了作为佐剂来使用，重组病毒DNA优选包含并表达那些能编码免疫刺激性肽或蛋白(如白细胞介素)的基因。
根据另一实施方案，优选所述病毒用作佐剂或添加至另一疫苗中时已被灭活。病毒的灭活可通过，例如，加热或用化学物质处理来进行，如本领域已知的那样。优选病毒被β-propriolacton灭活。根据本发明的这一实施方案，将灭活的病毒添加至对抗多种传染病或增生性疾病的疫苗中，从而增加患者针对该疾病的免疫应答。
发明简述
本发明单独或联合包含下列：
具有至少一种下列特性的痘苗病毒：
-能在鸡胚成纤维细胞(CEF)以及在幼年仓鼠肾细胞系BHK中进行繁殖性复制，但不能在人角质细胞系HaCat中进行繁殖性复制，
-不能在体内复制，
-在致死攻击模型中比已知病毒株MVA 575诱导出更高的致免疫性，和/或
-在痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加强免疫的方案中，与在DNA-初次免疫/痘苗病毒加强免疫的方案中相比，诱导出至少基本相同的水平的免疫力。
不能在以下任何一种人类细胞系中进行繁殖性复制的上述病毒：人类胚肾细胞系293，人类骨肉瘤细胞系143B和人类宫颈腺癌细胞系HeLa。
在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，Salisbury(UK)以保藏号V00083008进行保藏的上述病毒及其衍生物。
含有至少一种异源核酸序列的上述病毒。
上述病毒，其中所述异源核酸序列选自编码至少一种抗原、抗原性表位、和/或治疗性化合物的序列。
衍生自上述病毒的基因组或其功能性部分。
药用组合物，含有上述病毒和/或上述基因组和/或其功能性部分以及一种可药用载体、稀释剂和/或添加剂。
疫苗，含有上述病毒和/或上述基因组和/或其功能性部分。
上述病毒，上述基因组和/或其功能性部分，上述组合物或上述疫苗作为在活体动物(包括人体)中影响(优选诱导)免疫应答的药物。
上述病毒，上述药用组合物，上述疫苗或上述限定的病毒，其中所述病毒，组合物或疫苗在第一次接种(初次接种)和在第二次接种(加强接种)中以治疗有效量给予。
上述病毒，和/或上述基因组，在制备药物或疫苗中的用途。
将同源和/或异源核酸序列导入靶细胞的方法，包括用上述含异源序列的病毒感染靶细胞，或用上述基因组转染靶细胞。
制备肽、蛋白和/或病毒的方法，包括
-用上述病毒感染宿主细胞，
-在适当条件下培养已感染的宿主细胞，和
-分离和/或富集由所述宿主细胞产生的肽和/或蛋白和/或病毒。
在动物(包括人)活体内影响(优选诱导)免疫应答的方法，包括对需要治疗的动物或人给药上述病毒，上述基因组和/或其功能性部分，上述组合物或上述疫苗。
上述方法，包括给药至少102 TCID50(组织培养感染剂量)的病毒。
上述方法，其中所述病毒，组合物或疫苗在第一次接种(初次接种)和第二次接种(加强接种)中以治疗有效量给药。
上述方法，其中所述动物为免疫受损的动物。
上述方法，其中所述动物事先已具有对痘病毒的免疫力。
上述方法，其中所述动物正接受抗病毒治疗。
上述的动物正接受抗病毒治疗的方法，其特征在于所述抗病毒治疗是抗逆转录病毒治疗。
上述病毒，上述基因组和/或其功能性病毒作为佐剂的用途。
增强对抗疫苗中所含抗原和/或抗原性表位的特异性免疫应答的方法，包括对将要用所述疫苗进行治疗的活体动物，包括人，给药上述病毒或上述基因组作为佐剂。
上述病毒或上述基因组，它们作为佐剂使用。
一种细胞，优选人的细胞，它含有上述病毒，或含有上述基因组或其功能性部分。
获得上述痘苗病毒的方法，包括以下步骤：
-将一种市售痘苗病毒株，优选MVA 575引入能允许该病毒在其中进行繁殖性复制的那些非人类细胞中，其中所述非人类细胞优选选自CEF细胞和BHK细胞系，
-从这些细胞分离/富集病毒粒子，和
-分析所得病毒是否具有上述生物学特性的至少一种，
其中可任选重复上述步骤，直至获得具有所需复制特性的病毒。
用于初次/加强免疫接种的试剂盒，它在第一个小瓶/容器中包含用于第一次接种(初次接种)的上述病毒，上述疫苗，或上述作为药物的病毒，在第二个小瓶/容器中包含用于第二次接种(加强接种)的上述病毒，上述疫苗，或上述作为药物的病毒。
上述病毒，上述组合物和/或上述疫苗用于制备疫苗的用途，其中所述病毒，组合物或疫苗在初次接种中给药，相同的病毒或疫苗在加强接种中给药。
附图说明
图1：不同的MVA株在不同细胞系中的生长动力学。图1A)的结果是根据所测试的MVA株来分组，而图1B)的结果是根据所测试的细胞系来分组。B)在细胞系中培养4天(D4)后收获的病毒的量通过空斑试验测定，并将其表示为4天后收获的病毒相对于第1天(D1)原始接种量的比例。
图2：用MVA-BN或MVA 575进行接种所提供的对抗痘苗病毒致死攻击的保护作用。所述保护作用是通过标准空斑试验测定的攻击后第4天卵巢中滴度的减少。
图3：应用不同的初次免疫-加强免疫方案，对CTL的诱导效应以及所提供的对抗流感病毒攻击的保护作用。
3A：用编码鼠的多表位的DNA或MVA-BN疫苗以不同联合进行接种后，针对4种不同H-2d限制性表位的CTL应答的诱导。BALB/c小鼠(每组5只)用DNA(肌肉内)或MVA-BN(皮下)接种，并在三周后接受加强免疫。在加强免疫的2周后，用ELISPOT试验测定针对由这些疫苗(TYQRTRALV，流感病毒；SYIPSAEKI，P.Berghei；YPHFMPTNL，巨细胞病毒；RPQASGVYM，LCV)编码的4种不同表位的CTL应答。
3B：用编码鼠的多表位的DNA或MVA-BN疫苗以不同联合进行接种后，针对4种不同表位的CTL应答的诱导。BALB/c小鼠(每组5只)用DNA(肌肉内)或MVA-BN(静脉内)接种，并在三周后接受加强免疫。在加强免疫的2周后，用ELISPOT试验测定针对由这些疫苗(TYQRTRALV，流感病毒；SYIPSAEKI，P.Berghei；YPHFMPTNL，巨细胞病毒；RPQASGVYM，LCV)编码的4种不同表位的CTL应答。
3C：用相同的最佳剂量(1×108TCID50)的重组MVA-BN通过皮下途径进行初次和加强免疫后，肽特异性T细胞和MVA特异性T细胞的频率。每组8只小鼠用如图所示两种针剂的不同组合进行接种。末次接种的2周后，用IFN-γ ELISPOT试验测定肽特异性脾细胞的数量。柱形代表具体点的均数±均值标准差。
图4：接种MVA-BN nef或MVABN的猴子体内的SIV载量。
图5：免疫接种的猴子在用SIV进行感染后的存活。
图6：针对MVA-BN的猴血清抗体滴度。每一动物的抗体滴度用不同形状表示，实心矩形表示平均滴度。
图7：免疫受损(CD4＜400ml血液)的猴子在用编码tat的MVA-BN接种后的SIV水平。猴子已事先接受三次MVA-BN或MVA-BN nef接种(第0，8，16周)，并且已经用SIV的致病性分离物感染(第22周)。在第100，102和106周(箭头所示)，这些猴子接种了MVA-BN tat。
图8：接受抗逆转录病毒治疗并用MVA-BN进行了治疗性免疫接种的猴子体内的SIV水平。三组猴子(n＝6)用SIV感染，并每天用PMPA进行治疗(黑线所示)。在第10和16周，给这些动物接种重组MVA混合物或盐水(箭头所示)。
图9：感染并用重组MVA接种后针对SIV的体液应答。三组(n＝6)猴子用SIV致病性分离物感染(第0周)，然后进行抗逆转录病毒治疗(PMPA，黑线所示)。在第10和16周，给这些猴子接种重组MVA混合物或盐水。抗SIV抗体用感染的T细胞的裂解物作为抗原在标准ELISA试验中进行测定。
图10：正在接受抗逆转录病毒治疗的、感染了SIV的猴子中针对MVA的体液应答。三组(n＝6)猴子用SIV致病性分离物感染(第0周)，然后进行抗逆转录病毒治疗(PMPA，黑线所示)。在第10和16周，给这些猴子接种重组MVA混合物或盐水。抗MVA抗体用标准的MVA捕获性ELISA试验测定。
图11：小鼠用不同的天花疫苗接种后对MVA抗体的诱导。接种MVA-BN(第0和4周)后MVA抗体的水平，与接种常规痘苗病毒株后的水平进行比较，所述常规病毒株为：经由尾部划破(tail scarification)方式接种的Elstree和Wyeth(第0周)、MVA 572(第0和4周)、按照前-Elstree疫苗形式接种的MVA-BN和MVA 572。MVA 572已保藏在欧洲细胞培养物保藏中心，保藏号为ECACC V94012707。病毒滴度用捕获性ELISA测定，利用曲线图的线性部分进行线性回归，并定义为产生最佳密度0.3的稀释度。*MVA-BN：MVA-BN显著(p＞0.05)区别于MVA 572：MVA 572。
实施例
以下实施例将进一步举例说明本发明。本领域技术人员应理解，所提供的实施例无意限制本发明技术的应用。
实施例1
在选定的细胞系中新的MVA病毒株的生长动力学和体内复制
(i)细胞系中的生长动力学：
为了鉴定本发明新分离的病毒株(以下称为MVA-BN)，将这一新病毒株的生长动力学与其它已知MVA病毒株的进行比较。
比较以下病毒在后文所列的原代细胞以及细胞系中的生长动力学：
MVA-BN(病毒原种，#23，18.02.99粗制品，滴度2.0×107TCID50/ml)；
由Altenburger(美国专利5,185,146)鉴定、后来被称为MVA-HLR的MVA；
由Anton Mayr(Mayr，A.等[1975]Infection 3；6-14)鉴定、后来被称为MVA 575(ECACC V00120707)的MVA(第575代)；和
MVA-Vero，参见PCT/EP01/02703(WO 01/68820)(病毒原种，第49代，#20，22.03.99粗制品，滴度4.2×107TCID50/ml)。
所用的原代细胞和细胞系是：
CEF     鸡胚成纤维细胞(从SPF卵新鲜制备)；
HeLa   人类宫颈腺癌(上皮)，ATCC CCL-2；
143B    人类骨肉瘤TK-，ECACC 91112502；
HaCaT   人角质细胞系，Boukamp等1988，J Cell Biol 106(3)：
         761-771；
BHK     幼年仓鼠肾，ECACC 85011433；
Vero    非洲绿猴肾成纤维细胞，ECACC 85020299；
CV1     非洲绿猴肾成纤维细胞，ECACC 87032605。
为了进行感染，将不同的细胞以5×105细胞/孔的浓度接种在6孔板中添加了2％FCS的DMEM(Gibco，目录号61965-026)中，在5％CO2中37℃保温过夜。除去细胞培养基，细胞被大约moi 0.05的病毒在37℃，5％CO2中感染1小时(对于感染而言，推测细胞数在过夜后加倍)。对不同细胞类型进行每次感染所用的病毒量为5×104 TCID50，将它称为输入量(Input)。细胞然后用DMEM洗3次，最后添加1ml DMEM，2％FCS，将平板在37℃，5％CO2中保温96小时(4天)。通过将平板冻存在-80℃而终止感染，以备滴定分析。
滴定分析(用痘苗病毒特异性抗体进行免疫)
为了对病毒量进行滴定，将测试细胞(CEF)以1×104细胞/孔的浓度，接种在含有RPMI(Gibco，目录号61870-010)，7％FCS，1％抗生素/抗真菌素(Gibco，目录号15240-062)的96孔板上，在5％CO2中37℃保温过夜。将感染实验的6孔板冻融3次，用RPMI生长培养基制备10-1-10-12的稀释液。将病毒稀释液分配至测试细胞上，在5％CO2中37℃保温5天，使得产生CPE(致细胞病变效应)。将测试细胞固定(丙酮/甲醇1∶1)10min，用PBS洗涤，与在保温缓冲液中1∶1000稀释的痘苗病毒特异性多克隆抗体(QuartettBerlin，目录号9503-2057)室温(RT)保温1小时。用PBS(Gibco，目录号20012-019)洗涤两次，加入已在保温缓冲液(PBS，含3％FCS)中1∶1000稀释的HPR-偶联型抗-兔抗体(Promega Mannheim，目录号W4011)室温保温1小时。将细胞再用PBS洗2次，与染色液(10ml PBS+200μl邻联茴香胺在100％乙醇中的饱和溶液+15μl新鲜配制的H2O2)一起保温，直至可见到棕色斑点(2小时)。去掉染色液，加PBS以终止染色反应。将每个显示棕色斑点的孔标记为CPE阳性孔，用Kaerber的公式计算滴度(基于TCID50的试验)(Kaerber，G.1931.Arch.Exp.Pathol.Pharmakol.162，480)。
用所述病毒以低感染复数(即每个细胞接受0.05的感染复数(5×104TCID50))感染两个平行组，其中一组为CEF和BHK，预计它们能容许MVA；另一组为CV-1，Vero，Hela，143B和HaCat，预计它们不能容许MVA。然后，去掉病毒接种物，将细胞洗3次以除去任何残余的未被吸附的病毒。使感染持续4天，从中制备病毒提取物，然后在CEF细胞上滴定。表1和图1显示了滴定分析的结果，其中的值为感染4天后产生的病毒总量。
据显示，所有病毒如预计的那样在CEF细胞(鸡胚成纤维细胞)中良好扩增，因为这是所有MVA的容许细胞系。此外还显示，所有病毒在BHK(仓鼠肾细胞系)中有良好扩增。MVA-Vero的表现最佳，因为BHK是一种容许细胞系。
在Vero细胞(猴肾细胞系)中的复制情况是，MVA-Vero如预计的那样有良好的扩增，即比输入量高1000倍。MVA-HLR和MVA-575也都有良好扩增，分别比输入量高33倍和10倍。只有MVA-BN在这些细胞中不能向其它病毒一样进行良好扩增，它仅比输入量高2倍。
在CV1细胞(猴肾细胞系)中的复制情况是，MVA-BN在该细胞系中高度减毒。其病毒量比输入量低200倍。MVA-575也未能超出输入水平，其略显负扩增，即比输入量低16倍。MVA-HLR的扩增情况最佳，它比输入量高30倍；其次是MVA-Vero，比输入量高5倍。
最感兴趣的是比较这些病毒在人类细胞系中的生长动力学。就143B细胞(人类骨癌细胞系)中的繁殖性复制而言，只有MVA-Vero显示了超出输入量的扩增(超出3倍)。所有其它病毒的扩增未超过输入水平，但MVA-HLR与MVA-BN，以及与MVA575之间有较大差距。MVA-HLR为“边界水平”(比输入量低1倍)，MVA-BN的减毒程度最大(比输入量低300倍)，其次是MVA-575(比输入量低59倍)。总的看来，MVA-BN在人类143B细胞中的减毒程度最高。
在HeLa细胞(人类宫颈癌细胞)中的复制情况显示，MVA-HLR在该细胞系中扩增良好，甚至比它在容许性BHK细胞中的情况还要好(Hela＝比输入量高125倍；BHK＝比输入量高88倍)，MVA-Vero也可以在该细胞系中扩增(比输入量高27倍)。但MVA-BN在这些细胞系中减毒，MVA-575也是，但减毒程度稍小(MVA-BN＝比输入量低29倍，MVA-575＝比输入量低6倍)。
在HaCat细胞(人类角质细胞系)中的复制情况表明，MVA-HLR在该细胞系中扩增良好(比输入量高55倍)。MVA-Vero能适应这种细胞系，MVA-575能在这种细胞系中扩增(分别比输入量高1.2倍和1.1倍)。只有MVA-BN被证实减毒(比输入量低5倍)。
结论是，MVA-BN是这一组病毒中减毒程度最高的病毒株：MVA-BN在人类胚肾细胞(293：ECACC 85120602)中扩增比为0.05-0.2(数据未包括在表1中)，它在143B细胞中的扩增比约为0；在HeLa细胞中约为0.04；在HaCat细胞中约为0.22，以上都表明，它在人类细胞系中极度减毒。此外，MVA-BN在CV1细胞中的扩增比约为0.0。只有在Vero细胞中能观察到扩增(扩增比为2.33)，但仍不及其在容许性细胞系如BHK和CEF中的水平(见表1)。故MVA-BN是唯一在人类细胞系143B，Hela，HaCat和293中都显示出小于1的扩增比的已知MVA病毒株。
MVA-575的表现类似于MVA BN，但减毒程度不及MVA-BN。
MVA-HLR在参与测试的所有细胞系中都有良好扩增(在143B细胞中除外)，因此可将它视为在除了143B细胞以外的所有细胞系中都具有复制竞争力。有1例显示其在人类细胞系(HeLa)中的扩增甚至优于其在容许细胞系(BHK)中的扩增。
MVA-Vero在所有细胞系中都显示扩增，但程度不及MVA-HLR(除了在143B中的情况以外)。但考虑减毒水平，还不能将其视为与MVA-BN或MVA-575相同的“一类”。
2.体内复制
鉴于某些MVA病毒株可在体外复制，用转基因小鼠模型AGR129检查了不同的MVA株体内复制的能力。这种小鼠中，IFN受体I型(IFN-α/β)和II型(IFN-γ)的基因以及RAG中有毁坏。由于这些毁坏，该小鼠不具有IFN系统，不能产生成熟的B细胞和T细胞，因此免疫力严重受损，对复制型病毒高度易感。对6只一组的小鼠用107pfu的MVA-BN，MVA-HLR或MVA572(曾在德国应用于120,000人)进行免疫(i.p)，每日监控临床表征。所有接种了MVA HLR或MVA 572的小鼠分别在28天和60天内死亡。尸检表明，大多数器官中有严重病毒感染的常见表现，通过标准空斑试验从卵巢中回收到MVA(108pfu)。相反，接种了相同剂量的MVA-BN(对应于保藏株ECACC V00083008)的小鼠存活期为90天以上，并且不能从器官或组织中回收到MVA。
将体外研究和体内研究的数据综合，可明显看出，MVA-BN比其亲本株或MVA-HLR商业株的减毒程度更高。
实施例2
体内免疫学数据
以下实验用于比较MVA-BN与其它MVA相比的不同剂量和接种方案。
2.1.不同的MVA株刺激免疫应答的能力不同
具有复制竞争力的痘苗病毒株在小鼠中诱导较强的免疫应答，高剂量时是致死的。尽管MVA已高度减毒，并且在哺乳动物细胞中的复制能力减弱，但在不同MVA株之间减毒程度有不同。事实上，MVABN看上去比其它MVA株，甚至比亲本株MVA 575减毒程度更高。为确定减毒程度的这种差别是否影响MVA诱导保护性免疫应答的效力，在痘苗病毒致死攻击模型中比较了不同剂量的MVA BN和MVA 575。保护水平通过攻击后第4天测出的卵巢中痘苗病毒滴度的减少来确定，这样可以定量评估MVA的不同剂量和不同毒株。
致死攻击模型
不含具体病原体的6-8周龄雌性BALB/c(H-2d)小鼠(n＝5)用不同剂量(102，104或106 TCID50/ml)的MVA BN或MVA 575免疫(i.p.)。MVA-BN和MVA-575已在CEF细胞中繁殖，并已经过蔗糖纯化，用Tris pH7.4配制。3周后，以相同剂量的相同MVA株对小鼠进行加强免疫，2周后用具有复制竞争力的痘苗病毒株进行致死攻击(i.p.)。使用WR-L929 TK+或IHD-J病毒株作为具有复制竞争力的痘苗病毒(缩写为“rVV”)。对照小鼠接种安慰剂疫苗。保护作用通过标准空斑试验测定攻击后第4天在卵巢中的滴度减少来确定。为此，在攻击后第4天处死小鼠，取卵巢，在PBS(1ml)中匀浆，用VERO细胞进行标准空斑试验来测定病毒滴度(Thomson等，1998，J.Immunol.160：1717)。
两次接种了104或106 TCID50/ml的MVA-BN或MVA-575的小鼠受到完全保护，表现为攻击后第4天卵巢中的rVV滴度100％减少(图2)。参与攻击的病毒被清除。但在较低剂量水平，MVA-BN或MVA575的保护水平不同。两次接种102TCID50/ml的MVA575的小鼠未受到保护，表现为卵巢中rVV滴度很高(平均3.7×107pfu+/-2.11×107)。相反，接种相同剂量的MVA-BN的小鼠，其卵巢中的rVV滴度显著减少(96％)(平均0.21×107pfu+/-0.287×107)。接受安慰剂疫苗的对照小鼠的平均病毒滴度为5.11×107pfu(+/-3.59×107)(图2)。
两种MVA株都在小鼠体内诱导了对抗致死性rVV攻击的保护性免疫应答。虽然这两种MVA株在较高剂量都同等地有效，但在亚最佳剂量时，它们的效力有明显差别。MVA-BN在诱导对抗致死性rVV攻击的保护性免疫应答方面比其亲本株MVA-575更有效，这可能与MVA-BN比MVA-575减毒程度高有关。
2.2.MVA-BN在初次-加强接种方案中
2.2.1.：用不同的天花疫苗接种小鼠后诱导抗MVA抗体
MVA-BN与其它MVA以及此前用于根治天花的痘苗病毒株进行了效力比较。这些包括，用产生于CEF细胞中的痘苗病毒株Elstree和Wyeth经由尾部划破方式进行单个免疫，和用原德国天花根治项目中使用的MVA572进行免疫。此外，将MVA-BN和MVA 572都作为前-疫苗，接着经由划破方式接种Elstree，然后比较。每组8只BALB/c小鼠，所有MVA接种(1×107TCID50)都是在第0和第3周皮下给予。加强免疫的2周后，对小鼠给予痘苗病毒(IHD-J)攻击，4天后测定卵巢中的滴度。所有疫苗和方案都诱导了100％的保护作用。
用这些不同疫苗或方案诱导的免疫应答在攻击前的动物体内予以检测。使用那些测量中和抗体的水平，T细胞的增殖，T细胞的细胞因子(IFN-γ和IL-4)产生和IFN-γ产生的试验。MVA-BN所诱导的T细胞应答水平用ELlspot测定，该水平大体上等效于其它MVA和经证实有生物等效性(bio-equivalence)的痘苗病毒。在不同的接种方案之后，每周分析抗MVA抗体的滴度，结果表明，用MVA-BN进行接种，比其它接着方案显著增加了抗体应答的速度和程度(图11)。事实上，用MVA-BN进行接种，在第2，4，和5周(在进行加强免疫的第4周的1周后)时，抗MVA抗体滴度显著高于用MVA 572进行接种的小鼠体内的水平(p＞0.05)。于第4周进行了加强免疫后，MVA BN组的抗体滴度也显著高于接受痘苗病毒株Elstree或Wyeth单一接种的小鼠体内的滴度。这些结果清楚表明，用MVA-BN进行两次接种，比用传统的痘苗病毒株(Elstree和Wyeth)进行经典的单一接种诱导了更高水平的抗体应答，还证实了第1.5节的发现：MVA-BN比其它MVA株的致免疫性更强。
2.2.2.：在流感病毒攻击模型中，MVA-初次和加强免疫方案产生了与DNA-初次MVA-加强免疫方案相同水平的保护作用
对MVA初次-加强免疫方案产生高亲合力CTL应答的效力进行评估，并与此前报道的DNA初次/MVA加强免疫方案的效力进行比较。两种方案用由DNA载体或MVA-BN编码的鼠的多表位构建体进行评估，对CTL的诱导水平用ELISPOT进行比较，就应答的亲合力而言，测试的是流感病毒攻击后所提供的保护程度。
构建体
编码鼠的多表位(10种CTL表位，包括流感病毒，卵清蛋白)的DNA质粒已有描述(Thomson等，1998，J.Immunol.160：1717)。将这种鼠的多表位插入MVA-BN的缺失位点II，所述MVA-BN是在CEF细胞上繁殖，经蔗糖纯化，并配制在Tris pH7.4中。
接种方案
在本项研究中使用不含具体病原体的6-8周龄雌性BALB/c(H-2d)小鼠。用每组5只小鼠进行ELISPOT分析，用每组6只小鼠进行流感病毒攻击实验。这些小鼠用编码鼠的多表位的MVA或DNA以不同的初次-加强免疫方案进行接种，详见结果部分。在用DNA进行接种的情况中，小鼠被麻醉，对其已麻醉的四头肌注射50μg无内毒素的质粒DNA(在50μl PBS中)一次。用MVA进行初次免疫时，是每只小鼠静脉给予107pfu MVA-BN或每只小鼠皮下给予107pfu或108pfu MVA-BN。初次免疫的3周后进行加强免疫。用质粒DNA进行加强免疫的方式与用DNA进行初次免疫的方式(见上述)一样。为了建立CTL应答，在末次加强免疫的2周后，用流感CTL表位肽(TYQRTRALV)，P.Berghei表位肽(SYIPSAEKI)，巨细胞病毒肽表位(YPHFMPTNL)和/或LCV肽表位(RPQASGVYM)在脾细胞上进行ELISPOT试验(Schneider等，1998，Nat.Med.4；397-402)。在攻击试验中，小鼠被麻醉，鼻内(i.n.)感染亚致死剂量的ressortant流感病毒Mem71(4.5×105pfu，在50ml PBS中)。在感染后第5天，取肺，在Madin-Darby犬肾细胞系中用标准流感病毒空斑试验测定双份病毒滴度。
结果：
在单独使用DNA疫苗的情况中，诱导的针对4种由鼠的多表位编码的H-2d表位的CTL较少，仅可检测到针对P.Berghei表位(SYIPSAEKI)和淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒表位(RPQASGVYM)的弱应答。相反，在DNA初次MVA加强免疫(107pfu MVA-BN，皮下给予)的方案中，诱导了显著更多的针对SLY的CTL(增加8-倍)和针对RPQ的CTL(增加3-倍)，还观察到针对第3种表位：鼠巨细胞病毒表位(YPHFMPTNL)的应答(图3A)。但是，在用107pfu MVA-BN皮下给予进行初次和加强免疫的方案中，诱导的应答水平与用DNA然后用MVA-BN免疫诱导的水平相同(图3A)。令人惊讶的是，当仅用MVA-BN(107 TCID50)免疫一次的情况中，诱导的针对三种表位的CTL在数量上没有显著差别，说明用MVA-BN进行第二次免疫并未显著增强CTL应答。
此前已显示，在用其它MVA株进行接种的情况中，皮下给予107pfuMVA是最没有效力的途径和病毒浓度，尤其是与静脉免疫相比(Schneider等1998)。为了确定最佳免疫方案，在改变病毒量或改变给药模式的情况下，重复进行上述实验。在一个实验中，静脉接种107pfu MVA-BN(图3B)。在另一实验中，皮下给予108pfu MVA-BN(图3C)。在这些实验中，MVA-BN初次-加强免疫与DNA初次MVA加强免疫方案相比，针对所有三种CTL表位诱导出较高的的平均CTL数。与皮下给予107pfu MVA-BN相比，静脉接种107pfu MVA-BN和皮下给予108pfu都显著增强了CTL应答，这清楚表明，在针对载体已有免疫力的情况下，MVA-BN可用于增强CTL应答。
2.2.3.：MVA-BN nef疫苗在SIV感染的猕猴中的效力
为测定MVA-BN nef疫苗的效力，在用有毒力的SIV原代分离物进行攻击后，评估病毒载量和疾病的延迟。该研究还测定了MVA-BN是否可用于在已对MVA具有免疫力的免疫受损型猴子体内安全地增强免疫应答。
接种方案
两组(n＝6)猕猴(Macaca mulalta)，在第0，8和16周时，通过肌肉内大丸剂注射的方式单独接种MVA-BN或接种重组MVA-BN nef。在第22周，所有猴子用来自未经培养的原代猕猴PBMC的50 MID50致病性细胞结合型SIV原种(1XC)通过静脉途径进行攻击。频繁监控动物的临床状态，定期取血样测定病毒血症，免疫参数，以及完整的血液学参数和血液临床化学参数。将出现AIDs样疾病的猴子处死，对幸存的猴子在接种后监控99周。在第100周时，幸存的猴子全部用MVA-BN tat免疫(i.m.)，并在第102周和第106周用相同的MVA-BN再次免疫。
用MVA-BN或MVA-BN nef接种后都未观察到副作用。用SIV感染猴子后，病毒血症水平陡然升高，在感染的2周后达到峰值(图4)。由于组内存在较大的标准差，MVA-BN nef接种组与MVA-BN接种组的平均SIV水平无显著差异。但在MVA-BN nef接种组中，SIV载量总体上比对照组(MVA-BN)低10倍。此外，感染的35周后(初步观察阶段)，6只接种了MVA-BN nef的猴子中，仅1只因病情严重不得不被实施安乐死，而6只对照猴子中有4只被实施安乐死(图5)。疾病的发生与较高的病毒载量明显相关，因此在感染后对动物再观察29周。MVA BN nef疫苗倾向于比对照组更延迟疾病的进展，甚至在感染后第46周时，6只MVA-BN nef动物有5只存活(图5)。但在感染后第59周时，nef接种组的另两只动物被处以安乐死，仅余5只动物存活(3只来自MVA-BN nef组，2只接种的是MVA-BN)。测定这12只猴子体内抗MVA-BN抗体的滴度，结果清楚表明，MVA-BN能增强免疫应答，即使在已具有对MVA的免疫力的情况下也是如此(图6)。用MVA-BN或MVA-BN nef进行初次免疫后，所有猴子产生了对抗MVA的抗体应答，平均滴度为1000。这种抗体应答在第二次免疫接种后得到显著增强，这清楚表明，MVA可用于健康猴子体内引发-增强免疫应答。这些抗体滴度逐渐下降，虽然在免疫后第49周时滴度达到平台期，但在第99周时抗MVA抗体的平均滴度为2000。
5只幸存的猴子被SIV感染并且免疫受损，表现为CD4计数低于400/μl血液。为调查在免疫受损猴子体内应用MVA-BN的影响，在初次接种后第100，102和106周时，对这5只动物用MVA-BNtat进行三次接种。第一次MVA-BN tat免疫在这些免疫受损的猴子体内显著增强了抗MVA的抗体应答，6周后，这些猴子接受第三次加强免疫(图6)。以上结果进一步证实，MVA-BN可以在已有针对MVA的显著免疫力的情况下增强免疫应答，甚至在免疫受损的猴子体内也是如此。尽管这些猴子的免疫应答在用MVA BNtat免疫以后得到加强，但SIV水平仍维持稳定，表明用MVA-BN进行免疫是安全的，不影响免疫受损猴子体内的SIV水平(图7)。
本研究证实，MVA-BN可以在免疫受损的猕猴体内引发-增强免疫应答，且MVA-BN免疫是安全的，不影响被SIV感染的动物体内病毒血症的水平。接种MVA-BN nef疫苗的动物体内AIDS样疾病进展的延迟，表明成功产生了针对nef的免疫应答。
2.2.4.：对正在接受抗逆转录病毒治疗的被SIV-感染的猴子进行治疗性接种
在正接受抗逆转录病毒治疗的个体体内应用基于MVA-BN的治疗性HIV疫苗。因此，本研究调查了编码多种SIV抗原(gag，pol，env，rev，tat，和nef)的重组MVA，在被SIV感染并用PMPA治疗的猴子体内的安全性(对SIV水平的影响)和效力。PMPA是一种核苷类似物，能有效对抗HIV和SIV(Rosenwirth，B.等，2000，J Virol 74，1704-11)。
构建体
所有重组MVA构建体都在CEF细胞上繁殖，经蔗糖纯化，并配制在Tris pH7.4中。
接种方案
三组(n＝6)猕猴(Macaca mulatta)用50MID50致病性原代SIV分离物(1XC)感染，然后每天用PMPA(60mg/kg，皮下给予)进行治疗，连续19周。在第10周，给动物接种重组MVA-BN(i.m.)或盐水，并在6周后进行相同的接种。第1组接受MVAgag-poi和MVA-env的混合物，第2组接受MVA-tat，MVA-rev和MVA-nef，第3组接受盐水。频繁监控动物的临床状态，定期取血样测定病毒血症，免疫参数，以及完整的血液学参数和血液临床化学参数。
所有动物都出现了较高的SIV载量，于感染后第2周达到峰值(图8)。通过每天用PMPA进行治疗，SIV水平下降，在第9周稳定至低水平。与以前的研究一样，在第10和16周接种MVA对SIV水平没有影响，说明MVA-BN是免疫受损动物的安全疫苗载体。这些动物一旦终止PMPA治疗(第21周)，SIV水平就升高。虽然第1组动物与第3组动物相比，SIV水平下降，但各组动物之间，在结束PMPA治疗后，平均SIV载量没有显著差异(图8)。对被SIV感染的T-细胞裂解物进行ELISA发现，各组动物在感染后第4周产生针对SIV的抗体应答(图9)。对照组(盐水)的SIV抗体滴度在PMPA治疗期间下降，当终止PMPA治疗后迅速上升，反映出抗逆转录病毒治疗期间SIV水平的下降和随后增加(图9)。在接受MVA-tat，MVA-rev和MVA-nef的第2组观察到SIV抗体滴度的类似模式，很可能反映了这些调节蛋白在ELISA试验所用的SIV感染型T细胞裂解物中较低水平的表达。但与此相反，第1组的抗-SIV抗体滴度在第10周接种了MVA gag-pol和MVA-env后增加，表明重组MVA-BN可以在被(SIV)感染并正接受抗逆转录病毒治疗的动物体内增强对SIV的免疫应答。重要的是，第16周进行了第二次免疫后，抗-SIV抗体滴度增加，这再次表明，MVA可以在免疫受损动物体内增强免疫应答，即使在已有针对MVA的免疫力的情况下也是如此(图8)。第1组的抗-MVA抗体滴度还反映了这种模式，其中初次免疫以后产生了抗体应答，该应答在第二次接种后被显著增强(图10)。
参考文献
Schneider，J.，Gilbert，SC.，Blanchard，TJ.，Hanke，T.，Robson，KJ.，Hannan，CM.，Becker，M.，Sinden，R.，Smith，GL.，和Hill，AVS.1998.Enhancedimmunogenicity for CD8+T cell induction and complete efficacy of malariaDNA vaccination by boosting with modified vaccinia virus Ankara(疟疾DNA接种经改良安卡拉痘苗病毒加强免疫后，增强了对CD8+T细胞诱导的致免疫性和完整效力).Nat.Med.4；397-402.
Thomson，SA.，Sherritt，MA.，Medveczky，J.，Elliott，SL.，Moss，DJ.，Fernando，GJP.，Brown，LE.，和Suhrbier，A.1998.Delivery of multiple CD8cytotoxic T cell epitopes by DNA vaccination(通过DNA接种运送多重CD8细胞毒T细胞表位).J.Immunol.160：1717.
表1：
 CEF  Hela  HaCat  143B  BHK  Vero  CV1
 MVA-BN  579.73  0.04  0.22  0.00  65.88  2.33  0.00
 MVA-575  796.53  0.15  1.17  0.02  131.22  10.66  0.06
 MVA-HLR  86.68  124.97  59.09  0.83  87.86  34.97  29.70
 MVA-Vero  251.89  27.41  1.28  2.91  702.77  1416.46  4.48
感染4天后，病毒扩增，超出输入水平
扩增比＝输出的TCID50-输入的TCID50。
所有数值都是TCID50。
申请人或代理人档案号    BN 35 PCT 国际申请号
                            关于微生物保藏的说明
                               (细则13之二)
A.对说明书第______3______页，第______15______行所述的微生物的说明。
B.保藏事项                                                                        其它保藏在补充页中□
                   ECACC保藏单位名称欧洲细胞培养物保藏中心
保藏单位地址(包括邮政编码和国名)Centre for Applies Microbiology&ReseqrchSalisburyWiltshire SP4 OJG，United Kingdom
保藏日期    2000年8月30日 保藏编号    00083008
 C.补充说明(必要时)                                                                 本栏内容有补充页□
对于可以进行补充说明的所有指定国，在其国内法允许的情况下，依照相关专利立法，如欧洲专利公约细则28(4)，英国专利法实施细则1995，澳大利亚专利法实施细则3.25(3)，丹麦专利法22部分及33(3)以及其它指定国的类似相关规定，请求将已保藏的微生物的样本仅发放给独立的专业人员。
D.本说明是为下列指定国作的(如果说明不是为所有指定国而作的)
E.补充说明(必要时)
下列说明将随后向国际局提供(写出说明的类别，例如：“保藏的编号”)
PCT/RO/134表(1992年7月)
申请人或代理人档案号    BN 35 PCT 国际申请号
                                      关于微生物保藏的说明
                                          (细则13之二)
A.对说明书第______7______页，第______4______行所述的微生物的说明。
B.保藏事项                                                                        其它保藏在补充页中□
                   ECACC保藏单位名称欧洲细胞培养物保藏中心
保藏单位地址(包括邮政编码和国名)Centre for Applies Microbiology&ReseqrchSalisburyWiltshire SP4 OJG，United Kingdom
保藏日期    2000年12月7日 保藏编号    00120707
 C.补充说明(必要时)                                                                 本栏内容有补充页□
对于可以进行补充说明的所有指定国，在其国内法允许的情况下，依照相关专利立法，如欧洲专利公约细则28(4)，英国专利法实施细则1995，澳大利亚专利法实施细则3.25(3)，丹麦专利法22部分及33(3)以及其它指定国的类似相关规定，请求将已保藏的微生物的样本仅发放给独立的专业人员。
D.本说明是为下列指定国作的(如果说明不是为所有指定国而作的)
E.补充说明(必要时)
下列说明将随后向国际局提供(写出说明的类别，例如：“保藏的编号”)
PCT/RO/134表(1992年7月)
申请人或代理人档案号    BN 35 PCT 国际申请号
                 关于微生物保藏的说明
                    (细则13之二)
A.对说明书第____17____页，第____8____行所述的微生物的说明。
B.保藏事项                                    其它保藏在补充页中□
              PHILS Public Health Laboratory Service，Centre for Applied保藏单位名称  Microbiology and ResearchECACC欧洲细胞培养物保藏中心，CAMR
保藏单位地址(包括邮政编码和国名)ECACC European Collection of Cell Cultures，CAMRPorton DownSalisbury，SP4，OJG，UK
保藏日期    1994年1月27日 保藏编号    V94012707
C.补充说明(必要时)                              本栏内容有补充页□
D.本说明是为下列指定国作的(如果说明不是为所有指定国而作的)
E.补充说明(必要时)
下列说明将随后向国际局提供(写出说明的类别，例如：“保藏的编号”)
Figure A0181941000341
PCT/RO/134表(1992年7月)

Claims (27)

  1. (1)具有至少一种下列特征的痘苗病毒：
    (i)能在鸡胚成纤维细胞(CEF)以及在幼年仓鼠肾细胞系BHK中进行繁殖性复制，但不能在人类角质细胞系HaCat中进行繁殖性复制，
    (ii)不能在体内复制，
    (iii)在致死攻击模型中比已知病毒株MVA 575诱导出更高的致免疫性，和/或
    (iv)在痘苗病毒初次免疫/痘苗病毒加强免疫的方案中，与在DNA-初次免疫/痘苗病毒加强免疫的方案中相比，诱导出至少基本相同的水平的免疫力。
  2. (2)权利要求1的病毒，其中所述病毒不能在以下任何一种人类细胞系中进行繁殖性复制：人类胚肾细胞系293，人类骨肉瘤细胞系143B和人类宫颈腺癌细胞系HeLa。
  3. (3)权利要求1或2的病毒及其衍生物，所述病毒在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，Salisbury(UK)以保藏号V00083008进行保藏。
  4. (4)权利要求1-3之一的病毒，含有至少一种异源核酸序列。
  5. (5)权利要求4的病毒，其中所述异源核酸序列选自编码至少一种抗原、抗原性表位、和/或治疗性化合物的序列。
  6. (6)基因组或其功能性部分，衍生自权利要求1-5之一所述病毒。
  7. (7)药用组合物，含有权利要求1-5之一所述病毒和/或权利要求6所述基因组和/或其功能性部分以及一种可药用载体、稀释剂和/或添加剂。
  8. (8)疫苗，含有权利要求1-5之一所述病毒和/或权利要求6所述基因组和/或其功能性部分。
  9. (9)作为药物的权利要求1-5之一所述病毒，权利要求6所述基因组和/或其功能性部分，权利要求7所述组合物或权利要求8所述疫苗，所述药物在活体动物中，包括在人体中，影响免疫应答，优选诱导免疫应答。
  10. (10)权利要求1-5之一所述病毒，权利要求7所述药用组合物，权利要求8所述疫苗，或权利要求9所述病毒，其中所述病毒，组合物或疫苗在第一次接种(初次接种)和在第二次接种(加强接种)中以治疗有效量给予。
  11. (11)权利要求1-5之一所述病毒，和/或权利要求6所述基因组，在制备药物或疫苗中的用途。
  12. (12)将同源和/或异源核酸序列导入靶细胞的方法，包括用权利要求4或5所述病毒感染靶细胞，或用权利要求6所述基因组转染靶细胞。
  13. (13)制备肽、蛋白和/或病毒的方法，包括
    a)用权利要求1或5所述病毒感染宿主细胞，
    b)在适当条件下培养已被感染的宿主细胞，和
    c)分离和/或富集由所述宿主细胞产生的肽和/或蛋白和/或病毒。
  14. (14)在动物，包括人，的活体内影响免疫应答，优选诱导免疫应答的方法，包括对需要治疗的动物或人给药权利要求1-5之一所述病毒，权利要求6所述基因组和/或其功能性部分，权利要求7所述组合物或权利要求8所述疫苗。
  15. (15)权利要求14的方法，包括给药至少102 TCID50(组织培养感染剂量)的病毒。
  16. (16)权利要求14或15的方法，其中所述病毒，组合物或疫苗在第一次接种(初次接种)和第二次接种(加强接种)中以治疗有效量给药。
  17. (17)权利要求14-16之一的方法，其中所述动物为免疫受损的动物。
  18. (18)权利要求14-17之一的方法，其中所述动物事先已具有对痘病毒的免疫力。
  19. (19)权利要求14-18之一的方法，其中所述动物正接受抗病毒治疗。
  20. (20)权利要求19的方法，其中所述抗病毒治疗是抗逆转录病毒治疗。
  21. (21)权利要求1-5之一所述病毒，权利要求6所述基因组和/或其功能性部分作为佐剂的用途。
  22. (22)增强对疫苗中所含抗原和/或抗原性表位的特异性免疫应答的方法，包括对将要用所述疫苗进行治疗的活体动物，包括人，给药权利要求1-5之一所述病毒或权利要求6所述基因组作为佐剂。
  23. (23)作为佐剂的权利要求1-5之一所述病毒或权利要求6所述基因组。
  24. (24)一种细胞，优选人的细胞，它含有权利要求1-5之一所述病毒，或含有权利要求6所述基因组或其功能性部分。
  25. (25)获得权利要求1-3之一所述痘苗病毒的方法，包括以下步骤：
    -将一种市售痘苗病毒株，优选MVA 575，引入能允许该病毒在其中进行繁殖性复制的非人类细胞中，其中所述非人类细胞优选选自CEF细胞和BHK细胞系，
    -从这些细胞分离/富集病毒颗粒，和
    -分析所得病毒是否具有至少一种在权利要求1中限定的生物学特性，
    其中可任选重复上述步骤，直至获得具有所需复制特性的病毒。
  26. (26)用于初次/加强免疫接种的试剂盒，它在第一个小瓶/容器中包含用于第一次接种(初次接种)的权利要求1-5之一所述病毒，权利要求7所述组合物，权利要求8所述疫苗，或权利要求9所述病毒，在第二个小瓶/容器中包含用于第二次接种(加强接种)的权利要求1-5之一所述病毒，权利要求7所述组合物，权利要求8所述疫苗，或权利要求9所述病毒。
  27. (27)权利要求1-5之一所述病毒，权利要求7所述组合物，权利要求8所述疫苗，或权利要求9所述病毒，用于制备疫苗的用途，其中所述病毒，组合物或疫苗在第一次接种和第二次接种中以治疗有效量给药。
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