CN1446222A - 水环境中分析物的检测 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检测介质例如液体中分析物的存在或浓度的指示剂分子，以及实现这种检测的方法。更具体地说，本发明涉及含有相对疏水的指示剂组分单体、和亲水性单体的共聚物大分子，结果使得大分子能够在水环境中应用。

Description

水环境中分析物的检测
相关申请的交叉引用
本申请是2000年8月4日申请的申请号为09/632,624的继续申请。
技术领域
本发明涉及用于检测介质例如液体中分析物存在或浓度的指示剂分子，以及用于实现这种检测的方法。更具体地说，本发明涉及含有相对疏水的指示剂组分单体和亲水性单体的共聚物大分子，结果使得大分子能够在水环境中应用。
背景技术
用于检测介质中分析物存在或浓度的指示剂分子是公知的。不幸地是，其中的许多在水中是不可溶或极少可溶。举例说明，美国专利5,503,770(James等)描述了一种含有荧光硼酸的化合物，当结合到糖类例如葡萄糖上时发射出高强度的荧光。荧光化合物的分子结构含有荧光团、至少一个苯基硼酸部分和至少一个提供氮原子的胺，其中氮原子邻近苯基硼酸部分以使之与硼酸发生分子内的相互作用。结果，当结合到糖类上时，这种相互作用使化合物发射荧光。还可以参见T.James，等J.Am.Chem.Soc.117(35)：8982-87(1995)。然而，在美国专利5,503,770的实施例2中描述的化合物(具有结构式6)，实质上是不溶于水的，并且作为实际情况是，为了在液体环境中工作，需要有机溶剂例如甲醇。
当应用于水环境例如体内应用时，缺乏充分的水溶性将成为严重的问题。因此，存在着很大的需求使不可溶或极少可溶的指示剂适应用在水环境中。
发明内容
一方面，本发明涉及一种用于检测水环境中分析物存在或浓度的指示剂大分子，所述大分子包括下述组分的共聚物：
a)一种或多种指示剂组分单体，该单体单独不足以充分溶解在水中使之应用于用于检测所述分析物存在或浓度的水环境；和
b)一种或多种亲水性单体；
结果使得大分子能够检测水环境中所述分析物的存在或浓度。
另一方面，本发明涉及用于检测水环境中分析物存在或浓度的指示剂大分子的制备方法，所述方法包括共聚下述组分：
a)一种或多种指示剂组分单体，该单体单独不足以充分溶解在水中使之应用于用于检测所述分析物存在或浓度的水环境；和
b)一种或多种亲水性单体；
结果使得所得大分子能够检测水环境中所述分析物的存在或浓度。
另一方面，本发明涉及一种用于检测分析物在具有水环境的样品中的存在和浓度的方法，所述方法包括：
a)将样品暴露于指示剂大分子中，所述大分子含有下述组分的共
聚物
i)一种或多种指示剂组分单体，该单体单独不足以充分溶解在水中使之应用于用于检测所述分析物存在或浓度的水环境；和
ii)一种或多种亲水性单体；
结果使得所得大分子能够检测所述分析物在水环境中的存在或浓度，并且当所述大分子暴露于所述分析物中时，指示剂大分子具有依赖浓度方式变化的可检测出的量；和
b)测试所述可检测出的量的任何变化，由此确定所述分析物在所述样品中的存在或浓度。
另一方面，本发明提供一种能够具有激发物(excimer)作用的大分子，它包括下述组分的共聚物：
a)一种或多种形成激发物的单体，组成它的分子当彼此之间适当
地取向时能够表现出激发物作用；和
b)一种或多种其它单体；
结果使得所得大分子表现出所述的激发物作用。
又一方面，本发明提供了一种制备能够表现出激发物作用的大分子的方法，该方法包括聚合下述组分：
a)一种或多种形成激发物的单体，组成它的分子当彼此之间适当
地取向时能够表现出激发物作用；和
b)一种或多种其它单体；
结果使得所得大分子表现出所述的激发物作用。
再一方面，本发明提供了一种检测样品中分析物存在或浓度的方法，所述方法包括：
a)将样品暴露于指示剂大分子中，所述大分子含有下述组分的共
聚物
i)一种或多种指示剂组分单体，其分子当彼此之间适当地取向时能够表现出激发物作用，并且它还能够检测出分析物的存在或浓度；和
ii)一种或多种其它单体；
结果使得所得大分子表现出所述的激发物作用，并且当所述大分子暴露于所述分析物中时，其中的指示剂大分子具有依赖于浓度方式变化的可检测出的量；和
b)测试所述可检测出的量的任何变化，由此确定所述分析物在所述样品中的存在或浓度。
附图说明
图1-2本发明实施例2中所述的几种指示剂大分子的放射谱图。
图3描述了实施例3中提到的指示剂组分单体的合成。
图4说明了实施例5中描述的指示剂的规一化荧光发射(427nm处的I/I0)。
图5说明了实施例6中描述的指示剂的规一化荧光发射(428nm处的I/I0)。
图6说明了实施例6中描述的指示剂的规一化荧光发射(427nm处的I/I0)。
图7说明了实施例7中描述的指示剂的吸收谱图。
图8-9说明了实施例7中描述的指示剂的吸收率(450nm/530nm)。
具体实施方式
一方面，本发明提供了一种在水环境中利用指示剂组分的方式，这些指示剂组分本身在水环境中是不可溶或极少可溶。实际上，这些指示剂是与一种或多种单体共聚的，所述单体的亲水性高到足以使所得指示剂大分子整个亲水性高到足以克服指示剂组分单体的疏水贡献。
合适的指示剂组分包括在水中不可溶或极少可溶并且其分析物至少极少可溶解在水中的指示剂分子。合适的分析物包括葡萄糖、果糖和其它邻位二醇；α-羟基酸；β-酮酸；氧；二氧化碳；多种离子例如锌、钾、氢(pH值测试)、碳酸根；毒素；无机物；激素等。应该意识到，本文中所用的指示剂组分单体的范围包括两种或多种单个单体(至少一种单体不足以可溶到在水环境中足够地作用)的混合物，所述单体当结合到本发明的大分子中时，起指示剂的作用。
其中的多种指示剂组分是公知的。举例说明，美国专利5,503,770中所描述的化合物在检测糖类例如葡萄糖是有用的，但是它极少可溶直至不溶于水。另一类指示剂包括1999年3月11日申请的未审美国申请09/265,979(并且与1999年9月16日以PCT国际申请的形式公开为WO99/46600，该文献被引用在本文中作参考)中描述的镧系元素螯合物；多芳香烃和它们的衍生物；2001年1月5日申请的未审申请08/754,217和2001年2月21日提出的未审申请60/269,887中公开的指示剂，这两篇文献都描述了具有两个识别元素的指示剂，所述的识别元素能够在葡萄糖和葡萄糖之间区别并且干扰α-羟基酸或β-二酮等。
当将大分子暴露于要测试的分析物中时，本发明的指示剂组分一般具有依赖于浓度方式变化的可测试出的质量。其中多种质量是公知的，并可以用于本发明。举例说明，指示剂可以包括一发光(荧光或磷光)或化学发光部分，一吸光部分等。指示剂可以包括一能量给体部分和一能量受体部分，彼此间隔以使之当大分子与分析物相互作用时具有可检测得出的变化。指示剂可以包括一荧光团和一猝灭剂，构型为使当不含有分析物时荧光团被猝灭剂猝灭。此时，当存在分析物时，指示剂发生了构型变化，这种变化引起猝灭剂充分远离荧光团，由此发出荧光。相反，荧光团和猝灭剂可以构型为，当不存在分析物时，它们充分远离并且荧光团发出荧光；当与分析物相互作用时，荧光团和猝灭剂充分移近来产生猝灭。构型变化的概念更详细地描述在2001年1月5日申请的未审申请09/754,219中，其标题为“分析物的检测”，该文献被引用在本文中作参考。
其它可检测地出的部分包括其荧光受分析物相互作用的影响的那些，所述相互作用是通过电子诱导的电子转移或诱导作用。这些指示剂包括1999年3月11日申请的未审美国申请09/265,979(并且与1999年9月16日以PCT国际申请的形式公开为WO99/46600，该文献被引用在本文中作参考)中描述的镧系元素螯合物；多芳香烃和它们的衍生物；香豆素；BODIPY(Molecular Probes，Eugene，OR)；丹酰；儿茶酚等。这部分的另一类包括当指示剂化合物与分析物相互作用时其吸收谱图变化的那些，包括茜素红等。这部分的另一类包括通过近接效应调节其荧光的那些，例如能量给体/受体对例如丹酰/dabsyl等。
优选的是，可检测地出的质量是可检测地出的光或谱图变化，例如吸收特征的变化(例如吸收性和/或谱移)、荧光衰变时间(通过时域或频域测试来确定的)、荧光强度、荧光各向异性或极化中的变化；放射谱图的谱移；时间分辨各向异性衰变中的变化(通过时域或频域测试来确定的)等。
合适的亲水性单体应当充分亲水以克服疏水性指示剂组分单体的总和，以使所得指示剂大分子能够在水环境中作用。易于理解的是，很大量的亲水性单体适用于本发明。举例说明，合适的亲水性单体包括甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酰胺、TMAMA、乙烯基类、多糖类、聚酰胺、多氨基酸、亲水性硅烷或硅氧烷等，以及两种或多种不同单体的混合物。
对于设定应用的合适亲水性单体将根据多个参数进行变化，包括打算的操作温度、盐度、pH、其它溶质的存在和种类、离子强度等。很容易理解，指示剂大分子的亲水性程度可以通过添加其它的官能化组分例如离子(例如磺酸盐、季胺、羧基等)、极性部分(例如羟基、巯基、胺、羰基、酰胺等)、卤素等来增加。
应该意识到，亲水性单体与指示剂组分单体的摩尔比可以根据所需要的特定用途而大幅度变化。亲水性单体与指示剂组分单体的优选摩尔比大约为2∶1-1000∶1，更优选大约5∶1-50∶1。
本发明的指示剂大分子一般可以通过至少一种指示剂组分单体和至少一种亲水性单体的简单共聚来合成。最佳的聚合条件(时间、温度、催化剂等)可以根据具体反应物和最终产物的用途来改变，并且能够由本领域普通技术人员简单地完成。
应该认识到，本发明的指示剂大分子可以具有任何所需要的水溶解性。举例说明，下面实施例1和2的指示剂大分子非常可溶，易于溶解在水溶液中。另一方面，举例说明，含有亲水性单体HEMA(甲基丙烯酸羟乙基酯)或其它常规水凝胶成分的指示剂大分子可能是不可溶的，但却是亲水的。
可溶指示剂大分子可以直接应用于水中，如果希望是这样的话。另一方面，如果所需要的用途是这样要求的，那么指示剂大分子可以固定(例如通过外力包埋、共价或离子结合或其它方法)在不溶表面或基质(例如玻璃、塑料、聚合物等)内部。例如，当指示剂大分子包埋在另一种聚合物内部，该包埋指示剂大分子的物质优选对分析物来说充分可渗透，使分析物和大分子中的指示剂组分之间发生适当的相互作用。
本发明的指示剂大分子存在许多应用，包括在能源、医药和农业领域用作指示剂。例如，指示剂大分子能够用作用于检测血液、组织、尿等中的次级或上级葡萄糖的指示剂分子，由此为诊断或跟踪例如糖尿病和肾上腺机能不全这样的疾病提供有价值的信息。用于人体治疗用途的葡萄糖的医药制备需要跟踪和控制。
本发明在农药中的应用包括检测分析物例如葡萄糖在大豆和其它农作物中的含量。对于这种高价值的产品例如葡萄酒的关键农作物的判定中，必需认真跟踪葡萄糖。由于葡萄糖是发酵工艺中最昂贵的碳源和原料，因此在动力酒精(power alcohol)的制备中，为了优化反应器的加料速率，葡萄糖的跟踪是关键的。在制备饮料和发酵饮料的过程中，葡萄糖浓度的反应器混合和控制对于质量控制来说也是关键的，国际上，这些饮料消耗了最大量的葡萄糖和可发酵糖。
当指示剂大分子结合了荧光指示剂取代物时，现有技术中也已经知道能够利用本发明大分子的多种检测技术。例如，本发明的大分子能够用在荧光传感元件中(例如，美国专利5,517,313)，或者可以结合到聚合物或其它基质例如用于视觉测试的测试纸。例如，后一种技术将用于，例如以与用石蕊试纸条测试pH值类似的方法用于葡萄糖测试。本文中描述的大分子也可以用作使用标准长桌面分析设备例如Shimadzu，Hitachi，Jasco，Backman和其它公司制备的分光荧光计或临床分析议的简单试剂。这些分子还为例如OceanOptics(Dunedin，Floride)或Oriel Optics制备的光纤基传感器和分析荧光计提供分析物具体的化学/光信号转导。
美国专利5,517,313(其说明书被应用在本文中作参考)描述了一种荧光传感设备，其中，本发明的大分子能够用于确定液体介质中分析物例如葡萄糖或其它顺式二醇化合物的存在或浓度。该传感设备包括含有荧光指示剂分子的基质(后文中“荧光基质”)、高通量滤波器和光检测器的多层组合。该设备中，光源，优选发光二极管(“LED“)，至少部分位于指示剂材料内，或者位于其上放置指示剂介质的波导管中，因此，来自光源的入射光使指示剂分子发出荧光。高通量滤波器使发射光接触光检测器，通过过滤掉来自光源的散射入射光。
美国专利5,517,313中描述的设备中使用的指示剂分子的荧光是通过分析物例如葡萄糖或其它顺式二醇化合物的局部存在而调节例如衰弱或增强。
在美国专利5,517,313中描述的传感器中，含有指示剂分子的物质可透过分析物。因此，分析物可以从外围测试介质扩散到该物质中，因此影响指示剂分子发射的荧光。光源、含有指示剂分子材料、高通量滤波器和光检测器可以排列为，使指示剂分子发射的至少一部分荧光影响光检测器，产生电子信号，该信号指示了外围介质中的分析物的浓度(例如葡萄糖)。
根据利用本发明指示剂大分子的其它可能的实施方式，传感器还公开在美国专利5,910,661，5,917,605和5,894,351中，所有这些文献都引用在本文中作参考。
本发明的大分子还可以用在可植入的设备，例如用来连续跟踪体内的分析物(例如血液或组织葡萄糖含量)。合适的设备公开在，例如1999年8月26日提交的未审美国申请09/383,148，以及美国专利5,833,603，6,002,954和6,011,984中，所有这些文献都引用在本文中作参考。
本发明的大分子具有独特的优点。例如，样品的吸光率直接与吸收物的浓度和样品的路径长度成正比。因此，在基于吸光率的分析中，很明显，对于给定的吸光率来说，如果吸收物浓度大大增加，那么样品的路径长度就大大减小。令人想望的浓度增加可以通过降低亲水性单体与指示剂组分单体的比例来实现。事实上，本发明允许更多的吸收物组分的局部浓度进入有限的空间，由此增加单位厚度的吸光率。因此当进行基于吸光率的分析时，本发明额外地允许使用更小的设备。还显然的是，对于任何基于光的分析包括基于荧光的分析来说，大大增加指示剂组分的局部浓度的能力产生了若干优点。例如，指示剂组分的局部浓度更高，能够允许使用更薄的指示剂大分子层，这反过来大大降低了大分子对分析物存在或浓度的响应时间。此外，能够造成激发光的更高消光，这当在组织体系或生理溶液中工作时能够有利地降低自动荧光的入射。例如，当利用基于荧光的大分子工作时，不吸收的激发光能够与例如存在于组织或生理溶液中的NADH、色氨酸、酪氨酸等相互作用，产生来自这些部分的不利的干扰荧光发射。高吸光性指示剂组分的局部浓度高，可以降低这种不理想的干扰发射。另外，当在组织或生理溶液中使用基于吸光性的大分子时，有利的是降低辐射源的含量，这反映在潜在改变外围组织或液体中组分的含量例如胆红素。因此，高吸光性指示剂分子的局部浓度高，能够降低这种不利影响。
作为本发明的另一方面，已经发现，某些大分子存在激发物作用。作为背景技术，当带有芳香结构的两个平面分子(例如经常带有荧光团)交会在一点时，在此点上，它们的pi电子轨道叶重叠，然后，对于某些分子来说能够产生共振条件，其中来自重叠的共振产生杂化结构，这种结构是能量上最有利且稳定的。这两个平面分子在共平面构型中取向，象三明治上的两个面包片，它们的电子云在它们之间重叠。对于荧光平面物种来说，相对于未偶合物种，特征低磁场发射发生在比母物种远远更低能量的波长处。能够形成这种有利共振构型的分子被公知作为激发物。正如本文中所用的那样，激发物作用是指来自激发物的比特征波长更长波长处的发射。
典型的形成激发物多芳香烃的某些实例包括蒽和芘。还有许多其它的化合物。实例之一是用在本发明实施例1和2中指示剂组分的蒽衍生物(包括硼酸盐)。尽管公知蒽在溶液中形成激发物，但是还必需将分子浓缩到足够高的浓度来观察任何激发物特征。对于实施例1和2的蒽衍生物，其分子不溶于水，并且在溶剂例如甲醇中的溶解程度不足以观察激发物特性。本发明实施例中，蒽衍生物单体的相对浓度与共聚物中亲水性单体成比例地增加，从500∶1，400∶1，200∶1，100∶1，50∶1，25∶1，15∶1到5∶1。除了在5∶1的比例下突然出现绿色发射之外，所有的蒽衍生物都在417nm处具有特征蓝色发射。这种绿色发射是激发物杂化物的发射，并且发射向低磁场位移大约100+nm(～515-570nm，绿色)。由于通过沿着聚合物骨架放置而不是三维空间内的可溶浓缩物的方式控制了平面物种之间的距离，因此整个溶液的浓度不需要高。
令人惊奇地是发现，激发物发射区对分析物浓度变化无感应，但是对分析体系的所有其它方面例如激发强度、温度和pH值有感应。因此，本发明的指示剂大分子既作为指示剂，也作为内部参照物。例如，理想的参考方案是，其中指示剂波长处(即受分析物影响的波长)的发射强度利用带通滤波器的选择被激发物波长处的发射强度进行光学上的均分。所得数值作干扰系数(它影响发射荧光的性能例如被例如氧猝灭的荧光、pH值的漂移和误差)、动力系数和影响LED强度的漂移、室温变化等方面的校正。
容易认识到，具有激发物作用的本发明大分子既可以用于水环境也可以用于非水环境。因此，根据所需要的用途，这些大分子以及组分单体(形成激发物和其它单体)可以为亲水性至疏水性。
还有，当本发明的激发物大分子被用于检测分析物的存在或浓度时，该大分子可以直接用于溶液中，或者可以按照上述方法固定。
本发明的大分子能够由本领域技术人员，在不需要过度试验的情况下，利用已知的反应机理和反应物来制备，所述反应机理和反应物包括与下面常规方法一致的反应机理。
实施例1
a)9-[(甲基丙烯酰氨基丙基氨基)甲基]蒽的制备
(A)一相
向在冰水浴中搅拌的氯仿(250mL)中的N-(3-氨丙基)甲基丙烯酰胺氯化氢(Polysciences，#21200)(11.82g，0.066mole，3.0eq)和痕量阻聚剂DBMP(2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚)(10mg)的悬浮液中，20分钟内滴加二异丙基乙胺(25mL.，18.55g，0.144mole，6.5eq)。使该混合物的温度达到室温，并在此在冰水浴中冷却。1小时内，向其中滴加9-氯甲基蒽(5.0g，0.022mole)在氯仿(100mL)中的澄清溶液。在25℃下反应1小时，50℃下反应12小时，然后在70℃下反应2小时。
将该混合物用水洗涤(60mL×4)，用二氯甲烷萃取水层。将有机层混合在一起，在Na2SO4上干燥，分离并在40℃减压下除去溶剂。然后，将未提纯的物质用含有2-5％甲醇的二氯甲烷色谱分离在硅胶上，得到2.44g(33.4％)固体产物。TLC(硅胶)：Rf(MeOH/CH2Cl2＝1/9)，一个斑点。
(B)两相
向在冰水浴中搅拌的水(30mL)与四氢呋喃(30mL)的混合物中的N-(3-氨丙基)甲基丙烯酰胺氯化氢(788mg，4.41mmole，10eq)和痕量阻聚剂MEHQ(甲基醚氢醌)(2mg)的澄清溶液中，1小时内加入Na2CO3/NaHCO3缓冲液(66mL，0.2M，pH10)，并在3小时内，向其中滴加9-氯甲基蒽(100mg，0.441mmole)在氯仿(100mL)中的溶液。在25℃下反应7小时，然后在55℃下反应12小时。
分离有机层，用水洗涤(50mL×4)，并用二氯甲烷萃取水层。将有机层混合在一起，在Na2SO4上干燥，分离并在45℃减压下除去溶剂。然后，将未提纯的物质用含有10-20％甲醇的二氯甲烷色谱分离在硅胶上，得到28.7mg(19.6％)固体产物。TLC(硅胶)：Rf(MeOH/CH2Cl2＝3/7)，一个斑点。
b)9-[[N-甲基丙烯酰氨基丙基-N-(邻硼苄基)氨基]甲基]蒽的制备
向在冰水浴中搅拌的氯仿(200mL)中的上面步骤a)中得到的产物(2.440g，0.00734mole)和痕量阻聚剂DBMP(10mg)的溶液中，10分钟内分份加入DIEA(二异丙基乙胺)(2.846g，3.84mL，0.022mole，3.0eq)，然后30分钟内向其中加入2，2-二甲基丙烷-1，3-二基[邻(溴甲基)苯基]硼酸盐(2.492g，0.0088lmole，1.2eq)在氯仿(15mL)中的溶液。该反应在室温下进行20小时。
将该混合物用水洗涤，分离并用二氯甲烷萃取水层。将有机层混合在一起，在Na2SO4上干燥，分离并在25℃减压下除去溶剂。然后，将半固体(4.75g)用含有2-5％甲醇的二氯甲烷色谱分离在硅胶上，得到2.50g(76.3％)淡黄色结晶固体的产物，mp72-73℃。TLC(硅胶)：Rf(MeOH/CH2Cl2＝1/9)。它可溶解在CH2Cl2，CHCl3，THF，CH3OH和C2H5OH，在H2O和醚中具有有限的溶解度。
c)MAPTAC和9-[[N-甲基丙烯酰氨基丙基-N-(邻硼苯基)氨基]甲基]蒽的水溶性共聚溶液的制备
(50∶1)溶液：向单体(42.3mg，0.0908mmol)在乙醇(100％，1.5mL)的溶液中，加入MAPTAC[3-(甲基丙烯酰氨基)丙基]三甲基氯化铵(2.0mL，1.0g，4.54mmol，50eq)和作为引发剂的AIBN(偶氮二异丁腈)的乙醇溶液(0.183M，0.2mL)，得到一澄清溶液。将它用氮气饱和，然后在1小时内加热到70℃，并保持在70℃下80分钟，得到一粘稠溶液。
将所得液体用水处理(26mL)并通过微过滤器(0.45μm)过滤得到一澄清溶液。通过醋酸纤维素膜(MWCO3500)用水透析后(5L×4)，用聚丙二醇(MW 20K)浓缩为澄清溶液(34.54g)。浓缩物为1.0g溶液中含有24.0mg固体，总固体829mg，产量79.5％。
利用类似程序，制备亲水性单体与指示剂摩尔比为500∶1，400∶1，200∶1，100∶1，50∶1，25∶1，15∶1和5∶1的共聚物溶液。
50∶1和25∶1共聚物的葡萄糖调制
下面表1和表2表示了具有多种浓度的葡萄糖溶液对50∶1和25∶1的指示剂大分子的荧光的调制。表1表示了用四种不同葡萄糖浓度对该实施例的两种不同浓度(15mg/ml和25mg/ml)的25∶1指示剂大分子的结果。表2表示了用四种不同葡萄糖浓度对该实施例的两种不同浓度(10mg/ml和20mg/ml)的50∶1指示剂大分子的结果。这两个表中，I/I0是暴露于葡萄糖(365nm激发)之后和之前在420nm处的发射强度的比值。
表1
葡萄糖浓度(mM) 对于15mg/ml的指示剂大分子(25∶1)的I/I0 对于25mg/ml的指示剂大分子(25∶1)的I/I0
 0  1.00  1.00
 50  1.44  1.50
 100  1.75  1.90
 200  2.13  2.33
表2
葡萄糖浓度(mM) 对于10mg/ml的指示剂大分子(50∶1)的I/I0 对于20mg/ml的指示剂大分子(50∶1)的I/I0
 0  1.00  1.00
 50  1.40  1.48
 100  1.70  1.79
 200  2.04  2.22
实施例2
该实施例说明了与实施例1中制备的5∶1指示剂大分子有关的令人惊奇且有用的激发物作用。
图1画出了当暴露于三种浓度的葡萄糖(0mM，30mM和60mM)时，被365nm的光激发后，5∶1指示剂大分子的发射光谱。图1的阴影部分还表示，来自实施例1的非激发物25∶1指示剂大分子的发射。激发物发射区域表示了“等吸光区”而不是“等吸光点”。从图1中可以看出，激发物发射区(其中0mM，30mM和60mM葡萄糖线重叠的区域)对葡萄糖浓度的变化不起响应(正与等吸光点一样)。激发物发射区开始于比蒽衍生物调制的峰值响应波长大约100nm的低磁场处。除了葡萄糖之外，激发物响应于系统所有的其它方面，例如激发强度、温度和pH值。因此，理想的参考方案是，其在415nm处的振幅或信号值被515nm处的振幅或信号值或激发物发射区内的另一个波长或波长范围进行电子均分，并将所得值进行漂移和pH误差、动力系数和影响LED强度的漂移、室温变化等方面的校正。这将在下面进行说明。
激发强度、温度和pH校正的说明
用三种不同葡萄糖溶液(0mM，30mM和60mM)测试5∶1指示剂大分子的葡萄糖调制。在用于光源和发射光的三种不同分光光度计狭缝构型(1.5为较窄，3为较宽)中，测试每种葡萄糖溶液的发射谱图。数据表示在表3中。表中，420nm处的发射强度与550nm处的发射强度之间的比值相对独立于狭缝构型。
表3
狭缝构型 I420/I5500mM葡萄糖     I420/I550100mM葡萄糖     I420/I550200mM葡萄糖
    1.5/1.5     3.92     6.18     7.36
    1.5/3     3.93     6.12     7.25
    3/3     4.00     6.27     7.28
测试了5∶1激发物指示剂大分子的温度稳定性。对于暴露于200mM葡萄糖(pH 7.5)的1mg/ml 5∶1激发物指示剂大分子的溶液来说，420nm处与550nm处的发射强度之间的比值室温下为7.57，大约60℃的温度下为7.53。
还测试了5∶1激发物指示剂大分子的pH值稳定性。测试了1mg/ml 5∶1激发物指示剂大分子的溶液在三种不同pH值(6.5，7.0和7.5)中，420nm处与550nm处的发射强度之间的比值(370nm处的激发光，狭缝1.5，3)，并表示在表4中。整个发射谱图表示在图2中。测试范围内的变化从统计学上讲是不显著的。
表4
 I420nm/I550nm pH6.5  I420nm/I550nm pH7.0  I420nm/I550nm pH7.5
 4.28±0.18  4.60±0.37  4.29±0.19
据认为，激发物络合物(假设通过pi电子云)的稳定性超过非激发物蒽衍生物的稳定性，能够扰乱非激发物性能并由此制成好的指示剂的硼酸盐识别特征不能够扰乱更稳定的激发物，这样，激发物就成为非常好的参考指示剂。聚合物基质可以相同，事实上在该实施例中是相同的大分子。识别元素是敞开并完整的，而识别元素和荧光团中心之间的感应能量影响已经被弱化。
如上所述非常重要，这是由于它免去了分离指示剂和参考分子之间的物理和/或化学环境的需要。
实施例3
适当的镧系螯合物指示剂组分单体的合成描述在图3中。化合物(1)和(2)可以由Macrocyclics，Richardson买来，TX(化合物2)称作P-NH2-Bz-DOTA。
实施例4
二硼酸盐蒽的单甲基丙烯酰胺单体A、9-氯甲基-10-[[2-(2-羟基乙氧基)乙基氨基]-甲基]蒽盐酸盐向9，10-二(氯甲基)蒽(5.18g，18.8mmole，3.99eq)在200mLNMP的悬浮液中加入2-(2-氨基乙氧基)乙醇(0.495g，0.475mL，4.71mmole)。将该混合物黑暗中搅拌17小时。同时，将反应混合物50℃真空下浓缩到约50mL。将残留物用硅胶色谱分离(150g种类级硅胶，0-10％CH3OH/CH2CL2)来提纯，得到0.425g(24％)黄色/橙色固体。
TLC：Merck硅胶60板，70/30的CH2CL2/CH3OH的Rf0.72，用UV(254/366)检测，茚三酮染料。
HPLC：HP 1100 HPAL色谱分离，Vydac 201TF 10×250mm的柱子，0.100mL进样，2mL/min，在370nm处检测，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度：10％的B洗涤2min，10-80％的B洗涤18分钟，用80-100％的B洗涤2min，用100％的B洗涤2min，停留时间16.1min。
Figure A0181385500301
B、9-[[2-(2-羟基乙氧基)乙基氨基]甲基]-10-[[(3-甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]蒽
23℃下，向N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(3.08g，17.2mmole，4.2eq)、DIEA(5.19g，7.00mL，40.1mmole，9.8eq)和约3mgBHT在125mL CHCL3的悬浮液中，滴加9-氯甲基-10-[[2-(2-羟基乙氧基)乙基氨基]-甲基]蒽氢氯酸盐(1.56g，4.10mmole)在25mL CHCL3中的溶液。随后将该混合物在黑暗中搅拌92小时。同时，将反应混合物过滤并用2×40mL NaHCO3(饱和水溶液)洗涤。将有机提取物在无水Na2SO4上干燥，过滤并浓缩，得到一粘性的橙色固体，将它用氧化铝色谱分离法(50g活化的中性氧化铝，0-5％ CH3OH/CH2CL2)提纯得到0.364g(20％)的橙色固体。
TLC：Merck硅胶60板，70/30的CH2CL2/CH3OH的Rf0.16，用UV(254/366)检测，茚三酮染料。
HPLC：HP1100 HPLC色谱分离，Vydac 201TP10×250mm的柱子，0.100mL进样，2mL/min，在370nm处检测，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度：10％的B洗涤2min，10-80％的B洗涤18分钟，用80-100％的B洗涤2min，用100％的B洗涤2min，停留时间16.85min。
C、9-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基-N-[2-(2-羟基乙氧基)-乙基氨基]甲基]蒽(单甲基丙烯酰胺单体)
23℃下，将9-[[2-(2-羟基乙氧基)-乙基氨基]甲基-10-[[(3-甲基丙烯酰胺)丙基氨基]甲基]]蒽(0.343g，0.763mmole)，DIEA(0.965g，1.30mL，9.8eq)和(2-溴甲基苯基)硼酸新戊基酯(1.09g，3.85mmole，5.0eq)在20mL CHCL3中的溶液黑暗中搅拌25小时。同时，将该反应混合物开始用旋转式汽化器浓缩，然后用真空泵除去DIEA。将残留物用氧化铝柱式色谱分离法(40g活化的中性氧化铝，0-10％CH3OH/CH2CL2)纯化得到0.299g(46％)的桔黄色固体。将该产物与一种或多种其它单体共聚，制成指示剂大分子。该硼酸根基团在使用之前应当去保护。
FAB MS：计算的C51H65B2N3O7的[M]+为865，发现[M+1]+为855。
TLC：Merck碱性氧化铝板，95/5的CH2CL2/CH3OH的Rf0.35，用UV(254/366)检测。
HPLC：HP1100 HPLC色谱分离，Vydac 201TP10×250mm的柱子，0.100mL进样，2mL/min，在370nm处检测，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度：10％的B洗涤2min，10-80％的B洗涤18分钟，用80-100％的B洗涤2min，用100％的B洗涤2min，停留时间19.7min。
实施例5二硼酸盐—蒽的双甲基丙烯酰胺单体
Figure A0181385500321
A、9，10-双[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基-蒽
将9，10-二(氯甲基)蒽(1.5g，5.45mmole)、DIEA(28.17g，38.00mL，218mmole，40eq)、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺氢氯酸盐(9.76g，54.5mmole，10.0eq)和约5mgBHT在200mL 23℃的CHCL3中的悬浮液在40℃的黑暗中搅拌4天。同时，将温度增加到45℃，并将该混合物再搅拌3天。此时，形成沉淀物。将混合物过滤，并将固体产物溶解在少量CH2CL2中。一整夜形成了黄色结晶固体，即期望产物的双氢氯酸盐(定量3.15g)。
TLC：Merck碱性氧化铝板，90/10的CH2CL2/CH3OH的Rf0.31，用UV(254/366)检测。
HPLC：HP 1100 HPLC色谱分离，水5×100mmNovapak HR C18的柱子，0.100mL进样，0.75mL/min，在360nm处检测，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度：10％的B洗涤2min，10-80％的B洗涤18分钟，用80-100％的B洗涤2min，用100％的B洗涤2min，停留时间19.7min。
B、9，10-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基蒽
23℃下，将9，10-二[3-(甲基丙烯酰胺)-丙基氨基]甲基蒽(0.650g，1.34mmole游离胺)、DIEA(0.612g，0.825mL，4.74mmole，3.55eq)、(2-溴甲基苯基)硼酸新戊基酯(1.34g，4.74mmole，3.55eq)和BHT(5mg，作为引发剂)在20mL的CHCL3中的悬浮液黑暗中搅拌5天。此时，将反应混合物在真空中浓缩，并将残留物用氧化铝色谱分离法(200g活化的中性氧化铝，0-2％CH3OH/CH2CL2)提纯，得到0.465g(39％)非常粘稠的黄色油。
TLC：Merck碱性氧化铝板，90/10的CH2CL2/CH3OH的Rf0.59，用UV(254/366)检测。
HPLC：HP 1100 HPLC色谱分离，水5×100mm Novapak HR C18的柱子，0.050mL进样，0.75mL/min，在360nm处检测，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度：10％的B洗涤2min，10-80％的B洗涤18分钟，用80-100％的B洗涤2min，用100％的B洗涤2min，停留时间19.7min。
C、用葡萄糖引发剂制备N，N-二甲基丙烯酰胺水凝胶
制备N，N-二甲基丙烯酰胺(40％wt)和N，N′-亚甲基二丙烯酰胺(0.8％wt)在乙二醇中的溶液。将9，10-二[N-[2-(5，5-二甲基硼-2-基)-苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺)丙基氨基]甲基蒽(17.8mg，2×10-5mole)和40μL过硫酸铵水溶液(5％wt)与1mL乙二醇单体组合物混合。将所得溶液放在单体吹扫的手套箱中。将N，N，N′，N′-四甲基乙二胺的水溶液(80μL，5％wt)加入到单体溶液中来加速聚合。将所得单体组合物倒入显微镜载玻片和100微米不锈钢定距片构成的模板中。在氮气气氛中保持8小时后，将模板放在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(10mMPBS，pH＝4)，分离显微镜载玻片，并移出水凝胶。将水凝胶用100mL含有1mM月桂基磷酸钠盐和1mMEDTA钠盐的PBS洗涤3天，其中溶液每天更换，随后用DMF/PBS(10/90vol/vol，3×100mL)洗涤，最后用PBS(pH＝7.4，3×100mL)洗涤。所得水凝胶聚合物保存在含有0.2wt％叠氮化钠和1mMEDTA钠盐的PBS中(10mL，pH＝7.4)。
D、用葡萄糖、乳酸糖和乙酰乙酸盐调制荧光
测试该实施例中制备的指示剂大分子(它含有两种识别元素)通过葡萄糖、乳酸盐和乙酰乙酸盐对荧光的调制。图4表示，在含有不同含量L乳酸钠、乙酰乙酸锂或α-D-葡萄糖的10mMPBS中，该实施例的水凝胶的规一化荧光发射(427nm处的I/I0)，其中PBS的pH为7.4，含有0.2％NaN3和1mM EDTA。在37℃的低灵敏度下，利用温度控制的样品夹具，利用365nm激发(狭缝＝3nm)和427nm发射(狭缝＝3nm)的Shimadzu RF-5301分光荧光计记录数据。37℃，将含有3mL所需溶液的吸收池在测试之前平衡15分钟。将每种水凝胶样品在四个独立样品中测试。误差线是每个数值点四倍值的标准偏差。含有葡萄糖识别分子的水凝胶是按照上述方法制备的。在吸收池中，将水凝胶与入射光成45°角放在玻璃载玻片上，并用聚酯掩模覆盖。在含有0.2％ NaN3和1mM EDTA、pH为7.4的10mM PBS中，制备1、5、10和20mML乳酸钠(Aldrich)，5、10和20mM乙酰乙酸锂(Aldrich)和1、2、4、5、10和20mM α-D-葡萄糖的溶液。共聚物的荧光受存在的葡萄糖的影响，但不受乳酸盐或乙酰乙酸盐的影响。
实施例6
双硼酸盐—蒽的单—和双—甲基丙烯酸酯单体
A、9，10-二[[2-(2-羟基乙氧基)乙基氨基]甲基]-蒽
23℃下，向2-(2-氨基乙氧基)乙醇(31.4g，30.0mL，299mmole，20.9eq)在40mL CHCl3的溶液中加入9，10-二(氯甲基)蒽(3.94g，14.3mmole)。将溶液在黑暗中搅拌67小时。此时，加入100mL CH2Cl2，并将溶液用1×50ml和2×100mLNaHCO3(饱和水溶液)洗涤。将有机提取物在无水Na2SO4上干燥，过滤并浓缩，得到4.67％(79％)的黄色粉末。将产物(RP-HPLC测试，85％的纯度)按照下面的方式进行下去。
HPLC条件：HP1100 HPLC色谱分离，Vydac 201TP10×250mm的柱子，0.100mL进样，2mL/min，在370nm处检测，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度：10％的B洗涤2min，10-80％的B洗涤18分钟，用80-100％的B洗涤2min，用100％的B洗涤2min，停留时间15.6min。
Figure A0181385500361
B、9，10-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-羟基乙氧基)乙基氨基]甲基]蒽
23℃下，将9，10-二[[2-(2-羟基乙氧基)乙基氨基]甲基]蒽(4.02g，9.75mmole)、DIEA(12.6g，17.0mL，97.5mmole，10.0eq)、和(2-溴甲基-苯基)硼酸新戊基酯(13.7g，48mmole，4.9eq)在125mLCHCl3中的溶液黑暗中搅拌46小时。此时，将该反应混合物开始用旋转式汽化器浓缩，然后用真空泵除去DIEA。将残留物用氧化铝柱式色谱分离法(150g活化的中性氧化铝，0-3％CH3OH/CH2CL2)纯化得到5.67g(70％)的粘稠油，将其静置固化。将产物(RP-HPLC测试，85％的纯度)按照下面的方式进行下去。
TLC：Merck碱性氧化铝板，95/5的CH2CL2/CH3OH的Rf0.33，用UV(254/366)检测。
HPLC条件：HP1100 HPLC色谱分离，Vydac 201TP10×250mm的柱子，0.100mL进样，2mL/min，在370nm处检测，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度：10％的B洗涤2min，10-80％的B洗涤18分钟，用80-100％的B洗涤2min，用100％的B洗涤2min，停留时间18.8min。
C、9-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)乙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-羟基乙氧基)乙基氨基]甲基]蒽。(单—甲基丙烯酸酯单体)
23℃下，将9，10-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-羟基乙氧基)乙基氨基]甲基]-蒽(0.298g，0.359mmole)、甲基丙烯酸(0.304g，0.300mL，3.53mmole，9.84eq)、DCC(0.965g，4.68mmole，13.0eq)和N，N-二甲基氨基吡啶(0.020g，0.16mmole，0.46eq)在15mL CH2CL2中的溶液黑暗中搅拌4小时。此时，将反应混合物过滤并通过旋转式汽提器干燥。将残留物用氧化铝柱式色谱分离法(50g活化的中性氧化铝，0-4％CH3OH/CH2CL2)纯化得到0.150g(47％)的黄色固体。
FAB MS：计算的C52H66B2N2O9的[M]+为885，发现[M+1]+为886。
TLC：Merck碱性氧化铝板，95/5的CH2CL2/CH3OH的Rf0.45，用UV(254/366)检测。
HPLC：HP 1100 HPLC色谱分离，Vydac 201TP10×250mm的柱子，0.100mL进样，2mL/min，在370nm处检测，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度：10％的B洗涤2min，10-80％的B洗涤18分钟，用80-100％的B洗涤2min，用100％的B洗涤2min，停留时间21min。
D、9-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)乙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-羟基乙氧基)乙基氨基]甲基]蒽和TMAMA的水溶性共聚物(1∶50摩尔比)
向[2-(甲基丙烯酰胺)乙基]三甲基氯化铵(TMAMA，70wt％水溶液，0.344g单体，1.66mmole，50eq)在0.600mL水中的水溶液中加入9-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-甲基丙烯酰胺乙氧基)乙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-甲基丙烯酰胺乙氧基)乙基氨基]甲基]蒽(0.029g，0.033mmole)在3.00mLMeOH中的溶液。向该混合物中加入4，4′-偶氮二(4-氰基戊酸)(0.0075g，0.027mmole，总单体的1.6mole％)。将该溶液通过0.45μ膜过滤器过滤，吹入氮气，然后在黑暗中55℃下加热16小时。此时，将粘稠溶液冷却到25℃，并在真空中浓缩。将残留物用20mL水稀释，并通过0.2μ的膜过滤器过滤。将聚合物溶液相对于2×4L水用纤维素乙酸酯膜(MWCO 3500)透析。透析中得到38.5mL聚合物溶液。浓缩部分溶液至干燥，说明每1.0mL溶液中有0.0075g聚合物。聚合物的总收率为0.289g(77％)。
E、用葡萄糖、乳酸盐和乙酰乙酸盐调制荧光
测试该实施例中步骤D制备的共聚物(它含有两种识别元素)通过葡萄糖、乳酸盐和乙酰乙酸盐对荧光的调制。图5表示，在含有a)0-20mM葡萄糖、b)0-20mM乳酸盐、c)0-20mM乙酰乙酸锂的PBS中，1.5mg/mL的蒽二硼酸盐-TMAMA共聚物(1∶50摩尔比)溶液的规一化荧光发射(428nm处的I/I0)。光谱是通过在365nm激发、激发狭缝为1.5nm、发射狭缝为1.5nm的Shimadzu RF-5301分光荧光计在室温下记录的。共聚物的荧光受存在的葡萄糖的影响，但不受乳酸盐或乙酰乙酸盐的影响。
F、9，10-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)乙基氨基]甲基]蒽。(二-甲基丙烯酸酯单体)
0℃下，将9，10-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-羟基乙氧基)乙基氨基]甲基]-蒽(0.100g，0.120mmole)、甲基丙烯酸(0.112g，0.110mL，1.30mmole，10.8eq)、DCC(0.316g，1.63mmole，12.8eq)和N，N-二甲基氨基吡啶(0.014g，0.11mmole，0.92eq)在5mL CH2CL2中的溶液搅拌1小时，然后在23℃下搅拌22小时。此时，将反应混合物过滤并通过旋转式汽提器干燥。将残留物用氧化铝柱式色谱分离法(30g活化的中性氧化铝，0-2％CH3OH/CH2CL2)纯化得到0.030g(26％)的黄色固体。将该产物与一种或多种其它单体共聚得到一指示剂大分子。其硼酸盐基团在使用前去保护。
FAB MS：计算的C56H70B2N2O10的[M]+为953，发现[M]+(弱的分子离子峰)为951。
TLC：Merck碱性氧化铝板，95/5的CH2CL2/CH3OH的Rf0.67，用UV(254/366)检测。
HPLC：HP 1100 HPLC色谱分离，水5×100mm NovaPak HR C18的柱子，0.100mL进样，0.75mL/min，2mL注射循环，在370nm处检测，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度：10％的B洗涤2min，10-80％的B洗涤18分钟，用80-100％的B洗涤2min，用100％的B洗涤2min，停留时间19.6min。
G、利用葡萄糖指示剂的HEMA/SPE/MAA水凝胶的制备
制备甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA，0.078mL，0.084g，0.64mmole)、甲基丙烯酸(MAA，0.030mL，0.030g，0.35mmole)、聚二甲基丙烯酸乙二醇酯1000(PEGDMA，0.5mg/mL水溶液，0.048mL)和N，N-二-N-甲基丙烯酰氧乙基-N-(3-磺基丙基)-铵-batain(SPE，0.462g，1.65mmole)在0.900mL乙二醇中的溶液。将9，10-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)乙基氨基]甲基]-蒽(0.0096g，0.010mmole)和0.020mL过硫酸铵的5wt％水溶液与0.500mL乙二醇单体溶液混合。将该溶液放置在氮气吹扫下的手套箱中。将N，N，N′，N′-四甲基乙二胺的水溶液(0.040mL，5％wt)加入到单体溶液中来加速聚合。将所得单体组合物倒入显微镜载玻片和100微米不锈钢定距片构成的模板中。在氮气气氛中保持8小时后，将模板放在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH＝4)，分离显微镜载玻片，并移出水凝胶。将水凝胶用100mL含有1mM月桂基磷酸钠盐的PBS洗涤3天，其中溶液每天更换，随后用MeOH/PBS(20/80vol/vol，3×100mL)洗涤，最后用PBS(3×100mL)洗涤。所得水凝胶聚合物保存在含有0.2wt％叠氮化钠和1mMEDTA钠盐的PBS中(pH＝7.4)。
H、用葡萄糖调制荧光
测试该实施例中制备的二甲基丙烯酸酯指示剂化合物通过葡萄糖对荧光的调制。图6表示，在含有0-20mMA-D-葡萄糖的PBS(pH为7.4，含有0.2％NaN3和1mM EDTA)中，含有该实施例的二甲基丙烯酸酯葡萄糖识别分子的HEMA/SPE水凝胶(100微米厚，上述方法制备的)的相对荧光发射(427nm处的I)。在与入射光成45°角的吸收池中，将水凝胶放在玻璃载玻片上，并用聚酯掩模(Sefar America，Depewm NY)覆盖。所有的测试都是利用温度控制的样品夹具，37℃下，利用365nm激发(狭缝＝1.5nm)和427nm发射(狭缝＝1.5nm)的Shimadzu RF-5301分光荧光计在高灵敏度下进行的。37℃，将含有3mL所需葡萄糖溶液(0、1、2、4、5、10、20葡萄糖)的吸收池在测试之前平衡30分钟。利用单指数函数来适合原始荧光数据。
实施例7
葡萄糖或乳酸盐对含有N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基-3，4-二羟基-9，10-二氧-2-蒽磺酰胺(Alizarin Red S单体)和α，α′-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]-1，4-二甲苯(二硼酸单体)的丙烯酰胺水凝胶的作用
A、3，4-二羟基-9，10-二氧-2-蒽磺酰氯
将3，4-二羟基-9，10-二氧-2-蒽磺酸的钠盐(1.4g，3.9mmole)与30mL氯磺酸混合并加热到90℃ 5小时，随后将溶液冷却到0℃并倒入100g冰。冰融化后，将溶液用CH2CL2(3×100mL)萃取，将二氯甲烷萃取物混合，并用Na2SO4干燥并蒸发得到0.87g固体(收率66％)。
B、N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基-3，4-二羟基-9，10-二氧-2-蒽磺酰胺
将3，4-二羟基-9，10-二氧-2-蒽磺酰氯(96mg，0.28mmole)和N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺氢氯酸(108mg，0.6mmole)与20mLCH2CL2混合。将混合物在室温下搅拌24小时，过滤并蒸发溶剂。将所得固体进行SiO2(10g)上的柱式色谱分离法分离，其中以CH2CL2/MeOH(90/10)作洗脱液。所得产物是红色固体(80mg，收率64％)。
FAB MS：计算的C21H20B2N2O7S的[M]+为445，发现[M]+为445。
HPLC：HP 1100 HPLC色谱分离，水5×100mm NovaPak HR C18的柱子，0.100mL进样，0.75mL/min，2mL注射循环，在370nm处检测，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度：10％的B洗涤2min，10-80％的B洗涤18分钟，用80-100％的B洗涤2min，用100％的B洗涤2min，停留时间17.67min。
C、α，α′-二[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]-1，4-二甲苯
25℃下，向N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺氢氯酸盐(3.00g，16.8mmole，2.21eq)、DIEA(6.5g，8.8mL，50mmole，6.6eq)、对苯二甲醛(1.02g，7.60mmole)和Na2SO4(107g，75.3mmole，9.91eq)在75mL无水MeOH中的溶液黑暗中搅拌18小时。此时，将溶液过滤并向滤液中按比例加入NaBH4(1.73g，45.7mmole，6.01eq)，随后在25℃下搅拌21小时。将悬浮液通过Ceite过滤并浓缩滤液。将残留物溶解在100mL CH2CL2中并用1×25mL饱和NaHCO3水溶液洗涤。将有机提取物在无水Na2SO4干燥、过滤并浓缩得到粘稠油。将产物按照下述方式进行。
HPLC：HP1100 HPLC色谱分离，Vydac 201TP10×250mm的柱子，0.100mL进样，2mL/min，在260nm处检测，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度：10％的B洗涤2min，10-80％的B洗涤18分钟，用80-100％的B洗涤2min，用100％的B洗涤2min，停留时间15.8min。
D、α，α′-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]-1，4-二甲苯
25℃下，将α，α′-二[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]-1，4-二甲苯(2.94g，7.61mmole)、DIEA(2.97g，4.00mL，23.0mmole，3.02eq)、(2-溴甲基苯基)硼酸新戊基酯(6.50g，23.0mmole，3.02eq)和BHT(5mg作为引发剂)在75mL CH2CL2中的溶液黑暗中搅拌28小时。此时，将混合物用1×25mL饱和NaHCO3水溶液洗涤。将有机提取物在无水Na2SO4干燥、过滤并浓缩。向残留物中加入200mL醚，并将悬浮液搅拌18小时。将悬浮液过滤，并将残留物溶解在CH2CL2中，过滤并浓缩滤液。将固体残留物中加入150mL醚并将悬浮液搅拌18小时。此时，将悬浮液过滤得到1.98g(33％)蓬松粉末，它在PBS(pH＝7.4)中的最大溶解度为1毫摩尔。
FAB MS：计算的C46H64B2N4O6的[M]+为790，发现[M+1]+为791。
HPLC：HP 1100 HPLC色谱分离，水5×100mm NovaPak HR C18的柱子，0.050mL进样，0.75mL/min，在280nm处检测，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度：10％的B洗涤2min，10-80％的B洗涤18分钟，用80-100％的B洗涤2min，用100％的B洗涤2min，停留时间13.4min。
E、含有N-[3-(甲基丙烯酰胺基)]丙基-3，4-二羟基-9，10-二氧-2-蒽磺酰胺(Alizarin Red S单体)和α，α′-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]-1，4-二甲苯的丙烯酰胺凝胶的制备
制备含有30％wt丙烯酰胺和0.8％wt的N，N′-亚甲基二丙烯酰胺的乙二醇溶液的制备。将N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基-3，4-二羟基-9，10-二氧-2-蒽磺酰胺(1.5g，3.38×10-6mole)和α，α′-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]-1，4-二甲苯(28mg，3.54×10-5mole)与800μL乙二醇单体溶液和40μL过硫酸铵的5wt％水溶液混合。将该溶液连同显微镜载玻片和100微米不锈钢定距片构成的模板一起放置在氮气吹扫下的手套箱中。将N，N，N′，N′-四甲基乙二胺的水溶液(40μL，5％wt)加入到单体溶液中来加速聚合，将最终的组合物倒入玻璃模板中。将该模板放在氮气气氛下16小时，随后浸入PPS(pH＝7.4)中，并分离显微镜载玻片得到一薄膜形式的水凝胶聚合物。将所得水凝胶薄膜用100mL含有1mM月桂基磷酸钠盐的PBS洗涤3天，其中溶液每天更换，随后用MeOH/PBS(20/80vol/vol，3×100mL)洗涤，最后用PBS(pH＝7.4，3×100mL)洗涤。所得水凝胶聚合物保存在含有0.2wt％叠氮化钠和1mMEDTA钠盐的PBS中(10mM PBS，pH＝7.4)。
F、用葡萄糖和乳酸糖调制吸光率
测试该实施例制备的指示剂水凝胶(它含有两个识别元素)通过葡萄糖和乳酸盐对吸光率的调制。将丙烯酰胺凝胶安装实施例5中描述的方法安装在PMMA池中。在水浴中，将含有所需量葡萄糖或乳酸钠的磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH＝7.4)加热到37℃，并放入含有凝胶的PMMA池中，随后将PMMA池37℃下平衡15分钟。将每种葡萄糖或乳酸盐浓缩液一式三份进行吸光率测试。对于每个测试，将650nm处的吸光率用作空白对比，从A(450nm)和A(530nm)的值中减去A(650nm)。
图7表示，含有4mM Alizarin Red S单体(Alizarin Red：丙烯酰胺摩尔比为1∶1000)和44mM二硼酸单体的丙烯酰胺凝胶(30％)用或不用葡萄糖的吸收谱图。图8表示了葡萄糖对含有4mM AlizarinRed S单体和44mM二硼酸单体的丙烯酰胺凝胶(30％)的丙烯酰胺的吸光率的影响。图9表示了乳酸钠对含有4mM Alizarin Red S单体和44mM二硼酸单体(硼酸单体：丙烯酰胺的摩尔比为1∶95)的丙烯酰胺凝胶(30％)的吸光率的作用。指示剂的吸光率受存在的葡萄糖的影响，但是基本上不受乳酸盐的存在的影响。

Claims (59)

1、一种用于检测水环境中分析物存在或浓度的指示剂大分子，所述大分子含有下述组分的共聚物：
a)一种或多种指示剂组分单体，该单体单独不足以充分溶解在水中使之应用于用于检测所述分析物存在或浓度的水环境；和
b)一种或多种亲水性单体；
结果使得大分子能够检测水环境中所述分析物的存在或浓度。
2、根据权利要求1的指示剂大分子，其中该大分子能够通过光学变化来检测。
3、根据权利要求1的指示剂大分子，其中指示剂组分单体包括N-(邻硼苄基)氨基甲基蒽衍生物。
4、根据权利要求3的指示剂大分子，其中指示剂组分单体选自下述化合物：
9-[[N-甲基丙烯酰氨基丙基-N-(邻硼苄基)氨基]甲基]蒽；
9-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基-N-[2-(2-羟基乙氧基)-乙基氨基]甲基]蒽；
9-[N-(2-硼苄基)-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-(2-硼苄基)-N-[2-(2-羟基乙氧基)-乙基氨基]甲基]蒽；
9，10-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基蒽；
9，10-二[N-(2-硼苄基)-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)-丙基氨基]甲基]蒽；
9-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)乙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-羟基乙氧基)-乙基氨基]甲基]蒽；
9-[N-(2-硼苄基)-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)乙基氨基]甲基]-10-[N-(2-硼苄基)]-N-[2-(2-羟基乙氧基)-乙基氨基]甲基]蒽；
9，10-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)乙基氨基]甲基]蒽；
9，10-二[N-(2-硼苄基)-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)乙基氨基]甲基]蒽；
N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基-3，4-二羟基-9，10-二氧-2-蒽磺酰胺；
α，α′-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]-1，4-二甲苯；
以及它们的盐或衍生物。
5、根据权利要求3的指示剂大分子，其中亲水性单体包括[3-(甲基丙烯酰氧基氨基)-丙基]三甲基氯化铵。
6、根据权利要求1的指示剂大分子，其中指示剂组分单体选自镧系元素螯合物和多芳香烃。
7、根据权利要求1的指示剂大分子，其中亲水性单体与指示剂组分单体的摩尔比大约为2∶1-1000∶1。
8、根据权利要求7的指示剂大分子，其中亲水性单体与指示剂组分单体的摩尔比大约为5∶1-50∶1。
9、根据权利要求8的指示剂大分子，其中亲水性单体与指示剂组分单体的摩尔比大约为5∶1。
10、根据权利要求1的指示剂大分子，其中检测的分析物选自邻位二醇；α-羟基酸；β-酮酸；氧；二氧化碳；锌、钾、氢或碳酸盐离子；毒素；无机物；和激素。
11、根据权利要求10的指示剂大分子，其中检测的分析物选自含有糖类的邻位二醇。
12、根据权利要求11的指示剂大分子，其中糖类是葡萄糖。
13、根据权利要求1的指示剂大分子，其中：
i)亲水性单体与指示剂组分单体的摩尔比大约为2∶1-15∶1，
ii)指示剂组分单体含有N-(邻硼苄基)氨基]甲基]蒽衍生物，
iii)亲水性单体含有[3-(甲基丙烯酰氧基氨基)丙基]三甲基氯化铵，以及
iv)大分子具有激发物作用。
14、一种用于制备指示剂大分子的方法，所述指示剂大分子是用于检测水环境中分析物的存在或浓度，所述方法包括聚合下述组分：
a)一种或多种指示剂组分单体，该单体单独不足以充分溶解在水中使之应用于用于检测所述分析物存在或浓度的水环境；和
b)一种或多种亲水性单体；
结果使得大分子能够检测水环境中所述分析物的存在或浓度。
15、根据权利要求14的方法，其中该大分子能够通过光学变化来检测。
16、根据权利要求14的方法，其中指示剂组分单体包括N-(邻硼苯基)氨基甲基蒽衍生物。
17、根据权利要求16的方法，其中指示剂组分单体选自下述化合物：
9-[[N-甲基丙烯酰氨基丙基-N-(邻硼苄基)氨基]甲基]蒽；
9-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基-N-[2-(2-羟基乙氧基)-乙基氨基]甲基]蒽；
9-[N-(2-硼苄基)-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-(2-硼苄基)-N-[2-(2-羟基乙氧基)-乙基氨基]甲基]蒽；
9，10-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]蒽；
9，10-二[N-(2-硼苄基)-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)-丙基氨基]甲基]蒽；
9-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)乙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-羟基乙氧基)-乙基氨基]甲基]蒽；
9-[N-(2-硼苄基)-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)乙基氨基]甲基]-10-[N-(2-硼苄基)]-N-[2-(2-羟基乙氧基)-乙基氨基]甲基]蒽；
9，10-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)乙基氨基]甲基]蒽；
9，10-二[N-(2-硼苄基)-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)乙基氨基]甲基]蒽；
N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基-3，4-二羟基-9，10-二氧-2-蒽磺酰胺；
α，α′-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]-1，4-二甲苯；
以及它们的盐或衍生物。
18、根据权利要求14的方法，其中亲水性单体包括[3-(甲基丙烯酰氧基氨基)-丙基]三甲基氯化铵。
19、根据权利要求14的方法，其中指示剂组分单体选自镧系元素螯合物和多芳香烃。
20、根据权利要求14的方法，其中亲水性单体与指示剂组分单体的摩尔比大约为2∶1-1000∶1。
21、根据权利要求20的方法，其中亲水性单体与指示剂组分单体的摩尔比大约为5∶1-50∶1。
22、根据权利要求21的方法，其中亲水性单体与指示剂组分单体的摩尔比大约为5∶1。
23、根据权利要求14的方法，其中检测的分析物选自邻位二醇；α-羟基酸；β-酮酸；氧；二氧化碳；锌、钾、氢、或碳酸盐离子；毒素；无机物；和激素。
24、根据权利要求23的方法，其中检测的分析物选自含有糖类的邻位二醇。
25、根据权利要求24的方法，其中糖类是葡萄糖。
26、根据权利要求14的方法，其中：
i)亲水性单体与指示剂组分单体的摩尔比大约为2∶1-15∶1，
ii)指示剂组分单体含有N-(邻硼苄基)氨基]甲基]蒽衍生物，
iii)亲水性单体含有[3-(甲基丙烯酰氧基氨基)丙基]三甲基氯化铵，以及
iv)大分子具有激发物作用。
27、一种用于检测具有水环境的样品中分析物存在或浓度的方法，所述方法包括：
a)将样品暴露于指示剂大分子中，所述大分子含有下述组分的共
聚物
i)一种或多种指示剂组分单体，该单体单独不足以充分溶解在水中使之应用于用于检测所述分析物存在或浓度的水环境；和
ii)一种或多种亲水性单体；
结果使得所得大分子能够检测所述分析物在水环境中的存在或浓度，并且当所述大分子暴露于所述分析物中时，指示剂大分子具有依赖浓度方式变化的可检测出的量；和
b)测试所述可检测出的量的任何变化，由此确定所述分析物在所述样品中的存在或浓度。
28、根据权利要求27的方法，其中可检测得出的量是光学变化。
29、根据权利要求27的方法，其中指示剂组分单体包括N-(邻硼苄基)氨基甲基蒽衍生物。
30、根据权利要求29的方法，其中指示剂组分单体选自下述化合物：
9-[[N-甲基丙烯酰氨基丙基-N-(邻硼苄基)氨基]甲基]蒽；
9-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基-N-[2-(2-羟基乙氧基)-乙基氨基]甲基]蒽；
9-[N-(2-硼苄基)-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-(2-硼苄基)-N-[2-(2-羟基乙氧基)-乙基氨基]甲基]蒽；
9，10-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]蒽；
9，10-二[N-(2-硼苄基)-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)-丙基氨基]甲基蒽；
9-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)乙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-羟基乙氧基)-乙基氨基]甲基]蒽；
9-[N-(2-硼苄基)-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)乙基氨基]甲基]-10-[N-(2-硼苄基)]-N-[2-(2-羟基乙氧基)-乙基氨基]甲基]蒽；
9，10-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)乙基氨基]甲基]蒽；
9，10-二[N-(2-硼苄基)-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)乙基氨基]甲基]蒽；
N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基-3，4-二羟基-9，10-二氧-2-蒽磺酰胺；
α，α′-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]-1，4-二甲苯；
以及它们的盐或衍生物。
31、根据权利要求27的方法，其中亲水性单体包括[3-(甲基丙烯酰氧基氨基)-丙基]三甲基氯化铵。
32、根据权利要求27的方法，其中指示剂组分单体选自镧系元素螯合物和多芳香烃。
33、根据权利要求27的方法，其中亲水性单体与指示剂组分单体的摩尔比大约为2∶1-1000∶1。
34、根据权利要求33的方法，其中亲水性单体与指示剂组分单体的摩尔比大约为5∶1-50∶1。
35、根据权利要求34的方法，其中亲水性单体与指示剂组分单体的摩尔比大约为5∶1。
36、根据权利要求27的方法，其中检测的分析物选自糖类；氧；二氧化碳；和锌、钾、氢、或碳酸盐离子。
37、根据权利要求36的方法，其中检测的分析物是糖类。
38、根据权利要求37的方法，其中糖类是葡萄糖。
39、根据权利要求27的方法，其中：
i)亲水性单体与指示剂组分单体的摩尔比大约为2∶1-15∶1，
ii)指示剂组分单体含有N-(邻硼苄基)氨基]甲基]蒽衍生物，
iii)亲水性单体含有[3-(甲基丙烯酰氧基氨基)丙基]三甲基氯化铵，以及
iv)大分子具有激发物作用。
40、根据权利要求39的方法，其中所述大分子既用作指示剂又用作参照物。
41、一种能够表现出激发物作用的大分子，其包括下述单体的共聚物：
a)一种或多种形成激发物的单体，组成它的分子当彼此之间适当
地取向时能够表现出激发物作用；和
b)一种或多种其它单体；
结果使得所得大分子表现出所述的激发物作用。
42、根据权利要求41的大分子，其中大分子能够检测分析物的存在或浓度。
43、根据权利要求42的大分子，其中：
a)形成激发物的单体单独不足以充分溶解在水中使之应用于用于检测所述分析物存在或浓度的水环境；和
b)其它单体是亲水性单体；
结果使得大分子能够检测水环境中所述分析物的存在或浓度。
44、根据权利要求42的大分子，其中对于分析物存在或浓度的变化，激发物作用基本上不发生变化。
45、根据权利要求44的大分子，其中：
i)其它单体与形成激发物的单体之间的摩尔比大约为2∶1-15∶1，
ii)形成激发物的单体包括N-(邻硼苄基)氨基]甲基]蒽衍生物，
iii)其它单体包括[3-(甲基丙烯酰氧基氨基)丙基]三甲基氯化铵。
46、根据权利要求41的大分子，其中形成激发物的单体选自镧系元素螯合物和多芳香烃。
47、根据权利要求45的大分子，其中形成激发物的单体选自下述化合物：
9-[[N-甲基丙烯酰氨基丙基-N-(邻硼苄基)氨基]甲基]蒽；
9-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基-N-[2-(2-羟基乙氧基)-乙基氨基]甲基]蒽；
9-[N-(2-硼苄基)-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-(2-硼苄基)-N-[2-(2-羟基乙氧基)-乙基氨基]甲基]蒽；
9，10-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]蒽；
9，10-二[N-(2-硼苄基)-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)-丙基氨基]甲基]蒽；
9-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)乙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-羟基乙氧基)-乙基氨基]甲基]蒽；
9-[N-(2-硼苄基)-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)乙基氨基]甲基]-10-[N-(2-硼苄基)]-N-[2-(2-羟基乙氧基)-乙基氨基]甲基]蒽；
9，10-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)乙基氨基]甲基]蒽；
9，10-二[N-(2-硼苄基)-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)乙基氨基]甲基]蒽；
N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基]-3，4-二羟基-9，10-二氧-2-蒽磺酰胺；
α，α′-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]-1，4-二甲苯；
以及它们的盐或衍生物。
48、一种制备大分子的方法，所述大分子能够表现出激发物作用，所述方法包括共聚下述单体：
a)一种或多种形成激发物的单体，组成它的分子当彼此之间适当取向时能够表现出激发物作用；和
b)一种或多种其它单体；
结果使得所得大分子表现出所述的激发物作用。
49、根据权利要求48的方法，其中该大分子能够检测出分析物的存在或浓度。
50、根据权利要求49的方法，其中，
a)形成激发物的单体单独不足以充分溶解在水中使之应用于用于检测所述分析物存在或浓度的水环境；和
b)其它单体是亲水性单体；
结果使得大分子能够检测水环境中所述分析物的存在或浓度。
51、根据权利要求49的方法，其中对于分析物存在或浓度的变化，激发物作用基本上不发生变化。
52、根据权利要求51的方法，其中：
i)其它单体与形成激发物的单体之间的摩尔比大约为2∶1-15∶1，
ii)形成激发物的单体包括N-(邻硼苄基)氨基]甲基]蒽衍生物，
iii)其它单体包括[3-(甲基丙烯酰氧基氨基)丙基]三甲基氯化铵。
53、根据权利要求48的方法，其中形成激发物的单体选自镧系元素螯合物和多芳香烃。
54、根据权利要求52的方法，其中形成激发物的单体选自下述化合物：
9-[[N-甲基丙烯酰氨基丙基-N-(邻硼苄基)氨基]甲基]蒽；
9-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基-N-[2-(2-羟基乙氧基)-乙基氨基]甲基]蒽；
9-[N-(2-硼苄基)-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基]-10-[N-(2-硼苄基)-N-[2-(2-羟基乙氧基)-乙基氨基]甲基]蒽；
9，10-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]甲基蒽；
9，10-二[N-(2-硼苄基)-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)-丙基氨基]甲基]蒽；
9-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)乙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-羟基乙氧基)-乙基氨基]甲基]蒽；
9-[N-(2-硼苄基)-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)乙基氨基]甲基]-10-[N-(2-硼苄基)]-N-[2-(2-羟基乙氧基)-乙基氨基]甲基]蒽；
9，10-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)乙基氨基]甲基]蒽；
9，10-二[N-(2-硼苄基)-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)乙基氨基]甲基]蒽；
N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基]-3，4-二羟基-9，10-二氧-2-蒽磺酰胺；
α，α′-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基氨基]-1，4-二甲苯；
以及它们的盐或衍生物。
55、一种用于检测分析物在样品中的存在或浓度的方法，所述方
法包括：
a)将样品暴露于指示剂大分子中，所述大分子含有下述组分的
共聚物
i)一种或多种指示剂组分单体，组成它的分子当彼此之间适当取向时能够表现出激发物作用，并且它还能够用于检测分析物的存在或浓度；和
ii)一种或多种其它单体；
结果使得所得大分子表现出激发物作用，并且当所述大分子暴露于所述分析物中时，指示剂大分子具有依赖浓度方式变化的可检测出的量；和
b)测试所述可检测出的量的任何变化，由此确定所述分析物在所述样品中的存在或浓度。
56、根据权利要求55的方法，其中对于分析物存在或浓度的任何变化，激发物作用基本上不发生变化。
57、根据权利要求56的方法，其中
i)其它单体与指示剂组分单体之间的摩尔比大约为2∶1-15∶1，
ii)指示剂组分单体包括N-(邻硼苄基)氨基]甲基]蒽衍生物，
iii)其它单体包括[3-(甲基丙烯酰氧基氨基)丙基]三甲基氯化铵。
58、根据权利要求55的方法，其中指示剂组分单体选自镧系元素螯合物和多芳香烃。
59、根据权利要求57的方法，其中指示剂组分单体选自下述化合物：
9-[[N-甲基丙烯酰氨基丙基-N-(邻硼苄基)氨基]甲基]蒽；
9-[N-(2-硼苄基)-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)-丙基氨基]甲基]-10-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-羟基乙氧基)-乙基氨基]甲基]蒽；
9-[N-(2-硼苄基)-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)乙基氨基]甲基]-10-[N-(2-硼苄基)]-N-[2-(2-羟基乙氧基)-乙基氨基]甲基]蒽；和
9，10-二[N-(2-硼苄基)-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)乙基氨基]甲基]蒽；
以及它们的盐或衍生物。
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