CN1420775A - 鉴定及使用a2b腺苷受体拮抗剂介导哺乳动物细胞增殖的方法 - Google Patents

鉴定及使用a2b腺苷受体拮抗剂介导哺乳动物细胞增殖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及鉴定A2B腺苷受体激动剂和拮抗剂的方法，以及使用A2B腺苷受体拮抗剂治疗由A2B腺苷受体介导的细胞增殖疾病的方法。

Description

鉴定及使用A2B腺苷受体拮抗剂介导哺乳动物细胞增殖的方法
                         发明背景
本申请要求在美国专利局申请号为60/183141专利申请的申请日为优先权日，所述申请的申请日为在2000年2月17日，题述申请的说明书在此作为参考。
(1)发明领域
本发明涉及鉴定A2B腺苷受体激动剂和拮抗剂的方法，及使用A2B腺苷受体拮抗剂治疗由A2B腺苷受体介导的细胞增殖疾病的方法。
(2)背景技术
腺苷是由含氧量低的组织释放的，且被认为是一种血管生成因子，其连接由O2剥夺引起的细胞代谢的改变及代偿性的血管生成。腺苷可与G蛋白-偶联受体的四个亚型A1，A2A，A2B及A3结合。所述核苷腺苷涉及血管生成。特别是，已经证实了A2B腺苷受体(AdoR)的腺苷活化增加了人视网膜内皮细胞(HREC)中cAMP的积聚，细胞的增殖及血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达。以前曾经报导过A2BAdoR的活化增加了人视网膜内皮细胞(HREC)中血管内皮细胞生长因子(VEGF)mRNA和蛋白的表达。腺苷和VEGF对于体外视网膜内皮细胞的增殖和毛细血管的形态发生还具有协同作用。
视网膜的微血管异常，如视网膜病或早熟，黄斑变性及糖尿病性的视网膜病是非-创伤性失明的主要原因。这些疾病的特点在于由局部出血损伤视网膜血管而引起的新血管形成，即，代偿性的血管生成。因而治疗这些疾病的其中一个可能的疗法是抑制新血管形成。
                        本发明简述
本发明的一个实施方案是抑制表达A2B腺苷受体的哺乳动物细胞增殖的方法，包括给予哺乳动物治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。
本发明的另一个实施方案是测定化合物以确定它们是否是A2B腺苷受体拮抗剂或A2B腺苷受体激动剂的方法。该方法包括制备人视网膜内皮细胞的第一和第二份样品；将所要测试的化合物加入到人视网膜内皮细胞的第一份样品中，并使该化合物与人视网膜内皮细胞的第一份样品持续接触一定的时间；并比较在第一份样品中生长的新细胞数和在第二份样品中生长的新细胞数。
在另一个实施方案中，本发明包括通过本发明方法鉴定的A2B腺苷受体激动剂或拮抗剂化合物。
                       附图简要说明
图1A是NECA(10μmol/L)诱导的HREC增殖的时间曲线，NECA的增殖作用可被A2B-特异性拮抗剂3-N-丙基黄嘌呤(10μmol/L)或JW-V1-08(10μmol/L)完全阻断；
图1B是与未受刺激的细胞(MEM，基本培养基)相对照，NECA诱导的HREC迁移率浓度依赖性增加的曲线图，NECA-诱导的增殖和迁移率与未受刺激的细胞相比具有显著性的差异(p＜0.05，ANOVA)；
图2A，2B，2C和2D是在Matrigel上，内皮细胞毛细血管形成的显微照片。所有显微照片均是在第48小时拍摄的。未受刺激的对照细胞(4A)在48小时的时候显示出某些毛细血管的形成。在NECA作用48小时的时候，有大量毛细血管生成(4B)。与之相比，10μmol/L的A2B选择性拮抗剂JW-V1-08(4C)和10μmol/L的A2B选择性拮抗剂3-N-丙基黄嘌呤(4D)均减少了NECA诱导的毛细血管的生成。所有显微照片均是从来源于三个独立供体的细胞观察到的典型结果。
                         缩略语概述
HREC-      人视网膜内皮细胞
AdoR-      腺苷受体
NECA-      5’-N-乙基羧酰胺-腺苷
ADA-       腺苷脱氨基酶
JW-V1-08-  3-异丁基-8-吡咯烷黄嘌呤
LDL-       低密度脂蛋白
SFM-       无血清培养基
VEGF-      血管内皮生长因子
                     本发明的具体描述
本发明涉及鉴定有效的A2B腺苷受体拮抗剂的方法。本发明还包括通过本发明方法鉴定的A2B腺苷受体拮抗剂及使用A2B腺苷受体拮抗剂抑制哺乳动物细胞增殖的方法。
本发明的其中一个方面是筛选和鉴定化合物的方法，该化合物是指A2B腺苷受体激动剂和拮抗剂。由本发明方法鉴定的化合物可包括有机化合物，无机化合物，寡核苷酸，反义寡核苷酸，核酶，蛋白，酶，抗体和其它经得起本发明筛选方法评估检验的化合物或组合物。
用于评估本发明有效的A2B腺苷受体拮抗剂或激动剂化合物的其中一个方法是体外测定法，即测量化合物促进或抑制人视网膜内皮细胞(HREC)生长的能力。该测定法在实施例1中详细描述。化合物是利用测定法，通过对暴露于所讨论化合物中的人视网膜内皮细胞的生长及在标准溶液中或在有标准化合物存在的情况下，人视网膜内皮细胞的生长进行比较来筛选的。与标准品相比，刺激人视网膜内皮细胞生长的化合物是A2B腺苷受体激动剂，而与标准品相比，抑制人视网膜内皮细胞生长的化合物是A2B腺苷受体拮抗剂。
用于鉴定A2B腺苷受体拮抗剂和激动剂的第二个测定法是小鼠体内测定法。在小鼠模型中，使1星期大的C57BL/6J小鼠暴露于75％的氧中5天，然后使其暴露于室内空气中。在返回到标准氧条件后5天，小鼠产生可以计量的视网膜新血管丛。所述化合物是按照筛选方法，通过腹膜内(IP)给予小鼠所讨论的化合物，然后对处理过的小鼠眼睛中新血管丛的数量及未治疗的小鼠眼睛中新血管丛的数量进行比较而评估的。体内抑制新血管丛生长的化合物是A2B腺苷受体拮抗剂。
本发明的另一个重要方面是发现了A2B腺苷受体拮抗剂可用于治疗哺乳动物的细胞增殖疾病。这种疾病包括，但不局限于血管内皮细胞增殖，癌症，再狭窄，宿主移植排斥，痛风，普通的炎症反应，及其它增殖疾病。
我们已经发现A2B腺苷受体拮抗剂特别适用于抑制血管内皮细胞的生长，所述血管内皮细胞包括但不局限于冠状内皮细胞，来源于血管床的内皮细胞，肿瘤内皮细胞，视网膜内皮细胞，真皮内皮细胞等。本发明优选的方法包括治疗与视网膜内皮细胞增殖(异常的新血管形成)有关的疾病，如糖尿病性的视网膜病及早熟的视网膜病。所用A2B腺苷受体拮抗剂可以是非选择性的A2B腺苷受体拮抗剂，也可以是选择性的A2B腺苷受体拮抗剂或可包括A2B腺苷受体拮抗剂的组合。
本发明利用A2B腺苷受体拮抗剂抑制细胞增殖，特别是抑制内皮细胞增殖的方法适用于任何一种哺乳动物。然而，优选本发明的方法用于治疗人。本发明的方法是使用有效药物剂量的一种或多种化合物进行的，该化合物是指A2B腺苷受体拮抗剂。根据它们的预计用途，该组合物可以是固体，半固体或液体的给药剂型，例如，可以是片剂，栓剂，丸剂，胶囊剂，粉剂，液体制剂，混悬剂，气体，滴剂，膏剂等。优选的一类给药剂型是可以精确剂量口服给药的固体，半固体或液体等给药形式。该组合物可包括一种或多种常规的药物赋形剂，及至少一种本发明的活性化合物或其药学上可接受的盐，此外，还可包括其它医学试剂，药学试剂，载体，辅剂，稀释剂等。
对于固体组合物而言，所用常规的无毒固体包括，例如药物级的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，滑石粉，纤维素，葡萄糖，蔗糖，碳酸镁等。使用聚亚烷基二醇，例如丙二醇作为载体，可将上述活性化合物配制成栓剂。通过在赋形剂，如水，生理盐水，含水葡萄糖，甘油，乙醇等中溶解，分散上述活性化合物及可选择的药用辅剂，可制备液态的可服用的药物组合物，并由此形成溶液或混悬液。如果需要，所服用的药学组合物还可包括少量无毒的辅助物质，如湿润剂或乳化剂，pH缓冲剂等，例如醋酸钠，脱水山梨糖醇单月桂酸酯，三乙醇胺醋酸钠，油酸三乙醇胺等。制备这种给药形式的现行方法是已知的，或对于本领域的那些技术人员而言是显而易见的；例如，见Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，15th Edition，1975。无论如何，所给予的组合物或制剂均应包括一些有效治疗剂量的，即对减轻所治疗患者症状有效量的活性化合物。对于口服给药而言，药学上可接受的非-毒性组合物是通过掺入任何一种常规使用的赋形剂，如药物级的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，滑石粉，纤维素，葡萄糖，蔗糖，碳酸镁等制备的。这些组合物可采取溶液，混悬液，片剂，丸剂，胶囊剂，粉剂，缓释制剂等形式。这些组合物可包含10％-95％，优选1-70％的活性成分。
通常，非肠道给药的特点是可经皮下，肌内，或静脉内注射给药。可注射的制剂可被制成常规的剂型，如液态的溶液或混悬液，适于在注射前制成液态或混悬液的固体剂型，或乳浊液。适宜的赋形剂是，如水，生理盐水，葡萄糖，甘油，乙醇等。此外，如果需要，所服用的药物组合物还可包括少量无毒的辅助物质，如湿润剂或乳化剂，pH缓冲剂等，如醋酸钠，失水山梨糖醇单月桂酸酯，油酸三乙醇胺等。
当用于治疗视网膜内皮细胞时，可将本发明的组合物掺入到滴眼剂中，例如将一种或多种A2B腺苷受体拮抗剂与生理上适合的盐溶液或凝胶结合，然后将其直接用于正常基底上的眼睛中。
所服用活性化合物的剂量取决于所治疗的患者，患者的体重，疾病的严重程度，给药方式及处方医师的判断。然而，有效的给药剂量约为1微克-50毫克/kg/天。更优选，有效的给药剂量约为1微克/kg/天。既然此处所述化合物的许多作用均是通过相似的机理获得的，那么对于所有这些用途而言，所有给药剂量通常在相同的一般和优选范围内。
一般说来，A2B腺苷受体拮抗剂是用本发明的方法，以有效治疗剂量，即足以达到有效治疗的量给药的。所服用的活性化合物的量取决于所治疗的患者，患者的体重，疾病的严重程度，给药途径及处方医师的判断。此外，给药频率取决于给药方法，所治疗的疾病，及所治疗疾病的严重程度。例如，当治疗视网膜内皮细胞疾病时，含有A2B腺苷受体拮抗剂的滴眼剂可按照每天1-6次有规律的时间表，甚至更频繁地给药。
将A2B腺苷受体拮抗剂给予哺乳动物，从而治疗细胞增殖疾病的方法不局限于上述公开的那些方法，其广泛地包括本领域已知的，给予哺乳动物药学活性化合物和治疗剂的任何一种方法。
本发明的范围还包括通过其它已知的药学给药途径，包括但不局限于，通过大丸药，静脉内，透皮，吸入，皮下，口服，非肠道，鼻饲，滴眼剂，使用微型泵的方法，或通过本领域技术人员已知的，任何其它的治疗剂给药方法或途径给予哺乳动物，优选给予人本发明的一种或多种化合物。
                         实施例1
在本实施例中，我们通过检测选择性A2B AdoR拮抗剂对AdoR-介导的HREC增殖，毛细血管的形成及信号转到途径的作用而评估了A2B的是通过受体的途径发挥作用的。
方法概述：在没有或有AdoR拮抗剂存在的情况下，使HREC暴露于腺苷类似物5’-N-乙基羧酰胺-腺苷(NECA)中。利用Boyden室测量迁移率。通过计数来测定增殖。AdoR活化对毛细血管生成的作用是利用Matrigel上细胞的生长来研究的。材料和方法细胞培养
按照前述的方法制备HREC的原代培养细胞并维持其生长。，将第3-6代的细胞用于这些研究。培养中内皮细胞的鉴定是利用流式细胞仪检测内皮细胞中荧光标记的乙酰化LDL的掺入情况确定的，。为了保持HREC的纯净，采取了许多预防性的步骤。HREC是在来源于血浆的血清中生长的，其没有血小板衍生的生长因子，且不会促进外膜细胞(这类制备方法中的污染细胞类型)的生长。此外，在细胞传代前，使胰蛋白酶消化HREC的时间仅为45秒。在此短暂的胰蛋白酶消化过程中，内皮细胞漂浮下来，而外膜细胞仍然贴附在底物上。增殖的测定
在24孔平板中以10个细胞/cm接种HREC，过夜，使其贴壁。用Hank’s平衡盐溶液洗涤该细胞，并用没有血清和生长补给物的培养基(SFM)替换原来使用的培养基继续培养24小时，以诱导细胞周期停滞。再次洗涤该细胞，并用1U/mL的腺苷脱氨基酶(ADA)预处理30分钟。在有或没有3-N-丙基黄嘌呤(10μmol/L)或JW-V1-08(10μmol/L)存在的情况下，使细胞暴露于NECA(10μmol/L)中，相对于A2B受体，其显示出比其它有效的拮抗剂更大的选择性。对照组是暴露于SFM或标准生长培养基中的HREC。在接下来的3天，以24-小时的间隔用胰蛋白酶处理复制孔，收集细胞，并用Coulter Counter计数。一式三份，在三个独立的试验中，使用各试验所需的，来源于不同供体的细胞检测各种情况。趋化性
如前所述(Neuroprobe，Inc，Bethesda，MD)，在避光良好的趋化性室中测量内皮细胞的趋化性。简单地说，制备内皮细胞的单细胞悬液(3.0×10个细胞/孔)，并用ADA(1U/mL)处理。在所述避光良好的趋化室下层的48个孔中每孔加入30微升上述细胞悬液。用多孔的(5μm直径的孔)，且没有聚乙烯和吡咯烷酮的多聚碳酸酯膜(Nucleopore，Pleasanton，CA)覆盖所述细胞孔，用0.1％的真皮胶原包被。倒置趋化室2小时使所述细胞附着在膜上。然后垂直放置该室，并使其单独暴露于50μL体积的NECA(10μmol/L)中，或使其暴露于与3-N-丙基黄嘌呤结合或与JW-V1-08(10μmol/L)结合或与非选择性的AdoR拮抗剂黄嘌呤胺同源物(XAC，10μmol/L)结合的50μL体积的NECA(10μmol/L)，中。培养12小时后，回收该膜，并将附着细胞一侧膜上的细胞刮下来。剩余的细胞，即已经通过孔迁移的那些，用甲醇固定，并用改良的瑞氏染液染色，然后用苏木精和曙红复染。阳性对照是10％的胎牛血清，阴性对照是1％的ablumin。应答刺激物时，细胞迁移做为对刺激的一种反应，其非—定向增加的化学增活现象是通过将等浓度的NECA或NECA加一种拮抗剂加入到下层和上层的室中测量的。处理情况是一式三份，在三个单独的试验中检测的。Matrigel测定
内皮毛细血管的生成是在Matrigel上评估的。简单地说，融解Matrigel并在4℃保持。将多孔平板和移液枪枪头冷冻至-20℃，并将Matrigel(125μL)加入到48-孔板的各个孔中，使其在37℃最少硬化1小时。37℃时，在0.25％胰蛋白酶-EDTA中消化HREC 2分钟使其分散，离心(300xg，5分钟)，并在无血清培养基中重悬浮。制备2X最终浓度的试验试剂(100μL)，每孔加入100μL。然后加入HREC(3×10，100μL/孔)，在37℃培养该平板。接种后48小时给孔照相。照相是对各孔的同一区域进行的，以使可能的改变达到最小，这种改变是由细胞沉降所引起的细胞密度的改变导致的。照片是数字化的，并使用图像分析软件(Scion Image)测量各孔中预先划定的相应区域中的总管长。所有情况均是一式三份，使用不同供体的细胞，在三个单独的试验中试验的。结果
NECA和AdoR拮抗剂对细胞增殖的作用
由细胞计数测量可知，NECA(10μmol/L)诱导的HREC增殖随时间而增加，暴露于标准生长培养基中3天，可达到约80％的细胞密度。所试验的两种选择性A2B AdoR拮抗剂，10μmol/L的3-N-丙基黄嘌呤和10μmol/L的JW-V1-08，可完全阻断NECA的增殖作用(图1A)。
NECA和AdoR拮抗剂对HREC迁移的作用
采用Boyden室测定法测量时可看出，NECA可诱导HREC的趋化性。NECA可浓度-依赖性的增加迁移率。NECA和选择性AdoR拮抗剂XAC的同时加入抵消了NECA诱导的HREC迁移率增加。同样，NECA与选择性A2B拮抗剂JW-V1-08或3-N-丙基黄嘌呤的共同加入也拮抗了NECA对趋化性的诱导作用(图1B)。NECA单独或与AdoR拮抗剂结合使用时，均不会诱导趋化性。
NECA对内皮细胞毛细血管生成的作用
图4表示在没有或有NECA单独存在，或NECA与AdoR拮抗剂相结合的情况下，Matrigel上，内皮细胞毛细血管生成的典型显微照片。与未受刺激的对照细胞相比，一些毛细血管的生成在48小时后变得明显(图2A)。NECA(10μmol/L)处理使毛细血管的生成延伸(图2B)，这种延伸可由JW-V1-08抑制(图2C)。在第48小时的时候，3-N-丙基黄嘌呤(图2D)抑制了毛细血管的生成，导致少数血管的长度变短。
在数字化照片上，按照像素长测量总的血管长。与未处理的细胞相比，NECA将管长增加了2倍以上(分别为74.2±2.4对35.7±1.6，p＜0.01)。3-N-丙基黄嘌呤或JW-V1-08的加入，减少但未完全抵消NECA-诱导的管长增加(分别为53.7±0.9和66±1.2，p＜0.01)。
结论：
NECA对增殖的浓度-依赖性诱导可由选择性的A2B AdoR拮抗剂3-N-丙基黄嘌呤和JW-V1-08所抑制。NECA可浓度-依赖性的诱导趋化作用。两种拮抗剂均可阻断NECA对迁移率的作用。NECA增加了Matrigel上毛细血管的生成，而两种A2B选择性拮抗剂均减弱了这种作用。
上述结果表明选择性的A2B AdoR拮抗剂抑制了NECA-诱导的增殖，迁移率增加和毛细血管生成。对A2B AdoR的抑制为抑制血管生成，特别是视网膜的血管生成提供了一条新的途径，为治疗与异常的新血管生成，如糖尿病性的视网膜病和早熟的视网膜病等相关疾病的治疗提供了一种新的方法。
实施例1的结果还表明腺苷类似物NECA可刺激与血管生成有关的重要步骤。NECA诱导了细胞的迁移(通过Boyden室测定法评估)和毛细血管的生成(通过Matrigel测定法评估)。NECA还诱导了与细胞存活和细胞增殖相关的信号级联反应。我们所使用的选择性A2B拮抗剂减弱或消除了这些作用。这些结果说明选择性的腺苷A2B AdoR拮抗剂可减弱在糖尿病性的视网膜病中见到的导致异常血管形成的细胞增殖。因此，A2B AdoR拮抗剂代表了一种新的，减轻异常的视网膜新血管反应的治疗方法。

Claims (18)

1.一种抑制表达A2B腺苷受体的哺乳动物细胞增殖的方法，包括给予哺乳动物治疗有效量的A2B腺苷受体拮抗剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中表达A2B腺苷受体的细胞是血管内皮细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其中表达A2B腺苷受体的血管内皮细胞选自冠状血管的内皮细胞，及来源于血管床的内皮细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述血管床内皮细胞选自肿瘤内皮细胞，视网膜内皮细胞，真皮内皮细胞，及脑内皮细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述内皮细胞是视网膜内皮细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述A2B腺苷受体拮抗剂可抑制血管内皮细胞生长因子的表达。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述A2B腺苷受体拮抗剂是一种A2B腺苷受体的反义寡核苷酸。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述A2B腺苷受体拮抗剂是一种A2B-特异性核酶。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述A2B腺苷受体拮抗剂是一种非选择性的腺苷受体拮抗剂。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述A2B腺苷受体拮抗剂是一种选择性的A2B腺苷受体拮抗剂。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述A2B腺苷受体拮抗剂是以约1微克/kg-50毫克/kg的剂量给药的。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述A2B腺苷受体拮抗剂是以约1微克/kg-10毫克/kg的剂量给药的。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述A2B腺苷受体拮抗剂是通过口服，鼻饲，透皮，大丸剂，静脉内，滴眼剂，吸入，及使用微型泵的方式给药的。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述A2B腺苷受体激动剂是以滴眼剂的方式给药的。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
16.一种确定化合物是否是A2B腺苷受体拮抗剂或A2B腺苷受体激动剂的方法，包括下列步骤：
a.制备人视网膜内皮细胞的第一和第二份样品；
b.将所要测试的化合物加入到人视网膜内皮细胞的第一份样品中，并使该化合物与人视网膜内皮细胞的第一份样品持续接触一定的时间；并
c.比较在第一份样品中生长的新细胞数和在第二份样品中生长的新细胞数。
17.一种通过权利要求16的方法鉴定的A2B腺苷受体拮抗剂化合物，其中所述化合物使得在第一份样品中生长的新细胞少于在第二份样品中生长的新细胞。
18.一种通过权利要求16的方法鉴定的A2B腺苷受体激动剂化合物，其中所述化合物使得在第一份样品中生长的新细胞多于在第二份样品中生长的新细胞。
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