CN1402788A - 纤维蛋白溶解活性多肽 - Google Patents

Abstract

描述了一种可用于体内血凝块溶解的纤维蛋白溶解活性金属蛋白酶多肽(称为“新型作用血栓溶解性剂”)，及通过重组表达生产所述多肽的方法和材料。

Description

纤维蛋白溶解活性多肽

                       发明领域

本发明涉及一种具有非天然存在序列的纤维蛋白溶解活性金属蛋白酶及其生产的组合方法，和其在体内治疗血栓形成方面的应用。

                       发明背景

fibrolase是一种由203个氨基酸残基组成的酶活性多肽(具体地说，是一种金属蛋白酶)，该酶最初是由南方铜头蛇(SouthernCopperhead snake)的毒液纯化分离的；1986年9月9日授予的美国专利第4,610,879号(Markland等)；和Guan等，Archives of Biochemistryand Biophysics，第289卷，第2期，第197-207页(1991)。此酶显示出直接的纤维蛋白溶解活性、而极少或没有出血活性。它溶解或者由纤维蛋白原构成的血凝块或者由全血构成的血凝块。

也已经测定了fibrolase的氨基酸序列，也有关于其酵母重组生产方法的描述和其在体内治疗血栓形成性病症的应用；Randolph等，Protein Science，Cambridge University Press(1992)，第590-600页，和于1989年7月12日公布的欧洲专利申请第0 323 722号(Valenzuela等)。

                       发明概要

本发明提供了一种纤维蛋白溶解性金属蛋白酶，该蛋白酶具有SEQ ID NO：1中所示的非天然存在的线性排列的氨基酸，在此也称为“新型作用血栓溶解性剂(novel acting thrombolytic)”(或“NAT”)。也提供了编码NAT的核酸分子(诸如SEQ ID NO：2之一)及其变异体。

“成熟”一词以其通常含义使用，是指在宿主细胞内进行了原位的酶加工、从前原区切割下生物活性多肽。

NAT因其具有纤维蛋白溶解活性，用作血凝块的体内溶解剂，来治疗哺乳动物(包括大鼠、猪和人类)的血栓形成。

本发明所述NAT多肽作为治疗剂，提供优于天然存在的fibrolase(即在蛇毒中发现的纤维蛋白溶解性多肽)的优势。已知天然fibrolase含有几种可变的N-末端：QQRFP、EQRFP和ERFP(其中“E”表示环化谷氨酰胺或焦谷氨酸)。更具体地说，从由QQRFP组成的N-末端开始，所述fibrolase分子经过降解，产生分别具有EQRFP和ERFP的N-末端序列的两个同种型。由酵母产生的重组fibrolase一般产生所有这3种形式的混合物，因而是不均一的。参见Loayza等，Journal ofChromatography，B 662，第227-243页(1994)。此外，所述环化谷氨酰胺残基导致N-末端被封闭，这使得不可能进行测序。

相反，本发明所述重组NAT提供单一的种类：一般仅产生一种N末端。其结果是，终产物与重组fibrolase相比更均一，这在医学应用是计划的最终用途时是很有益的。

                       附图简述

图1以线性方式显示NAT的完整氨基酸序列(SEQ ID NO：3)，所述氨基酸序列由前原区(下划线)和成熟多肽(无下划线)组成，在前原区中包括“信号”肽。

                       发明详述

NAT可通过在合适的宿主细胞中重组表达SEQ ID NO：4的核酸分子而产生，该核酸分子编码NAT的完整氨基酸序列(SEQ ID NO：3)，包括来自核苷酸1-783的前原区和来自核苷酸784-1386的成熟多肽。在表达后，所述前原区在宿主细胞中被酶加工切掉，产生成熟活性多肽(SEQ ID NO：1)。

NAT最好是由重组酵母产生，其原因在后面将会更详细地解释。

如此产生的成熟多肽(SEQ ID NO：1)可能有或没有氨基末端甲硫氨酸，这取决于其制备方式。一般来说，当所述多肽是由非分泌型细菌(如：大肠杆菌)菌株作为宿主重组产生时，就会有一个氨基末端甲硫氨酸残基。

除了SEQ ID NO：2的核酸分子外，编码相同多肽的其简并序列也可采用。本发明也包含可以在所述成熟多肽编码区5’或3’部分侧翼编码额外氨基酸残基的核酸分子，所述额外氨基酸残基诸如编码取代天然前/原区(即在天然存在的fibrolase上所发现的)的替代前/原区的序列(即负责通过细胞膜分泌所述多肽的序列)。所述额外序列也可以是非编码序列，包括转录或翻译的调节序列，例如启动子的，这取决于宿主细胞。

采用众所周知的重组DNA技术，可以制备NAT，所述重组DNA技术在以下文献中有描述：Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY(1989)和/或Ausubel等，编辑，Current Protocols in MolecularBiology，Green Publishers Inc.and Wiley and Sons，New York(1994)。可获得编码所述多肽或其截短形式的DNA分子，例如，通过筛选基因组文库或cDNA文库，或通过PCR扩增，来获得编码fibrolase的核酸分子，然后，用丝氨酸的密码子取代编码N-末端氨基酸残基QQR的密码子。另一方面，可通过用专业人士所熟知的方法化学合成，来制备编码NAT的DNA分子，所述方法例如为Engels等，Angew.Chem.Intl.Ed.，第28卷，第716-734页(1989)所述的方法。通常，所述DNA的长度会有几百个核苷酸。超过约一百个核苷酸的核酸可采用这些相同的技术，作为几个片段合成，再将所述片段连接起来，形成一个所需长度的核苷酸序列。

将所述DNA分子插入到合适的表达载体上，在合适的宿主细胞内表达。选择在所用的特定宿主细胞中具有功能的载体(即该载体与所述宿主细胞机制是相容的，使得可以发生所述DNA的表达)。所述多肽可以在原核、酵母、昆虫(杆状病毒系统)或真核宿主细胞中表达，其中优选酵母，其原因将在后面更详细地解释。

用于在任何宿主细胞中表达NAT的载体，也可含有一个5’侧翼序列(也称为“启动子”)和有效连接于待表达DNA上的其他表达调节元件、以及一个增强子、一个复制起点元件、一个转录终点元件、一个包含一个供体和受体剪接位点的完整的内含子序列、一个信号肽序列、一个核糖体结合位点元件、一个聚腺苷酸化序列、一个用于插入编码NAT的核酸序列的多接头区和一个选择性标记元件。这些元件中的每种在下面还要讨论的。

可任选的是，所述载体还包含一个“标记”序列，例如，位于所述多肽编码序列的5’或3’端、编码多聚组氨酸(如六聚组氨酸(hexaHis))或其他小的免疫原性序列(例如c-myc或血凝素表位，其抗体包括单克隆抗体已有市售)的寡核苷酸序列。这种标记将和NAT一起表达，可以用作从宿主细胞中纯化该多肽的一种亲和标记。可任选的是，该标记在其后可以采用不同方法，例如用选择性肽酶，从纯化的多肽中除去。

所述5’侧翼序列可以是天然的5’侧翼序列，或可以是同源的(即来源于与宿主细胞相同的物种和/或株系)、异源的(即来源于与宿主细胞不同的物种或株系)、杂种的(即来自不止一个来源的5’侧翼序列的组合)、或合成的。该5’侧翼序列的来源可以是任何单细胞原核生物或真核生物、任何脊椎动物或无脊椎动物、或任何植物，条件是该5’侧翼序列在所述宿主细胞中是有功能的，并且可被该宿主细胞的机制所活化。

所述复制起点元件通常是从市场上购来的原核表达载体的一部分，帮助载体在宿主细胞中扩增。在某些情况下，所述载体扩增到一定的拷贝数，对于NAT的最佳表达是很重要的。如果所选用的载体不含复制起点，则可以按照已知的序列化学合成复制起点，然后将其连接到该载体上。

所述转录终点元件通常位于所述多肽编码序列的3’端，其作用是终止mRNA的转录。通常，在原核细胞中的转录终止元件是一个富含G-C的片段，接着是一个多聚T序列。虽然该元件容易从文库中克隆得到，或者甚至作为载体的一部分从市场上购买到，但它也可以用已知的核酸合成方法容易地合成。

选择性标记基因元件编码在选择性培养基中生长的宿主细胞存活和生长所必需的蛋白质。通常，选择性标记基因编码的蛋白质：(a)使宿主细胞对抗生素或其他毒素具有抗性，所述抗生素或毒素例如对于原核宿主细胞为氨苄青霉素、四环素或卡那霉素，对于酵母宿主细胞为zeocin，对于哺乳动物宿主细胞为新霉素；(b)对该细胞的营养缺陷互补；或(c)提供复合培养基不能提供的关键营养物质。用于原核表达的优选选择性标记是卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。

所述核糖体结合元件通常叫做Shine-Dalgarno序列(对于原核生物而言)或Kozak序列(对于真核生物而言)，对mRNA的翻译起始是必需的。该元件通常位于启动子的3’端和待合成多肽编码序列的5’端。Shine-Dalgarno序列是各不相同的，但通常是多聚嘌呤(即A-G含量高)。许多Shine-Dalgarno序列已被鉴别，每种序列均可采用上面提到的方法容易地合成并用于原核载体中。Kozak序列通常包括紧接在起始密码子之前和之后的序列。优选的Kozak序列是与在AUG起始密码子高效翻译起始有关的序列。

在希望NAT多肽从宿主细胞内分泌出来的情况下，可采用一个信号序列，来指导该多肽从合成所述多肽的宿主细胞中分泌出来。通常，所述信号序列位于核酸序列的编码区中，或直接位于编码区的5’端。许多信号序列已被鉴定，可以使用它们中的在所选宿主细胞中有功能的任一种。因此，该信号序列可以与所述多肽是同源的或异源的。此外，该信号序列可以采用上面提到的方法来化学合成。

当所述载体构建好后，将一种核酸插入该载体的合适位点，制备好的载体可插入到合适的宿主细胞中进行扩增和/或多肽表达。

如上所述，宿主细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如酵母细胞、昆虫细胞或脊椎动物细胞)。该宿主细胞，无论是酵母还是某一其他宿主，当在合适条件下培养时都可以合成NAT，随后从培养基中收集NAT(如果该宿主细胞将其分泌至培养基中的话)，或直接从生产NAT的宿主细胞中收集(如果它不被分泌)。收集后，可以采用分子筛色谱、亲和色谱和类似方法纯化NAT多肽。

对宿主细胞的选择，在很大程度上取决于宿主细胞是否能将NAT“折叠”成它天然的二级和三级结构(例如，二硫桥合适的定向等)，从而使这些细胞制备出生物活性材料。但是，即使在宿主细胞不合成生物活性材料时，也可以在合成后，采用合适的化学条件，例如本领域技术人员已知的合适化学条件，对它进行“折叠”。在以上两种情况下，根据获得生物活性材料的事实，可以推断出进行了正确折叠。

合适的宿主细胞或细胞系可以是哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵细胞(CHO)或3T3细胞。合适的哺乳动物宿主细胞的选择以及转化、培养、扩增、筛选和产物生产、纯化的方法，是本领域人员已知的。其它合适的哺乳动物细胞系有猴COS-1和COS-7细胞系和CV-1细胞系。其它示范性哺乳动物宿主细胞包括灵长类细胞系和啮齿动物细胞系，包括已转化的细胞系。正常的二倍体细胞、来源于原代组织体外培养物的细胞株以及原代外植体也适用。候选细胞可以在选定的基因上是基因型缺陷的，或是包含一个显性作用选择基因。其它合适的哺乳动物细胞系包括但不限于HeLa细胞、小鼠L-929细胞、来源于Swiss的3T3细胞系、Balb-c或NIH小鼠、BHK或HaK仓鼠细胞系。

细菌细胞也可用作宿主细胞。例如，大肠杆菌的不同菌株(如，HB101、DH5a、DH10和MC1061)在生物技术领域是为人熟知的宿主细胞。也可采用枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、假单胞菌(Pseudomonasspp.)、其他芽孢杆菌(Bacillus spp.)、链霉菌(Streptomyces spp.)等的不同菌株。此外，本领域技术人员已知的酵母菌的许多菌株，也可作为宿主细胞，用来表达本发明所述多肽。此外，如有需要，昆虫细胞也可用作宿主细胞。例如，参见Miller等，Genetic Engineering，第8卷，第277-298页(1986)。

将所述载体插入(也称为“转化”或“转柒”)到选定的宿主细胞中，可以采用诸如磷酸钙、电穿孔、微注射、脂质体转染(lipofection)或DEAE-葡聚糖方法之类的方法来完成。所选方法将部分随所用宿主细胞类型而变化。这些方法和其他合适方法对技术人员来说是熟知的，例如在Sambrook等的上述文献中有叙述。

可以用本领域技术人员所熟知的标准培养基，培养含所述载体的宿主细胞。所述培养基通常含有所述细胞生长和存活所必需的全部营养。例如，培养大肠杆菌的合适培养基是Luria肉汤(LB)和/或Terrific肉汤(TB)。培养真核细胞的合适培养基是RPMI 1640、MEM、DMEM，所有这些培养基都可以根据培养的特定细胞系的需要，补充血清和/或生长因子。用于昆虫培养物的一种合适培养基是补充有yeastolate、乳清蛋白水解物和/或胎牛血清(如果必要时)的Grace培养基。

通常，将对转化细胞的选择性生长有用的一种抗生素或其他化合物作为补充物，添加到培养基中。所采用的化合物由转化宿主细胞的质粒上所存在的选择性标记元件决定。例如，当选择性标记元件是卡那霉素抗性时，加入到培养基中的化合物就是卡那霉素。

在宿主细胞产生的NAT的量，可以用本领域所知的标准方法来估计。此类方法包括但不限于蛋白质印迹分析、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、非变性凝胶电泳、高效液相色谱分离、免疫沉淀和/或活性分析，诸如DNA结合凝胶阻滞分析(DNA binding gel shift assays)。

如果NAT是从非革兰氏阴性细菌的宿主细胞中分泌的，那么其大部分都会存在于细胞培养基中。如果NAT是革兰氏阴性菌分泌的，则NAT将在一定程度上存在于细胞周质中。如果NAT是非分泌型的，则将存在于细胞质中。

对胞内NAT来说，通常先要对所述宿主细胞进行机械破碎。对位于细胞周质的NAT，可用机械破碎或渗透压处理，使细胞周质的内容物释放到缓冲液中。然后，从该溶液中分离NAT多肽。再用各种技术，从溶液中进行纯化。如果合成NAT，使得在羧基末端或氨基末端带有一个标记(诸如六聚组氨酸，或其他小肽)，那么使溶液通过其中亲和柱基质对所述标记或直接对所述多肽具有高度亲和力(即单克隆抗体)的亲和柱，可能基本上以一步法纯化NAT。例如，多聚组氨酸以高度亲和性和特异性与镍结合，因此可用镍亲和柱(诸如Qiagen镍柱)来进行纯化(参见例如Ausubel等，编辑，Current Protocols in MolecularBiology，同上)。

另一方面，当所述多肽没有标记并且没有抗体可用时，可采用其它已知的纯化方法。该类方法包括但不限于离子交换色谱、分子筛色谱、反向色谱、高效液相色谱、非变性凝胶电泳结合凝胶洗脱和制备性等电聚焦(“Isoprime”设备/技术，Hoefer Scientific)。在某些情况下，可以结合两种或更多种这些技术以达到提高纯度。

尤其优选采用酵母细胞生产NAT，最优选称为毕赤酵母属(如：巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))的酵母属，因为比起例如细菌细胞(如大肠杆菌)来说，毕赤酵母重折叠的效率更高。用于所述酵母菌株的合适的重组表达方法在美国专利第4,855,231(Stroman等)、4,812,405(Lair等)、4,818,700(Cregg等)、4,885,242(Cregg)和4,837,148号(Cregg)中有描述，所述专利的说明书通过引用结合到本文中。

值得注意的是，毕赤酵母属细胞也可用于表达fibrolase，其表达效果与从编码该金属蛋白酶的DNA分子表达的效果相近，这样一种方法构成了本发明的另一方面。fibrolase是已知的金属蛋白酶，在科学文献及专利文献中已有描述，参见以上引用的Randolph等，和欧洲专利申请第0323722号。通常，待表达的fibrolase是具有SEQ ID NO：5的fibrolase，它由SEQ ID NO：6的cDNA分子(或编码同样氨基酸序列的变异体)编码。在这种系统中表达fibrolase，一般涉及SEQ ID NO：7的DNA分子，该DNA分子除了编码“成熟”多肽(核苷酸784-1392)外，还编码“前原”序列(核苷酸1-783)，。

其中所述多肽连接到聚合物或其他分子上、形成衍生物以修饰其特性的NAT的化学修饰形式，也包含在本发明的范围中。采用一定方法，将一个或多个其它化学部分连接到所述多肽部分上将NAT衍生化，尤其对于人类治疗目的可能是有利的。这样的化学部分可以从不同的水溶性聚合物中选取。该聚合物应为水溶性的，这样使得与之相连的所述NAT多肽在水性环境里(如在生理环境里)是可混溶的。水溶性聚合物可从以下组成的一组聚合物中选取：例如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酐共聚物、聚氨基酸(或者是均聚物，或者是随机或非随机共聚物(进一步参见下面关于融合分子的描述))、和葡聚糖或聚(乙烯吡咯烷酮)聚丙二醇、丙二醇均0聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚苯乙烯马来酸酯和聚乙烯醇。聚乙二醇丙醛因其在水中的稳定性，而在生产中有优势。

所述聚合物可以具有任何分子量，可以是分支或不分支的。对聚乙二醇而言，优选的分子量是在约2千道尔顿(kDa)和约100kDa之间(“约”一词指在聚乙二醇的制备中，有些分子量比声称的分子量要大，有的则要小)，便于处理和生产。其他大小也可采用，这取决于所需的治疗模式(例如，所需的持续释放的持续时间、对生物活性的影响(如果有的话)、操作的容易性、免疫原性的有无和大小以及聚乙二醇对治疗蛋白的其他已知的影响)。

如此连接的聚合物分子的数目可以不同，本领域专业人士能够确定其对功能的影响。可以用相同或不同的化学部分(如聚合物，诸如不同重量的聚乙二醇)，进行一衍生化、或可以提供二衍生化、三衍生化、四衍生化或某些组合衍生化。聚合物分子与NAT多肽分子的比例也是各不相同的，它们在反应混合物中的浓度也是不同的。一般来说，最佳比例(就反应效率而论，在反应中没有过量的未反应的多肽和聚合物)将由诸如所需衍生程度(一、二、三、四衍生化等)、所选聚合物的分子量、聚合物是否是分支结构和反应条件等的因素来决定。

将所述化学部分连接在NAT上，应考虑其对所述多肽的功能和抗原性结构域的影响。对本领域技术人员来说，有大量的连接方法可选用。例如，参见EP 0 401 384(将聚乙二醇偶联到G-CSF上)和Malik等，Experimental Hematology，第20卷，第1028-1035页(1992)(报道了用tresyl chloride对GM-CSF进行聚乙二醇(PEG)化)。作为说明，聚乙二醇可以通过反应基(诸如，游离氨基或羧基)与氨基酸残基共价结合。反应基是那些可与活化的聚乙二醇分子(或其他化学部团)结合的基团。具有一个游离氨基的氨基酸残基，可以包括赖氨酸残基和N末端氨基酸残基。具有一个游离羧基的氨基酸包括天冬氨酸残基、谷氨酸残基和C末端氨基酸残基。巯基也可用作连接所述聚乙二醇分子(或其他化学部分)的反应基。为了生产的目的，最好是连在氨基上，诸如在N-末端或在赖氨酸基团上。如果需要受体结合，则应避免连接那些对受体结合重要的残基。

可能特别需要N末端化学修饰的衍生物。以聚乙二醇为例，可以根据各种各样的聚乙二醇分子(根据分子量、分支等)、聚乙二醇与多肽分子在反应混合物的比例、待进行的聚乙二醇化的反应类型、以及获取所选N-末端聚乙二醇化NAT的方法进行选择。获得所述N末端聚乙二醇化制备物(即从其他单聚乙二醇化部分中分离所述部分，如果有必要的话)的方法，可以是从全体聚乙二醇化NAT分子中纯化N-末端聚乙二醇材料。选择性N末端化学修饰可以通过还原烷基化来完成，该方法利用了不同类型伯氨基(赖氨酸与N末端)的差别反应性。参见1996年4月25日公布的PCT申请WO 96/11953。在合适反应条件下，完成用含聚合物的羧基在N末端对NAT基本上选择性地衍生化。例如，通过在允许人们利用赖氨酸的ε氨基和所述多肽N末端残基的α氨基之间的pKa差异的pH下进行反应，可以对NAT进行选择性的N末端PEG化。通过这样的选择性衍生，控制聚合物与所述多肽的连接：聚合物的结合主要发生在所述多肽的N末端，而没有其他反应基如赖氨酸的侧链氨基的显著修饰。用还原烷基化，聚合物可以是如上所述的类型，而且应有单个反应性的醛，用于与所述多肽偶联。可以采用含一个反应性醛基的聚乙二醇丙醛。

按照本发明的NAT或化学修饰衍生物，可以配制用于体内给药，最优选通过血栓内给药(即通过直接局部传递至血管中的血凝块处，例如通过导管)。系统传递通常不是优选的方法，因为全身循环中先天的α2巨球蛋白可能与NAT复合，阻止其与纤维蛋白或纤维蛋白原相互作用，从而消弱血凝块的溶解。然而，可能有这样的情况：可以采用大量的NAT，超过α2巨球蛋白的循环水平，从而使得能够系统给药和传递。一般来说，本发明包括药用组合物，所述药用组合物包含有效量的NAT以及药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、辅助剂和/或载体。“有效量”是指足以产生可测量生物学效应的量(即实现溶解所治疗的一个或多个血凝块的血栓溶解有效量)。

通常，NAT将是高度纯化的形式，而且，用作传递溶媒的任何药用组合物通常都将预先灭菌待用，如通过无菌滤膜过滤。

本领域技术人员将能够通过给药和观察所需的治疗效果，确定有效剂量。在此范围内的具体有效剂量，将取决于所治疗的具体疾病或病症，以及接受者的年龄和一般健康状况，并且可以用标准临床程序来决定。如可能的话，最好是先在生物测定系统中体外测定该药用组合物的剂量-反应曲线，然后在有用的动物模型系统体内测定该药用组合物的剂量-反应曲线，继而在人体中进行试验。有经验的医师考虑到治疗背景、治疗中的疾病类型和其他合适的因素，无需过多的努力，就能够确定合适的剂量。通常，医师将给予所述NAT组合物，直到达到获得预期效果(即血凝块溶解)的剂量。所述组合物可以作为一剂给予，或在规定时间内作为两剂或更多剂(它们可以含有等量或不等量的多肽)给予，或在连续的基础上给予。

也可按标准方法用NAT来产生抗体。这些抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、单链抗体和/或双特异性抗体等等。为了提高产生免疫应答的可能性，可以分析NAT的氨基酸序列，以鉴定可能与免疫原性增加有关的分子部分。例如，可以对所述氨基酸序列进行计算机分析，以鉴定表面表位，诸如按照Hope和Woods，Proceedings of the National Academy of Science USA，第78卷，第3824-3828页(1981)所述方法来进行。

可以采用本领域已知的各种程序，产生识别NAT表位的多克隆抗体。为了产生抗体，可通过注射所述多肽，免疫各种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等。可以用各种佐剂增强免疫应答，这取决于宿主种类，所述佐剂包括但不限于弗氏佐剂、矿物凝胶例如氢氧化铝(明矾)、表面活性物质如溶血卵磷脂、多聚醇(pluronic polyols)、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚、和潜在有用的人用佐剂，如卡介苗和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。

关于针对NAT的单克隆抗体的制备，任何利用连续细胞系培养来生产抗原分子的技术均可采用。例如，最初由Kohler和Milstein开发的杂交瘤技术(其描述见Nature，第256卷，第495-497页(1975))以及人类B细胞杂交瘤技术-trioma技术(描述见Kozbor等，ImmunologyToday，第4卷，第72页(1983))和用来生产单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(描述见Cole等，“Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”，Alan R.Liss，Inc.，第77-96页(1985))，均可用于按照本发明制备单克隆抗体。

可以在治疗上应用本发明的抗体，诸如以便在给药后在体内与NAT结合，并因此中和或抑制过量的NAT。所述抗体还可用于诊断目的，诸如按已知的诊断方法，以标记的形式用来检测体液、组织样品或其他提取物中NAT的存在。

                     具体实施方案的描述

本发明在以下实施例中进行进一步说明。

                         实施例1

                      NAT序列的来源

产生fibrolase的一个有效方法是，一开始将其作为preprofibrolase表达，在前fibrolase中蛋白酶kex-2在“前原”区和“成熟”区之间的接点进行切割，产生生物活性材料(“成熟”fibrolase)。按此设计，preprofibrolase的合成和加工导致成熟fibrolase分泌到培养基中。在所述切割接点的实际序列是(…TKR↓QQRF…)

kex-2是一种内切蛋白酶，它在相邻的两个碱性氨基酸的后面进行切割，在本例中是赖氨酸(K)-精氨酸(R)。从具有上述序列的DNA序列表达的成熟fibrolase表明，所预期的N末端谷氨酰胺(Q)事实上经历了脱酰胺和环化，产生焦谷氨酸(E)。这种化学修饰被认为是不希望有的，因为具有N末端环化谷氨酰胺(焦谷氨酸)残基的多肽在用于氨基酸测序的Edman降解程序中不能进行反应。因此，使在成熟fibrolase序列中的N末端的这两种谷氨酰胺(Q)残基缺失，产生一个N末端精氨酸(R)残基。既然kex-2如上所述在两个相邻碱性氨基酸之后进行切割，那么可以预料，序列(...KRRF...)存在一个不确定的kex-2切割位点。因此，所述N末端精氨酸(R)残基(上面的下划线部分)用一个丝氨酸(S)残基取代，产生序列(...KRSF...)。之所以选择丝氨酸，是因为需要引入一个当存在于水解位点的C末端一侧时便于kex-2切割的氨基酸。Rholam等，European Journal of Biochemistry，第227卷，第707-714页(1995)。

因此，采用标准PCR方法，通过在成熟fibrolase的N末端编码区进行定点诱变，用一个“S”的密码子取代“QQR”的密码子，对preprofibrolase的DNA序列进行修饰，从而产生具有SEQ IN NO：3的氨基酸序列的前原NAT。用作PCR反应引物的寡核苷酸列在下面，也显示了它们与目标序列的同源性。最初，进行两种PCR反应，采用Oligo 1和4作为一个引物对，而用Oligo 2和3作为另一个引物对，都以亲代基因作为模板t。用琼脂糖凝胶电泳纯化这两种反应的DNA产物(核苷酸长度为601和815)，将其混合作为第二轮PCR的模板，用寡核苷酸1和2作为引物对。这种最终的PCR产物(长度为1372个核苷酸)用限制性核酸内切酶XhoI和NotI切割。用苯酚/氯仿除去消化液的蛋白，沉淀DNA。将一部分回收的DNA连接到质粒pPICZα(Invitrogen，Carlsbad，CA，Catalog No.VI95-20)上，该质粒也已相似地用限制性核酸内切酶XhoI和NotI进行了切割、酶促去磷酸化和苯酚/氯仿去蛋白。所有的后续步骤都按Invitrogen毕赤酵母表达试剂盒手册(Invitrogen Corp.，Catalog No.K1710-01)来进行。用电穿孔方法将所述连接反应产物转化到大肠杆菌中，根据在含zeocin的固体培养基上的存活进行选择。分离该质粒，通过DNA测序证实所述profibrolase区。通过用限制性核酸内切酶PmeI切割使该质粒线性化，再将其转化到巴斯德毕赤酵母GS115his⁺中。该GS115菌株正常情况下是his^-，所以通过用携带野生型his4基因的DNA转化，恢复了his⁺基因型。或者，也可从Invitrogen Corp.购买一个his⁺菌株(X-33细胞系，Catalog No.C180-00)。选择作为zeocin抗性菌落的整合体。在含甲醇培养基中诱导候选菌落，在4-20％PAGE上用考马斯染色，来分析肉汤中NAT的产生。

用于定点PCR诱变的寡核苷酸如下：

Oligo 1    5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′  (SEQ ID NO：8)

Oligo 2    5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′  (SEQ ID NO：9)

Oligo 3    (SEQ ID NO：10)

5′-TCCAATTAAACTTGACTAAGAGATCTTTCCCACAAAGATACGTAC-3′

Oligo 4    (SEQ ID NO：11)

5′-GTACGTATCTTTGTGGGAAAGATCTCTTAGTCAAGTTTAATTGG-3′

下面显示了这些寡核苷酸相对于待修饰以产生NAT的fibrolase(包括前原区)的双链DNA序列(SEQ IN NO：12编码链或有义链，SEQIN NO：13互补链或反义链)和相应氨基酸序列(SEQ ID NO：14)的位置。成熟fibrolase的N-末端和C-末端区域通过用下划线标注末端氨基酸序列(QQRF和LNKP)来指示。N末端区域(QQRF)是一个待修饰的区域(用S取代QQR)。对于Oligo 3和4，在下面，插入短横线来表明所省略的编码fibrolase N末端区中残基QQ的密码子的位置。ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCT---------+---------+---------+---------+---------+---------+TACTCTAAAGGAAGTTAAAAATGACGACAAAATAAGCGTCGTAGGAGGCGTAATCGACGAM  R  F  P  S  I  F  T  A  V  L  F  A  A  S  S  A  L  A  ACCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAACGGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGT---------+---------+---------+---------+---------+---------+GGTCAGTTGTGATGTTGTCTTCTACTTTGCCGTGTTTAAGGCCGACTTCGACAGTAGCCAP  V  N  T  T  T  E  D  E  T  A  Q  I  P  A  E  A  V  I  GTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAAT---------+---------+---------+---------+---------+---------+ATGAGTCTAAATCTTCCCCTAAAGCTACAACGACAAAACGGTAAAAGGTTGTCGTGTTTAY  S  D  L  E  G  D  F  D  V  A  V  L  P  F  S  N  S  T  N

        Oligo 1    5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′AACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA---------+---------+---------+---------+---------+---------+TTGCCCAATAACAAATATTTATGATGATAACGGTCGTAACGACGATTTCTTCTTCCCCATN  G  L  L  F  I  N  T  T  I  A  S  I  A  A  K  E  E  G  VXhoI

|TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCTTCTATTATCTTGGAATCTGGTAACGTTAAC---------+---------+---------+---------+---------+---------+AGAGAGCTCTTTTCTCTCCGACTTCGAAGAAFATAATAGAACCTTAGACCATTGCAATTGS  L  E  K  R  E  A  E  A  S  S  I  I  L  E  S  G  N  V  NGATTACGAAGTTGTTTATCCAAGAAAGGTCACTCCAGTTCCTAGGGGTGCTGTTCAACCA---------+---------+---------+---------+---------+---------+CTAATGCTTCAACAAATAGGTTCTTTCCAGTGAGGTCAAGGATCCCCACGACAAGTTGGTD  Y  E  V  V  Y  P  R  K  V  T  P  V  P  R  G  A  V  Q  PAAGTACGAAGATGCCATGCAATACGAATTCAAGGTTAACAGTGAACCAGTTGTCTTGCAC---------+---------+---------+---------+---------+---------+TTCATGCTTCTACGGTACGTTATGCTTAAGTTCCAATTGTCACTTGGTCAACAGAACGTGK  Y  E  D  A  M  Q  Y  E  F  K  V  N  S  E  P  V  V  L  HTTGGAAAAAAACAAAGGTTTGTTCTCTGAAGATTACTCTGAAACTCATTACTCCCCAGAT---------+---------+---------+---------+---------+---------+AACCTTTTTTTGTTTCCAAACAAGAGACTTCTAATGAGACTTTGAGTAATGAGGGGTCTAL  E  K  N  K  G  L  F  S  E  D  Y  S  E  T  H  Y  S  P  DGGTAGAGAAATTACTACTTACCCATTGGGTGAAGATCACTGTTACTACCATGGTAGAATC---------+---------+---------+---------+---------+---------+CCATCTCTTTAATGATGAATGGGTAACCCACTTCTAGTGACAATGATGGTACCATCTTAGG  R  E  I  T  T  Y  P  L  G  E  D  H  C  Y  Y  H  G  R  IGAAAACGATGCTGACTCCACTGCTTCTATCTCTGCTTGTAACGGTTTGAAGGGTCATTTC---------+---------+---------+---------+---------+---------+CTTTTGCTACGACTGAGGTGACGAAGATAGAGACGAACATTGCCAAACTTCCCAGTAAAGE  N  D  A  D  S  T  A  S  I  S  A  C  N  G  L  K  G  H  FAAGTTGCAAGGTGAAATGTACTTGATTGAACCATTGGAATTGTCCGACTCTGAAGCCCAT---------+---------+---------+---------+---------+---------+TTCAACGTTCCACTTTACATGAACTAACTTGGTAACCTTAACAGGCTGAGACTTCGGGTAK  L  Q  G  E  M  Y  L  I  E  P  L  E  L  S  D  S  E  A  HGCTGTCTACAAGTACGAAAACGTCGAAAAGGAAGATGAAGCCCCAAAGATGTGTGGTGTT---------+---------+---------+---------+---------+---------+CGACAGATGTTCATGCTTTTGCAGCTTTTCCTTCTACTTCGGGGTTTCTACACACCACAAA  V  Y  K  Y  E  N  V  E  K  E  D  E  A  P  K  M  C  G  V

                      Oligo   3    5′-TCCAATTAAACTTGACTAAACCCAAAACTGGGAATCATATGAACCAATCAAGAAGGCCTTCCAATTAAACTTGACTAAG---------+---------+---------+---------+---------+---------+TGGGTTTTGACCCTTAGTATACTTGGTTAGTTCTTCCGGAAGGTTAATTTGAACTGATTC

                          Oligo 4  3′-GGTTAATTTGAACTGATTT  Q  N  W  E  S  Y  E  P  I  K  K  A  F  Q  L  N  L  T  KAGA------TCTTTCCCACAAAGATACGTAC-3′AGACAACAAAGATTCCCACAAAGATACGTACAGCTGGTTATCGTTGCTGACCACCGTATG---------+---------+---------+---------+---------+---------+TCTGTTGTTTCTAAGGGTGTTTCTATGCATGTCGACCAATAGCAACGACTGGTGGCATACTCT------AGAAAAGGGTGTTTTCTATGCATG-5′R  Q  Q  R  F  P  Q  R  Y  V  Q  L  V  I  V  A  D  H  R  MAACACTAAATACAACGGTGACTCTGACAAAATCCGTCAATGGGTGCACCAAATCGTCAAC---------+---------+---------+---------+---------+---------+TTGTGATTTATGTTGCCACTGAGACTGTTTTAGGCAGTTACCCACGTGGTTTAGCAGTTGN  T  K  Y  N  G  D  S  D  K  I  R  Q  W  V  H  Q  I  V  NACCATTAACGAAATCTACAGACCACTGAACATCCAATTCACTTTGGTTGGTTTGGAAATC---------+---------+---------+---------+---------+---------+TGGTAATTGCTTTAGATGTCTGGTGACTTGTAGGTTAAGTGAAACCAACCAAACCTTTAGT  I  N  E  I  Y  R  P  L  N  I  Q  F  T  L  V  G  L  E  ITGGTCCAACCAAGATTTGATCACCGTTACTTCTGTATCCCACGACACTCTGGCATCCTTC---------+---------+---------+---------+---------+---------+ACCAGGTTGGTTCTAAACTAGTGGCAATGAAGACATAGGGTGCTGTGAGACCGTAGGAAGW  S  N  Q  D  L  I  T  V  T  S  V  S  H  D  T  L  A  S  FGGTAACTGGCGTGAAACCGACCTGCTGCGTCGCCAACGTCATGATAACGCTCAACTGCTG---------+---------+---------+---------+---------+---------+CCATTGACCGCACTTTGGCTGGACGACGCAGCGGTTGCAGTACTATTGCGAGTTGACGACG  N  W  R  E  T  D  L  L  R  R  Q  R  H  D  N  A  Q  L  LACCGCTATCGACTTCGACGGTGATACTGTTGGTCTGGCTTACGTTGGTGGCATGTGTCAA---------+---------+---------+---------+---------+---------+TGGCGATAGCTGAAGCTGCCACTATGACAACCAGACCGAATGCAACCACCGTACACAGTTT  A  I  D  F  D  G  D  T  V  G  L  A  Y  V  G  G  M  C  QCTGAAACATTCTACTGGTGTTATCCAGGACCACTCCGCTATTAACCTGCTGGTTGCTCTG---------+---------+---------+---------+---------+---------+GACTTTGTAAGATGACCACAATAGGTCCTGGTGAGGCGATAATTGGACGACCAACGAGACL  K  H  S  T  G  V  I  Q  D  H  S  A  I  N  L  L  V  A  LACCATGGCACACGAACTGGGTCATAACCTGGGTATGAACCACGATGGCAACCAGTGTCAC---------+---------+---------+---------+---------+---------+TGGTACCGTGTGCTTGACCCAGTATTGGACCCATACTTGGTGCTACCGTTGGTCACAGTGT  M  A  H  E  L  G  H  N  L  G  M  N  H  D  G  N  Q  C  HTGCGGTGCAAACTCCTGTGTTATGGCTGCTATGCTGTCCGATCAACCATCCAAACTGTTC---------+---------+---------+---------+---------+---------+ACGCCACGTTTGAGGACACAATACCGACGATACGACAGGCTAGTTGGTAGGTTTGACAAGC  G  A  N  S  C  V  M  A  A  M  L  S  D  Q  P  S  K  L  FTCCGACTGCTCTAAGAAAGACTACCAGACCTTCCTGACCGTTAACAACCCGCAGTGTATC---------+---------+---------+---------+---------+---------+AGGCTGACGAGATTCTTTCTGATGGTCTGGAAGGACTGGCAATTGTTGGGCGTCACAtAGS  D  C  S  K  K  D  Y  Q  T  F  L  T  V  N  N  P  Q  C  I

          NotI

             |CTGAACAAACCGTAAGCGGCCGCCAGCTTTCTAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGAT---------+---------+---------+---------+---------+---------+GACTTGTTTGGCATTCGCCGGCGGTCGAAAGATCTTGTTTTTGAGTAGAGTCTTCTCCTAL  N  K  P  *  A  A  A  S  F  L  E  Q  K  L  I  S  E  E  DCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGAGTTTGTAGCCTTAGACATGAC---------+---------+---------+---------+---------+---------+GACTTATCGCGGCAGCTGGTAGTAGTAGTAGTAGTAACTCAAACATCGGAATCTGTACTGL  N  S  A  V  D  H  H  H  H  H  H  *  V  C  S  L  R  H  DTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAG---------+---------+---------+--------+---------+---------+ACAAGGAGTCAAGTTCAACCCGTGAATGCTCTTCTGGCCAGAACGATCTAAGATTAGTTCC  S  S  V  Q  V  G  H  L  R  E  D  R  S  C  *  I  L  I  KAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATT---------+---------+---------+---------+---------+---------+TCCTACAGTCTTACGGTAAACGGACTCTCTACGTCCGAAGTAAAAACTATGAAAAAATAACCTACAGTCTTACGGTAAACG-5′  Oligo 2R  M  S  E  C  H  L  P  E  R  C  R  L  H  F  *  Y  F  F  I  -

                         实施例2

               在巴斯德毕赤酵母中表达NAT

当尝试在大肠杆菌中表达NAT的DNA时，非常差的重折叠和对稀释条件的要求，降低了纯化效率。这些考虑和其他的考虑，导致使用巴斯德毕赤酵母(一种酵母菌)作为宿主菌。将已经用前原NAT的cDNA(SEQ ID NO：4)转染的经选择的巴斯德毕赤酵母克隆，接种入500ml的下列接种生长培养基中：每升分批培养基酵母浸出物            30.0g磷酸二氢钾            17.2g葡萄糖                20.0g生物素                0.004g水                至1L磷酸，85％        调节pH到6.00

将转染后的巴斯德毕赤酵母细胞接种，于30℃摇床培养约30-32小时。用约1％(w/v)的所得培养物接种10L发酵罐。该发酵罐含已灭菌的基础盐和葡萄糖(如下)。发酵罐灭菌后，在每升分批培养基中加入12ml/L的PTM4盐(PTM4是一种微量金属溶液，包含五水硫酸铜、碘化钠、一水硫酸锰、二水钼酸钠、硼酸、六水氯化钴、氯化锌、七水硫酸亚铁、d-生物素、硫酸和纯水)。发酵生长温度为30℃。该发酵罐的pH用氢氧化铵和磷酸控制在pH6.00。得自添加到该培养基中的锌盐的锌，掺入到NAT中作为该金属蛋白酶结构的一部分。每升分批培养基中的基础盐磷酸，85％                26.7ml硫酸钙                    0.93g硫酸钾                    18.2g7水硫酸锰                 14.9g氢氧化钾                  4.13g葡萄糖                    30.0g水                        到1L

让分批培养物生长到葡萄糖完全耗尽(17到20小时)，然后开始补料分批培养阶段。补料分批培养阶段的培养基含葡萄糖和12ml PTM4盐/升。诱导补料含葡萄糖、25％甲醇和12ml PTM4盐/升。在诱导时，该反应器温度改到20℃。该诱导阶段持续60-75小时。收获所述条件培养基，去掉细胞碎片。

                         实施例3

                从巴斯德毕赤酵母纯化NAT

将得自实施例2的酵母肉汤(细胞碎片较少的条件培养基)澄清，将其pH和电导率分别调到6.5和10-20mS/cm。将该肉汤上样到固定化金属亲和树脂上，该树脂已加有铜(Cu)，并用磷酸缓冲盐溶液(PBS)平衡。用PBS洗该树脂，用PBS中的咪唑梯度(0-100Mm)洗脱。合并含“成熟”NAT(SEQ IN NO：1)的流分，稀释至电导率小于1.5mS/cm，pH6.4。将所述稀释合并液上样到已经用10mM的2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)平衡的SP葡聚糖树脂(Amersham Pharmacia Biotech，Inc.，Piscataway，NJ)上。用MES清洗柱子，用MES中的NaCl梯度(0-500mM)洗脱。收集并贮存含NAT的流分。

                         实施例4

大鼠颈动脉急性血栓形成的血栓溶解：NAT和尿激酶的比较

为了证明“成熟”NAT(SEQ ID NO：1)具有生物活性，并有独特功能，用通过施加阳极电流对一条颈动脉产生病灶性损伤的大鼠，进行了急性药理学研究。这一损伤一般会在15分钟内产生一个闭塞性血栓。一旦血栓形成，则观察所述动脉30分钟，以确保所述颈动脉闭塞是稳定的。然后静脉给予肝素和阿司匹林，以防血栓进一步形成。所述动物经动脉内灌注受试材料进行处理。在受试材料的传递过程中，监测该颈动脉的血流量，以便可以检测到成功的血块溶解，并记录血块溶解发生的时间。记录发生溶解的实验的百分率，并仅对于血块溶解成功的实验计算组的平均值。作为受试材料出血潜力的度量手段，用纱布拭子收集从手术部位流出的血。将拭子放在去垢剂溶液中，以溶解红细胞，释放血红素，再用分光光度计定量测定血红素。流出的血红素用于计算出血量。实验数据见下表。

                        表1血块溶解的发生率、血块溶解时间、手术出血量(平均值±标准差)

	溶解率(％)	溶解时间(min)	出血量(ml)
				盐水(n＝6)	0％(0/6)	N/A	0.10±0.23
尿激酶25U/min(n＝15)	33％(5/15)	55.3±15.9	1.06±1.59
				尿激酶250U/min(n＝15)	86％(13/15)	33.5±15.3	1.43±1.45
NAT 2mg(n＝14)	78％(11/14)	6.3±5.8	0.96±0.77

这些研究确定了，NAT在体内血块溶解动物模型中具有生物活性。而且，与尿激酶相比，其血块溶解时间明显减少、手术部位出血更少。因此，NAT的活性分布型可以区别于纤维蛋白溶酶原激活剂类的血栓溶解剂(以尿激酶为代表)，因为NAT对血块溶解更快并且出血性并发症减少。

NAT的纤维蛋白溶解活性和fibrolase的是类似的。此外，如上所述，NAT的N末端的稳定性，导致重组表达时终产物更为均一，这是明显的优点(即所述N末端在一定时间内将不会改变而产生不同形式的混合物，因而使得所述多肽更加稳定)。

                            序列表<110>Boone.Thomas C.

 Li，Huimin

 Mann，Mi chael B.<120>纤维蛋白溶解活性多肽<130>A-596<140>09/411,329<141>1999-10-01<160>20<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>201<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：NAT(Agkistrodon Contourtrix的

 fibrolase的类似物)<400>1Ser Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val Ile Val Ala Asp His Arg1               5                  10                  15Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys Ile Arg Gln Trp Val

         20                  25                  30His Gln Ile Val Asn Thr Ile Asn Glu Ile Tyr Arg Pro Leu Asn Ile

     35                  40                  45Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile Trp Ser Asn Gln Asp Leu Ile

 50                  55                  60Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala Ser Phe Gly Asn Trp65                  70                  75                  80Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His Asp Asn Ala Gln Leu

             85                  90                  95Leu Thr Ala Ile Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val Gly Leu Ala Tyr Val

        100                 105                 110Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly Val Ile Gln Asp His

    115                 120                 125Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met Ala His Glu Leu Gly

130                 135                 140His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln Cys His Cys Gly Ala145                 150                 155                 160Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp Gln Pro Ser Lys Leu

            165                 170                 175Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr Phe Leu Thr Val Asn

        180                 185                 190Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Lys Pro

    195                 200<210>2<211>603<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：编码NAT(fibrolase的类似物)<400>2tctttcccac aaagatacgt acagctggtt atcgttgctg accaccgtat gaacactaaa 60tacaacggtg actctgacaa aatccgtcaa tgggtgcacc aaatcgtcaa caccattaac 120gaaatctaca gaccactgaa catccaattc actttggttg gtttggaaat ctggtccaac 180caagatttga tcaccgttac ttctgtatcc cacgacactc tggcatcctt cggtaactgg 240cgtgaaaccg acctgctgcg tcgccaacgt catgataacg ctcaactgct gaccgctatc 300gacttcgacg gtgatactgt tggtctggct tacgttggtg gcatgtgtca actgaaacat 360tctactggtg ttatccagga ccactccgct attaacctgc tggttgctct gaccatggca 420cacgaactgg gtcataacct gggtatgaac cacgatggca accagtgtca ctgcggtgca 480aactcctgtg ttatggctgc tatgctgtcc gatcaaccat ccaaactgtt ctccgactgc 540tctaagaaag actaccagac cttcctgacc gttaacaacc cgcagtgtat cctgaacaaa 600ccg                                                               603<210>3<211>462<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：天然pro-NAT(fibrolase的类似物)<400>3Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser1               5                  10                  15Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

         20                  25                  30Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

     35                  40                  45Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

 50                  55                  60Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val65                  70                  75                  80Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Ser Ser Ile Ile Leu Glu Ser

             85                  90                  95Gly Asn Val Asn Asp Tyr Glu Val Val Tyr Pro Arg Lys Val Thr Pro

        100                 105                 110Val Pro Arg Gly Ala Val Gln Pro Lys Tyr Glu Asp Ala Met Gln Tyr

    115                 120                 125Glu Phe Lys Val Asn Ser Glu Pro Val Val Leu His Leu Glu Lys Asn

130                 135                 140Lys Gly Leu Phe Ser Glu Asp Tyr Ser Glu Thr His Tyr Ser Pro Asp145                 150                 155                 160Gly Arg Glu Ile Thr Thr Tyr Pro Leu Gly Glu Asp His Cys Tyr Tyr

            165                 170                 175His Gly Arg Ile Glu Asn Asp Ala Asp Ser Thr Ala Ser Ile Ser Ala

        180                 185                 190Cys Asn Gly Leu Lys Gly His Phe Lys Leu Gln Gly Glu Met Tyr Leu

    195                 200                 205Ile Glu Pro Leu Glu Leu Ser Asp Ser Glu Ala His Ala Val Tyr Lys

210                 215                 220Tyr Glu Asn Val Glu Lys Glu Asp Glu Ala Pro Lys Met Cys Gly Val225                 230                 235                 240Thr Gln Asn Trp Glu Ser Tyr Glu Pro Ile Lys Lys Ala Phe Gln Leu

            245                 250                 255Asn Leu Thr Lys Arg Ser Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val Ile

        260                 265                 270Val Ala Asp His Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys

    275                 280                 285Ile Arg Gln Trp Val His Gln Ile Val Asn Thr Ile Asn Glu Ile Tyr

290                 295                 300Arg Pro Leu Asn Ile Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile Trp Ser305                 310                 315                 320Asn Gln Asp Leu Ile Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala

            325                 330                 335Ser Phe Gly Asn Trp Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His

        340                 345                 350Asp Asn Ala Gln Leu Leu Thr Ala Ile Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val

    355                 360                 365Gly Leu Ala Tyr Val Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly

370                 375                 380Val Ile Gln Asp His Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met385                 390                 395                 400Ala His Glu Leu Gly His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln

            405                 410                 415Cys His Cys Gly Ala Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp

        420                 425                 430Gln Pro Ser Lys Leu Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr

    435                 440                 445Phe Leu Thr Val Asn Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Lys Pro

450                 455                 460<210>4<211>1386<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：编码pro-NAT

 (fibrolase的类似物)<400>4atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240tctctcgaga aaagagaggc tgaagcttct tctattatct tggaatctgg taacgttaac 300gattacgaag ttgtttatcc aagaaaggtc actccagttc ctaggggtgc tgttcaacca 360aagtacgaag atgccatgca atacgaattc aaggttaaca gtgaaccagt tgtcttgcac 420ttggaaaaaa acaaaggttt gttctctgaa gattactctg aaactcatta ctccccagat 480ggtagagaaa ttactactta cccattgggt gaagatcact gttactacca tggtagaatc 540gaaaacgatg ctgactccac tgcttctatc tctgcttgta acggtttgaa gggtcatttc 600aagttgcaag gtgaaatgta cttgattgaa ccattggaat tgtccgactc tgaagcccat 660gctgtctaca agtacgaaaa cgtcgaaaag gaagatgaag ccccaaagat gtgtggtgtt 720acccaaaact gggaatcata tgaaccaatc aagaaggcct tccaattaaa cttgactaag 780agatctttcc cacaaagata cgtacagctg gttatcgttg ctgaccaccg tatgaacact 840aaatacaacg gtgactctga caaaatccgt caatgggtgc accaaatcgt caacaccatt 900aacgaaatct acagaccact gaacatccaa ttcactttgg ttggtttgga aatctggtcc 960aaccaagatt tgatcaccgt tacttctgta tcccacgaca ctctggcatc cttcggtaac 1020tggcgtgaaa ccgacctgct gcgtcgccaa cgtcatgata acgctcaact gctgaccgct 1080atcgacttcg acggtgatac tgttggtctg gcttacgttg gtggcatgtg tcaactgaaa 1140cattctactg gtgttatcca ggaccactcc gctattaacc tgctggttgc tctgaccatg 1200gcacacgaac tgggtcataa cctgggtatg aaccacgatg gcaaccagtg tcactgcggt 1260gcaaactcct gtgttatggc tgctatgctg tccgatcaac catccaaact gttctccgac 1320tgctctaaga aagactacca gaccttcctg accgttaaca acccgcagtg tatcctgaac 1380aaaccg                                                            1386<210>5<211>203<212>PRT<213>Agkistrodon contortrix<220><223>Agkistrodon contortrix的天然fibrolase<400>5Gln Gln Arg Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val Ile Val Ala Asp1               5                  10                  15His Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys Ile Arg Gln

         20                  25                  30Trp Val His Gln Ile Val Asn Thr Ile Asn Glu Ile Tyr Arg Pro Leu

     35                  40                  45Asn Ile Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile Trp Ser Asn Gln Asp

 50                  55                  60Leu Ile Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala Ser Phe Gly65                  70                  75                  80Asn Trp Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His Asp Asn Ala

             85                  90                  95Gln Leu Leu Thr Ala lle Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val Gly Leu Ala

        100                 105                 110Tyr Val Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly Val Ile Gln

    115                 120                 125Asp His Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met Ala His Glu

130                 135                 140Leu Gly His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln Cys His Cys145                 150                 155                 160Gly Ala Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp Gln Pro Ser

            165                 170                 175Lys Leu Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr Phe Leu Thr

        180                 185                 190Val Asn Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Lys Pro

    195                 200<210>6<211>609<212>DNA<213>Agkistrodon contortrix<220><223>编码Agkistrodon contortrix的天然fibrolase<400>6caacaaagat tcccacaaag atacgtacag ctggttatcg ttgctgacca ccgtatgaac 60actaaataca acggtgactc tgacaaaatc cgtcaatggg tgcaccaaat cgtcaacacc 120attaacgaaa tctacagacc actgaacatc caattcactt tggttggttt ggaaatctgg 180tccaaccaag atttgatcac cgttacttct gtatcccacg acactctggc atccttcggt 240aactggcgtg aaaccgacct gctgcgtcgc caacgtcatg ataacgctca actgctgacc 300gctatcgact tcgacggtga tactgttggt ctggcttacg ttggtggcat gtgtcaactg 360aaacattcta ctggtgttat ccaggaccac tccgctatta acctgctggt tgctctgacc 420atggcacacg aactgggtca taacctgggt atgaaccacg atggcaacca gtgtcactgc 480ggtgcaaact cctgtgttat ggctgctatg ctgtccgatc aaccatccaa actgttctcc 540gactgctcta agaaagacta ccagaccttc ctgaccgtta acaacccgca gtgtatcctg 600aacaaaccg                                                         609<210>7<211>1392<212>DNA<213>Agkistrodon contortrix<220><223>Agkistrodon contortrix的天然pro-fibrolase的编码序列<400>7atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240tctctcgaga aaagagaggc tgaagcttct tctattatct tggaatctgg taacgttaac 300gattacgaag ttgtttatcc aagaaaggtc actccagttc ctaggggtgc tgttcaacca 360aagtacgaag atgccatgca atacgaattc aaggttaaca gtgaaccagt tgtcttgcac 420ttggaaaaaa acaaaggttt gttctctgaa gattactctg aaactcatta ctccccagat 480ggtagagaaa ttactactta cccattgggt gaagatcact gttactacca tggtagaatc 540gaaaacgatg ctgactccac tgcttctatc tctgcttgta acggtttgaa gggtcatttc 600aagttgcaag gtgaaatgta cttgattgaa ccattggaat tgtccgactc tgaagcccat 660gctgtctaca agtacgaaaa cgtcgaaaag gaagatgaag ccccaaagat gtgtggtgtt 720acccaaaact gggaatcata tgaaccaatc aagaaggcct tccaattaaa cttgactaag 780agacaacaaa gattcccaca aagatacgta cagctggtta tcgttgctga ccaccgtatg 840aacactaaat acaacggtga ctctgacaaa atccgtcaat gggtgcacca aatcgtcaac 900accattaacg aaatctacag accactgaac atccaattca ctttggttgg tttggaaatc 960tggtccaacc aagatttgat caccgttact tctgtatccc acgacactct ggcatccttc 1020ggtaactggc gtgaaaccga cctgctgcgt cgccaacgtc atgataacgc tcaactgctg 1080accgctatcg acttcgacgg tgatactgtt ggtctggctt acgttggtgg catgtgtcaa 1140ctgaaacatt ctactggtgt tatccaggac cactccgcta ttaacctgct ggttgctctg 1200accatggcac acgaactggg tcataacctg ggtatgaacc acgatggcaa ccagtgtcac 1260tgcggtgcaa actcctgtgt tatggctgct atgctgtccg atcaaccatc caaactgttc 1320tccgactgct ctaagaaaga ctaccagacc ttcctgaccg ttaacaaccc gcagtgtatc 1380ctgaacaaac cg                                                     1392<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>8tactattgcc agcattgctg c                                         21<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>9cctacagtct tacggtaaac g                                         21<210>10<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>10tccaattaaa cttgactaag agatctttcc cacaaagata cgtac               45<210>11<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>11ggttaatttg aactgattct ctagaaaggg tgtttctatg catg                44<210>12<211>1620<212>DNA<213>Agkistrodon contortrix<220><221>misc feature<222>互补((1)..(1620))<223>反义链(参见SEQ ID NO：13)的互补(有义)链<220><223>Agkistrodon contortrix的天然pro-fibrolase的编码序列<400>12atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240tctctcgaga aaagagaggc tgaagcttct tctattatct tggaatctgg taacgttaac 300gattacgaag ttgtttatcc aagaaaggtc actccagttc ctaggggtgc tgttcaacca 360aagtacgaag atgccatgca atacgaattc aaggttaaca gtgaaccagt tgtcttgcac 420ttggaaaaaa acaaaggttt gttctctgaa gattactctg aaactcatta ctccccagat 480ggtagagaaa ttactactta cccattgggt gaagatcact gttactacca tggtagaatc 540gaaaacgatg ctgactccac tgcttctatc tctgcttgta acggtttgaa gggtcatttc 600aagttgcaag gtgaaatgta cttgattgaa ccattggaat tgtccgactc tgaagcccat 660gctgtctaca agtacgaaaa cgtcgaaaag gaagatgaag ccccaaagat gtgtggtgtt 720acccaaaact gggaatcata tgaaccaatc aagaaggcct tccaattaaa cttgactaag 780agacaacaaa gattcccaca aagatacgta cagctggtta tcgttgctga ccaccgtatg 840aacactaaat acaacggtga ctctgacaaa atccgtcaat gggtgcacca aatcgtcaac 900accattaacg aaatctacag accactgaac atccaattca ctttggttgg tttggaaatc 960tggtccaacc aagatttgat caccgttact tctgtatccc acgacactct ggcatccttc 1020ggtaactggc gtgaaaccga cctgctgcgt cgccaacgtc atgataacgc tcaactgctg 1080accgctatcg acttcgacgg tgatactgtt ggtctggctt acgttggtgg catgtgtcaa 1140ctgaaacatt ctactggtgt tatccaggac cactccgcta ttaacctgct ggttgctctg 1200accatggcac acgaactggg tcataacctg ggtatgaacc acgatggcaa ccagtgtcac 1260tgcggtgcaa actcctgtgt tatggctgct atgctgtccg atcaaccatc caaactgttc 1320tccgactgct ctaagaaaga ctaccagacc ttcctgaccg ttaacaaccc gcagtgtatc 1380ctgaacaaac cgtaagcggc cgccagcttt ctagaacaaa aactcatctc agaagaggat 1440ctgaatagcg ccgtcgacca tcatcatcat catcattgag tttgtagcct tagacatgac 1500tgttcctcag ttcaagttgg gcacttacga gaagaccggt cttgctagat tctaatcaag 1560aggatgtcag aatgccattt gcctgagaga tgcaggcttc atttttgata cttttttatt 1620<210>13<211>1620<212>DNA<213>Agkistrodon contortrix<220><221>misc feature<222>互补((1)..(1620))<223>有义链(参见SEQ ID NO：12)的互补(反义)链<220><223>Agkistrodon contortrix的天然pro-fibrolase的反义编码序列<400>13aataaaaaag tatcaaaaat gaagcctgca tctctcaggc aaatggcatt ctgacatcct 60cttgattaga atctagcaag accggtcttc tcgtaagtgc ccaacttgaa ctgaggaaca 120gtcatgtcta aggctacaaa ctcaatgatg atgatgatga tggtcgacgg cgctattcag 180atcctcttct gagatgagtt tttgttctag aaagctggcg gccgcttacg gtttgttcag 240gatacactgc gggttgttaa cggtcaggaa ggtctggtag tctttcttag agcagtcgga 300gaacagtttg gatggttgat cggacagcat agcagccata acacaggagt ttgcaccgca 360gtgacactgg ttgccatcgt ggttcatacc caggttatga cccagttcgt gtgccatggt 420cagagcaacc agcaggttaa tagcggagtg gtcctggata acaccagtag aatgtttcag 480ttgacacatg ccaccaacgt aagccagacc aacagtatca ccgtcgaagt cgatagcggt 540cagcagttga gcgttatcat gacgttggcg acgcagcagg tcggtttcac gccagttacc 600gaaggatgcc agagtgtcgt gggatacaga agtaacggtg atcaaatctt ggttggacca 660gatttccaaa ccaaccaaag tgaattggat gttcagtggt ctgtagattt cgttaatggt 720gttgacgatt tggtgcaccc attgacggat tttgtcagag tcaccgttgt atttagtgtt 780catacggtgg tcagcaacga taaccagctg tacgtatctt tgtgggaatc tttgttgtct 840cttagtcaag tttaattgga aggccttctt gattggttca tatgattccc agttttgggt 900aacaccacac atctttgggg cttcatcttc cttttcgacg ttttcgtact tgtagacagc 960atgggcttca gagtcggaca attccaatgg ttcaatcaag tacatttcac cttgcaactt 1020gaaatgaccc ttcaaaccgt tacaagcaga gatagaagca gtggagtcag catcgttttc 1080gattctacca tggtagtaac agtgatcttc acccaatggg taagtagtaa tttctctacc 1140atctggggag taatgagttt cagagtaatc ttcagagaac aaacctttgt ttttttccaa 1200gtgcaagaca actggttcac tgttaacctt gaattcgtat tgcatggcat cttcgtactt 1260tggttgaaca gcacccctag gaactggagt gacctttctt ggataaacaa cttcgtaatc 1320gttaacgtta ccagattcca agataataga agaagcttca gcctctcttt tctcgagaga 1380taccccttct tctttagcag caatgctggc aatagtagta tttataaaca ataacccgtt 1440atttgtgctg ttggaaaatg gcaaaacagc aacatcgaaa tccccttcta aatctgagta 1500accgatgaca gcttcagccg gaatttgtgc cgtttcatct tctgttgtag tgttgactgg 1560agcagctaat gcggaggatg ctgcgaataa aacagcagta aaaattgaag gaaatctcat 1620<210>14<211>540<212>PRT<213>Agkistrodon contortrix<220><223>位置465、493、516和536中的Xaa对应于终止密码子。<220><223>Agkistrodon contortrix的天然pro-fibrolase<400>14Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser1               5                  10                  15Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

         20                  25                  30Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

     35                  40                  45Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

 50                  55                  60Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val65                  70                  75                  80Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Ser Ser Ile Ile Leu Glu Ser

             85                  90                  95Gly Asn Val Asn Asp Tyr Glu Val Val Tyr Pro Arg Lys Val Thr Pro

        100                 105                 110Val Pro Arg Gly Ala Val Gln Pro Lys Tyr Glu Asp Ala Met Gln Tyr

    115                 120                 125Glu Phe Lys Val Asn Ser Glu Pro Val Val Leu His Leu Glu Lys Asn

130                 135                 140Lys Gly Leu Phe Ser Glu Asp Tyr Ser Glu Thr His Tyr Ser Pro Asp145                 150                 155                 160Gly Arg Glu Ile Thr Thr Tyr Pro Leu Gly Glu Asp His Cys Tyr Tyr

            165                 170                 175His Gly Arg Ile Glu Asn Asp Ala Asp Ser Thr Ala Ser Ile Ser Ala

        180                 185                 190Cys Asn Gly Leu Lys Gly His Phe Lys Leu Gln Gly Glu Met Tyr Leu

    195                 200                 205Ile Glu Pro Leu Glu Leu Ser Asp Ser Glu Ala His Ala Val Tyr Lys

210                 215                 220Tyr Glu Asn Val Glu Lys Glu Asp Glu Ala Pro Lys Met Cys Gly Val225                 230                 235                 240Thr Gln Asn Trp Glu Ser Tyr Glu Pro Ile Lys Lys Ala Phe Gln Leu

            245                 250                 255Asn Leu Thr Lys Arg Gln Gln Arg Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu

        260                 265                 270Val Ile Val Ala Asp His Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser

    275                 280                 285Asp Lys Ile Arg Gln Trp Val His Gln Ile Val Asn Thr Ile Asn Glu

290                 295                 300Ile Tyr Arg Pro Leu Asn Ile Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile305                 310                 315                 320Trp Ser Asn Gln Asp Leu Ile Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr

            325                 330                 335Leu Ala Ser Phe Gly Asn Trp Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln

        340                 345                 350Arg His Asp Asn Ala Gln Leu Leu Thr Ala Ile Asp Phe Asp Gly Asp

    355                 360                 365Thr Val Gly Leu Ala Tyr Val Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser

370                 375                 380Thr Gly Val Ile Gln Asp His Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu385                 390                 395                 400Thr Met Ala His Glu Leu Gly His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly

            405                 410                 415Asn Gln Cys His Cys Gly Ala Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu

        420                 425                 430Ser Asp Gln Pro Ser Lys Leu Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr

    435                 440                 445Gln Thr Phe Leu Thr Val Asn Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Lys Pro

450                 455                 460Xaa Ala Ala Ala Ser Phe Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp465                 470                 475                 480Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His Xaa Val Cys Ser

            485                 490                 495Leu Arg His Asp Cys Ser Ser Val Gln Val Gly His Leu Arg Glu Asp

        500                 505                 510Arg Ser Cys Xaa Ile Leu Ile Lys Arg Met Ser Glu Cys His Leu Pro

    515                 520                 525Glu Arg Cys Arg Leu His Phe Xaa Tyr Phe Phe Ile

530                 535                 540<210>15<211>203<212>PRT<213>Agkistrodon contortrix<220><223>Agkistrodon contortrix的天然fibrolase<220><223>位置1中的Xaa代表化合物焦谷氨酸。该化合物在说明书中

 用字母“E”来指代。<400>15Xaa Gln Arg Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val Ile Val Ala Asp1               5                  10                  15His Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys Ile Arg Gln

         20                  25                  30Trp Val His Gln Ile Val Asn Thr Ile Asn Glu Ile Tyr Arg Pro Leu

     35                  40                  45Asn Ile Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile Trp Ser Asn Gln Asp

 50                  55                  60Leu Ile Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala Ser Phe Gly65                  70                  75                  80Asn Trp Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His Asp Asn Ala

             85                  90                  95Gln Leu Leu Thr Ala Ile Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val Gly Leu Ala

        100                 105                 110Tyr Val Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly Val Ile Gln

    115                 120                 125Asp His Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met Ala His Glu

130                 135                 140Leu Gly His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln Cys His Cys145                 150                 155                 160Gly Ala Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp Gln Pro Ser

            165                 170                 175Lys Leu Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr Phe Leu Thr

        180                 185                 190Val Asn Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Lys Pro

    195                 200<210>16<211>202<212>PRT<213>Agkistrodon contortrix<220><223>Agkistrodon contortrix的天然fibrolase<220><223>位置1中的Xaa代表化合物焦谷氨酸。该化合物在说明书中

 用字母“E”来指代。<400>16Xaa Arg Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val Ile Val Ala Asp His1               5                  10                  15Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys Ile Arg Gln Trp

         20                  25                  30Val His Gln Ile Val Asn Thr Ile Asn Glu Ile Tyr Arg Pro Leu Asn

     35                  40                  45Ile Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile Trp Ser Asn Gln Asp Leu

 50                  55                  60Ile Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala Ser Phe Gly Asn65                  70                  75                  80Trp Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His Asp Asn Ala Gln

             85                  90                  95Leu Leu Thr Ala Ile Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val Gly Leu Ala Tyr

        100                 105                 110Val Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly Val Ile Gln Asp

    115                 120                 125His Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met Ala His Glu Leu

130                 135                 14061y His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln Cys His Cys Gly145                 150                 155                 160Ala Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp Gln Pro Ser Lys

            165                 170                 175Leu Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr Phe Leu Thr Val

        180                 185                 190Asn Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Lys Pro

    195                 200<210>17<211>538<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：Agkistrodon contortrix的天然

 pro-fibrolase的类似物形式<400>17Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser1               5                  10                  15Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Gln Thr Ala Gln

         20                  25                  30Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

     35                  40                  45Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

 50                  55                  60Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val65                  70                  75                  80Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Ser Ser Ile Ile Leu Glu Ser

             85                  90                  95Gly Asn Val Asn Asp Tyr Glu Val Val Tyr Pro Arg Lys Val Thr Pro

        100                 105                 110Val Pro Arg Gly Ala Val Gln Pro Lys Tyr Glu Asp Ala Met Gln Tyr

    115                 120                 125Glu Phe Lys Val Asn Ser Glu Pro Val Val Leu His Leu Glu Lys Asn

130                 135                 140Lys Gly Leu Phe Ser Glu Asp Tyr Ser Glu Thr His Tyr Ser Pro Asp145                 150                 155                 160Gly Arg Glu Ile Thr Thr Tyr Pro Leu Gly Glu Asp His Cys Tyr Tyr

            165                 170                 175His Gly Arg Ile Glu Asn Asp Ala Asp Ser Thr Ala Ser Ile Ser Ala

        180                 185                 190Cys Asn Gly Leu Lys Gly His Phe Lys Leu Gln Gly Glu Met Tyr Leu

    195                 200                 205Ile Glu Pro Leu Glu Leu Ser Asp Ser Glu Ala His Ala Val Tyr Lys

210                  215                220Tyr Glu Asn Val Glu Lys Glu Asp Glu Ala Pro Lys Met Cys Gly Val225                 230                 235                 240Thr Gln Asn Trp Glu Ser Tyr Glu Pro Ile Lys Lys Ala Phe Gln Leu

            245                 250                 255Asn Leu Thr Lys Arg Ser Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val Ile

        260                 265                 270Val Ala Asp His Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys

    275                 280                 285Ile Arg Gln Trp Val His Gln Ile Val Asn Thr Ile Asn Glu Ile Tyr

290                 295                 300Arg Pro Leu Asn Ile Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile Trp Ser305                 310                 315                 320Asn Gln Asp Leu Ile Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala

            325                 330                 335Ser Phe Gly Asn Trp Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His

        340                 345                 350Asp Asn Ala Gln Leu Leu Thr Ala Ile Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val

    355                 360                 365Gly Leu Ala Tyr Val Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly

370                 375                 380Val Ile Gln Asp His Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met385                 390                 395                 400Ala His Glu Leu Gly His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln

            405                 410                 415Cys His Cys Gly Ala Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp

        420                 425                 430Gln Pro Ser Lys Leu Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr

    435                 440                 445Phe Leu Thr Val Asn Asn Pro Gln Cys Ile Leu Asn Lys Pro Xaa Ala

450                 455                 460Ala Ala Ser Phe Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn465                 470                 475                 480Ser Ala Val Asp His His His His His His Xaa Val Cys Ser Leu Arg

            485                 490                 495His Asp Cys Ser Ser Val Gln Val Gly His Leu Arg Glu Asp Arg Ser

        500                 505                 510Cys Xaa Ile Leu Ile Lys Arg Met Ser Glu Cys His Leu Pro Glu Arg

    515                 520                 525Cys Arg Leu His Phe Xaa Tyr Phe Phe Ile

530                 535<210>18<211>602<212>DNA<213>Agkistrodon contortrix<220><223>Agkistrodon contortrix fibrolase的片段<400>18tactattgcc agcattgctg ctaaagaaga aggggtatct ctcgagaaaa gagaggctga 60agcttcttct attatcttgg aatctggtaa cgttaacgat tacgaagttg tttatccaag 120aaaggtcact ccagttccta ggggtgctgt tcaaccaaag tacgaagatg ccatgcaata 180cgaattcaag gttaacagtg aaccagttgt cttgcacttg gaaaaaaaca aaggtttgtt 240ctctgaagat tactctgaaa ctcattactc cccagatggt agagaaatta ctacttaccc 300attgggtgaa gatcactgtt actaccatgg tagaatcgaa aacgatgctg actccactgc 360ttctatctct gcttgtaacg gtttgaaggg tcatttcaag ttgcaaggtg aaatgtactt 420gattgaacca ttggaattgt ccgactctga agcccatgct gtctacaagt acgaaaacgt 480cgaaaaggaa gatgaagccc caaagatgtg tggtgttacc caaaactggg aatcatatga 540accaatcaag aaggccttcc aattaaactt gactaagaga tctttcccac aaagatacgt 600ac                                                                602<210>19<211>816<212>DNA<213>Agkistrodon contortrix<220><223>Agkistrodon contortrix fibrolase的片段<400>19tccaattaaa cttgactaag agatctttcc cacaaagata cgtacagctg gttatcgttg 60ctgaccaccg tatgaacact aaatacaacg gtgactctga caaaatccgt caatgggtgc 120accaaatcgt caacaccatt aacgaaatct acagaccact gaacatccaa ttcactttgg 180ttggtttgga aatctggtcc aaccaagatt tgatcaccgt tacttctgta tcccacgaca 240ctctggcatc cttcggtaac tggcgtgaaa ccgacctgct gcgtcgccaa cgtcatgata 300acgctcaact gctgaccgct atcgacttcg acggtgatac tgttggtctg gcttacgttg 360gtggcatgtg tcaactgaaa cattctactg gtgttatcca ggaccactcc gctattaacc 420tgctggttgc tctgaccatg gcacacgaac tgggtcataa cctgggtatg aaccacgatg 480gcaaccagtg tcactgcggt gcaaactcct gtgttatggc tgctatgctg tccgatcaac 540catccaaact gttctccgac tgctctaaga aagactacca gaccttcctg accgttaaca 600acccgcagtg tatcctgaac aaaccgtaag cggccgccag ctttctagaa caaaaactca 660tctcagaaga ggatctgaat agcgccgtcg accatcatca tcatcatcat tgagtttgta 720gccttagaca tgactgttcc tcagttcaag ttgggcactt acgagaagac cggtcttgct 780agattctaat caagaggatg tcagaatgcc atttgc                           816<210>20<211>1373<212>DNA<213>Agkistrodon contortrix<220><223>Agkistrodon contortrix fibrolase的片段<400>20tactattgcc agcattgctg ctaaagaaga aggggtatct ctcgagaaaa gagaggctga 60agcttcttct attatcttgg aatctggtaa cgttaacgat tacgaagttg tttatccaag 120aaaggtcact ccagttccta ggggtgctgt tcaaccaaag tacgaagatg ccatgcaata 180cgaattcaag gttaacagtg aaccagttgt cttgcacttg gaaaaaaaca aaggtttgtt 240ctctgaagat tactctgaaa ctcattactc cccagatggt agagaaatta ctacttaccc 300attgggtgaa gatcactgtt actaccatgg tagaatcgaa aacgatgctg actccactgc 360ttctatctct gcttgtaacg gtttgaaggg tcatttcaag ttgcaaggtg aaatgtactt 420gattgaacca ttggaattgt ccgactctga agcccatgct gtctacaagt acgaaaacgt 480cgaaaaggaa gatgaagccc caaagatgtg tggtgttacc caaaactggg aatcatatga 540accaatcaag aaggccttcc aattaaactt gactaagaga tctttcccac aaagatacgt 600acagctggtt atcgttgctg accaccgtat gaacactaaa tacaacggtg actctgacaa 660aatccgtcaa tgggtgcacc aaatcgtcaa caccattaac gaaatctaca gaccactgaa 720catccaattc actttggttg gtttggaaat ctggtccaac caagatttga tcaccgttac 780ttctgtatcc cacgacactc tggcatcctt cggtaactgg cgtgaaaccg acctgctgcg 840tcgccaacgt catgataacg ctcaactgct gaccgctatc gacttcgacg gtgatactgt 900tggtctggct tacgttggtg gcatgtgtca actgaaacat tctactggtg ttatccagga 960ccactccgct attaacctgc tggttgctct gaccatggca cacgaactgg gtcataacct 1020gggtatgaac cacgatggca accagtgtca ctgcggtgca aactcctgtg ttatggctgc 1080tatgctgtcc gatcaaccat ccaaactgtt ctccgactgc tctaagaaag actaccagac 1140cttcctgacc gttaacaacc cgcagtgtat cctgaacaaa ccgtaagcgg ccgccagctt 1200tctagaacaa aaactcatct cagaagagga tctgaatagc gccgtcgacc atcatcatca 1260tcatcattga gtttgtagcc ttagacatga ctgttcctca gttcaagttg ggcacttacg 1320agaagaccgg tcttgctaga ttctaatcaa gaggatgtca gaatgccatt tgc        1373

Claims (19)

1.一种纤维蛋白溶解活性多肽，所述多肽具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

2.权利要求1的多肽，所述多肽是通过在酵母中重组表达而制备的。

3.一种核酸分子，所述核酸分子编码SEQ ID NO：1的多肽。

4.权利要求3的核酸分子，所述核酸分子具有SEQ ID NO：4的序列。

5.一种表达载体，所述表达载体包含与权利要求3的核酸分子有效连接的表达调节元件。

6.一种权利要求5的表达载体，其中所述核酸分子具有SEQ IDNO：4的核苷酸序列。

7.一种宿主细胞，所述宿主细胞已用权利要求3的核酸分子转化或转染。

8.一种权利要求7的转化或转染宿主细胞，所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞。

9.一种权利要求8的转化或转染原核细胞，所述细胞是一种酵母细胞

10.一种权利要求9的转化或转染酵母细胞，所述酵母细胞是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。

11.一种生产NAT的方法，所述方法包括：将含编码所述金属蛋白酶的DNA分子的宿主细胞在使得所述DNA分子表达的条件下培养，其中所述DNA分子与用于刺激所述DNA表达的调节元件有效连接；并且从所述宿主细胞培养物中分离所表达的金属蛋白酶。

12.权利要求11的方法，其中所述DNA分子是SEQ ID NO：4的DNA分子。

13.权利要求11的方法，其中所述宿主细胞是酵母细胞。

14.权利要求13的方法，其中所述酵母细胞是巴斯德毕赤酵母细胞。

15.一种生产金属蛋白酶纤维蛋白溶解剂的方法，所述纤维蛋白溶解剂选自fibrolase和NAT；所述方法包括：将含编码所述金属蛋白酶的DNA分子的毕赤酵母属宿主细胞在使得所述DNA分子表达的条件下培养，其中所述DNA分子与用于刺激所述DNA分子表达的调节元件有效连接；并且从所述宿主细胞培养物中分离所表达的金属蛋白酶。

16.权利要求15的方法，其中所述毕赤酵母属宿主细胞是巴斯德毕赤酵母。

17.一种用于治疗哺乳动物血栓形成的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物血栓溶解有效量的NAT。

18.一种抗体，所述抗体是针对权利要求1的多肽的抗体。

19.权利要求17的抗体，所述抗体是一种单克隆抗体。

Images