CN1348332A - 疫苗和基因治疗组合物以及其制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了在个体中诱导针对免疫原的免疫应答的方法。该方法包括向个体给予一种或多种核酸分子,其包括编码所述免疫原的核苷酸序列和编码主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列。编码所述免疫原和主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列在被个体的细胞摄取时表达,针对所述免疫原的免疫应答在个体中被诱导出来。公开了使接受细胞、组织或器官移植的个体对非匹配供体细胞、组织或器官的排斥减少的方法。该方法包括向个体给予一种或多种核酸分子,所述核酸分子包括编码死亡信号或毒素的核苷酸序列或编码与供体细胞、组织或器官匹配的主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列。编码主要组织相容性复合体抗原和死亡信号或毒素的核苷酸序列在被个体的细胞摄取时表达。T细胞经与死亡信号或毒素作用而死亡,这导致对非匹配供体细胞、组织或器官的排斥减少。还公开了减少个体中优势免疫应答的方法和扩展与特异性免疫应答相关的T细胞亚群的方法。公开了可用于实施本发明方法的质粒和包括质粒的组合物。

Description

疫苗和基因治疗组合物以及其制备和使用方法
发明领域
本发明涉及在个体中诱导预防性和/或治疗性免疫应答的疫苗和方法。本发明涉及对接受细胞、组织和/或器官移植的患者进行治疗的组合物和方法。本发明涉及调节免疫应答的组合物和方法。
发明背景
疫苗可用于使个体对靶抗原产生免疫，所述靶抗原例如为病原体抗原或与涉及人类疾病的细胞相关联的抗原。与涉及人类疾病的细胞相关联的抗原包括癌相关性肿瘤抗原和与涉及自身免疫病的细胞相关联的抗原。
在设计这些疫苗时认识到，在接种了疫苗的个体中产生靶抗原的疫苗可有效诱导免疫系统的细胞臂。具体而言，减毒的活疫苗、使用无毒载体的重组疫苗和DNA疫苗均导致抗原在接种了疫苗的个体的细胞中产生，由此诱导免疫系统的细胞臂。另一方面，只包括蛋白和诱导体液应答的死疫苗或灭活疫苗的亚单位疫苗，不诱导良好的细胞免疫应答。
对于提供抗病原体感染保护，和提供有效用于治疗病原体感染、癌症或自身免疫病的免疫介导疗法，细胞免疫应答常常是必须的。因此，在接种了疫苗的个体中产生靶抗原的疫苗是优选的，例如减毒的活疫苗、使用无毒载体的重组疫苗和DNA疫苗。
尽管据报导一些疫苗对于预防性或治疗性地使个体免患病原体感染或人类疾病是有效的，但改良的疫苗仍是需要的。产生增强的免疫应答的组合物和方法也是需要的。
免疫应答也涉及移植患者所经历的细胞、组织和器官的排斥和移植物抗宿主疾病。供体细胞、组织和器官常常具有不同于受体细胞的主要组织相容性复合体(MHCI)抗原亚型。受体的免疫系统检测出MHCI亚型的不同，并指导针对供体细胞、组织和器官的免疫应答。
与之相似，对于接受骨髓移植的患者，MHC II抗原亚型的不同可导致对表达MHC II抗原的供体细胞的排斥。
可防止移植排斥或减轻其程度的组合物和方法是需要的。
发明概述
本发明涉及在个体中诱导针对免疫原的免疫应答的方法。所述方法包括在个体身体的某个位置上向个体给予核酸分子，所述核酸分子包括可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接的编码免疫原的核苷酸序列和可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列。所述的核酸分子被个体细胞所摄取。在那里，编码免疫原和主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列得以表达，针对所述免疫原的免疫应答在个体中诱导出来。另外，这些方法还可进一步地或仅包括在个体身体的某个位置上向个体给予第一核酸分子和第二核酸分子。第一核酸分子包括可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接的编码免疫原的核苷酸序列。第二核酸分子包括可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列。所述的核酸分子被个体细胞所摄取，编码免疫原和主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列得以表达，针对所述免疫原的免疫应答在个体中诱导出来。在一些实施方案中，核酸分子进一步包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列。
本发明还涉及质粒及其药物组合物，所述质粒包括可操作地与调控元件相连接的编码免疫原的核苷酸序列，可操作地与调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列，和任选的可操作地与调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列。
本发明还涉及包括第一质粒和第二质粒的组合物，其中第一质粒包括可操作地与调控元件相连接的编码免疫原的核苷酸序列，和可操作地与调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列，第二质粒包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列。
本发明还涉及一质粒，其包括可操作地与调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列，和可操作地与调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列。
本发明还涉及包括第一质粒和第二质粒的组合物。所述第一质粒包括编码免疫原的核苷酸序列，所述第二质粒包括编码主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列。两种质粒均可以任选地进一步包括编码B7.2的核苷酸序列。该组合物可任选地包括第三质粒，其包括编码B7.2的核苷酸序列。
本发明还涉及使接受细胞、组织或器官移植的个体对非匹配供体细胞、组织或器官的排斥减少的方法。该方法包括向个体给予一种或多种核酸分子的步骤，所述核酸分子包括可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列或可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列。主要组织相容性复合体抗原与供体细胞、组织或器官匹配。所述的核酸分子被个体细胞所摄取，在那里，编码主要组织相容性复合体抗原和死亡信号或毒素的核苷酸序列得以表达。T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由细胞表达的主要组织相容性复合体抗原。T细胞在复合体形成后经与死亡信号或毒素作用而死亡。由此使对个体中的非匹配供体细胞、组织或器官的排斥减少。另外，这些方法还可进一步地或仅包括在个体的某个位置上向个体给予第一核酸分子和第二核酸分子。第一核酸分子包括编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。第二核酸分子包括编码主要组织相容性复合体I类抗原的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。主要组织相容性复合体抗原与供体细胞、组织或器官匹配。所述的第一和第二核酸分子被个体细胞所摄取，在那里，编码主要组织相容性复合体抗原和死亡信号或毒素的核苷酸序列得以表达。T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由细胞表达的主要组织相容性复合体抗原。T细胞在复合体形成后经与死亡信号或毒素作用而死亡，并且使对个体中的非匹配供体细胞、组织或器官的排斥减少。在一些实施方案中，核酸分子进一步包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列。
本发明还涉及质粒及其药物组合物，所述质粒包括可操作地与调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，可操作地与调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列，和任选的可操作地与调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列。
本发明还涉及包括第一质粒和第二质粒的组合物。第一质粒包括可操作地与调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，和可操作地与调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列。第二质粒包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列。
本发明还涉及质粒，所述质粒包括可操作地与调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列，和编码死亡信号或毒素的核苷酸序列。
本发明还涉及包括第一质粒和第二质粒的组合物。第一质粒包括编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，第二质粒包括编码主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列。
本发明还涉及减少个体中优势免疫应答的方法。这些方法包括识别主要组织相容性复合体抗原亚型，该亚型和与优势免疫应答相关的T细胞亚群形成复合体。在个体身体的某个位置上，向个体给予核酸分子，所述核酸分子包括可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列和可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原亚型的核苷酸序列。所述的核酸分子被个体细胞所摄取，在那里，编码主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列和编码死亡信号或毒素的核苷酸序列得以表达。T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由细胞表达的主要组织相容性复合体抗原亚型。T细胞在复合体形成后经与死亡信号或毒素作用而死亡，个体中的优势免疫应答减少。另外，还可进一步地或仅在个体的某个位置上向个体给予第一核酸分子和第二核酸分子。第一核酸分子包括编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。第二核酸分子包括编码主要组织相容性复合体抗原亚型的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。所述的第一和第二核酸分子被个体细胞所摄取，在那里，编码主要组织相容性复合体抗原亚型的核苷酸序列和编码死亡信号或毒素的核苷酸序列得以表达。T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由细胞表达的主要组织相容性复合体抗原亚型。T细胞在复合体形成后经与死亡信号或毒素作用而死亡，个体中的优势免疫应答减少。
本发明还涉及扩展与特异性免疫应答相关的T细胞亚群的方法。该方法包括识别主要组织相容性复合体抗原亚型，该亚型和与特异性免疫应答相关的T细胞亚群形成复合体。在个体身体的某个位置上向个体给予核酸分子，所述核酸分子包括可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列和可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原亚型的核苷酸序列。所述的核酸分子被个体细胞所摄取，在那里，编码主要组织相容性复合体抗原亚型的核苷酸序列和编码B7.2蛋白的核苷酸序列得以表达。T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由细胞表达的主要组织相容性复合体抗原亚型。T细胞在复合体形成后经与B7.2作用而增殖。与特异性免疫应答相关的T细胞亚群扩展。另外，还可进一步地或仅在个体的某个位置上向个体给予第一核酸分子和第二核酸分子。第一核酸分子包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。第二核酸分子包括编码主要组织相容性复合体抗原亚型的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。所述的核酸分子被个体细胞所摄取，在那里，编码主要组织相容性复合体抗原亚型的核苷酸序列和编码B7.2蛋白的核苷酸序列得以表达。T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由细胞表达的主要组织相容性复合体抗原亚型，T细胞在复合体形成后经与B7.2作用而增殖，与特异性免疫应答相关的T细胞亚群扩展。
附图简述
图1显示利用流式细胞仪测定嵌合作用所得的数据。在移植后三个月，利用免疫荧光染色，分析外周血单核细胞(PBMC)的MHC I类表达，从而证实嵌合小鼠的产生。β2m-/-→β2m+/+小鼠的PBMC不显著表达MHC I类分子，而β2m+/+→β2m-/-小鼠的PBMC表达MHC I类分子。
图2A和2B显示在β2m+/+、β2m-/-、β2m+/+→β2m-/-和β2m-/-→β2m+/+小鼠中直接(图2A)和间接(图2B)的痘苗病毒(vMN462)特异性CTL应答。在不进行活体外刺激效应细胞的情况下用牛痘免疫后7天，分析直接的牛痘特异性CTL应答。在活体外刺激效应细胞的情况下用牛痘免疫后4周，进行间接的牛痘特异性CTL测定。为了计算靶细胞的比溶，用特异性(被vMN462感染的)靶细胞的溶解百分率减去非特异性(未被感染的)靶细胞的溶解百分率。实验重复两次，得到相似的结果。
图3显示了在用pCDNA3、pCEnv、pCEnv+pCD80或pCEnV+pCD86免疫的β2m-/-、β2m+/+→β2m-/-和β2m-/-→β2m+/+嵌合体(每组4只小鼠)中的HIV-1包膜特异性CTL应答。针对在活体外刺激效应细胞后被牛痘感染的靶细胞，分析HIV-1包膜特异性CTL应答。为计算靶细胞的比溶解率，用特异性(被vMN462感染的)靶细胞的溶解百分率减去非特异性(被WR感染的)靶细胞的溶解百分率。实验重复两次，得到相似的结果。
图4显示了证明在用pCDNA3、pCEnv、pCEnv+pCD80或pCEnv+pCD86免疫的β2m-/-→β2m+/+嵌合小鼠中的直接HIV-1包膜特异性CTL应答的数据。针对在不进行活体外刺激效应细胞的情况下被牛痘感染的靶细胞，分析HIV-1包膜特异性CTL应答。在这些实验中，非特异性溶解的最高水平低于5％。
图5显示了证明受激效应细胞表达细胞因子的数据。在第6天收集来自用于CTL测定的受激细胞的上清液，并使用针对IFN-γ和IL-4的ELISA试剂盒(两试剂盒均来自Biosource International，Inc.，Camarillo，CA)测定细胞因子的分布。实验重复两次，得到相似的结果。
图6显示了证明在肌肉中存在CD4+和CD8+T细胞的数据。肌肉细胞用pCEnv+pCD86共免疫，然后浸润细胞进一步用抗CD4+或抗CD8+的抗体染色。从已染色的载玻片中，对CD4+和CD8+T细胞计数。
优选实施方案的说明
本文使用的术语“遗传构建体”指的是DNA分子，其包括编码蛋白并包括了起始和终止信号的核苷酸序列，所述起始和终止信号可操作地与调控元件相连接，所述调控元件包括启动子和能在个体细胞中指导表达的多腺苷酸化信号。
本文使用的术语“可表达形式”指的是含有必要的调控元件的基因构建体，所述调控元件可操作地与编码蛋白的编码序列相连接，从而当存在于个体细胞中时，所述编码序列将得以表达。
本文使用的术语“保护性免疫应答”和“预防性免疫应答”可互换使用，指的是靶向个体尚未暴露于其中的免疫原的免疫应答，所述免疫原例如为未感染个体中的病原体抗原，或与未患疾病的个体中的蛋白相关的疾病细胞，所述疾病例如是与未患肿瘤的患者中的蛋白相关的肿瘤。
本文使用的术语“治疗性免疫应答”指的是靶向个体已暴露其中的免疫原的免疫应答，所述免疫原例如为已感染个体中的病原体抗原，或与已患疾病的个体中的蛋白相关的疾病细胞，所述疾病例如是与患有肿瘤的患者中的蛋白相关的肿瘤。
本文使用的术语“预防有效量”，在传染物的情况下，指的是防止个体受到感染的必要量，在细胞特异性疾病的情况下，指的是防止个体发展成细胞特异性疾病的必要量。
本文使用的术语“治疗有效量”，在传染物的情况下，指的是减少已感染的个体中感染水平以减轻症状或消除感染的必要量，在细胞特异性疾病的情况下，指的是减少患有细胞特异性疾病的个体中的细胞特异性疾病细胞数以减轻症状或治愈个体的必要量。
本文使用的术语“细胞特异性疾病”指的是自身免疫病和以细胞过度增殖为特征的疾病如癌症。
本文使用的术语“免疫原”、“抗原”、“靶抗原”和“靶蛋白”可互换使用，指的是由本发明的基因构建体编码的肽、多肽和蛋白，它们作为针对其诱导免疫应答的目标。
本文使用的术语“诱导针对免疫原的免疫应答”指的是在自然个体中诱导免疫应答，和在先前暴露于免疫原的个体中诱导免疫应答，其中后者针对免疫原的免疫应答是增强了的。因此，可利用本发明的方法治疗例如患有病原体感染的个体，以诱导针对病原体抗原的免疫应答。在已感染的个体中将诱导出对抗病原体的治疗性免疫应答。
本文使用的术语“表达所必需的调控元件”指的是基因构建体的编码序列成为可表达形式所必须的调控元件。
本文使用的术语“主要组织相容性复合体抗原亚型”指的是MHCI类抗原等位基因或MHC II类抗原等位基因的蛋白产物。
本文使用的术语“匹配”，当涉及主要组织相容性复合体抗原亚型时，指的是相同组和亚型的主要组织相容性复合体抗原。
本文使用的术语“非匹配”，当涉及供体细胞、组织或器官的主要组织相容性复合体抗原亚型时，指的是不同组和亚型的主要组织相容性复合体抗原。非匹配供体细胞、组织或器官表达与受体个体不同的主要组织相容性复合体抗原亚型。非匹配供体也称作同种异型供体。
本文使用的术语“T细胞与死亡信号或毒素的作用”指的是T细胞具有的与个体细胞所表达的死亡信号或毒素之间的作用，该作用导致T细胞死亡。例如，当fas/fas受体是所用的死亡信号系统时，fas死亡信号(fas配体-fas-1)与T细胞上fas受体的作用导致T细胞死亡。
本文使用的术语“优势免疫应答”指的是针对某一抗原的胜过针对任何其他抗原的免疫应答的免疫应答，其包括细胞和体液组分。
本文使用的术语“扩展T细胞亚群”指的是使特定的T细胞克隆增殖。
本文使用的术语“特异性免疫应答”指的是针对特定表位的细胞或体液免疫应答。通过在MHC、抗原和T细胞的T细胞受体(TCR)之间形成复合体，MHC将表位呈递给T细胞，然后针对抗原的特定表位的特异性免疫应答被诱导出来。参与形成复合体的特定T细胞表达与MHC/抗原复合体特异性作用的TCR。
主要组织相容性复合体(MHC)抗原实际上是一个蛋白异二聚体家族，这些蛋白异二聚体是免疫球蛋白超家族的成员。这些抗原是在免疫系统中发挥作用的细胞蛋白，主要作为抗原呈递者。MHC与抗原形成复合体，MHC/抗原复合体被呈递给对MHC/抗原复合体具有特异性的T细胞受体，在复合体中抗原是特定的表位。因此，T细胞受体不是只识别特定的表位，而是只识别在特定MHC中呈递的特定表位。MHC/抗原复合体和T细胞受体之间的作用对于针对抗原的免疫应答的诱导、维持和记忆是必需的。MHC抗原，包括其结构和功能，述于Stites，D.P.等人，基础和临床免疫学(Basic And ClinicalImmunology)，第6版，1987，Appleton and Lange，Norwalk，CT；和Roitt，I.M.等人，免疫学(Immunology)，1985，C.V.Moseby Co.St.Louis MO，Toronto，Gower Medical Publishing，London UK，New York，NY，这些文献均引入本文作参考。
通常将MHC蛋白分成两大组，主要组织相容性复合体I类(MHC I)抗原和主要组织相容性复合体II类(MHC II)抗原。这两类蛋白在免疫系统中具有不同的抗原呈递功能。但是，它们均由高度多态的基因所编码，提供多种等位基因，由此允许有可与不同抗原表位结合的多种不同的MHC亚型，这些抗原表位将被免疫系统检测到。MHC I类抗原和MHC II类抗原将抗原呈递到不同的T细胞：MHC I类抗原将抗原呈递到细胞毒性T细胞，而MHC II类抗原将抗原呈递到辅助性T细胞和抑制性T细胞。MHC抗原也被称作人白细胞抗原(HLA)。对于I和II类，在每一种中均存在若干亚类，其各自包括有不同等位基因编码的若干亚型。
MHC I抗原涉及HLA亚类：HLA-A、HLA-B和HLA-C抗原。事实上，发现这三个亚类存在于每一种人类细胞中。I类抗原的结构由双链蛋白复合体组成，该复合体包括一分子量为44000的多态性糖蛋白。对于HLA-A基因座，至少有23个不同的等位基因(因此至少有23种HLA-A亚型)；对于HLA-B基因座，至少有47个不同的等位基因(因此至少有47种HLA-B亚型)；对于HLA-C基因座，至少有8个不同的等位基因(因此至少有8种HLA-C亚型)。每一个人表达多种等位基因的不同组合。即，个体表达不同的亚型集合。因此，可将每一个人分型，以确定在其细胞上存在什么样的HLA-A、HLA-B和HLA-C亚型组合。对I类抗原进行HLA分型，是一种被称为淋巴细胞微量细胞毒测定的方法。简言之，将针对HLA-A、HLA-B和HLA-C抗原的多种抗血清置于分型盘的微量孔中。将1000-2000个外周血淋巴细胞加入各微量孔中。在温育后，加入补体，继续温育。然后，加入重要的染料，例如曙红。使用相位显微镜术，基于溶解的细胞将摄取染料而活细胞保持未染色这一事实，将活细胞与死细胞区分开。然后，基于反应模式，将指定个体的HLA-A、HLA-B和HLA-C表型定位。
MHC II类抗原涉及HLA亚型HAL-D、HAL-DR、HLA-DQ和HLA-DP。主要在免疫活性细胞如巨噬细胞、单核细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞的表面上发现存在II类抗原。DP抗原与其它II类抗原不同，它们引发强的继发增殖反应，并作为CTL的靶抗原。至少有19个HLA-D等位基因(编码至少19个HLA-D亚型)，至少有16个HLA-DR等位基因(编码至少16个HLA-DR亚型)，至少有3个HLA-DQ等位基因(编码至少3个HLA-DQ亚型)，至少有6个HLA-DP等位基因(编码至少6个HLA-DP亚型)。对HLA-DR和HLA-DQ分型可以类似于HLA I类抗原分型方式的方式进行，除了用已纯化的B淋巴细胞群代替外周血淋巴细胞之外。使用混合淋巴细胞反应，将HLA-D抗原分型。使用一级淋巴细胞分型法，将HLA-DP抗原分型。
B7.2最早述于Azuma，M.等人，1993，自然(Nature)366：76-79，该文献引入本文作参考。该出版物的图2B公开了B7.2蛋白的核苷酸序列和预测的氨基酸序列。所述序列信息也可参见Genbank数据库中的U04343，其引入本文作参考。
死亡结构域受体包括但不限于：Apo-1(Oehm等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，1992，267(15)，10709-15；入藏登记号为X63717)；Fas(Itoh等人，细胞(Cell)，1991，66(2)，233-43；入藏登记号为M67454)；TNFR-1(Nophar等人，EMBO J.，1990，9(10)，3269-78；入藏登记号为M67454)；p55(Loetscher等人，细胞(Cell)，1990，61，351-359；入藏登记号为M58286、M33480)；WSL-1(Kitson等人，自然(Nature)，1996，384(6607)，372-5；入藏登记号为Y09392)；DR3(Chinnaiyan等人，科学(Science)，1996，274(5829)，990-2；入藏登记号为U72763)；TRAMP(Bodmer等人，免疫(Immunity)，1997，6(1)，79-88；入藏登记号为U75381)；Apo-3(Marsters等人，当代生物学(Curr.Biol.)，1996，6(12)，1669-76；入藏登记号为U74611)；AIR(Degli-Esposti等人，直接提交；入藏登记号为U78029)；LARD(Screaton等人，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，1997，94(9)，4615-19；入藏登记号为U94512)；NGRF(Johnson等人，细胞(Cell)，1986，47(4)，545-554；入藏登记号为M14764)；DR4(Pan等人，科学(Science)，1997，276(5309)，111-113；入藏登记号为U90875)；DR5(Sheridan等人，科学(Science)，1997，277(5327)，818-821；入藏登记号为AF012535)；KILLER(Wu等人，自然遗传学(Nature Genetics)，出版中)；TRAIL-R2(MacFarlane等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，1997，出版中；入藏登记号为AF020501)；TRICK2(Screaton等人，当代生物学(Curr.Biol.)，1997，出版中；入藏登记号为AF018657)；DR6(Pan等人，未出版；入藏登记号为AF068868)。这些文献和Genbank序列引入本文作参考。
死亡信号即为与死亡结构域受体相互作用的蛋白，包括但不限于：FADD(Chinnaiyan等人，细胞(Cell)，1995，81(4)，505-12；入藏登记号为U24231)；FAP-1(Sato等人，科学(Science)，1995，268(5209)，411-15；入藏登记号为L34583)；TRADD(Hsu等人，细胞(Cell)，1995，81(4)，495-504；入藏登记号为L41690)；RIP(Stanger等人，细胞(cell)，1995，81(4)，513-23；入藏登记号为U25994)；和FLICE(Muzio等人，细胞(Cell)，1996，85(6)，817-27；入藏登记号为U58143)；RAIDD(Lennon等人，基因组(Genomics)，1996，33(1)，151-2；入藏登记号为U79115)。这些文献和Genbank序列引入本文作参考。死亡信号还包括与死亡结构域受体结合并起始编程性细胞死亡的配体，包括但不限于：FAS-L(Alderson等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)，1995，181(1)，71-7；入藏登记号为U08137)和TNF，这些文献和Genbank序列引入本文作参考；和与死亡结构域受体相互作用的中介体，其包括但不限于：FADD(Chinnaiyan等人，细胞(Cell)，1995，81(4)，505-12；入藏登记号为U24231)；MORT1(Boldin等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，1995，270(14)，7795-8；入藏登记号为X84709)；CRADD(Ahmad等人，癌症研究(Cancer Res.)，1997，57(4)，615-9；入藏登记号为U84388)；和MyD88(Bonnert等人，FEBS Lett.，1997，402(1)，81-4；入藏登记号为U84408)。这些文献和Genbank序列引入本文作参考。
毒素包括杀死细胞的蛋白。毒素包括但不限于昆虫和蛇的毒液、细菌内毒素如假单胞菌内毒素、双链核糖体灭活性蛋白如包括单链毒素的篦麻毒素和gelonin。
已发现，当疫苗中除免疫原之外还包括编码MHC抗原的核苷酸序列的可表达形式时，针对由疫苗编码的免疫原的免疫应答得到增强。如此表达的MHC抗原将免疫原呈递给T细胞，产生增强的免疫应答。本发明提供在个体中诱导或增强针对免疫原的免疫应答的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在个体身体的某个位置上向个体给予核酸分子的步骤，所述核酸分子包括可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接的编码免疫原的核苷酸序列和可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接的编码MHC抗原的核苷酸序列。所述的核酸分子被个体细胞所摄取，在那里，编码免疫原和MHC的核苷酸序列分别得以表达。所产生的MHC将免疫原的表位呈递给个体免疫系统中的T细胞，针对免疫原的增强的免疫应答在个体中诱导出来。在一些实施方案中，所述方法包括在个体身体的某个位置上向个体给予至少两种不同核酸分子的步骤。第一核酸分子包括编码免疫原的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。第二核酸分子包括编码MHC抗原的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。第一和第二核酸分子均被个体细胞所摄取，在那里，编码免疫原和MHC抗原的核苷酸序列分别得以表达。所产生的MHC将免疫原的表位呈递给个体免疫系统中的T细胞，针对免疫原的增强的免疫应答在个体中诱导出来。
在一些实施方案中，在给予个体的核酸分子中包括了编码MHC I抗原的核苷酸序列。在一些实施方案中，MHC I类抗原与个体所表达的MHC I抗原等位基因匹配。如上所述，可按常规对个体进行MHC表型分型。一旦鉴定了由个体表达的MHC I等位基因，则可制备或从所制备的基因构建体中选出包括编码由个体表达的亚型的核苷酸序列的基因构建体，从而证明给予个体的是匹配的MHC I。
在一些实施方案中，在给予个体的核酸分子中包括了编码MHC II抗原的核苷酸序列。在一些实施方案中，MHC II类抗原与个体所表达的MHC II抗原等位基因匹配。如上所述，可按常规对个体进行MHC表型分型。一旦鉴定了由个体表达的MHC II等位基因，则可制备或从所制备的基因构建体中选出包括编码由个体表达的亚型的核苷酸序列的基因构建体，从而证明给予个体的是匹配的MHC II。
本发明一方面涉及使用编码MHC I蛋白和免疫原的遗传物质的组合物和方法。本发明另一方面涉及使用编码MHC II蛋白和免疫原的遗传物质的组合物和方法。这些方法涉及已改良的诱导针对免疫原性目标的预防性和治疗性免疫应答的方法。因此，通过提供可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接的编码MHC I抗原和/或MHC II抗原的核苷酸序列和可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接的编码免疫原的核苷酸序列，本发明的一些实施方案提供了改良的疫苗。组合物可以是疫苗如DNA疫苗、无毒重组载体疫苗和减毒的活疫苗。
还发现，当疫苗中除免疫原之外还包括编码B7.2蛋白和MHC抗原的核苷酸序列的可表达形式时，针对由疫苗编码的免疫原的免疫应答得到增强。由此，B7.2蛋白和MHC抗原在接种了疫苗的个体的细胞中共产生，所述细胞表达靶抗原。根据本发明的这一方面，提供了使用编码免疫原、B7.2蛋白、MHC I抗原和/或MHC II抗原蛋白的遗传物质的组合物和方法。这些方法涉及已改良的诱导针对免疫原性目标的预防性和治疗性免疫应答的方法。因此，通过提供可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接的编码B7.2的核苷酸序列、可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接的编码MHC I抗原和/或MHC II抗原的核苷酸序列和可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接的编码免疫原的核苷酸序列，本发明的一些实施方案提供了改良的疫苗。组合物可以是疫苗如DNA疫苗、无毒重组载体疫苗和减毒的活疫苗。
根据本发明的一些实施方案，给予个体的遗传物质包括核酸分子，该分子包括编码免疫原的核苷酸序列、编码MHC I抗原的核苷酸序列和编码B7.2蛋白的核苷酸序列。各核苷酸序列均可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。
根据本发明的一些实施方案，给予个体的遗传物质包括第一核酸分子和第二核酸分子。第一核酸分子包括编码免疫原的核苷酸序列和编码B7.2蛋白的核苷酸序列。两核苷酸序列均可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。第二核酸分子包括编码MHC I抗原的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。
根据本发明的一些实施方案，给予个体的遗传物质包括第一核酸分子和第二核酸分子。第一核酸分子包括编码免疫原的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。第二核酸分子包括编码MHC I抗原的核苷酸序列和编码B7.2蛋白的核苷酸序列。这两个核苷酸序列均可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。
根据本发明的一些实施方案，给予个体的遗传物质包括第一核酸分子和第二核酸分子。第一核酸分子包括编码免疫原的核苷酸序列和编码MHC I抗原的核苷酸序列。这两个核苷酸序列均可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。第二核酸分子包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。
根据本发明的一些实施方案，给予个体的遗传物质包括第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子。第一核酸分子包括编码免疫原的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。第二核酸分子包括编码MHC I抗原的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。第三核酸分子包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。
根据本发明的一些实施方案，给予个体的遗传物质包括编码免疫原的核苷酸序列、编码MHC II抗原的核苷酸序列和编码B7.2蛋白的核苷酸序列。各核酸序列均可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。
根据本发明的一些实施方案，给予个体的遗传物质包括第一核酸分子和第二核酸分子。第一核酸分子包括编码免疫原的核苷酸序列和编码B7.2蛋白的核苷酸序列。两核苷酸序列均可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。第二核酸分子包括编码MHC II抗原的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。
根据本发明的一些实施方案，给予个体的遗传物质包括第一核酸分子和第二核酸分子。第一核酸分子包括编码免疫原的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。第二核酸分子包括编码MHC II抗原的核苷酸序列和编码B7.2蛋白的核苷酸序列。这两个核苷酸序列均可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。
根据本发明的一些实施方案，给予个体的遗传物质包括第一核酸分子和第二核酸分子。第一核酸分子包括编码免疫原的核苷酸序列和编码MHC II抗原的核苷酸序列。这两个核苷酸序列均可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。第二核酸分子包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。
根据本发明的一些实施方案，给予个体的遗传物质包括第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子。第一核酸分子包括编码免疫原的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。第二核酸分子包括编码MHC II抗原的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。第三核酸分子包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。
遗传物质由个体细胞所表达，它用作免疫原性目标，针对该目标来引发免疫应答。产生的免疫应答具有广泛的基础：除体液免疫应答之外，还引发了细胞免疫应答的两个臂。本发明的方法可用于产生预防性和治疗性免疫。因此，免疫方法包括针对免疫原的免疫方法、例如由此保护个体抵抗病原体攻击或者特定细胞出现或增殖的免疫方法和治疗患有病原体感染、超常增殖性疾病或自身免疫病的个体的方法。
靶蛋白优选是需要针对其诱导免疫的免疫原性蛋白，其与来自病原体或不希望的细胞类型的蛋白具有至少一个相同的表位，所述不希望的细胞类型例如为癌症细胞或参与自身免疫病的细胞。针对靶蛋白的免疫应答，将保护个体抵抗与靶蛋白相关的特定感染或疾病，或者治疗个体的上述感染或疾病。
本发明可用于引发针对靶蛋白的广谱免疫应答，所述靶蛋白即与病原体、变态反应原或个体自身的“异常”细胞特异性相关的蛋白。本发明可用于使个体具有对抗病原性物质和生物的免疫性，从而针对病原体蛋白的免疫应答提供对抗病原体的保护性免疫。通过诱发针对与超常增殖性细胞特异性相关的靶蛋白的免疫应答，本发明可用于对抗超常增殖性疾病和障碍如癌症。通过诱发针对与参与自身免疫病的细胞特异性相关的靶蛋白的免疫应答，本发明可用于对抗自身免疫性疾病和障碍。
根据本发明传递到细胞的核酸分子可用作免疫原的遗传模板，所述免疫原用作预防性和/或治疗性免疫剂。本发明可用于使个体对所有病原体如病毒、原核生物和病原性真核生物如单细胞病原生物和多细胞寄生虫具有免疫性。本发明特别可用于使个体对那些感染细胞和未被包封的病原体如病毒，和原核生物如淋病菌属(gonorrhea)、李斯特菌属和志贺菌属具有免疫性。此外，本发明也可用于使个体对原生动物病原体具有免疫性，这些原生动物病原体在生命周期中包括一个阶段，在其中它们是细胞内病原体。本文使用的术语“细胞内病原体”指的是病毒或病原生物，它们在至少一部分复制或生命周期中，存在于宿主细胞内，并在其中产生病原体蛋白或使其得以产生。表2提供了一些病毒科和病毒属的列表，可针对它们制备本发明的疫苗。DNA构建体可用于疫苗中，所述构建体包括编码包括至少一个表位的肽的DNA序列，所述表位与在病原体抗原例如表中列出的那些抗原上展示的表位相同或基本上相似。此外，本发明也可用于使个体对其他病原体具有免疫性，这些病原体包括原核和真核原生生物病原体和多细胞寄生虫，例如表3中列出的那些病原体。
为了产生基因疫苗以防止病原体感染，编码免疫原性蛋白的遗传物质必须包括在遗传构建体中作为目标的编码序列，可针对所述免疫原性蛋白诱导保护性免疫应答。无论是本发明特别适用的细胞内病原体感染还是细胞外病原体感染，未必所有的病原体抗原可引发保护性应答。由于DNA和RNA都比较小，较易于产生，因此本发明提供了允许使用多种病原体抗原进行疫苗接种的额外优点。用于基因疫苗的遗传构建体可包括编码许多病原体抗原的遗传物质。例如通过提供多种目标，在单一构建体中可包括若干病毒基因。
表2和3包括一些病原性物质和生物的列表，可针对它们来制备基因疫苗以保护个体不被它们感染。在一些优选的实施方案中，使个体对病原体具有免疫性的方法是针对HIV、HTLV或HBV的。
本发明另一方面提供了产生针对超常增殖性细胞的广谱保护性免疫应答的方法，和治疗患有超常增殖性疾病的个体的方法，所述超常增殖性细胞是超常增殖性疾病的特征。本文使用的术语“超常增殖性疾病”指的是以细胞超常增殖为特征的那些疾病和障碍。超常增殖性疾病的例子包括各种癌症和牛皮癣。
将包括编码与“超常增殖性细胞”相关的免疫原性蛋白的核苷酸序列的遗传构建体引入到个体细胞中，导致这些蛋白在接种了疫苗的个体中产生。本文使用的术语“超常增殖性相关蛋白”指的是与超常增殖性疾病相关的蛋白。为了使个体对超常增殖性疾病具有免疫性，将包括编码与“超常增殖性疾病”相关的蛋白的核苷酸序列的遗传构建体给予个体。
为了使超常增殖性相关蛋白成为有效的免疫原性目标，它必须专门在超常增殖性细胞中产生，或与正常细胞相比，在超常增殖性细胞中的水平较高。靶抗原包括这些蛋白、其片段和肽，所述片段和肽至少包括一个在该蛋白中发现的表位。有时，超常增殖性相关蛋白是编码蛋白的基因突变的产物。突变的基因编码的蛋白与正常蛋白几乎相同，除了具有稍微不同的氨基酸序列之外，这种不同产生不同的表位，在正常细胞中未发现该表位的存在。这样的靶蛋白包括由癌基因如myb、myc、fyn和易位基因bcr/abl、ras、src、P53、neu、trk和EGRF编码的蛋白。除了以癌基因产物作为靶抗原之外，用于抗癌治疗和保护计划的靶蛋白包括由B细胞淋巴瘤制备的抗体的可变区和T细胞淋巴瘤的T细胞受体的可变区，在一些实施方案中，其也作为靶抗原用于自身免疫病。其他肿瘤相关蛋白可用作靶蛋白，例如被发现以较高水平存在于肿瘤细胞中的蛋白，包括有单克隆抗体17-1A识别的蛋白，和叶酸结合性蛋白。
尽管本发明可用于使个体对若干癌症形式中的一种或多种具有免疫性，但本发明特别可用于预防性地对个体进行免疫，所述个体易于发展成特定癌症，或已患癌症并易于复发。遗传学、技术和流行病学的发展使得能够确定个体癌症发展的概率并估计其危险率。利用遗传筛选和/或家庭健康史，有可能预测特定个体发展出若干癌症类型中任一种的概率。
与之类似，已患有癌症的个体和已接受用于消除癌症的治疗或症状缓解的个体特别易于复发。作为治疗计划的一部分，可使这些个体对他们被确诊患有的癌症具有免疫性，以对抗复发。因此，一旦已知个体患有一种癌症和有复发的危险，可对其进行免疫，以使其免疫系统能够对抗未来所述癌症的发作。
本发明提供了治疗患有超常增殖性疾病的个体的方法。在这些方法中，引入遗传构建体，其用作免疫治疗剂，指导并促进个体的免疫系统对抗超常增殖性细胞，由该遗传构建体产生靶蛋白。
本发明提供了通过诱导针对目标的广谱保护性免疫应答，治疗患有自身免疫性疾病和障碍的个体的方法。所述目标与自身免疫相关，自身免疫包括细胞受体和产生“自”定向抗体的细胞。
T细胞介导的自身免疫病包括风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、干燥综合症、结节病、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、自身免疫性甲状腺炎、反应性关节炎、关节强硬性脊椎炎、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、牛皮癣、脉管炎、韦格纳肉芽肿病、局限性回肠炎和溃疡性结肠炎。这些疾病的特征均为存在下述T细胞受体，该受体结合内源性抗体并启动与自身免疫病相关的炎性级联。针对T细胞可变区的疫苗接种将引发包括CTL在内的免疫应答，以消除那些T细胞。
对于RA，已表征了若干参与所述疾病的T细胞受体(TCR)的特异性可变区。这些TCR包括Vβ-3、Vβ-14、Vβ-17和Vα-17。因此，用编码这些蛋白中至少一种的DNA构建体进行疫苗接种，将引发免疫应答，该免疫应答将靶向参与RA的T细胞。参见：Howell，M.D.等人，1991，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，88：10921-10925；Paliard，X.等人，1991，科学(Science)，253：325-329；Williams，W.V.等人，1992，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)，90：326-333；各文献均引入本文作参考。
对于MS，已表征了若干参与所述疾病的TCR的特异性可变区。这些TCR包括Vβ-7和Vα-10。因此，用编码这些蛋白中至少一种的DNA构建体进行疫苗接种，将引发免疫应答，该免疫应答将靶向参与MS的T细胞。参见：Wucherpfennig，K.W.等人，1990，科学(Science)，248：1016-1019；Oksenberg，J.R.等人，1990，自然(Nature)，345：344-346；各文献均引入本文作参考。
对于硬皮病，已表征了若干参与所述疾病的TCR的特异性可变区。这些TCR包括Vβ-6、Vβ-8、Vβ-14、Vα-16、Vα-3C、Vα-7、Vα-14、Vα-15、Vα-16、Vα-28和Vα-12。因此，用编码这些蛋白中至少一种的DNA构建体进行疫苗接种，将引发免疫应答，该免疫应答将靶向参与硬皮病的T细胞。
为了治疗患有T细胞介导的自身免疫疾病的患者，特别是那些其TCR的可变区尚未被表征的患者，可进行滑液活检。取出所存在的T细胞样品，采用标准技术识别那些TCR的可变区。并可利用这些信息制备基因疫苗。
B细胞介导的自身免疫病包括狼疮(SLE)、毒性弥漫性甲状腺肿、重症肌无力、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、哮喘、冷球蛋白血症、原发性胆硬化和恶性贫血。这些疾病的特征均为存在下述抗体，其结合内源性抗原并启动与自身免疫病相关的炎性级联。针对抗体可变区的疫苗接种将引发包括CTL在内的免疫应答，以消除那些产生抗体的B细胞。
为了治疗患有B细胞介导的自身免疫病的患者，必须鉴定参与自身免疫活性的抗体的可变区。可进行活组织检查，可提取存在于炎症位置上的抗体样品。可使用标准技术鉴定这些抗体的可变区。可使用该信息制备基因疫苗。
在SLE的情况下，一个抗原被认为是DNA。因此，在将接受针对SLE的免疫的患者中，可针对抗DNA的抗体来筛选其抗血清，可制备包括DNA构建体的疫苗，所述构建体编码在血清中发现的抗DNA抗体的可变区。
TCR和抗体的可变区之间的共同的结构特征是众所周知的。通常可使用熟知的方法，来发现编码特定TCR或抗体的DNA序列，方法例如参见Kabat等人，1987，具有免疫学作用的蛋白质的序列(Sequenceof Proteins of Immunological Interest)，U.S.Department of Health andHuman Services，Bethesda MD，该文献引入本文作参考。此外，克隆来自抗体的功能性可变区的通用方法可参见Chaudhary，V.K.等人，1990，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87：1066，该文献引入本文作参考。
本发明特别可用于增强免疫抑制或无免疫应答的个体中的免疫应答。这些患者特别易于受到感染，很少能达到有效的免疫应答。本发明还特别可用于治疗癌症患者。在一些此类患者中，癌细胞不能有效呈递癌相关抗原，因此个体很少产生最理想的有效免疫应答。
在一些优选实施方案中，提供了质粒，所述质粒包括可操作地与调控元件相连接的编码免疫原的核苷酸序列，和可操作地与调控元件相连接的编码MHC I抗原和/或MHC II抗原的核苷酸序列。在一些优选实施方案中，提供了包括第一质粒和第二质粒的组合物。所述第一质粒包括编码免疫原的核苷酸序列，所述第二质粒编码MHC I抗原和/或MHC II抗原的核苷酸序列。在一些优选实施方案中，免疫原是病原体抗原、与超常增殖性疾病相关的蛋白或与自身免疫病相关的蛋白。在一些实施方案中，质粒可任选进一步包括可操作地与调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列。优选实施方案包括药物组合物，包括可注射的组合物，其中包括质粒，所述质粒包括可操作地与调控元件相连接的编码免疫原的核苷酸序列，和可操作地与调控元件相连接的编码MHC I抗原和/或MHC II抗原的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第一质粒包括可操作地与调控元件相连接的编码免疫原的核苷酸序列，和可操作地与调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列。所述第二质粒包括可操作地与调控元件相连接的编码MHCI抗原和/或MHC II抗原的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第一质粒包括可操作地与调控元件相连接的编码免疫原的核苷酸序列，且所述第二质粒包括可操作地与调控元件相连接的编码MHC I抗原和/或MHC II抗原的核苷酸序列，和可操作地与调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，提供了第一和第二质粒。所述第一质粒包括可操作地与调控元件相连接的编码免疫原的核苷酸序列，和可操作地与调控元件相连接的编码MHC I抗原和/或MHC II抗原的核苷酸序列，且所述第二质粒包括可操作地与调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，提供了第一、第二和第三质粒。所述第一质粒包括可操作地与调控元件相连接的编码免疫原的核苷酸序列。所述第二质粒包括可操作地与调控元件相连接的编码MHC I抗原和/或MHC II抗原的核苷酸序列。所述第三质粒包括可操作地与调控元件相连接的编码B7.2的核苷酸序列。
根据本发明的另一方面，通过给予包括编码供体亚型MHC I蛋白和死亡信号或毒素的核苷酸序列的可表达形式的组合物，可消除或减少针对与非MHC I亚型匹配的供体细胞、组织和器官的免疫应答。这些方法涉及已改良的消除免疫细胞的方法，所述免疫细胞参与对同基因细胞、组织和器官的排斥，例如那些植入移植患者体内的同基因细胞、组织和器官。根据本发明，MHC I抗原和死亡信号或毒素在细胞中的表达将使针对细胞、组织和器官的免疫应答减少，所述MHC I抗原对应于供体MHC I抗原，而该供体MHC I抗原相对受体而言是同种异型的，所述细胞、组织和器官展示同种异型的供体MHC I抗原。已发现，毒素或死亡信号和MHC I亚型抗原在移植患者的细胞中的共产生，导致靶向同基因细胞、组织和器官的T细胞的消除，由此消除针对同基因细胞、组织和器官的免疫应答，所述MHC I亚型抗原是与同基因细胞、组织和器官的MHC I亚型相匹配的亚型抗原。参与针对同种异型MHC I抗原的免疫应答的T细胞，经与死亡信号和毒素作用而被杀死。本质上，消除参与针对同种异型MHC I抗原的免疫应答的细胞，会使同种异型MHC I抗原消失。由此通过减少参与针对移植细胞、组织或器官的免疫应答的T细胞，减少移植排斥。
根据本发明，对受体和供体均进行分型。比较MHC I等位基因的表达模式，指明了免疫应答将针对供体的哪些MHC I抗原，该免疫应答导致对供体物质的排斥。对同种异型供体MHC I抗原响应的T细胞，其消除将减少排斥。在优选实施方案中，在进行移植之前，先消除T细胞以尽可能减少排斥。可制备多基因构建体，以靶向多种同种异型MHC I抗原。
对于包括表达MHC II的细胞的移植，例如骨髓移植，可通过对供体和受体进行分型来鉴定同种异型供体MHC II抗原。可将编码同种异型供体MHC II抗原的基因构建体和死亡信号或毒素一起施用，以消除对同种异型供体MHC II抗原响应的T细胞。
因此，本发明提供了在接受细胞、组织或器官移植的个体中减少对非匹配供体细胞、非匹配供体组织或非匹配供体器官排斥的方法。在一些实施方案中，这些方法包括在所述个体身体的某个位置上向个体给予核酸分子的步骤，所述核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，和可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接的编码MHC的核苷酸序列。所述MHC与供体细胞、供体组织或供体器官相匹配，并对受体而言是同种异型的。所述的核酸分子被个体细胞所摄取，在那里，编码MHC抗原和死亡信号或毒素的核苷酸序列得以表达。T细胞与表达同种异型MHC抗原的细胞形成复合体。该细胞也表达死亡信号或毒素。T细胞在与表达同种异型MHC抗原和死亡信号或毒素的细胞形成复合体后死亡，在接受细胞、组织或器官移植的个体中对非匹配供体细胞、非匹配供体组织或非匹配供体器官的排斥减少。在一些实施方案中，在个体的某个位置上向个体给予第一核酸分子和第二核酸分子。第一核酸分子包括编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。第二核酸分子包括编码同种异型MHC抗原的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。
在一些实施方案中，向个体给予可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列、编码死亡信号或毒素的核苷酸序列和编码同种异型MHC抗原的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述方法包括在个体身体的某个位置上向个体给予核酸分子的步骤，所述核酸分子包括编码死亡信号或毒素的核苷酸序列、编码同种异型MHC抗原的核苷酸序列和编码B7.2蛋白的核苷酸序列。各核苷酸序列可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。在一些实施方案中，所述方法包括在个体的某个位置上向个体给予第一核酸分子和第二核酸分子的步骤。所述第一核酸分子包括编码死亡信号或毒素的核苷酸序列和编码B7.2蛋白的核苷酸序列，它们各自可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接，所述第二核酸分子包括编码同种异型MHC抗原的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。在一些实施方案中，所述方法包括在个体的某个位置上向个体给予第一核酸分子和第二核酸分子的步骤。所述第一核酸分子包括编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接，所述第二核酸分子包括编码同种异型MHC抗原的核苷酸序列和编码B7.2蛋白的核苷酸序列，它们各自可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。在一些实施方案中，所述方法包括在个体的某个位置上向个体给予第一核酸分子和第二核酸分子的步骤。所述第一核酸分子包括编码死亡信号或毒素的核苷酸序列和编码同种异型MHC抗原的核苷酸序列，它们各自可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接，所述第二核酸分子包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。一些实施方案中，所述方法包括在个体的某个位置上向个体给予第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子的步骤。所述第一核酸分子包括可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列。所述第二核酸分子包括可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接的编码MHC抗原的核苷酸序列。所述第三核酸分子包括可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列。
本发明提供了质粒，其包括可操作地与调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，和可操作地与调控元件相连接的编码MHC抗原的核苷酸序列。MHC抗原可以是MHC I抗原和/或MHC II抗原。在一些实施方案中，所述质粒进一步包括可操作地与调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列。本发明提供药物组合物，包括可注射的组合物，其中包括质粒，所述质粒包括可操作地与调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，和可操作地与调控元件相连接的编码MHC抗原的核苷酸序列。本发明提供质粒，其包括可操作地与调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列和编码死亡信号或毒素的核苷酸序列。
在一些实施方案中，提供了包括第一质粒和第二质粒的组合物。第一质粒包括编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，第二质粒包括编码MHC抗原的核苷酸序列。MHC抗原可以是MHC I抗原和/或MHC II抗原。所述第一质粒包括可操作地与调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，和可操作地与调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列。所述第二质粒包括可操作地与调控元件相连接的编码MHC抗原的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述质粒包括可操作地与调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，且所述第二质粒包括可操作地与调控元件相连接的编码MHC抗原的核苷酸序列，和可操作地与调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述第一质粒包括可操作地与调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，和可操作地与调控元件相连接的编码MHC抗原的核苷酸序列，且所述第二质粒包括可操作地与调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，提供了包括第一、第二和第三质粒的组合物。所述第一质粒包括编码死亡信号或毒素的核苷酸序列。所述第二质粒包括编码MHC抗原的核苷酸序列。MHC抗原可以是MHC I抗原和/或MHC II抗原。所述第三质粒包括可操作地与调控元件相连接的编码B7.2的核苷酸序列。
本发明另一方面涉及用于在个体中减少优势免疫应答的组合物和方法。优势免疫应答的特征在于，大部分抗体和/或CTL针对一特定的抗原。在优势免疫应答中，使用“优势靶抗原”形成的MHC/Ag/TCR复合体介导该优势免疫应答。因此，消除对MHC/优势抗原复合体特异的T细胞，将减少针对优势抗原的免疫应答，并增加针对非优势抗原的免疫应答。根据本发明的一些实施方案，鉴别了与优势抗原复合以形成MHC/优势抗原/TCR复合体的MHC亚型。然后，在个体的某个位置上向个体给予编码死亡信号或毒素的核苷酸序列和编码MHC亚型的核苷酸序列，该MHC亚型与优势抗原复合以形成MHC/优势抗原/TCR复合体。所述的两个核苷酸序列均可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。所述的核酸分子被个体细胞所摄取，在那里，编码MHC和死亡信号或毒素的核苷酸序列得以表达。T细胞亚群中与MHC/优势抗原复合体形成复合体的T细胞，与所述细胞形成复合体。在与表达死亡信号或毒素的细胞形成复合体后，T细胞死亡。该个体中的优势免疫应答减少。根据本发明的另一些实施方案，鉴别了与优势抗原复合以形成MHC/优势抗原/TCR复合体的MHC亚型，并在个体的某个位置上向个体给予第一核酸分子和第二核酸分子。所述第一核酸分子包括编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。第二核酸分子包括编码MHC的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。由第二核酸分子的核苷酸序列编码的MHC与这样的MHC亚型相匹配，该MHC亚型被鉴别为与优势抗原复合以形成MHC/优势抗原/TCR复合体的MHC亚型。所述的第一和第二核酸分子被个体细胞所摄取，编码死亡信号或毒素和MHC的核苷酸序列得以表达，且T细胞亚群中与MHC/优势抗原复合体形成复合体的T细胞，与所述细胞形成复合体。在与表达死亡信号或毒素的细胞形成复合体后，T细胞死亡。该个体中的优势免疫应答减少。在一些实施方案中，所述MHC是MHC I抗原。在一些实施方案中，所述MHC是MHC II抗原。在一些实施方案中，可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列被一起给予所述个体。
在一些实施方案中，所述方法包括在个体身体的某个位置上向个体给予核酸分子的步骤。所述核酸分子包括编码死亡信号或毒素的核苷酸序列、编码抗原的核苷酸序列和编码B7.2蛋白的核苷酸序列。各核苷酸序列可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。由所述核苷酸序列编码的MHC与这样的MHC亚型相匹配，该MHC亚型被鉴别为与优势抗原复合以形成MHC/优势抗原/TCR复合体的亚型。所述核酸分子被个体细胞所摄取，在那里，编码死亡信号或毒素以及MHC和B7.2的核苷酸序列得以表达。T细胞亚群中与MHC/优势抗原复合体形成复合体的T细胞，与所述细胞形成复合体。在与表达死亡信号或毒素的细胞形成复合体后，T细胞死亡。该个体中的优势免疫应答减少。
根据一些实施方案，所述方法包括在个体的某个位置上向个体给予第一核酸分子和第二核酸分子的步骤。在一些实施方案中，所述第一核酸分子包括编码死亡信号或毒素的核苷酸序列和编码B7.2蛋白的核苷酸序列，各核苷酸序列可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。所述第二核酸分子包括编码MHC抗原的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。在一些实施方案中，所述第一核酸分子包括编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。所述第二核酸分子包括编码MHC抗原的核苷酸序列和编码B7.2蛋白的核苷酸序列，各核苷酸序列可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。在一些实施方案中，所述第一核酸分子包括编码死亡信号或毒素的核苷酸序列和编码MHC抗原的核苷酸序列，各核苷酸序列可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。所述第二核酸分子包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列，其可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。在各实施方案中，由所述核苷酸序列编码的MHC可以是MHC I或MHC II。该MHC与这样的MHC亚型相匹配，该MHC亚型被鉴别为与优势抗原复合以形成MHC/优势抗原/TCR复合体的亚型。所述第一和第二核酸分子被个体细胞所摄取，在那里，编码死亡信号或毒素、MHC和B7.2的核苷酸序列得以表达。T细胞亚群中与MHC/优势抗原复合体形成复合体的T细胞，与所述细胞形成复合体。在与表达死亡信号或毒素的细胞形成复合体后，T细胞死亡。该个体中的优势免疫应答减少。
根据本发明的一些实施方案，所述方法包括在个体的某个位置上向个体给予第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子的步骤。所述第一核酸分子包括编码死亡信号或毒素的核苷酸序列。所述第二核酸分子包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列。所述第三核酸分子包括编码MHC抗原的核苷酸序列。各核苷酸序列可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。由所述核苷酸序列编码的MHC可以是MHC I或MHC II。该MHC与这样的MHC亚型相匹配，该MHC亚型被鉴别为与优势抗原复合以形成MHC/优势抗原/TCR复合体的亚型。所述第一、第二和第三核酸分子被个体细胞所摄取，在那里，编码死亡信号或毒素、MHC和B7.2的核苷酸序列得以表达。T细胞亚群中与MHC/优势抗原复合体形成复合体的T细胞，与所述细胞形成复合体。在与表达死亡信号或毒素的细胞形成复合体后，T细胞死亡。该个体中的优势免疫应答因此减少。
根据一些实施方案，本发明涉及用于扩展目标T细胞亚群的组合物和方法。目标T细胞亚群优选与MHC/抗原复合体形成复合体，所述MHC/抗原复合体包括一抗原，针对该抗原的增强的免疫应答是所希望的。鉴别了形成MHC/Ag/TCR复合体的MHC亚型，所述MHC/Ag/TCR包含由有待扩展的T细胞所表达的TCR。在个体身体的某个位置上向个体给予核酸分子，所述核酸分子包括编码形成MHC/Ag/TCR复合体的MHC亚型的核苷酸序列和编码B7.2蛋白的核苷酸序列，所述MHC/Ag/TCR包含由有待扩展的T细胞所表达的TCR。两核苷酸序列均可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。所述核酸分子被个体细胞所摄取，在那里，编码MHC的核苷酸序列和编码B7.2的核苷酸序列得以表达。T细胞亚群中与MHC/优势抗原复合体形成复合体的T细胞，与所述细胞形成复合体。在与表达B7.2的细胞形成复合体后，T细胞因响应B7.2而增殖。根据本发明的另一些实施方案，在个体身体的某个位置上向个体给予第一核酸分子和第二核酸分子。所述第一核酸分子包括编码形成MHC/Ag/TCR复合体的MHC亚型的核苷酸序列，所述MHC/Ag/TCR包含由有待扩展的T细胞所表达的TCR。第二核酸分子包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列。两核苷酸序列均可操作地与在个体中表达所必需的调控元件相连接。所述第一和第二核酸分子被个体细胞所摄取，在那里，编码MHC的核苷酸序列和编码B7.2的核苷酸序列得以表达。T细胞亚群中与MHC/优势抗原复合体形成复合体的T细胞，与所述细胞形成复合体。在与表达B7.2的细胞形成复合体后，T细胞因响应B7.2而增殖。在一些实施方案中，所述MHC是MHC I抗原。在一些实施方案中，所述MHC是MHC II抗原。
用于通过直接给予DNA而将蛋白传递至细胞，包括用于疫苗和治疗剂应用的组合物和方法已有报道，其中使用了多种方案。这些方法的例子述于美国专利5,593,972、美国专利5,739,118、美国专利5,580,859、美国专利5,589,466、美国专利5,703,055、美国专利5,622,712、美国专利5,459,127、美国专利5,676,954、美国专利5,614,503和PCT申请PCT/US95/12502，这些文献各自引入本文作参考。用于通过直接给予DNA而将蛋白传递至细胞的组合物还述于PCT/US90/01515、PCT/US93/02338、PCT/US93/048131和PCT/US94/00899，这些文献各自引入本文作参考。除了在这些申请中描述的传递方案，在美国专利4,945,050和5,036,006中描述了另一些传递DNA的方法，这两个文献均引入本文作参考。可用于传递核酸序列的重组腺病毒载体的例子述于美国专利5,756,283和美国专利5,707,618，这些文献各自引入本文作参考。核酸分子也可利用脂质体介导的DNA转移方法进行传递，例如述于美国专利4,235,871、美国专利4,241,046和美国专利4,394,448中的方法，这些文献各自引入本文作参考。
根据本发明的一些方法，可在所述个体身体的某个位置上向个体给予核酸分子，其中给药途径选自：经肌肉、鼻内、腹膜内、皮下、皮内或局部给药，或者通过灌洗给至选自阴道、直肠、尿道、口腔和舌下的黏膜组织。一些优选的给药途径包括经皮内、皮下、腹膜内、肌肉和口服给药。
根据本发明的一些方法，所述DNA是质粒DNA。
根据本发明的一些方法，所述启动子选自：猿猴病毒40(SV40)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)如HIV长末端重复序列(LTR)启动子、莫洛尼氏病毒、ALV、巨细胞病毒(CMV)如CMV立即早期启动子、EB病毒(EBV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)和来自人类基因如人肌动蛋白、肌球蛋白、血红蛋白、人肌肉肌酸和人金属硫因的启动子。
根据本发明的一些方法，多腺苷酸化信号选自SV40多腺苷酸化信号和牛生长激素多腺苷酸化信号。
根据本发明的一些方法，用促进细胞摄取DNA分子的组合物来给予所述DNA分子。在一些实施方案中，在将核酸分子给至细胞的同时，给予一共同作用物。共同作用物的例子述于美国专利5,593,972、美国专利5,739,118和于1994年1月26日申请的国际申请PCT/US94/00899，这些文献各自引入本文作参考。与核酸分子一起给药的共同作用物可以作为与核酸分子的混合物给药，或在核酸分子给药的同时、之前或之后分开给药。在一些实施方案中，共同作用物可以是阳离子型脂质，包括但不限于美国专利5,703,055中描述的那些。其他共同作用物的例子包括生长因子、细胞因子和淋巴因子如α干扰素、γ干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12，以及成纤维细胞生长因子、表面活性物质如免疫刺激复合体(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、包括单磷酰基脂质A(MPL)等LPS类似物、霍乱毒素、眼镜蛇毒素、皂草甙、胞壁酰基肽、醌类似物和囊泡如角鲨烯和角鲨烯，和透明质酸。在一些实施方案中，免疫调节性蛋白可用作共同作用物。优选的促进细胞摄取DNA分子的组合物选自：阳离子型脂质、脂质体和局麻药。在一些优选的实施方案中，所述DNA分子与丁哌卡因一起给药。在一些实施方案中，使用多种共同作用物。与核酸分子一起给药的共同作用物可以作为与核酸分子的混合物给药，或在核酸分子给药的同时、之前或之后分开给药。
除了在基于质粒的基因转移方案中使用MHC编码序列的可表达形式和免疫原的编码序列和/或死亡信号或毒素的编码序列和/或B7.2编码序列，本发明还提供其他基因转移方法，例如使用减毒活疫苗和利用重组载体传递编码抗原的外源基因的疫苗的那些方法。减毒活疫苗和利用重组载体传递外源抗原的疫苗的例子述于美国专利：4,722,848、5,017,487、5,077,044、5,110,587、5,112,749、5,174,993、5,223,424、5,225,336、5,240,703、5,242,829、5,294,441、5,294,548、5,310,668、5,387,744、5,389,368、5,424,065、5,451,499、5,453,364、5,462,734、5,470,734和5,482,713，这些文献各自引入本文作参考。可将本发明的基因构建体导入减毒的活疫苗和重组疫苗，以产生本发明的改良的疫苗。
本发明的一个方面涉及可用于本发明中的药物组合物。所述药物组合物包括一DNA分子，其包括可操作地与在个体细胞中表达所必需的调控元件相连接的编码蛋白的核苷酸序列。所述药物组合物进一步包括药用载体或稀释剂。术语“药”是众所周知的，可为本领域技术人员普遍理解。本文使用的术语“药物组合物”和“可注射的药物组合物”指的是如本领域技术人员所理解的一般含义。要求药物组合物满足特定的标准，涉及无菌状态、热原质、颗粒物质、等渗性和pH。例如可注射的药物组合物是无菌的和无热原质的。
本发明的药物组合物包括约1ng-约10000μg DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物包含约2000μg、3000μg、4000μg或5000μgDNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物包含约1000μg DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物包含约10ng-约800μg DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物包含约0.1-约500μg DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物包含约1-约350μg DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物包含约25-约250μg DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物包含约100μg DNA。
本发明的药物组合物根据将要使用的给药方式进行配制。本领域普通技术人员可容易地配制出包括遗传构建体的疫苗。当选择肌肉注射作为给药方式时，优选使用等渗制剂。通常，用于保持等渗压的添加剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情况下，等渗溶液如磷酸缓冲盐溶液是优选的。稳定剂包括白明胶和白蛋白。在一些实施方案中，将血管收缩剂加入制剂中。所提供的本发明的药物制剂是无菌且无热原质的。
在优选实施方案中，通过肌肉注射给予DNA。在给予遗传构建体之前、同时或之后，给予丁哌卡因，其为众所周知且可商购的药物化合物。可将丁哌卡因和遗传构建体配制到同一组合物中。当给药至组织时，鉴于它的一些性质和活性，丁哌卡因是特别有用的。丁哌卡因与氨酰基局麻药在化学和药理学上有一定的关联。它是甲哌卡因的同系物，并与利多卡因有关。丁哌卡因使肌肉组织电位差对钠敏感，并影响细胞内的离子浓度。对丁哌卡因药理活性的详细描述可参见Ritchie，J.M.和N.M.Greene，The Pharmacological Basis of Therapeutics，Gilman，A.G.等编辑，第8版，第15章：3111，其引入本文作参考。在本发明的方法中，丁哌卡因和与丁哌卡因功能相似的化合物是优选的。
丁哌卡因-HCl在化学上被定为1-丁基-N-(2，6-二甲基苯基)-2-哌啶羧酰胺一盐酸盐一水合物，可广泛地商购自包括Astra PharmaceuticalProducts Inc.(Westboro，Mass.)和Sanofi Winthrop Pharmaceuticals(NewYork，N.Y.)在内的许多公司用于药物用途。商业上，在存在或不存在对羟基苯甲酸甲酯以及存在或不存在肾上腺素的情况下配制丁哌卡因。可使用任何这样的制剂。它可以以0.25％、0.5％和0.75％的浓度商购用于药物用途，这些浓度可用于本发明中。如果需要，可制备成引发目标作用的其他浓度。根据本发明，给予约250μg-约10mg丁哌卡因。在一些实施方案中，给予约250μg-约7.5mg。在一些实施方案中，给予约0.5mg-约5.0mg。在一些实施方案中，给予约1.0mg-约3.0mg。在一些实施方案中，给予约5.0mg。例如，在一些实施方案中，在给予疫苗之前、同时或之后，在与疫苗相同的位置上，给予位于等渗药用载体中的约50μl-约2ml、优选50μl-约1500μl、更优选约1ml的0.5％丁哌卡因-HCl和0.1％对羟基苯甲酸甲酯。相似地，在一些实施方案中，在给予疫苗之前、同时或之后，在与疫苗相同的位置上，给予位于等渗药用载体中的约50μl-约2ml、优选50μl-约1500μl、更优选约1ml的0.5％丁哌卡因-HCl。丁哌卡因和任何其他具有相似作用的化合物，特别是相关的局麻药类化合物，可以以提供所希望的对细胞摄取遗传构建体的促进作用的浓度给药。
在本发明的一些实施方案中，首先给个体注射丁哌卡因，之后经肌肉注射进行基因疫苗接种。例如，在疫苗接种之前至多约1周，首先给个体注射丁哌卡因。在一些实施方案中，在疫苗接种之前，在给予遗传构建体之前约1-5天，给个体注射丁哌卡因。在一些实施方案中，在疫苗接种之前，在给予遗传构建体之前约24小时，给个体注射丁哌卡因。另外，可在疫苗接种的同时、数分钟之前或之后注射丁哌卡因。
因此，丁哌卡因和遗传构建体可联合给药，并作为一混合物同时注射。在一些实施方案中，在给予遗传构建体后给予丁哌卡因。例如，在给予遗传构建体后至多约1周至10天，给个体注射丁哌卡因。在一些实施方案中，在疫苗接种后约24小时，给个体注射丁哌卡因。在一些实施方案中，在疫苗接种后约1-5天，给个体注射丁哌卡因。在一些实施方案中，在疫苗接种后至多约1周至10天，向个体给予丁哌卡因。
可使用局麻药作为促进剂来实施本发明。除了丁哌卡因、甲哌卡因、利多卡因、普鲁卡因、卡波卡因和甲基丁哌卡因，还可使用其他作用相似的化合物。
实施例构建β2m剔除嵌合小鼠
4周龄雌性C57B1/6J(β2m+/+)和C57B1/6J-β2mtm1/Unc(β2m-/-)小鼠购自Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)。β2m+/+和β2m-/-均用于互换骨髓移植。骨髓嵌合体的制备详细述于Sobel等，实验医学杂志(J.Exp.Med.)，1991，173：1441，该文献以全文引入本文作参考。简言之，通过在第(-2)和(-1)天IP注射200μg/ml单克隆抗体PK136(抗NK1.1)，使受体小鼠(β2m+/+和β2m-/-)匮乏NK细胞。这一预处理防止C57B1/6J小鼠中的抗辐射性NK细胞对源自C57B1/6J-β2mtml/Unc小鼠的骨髓细胞产生排斥。在互换骨髓移植当天，间隔3小时，以两等份的剂量，总共1050拉德，致死性照射受体小鼠。将供体小鼠处死，通过冲洗胫骨和股骨收集骨髓。骨髓细胞与Low-Tox-M兔补体(Cederlane Labs)一起温育，然后与饱和浓度的抗CD4(172.4)、抗CD8(31M)和抗Thy1.2(mmt 1)的单克隆抗体混合物一起温育(4℃，45分钟)，从而使骨髓细胞匮乏成熟T细胞。通过IV注射107细胞(0.3ml)，用互换骨髓细胞重建受体小鼠。所有动物均饲养在控温、控制明暗循环的装置中。免疫小鼠
如Boyer等，医学灵长类动物学杂志(J.Med.Primatol.)，1996，25：342；Wang等，AIDS，1995，9：S159所述，制备编码HIV-1MN包膜蛋白的DNA疫苗构建体，所述文献以全文引入本文作参考。如Kim等，Nat.Biotech.，7，15：641所述，制备CD80和CD86表达盒，所述文献以全文引入本文作参考。如Kim等，Nat.Biotech.，7，15：641和Kim等，免疫学杂志(J.Immunol.)，1997，158：816所述，用在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中配制的各目标DNA构建体50μg和0.25％丁哌卡因-HCl(Sigma，St.Louis，MO)对各小鼠进行三次肌肉注射(以两周为间隔)，所述文献以全文引入本文作参考。按上述方法给予50μgpCEnv，结果在小鼠中诱导出中等阳性的免疫应答。选择该剂量是为了证明共刺激基因的共传递可增强免疫应答。还用表达HIV-1包膜蛋白(vMN462)(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)的重组牛痘病毒对动物注射。给小鼠静脉注射vMN462(每只小鼠5×106蚀斑形成单位(PFU))。7天后，取脾，用于直接CTL测定。在用相同剂量的vMN462免疫4周后，也对小鼠进行间接CTL。流式细胞计量术
通过使用针对H-2Db分子的α3结构域的单克隆抗体进行FACS分析，证实产生了嵌合小鼠。将识别H-2Db分子(由J.Frelinger(ChapelHill，NC)提供)的α-3结构域的1μg/ml小鼠单克隆抗体28-14-8s(IgG2a同种型)加入分离自单个小鼠的PBMC(10×105)中。数据用CELLquestTM数据采集和软件(Becton Dickinson Immunocytometry Systems，SanJose，CA)通过FACScan进行分析。对肌肉细胞进行免疫组化分析
对经免疫的腿部肌肉进行免疫组化分析，分析活体内CD80、CD86和包膜蛋白的活体内表达。小鼠四头肌用50mg的pCEnv+pCD80、pCEnv+pCD86或对照载体接种。接种后7天，将小鼠处死，取出四头肌。然后将新鲜的肌肉组织冷冻在O.C.T.化合物(Sakura FinetekUSA，Inc.，Torrance，CA)中。使用Leica 1800恒冷切片机(Leica INC.，Deerfield，IL)制备4微米的冷冻切片。将切片放置在ProbeOn Plus载玻片(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)上。切片在丙酮中固定，并用1.5％山羊血清(Vector Labs，Burlingame，CA)封闭。为测定共表达，将载玻片与稀释20倍的生物素化α-gp120抗体(Immuno Diagnostics，Bedford MA.)以及稀释5倍的与FITC偶联的抗CD80或抗CD86抗体(PharMingen，San Diego，CA.)一起在28℃下温育12小时。然后，将载玻片与PBS中400倍稀释的链霉抗生物素蛋白得克萨斯红(NEN LifeSciences，Boston MA)在室温下温育30分钟。为检测肌肉中淋巴细胞的存在，用苏木精和曙红(H&E)染料将载玻片染色。用NikonOPTIPHOT荧光显微镜(Nikon Inc.，Tokyo，JAPAN)，使用40X物镜(Nikon Fluo 40X Ph3D2)观察载玻片。使用Nikon相机FX35DX和柯达Ektachrome 160T载玻片胶卷，得到载玻片的照片，其中用NikonUFX-II进行曝光控制。
通过制备冷冻组织切片，分析肌肉中淋巴细胞的渗入，所述切片来自被注射了DNA的动物并经苏木精和曙红(H&E)染料(Vector Labs)染色。还用抗CD4或抗CD8的抗体(PharMingen)对载玻片染色。ELISA
50ml重组gp120(Immuno Diagnostics，Bedford，MA)在0.1M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH9.5)中稀释成2μg/ml浓度的溶液。在4℃下将其吸附到微量滴定板的孔上，过夜。板用PBS-0.05％吐温20洗涤，用含0.05％吐温20的PBS中3％的BSA在37℃下封闭1小时。小鼠抗血清用0.05％吐温20稀释，在37℃下温育1小时，然后与HRP偶联的山羊抗小鼠IgG(Sigma，St.Louis，MO)一起温育。洗板，用3’3’5’5’TMB(Sigma)缓冲溶液显象。在450nm下，用Dynatech MR5000板读数仪对板进行光密度读数。抗体效价被定义为血清的最高稀释度，其中实验孔的吸光度超过免疫前平均值至少2个标准偏差。细胞毒性T淋巴细胞测定
如Kim等，Nat.Biotech.，7，15：641和Kim等，免疫学杂志(J.Immunol.)，1997，158：816所述，进行5小时的51Cr释放CTL测定。利用FACS分析正常和被牛痘感染的EL-4细胞(H-2b T细胞淋巴瘤)表达MHC II类分子的能力。正如所料，在任何情况下，EL-4细胞均不表达MHC II类分子。用由RPMI 1640(Gibco-BRL，Grand Island，NY)、10％胎牛血清(Gibco-BRL)和无Con A的10％RAT-T-STIM(BectonDickinson Labware，Beford，MA)组成的CTL培养基，以5×106细胞/ml，非特异性地刺激效应物2天。还用0.1％戊二醛固定的被vMN462感染的EL-4细胞再特异性地刺激效应物4天。通过用vMN462感染EL-4细胞，制备用于所有CTL实验的特定靶。分别使用未感染的EL-4细胞和用WR(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)牛痘病毒感染的EL-4细胞，作为牛痘病毒和DNA免疫实验的非特异性对照。进行标准铬释放实验，其中靶细胞用100μCi/ml Na2 51CrO4标记2小时，用于和效应细胞在37℃温育5小时。在50∶1-12.5∶1的效应物-靶(E∶T)比值下，测定CTL溶解。收集上清液，用LKB CliniGammaγ计数仪进行计数。从下式确定比溶百分率：
Figure A0080453500601
通过在含10％Triton X-100的培养基中溶解靶细胞，测定最大释放量。如果‘自发释放’值超过‘最大释放’20％，则认为测定无效。为了计算靶的比溶，用特异性(被vMN462感染的)靶的溶解百分率减去非特异性(被WR感染的)靶的溶解百分率。如上所述进行直接CTL测定，除了不对效应细胞进行活体外刺激(既不是特异性的又不是非特异性的)。结果识别在互换β2m剔除嵌合小鼠中的功能性MHC I类分子
β2mM表达是MHC I类分子在细胞表面上表达所必须的，其对于产生对传染性病原体的保护性细胞毒性免疫应答有重要的作用。这些分子将源自外源抗原的短肽片段呈递给CD8+细胞毒性淋巴细胞，所述外源抗原在细胞溶胶中合成。我们利用C57B1/6J-β2mtm/Unc小鼠和正常C57B1/6J(β2m+/+)动物产生相同单倍型(H-2b)的互换骨髓嵌合体，所述C57B1/6J-β2mtm/Unc小鼠对β2mM剔除基因(β2m-/-)而言是纯合的。
使用β2m+/+和β2m-/-动物进行互换骨髓移植。β2m-/-→β2m+/+小鼠具有不表达MHC I类分子的由骨髓衍生的APC，和表达MHC I类分子的肌肉细胞。β2m+/+→β2m-/-小鼠具有MHC I类阳性的由骨髓衍生的APC，和MHC I类分子阴性的肌肉细胞。用在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中配制的50μg各DNA构建体(pCEnv、pCD80或pCD86)和0.25％丁哌卡因-HCl对各小鼠进行三次肌肉注射(以2周为间隔)。
在骨髓移植后，通过使用针对H-2Db分子的α3结构域的单克隆抗体进行FACS分析，证实产生了嵌合小鼠。这些动物的嵌合用3个月来完成。产生的嵌合小鼠显示出MHC I类分子在肌肉细胞和APC上的差异表达(图1)。β2m-/-→β2m+/+小鼠具有不表达MHC I类分子的由骨髓衍生的APC(供体)，和表达MHC I类分子的肌肉细胞(受体)。相反，β2m+/+→β2m-/-小鼠具有MHC I类阳性的由骨髓衍生的APC，和MHC I类分子阴性的肌肉细胞。一些报道指出，低水平的α链——低于FACS灵敏度的水平——事实上可在β2m-/-细胞表面上表达，这些o链反过来可结合游离的β2m并关联地将外源肽呈递给CD8+T细胞。在另一方面，在T细胞分化过程中，不具有MHC I+类胸腺上皮细胞的β2m+/+→β2m-/-小鼠可能不产生功能性CD8+CTL。甚至已证实，MHCI+类骨髓细胞阳性选择这些淋巴细胞。事实上已显示，β2m-/-→β2m+/+和β2m+/+→β2m-/-嵌合体均产生显著数目的CD4和CD8细胞。但是，决定研究互换嵌合小鼠产生抗病毒CD8+CTL免疫应答的能力。用重组牛痘病毒(vMN462)免疫正常C57B1/6(β2m+/+)和β2m-/-剔除小鼠以及β2m-/-→β2m+/+和β2m+/+→β2m-/-嵌合小鼠。随后，分析在这些动物中产生的抗病毒CD8+CTL免疫应答。如图2中所示，C57B1/6和β2m+/+→β2m-/-小鼠均产生初次(直接)和再次(间接)CD8+CTL应答。C57B1/6小鼠中的CTL应答比β2m+/+→β2m-/-嵌合小鼠中的更强，这些结果与早先的观察结果一致。相反，在β2m-/-剔除或β2m-/-→β2m+/+嵌合小鼠中没有观察到抗病毒CD8+CTL免疫应答。因此，这些结果证明，正常和β2m剔除小鼠间形成的嵌合体提供了一个洁净的模型，以在DNA免疫后检查肌肉细胞在MHC I类限制性T细胞应答中的作用。共刺激分子和病毒蛋白在肌肉细胞上共表达
给小鼠肌肉注射编码CD80和CD86共刺激分子的质粒，结果导致CD80和CD86分子在肌肉中表达，具有相似的感染效力。我们进一步研究两种表达构建体(一个编码HIV-1包膜蛋白，一个编码共刺激分子)的共传递是否导致这些蛋白在相同细胞中共表达。用表达HIV-1MN包膜蛋白的DNA疫苗(pCEnv)，和编码CD80或CD86基因的质粒(pCD80或pCD86)或对照质粒(pCDNA3)，对β2m+/+小鼠进行免疫。对CD80、CD86或包膜蛋白在接受注射的腿部肌肉中的表达进行免疫组化检查。由接受DNA注射的动物来制备冷冻的肌肉切片，并用FITC标记(绿色)的抗CD80或抗CD86抗体和德克萨斯红标记(红色)的抗gp120抗体进行染色。来自接受pCEnv+pCD80免疫的腿部的切片，用抗CD 80抗体或抗CD80和抗gp120抗体进行染色。来自接受pCEnv+pCD86免疫的腿部的切片，用抗CD 86抗体或抗CD86和抗gp120抗体进行染色。来自接受pCDNA3(对照质粒)免疫的腿部的切片，用抗CD 80和抗CD86抗体染色，或用抗CD 80、抗CD86和抗gp120的抗体进行染色。用pCEnv+pCD80或pCEnv+pCD86共免疫，导致这些蛋白在肌肉细胞中共表达。由分别用pCEnv+pCD80和pCEnv+pCD86注射的小鼠产生的包膜和CD80或者包膜和CD86的共表达水平相似。相反，对照腿部不显示出这些蛋白的表达。H-2Db阳性非造血细胞可被建造成MHC I类限制性CTL的活性前体
在用编码病毒抗原的质粒和共刺激分子免疫的嵌合和对照小鼠中，分析体液和细胞免疫应答。对在免疫之前和之后从实验小鼠中采集的血清中的体液免疫应答进行分析。通过ELISA分析这些血清样品对包膜蛋白(gp120)的反应性。如表1中所示，在两种嵌合体中均产生了HIV-1包膜特异性体液应答。β2m-/-小鼠中的体液免疫应答与嵌合小鼠中的相似。这些结果证明抗原特异性体液免疫应答可在质粒DNA免疫后在β2m剔除小鼠中产生，与先前报道的在蛋白免疫后该模型系统中的结果一致(Raulet，免疫学进展(Advances in Immunology)，1993，55：381-421，其以全文引入本文作参考)。此外，这些结果说明，用pCD80或pCD86共免疫互换嵌合体，对由pCEnv免疫诱导的特异性抗体终点效价几乎没有影响，如先前在正常BALB/c小鼠中观察到的(Kim等，自然生物技术(Nature Biot.)，1997，15：641-645，其以全文引入本文作参考)。
  嵌合小鼠 免疫组   免疫后3周   免疫后7周
  β2m-/-→β2m+/+ pCEnv   1024   1024
  β2m-/-→β2m+/+ pCEnv+pCD80   2048   512
  β2m-/-→β2m+/+ pCEnv+pCD86   2048   1024
  β2m+/+→β2m-/- pCEnv   1024   1024
  β2m+/+→β2m-/- pCEnv+pCD80   1024   512
  β2m+/+→β2m-/- pCEnv+pCD86   1024   512
表1.在用pCD80或pCD86共免疫(每组4只小鼠)后的HIV-1包膜特异性抗体应答。使用HIV-1 gp120蛋白，利用ELISA检测小鼠血清中的包膜特异性抗体应答。系列稀释为1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024、1∶2048和1∶4096。ELISA的背景光密度水平低于0.015。这些实验重复两次，得到相似的结果。
还对CTL应答在互换嵌合体和β2m-/-动物中的产生进行评价。先前已证明，用CD86而非CD8基因共免疫，导致在MHC正常动物中MHC I类限制性抗病毒CTL的显著增强(Kim等，自然生物技术(NatureBiot.)，1997，15：641-645，其以全文引入本文作参考)。利用EL-4 T淋巴瘤细胞作为不表达MHC-II类分子的靶，分析MHC I类限制性CD8+CTL应答。为了计算靶的比溶，用特异性(被vMN462感染的)靶的溶解百分率减去非特异性(被WR感染的)靶的溶解百分率。从用对照质粒、pCEnv、pCEnv+pCD80或pCEnv+pCD86免疫的β2m-/-对照和β2m+/+→β2m-/-嵌合小鼠中观察特异性致死的背景水平(图3)。但是，用pCEnv+pCD86而非pCEnv+pCD80共免疫β2m-/-→β2m+/+小鼠，产生高水平的包膜特异性CTL(在E∶T比值为50∶1时，为37％)。为进一步检测CTL诱导的强度，分析了在β2m-/-→β2m+/+嵌合小鼠中诱导直接、非受激CTL应答的能力(图4)。用pCEnv免疫的小鼠不诱导特异性致死。相反，在E∶T比值为50∶1时，在pCEnv+pCD86免疫组中观察到比溶为23％，在E∶T比值为12.5∶1时，测定为11％。由于在β2m-/-→β2m+/+小鼠中的骨髓衍生细胞不能产生实质性的抗病毒CD8+CTL(图2)，因此这些结果表明，HIV包膜和CD86分子在非造血细胞中的共表达可使它们能够引发抗HIV-1特异性CTL应答。此外，来自免疫学正常的β2m+/+→β2m-/-嵌合体的结果(图2)表明，没有观察到CD86分子对CTL扩展的作用经小量的APC的转变而增强，而这在非造血细胞中更为普遍。
由免疫细胞释放的多种细胞因子的水平反映免疫应答的方向和大小。CD4+和CD8+T细胞均产生IFN-γ和IL-4细胞因子。IFN-γ复杂地参与调节T细胞介导的细胞毒性免疫应答，而IL-4在B细胞介导的免疫应答中起着支配性的作用。因此，除了CTL分析之外，从在活体外受激用于CTL测定的效应细胞中收集上清液，并测试其中IFN-γ和IL-4的释放。如图5中所示，IFN-γ释放的水平对应于图3所示的CTL应答的水平。事实上，用pCEnv+pCD86(45ng/ml)免疫的β2m-/-→β2m+/+小鼠所释放的IFN-γ的水平是其它组的至少3倍。另一方面，所有组释放的IL-4的水平相似。因此，IFN-γ释放数据支持了以下说法，即CD86在非造血细胞上的表达可引发主要在MHC I类表达过程中的细胞因子诱导，支持了由非专一性APC进行直接TCR共连接的说法。CD86的表达诱导淋巴细胞浸润到免疫动物的肌肉中
为了进一步阐明用CD86转染的非骨髓细胞直接驱动T细胞的能力，我们寻找了在活体内T细胞与转染的肌肉细胞连接的直接证据。在免疫后7天观察到，与对照或用pCEnv+pCD80免疫的小鼠的相比，淋巴细胞更多地浸润到用pCEnv+pCD86免疫的小鼠的肌肉中。在抗原和CD86表达位点上观察到大量的浸润性淋巴细胞，它们似乎要攻击此处存在的肌肉细胞。当对载玻片进行T细胞免疫组化染色，观察到浸润性T细胞包括CD4+和CD8+T细胞(图6)。观察到淋巴细胞向免疫肌肉的浸润在1个月内完成，与cDNA表达后抗原的表达持续时间相关。与未接种疫苗的动物相比，这些动物没有表现出这种侵入的明确表型作用。稍后检查肌肉切片，结果证明正常肌肉表型不存在淋巴细胞的侵入。有趣的是，甚至在淋巴细胞渗入的早期，小鼠仍表现正常。这些结果表明，被遗传改造表达携有MHC I类和CD86而非CD80分子的病毒抗原的肌肉细胞，可有效地吸引淋巴细胞，并直接与它们相互作用。此数据清楚地显示，吸引本身并不是CD80的功能。
                         表2小核糖核酸病毒科属：              鼻病毒属：(医学)引起普通感冒病例中的约50％。
              肠道病毒属：(医学)包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇
              病毒、人肠道细胞病变孤儿病毒和人肠道病毒如
              甲型肝炎病毒。
              Apthovirus：(兽医学)这些是口蹄疫病毒。靶抗原：          VP1、VP2、VP3、VP4、VPGCalcovirus科属：              诺沃克类病毒：(医学)这些病毒是流行性胃肠炎的
              重要致病物。披膜病毒科属：              α病毒属：(医学和兽医学)例子包括新培斯病毒、
              RossRiver病毒和东方和西方马脑炎病毒。
              风疹病毒属：(医学)风疹病毒。黄病毒科          例子包括：(医学)登革热、黄热病、日本脑炎、圣
              路易型脑炎和蜱传性脑炎病毒。丙型肝炎病毒：    (医学)这些病毒仍未被置于一个科中，但相信它们
              是一种披膜病毒或黄病毒。它们与披膜病毒科非常
              相似。冠状病毒科：      (医学和兽医学)
              传染性支气管炎病毒(家禽)
              猪传播性胃肠道病毒(猪)
              猪血细胞凝集性脑脊髓炎病毒(猪)
              猫传染性腹膜炎病毒(猫)
              猫肠冠状病毒(猫)
              犬冠状病毒(狗)
              人呼吸道冠状病毒引起普通感冒中的～40％。EX.
              224E，0C43
              注意-冠状病毒可引起除甲型、乙型和丙型以外的
              肝炎靶抗原：          E1-也称M或基质蛋白
              E2-也称S或Spike蛋白
              E3-也称HE或血细胞凝集-elterose糖蛋白(不存在
              于所有的冠状病毒中)
              N-核壳棒状病毒科属：              水泡性病毒属：水泡性口膜炎病毒
              狂犬病病毒属：(医学和兽医学)狂犬病靶抗原：          G蛋白
              N蛋白线性病毒科：      (医学)
              出血热病毒，如Marburg和Ebola病毒副粘病毒科：属：              1型副流感病毒
              3型副流感病毒
              牛3型副流感病毒
              Rubulavirus：(医学和兽医学)
              腮腺炎病毒、2型副流感病毒、4型副流感病毒、
              新城疫病毒(鸡中的重要病原体)
              Morbillivirus：(医学和兽医学)
              麻疹、犬瘟热
              Pneumonvirus：(医学和兽医学)
              呼吸道合胞病毒正粘病毒科        (医学)
              流行性感冒病毒本杨病毒科属：              本杨病毒属：(医学)加利福尼亚脑炎、拉克罗丝脑炎
              白岭病毒属：(医学)裂谷热
              汉滩病毒属：Puremala是一种hemahagin热病毒
              纳伊罗病毒属(兽医学)内罗毕羊病
              还包括许多未指定的bungavirus嵌沙样病毒科      (医学)
              LCM、拉沙热病毒呼肠孤病毒科属：              呼肠孤病毒：可能的人类病原体
              轮状病毒：儿童急性胃肠炎
              环状病毒：(医学和兽医学)
              Cultivirus：科洛拉多蜱传热、Lebombo(人)马变性
              性脑病、蓝舌病逆转录酶病毒科亚科：            肿瘤病毒(Oncorivirinal)亚科：(兽医学)猫白血病病
              毒、HTLVI和HTL VII
              慢病毒亚科：(医学和兽医学)HIV、猫免疫缺陷性
              病毒、马感染、贫血症病毒
              泡沫病毒亚科乳多空病毒科亚科：            Polyomavirus：(医学)BKU和JCU病毒亚科：            乳头状瘤病毒：(医学)许多与癌症或乳头状瘤的恶
              性进展相关的病毒类型腺病毒            (医学)
              EX AD7、ARD.、O.B.-引起呼吸道疾病-一些
              腺病毒如275引起肠炎细小病毒科        (兽医学)
              猫细小病毒：引起猫肠炎
              猫panleucopeniavirus
              犬细小病毒
              猪细小病毒疱疹病毒科亚科：            α疱疹病毒属：              单纯疱疹病毒属(医学)
              HSVI、HSVII
              水痘病毒属：(医学-兽医学)假性狂犬病-水痘带状
              疱疹亚科：            β疱疹病毒属：              巨细胞病毒属(医学)
              HCMV
              Muromegalovirus亚科：            γ疱疹病毒属：              淋巴潜伏病毒属(医学)
              EBV-(伯基特淋巴瘤)
              Rhadinovirus痘病毒科亚科：            脊髓动物痘病毒(医学-兽医学)属：              正痘病毒属
              天花
              牛痘
              副痘病毒属-兽医学
              Auipoxvirus-兽医学
              山羊痘病毒属
              兔痘病毒属
              猪痘病毒属亚科：            Entemopoxviridue嗜肝DNA病毒科：   乙型肝炎病毒未分类的：        丁型肝炎病毒
                           表3细菌病原体
病原性革兰氏阳性球菌包括：肺炎球菌；葡萄球菌；和链球菌。病原
性革兰氏阴性球菌包括：脑膜炎球菌；和淋球菌。
病原性革兰氏阴性肠道杆菌包括：肠杆菌科；假单胞菌、不动杆菌和
埃肯菌属；类鼻疽；沙门氏菌；志贺氏菌病；嗜血杆菌；摩拉克氏菌；
软性下疳；布鲁氏杆菌病；土拉菌病；耶尔森氏鼠疫杆菌(巴斯德氏
菌)；链杆菌念珠棘虫属和螺旋菌；单核细胞增多性李氏菌；丹毒丝
菌属rhusiopathae；白喉；霍乱；炭疽热；性病肉芽肿(腹股沟肉芽
肿)；和巴尔通氏体病。
病原性厌氧菌包括：破伤风；肉毒梭菌中毒；其他梭状芽孢杆菌；肺
结核；麻风病；和其他分枝杆菌。病原性螺旋体疾病包括：梅毒；密
螺旋体病：雅司病、品他病和地方性梅毒；和钩端螺旋体病。
由较高病原体细菌和病原性真菌引起的其他感染包括：放线菌病；诺
卡氏菌病；隐球菌病、芽生菌病、组织胞浆菌病和球孢子菌病；念珠
菌病、曲霉病和白霉菌病；孢子丝菌病；副球孢子菌病、petriellidiosis、
球拟酵母病、足分支菌病和着色真菌病；和皮真菌病。
立克次体感染包括立克次体的和立克次体病。
支原体和衣原体感染的例子包括：肺炎支原体，性病性淋巴肉芽肿；
鹦鹉热；和围产期衣原体感染。病原性真核生物
病原性原生动物和蠕虫及由其引起的感染包括：阿米巴病；疟疾；利
什曼病；锥虫病；弓形体病；卡氏肺孢子虫；巴贝西虫病；贾第鞭毛
虫病；旋毛虫病；丝虫病；血吸虫病；线虫；吸虫或蛭；和绦虫感染。

Claims (84)

1.在个体中诱导针对免疫原的免疫应答的方法，包括以下步骤：
在所述个体身体的某个位置上向所述个体给予一种核酸分子，所述核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码免疫原的核苷酸序列和可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列，其中所述的核酸分子被所述个体的细胞所摄取，编码所述免疫原和所述主要组织相容性复合体抗原的所述核苷酸序列得以表达，针对所述免疫原的免疫应答在所述个体中诱导出来；和/或
在所述个体身体的某个位置上向所述个体给予第一核酸分子和第二核酸分子，其中所述第一核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码免疫原的核苷酸序列，所述第二核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列，其中所述的第一和第二核酸分子被所述个体的细胞所摄取，编码所述免疫原和所述主要组织相容性复合体抗原的所述核苷酸序列得以表达，针对所述免疫原的免疫应答在所述个体中诱导出来。
2.权利要求1的方法，其中所述免疫原是病原体抗原、与超常增殖性疾病相关的蛋白或与自身免疫病相关的蛋白。
3.权利要求1的方法，其中所述主要组织相容性复合体抗原是主要组织相容性复合体I类抗原。
4.权利要求3的方法，其中所述主要组织相容性复合体蛋白是主要组织相容性复合体I类抗原，其是与由所述个体表达的主要组织相容性复合体I类抗原亚型相匹配的一个亚型。
5.权利要求1的方法，其中所述主要组织相容性复合体抗原是主要组织相容性复合体II类抗原。
6.权利要求5的方法，其中所述主要组织相容性复合体II类蛋白是主要组织相容性复合体I类抗原，其是与由所述个体表达的主要组织相容性复合体II类抗原亚型相匹配的一个亚型。
7.权利要求1的方法，其中在所述个体身体的某个位置上向所述个体给予一种核酸分子，所述核酸分子包括编码免疫原的核苷酸序列和编码主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列。
8.权利要求7的方法，其中所述核酸分子进一步包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列。
9.权利要求1的方法，其中在所述个体身体的某个位置上向所述个体给予第一核酸分子和第二核酸分子，其中所述第一核酸分子包括编码免疫原的核苷酸序列，所述第二核酸分子包括编码主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列。
10.权利要求9的方法，其中所述第一核酸分子进一步包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列；和/或所述第二核酸分子进一步包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列。
11.权利要求9的方法，进一步包括给予第三核酸分子，其中所述第三核酸分子包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列。
12.权利要求1的方法，包括以下步骤：
通过肌内给药向所述个体给予一种核酸分子，所述核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码免疫原的核苷酸序列和可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列，其中所述的核酸分子被所述个体的细胞所摄取，编码所述免疫原和所述主要组织相容性复合体抗原的所述核苷酸序列得以表达，针对所述免疫原的免疫应答在所述个体中诱导出来；和/或
通过肌内给药向所述个体给予第一核酸分子和第二核酸分子，其中所述第一核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码免疫原的核苷酸序列，所述第二核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列，其中所述的第一和第二核酸分子被所述个体的细胞所摄取，编码所述免疫原和所述主要组织相容性复合体抗原的所述核苷酸序列得以表达，针对所述免疫原的免疫应答在所述个体中诱导出来。
13.权利要求1的方法，包括以下步骤：
在所述个体身体的某个位置上向所述个体给予一种质粒，所述质粒包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码免疫原的核苷酸序列和可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列，其中所述的质粒被所述个体的细胞所摄取，编码所述免疫原和所述主要组织相容性复合体抗原的所述核苷酸序列得以表达，针对所述免疫原的免疫应答在所述个体中诱导出来；和/或
在所述个体身体的某个位置上向所述个体给予第一质粒和第二质粒，其中所述第一质粒包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码免疫原的核苷酸序列，所述第二质粒包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列，其中所述的第一和第二质粒被所述个体的细胞所摄取，编码所述免疫原和所述主要组织相容性复合体抗原的所述核苷酸序列得以表达，针对所述免疫原的免疫应答在所述个体中诱导出来。
14.权利要求1的方法，其中所述个体是无免疫应答的。
15.权利要求1的方法，其中所述个体是免疫抑制的。
16.权利要求1的方法，其中所述个体患有癌症。
17.权利要求1的方法，其中所述免疫应答是预防性的。
18.权利要求1的方法，其中所述免疫应答是治疗性的。
19.一种质粒，包括可操作地与调控元件相连接的编码免疫原的核苷酸序列和可操作地与调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列。
20.权利要求19的质粒，其中所述免疫原是病原体抗原、与超常增殖性疾病相关的蛋白或与自身免疫病相关的蛋白。
21.权利要求19的质粒，其中所述主要组织相容性复合体抗原是主要组织相容性复合体I类抗原。
22.权利要求19的质粒，其中所述主要组织相容性复合体抗原是主要组织相容性复合体II类抗原。
23.权利要求19的质粒，进一步包括可操作地与调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列。
24.一种药物组合物，包括权利要求19的质粒。
25.一种组合物，包括第一质粒和第二质粒，所述第一质粒是如权利要求19所述的质粒，所述第二质粒包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列。
26.一种质粒，包括可操作地与调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列和可操作地与调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列。
27.权利要求26的质粒，其中所述主要组织相容性复合体抗原是主要组织相容性复合体I类抗原。
28.权利要求26的质粒，其中所述主要组织相容性复合体抗原是主要组织相容性复合体II类抗原。
29.一种组合物，包括第一质粒和第二质粒，所述第一质粒包括编码免疫原的核苷酸序列，所述第二质粒包括编码主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列。
30.权利要求29的组合物，其中所述免疫原是病原体抗原、与超常增殖性疾病相关的蛋白或与自身免疫病相关的蛋白。
31.权利要求29的组合物，其中所述主要组织相容性复合体抗原是主要组织相容性复合体I类抗原。
32.权利要求29的组合物，其中所述主要组织相容性复合体抗原是主要组织相容性复合体II类抗原。
33.权利要求29的组合物，其中：
所述第一质粒进一步包括可操作地与调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列；和/或
所述第二质粒进一步包括可操作地与调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列；和/或
所述组合物进一步包括第三质粒，所述第三质粒进一步包括可操作地与调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列。
34.使接受细胞、组织或器官移植的个体对非匹配供体细胞、组织或器官的排斥减少的方法，包括以下步骤：
在所述个体身体的某个位置上向所述个体给予一种核酸分子，所述核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列和可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体I类抗原的核苷酸序列，其中所述主要组织相容性复合体I类抗原与所述供体细胞、组织或器官匹配，所述的核酸分子被所述个体的细胞所摄取，编码所述主要组织相容性复合体I类抗原和所述死亡信号或毒素的所述核苷酸序列得以表达，T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由所述细胞表达的所述主要组织相容性复合体I类抗原，所述T细胞在复合体形成后经与所述死亡信号或毒素作用而死亡，对所述个体中的非匹配供体细胞、组织或器官的排斥减少；和/或
在所述个体的某个位置上向所述个体给予第一核酸分子和第二核酸分子，其中所述第一核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，所述第二核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体I类抗原的核苷酸序列，其中所述主要组织相容性复合体I类抗原与所述供体细胞、组织或器官匹配，所述的第一和第二核酸分子被所述个体的细胞所摄取，编码所述主要组织相容性复合体I类抗原和所述死亡信号或毒素的所述核苷酸序列得以表达，T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由所述细胞表达的所述主要组织相容性复合体I类抗原，所述T细胞在复合体形成后经与死亡信号或毒素作用而死亡，对所述个体中的非匹配供体细胞、组织或器官的排斥减少。
35.权利要求34的方法，其中所述死亡信号或毒素选自FADD、FAP-1、TRADD、RIP、RAIDD、FAS-L TNF、MORT1、CRADD、MyD88、昆虫毒液、蛇毒液、细菌内毒素、双链核糖体灭活性蛋白和gelonin。
36.权利要求34的方法，其中在所述个体身体的某个位置上向所述个体给予一种核酸分子，所述核酸分子包括编码死亡信号或毒素的核苷酸序列和编码主要组织相容性复合体I类抗原的核苷酸序列。
37.权利要求34的方法，其中所述核酸分子进一步包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列。
38.权利要求34的方法，其中在所述个体身体的某个位置上向所述个体给予第一核酸分子和第二核酸分子，其中所述第一核酸分子包括编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，所述第二核酸分子包括编码主要组织相容性复合体I类抗原的核苷酸序列。
39.权利要求38的方法，其中所述第一核酸分子进一步包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列；和/或所述第二核酸分子进一步包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列。
40.权利要求38的方法，进一步包括给予第三核酸分子，其中所述第三核酸分子包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列。
41.权利要求34的方法，包括以下步骤：
通过肌内给药向所述个体给予一种核酸分子，所述核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列和可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体I类抗原的核苷酸序列，其中所述主要组织相容性复合体I类抗原与所述供体细胞、组织或器官匹配，所述的核酸分子被所述个体的细胞所摄取，编码所述主要组织相容性复合体I类抗原和所述死亡信号或毒素的所述核苷酸序列得以表达，T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由所述细胞表达的所述主要组织相容性复合体I类抗原，所述T细胞在复合体形成后经与所述死亡信号或毒素作用而死亡，对所述个体中的非匹配供体细胞、组织或器官的排斥减少；和/或
通过肌内给药向所述个体给予第一核酸分子和第二核酸分子，其中所述第一核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，所述第二核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体I类抗原的核苷酸序列，其中所述主要组织相容性复合体I类抗原与所述供体细胞、组织或器官匹配，所述的第一和第二核酸分子被所述个体的细胞所摄取，编码所述主要组织相容性复合体I类抗原和所述死亡信号或毒素的所述核苷酸序列得以表达，T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由所述细胞表达的所述主要组织相容性复合体I类抗原，所述T细胞在复合体形成后经与死亡信号或毒素作用而死亡，对所述个体中的非匹配供体细胞、组织或器官的排斥减少。
42.权利要求34的方法，包括以下步骤：
在所述个体身体的某个位置上向所述个体给予一种质粒，所述质粒包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列和可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体I类抗原的核苷酸序列，其中所述主要组织相容性复合体I类抗原与所述供体细胞、组织或器官匹配，所述的核酸分子被所述个体的细胞所摄取，编码所述主要组织相容性复合体I类抗原和所述死亡信号或毒素的所述核苷酸序列得以表达，T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由所述细胞表达的所述主要组织相容性复合体I类抗原，所述T细胞在复合体形成后经与所述死亡信号或毒素作用而死亡，对所述个体中的非匹配供体细胞、组织或器官的排斥减少；和/或
在所述个体的某个位置上向所述个体给予第一质粒和第二质粒，其中所述第一质粒包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，所述第二质粒包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体I类抗原的核苷酸序列，其中所述主要组织相容性复合体I类抗原与所述供体细胞、组织或器官匹配，所述的第一和第二质粒被所述个体的细胞所摄取，编码所述主要组织相容性复合体I类抗原和所述死亡信号或毒素的所述核苷酸序列得以表达，T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由所述细胞表达的所述主要组织相容性复合体I类抗原，所述T细胞在复合体形成后经与死亡信号或毒素作用而死亡，对所述个体中的非匹配供体细胞、组织或器官的排斥减少。
43.使接受细胞移植的个体对非匹配供体细胞、组织或器官的排斥减少的方法，包括以下步骤：
在所述个体身体的某个位置上向所述个体给予一种核酸分子，所述核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列和可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体II类抗原的核苷酸序列，其中所述主要组织相容性复合体II类抗原与所述供体细胞匹配，所述的核酸分子被所述个体的细胞所摄取，编码所述主要组织相容性复合体II类抗原和所述死亡信号或毒素的所述核苷酸序列得以表达，T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由所述细胞表达的所述主要组织相容性复合体II类抗原，所述T细胞在复合体形成后经与所述死亡信号或毒素作用而死亡，对所述个体中的非匹配供体细胞的排斥减少；和/或
在所述个体的某个位置上向所述个体给予第一核酸分子和第二核酸分子，其中所述第一核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，所述第二核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体II类抗原的核苷酸序列，其中所述主要组织相容性复合体II类抗原与所述供体细胞匹配，所述的第一和第二核酸分子被所述个体的细胞所摄取，编码所述主要组织相容性复合体II类抗原和所述死亡信号或毒素的所述核苷酸序列得以表达，T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由所述细胞表达的所述主要组织相容性复合体II类抗原，所述T细胞在复合体形成后经与死亡信号或毒素作用而死亡，对所述个体中的非匹配供体细胞的排斥减少。
44.权利要求43的方法，其中所述死亡信号或毒素选自FADD、FAP-1、TRADD、RIP、RAIDD、FAS-L TNF、MORT1、CRADD、MyD88、昆虫毒液、蛇毒液、细菌内毒素、双链核糖体灭活性蛋白和gelonin。
45.权利要求43的方法，其中在所述个体身体的某个位置上向所述个体给予一种核酸分子，所述核酸分子包括编码死亡信号或毒素的核苷酸序列和编码主要组织相容性复合体II类抗原的核苷酸序列。
46.权利要求43的方法，其中所述核酸分子进一步包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列。
47.权利要求43的方法，其中在所述个体身体的某个位置上向所述个体给予第一核酸分子和第二核酸分子，其中所述第一核酸分子包括编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，所述第二核酸分子包括编码主要组织相容性复合体II类抗原的核苷酸序列。
48.权利要求47的方法，其中所述第一核酸分子进一步包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列；和/或所述第二核酸分子进一步包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列。
49.权利要求47的方法，进一步包括给予第三核酸分子，其中所述第三核酸分子包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列。
50.权利要求43的方法，包括以下步骤：
通过肌内给药向所述个体给予一种核酸分子，所述核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列和可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体II类抗原的核苷酸序列，其中所述主要组织相容性复合体II类抗原与所述供体细胞匹配，所述的核酸分子被所述个体的细胞所摄取，编码所述主要组织相容性复合体II类抗原和所述死亡信号或毒素的所述核苷酸序列得以表达，T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由所述细胞表达的所述主要组织相容性复合体II类抗原，所述T细胞在复合体形成后经与所述死亡信号或毒素作用而死亡，对所述个体中的非匹配供体细胞的排斥减少；和/或
通过肌内给药向所述个体给予第一核酸分子和第二核酸分子，其中所述第一核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，所述第二核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体II类抗原的核苷酸序列，其中所述主要组织相容性复合体II类抗原与所述供体细胞匹配，所述的第一和第二核酸分子被所述个体的细胞所摄取，编码所述主要组织相容性复合体II类抗原和所述死亡信号或毒素的所述核苷酸序列得以表达，T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由所述细胞表达的所述主要组织相容性复合体II类抗原，所述T细胞在复合体形成后经与死亡信号或毒素作用而死亡，对所述个体中的非匹配供体细胞的排斥减少。
51.权利要求43的方法，包括以下步骤：
在所述个体身体的某个位置上向所述个体给予一种质粒，所述质粒包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列和可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体II类抗原的核苷酸序列，其中所述主要组织相容性复合体II类抗原与所述供体细胞匹配，所述的核酸分子被所述个体的细胞所摄取，编码所述主要组织相容性复合体II类抗原和所述死亡信号或毒素的所述核苷酸序列得以表达，T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由所述细胞表达的所述主要组织相容性复合体II类抗原，所述T细胞在复合体形成后经与所述死亡信号或毒素作用而死亡，对所述个体中的非匹配供体细胞的排斥减少；和/或
在所述个体的某个位置上向所述个体给予第一质粒和第二质粒，其中所述第一质粒包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，所述第二质粒包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体II类抗原的核苷酸序列，其中所述主要组织相容性复合体II类抗原与所述供体细胞匹配，所述的第一和第二质粒被所述个体的细胞所摄取，编码所述主要组织相容性复合体II类抗原和所述死亡信号或毒素的所述核苷酸序列得以表达，T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由所述细胞表达的所述主要组织相容性复合体II类抗原，所述T细胞在复合体形成后经与死亡信号或毒素作用而死亡，对所述个体中的非匹配供体细胞的排斥减少。
52.一种质粒，包括可操作地与调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列和可操作地与调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列。
53.权利要求52的质粒，其中所述死亡信号或毒素是FADD、FAP-1、TRADD、RIP、RAIDD、FAS-L TNF、MORT1、CRADD、MyD88、昆虫毒液、蛇毒液、细菌内毒素、双链核糖体灭活性蛋白和gelonin。
54.权利要求52的质粒，其中所述主要组织相容性复合体抗原是主要组织相容性复合体I类抗原。
55.权利要求52的质粒，其中所述主要组织相容性复合体抗原是主要组织相容性复合体II类抗原。
56.权利要求52的质粒，进一步包括可操作地与调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列。
57.一种药物组合物，包括权利要求52的质粒。
58.一种组合物，包括第一质粒和第二质粒，其中所述第一质粒是如权利要求52所述的质粒，所述第二质粒包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列。
59.一种质粒，包括可操作地与调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列和编码死亡信号或毒素的核苷酸序列。
60.权利要求59的质粒，其中所述主要组织相容性复合体抗原是主要组织相容性复合体I类抗原。
61.权利要求59的质粒，其中所述主要组织相容性复合体抗原是主要组织相容性复合体II类抗原。
62.一种组合物，包括第一质粒和第二质粒，其中所述第一质粒包括编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，所述第二质粒包括编码主要组织相容性复合体抗原的核苷酸序列。
63.权利要求62的组合物，其中所述死亡信号或毒素是……
64.权利要求62的组合物，其中所述主要组织相容性复合体抗原是主要组织相容性复合体I类抗原。
65.权利要求62的组合物，其中所述主要组织相容性复合体抗原是主要组织相容性复合体II类抗原。
66.权利要求62的组合物，其中：
所述第一质粒进一步包括可操作地与调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列；和/或
所述第二质粒进一步包括可操作地与调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列；和/或
所述组合物进一步包括第三质粒，所述第三质粒包括可操作地与调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列。
67.减少个体中优势免疫应答的方法，包括以下步骤：
a)识别和T细胞亚群形成复合体的主要组织相容性复合体抗原亚型，所述T细胞亚群与所述优势免疫应答相关；
b)在所述个体身体的某个位置上向所述个体给予一种核酸分子，所述核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列和可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原亚型的核苷酸序列，所述的核酸分子被所述个体细胞所摄取，编码所述主要组织相容性复合体抗原亚型的所述核苷酸序列和编码所述死亡信号或毒素的所述核苷酸序列得以表达，T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由所述细胞表达的所述主要组织相容性复合体抗原亚型，所述T细胞在复合体形成后经与死亡信号或毒素作用而死亡，所述个体中的优势免疫应答减少；和/或
在所述个体的某个位置上向所述个体给予第一核酸分子和第二核酸分子，其中所述第一核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，所述第二核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原亚型的核苷酸序列，所述的第一和第二核酸分子被所述个体细胞所摄取，编码所述主要组织相容性复合体抗原亚型的所述核苷酸序列和编码所述死亡信号或毒素的所述核苷酸序列得以表达，T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由所述细胞表达的主要组织相容性复合体抗原亚型，所述T细胞在复合体形成后经与所述死亡信号或毒素作用而死亡，所述个体中的优势免疫应答减少。
68.权利要求67的方法，其中所述死亡信号或毒素是FADD、FAP-1、TRADD、RIP、RAIDD、FAS-L TNF、MORT1、CRADD、MyD88、昆虫毒液、蛇毒液、细菌内毒素、双链核糖体灭活性蛋白和gelonin。
69.权利要求67的方法，其中所述主要组织相容性复合体抗原亚型是主要组织相容性复合体I类抗原亚型。
70.权利要求67的方法，其中所述主要组织相容性复合体抗原亚型是主要组织相容性复合体II类抗原亚型。
71.权利要求67的方法，其中在所述个体身体的某个位置上向所述个体给予一种核酸分子，所述核酸分子包括编码死亡信号或毒素的核苷酸序列和编码主要组织相容性复合体抗原亚型的核苷酸序列。
72.权利要求67的方法，其中所述核酸分子进一步包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列。
73.权利要求67的方法，其中在所述个体身体的某个位置上向所述个体给予第一核酸分子和第二核酸分子，其中所述第一核酸分子包括编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，所述第二核酸分子包括编码主要组织相容性复合体抗原亚型的核苷酸序列。
74.权利要求73的方法，其中所述第一核酸分子进一步包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列；和/或所述第二核酸分子进一步包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列。
75.权利要求73的方法，进一步包括给予第三核酸分子，其中所述第三核酸分子包括编码B7.2蛋白的核苷酸序列。
76.权利要求67的方法，包括以下步骤：
通过肌内给药向所述个体给予一种核酸分子，所述核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列和可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原亚型的核苷酸序列，所述的核酸分子被所述个体细胞所摄取，编码所述主要组织相容性复合体抗原亚型和所述死亡信号或毒素的所述核苷酸序列得以表达，T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由所述细胞表达的所述主要组织相容性复合体抗原亚型，所述T细胞在复合体形成后经与死亡信号或毒素作用而死亡，所述个体中的优势免疫应答减少；和/或
通过肌内给药向所述个体给予第一核酸分子和第二核酸分子，其中所述第一核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，所述第二核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原亚型的核苷酸序列，其中所述的第一和第二核酸分子被所述个体细胞所摄取，编码所述主要组织相容性复合体抗原亚型和所述死亡信号或毒素的所述核苷酸序列得以表达，T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由所述细胞表达的主要组织相容性复合体抗原亚型，所述T细胞在复合体形成后经与所述死亡信号或毒素作用而死亡，所述个体中的优势免疫应答减少。
77.权利要求67的方法，包括以下步骤：
在所述个体身体的某个位置上向所述个体给予一种质粒，所述质粒包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列和可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原亚型的核苷酸序列，其中所述质粒被所述个体细胞所摄取，编码所述主要组织相容性复合体抗原亚型和所述死亡信号或毒素的所述核苷酸序列得以表达，T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由所述细胞表达的所述主要组织相容性复合体抗原亚型，所述T细胞在复合体形成后经与死亡信号或毒素作用而死亡，所述个体中的优势免疫应答减少；和/或
在所述个体的某个位置上向所述个体给予第一质粒和第二质粒，其中所述第一质粒包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码死亡信号或毒素的核苷酸序列，所述第二质粒包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原亚型的核苷酸序列，其中所述的第一和第二质粒被所述个体细胞所摄取，编码所述主要组织相容性复合体抗原亚型和所述死亡信号或毒素的所述核苷酸序列得以表达，T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由所述细胞表达的主要组织相容性复合体抗原亚型，所述T细胞在复合体形成后经与所述死亡信号或毒素作用而死亡，所述个体中的优势免疫应答减少。
78.扩展与特异性免疫应答相关的T细胞亚群的方法，包括以下步骤：
a)识别和T细胞亚群形成复合体的主要组织相容性复合体抗原亚型，所述T细胞亚群与特异性免疫应答相关；
b)在所述个体身体的某个位置上向所述个体给予一种核酸分子，所述核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列和可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原亚型的核苷酸序列，所述的核酸分子被所述个体的细胞所摄取，编码所述主要组织相容性复合体抗原亚型的所述核苷酸序列和编码所述B7.2蛋白的所述核苷酸序列得以表达，T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由所述细胞表达的所述主要组织相容性复合体抗原亚型，所述T细胞在复合体形成后经与所述B7.2作用而增殖，与特异性免疫应答相关的T细胞亚群得以扩展；和/或
在所述个体身体的某个位置上向所述个体给予第一核酸分子和第二核酸分子，其中所述第一核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列，所述第二核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原亚型的核苷酸序列，所述的核酸分子被所述个体细胞所摄取，编码所述主要组织相容性复合体抗原亚型的所述核苷酸序列和编码所述B7.2的所述核苷酸序列得以表达，T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由所述细胞表达的所述主要组织相容性复合体抗原亚型，所述T细胞在复合体形成后经与所述B7.2作用而增殖，与特异性免疫应答相关的T细胞亚群得以扩展。
79.权利要求77的方法，其中所述主要组织相容性复合体抗原亚型是主要组织相容性复合体I类抗原亚型。
80.权利要求77的方法，其中所述主要组织相容性复合体抗原亚型是主要组织相容性复合体II类抗原亚型。
81.权利要求77的方法，其中在所述个体身体的某个位置上向所述个体给予一种核酸分子，所述核酸分子包括编码B7.2的核苷酸序列和编码主要组织相容性复合体抗原亚型的核苷酸序列。
82.权利要求77的方法，其中在所述个体身体的某个位置上向所述个体给予第一核酸分子和第二核酸分子，其中所述第一核酸分子包括编码B7.2的核苷酸序列，所述第二核酸分子包括编码主要组织相容性复合体抗原亚型的核苷酸序列。
83.权利要求77的方法，包括以下步骤：
通过肌内给药向所述个体给予一种核酸分子，所述核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列和可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原亚型的核苷酸序列，所述的核酸分子被所述个体的细胞所摄取，编码所述主要组织相容性复合体抗原亚型的所述核苷酸序列和编码所述B7.2蛋白的所述核苷酸序列得以表达，T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由所述细胞表达的所述主要组织相容性复合体抗原亚型，所述T细胞在复合体形成后经与所述B7.2作用而增殖，与特异性免疫应答相关的T细胞亚群得以扩展；和/或
通过肌内给药向所述个体给予第一核酸分子和第二核酸分子，其中所述第一核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列，所述第二核酸分子包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原亚型的核苷酸序列，所述的核酸分子被所述个体细胞所摄取，编码所述主要组织相容性复合体抗原亚型的所述核苷酸序列和编码所述B7.2的所述核苷酸序列得以表达，T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由所述细胞表达的所述主要组织相容性复合体抗原亚型，所述T细胞在复合体形成后经与所述B7.2作用而增殖，与特异性免疫应答相关的T细胞亚群得以扩展。
84.权利要求77的方法，包括以下步骤：
b)在所述个体身体的某个位置上向所述个体给予一种质粒，所述质粒包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列和可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原亚型的核苷酸序列，所述的质粒被所述个体的细胞所摄取，编码所述主要组织相容性复合体抗原亚型的所述核苷酸序列和编码所述B7.2蛋白的所述核苷酸序列得以表达，T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由所述细胞表达的所述主要组织相容性复合体抗原亚型，所述T细胞在复合体形成后经与所述B7.2作用而增殖，与特异性免疫应答相关的T细胞亚群得以扩展；和/或
在所述个体身体的某个位置上向所述个体给予第一质粒和第二质粒，其中所述第一质粒包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码B7.2蛋白的核苷酸序列，所述第二质粒包括可操作地与在所述个体中表达所必需的调控元件相连接的编码主要组织相容性复合体抗原亚型的核苷酸序列，所述的质粒被所述个体细胞所摄取，编码所述主要组织相容性复合体抗原亚型的所述核苷酸序列和编码所述B7.2的所述核苷酸序列得以表达，T细胞的T细胞受体形成复合体，该复合体包括由所述细胞表达的所述主要组织相容性复合体抗原亚型，所述T细胞在复合体形成后经与所述B7.2作用而增殖，与特异性免疫应答相关的T细胞亚群得以扩展。
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