CN1347460A - 用于检测含标记的靶的单分子层和电极以及它们的应用方法 - Google Patents

用于检测含标记的靶的单分子层和电极以及它们的应用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1347460A
CN1347460A CN00806497A CN00806497A CN1347460A CN 1347460 A CN1347460 A CN 1347460A CN 00806497 A CN00806497 A CN 00806497A CN 00806497 A CN00806497 A CN 00806497A CN 1347460 A CN1347460 A CN 1347460A
Authority
CN
China
Prior art keywords
base
sample
electrode
target
oxidation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN00806497A
Other languages
English (en)
Inventor
A·E·埃克哈德特
J·C·米库莱基
M·E·纳皮尔
R·S·托马斯
H·H·托尔普
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of North Carolina at Chapel Hill
Original Assignee
University of North Carolina at Chapel Hill
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of North Carolina at Chapel Hill filed Critical University of North Carolina at Chapel Hill
Publication of CN1347460A publication Critical patent/CN1347460A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites

Abstract

一种用于检测结合对成员之间相互作用的电极,这种电极已通过形成不导电的自组合单分子层加以改性,一种利用这种电极检测生物分子的方法,例如检测核酸或其它靶,其中包括接受体、配位体、抗原、或抗体。在与靶核酸接触时,偶合在自组合单分子层上的低聚核苷酸探子与靶核酸反应,在改性电极表面上生成杂交的核酸。杂交的核酸与能在氧化－还原反应中氧化杂交的核酸中预选碱基的过渡金属络合物反应,检测氧化－还原反应,根据所检测的氧化－还原反应确定核酸的存在或不存在。

Description

用于检测含标记的靶的单分子层和电极 以及它们的应用方法
                与有关申请的关系
本申请是1998年10月27日提交的序号为09/179,665的共同未决的申请的部分继续申请，该申请是1996年6月20日提交的序号为08/667,338的分案申请，即现在的美国专利5,871,918；该专利是1995年6月27日提交的序号为08/495,817的申请(现已废止)的部分继续申请；本申请也是1997年10月14日提交的序号为08/950,503的共同未决的申请的部分继续申请，该申请是1996年6月20日提交的序号为08/667,338的申请，即现在的美国专利5,871,918的部分继续申请；该专利是1995年6月27日提交的序号为08/495,817的申请(现已废止)的部分继续申请，在此引入这些申请的全部公开内容作为参考。
                      发明背景
发明领域
本发明涉及用于分析结合对相互作用的改性电极以及这些电极的应用，特别是在核酸分析和蛋白质-蛋白质相互作用方面的应用。对相关技术的说明
本发明涉及用于检测结合对成员之间相互作用的电极，这些电极是通过生成不导电的自组合单分子层改性的，本发明还涉及利用这些电极检测生物分子的方法，例如检测核酸或其它对象，其中包括受体、配位体、抗原或抗体在内。
已将固体表面核酸杂交的检测应用于临床样品中传染性生物体的鉴定(Spargo，C.A.等人，1993，分子和细胞探子(Molecular andCellular Probes)7，395-404；Martin，W.J.的传染性疾病，1994，聚合酶链反应(The Polymerase Chain Reaction)(K.B.Mullis，F.Ferre和R.A.Gibbs，eds.)，pp.406-417，Berkhauser，波斯顿)，基因表达分析信使核糖核酸(mRNA)的定量测定(Schena，M.，等人，1995，科学(Science)270，467-470)，和关于高密度“碎片”排列的基因组的DNA序列或恢复序列(Chee，M.，等人，1996，科学274，610-613)。在此引入涉及本申请的公报和专利申请的公开内容作为参考。目前，这项检测包括将荧光标记附着到靶核酸上，然后使靶核酸与探子改性的表面杂交，在从固体表面上洗掉未杂交的DNA以后，检测靶核酸。由于检测杂交需要检测光子，所以以这种方法标记的排列的分析需要高分辨率的荧光显微镜。另外，可以采用夹层分析间接地检测杂交，其中使表面结合的杂种随后与带有一个或多个荧光标记或酶的另一种信号探子杂交，将没有荧光的基质转化成发荧光的基质(Spargo，C.A.等人，1993，分子和细胞探子7，395-404)。通过将多种酶附着到探子上，可以获得大的信号放大率(Holodniy，M.等人，1995，病毒学杂志(J.Virology)69，3510-3516)；然而，这些多酶系统的制备是复杂的。
另一些研究人员已经研究出一种基因检测方法，这种检测方法利用固定在载体上的核酸探子，和专门识别双链核酸的物质，但这些方法不能识别单链的对象，因为需要在核酸中插入报导基团(Hashimoto等人，美国专利5,776,672)。
Heller的专利(美国专利5,532,129、5,565,322、5,605,662和5,632,957)公开一种带渗透层电极的应用，渗透层是一层放在电极上的琼胶糖凝胶。对电极施加电位，将探子或靶核酸引导到电极上的反应位置，而不是采用荧光探子所进行的检测步骤的一部分。
可将有机硅烷共价附着在基质例如附着在二氧化硅的羟基化表面的选定位置上，形成如在Chrisey等人的专利(美国专利5,688,642)中所述的有机硅烷单分子层或二分子层薄膜或覆层。所采用的有机硅烷具有至少一个能与基质的羟基化的表面结合的反应位置以及另一个反应性位置，该位置既不能与覆层中其它的有机硅烷分子结合，也不能与基质结合，但它能与与这些不同的分子，例如通过加入硫醇或氨基改性的核酸结合。
一直采用标记的蛋白质和可溶性的试剂来检测蛋白质-蛋白质的相互作用。例如，Weetall的专利(美国专利5,066,372)公开一种在工作电极上的支持层，支持层对试剂是多孔的，可将蛋白质固定在支持层上。还可参见美国专利：Hill的4,945,045、Higgins的4,545,382、和Gratzel的5,378,628。
Wang等人的论文(Wang等人，1997，分析化学(Anal.Chem.)69，4056-4059)，叙述了一种以膜包覆的碳电极，用于在聚合核酸存在下分析低聚核苷酸。使用膜的目的是排除聚合的DNA，同时小分子却能通过该膜以利用碳电极进行电分析。未采用该膜附着探子，以膜覆盖的电极不能识别序列水平。
在本申请从前的申请中，公开了在另一些发明中定性和定量地检测核酸杂交的顺序和方法，在此详细地引入从前申请的全部说明、附图、和权利要求作为参考。这些发明代表了本领域的主要进展，并提供一些在不加酶或荧光标记的情况下，以催化方式起作用的氧化-还原络合物，在一种确定靶核酸存在或不存在的有效方法中，提供获得鸟嘌呤或其它碱浓度的催化电流，以及提供极其准确的化验。
利用自组合单分子层在表面上的生成，能够设计用于研究具有特殊氧化还原活性的被分析物、太阳能转换、和基础电化学的新界面。现有的单分子层是通过羧酸酯和膦酸酯与金属氧化物表面，例如掺锡的铟氧化物表面之间的链烷硫醇-金键以及相关键形成的。因此，已经利用以己撑连接基(linker)与低核苷酸连接的硫醇基团在5’端官能化的DNA采用自组合控制在高盐浓度中金表面上低聚DNA单分子层的结构。显然DNA仍是通过其硫醇端基附着的，同时通过巯基己醇单分子层的生成，防止DNA主链和表面之间的接触。低聚的核酸探子很容易与其互补的序列杂交。(Levicky，R.等人，1998，美国化学学会会志(J.Amer.Chem.Soc.)，120，9787)。一些其它的系统，包括Hill等人在PCT/GB93/00631中的系统，是利用从与电极接触的核酸上直接转移电子设计的，而不是利用催化或利用自组合单分子层转移电子。
对在宽带间隙半导体表面改性，或对探索界面电子转移反应动力学上的应用，可将羧酸酯官能化的钌双吡啶络合物与大面积的纳米二氧化钛晶体薄膜一起，用作获得表面附着的一种途径。另一种途径，是Ru(bpy)3 2+的六磷化作用(Yan，S.G.等人，1996，物理化学杂志(J.Physical Chem.)，100，6867)，以膜(电极)或胶体的形式对TiO2纳米晶体进行表面附着，并随后在宽pH范围内固定这些分子。和在本发明中一样，这种现有技术并不涉及媒介溶液的电化学，但在采用光代替电压作为激励源时，却涉及到电子的直接转移。
迄今对自组合单分子层的研究包括由不能与结合对成员结合的甲基或氢氧化物之类成分封端的单分子层的生成，它们被用于与使生物分子和单分子层结合不同的目的，而且一般是经常变化的。例如，吸附在金属氧化物上的以甲基或羟基封端的长链烷氧肟酸的自组合单分子层已被用于金属防腐(Folkers，J.P.等人，1995，Langmuir，11，813和Laibinis，P.E.等人，1989，科学，245，845)，而且已经制成硫醇封端的自组合单分子层，它能利用静电与金属结合(Tarlov，M.J.和Bowden，E.F.，1991，美国化学学会会志，113，1847)。
与这里所述与本发明相关的早期研究，与在铟锡氧化物(ITO)电极上形成1，12-十四烷双酸(DDCA)单分子层，以及在用水溶性碳化二亚胺活化以后，通过侧链羧酸酯与核酸碱基的内源胺反应，采用DNA进一步衍生的电极有关(Napier，M.等人，1997，Langmuir，13，6342)。DNA在电极上的附着，导致催化作用大大地增强，是由于鸟嘌呤被氧化的金属络合物Ru(bpy)3 3+氧化。在E1/2＝1.05V(对Ag/AgCl)时，羧酸酯-ITO界面是与Ru(bpy)3 2+/3+的电化学相容的，这并不是金-硫醇单分子层的情况。然而，在热应力下，1，12-十四烷双酸单分子层是不稳定的，与本发明的膦酸酯相比，由于其稳定性较低，所以羧酸酯单分子层的生成没有重现性。
在本发明之前，还没有人叙述过能直接附着低聚核苷酸探子并通过鸟嘌呤的氧化能电化学检测被固定的DNA的自组合单分子层。本发明的自组合单分子层是热稳定和耐氧化的，并能迅速地生成，而且具有重现性。当采用羧酸酯作为封端基时，非特定键合能减少到最小。而且，在本发明中采用的优选的膦酸酯化合物是从前买不到的，或合成非常困难的(已知只有C3羧基膦酸酯和C3氨基膦酸酯能够在市场上买到)。
迄今对其它膦酸酯化合物的研究是在溶液中进行的，例如提高色谱的分离作用(Lukes，I.等人，1994，美国化学学会会志，116，1737)，制成多层绝缘膜(例如Hong，H-G等人的硫醇膦酸酯，1991，Langmuir，7，2362，和Yang，H.C.等人的金属烷烃双膦酸酯，1993，美国化学学会会志，115，11855)或绝缘单分子层(Kayyem，J.等人，PCT/US97/20014，在电极表面上形成一种钝化剂，将低聚核苷酸与电极隔开，保持载流子离开电极表面，并阻止溶剂接近电极，所以只在所需的位置上发生电子迁移)，或研究膦酸与金属表面的反应(Gao，W.等人，1996，Langmuir，12，6429)。例如，Gardner，T.J.等人研究了采用二茂铁标记的官能化的硫醇、羧酸或膦酸的正交自组合系统，1995，美国化学学会会志，117，6927。这一研究根本没有涉及结合对成员与电极上自组合膦酸酯单分子层的结合。当将DNA固定在这种现有的膜上时，那是通过静电结合而不是共价附着，在双链DNA中插入DNA的(Xu，X-H等人，1994，美国化学学会会志，116，8386)。
对电极上薄层的其它研究，也未涉及单分子层，但却涉及到双分子层，例如研究了附着在SiO2上的包含类脂的双分子层，以及配位体与生物分子的相互作用(Boxer等人，PCT/US97/21835)，或在用于检测所选核酸序列的膜和电极之间具有间隙的双分子层(Harding等人，PCT/AU97/00316)；还涉及到采用生物传感器的聚合层(Ribi(欧洲专利0402917B1)，这些传感器使用电、光、和机械信号，具有导电的表面活性剂层，导电的表面活性剂层与特定的结合对成员结合，表面活性剂层可以以均匀的定向层的形式存在，在采用标准的类脂单分子层技术制成的表面活性剂膜中，由于聚合的不饱和基团的聚合作用，表面活性剂层是导电的；或涉及到为了完全不同的目的使用的半渗透膜(Maley等人，美国专利5,711,868，其中采用电化学传感器利用酶检测葡萄糖，其中的工作电极，是采用半透膜覆盖的)。
因此本发明的目的是提供一种将低聚核苷酸探子或结合蛋白质的物质固定在ITO等电极表面上的方法，使它们能与靶核酸进行杂交，或与靶蛋白质结合，随后通过氧化-还原反应进行检测。
本发明的另一个目的是提供一种在电极上制造不导电的自组合单分子层的方法，可采用这种单分子层检测和定量测量靶生物分子，例如核酸或其它靶，其中包括接受体、配位体、抗原或抗体。
从下列公开内容和所附的权利要求，可以更充分地看出本发明的其它目的和优点。
                      发明概述
本发明是一种在电极上的自组合膦酸酯单分子层，在优选的实施方案中，自组合单分子层是在ITO表面上的羧基-烷基膦酸酯，使结合对的一个成员与其共价结合。本发明还包括采用单分子材料在电极表面上形成自组合单分子层的方法，以及将结合对成员固定在改性电极表面上的方法。在优选的实施方案中，具有自组合单分子层的电极对电化学检测核酸中预选的碱基和确定试样中靶核酸的存在是有效的。在与靶核酸接触时，偶合到自组合单分子层上的低聚核苷酸探子与靶核酸反应，在改性电极表面上生成杂交的核酸。杂交的核酸与能在氧化-还原反应中氧化杂交的核酸中预选碱基的过渡金属络合物反应，检测氧化-还原反应；和根据所检测的氧化-还原反应确定杂交核酸的存在或不存在。可以按照本发明检测氧化-还原反应，因为电子在从被固定的结合对转移到过渡金属络合物上以后，单分子层能容许过渡金属络合物将电子转移到电极表面，在电极上检测它们。因此，自组合单分子层是不导电的，用于固定靠近电极表面的反应剂，并容许过渡金属络合物从被固定的反应剂自由地移动到电极的导电的工作表面，使电子发生迁移。在某些情况下，可将本领域已知的放大技术与本发明结合起来使用。
还可应用本发明检测其它靶(例如接受体、配位体、抗原、和抗体等)。例如，可以通过使靶蛋白质与结合蛋白质的物质如附着在本发明自组合单分子层上的抗体反应，接着加入第二种结合蛋白质的物质如已经结合一种能在氧化-还原反应中被氧化的标记的第二种抗体，检测试样中的对象蛋白质。与核酸的情况一样，使标记与能在氧化-还原反应中氧化标记的过渡金属络合物反应。检测氧化-还原反应能确定靶蛋白质的存在或不存在。一种适合在本发明中使用的标记是低聚核苷酸。
从下列公开内容和所附的权利要求中，能更充分地看出本发明的其它目的和特征。
                   附图简述
图1a和1b是以皮摩尔(picomole)表示的所结合的包含鸟嘌呤的低聚核苷酸的量对本发明自组合单分子层组合时间的曲线，表明自组合时间对单分子层生成的影响与单分子层能与其结合的低聚核苷酸探子的量的函数关系。
图2用曲线说明自组合溶液中C12羧基膦酸酯浓度对单分子层生成的影响，这种影响与偶合到自组合单分子层上的包含鸟嘌呤的低聚核苷酸的电化学响应所指示的相同。电化学测量是在扫描速度为20V/s，和Ru(bpy)3 2+浓度为100μM的条件下，采用循环伏安法进行的。
图3用曲线说明根据本发明采用12-碳羧基-烷基膦酸酯制造的含鸟嘌呤的低聚核苷酸单分子层的稳定性。电化学测量是在扫描速度为20V/s，和Ru(bpy)3 2+浓度为100μM的条件下，采用循环伏安法进行的。
图4是一组说明偶合低聚核苷酸的单分子层剂量响应的循环伏安曲线，在单分子层中固定的含鸟嘌呤的低聚核苷酸量是变化的。电化学测量是在扫描速度为20V/s，和Ru(bpy)3 2+浓度为100μM的条件下，采用循环伏安法进行的。
图5是用图解法说明图4所示的计量响应。电化学测量是在扫描速度为20V/s，和Ru(bpy)3 2+浓度为100μM的条件下，采用循环伏安法进行的。
发明详述及对优选实施方案的说明
本发明提供一种在电极上的具有共价结合的结合对成员的自组合膦酸酯单分子层，以及应用这些自组合单分子层的方法。
本申请所采用的术语不导电的“单分子层”，包括覆盖电极导电工作表面的单分子层，优选包括从溶液中自组合到ITO电极表面上的烷基膦酸酯，其中将膦酸酯上的氧和电极上的金属原子之间的键称作“配价键”或“配位键”(在优选实施方案中)。本发明的单分子层的生成不包括真正共价键的生成，例如不包括在C、N和O等二种非金属之间生成的键，这些键能共享电子，形成真正的共价键。本发明也不包括聚合物膜。
具体而言，本发明的自组合单分子层，是由能附着到电极并改性电极，例如ITO电极的膦酸酯分子形成的。本发明所用的分子是多官能的，最少具有至少一个能与ITO表面结合的表面活性的官能团，优选膦酸酯，和至少一个端基团R1，例如羧基、氨基、羟基、或甲基，结合对的成员能以共价键与这些基团结合。此外，这些分子可以在膦酸酯基和R1基之间具有一个有机隔离基R2，优选R2包含一个或多个碳原子以及连带的取代基(一般为氢)。膦酸酯单分子层优选包括羧基-烷基膦酸酯(其中R1＝-CO2H和R2＝-(CH2)n-)，如在下面更详细讨论的，最优选11-羧基十一烷膦酸(其中R1＝-CO2H和R2＝-(CH2)11-)。本发明所用的术语“结合对的成员”，包括所有能互相结合的生物分子，例如核酸、接受体、配位体、抗体、抗原和碳水化合物。虽然本发明的这些实施例主要涉及低聚核苷酸的应用，但本领域的普通技术人员能够对其它的生物分子应用这些实施例和本发明的内容。
本发明所采用的电极包括导电的基质，或具有起导电工作表面作用的外表面的基质。基质本身可以是导电的，或是非导电的，但具有导电的工作表面。电极可以具有本领域中任何常规的形状，例如在其外部具有导电工作表面的圆柱形电极，或具有在其一侧上形成的导电工作表面的平板形电极。在其上组合单分子层的导电基质，可以是通常使用的任一种金属或非金属材料，其中包括碳，例如石墨、玻璃质碳、热解石墨、碳膏剂、和碳素纤维；掺杂或未掺杂的氧化物，例如掺铟的锡氧化物(ITO)、锡氧化物、钛氧化物、锰氧化物、和铅氧化物；和半导体材料，例如Si、Ge、ZnO、CdS、TiO2、和GaAs等。优选采用ITO，因为其性质是比较熟悉的，而且便宜，还因为它在水中在中性pH下的氧化电位极限高，而且充电电流较低。所以将结合ITO进一步叙述本发明。本发明不能采用如吸附了硫醇或二硫化物的金等金属，因为在电位低于鸟嘌呤氧化所需的电位下，它们会发生氧化。
测定含标记靶存在的仪器，例如，可以包括一个装流体试样的试样容器；一个电极，其中包括在其上具有导电工作表面的基质；和在所述导电工作表面上的不导电的自组合单分子层，所述的单分子层包含膦酸酯分子，每一个这种膦酸酯分子最少具有至少一个膦酸酯基，和至少一个R1基，其中R1基与结合对成员共价结合，通过该单分子层过渡金属络合物能从被固定的反应剂自由地移动到导电的工作表面上，以将电子转移到导电的工作表面上；和以电子与单分子层相通的恒电位仪。这些仪器还包括结合对的一个成员，例如固定在自组合单分子层上的低聚核苷酸探子，或固定在自组合单分子层上的结合有蛋白质的物质。
测定试样中存在靶核酸的方法，一般包括使自组合在电极上的单分子层与低聚核苷酸探子接触，使低聚核苷酸探子以共价键附着在单分子层上；使电极上由探子改性的单分子层与核酸溶液接触，使靶核酸和低聚核苷酸探子在改性的电极上形成杂交的核酸；使杂交的核酸与能在氧化-还原反应中氧化杂交的核酸中预选碱的过渡金属络合物反应；检测氧化-还原反应；根据所检测的氧化-还原反应，确定核酸的存在或不存在。另外，在单分子层组合在电极上之前，可使低聚核苷酸探子偶合到膦酸酯上。
至于蛋白质，确定靶蛋白质在试样中的存在，包括使自组合在电极上的单分子层与结合有蛋白质的物质接触，使所结合的物质以共价键附着在根据本发明的单分子层上；使电极上蛋白质改性的单分子层与试样接触；使改性电极与经改性含有标记的第二种结合蛋白质的物质接触；使单分子层与能在氧化-还原反应中可氧化这种标记的过渡金属络合物反应；检测氧化还原反应；根据所检测的氧化-还原反应，确定靶蛋白质的存在或不存在。一种适合本发明使用的标记是低聚核苷酸。另外，在单分子层组合在电极上之前，可使结合蛋白质的物质偶合到膦酸酯单分子层上。
膦酸酯.如前面所讨论的，形成本发明的自组合单分子层的分子包括能与ITO电极表面结合的膦酸酯基(-PO3H2)，和能与结合对的一个成员共价结合的R1基。膦酸酯基可以是单膦酸酯、二膦酸酯、三膦酸酯、四膦酸酯或多膦酸酯基。R1端基包括，但不限于羧基、酸性卤化物、酸酐、羟基、环氧化物、醛、酮、巯基、腈和氨基。膦酸酯基和R1优选采用有机隔离基或连接基R2搭桥，当存在时，它们可以包括烷基、烯基、炔基、和芳香族结构，芳香族结构可以是直链、支链、环链或聚合结构。R2可以用任意数目能与ITO表面结合的膦酸酯分子取代。
膦酸酯的来源，优选羧基-烷基膦酸酯。在本发明的自组合的单分子层中，羧基-烷基膦酸酯的膦酸根部分与ITO结合，其稳定性随烷基部分碳原子数的增加而增加。羧基部分供给单分子层负电荷，而且正是这个羧基与结合对的成员偶合。如果需要单分子层带正电荷，可以使用氨基-烷基膦酸酯，对于电中性的表面，可以使用甲基或羟基膦酸酯。
基于迄今所做的实验，最优选的羧基-烷基膦酸酯是12-碳羧基-烷基膦酸酯(本发明也称作11-羧基十一烷膦酸)(优选的新制备方法，参见实施例2)。在本发明实施例中所述的实验中，首次使用这种12-碳膦酸酯。这些实验表明，在烷基中具有2-14个碳的羧基-烷基膦酸酯能生成具有足够稳定性的自组合单分子层，并提供在本发明中使用所需要的特性。按照在12-碳羧基-烷基膦酸酯之后，在本发明中有效性依次降低的顺序，判断何时在单分子层中只使用3-碳氨基-烷基膦酸酯和3-碳羧基-烷基膦酸酯。随着膦酸酯链中碳数目的增加，获得的单分子层的稳定性也增加。
在实施例2中更详细叙述的羧基-烷基膦酸酯的合成，一般包括：(1)通过与草酰氯反应，将溴代烷基羧酸转化成酸性氯化物中间体；然后(2)通过在碱性条件下与醇反应，例如与乙醇反应，将酸性氯化物中间体转化成溴代烷基酯，所以(3)通过与三乙基亚磷酸酯(或三甲基亚磷酸酯)反应，然后酸性水解生成酸，可将溴化烷基酯中间体转化成羧基-烷基膦酸酯。
在本发明实施例中讨论的自组合膦酸酯单分子层，在化学上是均相的，即只由羧基-烷基膦酸酯组成。然而，本发明包括自组合的非均相单分子层，其中这些膦酸酯补充以其它材料，例如，氨基-烷基膦酸酯、羟基-烷基膦酸酯、甲氧基-烷基膦酸酯、甲基-烷基膦酸酯、硫醇-烷基膦酸酯、醛-烷基膦酸酯、三氟甲基-烷基膦酸酯、和各种长度的两性离子膦酸酯，所以改变了单分子层的物理和化学特性，例如在单分子层上的总电荷或电荷分布。这些材料可以能，也可以不能与结合对的一个成员共价结合。在特定条件下，混合的单分子层可增强特定靶分子与结合对成员的结合，和/或减少非靶分子与电极表面的非特定结合。
实验样品。这种方法可对包含靶核酸或其它靶生物分子如蛋白质的试样使用。任何怀疑包含靶的试样均可被使用，其中包括，但不限于组织试样，例如活组织试样和生物学流体，例如血液、痰、尿和精液试样、细菌培养物、土壤试样、食品试样、和细胞培养物等。靶可以是任何来源的，其中包括动物、植物或微生物(例如，病毒、原核生物、和真核生物的生物体，其中包括细菌、原生动物和真菌等)，这取决于实验的具体目的。一些实例包括手术试样、医疗诊断使用的试样、遗传化验使用的试样、环境试样、细胞培养物试样、食品试样、牙齿试样、和兽医试样。在使用本方法之前，可以采用本领域的技术人员熟知或有效的技术处理或纯化这些试样；如果需要，在使用本方法之前，其中的核酸可以被消化、破碎和/或放大(见下文)。
放大。因为利用具有根据本发明的自组合单分子层的电极的方法包括使靶核酸试样与低聚核苷酸探子接触，以生成杂交的核酸，所以采用本发明的某些应用，可能需要在与低聚核苷酸探子接触之前将核酸放大。所选择的或靶的核酸序列的放大，可以采用任何适宜的装置进行，例如采用在共同未决的申请(SN09/179,665和SN08/950,503)中公开和讨论的装置进行。
核酸的检测。如上所述，已在其上形成自组合的单分子层的本发明的电极，和采用这种电极的方法能检测杂交的核酸。在这种方法中，使靶核酸与已与自组合单分子层结合的低聚核苷酸探子接触，以生成杂交的核酸。在本发明的方法中采用的低聚核苷酸探子可以是任一种由约4或6个碱基直至约80或≥100个碱基组成的探子，更优选约8至约30个碱基。根据本领域熟知的技术，可以制备具有任意多种碱基顺序的低聚核苷酸探子。适合制备低聚核苷酸探子的碱基，可以选自天然产生的核苷酸碱基，例如腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、和胸腺嘧啶；和非天然产生的或“合成的”核苷酸碱基，例如8-氧-鸟嘌呤、6-巯基鸟嘌呤、4-乙酰胞嘧啶核苷、5-(羧基羟基乙基)尿苷、2′-O-甲基胞嘧啶核苷、5-羧基甲基氨基-甲基-2-硫代尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿苷、二氢尿苷、2′-O-甲基假尿苷、β，D-半乳糖苷queosine、2′-O-甲基鸟苷、次黄苷、7-脱氮鸟嘌呤、N6-异戊烯腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基次黄苷、2，2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞嘧啶核苷、5-甲基胞嘧啶核苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿苷、β，D-甘露糖苷queosine、5-甲氧基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲基硫代-N6-异戊烯腺苷、N-((9-β-D-呋喃核糖-2-甲基硫代嘌呤-6)氨甲酰)苏氨酸、N-((9-β-D-呋喃核糖嘌呤-6)N-甲基-氨甲酰)苏氨酸、尿苷-5-氧乙酸甲基酯、尿苷-5-氧乙酸、wybutoxosine、假尿苷、queosine、2-硫代胞嘧啶核苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-β-D-呋喃核糖嘌呤-6-氨甲酰)苏氨酸、2′-O-甲基-5-甲基尿苷、2′-O-甲基尿苷、wybutosine、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷、2′-O-甲基腺嘌呤、和2′-O-甲基次黄苷。可以采用任一种寡核苷酸主链，其中包括DNA、RNA、修饰糖类，例如碳环，和包含2′取代基如氟基和甲氧基的糖类。低聚核苷酸可以是其中至少一种或全部在核苷酸之间搭桥的磷酸酯残留物是改性的磷酸酯的低聚核苷酸，例如甲基膦酸酯、甲基phosphonothioates、phosphoromorpholidates、phosphoropiperazidates、和phosphoramidates(例如，象所述的那样，可改性核苷酸之间每隔一个搭桥的磷酸酯残留物)。低聚核苷酸可以是“肽核苷酸”，例如P.Nielsen等人在1991，科学254，1497-1500中所述的。唯一的要求是，低聚核苷酸探子应该是有顺序的，至少一部分顺序与靶核酸的一部分顺序是互补的。在某些应用中，需要使核酸试样与许多具有不同碱基顺序的低聚核苷酸探子接触(例如，在试样中具有二种或多种靶核酸时，或当在“夹层”分析中使一种靶核酸与二种或多种低聚核苷酸探子杂交时)。
预选的碱基。在杂交后，与附着在自组合在电极上的单分子层上的低聚核苷酸探子杂交的靶核酸与适宜的介体反应，这种介体能在氧化-还原反应中氧化预选的碱基。这种预选的碱基可以是任何天然产生的，或合成的核苷酸碱基，在与所选的介体反应时，它能发生氧化。与预选的碱基未成对时比较，在成对时，预选的碱基应具有唯一的氧化速率。当与四种天然产生的碱基的每一种成对时，预选的碱基都应具有唯一的氧化速率。一般可采用催化反应检测其5′-单核苷酸(例如5′-脱氧核糖核苷酸或5′-核糖核苷酸)速率常数大于104M-1s-1的碱基。适宜的预选碱基的实例，包括但不限于鸟嘌呤、腺嘌呤、8-氧-鸟嘌呤、8-氧-腺嘌呤、8-溴-鸟嘌呤、黄嘌呤、假尿苷、6-巯基鸟嘌呤、8-巯基鸟嘌呤、2-硫代黄嘌呤、6-硫代黄嘌呤、6-巯基嘌呤、2-氨基-6-羧甲基-巯基嘌呤、2-巯基嘌呤、6-甲氧基嘌呤、2-乙酰氨基-6-羟基嘌呤、6-甲基硫代-2-羟基嘌呤、2-二甲基氨基-6-羟基嘌呤、2-羟基嘌呤、2-氨基嘌呤、6-氨基-2-二甲基烯丙基-嘌呤、2-硫代腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤、和8-甲氧基腺嘌呤。预选的碱基一般选自鸟嘌呤、腺嘌呤、6-巯基鸟嘌呤、8-氧-鸟嘌呤、和8-氧-腺嘌呤，现在优选的天然产生的预选碱基是鸟嘌呤，现在优选的合成的预选碱基是8-氧-鸟嘌呤或6-巯基鸟嘌呤。
介体.能进行电子转移所需的介体，可以是任一种分子，例如阳离子的、阴离子的、非离子的或两性离子的分子，它能在唯一的氧化电位下与预选的碱基反应，将电子从核酸转移到电极上。因此，介体的选择取决于所选择的特定的预选碱基，本发明的技术人员很容易就能确定。特别优选的介体包括过渡金属络合物，过渡金属络合物能够采用预选的碱基，进行金属-核酸电子转移，以致产生还原形式的金属络合物，完成催化循环。适合在本发明的方法中使用的过渡金属络合物的实例包括，例如钌2+(2，2′-双吡啶)3(“Ru(bpy)3 2+”)、钌2+(4，4′-二甲基-2，2′-双吡啶)3(“Ru(Me2-bpy)3 2+”)、钌2+(5，6-二甲基-1，10-菲绕啉)3(“Ru(Me2-Phen)3 2+”)、铁2+(2，2′-双吡啶)3(“Fe(bpy)3 2+”)、铁2+(5-氯菲绕啉)3(“Fe(5-Cl-phen)3 2+”)、锇2+(2，2′-双吡啶)3(“Os(bpy)3 2+”)、锇2+(5-氯菲绕啉)3(“Os(5-Cl-phen)3 2+”)、二氧铼1+磷化氢、和二氧铼1+吡啶(“ReO2(py)4 1+”)。一些适合用作介体的阴离子络合物是Ru(bpy)((SO3)2-bpy)2 2-和Ru(bpy)((CO2)2-bpy)2 2-，一些用作介体的两性离子络合物是Ru(bpy)2((SO3)2-bpy)和Ru(bpy)2((CO2)2-bpy)，其中(SO3)2-bpy2-是4，4′-二磺基-2，2′-双吡啶，和(CO2)2-bpy2-是4，4′-二羧基-2，2′-双吡啶。在具有任一种前述金属的络合物中，也可以采用吡啶、双吡啶和菲绕啉基团的适宜取代衍生物。适宜的取代衍生物包括，但不限于4-氨基吡啶、4-二甲基吡啶、4-乙酰吡啶、4-硝基吡啶、4，4′-二氨基-2，2′-双吡啶、5，5′-二氨基-2，2′-双吡啶、6，6′-二氨基-2，2′-双吡啶、4，4′-二乙撑二胺-2，2′-双吡啶、5，5′-二乙撑二胺-2，2′-双吡啶、6，6′-二乙撑二胺-2，2′-双吡啶、4，4′-二羟基-2，2′-双吡啶、5，5′-二羟基-2，2′-双吡啶、6，6′-二羟基-2，2′-双吡啶、4，4′，4″-三氨基-2，2′，2″-三吡啶、4，4′，4″-三乙撑二胺-2，2′，2″-三吡啶、4，4′，4″-三羟基-2，2′，2″-三吡啶、4，4′，4″-三硝基-2，2′，2″-三吡啶、4，4′，4″-三苯基-2，2′，2″-三吡啶、4，7-二氨基-1，10-菲绕啉、3，8-二氨基-1，10-菲绕啉、4，7-二乙撑二胺-1，10-菲绕啉、3，8-二乙撑二胺-1，10-菲绕啉、4，7-二羟基-1，10-菲绕啉、3，8-羟基-1，10-菲绕啉、4，7-二硝基-1，10-菲绕啉、3，8-二硝基-1，10-菲绕啉、4，7-二苯基-1，10-菲绕啉、3，8-二苯基-1，10-菲绕啉、4，7-二精胺-1，10-菲绕啉、3，8-二精胺-1，10-菲绕啉、双吡啶并[3，2-a：2′，2′-c]吩嗪、6，6′-二氯-2，2′-双吡啶、酞花青和卟啉。
氧化-还原反应。在足以引起介体与预选的碱基进行氧化-还原反应的条件下，可使介体与杂交的核酸反应。在其中发生氧化-还原反应的溶剂可以是任一种适合溶解核酸的溶剂，优选包括水。本领域的技术人员会了解能进行氧化-还原反应的适宜条件。
氧化-还原反应的检测。在具有根据本发明的自组合单分子层的电极上检测氧化-还原反应的发生，以观测表示发生氧化-还原反应的电子信号的变化。将电极放置在与介体溶液接触的位置上，一般也将参比电极和辅助电极与工作电极一起放置在与溶液接触的位置上(大部分电流通过辅助电极)。同样，适宜的参比电极在本领域也是已知的，例如其中包括银/氯化银电极。适宜的辅助电极是Pt电极。
检测伴随氧化-还原反应的电子信号，能确定靶的存在或不存在。确定靶存在或不存在的步骤，一般包括(i)测定氧化-还原反应的反应速率，(ii)将测定的反应速率与在有核酸存在或没有核酸存在的情况下，过渡金属络合物的氧化-还原反应速率进行比较，然后(iii)确定所测定的反应速度是否与在有或没有靶的过渡金属络合物的氧化-还原反应速率基本上相同。测定反应速率的步骤，可以采用任何适宜的装置进行。例如，相对反应速度，可以通过在相同的扫描速率、探子浓度、靶浓度、介体、缓冲剂、温度、和/或电化学方法下，比较电流来测定。
氧化-还原反应的速率可以采用本领域的技术人员已知的适宜的装置进行测定。氧化-还原反应的速率一般是通过测量伴随氧化-还原反应产生的电子信号测定的。例如，可以安装与覆有本发明公开的自组合单分子层的电极以电子连通的适宜的电子仪器，测定伴随氧化-还原反应的电子信号。为了测量杂交的核酸和催化剂之间反应的氧化-还原反应速率，适宜的仪器是能测量所产生的电子信号的恒电位仪。当待检测的靶是蛋白质时，检测器结合到能在氧化-还原反应中被氧化的标记上，一种这样的标记就是包含预选碱基的低聚核苷酸。
电子输出是包括循环伏安测量法、常规脉冲伏安测量法、计时安培分析法、计时库仑分析法、或方波伏安测量法在内的任一种电化学方法的特性，本发明优选的方法是循环伏安测量法和计时安培分析法。可以采用本领域所熟悉的计算机，控制电极的使用并记录使用的结果。采用根据本发明自组合在ITO电极上的单分子层分析核酸的最常用的方法是循环伏安测量法。在循环伏安测量法中，电化学系统的电位，从初始电位(0-800mV)至最终电位(1300-2000mV)是线性变化的。在达到最终电位时，扫描的方向则倒过来，按相反的方向扫过相同的电位范围。在扫描速率不变下(例如约10mV/s至约5000V/s)，电位是变化的。对于大多数实验，将初始电位调至0mV，最终电位是在实验中由扫描速率确定的。现在优选的扫描速率为20V/s，最终电位为1600mV。收集在每个电位下的电流，并将这些数据标绘成电流对电位的曲线。
作为循环伏安测量法的另一种方案，可以采用如计时库仑分析法或计时安培分析法等电位阶跃方法，以分析本发明单分子层上的核酸。在计时库仑分析法中，电化学系统从初始电位(0mV-800mV)直接阶跃到最终电位(1000mV-1600mV)。使电化学系统在最终电位下维持某一指定时间(50μs-30μs)，以时间的函数收集电荷。虽然现在未进行，但如果需要，可使电位阶跃返回到初始电位，并可在初始电位下，以时间的函数收集电荷。在计时安培分析法中，在某一规定时间(50μs-30μs)内，电化学系统从初始电位(0mV-800mV)直接阶跃到最终电位(1000-1600mV)，并以时间的函数收集电流。如果需要，可使电位阶跃返回到初始电位，并可在初始电位下，以时间的函数收集电流。虽然优选的电位阶跃和时间可以随不同的分析参数而变化，但优选的电位阶跃为1100mV，收集时间为500ms。
检测方法。采用根据本发明的具有不导电的自组合单分子层的电极检测靶核酸上的预选碱基包括，(a)使试样与已与根据本发明的单分子层结合的，特别是能与靶核酸结合生成杂交核酸的低聚核苷酸探子接触；(b)使杂交的核酸与在氧化-还原反应中能氧化预选碱基的过渡金属络合物接触；(c)检测伴随杂交核酸的氧化-还原反应的存在或不存在；和(d)根据检测预选碱基的氧化-还原反应，确定靶核酸在试样中存在或不存在。
优选是靶核酸包含的预选碱基比低聚核苷酸探子包含的预选碱基至少多约10个，更优选至少多50或100个。当靶核酸包含的预选碱基比低聚核苷酸探子包含的多许多时，有利的是电流的增加较大。
靶核酸优选比低聚核苷酸探子长，而且至少一个预选的碱基，如在美国专利5,871,918中所述，是“外伸的”，并不与杂交核酸中的低聚核苷酸探子杂交。优选至少10、50或100个预选的碱基是“外伸的”碱基，借此充分放大被检测的电化学信号。
虽然可以任选，但却优选低聚核苷酸探子的顺序不包含预选的碱基。在这种容易与靶核酸杂交又不包含预选碱基的天然生成的碱基的这种顺序不能利用时，可以采用的对策是，使用另一些氧化还原不活性的碱基(在下面讨论)。
例如，可以选择不包含任何鸟嘌呤残留物的低聚核苷酸探子的顺序(例如，只有A、T、和C)。在这条链存在下，Ru(bpy)3 2+的循环伏安图与没有低聚聚体的情况非常相似。如果靶核酸比低聚核苷酸探子长，那么使这种低聚核苷酸探子与在成对碱基重叠的区域和/或在外伸的区域包含鸟嘌呤的靶核苷酸链杂交。由于检测多个鸟嘌呤，所以相对生成的杂种数目的信号放大了。在基因组DNA或RNA是靶核酸链的情况下，遇到大量外伸的鸟嘌呤，它们将给出非常大的信号放大率。
在优选的实施方案中，靶核酸链上预选碱基的分析包括(优选无氧化还原作用的)低聚核苷酸探子链固定在电极表面自组合单分子层上，当在介体存在下扫描时，本底的信号低。然后使单分子层与靶核酸溶液接触，靶核酸包含预选的碱基。如果发生杂交，靶核酸就将非常接近电极，在介体存在下，检测的电流会增大。
可以采用另一种碱基代替低聚核苷酸探子链上的鸟嘌呤(和鸟嘌呤一样，是一种对胞嘧啶的结合亲合力比对成对核酸中的其它碱基的结合亲和力更大的碱基)，但在可应用的反应条件下，这种碱基不能被介体氧化。在靶核酸中的预选碱基是鸟嘌呤，并靶核酸也包含胞嘧啶(它通常与低聚核苷酸探子中的鸟嘌呤结合)时，探子包含另一种能与杂交核酸中胞嘧啶结合的碱基。另一种碱基可以是次黄苷，在电化学上次黄苷的活性比鸟嘌呤低三个数量级。反应步骤一般包括使过渡金属络合物在足以引起预选碱基的选择性氧化而不氧化另一种碱基的条件下与核酸反应。
因此，当靶核酸包含至少一种预选的碱基，和低聚核苷酸探子包含另一种氧化还原不活性的碱基时，检测靶核酸的方法包括：(a)使靶核酸与一种互补的，特别是能与靶核苷酸结合生成杂交核苷酸的低聚核苷酸探子接触；(b)使杂交的核苷酸与在氧化-还原反应中能氧化预选碱基的过渡金属络合物接触；(c)检测氧化-还原反应；和(d)根据检测预选碱基的氧化-还原反应，确定杂交核酸的存在或不存在。
测定核酸量。上述的方法特别适合核酸的定量检测。在这一部分所述的情况下，可以采用数字模拟，根据循环伏安图，测定被介体(例如Ru(bpy)3 2+)氧化杂交核酸的速率常数。在大多数情况下，这一反应将遵守二级反应动力学，所以速率＝k[Ru(bpy)3 2+][DNA]，其中k是速率常数，对这种特定的低聚核苷酸探子-靶核酸的杂种，k是特定的，[Ru(bpy)3 2+]是介体的浓度，[DNA]是杂交的核酸(杂交核酸可能是一种DNA-RNA的杂种)的浓度。如果k和[Ru(bpy)3 2+]是已知的，则可测定杂交核酸的量。在实践中，绘制采用不同量的包含靶核酸的标准溶液获得的电流增加标准曲线，并采用电流的增加直接获得杂交核酸的量。然后使该量直接与包含靶核酸的材料量(例如临床试样中传染性的生物体)发生关联。参见例如M.Holodniy等人，1995，病毒学杂志(J.Virol.)69，3510-3516；J.Mellors等人，1996，科学272，1167-1170。
对蛋白质的应用。也可以将本发明公开的内容与本领域的技术人员已知的研究蛋白质的方法一道采用，使用自组合在电极导电工作表面上的单分子层检测非核酸的生物分子，例如蛋白质。与核酸的情况一样，对于其它生物分子，采用本发明不需要酶标记。例如，检测试样中靶蛋白质的方法包括：(a)将含蛋白质的物质附着在已经自组合在导电工作表面上的单分子层上；(b)使靶蛋白质与偶合在单分子层上的含蛋白质的物质接触；(c)使已结合到单分子层上的靶蛋白质，与已结合到能在氧化-还原反应中被氧化的标记上的第二种含蛋白质的物质接触；(d)使在已与靶蛋白质结合的第二种含蛋白质物质上的标记与能在氧化-还原反应中氧化标记的过渡金属络合物反应；(e)检测氧化-还原反应；和(f)根据所检测的氧化-还原反应，确定靶蛋白质的存在或不存在。
参照下列实施例会更清楚地理解本发明的特征，但不能认为这些实施例是对本发明的限制。
                     实施例
实施例1。试剂和DNA。在这些实验中采用的无机试剂是分析级或更纯的。试剂的来源如下：羧基-烷基膦酸酯是根据实施例2制备的，或由Sigma Chemicals(密苏里州，圣路易斯)或Aldrich(威斯康星州，密尔沃基)生产的；1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、和乙醇胺(Sigma或Aldrich)；[γ-32p]腺苷三磷酸(ATP)(Pharmacia Biotech。有限责任公司，新泽西州，皮斯卡塔维)；水(Millipore的Milli-Q Plus纯化系统，马萨诸塞州，贝德福德)；合成的低聚核苷酸(Oligos Etc。有限责任公司，俄勒冈州，威尔松维尔)；1-溴代十二酸、N，N′-二甲基甲酰胺、和三乙膦(Sigma)；草酰氯、二氯甲烷、无水乙醇、和三乙胺(Aldrich)；和Na2HPO4、NaH2PO4、NaCl和浓HCl(Fisher，宾夕法尼亚州，匹茨堡)。
实施例2。制备C-12膦酸酯的优选方法。虽然目前在市场上可以买到某些膦酸，例如氨基丙基膦酸和2-羧基乙基膦酸(Sigma或Aldrich)，优选采用碳较多的膦酸，例如11-羧基十一烷膦酸(C-12膦酸酯)
C-12膦酸酯可以如下制备：将1.12g(4mmol)的溴代十二酸溶解在在50ml圆底烧瓶中的10ml二氯甲烷中。在搅拌下，在氮气氛中和在室温下，加入草酰氯(2ml，2M)，接着加入100μl N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)开始反应。在开始反应后1-2分钟，将另外100μlDMF加入溶液中。在15分钟后，将8ml二氯甲烷加入反应混合物中，在氮气中继续搅拌15分钟。然后用氮气流从酸性氯化物中间体中除去溶剂。
立即将酸性氯化物中间体溶解在10ml二氯甲烷中，一面迅速搅拌，一面加入乙醇(350μl)和三乙胺(835μl)。用pH试纸检查，溶液的pH为7-8。溶液在室温下搅拌1小时。蒸发出溶剂，将产物溶解在10ml己烷中，用10ml水洗涤产物。回收己烷相，蒸发至干，回收乙酯中间体。
将三乙膦(1.5ml)加入在100ml圆底烧瓶中的乙酯中间体中，并在氮气中回流溶液。在1.5小时后，将另一些三乙膦(1.5ml)加入反应混合物中，在氮气中继续回流4.5小时。将反应混合物冷却到约50℃，并加入13.2ml浓HCl。在回流16小时后，将反应混合物用移液管转移到烧杯中，并加入5ml水。当反应混合物冷却到室温时，从溶液中沉淀出12-十二烷膦酸沉淀产物。采用过滤收集这种产物，用水洗涤和干燥。
实施例3。制备电极上的单分子层。在使用之前，清洁在玻璃(Delta Technologies，明尼苏达州，斯第尔沃特)上的ITO电极，并使其在空气中干燥，玻璃具有所需的尺寸和形状，例如15mm×15mm的方块，电阻率为10ohms/方，ITO层的厚度为1400-1600，SiO2底基层厚度为2000。
在室温下，将清洁和干燥的电极暴露在所选的、溶解在有机溶剂(例如甲醇或乙醇)中的羧基-烷基膦酸酯中。甲醇是优选的，因为羧基-烷基膦酸酯非常易溶解在其中，并能从甲醇中进行良好地自组合。羧基-烷基膦酸酯的浓度为0.1mM-20mM，优选2-5mM的羧基-烷基磷酸酯，以生成足够的单分子层。适宜的自组合时间可为3秒-20小时，现在优选30分钟。用水洗涤三次，将未附着的羧基-烷基膦酸酯从ITO电极上冲洗掉，使电极干燥。如果膦酸酯不够，单分子层的顺序可能较差，羧酸酯基不易于活化和低聚核苷酸探子的附着。过量的单分子层能起电子迁移阻挡层的作用，阻止过渡金属络合物从低聚核苷酸向电极表面上的移动。而且，过量的羧基-烷基膦酸酯单分子层还可能导致低聚核苷酸探子结合和靶杂交的静电障碍。
如本领域所熟知的，例如在电极不导电的一侧作上标记，可使试剂在本发明单分子层/ITO电极上的放置标准化。
实施例4。电极上单分子层的活化。将在其上具有根据实施例3的单分子层的ITO电极暴露在活化/偶合化合物1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)、和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)中，其摩尔比例为4∶1。EDC的浓度为20-400mM，NHS的浓度为5-100mM。现在优选EDC的浓度为400mM，NHS为100mM。将30μl EDC/NHS溶液用移液管转移到每个ITO电极/单分子层上，在室温下保温30分钟。用水洗涤三次，将未附着的EDC/NHS从ITO电极上冲洗掉，然后使电极在空气中干燥。
实施例5.DNA探子的附着。采用在3’-或5’-端上的烷基胺连接基将低聚核苷酸探子偶合到活化的单分子层上。烷基胺的长度应至少为3个碳，优选3-12个碳，现在优选的长度为6个碳。将在1MNaCl/0.25M NaHCO3中的浓度为20-100μM和pH9的低聚核苷酸探子(20μl)，用移液管转移到活化的单分子层上，在室温(约25℃)下保温30分钟。除去低聚核苷酸探子溶液，将电极浸入水中洗涤，然后用0.1M和pH7的磷酸钠缓冲溶液、1.0M NaCl、和水洗涤电极。低聚核苷酸探子在单分子层上的附着程度可通过向反应混合物中加入32P-标记的低聚核苷酸探子，并采用放射化学方法分析。
为了减少非特定靶的结合，采用乙醇胺阻塞未与低聚核苷酸探子反应的活化的羧基。电极在0.1M、pH7的乙醇胺中，在25℃下浸泡约20分钟。用水洗涤三次，从电极上冲洗掉乙醇胺，使电极在空气中干燥。
本领域的普通技术人员都会清楚，低聚核苷酸探子的浓度、pH、保温时间、温度、和阻塞剂都是可以改变的。
实施例6。电极在靶核酸中的暴露。使具有核酸顺序与一部分低聚核苷酸探子顺序互补的核酸靶与探子杂交。现在采用一种包含23个鸟嘌呤的互补的合成低聚核苷酸。将靶核酸(20μl，在0.8M NaCl和0.05M NaH2PO4中，pH7)用移液管转移到低聚核苷酸探子/单分子层上，在25℃下保温1小时。除去靶核酸溶液，用水洗涤电极，然后用0.1M、pH7.0的NaH2PO4、1.0M NaCl、和水洗涤。本领域的普通技术人员都清楚，杂交的条件是可以改变的。可采用放射化学方法，通过向反应混合物中加入32P-标记的靶核酸分析靶核酸与低聚核苷酸探子杂交的程度。
实施例7。电极的电化学。虽然如计时安培分析法、计时库仑分析法和阶跃伏安法等电化学探测方法也是有效的，但目前在电化学上探测电极的优选方法是循环伏安法。对每一种ITO电极的循环伏安法是如下进行的。适宜的扫描速度包括扫描速度为约50mV/s-5000V/s，优选的扫描速度为20V/s。在这种扫描速度下，有来自结合DNA的最大信号，和来自本底的最小信号。首先在正极方向上扫描电位，起始电位为0V，切换电位为1.3-1.8V，这取决于扫描速度。采用三电极配置：Ag/AgCl参比电极、Pt丝辅助电极、和根据本发明的改性ITO工作电极。改性ITO电极放置在电化学池中，在改性电极上放置200μl在50mM磷酸钠缓冲溶液(pH7.0)中的100μM的Ru(bpy)3 2+。缓冲液可包含NaCl(一般高达约1M，或按所研究的具体系统的需要)，在某些情况下，NaCl能增加信号的距离。将参比电极和Pt电极放置在与Ru(bpy)3 2+溶液接触的电化学池中。探测试样，并收集、储存、和分析数据。
实施例8。单分子层生成的评价。图1a和1b示出自组合时间对由低聚核苷酸探子量表示的单分子层生成的影响。图1a为自组合时间达2小时，而图1b为自组合时间达90小时。结合到单分子层上的低聚核苷酸探子量是单分子层生成的间接量度。对自组合时间达约10小时的情况，看上去自组合时间基本上未对单分子层结合低聚核苷酸探子的能力发生影响。在自组合20小时以后，单分子层结合低聚核苷酸探子的能力急剧下降，发现在保温时间3秒-10小时内，与单分子层结合的低聚核苷酸探子量保持不变。
单分子层的生成是以与膦酸酯溶液浓度的关系评价的，电极是暴露在该膦酸酯溶液中。如图2所示，这一评价是通过检测低聚核苷酸链上每皮摩尔鸟嘌呤在本底上的电流进行的。在所有浓度下，形成单分子层的自组合时间都采用2小时，并在20V/s和Ru(bpy)3 2+浓度为100μM的条件下，采用循环伏安法进行电化学测量。以偶合在单分子层上的每皮摩尔鸟嘌呤在本底上的峰间距μA测量电化学响应。12-碳羧基-烷基膦酸酯在自组合溶液中的浓度为0.1-20mM。膦酸酯溶液浓度的影响是微小的。
评价具有或没有低聚核苷酸的自组合单分子层的稳定性。在0天，单分子层自组合在ITO电极上，并将包含鸟嘌呤的低聚核苷酸附着到60％的电极上。然后将所有的电极放在冷库中。在1、2、3、6和7天，选取5个电极(2个只具有单分子层，3个具有单分子层加低聚核苷酸)，采用电化学方法分析，以测定所产生的信号。在20V/s和Ru(bpy)3 2+浓度为100μM的条件下，采用循环伏安法进行电化学测量。测定附着在电极上的低聚核苷酸链中，每皮摩尔鸟嘌呤在本底上产生的μA信号(电流)，以评价这些试样。在7天以后，电化学响应没有明显的变化，因此，认为在这些条件下，单分子层在7天内是稳定的(图3)。
实施例9。单分子层的循环伏安图。图4示出自组合单分子层电极的剂量响应，在该电极上，附着有不同量的包含鸟嘌呤的低聚核苷酸。偶合到每个电极的单分子层上的低聚核苷酸量为0.008-0.466皮摩尔低聚核苷酸链。低聚核苷酸是合成的，具有34个链节，每条链上具有23个鸟嘌呤。在20V/s和Ru(bpy)3 2+浓度为100μM的条件下，采用循环伏安法进行电化学测量。该图表明，人们可以区别附着不同量低聚核苷酸的单分子层。该信号(电流)与每个电极上的鸟嘌呤数成正比。
图5是图4的图解表示，其中是以本底上的μA信号对每个电极上低聚核苷酸链中鸟嘌呤的皮摩尔标绘的。制备具有不同低聚核苷酸量的单分子层，测定电化学响应(峰在本底上的间距μA)，并以与偶合在单分子层上的低聚核苷酸中鸟嘌呤量(以皮摩尔表示)的关系标绘。该曲线示出电化学响应与鸟嘌呤量之间的直接关系。
实施例10。通过羧基-烷基膦酸酯固定低聚核苷酸的另一种方法。形成附着有低聚核苷酸的自组合单分子层的另一种方法是在形成自组合单分子层之前，使羧基-烷基膦酸酯偶合到低聚核苷酸上。将在3’-或5’-端上具有烷基胺连接基的低聚核苷酸加入包含0.005-1mM羧基-烷基膦酸酯、0.2M1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)、和0.05M N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的二甲基亚砜溶液中。反应混合物的最终体积是100-200μl，低聚核苷酸的浓度为20μM。可在25℃下将混合物保温6-8小时。如果需要定量测定低聚核苷酸-膦酸酯在电极上的附着程度，可以使用经放射性标记的低聚核苷酸。将包含成对结合的羧基-烷基膦酸酯-低聚核苷酸的反应混合物(20μl)用移液管转移到ITO玻璃电极上，在25℃下保温2-4小时，以形成单分子层。除去未附着的材料，然后用水、0.1M pH7.0的NaH2PO4、1.0M NaCl、和水洗涤电极。
将羧基-烷基膦酸酯偶合到低聚核苷酸上的这种方法，一般会产生非均相的产物，该产物具有附着在低聚核苷酸上的一个或多个羧基-烷基膦酸酯基，主要附着位置是低聚核苷酸3’-或5’-端上的烷基胺，以及碱基上用作羧基-烷基膦酸酯第二附着位置的其它环外胺。有多少羧基-烷基膦酸酯基团在低聚核苷酸上存在会影响对ITO电极的附着以及靶核酸分子的杂交。
也可以使用由具有被阻塞的环外氨基的低聚核苷酸来制备低聚核苷酸-膦酸酯产物的另一些方法，使唯一一种羧基-烷基膦酸酯通过在5’-或3’-端上的烷基胺附着到每一个低聚核苷酸上。例如，可以采用在水-非水溶剂混合物中的碳化二亚胺将羧基-烷基膦酸酯偶合到低聚核苷酸上，这些低聚核苷酸是在合成后固定在玻璃珠上的，并仍保留着在环外胺上的保护基团。在羧基-烷基膦酸酯结合后，能很容易地洗掉试剂，以生产纯的产品。
优选首先通过把共轭物溶解在85-100％的二甲基亚砜中，将纯羧基-烷基膦酸酯-低聚核苷酸共轭物附着到ITO电极上。将游离的羧基-烷基膦酸酯加到溶液中，以获得浓度为约5μM-5mM的烷基膦酸酯溶液。用移液管将这种混合物(20μl)转移到ITO玻璃电极上，在25℃下保温2-4小时，使其生成单分子层。除去未附着的材料，然后用水、0.1M pH7.0的磷酸钠、1.0M NaCl、和水洗涤电极。
虽然参照具体的实施方案说明了本发明，但可以明显地看出，有许多变动、改进、和实施方案是可行的，因此认为，所有这些变动、改进、和实施方案都在本发明的内容和范围内。

Claims (120)

1.一种电极，其包括：
(a)在其上具有导电工作表面的基质；和
(b)在所述导电工作表面上的不导电的自组合单分子层，所述的单分子层包括最少具有至少一个膦酸酯基和至少一个R1基的膦酸酯分子，其中R1基与结合对的一个成员共价结合，过渡金属络合物能通过该单分子层从固定在单分子层上的反应剂自由地移动到导电的工作表面上，以将电子转移到导电的工作表面上。
2.权利要求1的电极，其中有机隔离基R2位于膦酸酯基和R1基之间。
3.权利要求2的电极，其中R2包括(CH2)11。
4.权利要求1的电极，其中膦酸酯分子包括羧基-烷基膦酸酯。
5.权利要求4的电极，其中羧基-烷基膦酸酯是11-羧基十一烷膦酸。
6.权利要求1的电极，其中导电的工作表面包括ITO表面。
7.权利要求1的电极，其中在生成自组合单分子层之前，使R1基偶合到结合对的成员上。
8.权利要求1的电极，其中结合对的成员包括低聚核苷酸探子。
9.权利要求1的电极，其中结合对的成员包括含蛋白质的物质。
10.权利要求9的电极，其中含蛋白质的物质包括蛋白质。
11.权利要求1的电极，其中R1基是采用偶合剂活化的。
12.权利要求11的电极，其中偶合剂包括碳化二亚胺。
13.权利要求1的电极，其中基质选自金属基质和非金属基质。
14.一种仪器，其包括：
(a)装液体试样的试样容器；
(b)电极，其包括在其上具有导电工作表面的基质；和在所述导电工作表面上不导电的自组合单分子层，所述的单分子层包括最少具有至少一个膦酸酯基和至少一个R1基的膦酸酯分子，其中R1基与结合对中的一个成员共价结合，过渡金属络合物能通过该单分子层，从被固定的反应剂自由地移动到导电的工作表面上，以将电子转移到导电的工作表面上；和
(c)与电极以电子连通的恒电位仪。
15.根据权利要求14的仪器，其中结合对的成员包括低聚核苷酸探子。
16.根据权利要求14的仪器，其中结合对的成员包括含蛋白质的物质。
17.一种在基质上的不导电的自组合单分子层，其包括最少具有至少一个膦酸酯基和至少一个R1基的膦酸酯分子，其中R1基与结合对的一个成员共价结合。
18.权利要求17的自组合单分子层，其中有机隔离基R2位于膦酸酯基和R1基之间。
19.权利要求18的自组合单分子层，其中R2包括(CH2)11。
20.权利要求17的自组合单分子层，其中膦酸酯分子包括羧基-烷基膦酸酯。
21.权利要求20的自组合单分子层，其中羧基-烷基膦酸酯是11-羧基十一烷磷酸。
22.权利要求17的自组合单分子层，其中基质具有包括ITO表面的导电工作表面。
23.权利要求17的自组合单分子层，其中在自组合单分子层组合之前，使R1基偶合到结合对的成员上。
24.权利要求17的自组合单分子层，其中结合对的成员包括低聚核苷酸探子。
25.权利要求17的自组合单分子层，其中结合对的成员包括含蛋白质的物质。
26.权利要求25的自组合单分子层，其中含蛋白质的物质包括蛋白质。
27.权利要求17的自组合单分子层，其中R1基在与结合对的成员共价结合之前，采用偶合剂活化。
28.权利要求27的自组合单分子层，其中偶合剂包括碳化二亚胺。
29.权利要求17的自组合单分子层，其中基质选自金属基质和非金属基质。
30.一种用于确定试样中含标记的靶存在的方法，其包括：
(a)使在具有导电工作表面的电极上不导电的自组合单分子层与推测含能在氧化-还原反应中被氧化的含标记靶的试样接触，使结合对的固定的成员和靶，如果存在，在单分子层上生成靶络合物，所述的单分子层包括一些膦酸酯分子，该膦酸酯分子最少具有至少一个膦酸酯基和至少一个与结合对的一个成员共价结合的R1基，过渡金属络合物能通过该单分子层，从固定在单分子层上的反应剂自由地移动到导电的工作表面上，以将电子转移到导电的工作表面上；
(b)使单分子层和靶络合物，如果存在，与能在氧化-还原反应中氧化含标记靶的过渡金属络合物接触；
(c)检测氧化-还原反应；和
(d)根据所检测的氧化-还原反应，确定靶的存在或不存在。
31.权利要求30的方法，其中过渡金属络合物是Ru(bpy)3 2+，被检测的氧化-还原反应是鸟嘌呤的氧化。
32.权利要求30的方法，其中有机隔离基R2位于膦酸酯基和R1基之间。
33.权利要求32的方法，其中R2包括(CH2)11。
34.权利要求30的方法，其中膦酸酯分子包括羧基-烷基膦酸酯。
35.权利要求34的方法，其中羧基-烷基膦酸酯是11-羧基十一烷膦酸。
36.权利要求30的方法，其中含标记的靶选自核酸、蛋白质、和碳水化合物。
37.权利要求30的方法，其中导电的工作表面包括ITO表面。
38.权利要求30的方法，其中含标记的靶是包含鸟嘌呤的核酸，被固定的结合对的成员是能与所述的靶杂交以生成杂交的靶络合物的低聚核苷酸探子。
39.权利要求38的方法，其还包括在使自组合单分子层与靶接触之前，将靶核酸放大，以产生放大的核酸溶液。
40.权利要求39的方法，其中放大是采用选自聚合酶链反应、链置换放大、连接酶链反应、和核酸顺序基放大的方法进行的。
41.权利要求30的方法，其中结合对的成员包括低聚核苷酸探子。
42.权利要求30的方法，其中结合对的成员包括含蛋白质的物质。
43.权利要求42的方法，其中含蛋白质的物质包括蛋白质。
44.权利要求30的方法，其中试样选自：合成的或天然的低聚核苷酸、手术试样、医疗诊断使用的试样、遗传化验使用的试样、环境试样、细胞培养物试样、食品试样、牙齿试样、和兽医试样。
45.权利要求30的方法，其中在步骤(a)之前，使R1基与结合对的一个成员共价结合，然后将获得的膦酸酯分子施加到电极上。
46.一种用于确定试样中含标记的靶存在的方法，其包括：
(a)使具有导电工作表面的电极与膦酸酯分子接触，膦酸酯分子最少具有至少一个膦酸酯基和至少一个R1基，其中R1基或与结合对的一个成员共价结合，或能与结合对的一个成员共价结合，以在所述的电极上形成不导电的自组合单分子层，过渡金属络合物能通过该单分子层，从被固定在单分子层上的反应剂自由地移动到导电的工作表面上，将电子转移到导电的工作表面上；
(b)使R1基与结合对的成员结合，如果已经不能如此结合，则采用偶合剂将R1基活化，使活化的R1基与能与靶结合的结合对的一个成员接触，以固定该结合对的成员；
(c)使在其上固定有结合对成员的自组合单分子层，与推测含能在氧化-还原反应中被氧化的含标记靶的试样接触，使被固定的该结合对的成员和靶在单分子层上生成靶络合物；
(d)使单分子层和靶络合物，如果存在，与能在氧化-还原反应中氧化含标记靶的过渡金属络合物接触；
(e)检测氧化-还原反应；和
(f)根据所检测的氧化-还原反应，确定靶的存在或不存在。
47.权利要求46的方法，其中过渡金属络合物是Ru(bpy)3 2+，被检测的氧化-还原反应是鸟嘌呤的氧化。
48.权利要求46的方法，其中有机隔离基R2位于膦酸酯基和R1基之间。
49.权利要求48的方法，其中R2包括(CH2)11。
50.权利要求46的方法，其中膦酸酯分子包括羧基-烷基膦酸酯。
51.权利要求50的方法，其中羧基-烷基膦酸酯是11-羧基十一烷膦酸。
52.权利要求46的方法，其中含标记的靶选自核酸、蛋白质、和碳水化合物。
53.权利要求46的方法，其中导电的工作表面包括ITO表面。
54.权利要求46的方法，其中含标记的靶是包含鸟嘌呤的核酸，被固定的结合对成员是能与所述的靶杂交以生成杂交的靶络合物的低聚核苷酸探子。
55.权利要求54的方法，其还包括在使自组合单分子层与靶接触之前，放大靶核酸，以产生放大的核酸溶液。
56.权利要求55的方法，其中采用选自聚合酶链反应、链置换放大、连接酶链反应、和核酸顺序基放大的方法进行放大。
57.权利要求46的方法，其中结合对的成员包括低聚核苷酸探子。
58.权利要求46的方法，其中结合对的成员包括含蛋白质的物质。
59.权利要求58的方法，其中含蛋白质的物质包括蛋白质。
60.权利要求46的方法，其中偶合剂包括碳化二亚胺。
61.权利要求46的方法，其中试样选自：合成的或天然的低聚核苷酸、手术试样、医疗诊断使用的试样、遗传化验使用的试样、环境试样、细胞培养物试样、食品试样、牙齿试样、和兽医试样。
62.一种在电极上制备自组合单分子层的方法，其包括：
(a)制备具有导电工作表面的基质；
(b)制备最少具有至少一种磷酸基和至少一种R1基的膦酸酯分子，其中R1基能与结合对的一个成员共价结合，其中所述的自组合单分子层是不导电的，过渡金属络合物能通过单分子层从固定在单分子层上的反应剂自由地移动到导电的工作表面上，以将电子转移到导电的工作表面上；和
(c)使基质与膦酸酯分子接触，生成自组合的单分子层。
63.权利要求62的方法，其中有机隔离基R2位于膦酸酯基和R1基之间。
64.权利要求63的方法，其中R2基包括(CH2)11。
65.权利要求62的方法，其中膦酸酯分子包括羧基-烷基膦酸酯。
66.权利要求65的方法，其中羧基-烷基膦酸酯是11-羧基十一烷膦酸。
67.权利要求62的方法，其中导电的工作表面包括ITO表面。
68.权利要求62的方法，其中在生成自组合单分子层之前，将R1基偶合到结合对的成员上。
69.权利要求62的方法，其中结合对的成员包括低聚核苷酸探子。
70.权利要求62的方法，其中结合对的成员包括含蛋白质的物质。
71.权利要求70的方法，其中含蛋白质的物质包括蛋白质。
72.权利要求62的方法，其还包括采用偶合剂活化R1基。
73.权利要求72的方法，其中偶合剂包括碳化二亚胺。
74.一种将结合对的一个成员固定在电极表面上的方法，其包括：
(a)制备具有导电工作表面的电极；
(b)在导电条件下使该表面暴露在所选的膦酸酯分子中，以在所述的表面上生成不导电的自组合单分子层，所述的膦酸酯分子最少具有至少一个膦酸酯基和至少一个R1基，其中R1基能与结合对的一个成员共价结合，过渡金属络合物能通过单分子层从固定在单分子层上的反应剂自由地移动到导电的工作表面上，以将电子转移到导电的工作表面上；
(c)采用偶合剂活化R1基；和
(d)使自组合单分子层与结合对的成员接触。
75.权利要求74的方法，其中有机隔离基R2位于膦酸酯基和R1基之间。
76.权利要求75的方法，其中R2包括(CH2)11。
77.权利要求74的方法，其中膦酸酯分子包括羧基-烷基膦酸酯。
78.权利要求77的方法，其中羧基-烷基膦酸酯是11-羧基十一烷膦酸。
79.权利要求74的方法，其中导电的工作表面包括ITO表面。
80.权利要求74的方法，其中在生成自组合单分子层之前，使R1基偶合到结合对的成员上。
81.权利要求74的方法，其中结合对的成员包括低聚核苷酸探子。
82.权利要求74的方法，其中结合对的成员包括含蛋白质的物质。
83.权利要求82的方法，其中含蛋白质的物质包括蛋白质。
84.权利要求74的方法，其中偶合剂包括碳化二亚胺。
85.一种用于确定试样中靶核酸存在的方法，其包括：
(a)在具有导电工作表面的电极上，制备不导电的自组合单分子层，所述的单分子层包括一些膦酸酯分子，膦酸酯分子最少具有至少一个膦酸酯基和至少一个已与寡核苷酸探子共价结合的R1基，过渡金属络合物能通过单分子层从固定在单分子层上的反应剂自由地移动到导电的工作表面上，以将电子转移到导电的工作表面上；
(b)使在其上固定有低聚核苷酸探子的自组合单分子层，与推测包含能在氧化-还原反应中被氧化的靶核酸的试样接触，使被固定的低聚核苷酸探子和靶核酸，如果存在，在单分子层上生成靶络合物；
(c)使单分子层和靶络合物，如果存在，与能在氧化-还原反应中氧化靶核酸的过渡金属络合物接触；
(d)检测氧化-还原反应；和
(e)根据所检测的氧化-还原反应，确定靶核酸的存在或不存在。
86.权利要求85的方法，其中过渡金属络合物是Ru(bpy)3 2+，并检测鸟嘌呤的氧化。
87.权利要求85的方法，其中有机隔离基R2位于膦酸酯基和R1基之间。
88.权利要求87的方法，其中R2包括(CH2)11。
89.权利要求85的方法，其中膦酸酯分子包括羧基-烷基膦酸酯。
90.权利要求89的方法，其中羧基-烷基膦酸酯是11-羧基十一烷膦酸。
91.权利要求85的方法，其中导电的工作表面包括ITO表面。
92.权利要求85的方法，其中在生成自组合单分子层之前，使R1基偶合到结合对的成员上。
93.权利要求85的方法，其还包括在使自组合单分子层与靶接触之前，放大靶核酸，产生放大的核酸溶液。
94.权利要求93的方法，其中采用选自聚合酶链反应、链置换放大、连接酶链反应、和核酸顺序基放大的方法进行放大。
95.权利要求85的方法，其中试样选自：合成的或天然的低聚核苷酸、手术试样、医疗诊断使用的试样、遗传化验使用的试样、环境试样、细胞培养物试样、食品试样、牙齿试样、和兽医试样。
96.一种用于确定试样中靶蛋白质存在的方法，其包括：
(a)在具有导电工作表面的电极上，制备不导电的自组合单分子层，所述的单分子层包括一些膦酸酯分子，膦酸酯分子最少具有至少一个膦酸酯基，和至少一个与含蛋白质的物质共价结合的R1基，过渡金属络合物能通过单分子层从固定在单分子层上的反应剂自由地移动到导电的工作表面上，以将电子转移到导电的工作表面上；
(b)使在其上固定有结合蛋白质物质的自组合单分子层与推测包含靶蛋白质的试样接触；
(c)使结合在单分子层上的靶蛋白质，如果存在，与已与一种能在氧化-还原反应中被氧化的标记结合的第二种含蛋白质的物质接触，使含蛋白质的物质和靶蛋白质，如果存在，在单分子层上生成靶络合物；
(d)使单分子层和靶络合物，如果存在，与能在氧化-还原反应中氧化标记的过渡金属络合物接触；
(e)检测氧化-还原反应；和
(f)根据所检测的氧化-还原反应，确定靶蛋白质的存在或不存在。
97.权利要求96的方法，其中标签包括低聚核苷酸。
98.权利要求96的方法，其中含蛋白质的物质是蛋白质。
99.权利要求96的方法，其中有机隔离基R2位于膦酸酯基和R1基之间。
100.权利要求99的方法，其中R2包括(CH2)11。
101.权利要求96的方法，其中膦酸酯分子包括羧基-烷基膦酸酯。
102.权利要求101的方法，其中羧基-烷基膦酸酯是11-羧基十一烷膦酸。
103.权利要求96的方法，其中导电的工作表面包括ITO表面。
104.权利要求96的方法，其中试样选自：合成的或天然的低聚核苷酸、手术试样、医疗诊断使用的试样、遗传化验使用的试样、环境试样、细胞培养物试样、食品试样、牙齿试样、和兽医试样。
105.一种用于确定试样中靶蛋白质存在的方法，其包括：
(a)在具有导电工作表面的电极上，制备不导电的自组合单分子层，所述的单分子层包括一些膦酸酯分子，膦酸酯分子最少具有至少一个膦酸酯基和至少一个与含蛋白质的物质共价结合的R1基，过渡金属络合物能通过单分子层从固定在单分子层上的反应剂自由地移动到导电的工作表面上，以将电子转移到导电的工作表面上；
(b)使在其上固定有含蛋白质物质的自组合单分子层与已与一种能在氧化-还原反应中被氧化的标记结合的推测包含靶蛋白质的试样接触，使被固定的含蛋白质的物质和靶蛋白质，如果存在，在单分子层上生成靶络合物；
(c)使单分子层和靶络合物，如果存在，与能在氧化-还原反应中氧化标记的过渡金属络合物接触；
(d)检测氧化-还原反应；和
(e)根据所检测的氧化-还原反应，确定靶蛋白质的存在或不存在。
106.权利要求105的方法，其中标记包括低聚核苷酸。
107.权利要求105的方法，其中含蛋白质的物质包括蛋白质。
108.权利要求105的方法，其中有机隔离基R2位于膦酸酯基和R1基之间。
109.权利要求108的方法，其中R2包括(CH2)11。
110.权利要求105的方法，其中膦酸酯分子包括羧基-烷基膦酸酯。
111.权利要求110的方法，其中羧基-烷基膦酸酯是11-羧基十一烷膦酸。
112.权利要求105的方法，其中导电的工作表面包括ITO表面。
113.一种膦酸酯分子，它最少具有至少一个膦酸酯基和至少一个与结合对的一个成员共价结合的R1基。
114.权利要求113的膦酸酯分子，其中有机隔离基R2位于膦酸酯基和R1基之间。
115.权利要求114的膦酸酯分子，其中R2包括(CH2)11。
116.权利要求113的膦酸酯分子，其中膦酸酯分子包括羧基-烷基膦酸酯。
117.权利要求116的膦酸酯分子，其中羧基-烷基膦酸酯是11-羧基十一烷膦酸。
118.权利要求113的膦酸酯分子，其中结合对的成员包括低聚核苷酸探子。
119.权利要求113的膦酸酯分子，其中结合对的成员包括含蛋白质的物质。
120.权利要求119的膦酸酯分子，其中含蛋白质的物质包括蛋白质。
CN00806497A 1999-04-22 2000-02-04 用于检测含标记的靶的单分子层和电极以及它们的应用方法 Pending CN1347460A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/296,929 US6127127A (en) 1995-06-27 1999-04-22 Monolayer and electrode for detecting a label-bearing target and method of use thereof
US09/296929 1999-04-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1347460A true CN1347460A (zh) 2002-05-01

Family

ID=23144136

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN00806497A Pending CN1347460A (zh) 1999-04-22 2000-02-04 用于检测含标记的靶的单分子层和电极以及它们的应用方法

Country Status (13)

Country Link
US (1) US6127127A (zh)
EP (1) EP1185692B1 (zh)
JP (1) JP2002542794A (zh)
KR (1) KR20020008157A (zh)
CN (1) CN1347460A (zh)
AT (1) ATE312200T1 (zh)
AU (1) AU781085B2 (zh)
CA (1) CA2367594A1 (zh)
DE (1) DE60024618D1 (zh)
HK (1) HK1045178B (zh)
NO (1) NO20014882L (zh)
NZ (1) NZ514682A (zh)
WO (1) WO2000065099A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107884370A (zh) * 2016-09-30 2018-04-06 斯帕克生物制药有限公司 鉴定药物分子的靶标蛋白质的方法

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6207369B1 (en) * 1995-03-10 2001-03-27 Meso Scale Technologies, Llc Multi-array, multi-specific electrochemiluminescence testing
US6346387B1 (en) 1995-06-27 2002-02-12 Xanthon, Inc. Detection of binding reactions using labels detected by mediated catalytic electrochemistry
US7815963B2 (en) * 1996-10-17 2010-10-19 The Trustees Of Princeton University Enhanced bonding layers on titanium materials
US6013459A (en) 1997-06-12 2000-01-11 Clinical Micro Sensors, Inc. Detection of analytes using reorganization energy
US6833267B1 (en) * 1998-12-30 2004-12-21 Clinical Micro Sensors, Inc. Tissue collection devices containing biosensors
US20020177135A1 (en) * 1999-07-27 2002-11-28 Doung Hau H. Devices and methods for biochip multiplexing
US7348183B2 (en) * 2000-10-16 2008-03-25 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Self-contained microelectrochemical bioassay platforms and methods
AU2002241803A1 (en) * 2000-10-20 2002-06-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Transient electrical signal based methods and devices for characterizing molecular interaction and/or motion in a sample
US6632536B2 (en) * 2000-12-28 2003-10-14 International Business Machines Corporation Self-assembled monolayer etch barrier for indium-tin-oxide useful in manufacturing thin film transistor-liquid crystal displays
DE10126798A1 (de) * 2001-06-01 2002-12-19 Nanotype Gmbh Verfahren zur Bestimmung einer Probe
US20020182606A1 (en) * 2001-06-04 2002-12-05 Xanthon, Inc. Detection of single nucleotide polymorphisms
WO2003042396A2 (en) * 2001-06-11 2003-05-22 Genorx, Inc. Electronic detection of biological molecules using thin layers
US6824974B2 (en) * 2001-06-11 2004-11-30 Genorx, Inc. Electronic detection of biological molecules using thin layers
CA2764307C (en) 2001-06-29 2015-03-03 Meso Scale Technologies, Llc. Assay plates, reader systems and methods for luminescence test measurements
AU2002365115A1 (en) * 2001-07-20 2003-09-02 North Carolina State University Light addressable electrochemical detection of duplex structures
JP4262426B2 (ja) * 2001-09-03 2009-05-13 富士フイルム株式会社 核酸断片固定電極及びその利用
US20050014151A1 (en) * 2001-09-12 2005-01-20 Marcus Textor Device with chemical surface patterns
WO2003089895A2 (en) * 2001-09-24 2003-10-30 University Of North Carolina At Chapel Hill Methods for the electrochemical detection of multiple target compounds
AU2004201425B2 (en) * 2001-09-24 2007-06-28 University Of North Carolina At Chapel Hill Methods for the electrochemical detection of multiple target compounds
US7202028B2 (en) * 2001-09-24 2007-04-10 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods for the electrochemical detection of multiple target compounds
US20040014078A1 (en) * 2002-02-06 2004-01-22 James Xia Compositions and methods for rolling circle amplification
GB0205455D0 (en) 2002-03-07 2002-04-24 Molecular Sensing Plc Nucleic acid probes, their synthesis and use
GB0211449D0 (en) * 2002-05-17 2002-06-26 Oxford Biosensors Ltd Analyte measurement
EP1570091B1 (fr) * 2002-12-11 2012-02-08 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Procede de detection electronique d'au moins une interaction specifique entre des molecules sondes et des biomolecules cibles.
US20040180369A1 (en) * 2003-01-16 2004-09-16 North Carolina State University Photothermal detection of nucleic acid hybridization
US7138121B2 (en) * 2003-01-23 2006-11-21 Spangler Brenda D Biosensors utilizing dendrimer-immobilized ligands and there use thereof
KR100547015B1 (ko) * 2003-05-23 2006-01-26 주식회사 올메디쿠스 일정한 크기 이상의 분석물질을 정량 분석하기 위한바이오센서 및 그 제조방법
WO2005042785A1 (en) * 2003-10-30 2005-05-12 North Carolina State University Electrochemical detection of nucleic acid hybridization
US20050191651A1 (en) * 2003-10-30 2005-09-01 North Carolina State University Temperature-jump enhanced electrochemical detection of nucleic acid hybridization
US7981362B2 (en) * 2003-11-04 2011-07-19 Meso Scale Technologies, Llc Modular assay plates, reader systems and methods for test measurements
US8048377B1 (en) 2004-03-08 2011-11-01 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Immobilizing chemical or biological sensing molecules on semi-conducting nanowires
US7462452B2 (en) 2004-04-30 2008-12-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Field-switch sequencing
US20060094024A1 (en) * 2004-11-01 2006-05-04 Pirrung Michael C Electrochemical arrays
WO2006089268A2 (en) * 2005-02-18 2006-08-24 The University Of North Carolina At Chapel Hill Gene and cognate protein profiles and methods to determine connective tissue markers in normal and pathologic conditions
US20070235346A1 (en) * 2006-04-11 2007-10-11 Popovich Natasha D System and methods for providing corrected analyte concentration measurements
US7909983B2 (en) * 2006-05-04 2011-03-22 Nipro Diagnostics, Inc. System and methods for automatically recognizing a control solution
CN101506380A (zh) * 2006-08-11 2009-08-12 香港科技大学 用电导或电化学活跃标签实时定量分析与监察核酸扩增的方法与系统
US20080131709A1 (en) * 2006-09-28 2008-06-05 Aculon Inc. Composite structure with organophosphonate adherent layer and method of preparing
US9688718B2 (en) 2008-01-11 2017-06-27 Lawrence Livermore National Security, Llc Nanolipoprotein particles comprising hydrogenases and related products, methods and systems
WO2009100201A2 (en) * 2008-02-07 2009-08-13 Lawrence Livermore National Security, Llc Functionalized platform for arrays configured for optical detection of targets and related arrays, methods and systems
US9303273B2 (en) 2008-05-09 2016-04-05 Lawrence Livermore National Security, Llc Nanolipoprotein particles comprising a natural rubber biosynthetic enzyme complex and related products, methods and systems
US10151037B2 (en) 2009-01-12 2018-12-11 Lawrence Livermore National Security, Llc Electrochemical flow-cell for hydrogen production and nicotinamide dependent target reduction, and related methods and systems
US8906610B2 (en) 2010-02-08 2014-12-09 The Regents Of The University Of California Using phylogenetic probes for quantification of stable isotope labeling and microbial community analysis
EP2661485A4 (en) 2011-01-06 2018-11-21 Meso Scale Technologies, LLC Assay cartridges and methods of using the same
US9644038B2 (en) 2011-12-21 2017-05-09 The Regents Of The University Of California Apolipoprotein nanodiscs with telodendrimer
US11279749B2 (en) 2015-09-11 2022-03-22 Lawrence Livermore National Security, Llc Synthetic apolipoproteins, and related compositions methods and systems for nanolipoprotein particles formation
US11207422B2 (en) 2017-05-02 2021-12-28 Lawrence Livermore National Security, Llc MOMP telonanoparticles, and related compositions, methods and systems
WO2019075261A1 (en) * 2017-10-11 2019-04-18 Microvention, Inc. PHOSPHONATES AND THEIR USES

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3278334D1 (en) * 1981-10-23 1988-05-19 Genetics Int Inc Sensor for components of a liquid mixture
DE3479522D1 (en) * 1983-12-16 1989-09-28 Medisense Inc Assay for nucleic acids
US4883579A (en) * 1984-04-27 1989-11-28 Molecular Devices Corporation Photoresponsive redox detection and discrimination
US4704353A (en) * 1984-04-27 1987-11-03 Molecular Devices Corporation Photoresponsive redox detection and discrimination
GB8417301D0 (en) * 1984-07-06 1984-08-08 Serono Diagnostics Ltd Assay
US5112974A (en) * 1985-01-18 1992-05-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Mixed ligand complexes and uses thereof as binding agents to DNA
US5157032A (en) * 1985-01-18 1992-10-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Mixed ligand complexes and uses thereof as binding agents and probes to DNA
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4965188A (en) * 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4800159A (en) * 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
GB8606719D0 (en) * 1986-03-19 1986-04-23 Lister Preventive Med Genetic probes
US5066372A (en) * 1986-05-02 1991-11-19 Ciba Corning Diagnostics Corp. Unitary multiple electrode sensor
US4908307A (en) * 1986-12-19 1990-03-13 Karin D. Rodland Hybridization method and probe for detecting nucleic acid sequences
US4963815A (en) * 1987-07-10 1990-10-16 Molecular Devices Corporation Photoresponsive electrode for determination of redox potential
US4995402A (en) * 1988-10-12 1991-02-26 Thorne, Smith, Astill Technologies, Inc. Medical droplet whole blood and like monitoring
US5143854A (en) * 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5156810A (en) * 1989-06-15 1992-10-20 Biocircuits Corporation Biosensors employing electrical, optical and mechanical signals
US5194372A (en) * 1989-07-10 1993-03-16 Hitachi, Ltd. Method and apparatus for detecting disorders in genomic substances
JPH0376600A (ja) * 1989-08-21 1991-04-02 Hitachi Ltd 遺伝子変異検出法
CA2033692A1 (en) * 1990-01-25 1991-07-26 Wilhelm Bannwarth Energy transfer systems
WO1991015768A1 (en) * 1990-04-06 1991-10-17 Syngene, Inc. Process and composition for performing dna assays
US5667976A (en) * 1990-05-11 1997-09-16 Becton Dickinson And Company Solid supports for nucleic acid hybridization assays
EP0478319B1 (en) * 1990-09-28 1997-04-02 Kabushiki Kaisha Toshiba Gene detection method
US5776672A (en) * 1990-09-28 1998-07-07 Kabushiki Kaisha Toshiba Gene detection method
JP3076600B2 (ja) 1990-11-20 2000-08-14 株式会社日本マイクロニクス 表示パネル用プローバ
US5272056A (en) * 1991-01-03 1993-12-21 The Research Foundation Of State University Of New York Modification of DNA and oligonucleotides using metal complexes of polyaza ligands
US5439829A (en) * 1991-01-30 1995-08-08 Eli Lilly And Company Immobilization of biologically active molecules by changing the Oxidation state of a chelated transition metal ion
FR2673289B1 (fr) * 1991-02-21 1994-06-17 Asulab Sa Capteur de mesure de la quantite d'un composant en solution.
US5171853A (en) * 1991-08-05 1992-12-15 North Carolina State University Process of cleaving nucleic acids with oxoruthenium(IV) complexes
US5632957A (en) * 1993-11-01 1997-05-27 Nanogen Molecular biological diagnostic systems including electrodes
JP3509859B2 (ja) * 1991-11-07 2004-03-22 ナノトロニクス，インコーポレイテッド 供与体−供与体エネルギー転移系を創製するための発色団および蛍光団でコンジュゲート化されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション
US5605662A (en) * 1993-11-01 1997-02-25 Nanogen, Inc. Active programmable electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics
GB9206671D0 (en) * 1992-03-27 1992-05-13 Cranfield Biotech Ltd Electrochemical detection of dna hybridisation
EP0587408A1 (en) * 1992-09-07 1994-03-16 Terumo Kabushiki Kaisha Method for determination of DNA and sensor therefor
US5312527A (en) * 1992-10-06 1994-05-17 Concordia University Voltammetric sequence-selective sensor for target polynucleotide sequences
FR2703359B1 (fr) * 1993-03-31 1995-06-23 Cis Bio Int Copolymère nucléotide(s)/polymère conducteur électronique ; son procédé de préparation et son utilisation .
EP0705271B1 (en) * 1993-06-25 2002-11-13 Affymetrix, Inc. (a Delaware Corporation) Hybridization and sequencing of nucleic acids
US5494562A (en) * 1994-06-27 1996-02-27 Ciba Corning Diagnostics Corp. Electrochemical sensors
US5688642A (en) * 1994-12-01 1997-11-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Selective attachment of nucleic acid molecules to patterned self-assembled surfaces
IT1275482B (it) * 1995-07-05 1997-08-07 Cooperativa Centro Ricerche Po Biosensori elettrochimici basati su trasduttori compositi
WO1997044651A1 (en) * 1996-05-22 1997-11-27 Australian Membrane And Biotechnology Research Institute Nucleic acid sensor
EP0939762A2 (en) * 1996-11-05 1999-09-08 Clinical Micro Sensors Electrodes linked via conductive oligomers to nucleic acids
US6228326B1 (en) * 1996-11-29 2001-05-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Arrays of independently-addressable supported fluid bilayer membranes

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107884370A (zh) * 2016-09-30 2018-04-06 斯帕克生物制药有限公司 鉴定药物分子的靶标蛋白质的方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1185692A1 (en) 2002-03-13
CA2367594A1 (en) 2000-11-02
HK1045178A1 (en) 2002-11-15
AU3483000A (en) 2000-11-10
NO20014882D0 (no) 2001-10-08
KR20020008157A (ko) 2002-01-29
EP1185692B1 (en) 2005-12-07
NZ514682A (en) 2003-07-25
HK1045178B (zh) 2006-08-11
US6127127A (en) 2000-10-03
ATE312200T1 (de) 2005-12-15
NO20014882L (no) 2001-12-27
JP2002542794A (ja) 2002-12-17
WO2000065099A1 (en) 2000-11-02
DE60024618D1 (de) 2006-01-12
AU781085B2 (en) 2005-05-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1347460A (zh) 用于检测含标记的靶的单分子层和电极以及它们的应用方法
US6387625B1 (en) Monolayer and electrode for detecting a label-bearing target and method of use thereof
US5968745A (en) Polymer-electrodes for detecting nucleic acid hybridization and method of use thereof
Lucarelli et al. Carbon and gold electrodes as electrochemical transducers for DNA hybridisation sensors
Singh et al. Application of peptide nucleic acid towards development of nanobiosensor arrays
Fojta et al. Two‐surface strategy in electrochemical DNA hybridization assays: detection of osmium‐labeled target DNA at carbon electrodes
EP0871773B1 (en) Electrochemical detection of nucleic acid hybridization
US7049068B2 (en) Microelectronic device for electrochemical detection of nucleic acid hybridization
US6180346B1 (en) Electropolymerizable film, and method of making and use thereof
JP2003514227A (ja) 被検体検出のための結合促進法
US6132971A (en) Microelectronic device
Ju et al. Electrochemical biosensors for DNA analysis
Spehar-Deleze et al. Electrochemiluminescent hybridization chip with electric field aided mismatch discrimination
Jin Label-free monitoring of site-specific DNA cleavage by EcoRI endonuclease using cyclic voltammetry and electrochemical impedance
JP3939256B2 (ja) ターゲット認識素子及びターゲット認識素子を利用したバイオセンサ
Wang Electrochemical nucleic acid biosensors
CN216786121U (zh) 自动化核酸滚环扩增和酶标催化底物双重放大信号的dna测序微流控生物芯片
JP3902616B2 (ja) 核酸ハイブリッド形成の電気化学的検出
US20040096859A1 (en) Method for detecting and/or quantifying an analyte
WO2008048216A2 (en) Electrocatalytic detection of carbon nanotubes
AU753350B2 (en) Microelectronic device
MXPA01010772A (en) Monolayer and electrode for detecting a label-bearing target and method of use thereof
JP2005520175A (ja) 多重標的化合物の電気化学的検出方法
MXPA01009221A (en) Electropolymerizable film, and method of making and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication