CN1309717A

CN1309717A - 无细胞嵌合体制备技术和异源双螺旋突变载体的真核应用

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Publication number: CN1309717A
Application number: CN99808545A
Authority: CN
Inventors: E·B·克米克; H·B·加姆佩尔; A·D·科勒－斯特劳斯
Original assignee: KIMEAGEN Inc
Current assignee: KIMEAGEN Inc; Kimeragen Inc
Priority date: 1998-05-12
Filing date: 1999-05-12
Publication date: 2001-08-22
Also published as: HK1039962A1; EP1078097A1; JP2002514434A; US6573046B1; AU740702B2; WO1999058702A1; EP1078097A4; KR20010071227A; AU3901499A; CA2328477A1; US6010907A

Abstract

本发明是以重组诱发性寡核苷酸在含有胞质提取物和质粒上的待测双螺旋DNA的无细胞系统中的反应为基础。在转化的MutS、RecA缺陷型细菌中,所述反应特异性地将突变kan^r基因转变恢复成抗性表型,从而能够迅速并定量地比较重组诱发性寡核碱基。利用该系统,一种被称为异源双螺旋突变载体的双螺旋突变载体类型比此前检测的突变载体类型更有活性。此外,通过核酸酶抗性寡核苷酸例如四－2’－O－甲基－尿苷代替四胸苷连接物连接双螺旋突变载体的两条链并除去含DNA的插入片段可以提高活性。权利要求涉及含上述改进的双螺旋突变载体。在另一实施方案中,权利要求涉及含重组诱发性寡核碱基、无细胞酶混合物和含靶序列的双螺旋DNA的反应混合物。在另一实施方案中,本发明涉及利用这种混合物在检测重组诱发性寡核碱基的改进以及检测所述化合物对无细胞酶混合物活性的影响和在靶DNA序列中产生特异性改变方面的应用。

Description

无细胞嵌合体制备技术和异源双螺旋突变载体的真核应用

1．发明领域

嵌合体制备技术(chimeraplasty)涉及通过将双螺旋寡核苷酸导入靶细胞来在DNA的特定位点导入定向改变，这种方法通过细胞同源重组和错误修复系统进行加工，使靶DNA序列在有差别的位置转变为寡核苷酸的序列。本发明涉及在无细胞系统中实施的嵌合体制备技术方法。

2．发明背景

2.1嵌合体制备技术

在E.B.Kmiec(简称“Kmiec”)的美国专利5565350(1996年10月15日公告)和5731181(1998年3月24日公告)中公开了真核细胞中的嵌合体制备技术和所用的双螺旋重组诱发性寡核苷酸。由Kmiec公开的重组诱发性寡核苷酸含有彼此杂交的核糖型核苷酸如2’-O-甲基-核糖核苷酸和脱氧核糖型核苷酸，它们被称为嵌合突变载体(CMV)。在Yoon,K等1996年《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.)93:2071中报道了经设计用于修复编码肝/骨/肾型碱性磷酸酶的基因中的突变的CMV。碱性磷酸酶通过质粒被瞬时导入CHO细胞。6小时后，导入CMV。在导入CMV24小时后回收质粒并进行分析。结果表明约30％至38％的碱性磷酸酶基因被CMV修复。

在Cole-Strauss,A等1996年《科学》(Science)273:1386中描述了经设计用于矫正引起镰刀细胞病的人β珠蛋白基因中的突变的CMV以及其成功的应用。在Kren等1998年，《天然药物》(NatureMedicine)4:285-290中公开了经设计用于在大鼠肝细胞的大鼠血凝集因子Ⅸ基因中产生突变的CMV。在Kren等1997年7月的《肝病学》(Hepatology)25:1462中给出了一个CMV例子，该CMV的第一条链含有一个与第二条链的非互补碱基配对的碱基。

1996年5月1日由E.B.Kmiec,A Cole-Strauss和K.Yoon申请的、以WO97/41141于1996年11月6日公开的美国专利申请系列08/640517以及1997年8月5日申请的申请系列08/906265公开了用于治疗造血细胞的遗传病如镰刀细胞病、地中海贫血和家族性脾性贫血的方法和CMV。

在Kren等1997年7月的《肝病学》(Hepatology)25:1462中给出了一个CMV的应用实例，该CMV的第一条链含有一个与第二条链的非互补碱基配对的碱基。在Kren的CMV中，含有所需的、不同的序列的链是含有2’-O-甲基核糖核苷酸的链，该链与具有3’末端和5’末端的链配对。美国专利5565350描述了含有2’-O-甲基化RNA的单个片段的CMV，该片段位于具有5’末端核苷酸的链上。

申请人知道包含了有关嵌合突变载体的教导的下列在前申请：Steer等1997年4月30申请的60/045288；1997年8月5日申请的60/054837；1997年11月10申请的60/064996；和由Steer&Roy-Chowdhury等于1998年2月12日申请的60/074497，题目为“通过改变APO B和APO E基因的预防和治疗方法”。

2.2无细胞重组

已公开了利用无细胞提取物进行同源重组的各种报道。

Hotta,Y等1985年《染色体》(Chromosoma)93:140-151报道了用酵母、小鼠精母细胞和Lilium的抽提物影响两个突变pBR322质粒间的同源重组。其中一个质粒是超卷曲的，第二个质粒可以是线性的或者超卷曲的。最大重组率不到1％。在Kucherlapati,R.S.等1985年《分子和细胞生物学》(Molecular and Cellular Biology)5:714-720中报道了用突变体缺陷型pSV2neo和EJ细胞提取物进行的类似的试验。最大重组率为约0.2％。Kucherlapati报道绝对需要一个线性化的突变质粒。相反在Hotta的报道中，尽管环状和线性质粒间的重组率更高，但还报道了两个环状质粒间的重组。

Jessbrger,R.,&Berg,P.,1991年《分子和细胞生物学》(Mol.&Cell.Biol.)11:445的报道涉及通过核提取物催化的质粒间的重组。它在两个方面与上述两种情况不同。报道的重组率为约20％，与不到0.5％的重组率形成对比。另外，Jessberger观察到环状质粒间的重组率与环状与线性质粒间的重组率相同。

Lopez,B.S等1992年《核酸研究》(Nucleic AcidsResearch)20:501-506报道了用人核提取物进行的相关试验。Lpoez报道了在无细胞系统中，一个线性质粒与在随后的选择条件下不能存活的不相关的超卷曲质粒间的重组。所述线性和超卷曲质粒分别含有lacZ基因；在线性质粒中的该基因是一个突变体。在距突变的不同位置的lacZ基因中切割线性质粒。因此，突变与切割位点间的同源重组导致所述质粒的环化，然后该质粒变为可存活的并获得了lacZ功能。Lopez报道，当切割与突变位点间相距15个碱基对时，检测不到同源重组。当距离为27个碱基对时，可观察到低水平的同源重组。当距离大于165个碱基对时，同源重组率没有进一步的提高。Lopez等1987年《核酸研究》(Nucleic Acids Research)。

2.3RAD51和RAD52在重组中的活性

同源重组是两个染色体的基因进行交换的过程。两个遗传座位间的同源重组率与其遗传连锁成反比，紧密连锁的基因很少重组。除其遗传功能外，同源重组可以使体细胞通过双链断裂修复DNA损伤。

通常认为同源重组中的第一步是联会形成。联会是一种其中一个链与另外两个链杂交的DNA分子。联会形成需要酶活性和从ATP水解中输入的能量。用于检测无细胞系统中被认为是联会形成所需的酶活性的人工试验是“链转移”。在一个典型的链转移试验中，将环状单链DNA与一个线性双螺旋混合以产生“带切口的”或松弛的环状双螺旋和一个线性单链。已将来自酵母、小鼠和人的Rad51基因进行了克隆并将其用于催化链转移。Rad51被认为参与了联会的形成。Baumann,P.等，1996年，《细胞》(Cell)87:757-766；Gupta,R.C.,1997年《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.)94:463-468。Rad52蛋白质和复制蛋A的存在会进一步提高链转移活性。Baumann,P.,&West,S.C.,1997年，《EMBO J.》16:5198-5206；New,J.H.等1998年，《自然》(Nature)391:407-410；Benson,F.E.等，1998年，《自然》(Nature)391:401-404。尽管RAD51蛋白质不象RecA能与双螺旋DNA结合，引用自Baumann,P.,&West的文章；Benson,F.E.等《EMBO J.》13,:5764-5771，但在存在RAD52时，其结合直接针对单链DNA。

在酵母中，由于不能修复双链断裂，Rad51或Rad52缺陷型个体是辐射敏感性的。在小鼠中，Rad51敲除将导致胚胎致死。Tsuzuki,T.,等《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.)93:6236-6240；Lin,S.D.,&Hasty,P.A.,《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)16,7133。

2.4无细胞错配修复

没有“错误更正”机制的存在，DNA复制本身(热动力学)的保真度会导致不能接受的高突变率。错配修复就是一种这样的机制。在错配修复中，含有与非互补碱基配对之碱基的双螺旋DNA受到加工，从而使其中一条链被更正。该过程涉及其中一条链的切割及其再合成。在Muster-Nassal & Kolodner,1986年，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.)83:7618-7622(酵母)；Glazer,P.M.等，1987年，《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)7:218-224(HeLa细胞)；Holmes等1991年，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.)87:5837-5841(HeLa细胞和果蝇)中可以找到有关无细胞真核系统中错配修复的报道。HeLa和果蝇无细胞系统的完整活性需要错配双螺旋中的一条链是带切口的。相反，据报道非洲蟾蜍卵提取物的修复不需要错配的双螺旋是带切口的。Varlet,I.等，1990年，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.)87:7883-7887。但是，在Varlet报告中，错配以随机的方式被修复，即两条链作为模板的机率是相同的。

以与大肠杆菌错配修复基因的同源性为基础，已克隆了酵母和人中错配修复所需的许多基因。Kolodner,R.,1996年，《基因和发育》(Genes & Development)10:1433-1442。带有缺陷型错配修复基因的细胞表现出遗传不稳定性，后者被称为复制错误(RER)，在小卫星DNA中特别明显，还表现出恶性转化。RER细胞提取物没有错配修复活性。Umar,A.等《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)269:14367-14370。

3．附图简述

图1．双发夹型重组诱发性寡聚体的构象实例。其特征是：a，第一条链；b，第二条链；c，第二条链的第一链区；1，最5’核碱基(nucleobase)；2,3’末端核碱基；3,5’末端核碱基；4，最3’核碱基；5，第一末端核碱基；6，第二末端核碱基。

图2．带有突出端的单发夹型重组诱发性核碱基的构象实例。特征如上，并增加特征d，突出端。请注意，相同的核碱基是第二条链的最5’核碱基和5’末端核碱基。

4．发明概述

对于治疗人类疾病和开发有用的遗传工程植物和动物株来说，嵌合体制备技术是一种日益重要的方法。利用可给出快速和定量的结果的细菌检测系统已大大促进了改进的重组诱发性寡核苷酸的开发，见R.Kumar等的题目为“非嵌合突变载体(Non-Chimeric MutationalVectors)”的普通许可的美国专利申请和同时由Kumar等(下文统称为“Kumar”)申请的“异源双螺旋突变载体和其在细菌中的应用(Heteroduplex Mutational Vectors and Use Thereof inBacteria)”临时申请(全文引入本文作为参考)中的介绍，Kumar的技术没有说明在细菌系统中的最佳重组诱发性寡核苷酸是否在真核生物中也是最佳的。现有技术中的体内和细胞培养嵌合体制备技术不是为快速定量分析设计的，并且不能使用与用于细菌系统中相同的重组诱发性寡核碱基和DNA靶。

因此，本发明的一个目的是一种检测方法，该检测方法可利用被设计用于细菌系统的DNA靶和重组诱发性寡核碱基来快速评估不同类型重组诱发性寡核苷酸与不同(生物)门的重组修复酶之间的相容性，例如细菌、植物、昆虫和哺乳动物的重组和错配修复酶有不同的底物偏好吗？

本发明的另一目的是可以快速确定组织或细胞系是否是嵌合体制备技术的靶即它是否含有必需的酶的检测方法。另一目的是用于确定什么试剂或处理可改变细胞系或组织中的嵌合体产生活性水平的检测方法。本发明的另一目的是可确定一种化合物是否是重组和修复途径的激动剂或拮抗剂的检测方法。本发明的另一目的是在无细胞系统中对DNA序列进行特定遗传改变的实用方法，该方法是与聚合酶链反应PCR为基础的方法不同的一种替换方法。

由于意想不到地发现嵌合体制备技术可在无细胞系统中完成，本发明达到了这些目的。无细胞系统的组分是含链转移活性并可选择含有错配修复活性的酶混合物、靶DNA序列和重组诱发性寡核碱基。可以通过获得一种细胞提取物或重组产生的纯化酶的混合物来制备所述酶混合物。靶DNA序列优选是可用于转化表达宿主例如细菌的质粒。在优选的实施方案中，所述质粒是超蜷曲的。重组诱发性寡核碱基是可用于在细胞中导入位点特异性、预定的遗传改变的任何寡核苷酸或寡核苷酸衍生物。在本文中，由200个以上脱氧核糖核苷酸组成并且无核苷酸衍生物的DNA双螺旋不是重组诱发性寡核碱基。通常，重组诱发性寡核碱基的特征是双螺旋核苷酸，包括核苷酸衍生物或非核苷酸性链间连接物，以及有20-120个核碱基或者等价地有10-60个Watson-Crich核碱基对。在优选的实施方案中，重组诱发性寡核碱基基本上是双螺旋，并含有单3’和5’末端；因此，所述双螺旋的链通过寡核碱基或非寡核碱基连接物共价相连。本发明的另一实施方案是基于发现Kumar的嵌合突变载体(NCMV)是真核、特别是哺乳动物细胞链转移和修复酶的有效底物。本发明的另一优选实施方案是基于发现当与真核特别是哺乳动物链转移和修复酶一起使用时，Kumar的两类重组诱发性寡核碱基、异源双螺旋突变载体(HDMV)和在含3’末端核碱基和5’末端核碱基的链的相反链中含有单核糖型核碱基片段的载体能产生意外的好结果。本文所用术语双螺旋突变载体(DMV)统指CMV、HDMV和NCMV。请注意，HDMV可以是嵌合的或非嵌合的，但术语CMV不包括HDMV。

5．发明详述

根据本发明，在含链转移和错配修复活性的酶混合物、DNA靶和重组诱发性寡核碱基的反应混合物中完成反应。在一实施方案中，DNA靶是突变的质粒抗生素抗性基因，例如tet或neo(kan)，重组诱发性寡核碱基是Kmiec的、以约1∶200的摩尔比含2’-O-甲基的CMV。通过特异性地改变单个碱基恢复突变tet或kan的功能。通过酚/氯仿抽提终止反应，然后将抽提的质粒电穿孔到RecA或MutS缺陷型细菌中。根据重组(kanr或tetr)菌落与亲本型(ampr)的比例来确定靶DNA的修饰程度。当质粒与嵌合体分开反应并在氯仿/酚抽提后合并时，观察不到超过背景的重组菌落。当使用错配修复缺陷型细胞(LoVo)的抽提物时，重组菌落减少了约90％。这些对照表明，在反应混合物中完成了修饰，直至错配切割的位点。使用Kren等《天然药物》(NatureMedicine)1998年，4:285-290和Cole-Strauss等《科学》(Science)(Cole-Straus CMV)273:1386介绍的CMV类型的CMV，重组菌落的频率为约每105个亲本菌落5个重组菌落。

用于此处，当无细胞酶混合物可用于获得上述结果时，该无细胞混合物被认为是具有链转移和错配修复活性。

下文表1表明在细菌和无细胞真核系统中，Cole-Straus CMV的多重修复作用。在每个系统中测量的任何修复活性间有很好的关联。特别是2’-O-甲基尿嘧啶取代链间连接物中的胸腺嘧啶(变体Ⅳ和Ⅴ)、仅在5’链(变体Ⅵb)放置增变基因以及缺失3’链的DNA可显著提高两个系统中重组诱发性寡核碱基的性能。

在两个系统中，在3’链放置增变基因(变体Ⅵa)会导致功能基本上丧失，即每105菌落中只有一个以下的重组菌落。用变体Ⅵa观察到的频率明显高于背景。因此，用于此处，重组诱发性寡核碱基是一种在上述无细胞系统中可提供至少与根据具有相同增变基因序列的变体Ⅵa制备的重组诱发性寡核碱基一样高的重组频率的寡核碱基。

具有一个碱基增变基因序列的变体Ⅶ被观察到能够影响重组，频率为4.4/105。该频率显著高于在细菌系统以及在培养细胞中观察到的频率。没有理论上的限制，该差异被认为是由于无细胞系统中相对缺少核酸外切酶和核酸内切酶。

5.1无细胞酶混合物

用于实施本发明的无细胞酶混合物含有链转移和错配修复活性。用于此处，术语“无细胞酶混合物”指不包括活细胞、优选不包括细胞器如核和线粒体的混合物。无细胞酶混合物中所需的错配修复程度取决于用于检测靶DNA序列之修饰作用的方法和实用性。

当用生物化学方法，例如限制核酸外切酶消化检测修饰时，错配修复活性应包括能够完成切除和连接的错配检测、链切割和切除以及链的再合成。当在重组缺陷型细菌例如大肠杆菌菌株DH110中检测修饰时，可以从无细胞酶混合物中省去链再合成和连接活性。用于此处，“错配修复活性”不包括再合成和连接活性，这些活性可以存在于无细胞酶混合物中，但在大多数情况下是不需要的。

在特定的应用中，例如用植物或哺乳动物酶检测重组诱发性寡核碱基的修饰对其效力的影响，优选通过无细胞酶混合物提供错配修复活性。优选通过生物化学方法或者在没有错配修复的宿主例如MutS细菌如NR9162中检测。

对于特定的应用，理想的是将靶DNA与重组诱发性寡核碱基的复合物与未复合的靶DNA分开。通过将亲和配体，例如生物素导入到重组诱发性寡核碱基上很容易完成分离。在所述应用中，可使用两种无细胞酶混合物，一种在分离前，一种在分离后。前一种混合物应仅含有链转移活性，后一种仅含有错配修复活性。

可以以细胞提取物的形式获得无细胞酶混合物。可使用Li&Kelly的方法。Li.,J.J.等，1985年，《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)5:1238-1246。Li&Kelly的方法是“胞质抽提”。将细胞在低渗缓冲液中机械破碎，使用以2000xg离心10分钟、以12000xg离心两个15分钟得到的上清液。没有理论上的限制，我们认为链转移和错配修复酶的生理细胞定位是核，但在制备过程中这些酶大量从核中丢失。按照Dignam等1983年，《核酸研究》(Nucleic AcidResearch)11:1475制备的粗核抽提物不是优选的。

从有复制错误表型的突变细胞的抽提物可得到缺乏错配修复的无细胞酶混合物。Umar等，1994年，《生物化学》(Biol.Chem.)269:14367。细胞系LoVo已缺失了人MutS同系物的两个等位基因(MSH2)，并适宜作为没有错配修复活性的链转移活性的来源。

在另一实施方案中，无细胞酶混合物可以是含重组生产的酶的组合物。一种确定的酶的重组生产使得可以增加已知数量的确定的酶而没有与链转移和错配修复有关的所有其他酶。当将一种确定的酶加到该酶缺陷型细胞的提取物中时，结果得到就该酶而言的一种确定的酶混合物。通过Gupta,R.C.1997年，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.)94:463-468报道的方法可完成重组Rad51的生产。

5.2重组诱发性寡核碱基

按照美国专利556535和5731181的教导可构建用于无细胞系统的重组寡核碱基。另外可按照下面的方法制备重组寡核碱基。

定义

应按照下列定义理解本发明。

寡核碱基是核碱基的聚合物，是可通过Watson-Crick碱基配对原则与含有互补序列的DNA杂交的聚合物。

核碱基含有一个碱基，该碱基可以是嘌呤、嘧啶或其衍生物或类似物。核碱基包括肽核碱基、肽核酸的亚单位、吗啉核碱基以及含戊糖呋喃糖基部分如任意取代的核苷或2’-脱氧核苷的核碱基。核苷酸是含通过磷酸二酯相连的含戊糖呋喃糖基的核碱基。其他含戊糖呋喃糖基的核碱基通过取代的磷酸二酯例如硫代磷酸酯或者三酯化磷酸相连。

寡核碱基化合物有单5’和3’末端核碱基，它们是聚合物的最终端核碱基。核碱基是脱氧核糖型或者核糖型。核糖型核碱基是含戊糖呋喃糖基的核碱基，其中2’碳是用羟基、取代的氧或卤素取代的亚甲基。脱氧核糖型核碱基是一种非核糖型核碱基的核碱基，包括所有不含戊糖呋喃糖基部分的核碱基，例如肽核酸。

寡核碱基链一般包括与等长互补链的基本上所有核碱基杂交的寡核碱基化合物的区域或片段。寡核碱基链有最3’(3’末端)核碱基和最5’(5’末端)核碱基。链的最3’核碱基与互补链的最5’核碱基杂交。一条链的两个核碱基如果直接共价相连或者如果它们与直接共价相连的互补链的核碱基杂交，则它们是相邻的核碱基。寡核碱基链可由连接的核碱基组成，其中链中的每个核碱基都与其相邻的核碱基共价相连。而当两个相邻的核碱基不相连时，则将一条链(strand)分成两个链区(chain)。一条链的5’(或3’)末端核碱基可在其5'-O(或3'-)与连接物相连，所述连接物再与第二条寡核碱基链的3’(或5’)末端相连，第二条链与第一条链互补，这样这两条链形成单寡核碱基化合物。所述连接物可以是寡核苷酸、寡核碱基或其他化合物。寡核碱基化合物5’末端和3’末端的核碱基的5’-O和3’-O可用保护寡核碱基链的阻断基团取代。但是，例如封闭的环状寡核苷酸不含3’或5’末端核苷酸。请注意，当寡核碱基化合物含有分开的链区时，3’和5’末端核碱基不是链的末端核碱基。

构象

双螺旋突变载体(DMV)是由核碱基聚合物组成的，该聚合物与含有适宜序列的DNA杂交，即形成嘌呤和嘧啶的Watson-Crick碱基对。将每个DMV分成至少12个核碱基但不超过75个核碱基的第一和第二链。在优选的实施方案中，链长度均在20-50个核碱基之间。所述链含有彼此互补的区域。在优选的实施方案中，两条链在除其中靶序列与所需序列不同的核碱基以外的每个核碱基均彼此互补。含至少5个核碱基的至少两个非重叠区域是优选的。

核碱基含有一个碱基，该碱基可以是嘌呤或嘧啶或其类似物或衍生物。有两类核碱基。核糖型核碱基是含有2’-羟基、取代的2’-羟基或2’-卤代-取代的核糖的核糖核苷。核糖型核碱基以外的所有核碱基是脱氧核糖型核碱基。因此，脱氧型核碱基包括肽核碱基。

在其中链的每个核碱基均彼此互补的实施方案中，第一和第二链的序列由至少两个与靶基因同源的区域和一个或多个不同于靶基因并将遗传改变导入靶基因的区域(增变基因区域)组成。增变基因区域在3’和5’方向直接与同源区相邻。在本发明的特定实施方案中，两个同源区至少有3个核碱基，或者至少6个核碱基或者至少12个核碱基长。所有同源区的总长度优选至少12个核碱基，更优选16个且最优选20核碱基-约60个核碱基长。更优选的是同源和增变区的总长度在25-45个核碱基之间，最优选为30-45个核碱基或者约35-40个核碱基。每个同源区可以是8-30个核碱基，更优选8-15个核碱基，最优选为12个核碱基。

DMV的一条或两条链可任意含有核糖型核碱基。在优选的实施方案中，DMV的第一链仅由核糖型核碱基组成，而第二链由脱氧型核碱基组成。在另一优选的实施方案中，将第二链分成第一和第二链区。第一链区不含核糖型核碱基，而与第一链区的核碱基配对的第一条链的核苷酸是核糖型核碱基。在另一实施方案中，第一条链由插在两个核糖型核碱基片段间的脱氧核糖型核碱基单片段组成。在所述的实施方案中，插入的片段含有增变基因区，或者HDMV的情况下，插入区与另一条链的增变基因区配对。

增变基因区优选由20个或更少的碱基，更优选6个或更少的碱基，最优选为3个或更少的碱基组成。增变基因区可以与分开与DMV之同源区具有同源性的靶基因区的序列长度不同，以便导致所述靶基因的插入或缺失。当用DMV将缺失导入靶基因时，在增变基因区内没有可鉴定的碱基。突变多少会受在靶基因内分开的两个同源区并列的影响。为了达到本发明的目的，将缺失导入靶基因的DMV之增变基因区的长度被认为是缺失的长度。在一个实施方案中，增变基因区是6-1个碱基、优选3-1个碱基的缺失。通过单个DMV可导入多个分开的突变，其中多个增变基因区在同一DMV上。或者可用多个DMV将多个遗传改变同时导入一个基因内，或者将遗传改变导入相同细胞的多个基因内。本文中，增变基因区还指异源区。当所需的不同序列是插入或者缺失时，两个链的序列是具有不同的、所需序列的序列。

DMV是24-150个核碱基的单寡核碱基化合物(聚合物)。因此，DMV含有一个3’末端和5’末端。第一和第二链可通过核碱基或者通过非寡核碱基连接物共价连接。在优选的实施方案中，保护每条链的3’末端核碱基不受3’核酸外切酶的攻击。通过本领域技术人员已知的现有的多种技术或者任何即将发展出的技术可以完成所述保护。

在一实施方案中，通过将一条链的最3’(末端)核碱基与另一条链的最5’(末端)核碱基经核酸酶抗性共价连接物，例如聚乙二醇、聚1,3-丙二醇或聚-1,4-丁二醇连接来达到免于3’-核酸外切酶攻击的保护作用。适用于连接两个杂交的核酸链的各种连接物的长度是本领域技术人员已知的。有6-3个乙烯单位和末端磷酰基部分的聚乙二醇连接物是适宜的。Durand,M.等1990年，《核酸研究》(Nucleic AcidResearch)18:6353；Ma,MU-X等，1993年，《核酸研究》(NucleicAcids Res.)21:2585-2589.优选的其他连接物是二-磷酰基丙基-反-4,4’-芪氨甲酰。Letsinger,R.L.,等人1994年，《美国化学会志》(J.Am.Chem.Soc.)116:811-812；Letsinger,R.L.,等人1995年，《美国化学会志》(J.Am.Chem.Soc.)117:7323-7328。用常规固相合成法可将所述连接物插入到DMV中。或者，按Letsinger,R.L.,等人的专利公开WO97/05284(1997年2月13日)的介绍，将DMV链分开合成，然后杂交，并用含thiophoryl的芪氨甲酰形成链间连接。

在其他实施方案中，连接物可以是由核酸酶抗性核碱基组成的单链寡核碱基，例如2’-O-甲基、2’-O-丙烯基或者2’-F核糖核苷酸。四核糖核苷酸序列TTTT、UUUU和UUGG以及三核苷酸序列TTT、UUU和UCG是特别优选的核苷酸连接物。

在另一实施方案中，通过修饰3’末端核碱基可完成3’核酸外切酶保护。如果一条链的3’末端核碱基是3’末端，则通过酯化成3’-OH、2’-OH或者2’或3’磷酸酯可连接立体保护基团。适宜的保护基团是1,2-(ω-氨基)-烷基二醇或者1,2～羟甲基-(ω-氨基)-烷基。可进行的修饰包括烯烃或者支链烷烃或烯烃的使用，以及ω-氨基的取代或者用羟基取代ω-氨基。其他适宜的保护基团包括3’末端甲基磷酸酯，Tidd,D.M.等1989年，《Br.J.Cancer》,60:343-350；和3’-氨基己基，Gamper H.H.等1993年，《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)21:145-150。或者，通过与取代的磷例如甲基磷酸酯或者硫代磷酸酯结合可衍生3’或5’末端羟基。

在另一实施方案中，通过使链的最3’核碱基成为核酸酶抗性核碱基来完成3'-末端核碱基的保护。核酸酶抗性核碱基包括肽核酸核碱基和2’取代的核糖核苷酸。适宜的取代基包括美国专利5731181和美国专利5334711(Sproat)(这两篇文献引入本文作为参考)教导的取代基和专利公开EP629387和EP679657(统称Martin申请)(所述文献因为本文作为参考)教导的取代基。在本文中将核糖核苷酸的2’氟、氯或溴衍生物或者Martin申请或Sproat中所述的有取代的2'-O的核苷核苷酸称为“2’-取代的核糖核苷酸”。特别优选的2’-取代的核糖核苷酸的实施方案是2’-氟、2’-甲氧基、2’-丙氧基、2’-丙烯氧基、2’-羟乙氧基、2’-甲氧乙氧基、2'-氟丙氧基和2’-三氟丙氧基取代的核糖核苷酸。2’-取代的核糖核苷酸的更优选实施方案是2’-氟、2’-甲氧基、2’-甲氧基乙氧基和2’-烯丙氧基取代的核苷酸。

术语“核酸酶抗性核糖核苷”包括2’-取代的核糖核苷酸和所有2’-羟基核糖核苷酸而不是核糖核苷酸，例如通过非磷酸酯或取代的磷酸二酯连接的核糖核苷酸。核碱基抗性脱氧核糖核苷有类似的定义。在优选的实施方案中，DMV优选包括至少3个核酸酶抗性核糖核苷，更优选6个核酸酶抗性核糖核苷。在一优选的实施方案中，CMV仅含有核酸酶抗性核糖核苷和脱氧核糖核苷酸。在另一优选的实施方案中，每一个其他核糖核苷均是核酸酶抗性。

每个DMV有一个3’末端和一个5’末端。在一实施方案中，所述末端是链的末端核碱基。在另一实施方案中，将链分成通过其他链共价相连但不彼此直接相连的两个链区。在将链分成两个链区的实施方案中，3’和5’末端是与所述其他链的相邻核碱基配对的Watson-Crick碱基。在所述链中，3’和5’末端都不是末端核碱基。用上述不被核酸酶活性裂解的立体保护基可任意地取代不是链的末端核碱基的3’和5’末端。在另一实施方案中，将一条链的末端核碱基与不与相反链的相应核碱基配对并且不是链链连接的一部分的核碱基相连。所述实施方案有一个带有3’和5’突出端的“发夹”构象。不配对的核碱基和突出端的其他组分不被认为是链的一部分。突出端可包括自杂交的核碱基或非核碱基部分，例如亲和配体或者标记物。在有3’-突出端的DMV的特别优选的实施方案中，含5’核碱基的链仅由脱氧型核碱基组成，这些核碱基与相反链的核糖型核碱基配对。在有3’-突出端的DMV的另一优选的实施方案中，含5’末端核碱基的链的序列是不同的、所需的序列，并且含有突出端的链的序列是靶DNA的序列。

本发明的一个特别优选的实施方案是其中两条链不完全互补的DMV。一条链的序列含有相当的待修饰靶DNA的序列，另一条链的序列含有使用者用于导入代替靶序列的不同的、所需序列。随后，在靶和所需序列不同的位置上，一条链的碱基与另一条链的非互补碱基配对。本文将所述DMV命名为异源双螺旋突变载体(HDMV)。在一优选的实施方案中，所需的序列是被分开链的链区的序列。在第二个优选的实施方案中，所需的序列在不含核糖型核碱基的链区或链上。在更优选的实施方案中，所需的序列是被分开链的链区的序列，其中所述链区不含核糖型碱基。

核碱基间连接

DMV链之核碱基间的连接可以是和DMV与其靶序列的杂交相容的任何键。所述序列包括天然核酸中的常规磷酸二酯键。在美国专利Re:34069中描述了含有所述核苷酸的寡核苷酸的有机固相合成。

另外，核碱基间键可以是取代的磷酸二酯键，例如硫代磷酸酯、取代的磷酸三酯键。或者，可以使用非磷酸酯的、含磷的键。Letsinger的美国专利5476925中描述了氨基磷酸酯键。3’-氨基磷酸酯键(3’-NP(O)(O)0-5’)非常适用于DMV，因为与5’-氨基磷酸酯相比，它可以使杂交稳定。还可使用核碱基间的非磷酸酯键。美国专利5489677中描述了有相邻的N和O的核碱基间键以及其合成方法。3’-ON(CH₃)CH₂-5’(亚甲基甲基亚氨基)是优选的实施方案。在Kmiec的美国专利5731181中描述了适用于DMV的其他键。在本发明中还可使用没有戊糖呋喃糖基部分并通过肽键相连的核碱基。在Nielsen的美国专利5539082中描述了含所述肽核酸(PNA)的寡核碱基。在WO95/14706中描述了制备PNA/核苷酸嵌合体的方法。

5.3具体应用

本发明的异源双螺旋突变载体和非嵌合突变载体可代替现有技术中的嵌合突变载体用于任何真核细胞。Kmiec的专利公开WO97/41141教导了嵌合突变载体的体外应用，美国专利5565350和美国专利5731181也进行了同样的工作。Kren等1998年《天然药物》(Nature Medicine)4:285提供了体内使用嵌合突变载体的指南。

可以在无细胞系统中使用重组诱发性寡核苷酸来达到多种目的，这些目的对于本领域技术人员是显而易见的。下列实施例是非限制性的。

在无细胞系统中可以快速定量地检测修饰对重组诱发性寡核苷酸的纯度、化学特征、大小和/或构象的影响。无细胞系统还有不依赖于传递效率即可测量重组效率的优点。

可用无细胞系统检测旨在抑制或提高嵌合体制备技术所需之酶的活性的化合物，在另一实施方案中是为了检测代替混合物之酶的化合物。抑制化合物可以是直接作用于所涉及之酶的竞争性或非竞争性抑制剂。另外，所述抑制剂可作用于这样一种细胞，该细胞的提取物被制备来阻断酶的合成或者加速酶的降解。这些化合物可通过诱导或抑制相关酶的合成而起作用或者通过诱导能激活或失活相关酶的合成后修饰来发挥作用。

无细胞系统还可进一步用于检测与嵌合体制备技术机制有关的或特定的蛋白质。所述检测，例如(非限制性地)可通过蛋白质-特异性单克隆抗体的使用以确定所研究蛋白质是否与嵌合体制备技术有关来完成。

无细胞系统的进一步应用是质粒或者其他分离的DNA分子的特异性修饰。在用于该目的一个实施方案中，重组诱发性寡核碱基含有可以将含靶DNA的复合物与未复合的靶DNA分开的亲和配体例如生物素。在该实施方案中，嵌合体制备技术反应用分开的链转移步骤和错配修复步骤完成。可用该实施方案提高被修饰DNA靶的比例，以便无需浪费更多的材料和进行更多的筛选即可得到非选择性的修饰。在一个实施方案中，将嵌合配体的受体与固相颗粒结合以便使重组诱发性寡核碱基/靶DNA复合物附着于所述颗粒。在反应的第二个阶段，错配修复活性导致靶DNA的修饰和释放，这样用第二步的上清液富集修饰的质粒。

6．实施例

表Ⅰ列出了用Kany.y变体矫正Kan抗性基因中的导致一个终止密码子的CG易位而得到的卡那霉素和氨苄青霉素抗性菌落的相对数。

使用下列材料和方法以得到这些数据。

无细胞提取物：使HuH-7(Nakabayashi,H.等1982年，《癌症研究》(Cancer Res.)42:3858)细胞在用10％胎牛血清补充的DMEM中生长至对数生长中期，约5×10⁵个细胞/ml。通过机械方法使细胞离开组织培养瓶中的原位，以500xg离心。将沉淀用冰冷含蔗糖的低渗缓冲液(20mM HEPES,pH7.5,5mM KCl,1.5mM MgCl₂,1mM DTT,250mM蔗糖)洗涤，再用不含蔗糖的冰冷低渗缓冲液洗涤，然后以6.5×10⁷个细胞/ml重悬在低渗缓冲液中，在冰上保温15分钟。此后用Dounce匀浆器，3-5分冲程将细胞溶解，然后在冰上再保温45分钟。以10,000xg离心10分钟使溶解产物澄清，然后将上清液分成等份并于-80℃贮存直到使用。

反应条件：使无细胞酶混合物、质粒和DMV在50微升的终体积中反应。反应缓冲液是20mM Tris,pH7.4,15mM MgCl₂,0.4mM DTT和1.0mMATP。质粒、DMV和提取物蛋白质的终浓度分别为20μg/ml、20μg/ml和600μg/ml。反应在500μl微量离心管(Eppendorf tube)中进行。将离心管在冰上预冷，然后加入除提取物外的试剂，混合。然后加入提取物，在37℃将反应保温45分钟。通过氯仿/酚抽提终止反应。在-20℃，用10％(v/v)3M醋酸钠，pH4.8和2体积无水乙醇沉淀核酸。

细菌转化：将沉淀的DMV处理的质粒溶解，按照标准技术通过电穿孔转化细菌。电穿孔后，在不含抗生素(卡那霉素)的条件下将细菌培养1小时，然后在存在20％选择水平的抗生素的条件下培养4小时。

分析：可以从卡那霉素抗性菌落和氨苄青霉素抗性菌落的比例确定DMV的效率，该比例是质粒回收率和电穿孔效率的测量值。下列表中所给的比例是基于与次选择水平的卡那霉素保温4小时后得到的数据。所述选择性保温导致kanr菌落增加约100倍。报道了经过预铺板筛选进行校正的绝对频率。

DMV：下面给出用于导入卡那霉素抗性的双螺旋突变载体的一般结构。将插入片段、3’同源区和5’同源区分别称为“Ⅰ”、“H-3”和“H-5”。将链间连接物命名为“L”。将任意的chi位点(5’-GCTGGTGG-3’)和其互补片段称为X和X’。3’和5’增变区域是分别标为M^3’和M^5’的单核苷酸。变体Ⅰ与Cole-Strauss,1996年、《科学》(Science)273:1386和Kren,1998年，《天然药物》(Nature Medicine)4:285-290中所述的嵌合突变载体相似。在本说明书中，将变体Ⅰ称为Kany.y。符号“--”在用于变体特征时表示所述变体的特征与变体Ⅰ的相同。

上述DMV引起将TAG终止密码子改变为TAG tyr密码子的CG易位。应注意Ⅰ的第一条链没有核酸外切酶保护的3’末端，而Ⅰ的第二链是分开的链，其第一链区是所需的不同序列。变体Ⅳ和Ⅴ分别是嵌合突变载体和非嵌合突变载体，带有通过核酸酶抗性连接物(2’OMe-U₄)保护的3’末端核酸外切酶。变体Ⅵa和Ⅵb是嵌合异源双螺旋突变载体。变体Ⅵb是其中所需的不同序列在第一链区上并仅由DNA型核苷酸组成的变体。

下表给出在细菌系统中所述变体相对于变体Ⅰ的活性，并给出无细胞提取物中的kan^r/10⁵质粒转变频率。除在无细胞系统和细菌系统中的变体Ⅵa和在细菌系统中的变体Ⅶ外，与实验值相比，背景率可以忽略。报道的这些变体的数据是背景校正过的。变体Ⅵa和Ⅶ有低活性或者没有活性。在两个系统中的变体Ⅲ-Ⅴ均比变体Ⅰ好，变体Ⅰ是在上述引用的Yoon,Cole-Strauss和Kren的科学文献中描述的类型。基于这些数据变体Ⅷ是最佳嵌合体。

结果表明无细胞提取物中的活性与细菌系统中的活性间有极好的相关性。具体地讲，在两个系统中，变体Ⅳ和Ⅵb均比kany.y好，在两个系统中非嵌合突变载体均是有活性的。唯一的差异是变体Ⅶ，它仅含有脱氧核苷酸。变体Ⅶ在无细胞提取物中有活性，但在细菌系统中无活性。脱氧寡核苷酸被发现在真核细胞中也没活性。没有理论上的限制，申请人认为，变体Ⅶ在无细胞系统中的活性归因于与含细胞系统相比在所述无细胞系统中核酸酶数量的减少。具体地讲，申请人发现在37℃保温10分钟，5’末端标记的46nt单链DNA不会被无细胞提取物降解(＜1％)。用46bp5’末端标记的线性双螺旋DNA底物可以得到类似的结果。反应缓冲液是2mM ATP,1mM DTT,25mM Tris-醋酸，pH7.5,5mM Mg。

DMV	M^5′	M^3′	H^5′	I	H3′	L	X(X′)	R.A.(bac)	kan^r/10⁵amp^r无细胞
DMV	M^5′	M^3′	H^5′	I	H3′	L	X(X′)	R.A.(bac)	kan^r/10⁵amp^r无细胞	Ⅰ	C	G	2′-OMe	DNA	2′-OMe	T4	无	1	6.0
Ⅱ	--	--	--	--	--	--	chi	3.2	1.4.	Ⅰ	C	G	2′-OMe	DNA	2′-OMe	T4	无	1	6.0
Ⅱ	--	--	--	--	--	--	chi	3.2	1.4.	Ⅲ	--	--	--	2′-OMe	--	--	--	1.6	13
Ⅳ	--	--	--	--	--	2′-OMe-U₄	--	10.0	50	Ⅲ	--	--	--	2′-OMe	--	--	--	1.6	13
Ⅳ	--	--	--	--	--	2′-OMe-U₄	--	10.0	50	Ⅴ	--	--	DNA	--	DNA	2′-OMe-U₄	--	3.0	9.8
Ⅵa	G	--	--	--	--	--	--	0.06^*	0.25	Ⅴ	--	--	DNA	--	DNA	2′-OMe-U₄	--	3.0	9.8
Ⅵa	G	--	--	--	--	--	--	0.06^*	0.25	Ⅵb	--	C	--	--	--	--	--	7.5	10.8
Ⅵ	--	--	--	--	--	T₃	--	4.2	N.D.	Ⅵb	--	C	--	--	--	--	--	7.5	10.8
Ⅵ	--	--	--	--	--	T₃	--	4.2	N.D.	Ⅶ	--	--	DNA	--	DNA	--	--	~0	4.4
Ⅷ	--	C	2′-OMe	2′-OMe	2′-OMe	2′-OMe-U₄	--	N.D.	N.D.	Ⅶ	--	--	DNA	--	DNA	--	--	~0	4.4

*位点特异性率

+GCTGGTGG

+从对其他数据标准化的独立实验得到的结果。

下面给出用于导入四环素抗性的DMV序列：TetΔ208T

Tet153

序列表

(1)一般资料

(ⅰ)申请人：Kmiec,Eric B.

Gamper,Howard B.

Cole-Strauss,Allyson D.

(ⅱ)发明题目：非嵌合突变载体的真核应用

(ⅲ)序列数：4

(ⅳ)相地址：

(A)收件人：Kimeragen,Inc.

(B)街道：300Pheasant Run

(C)城市：Newtown

(D)州：PA

(E)国家：USA

(F)邮编：18940

(ⅴ)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM兼容

(C)操作系统：DOS

(D)软件：FastSEQ for Windows Version2.0

(ⅵ)现有申请资料：

(A)申请号：

(B)申请日：

(C)分类号：

(ⅶ)在先申请资料：

(A)申请号：

(B)申请日：

(ⅷ)代理人/代理资料：

(A)姓名：Hansburg,Daniel

(B)注册号：36156

(C)文献/文件号：7991-035-999

(ⅸ)通讯资料：

(A)电话：215-504-444

(B)传真：215-504-4545

(C)电传：

(2)SEQ ID N0:1的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：84个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:GCTATTCGGC TASGACTGGG CACAAGCTGG TGGTTTTCCA CCAGCTTGTG CCCAGTCSTA 60GCCGAATAGC GCGCGTTTTC GCGC 84

(2)SEQ ID NO:2的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：68个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:GCTATTCGGC TASGACTGGG CACAATTTTT TGTGCCCAGT CSTAGCCGAA TAGCGCGCGT 60TTTCGCGC 68

(2)SEQ ID NO:3的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：68个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:TTCCGACAGC ATTGCCAGTC ACTATTTTTA TAGTGACTGG CAATGCTGTC GGAAGCGCGT 60TTTCGCGC 68

(2)SEQ ID NO:4的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：68个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：其他

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:TAGGCATAGG CTTGGTTATG CCGGTTTTTA CCGGCATAAC CAAGCCTATG CCTAGCGCGT 60TTTCGCGC 68

Claims

1．用于修饰DNA序列的无细胞组合物，含有：

a．含靶序列的双螺旋DNA；

b．以所述DNA序列为靶并编码其修饰物的重组诱发性寡核碱基，

c．具有链转移活性的无细胞酶混合物。

2．权利要求1的组合物，其中所述寡核碱基含有至少20个但不多于200个核碱基。

3．权利要求1的组合物，其中所述寡核碱基含有至少10个但不多于60个Watson-Crick核碱基对。

4．权利要求1的组合物，其中所述寡核碱基含有一个3’末端和一个5’末端。

5．权利要求1的组合物，其中所述双螺旋DNA含有两个封闭的环状DNA聚合物。

6．权利要求1的组合物，其中所述双螺旋DNA序列是与启动子有效相连的所需基因的一部分，以便可以在宿主生物中表达所述基因。

7．权利要求6的组合物，其中无细胞酶混合物没有错配修复活性。

8．权利要求1的组合物，其中所述链转移活性是由真核生物衍生的酶提供的。

9．权利要求8的组合物，其中所述无细胞酶混合物是一种Rad51哺乳动物同系物或Rad52哺乳动物同系物的确定的酶混合物。

10．权利要求8的组合物，其中所述无细胞酶混合物是真核细胞的提取物。

11．权利要求10的组合物，其中所述无细胞酶混合物是哺乳动物细胞的提取物。

12．权利要求1的组合物，其中所述无细胞酶混合物进一步含有错配修复活性。

13．权利要求12的组合物，其中所述错配修复活性是由真核生物衍生的酶提供的。

14．权利要求13的组合物，其中所述无细胞酶混合物是真核细胞提取物。

15．权利要求14的组合物，其中所述无细胞酶混合物是哺乳动物细胞的提取物。

16．权利要求12的组合物，其中所述链转移活性是由真核生物衍生的酶提供的。

17．权利要求16的组合物，其中所述无细胞酶混合物是真核细胞提取物。

18．权利要求1的组合物，其中所述重组诱发性寡核碱基是双螺旋突变载体，含有：

a．至少12个相连的核碱基，但不多于75个相连核碱基的第一寡核碱基链，所述链含有第一和第二末端核碱基；

b．与第一链有相同数目核碱基的第二寡核碱基链，所述链可以被分成第一链区和第二链区；和

c．一个3’末端核碱基和一个5’末端核碱基；

其中

ⅰ．第二条链的最3’和最5’核碱基是分别与第一条链的第

一和第二末端核碱基配对的Watson-Crick碱基，和

ⅱ．第二条链含有至少两个含至少5个连续核碱基的非重叠

区，所述核碱基是与第一条链的核碱基配对的Watson-Crick碱

基；

其中至少一条链的序列含有不同的、所需的序列。

19．修饰所需基因的位点的方法，该方法包括：

a．将下列物质反应

ⅰ．编码所需基因的修饰的重组诱发性寡核碱基，

ⅱ．含有与启动子有效相连的所需基因的双螺旋DNA分子，

以便可以在宿主生物中表达所需基因，和

ⅲ．含链转移活性和错配修复活性的无细胞酶混合物；

由此在靶位点修饰所需基因；

b．将修饰的所需基因导入生物体；

c．检测所述被修饰基因的表达。

20．权利要求19的方法，其中所述寡核碱基含有至少20核碱基，但不超过200个核碱基。

21．权利要求19的方法，其中所述寡核碱基含有至少10个但不超过60个Watson-Crick核碱基对。

22．权利要求19的方法，其中所述寡核碱基含有一个3’末端和一个5’末端。

23．权利要求19的方法，其中所述双螺旋DNA含有两个封闭的环状DNA聚合物。

24．权利要求19的方法，其中被修饰所需基因的表达使所述生物体具有一种可选择特征。

25．权利要求19的方法，其中被修饰所需基因的表达使所述生物体具有一种可观察的特征。

26．改变DNA序列的方法，该方法包括

a．将下列物质反应

ⅰ．编码DNA序列修饰的重组诱发性寡核碱基，

ⅱ．含有该序列的双螺旋DNA分子，和

ⅲ．含链转移活性和错配修复活性的无细胞酶混合物；

由此修饰所述序列；

b．检测修饰的序列。

27．权利要求26的方法，其中进一步包括将无细胞组合物分级分离以便在检测修饰的序列前，相对于未修饰的双螺旋DNA，富集修饰的双螺旋DNA。

28．权利要求26的方法，其中所述寡核碱基含有至少20个但不超过200个核碱基。

29．权利要求26的方法，其中所述寡核碱基含有至少10个但不超过60个Watson-Crick核碱基对。

30．权利要求26的方法，其中所述寡核碱基含有一个3’末端和一个5’末端。

31．权利要求26的方法，其中所述重组诱发性寡核碱基是双螺旋突变载体，含有：

c．一个3’末端核碱基和一个5’末端核碱基；

其中

ⅰ．第二条链的最3’和最5’核碱基是分别与第一条链的第

一和第二末端核碱基配对的Watson-Crick碱基，和

ⅱ．第二条链含有至少两个至少含5个连续核碱基的非重叠

区，所述核碱基是与第一条链的核碱基配对的Watson-Crick碱

基；

其中至少一条链的序列含有不同的、所需的序列。

32．将靶DNA序列转化到真核细胞中的不同的、所需序列中的方法，该方法包括(A)给细胞施用双螺旋突变载体，所述载体含有：

a．至少12个相连的核碱基，但不多于75个相连核碱基的第一寡核碱基链，所述链含有第一末端核碱基和第二末端核碱基；

b．含有最3’核碱基和最5’核碱基并与第一链有相同数目核碱基的第二寡核碱基链，所述链可以被分成第一链区和第二链区；和

c．一个3’末端核碱基和一个5’末端核碱基；

其中

ⅰ．第二条链的最3’和最5’核碱基是分别与第一条链的第

一和第二末端核碱基配对的Watson-Crick碱基，和

ⅱ．保护所述最3’核碱基和所述第二末端核碱基免受3’核

酸外切酶的攻击，

ⅲ．第二条链含有至少两个至少含5个连续核碱基的非重叠

区，所述核碱基是与第一条链的核碱基配对的Watson-Crick碱

基；

前提是由核糖型和脱氧核糖型核碱基组成的连续Watson-Crick碱基对不超过两个；(B)检测含有不同的、所需序列的DNA在细胞或其子代中的存在。

33．权利要求32的方法，其中第一条链的每个核碱基与第二条链的互补核碱基Watson-Crick配对。

34．权利要求32的方法，其中所述第一条链的序列含有不同的、所需序列的序列。

35．权利要求32的方法，其中所述第一末端核碱基和最3’核碱基通过含有选自下列基团的部分的连接物相连：2’-甲氧基-尿苷、2’-烯丙氧基-尿苷、2’-氟-尿苷、2’-甲氧基-胸苷、2’-烯丙氧基-胸苷、2’-氟-胸苷、聚乙二醇和反-4,4’-芪氨甲酰。

36．权利要求32的方法，其中所述第二末端核碱基和最5’核碱基通过含有选自下列基团的部分的连接物相连：2’-甲氧基-尿苷、2’-烯丙氧基-尿苷、2’-氟-尿苷、2’-甲氧基-胸苷、2’-烯丙氧基-胸苷、2’-氟-胸苷、聚乙二醇和反-4,4'-芪氨甲酰。

37．权利要求32的方法，其中所述第二条链由第一链区和第二链区组成，而且第一链区不含有核糖型核碱基。

38．权利要求37的方法，其中所述第一条链的每个核碱基与第二条链的互补核碱基Watson-Crick配对。

39．权利要求37的方法，其中所述不同的、所需序列的序列是第一链区的序列。

40．权利要求32的方法，其中所述第一链区含有5’末端核碱基。

41．权利要求32的方法，其中所述第一链区含有3’末端核碱基。

42．将靶DNA转化到真核细胞中的不同的、所需序列中的方法，该方法包括(A)给细胞施用双螺旋突变载体，所述载体含有：

b．有最3’和最5’核碱基并与第一链有相同数目核碱基的第二寡核碱基链，所述第二条链可以被分成第一链区和第二链区；和

c．一个3’末端核碱基和一个5’末端核碱基；

其中

ⅰ．第二条链的最3’和最5’核碱基是分别与第一条链的第

一和第二末端核碱基配对的Watson-Crick碱基，和

ⅱ．第二条链含有至少两个至少含5个连续核碱基的非重叠

区，所述核碱基是与第一条链的核碱基配对的Watson-Crick碱

基；

其中第一的序列链含有靶DNA的序列，并且第二链的序列含有不同的、所需序列。

(B)检测含有不同的、所需序列的DNA在细胞或其子代中的存在。

43．权利要求42的方法，其中所述第一条链含有至少12个核糖型核碱基。

44．权利要求42的方法，其中将所述第二条链分成第一链区和第二链区。

45．权利要求44的方法，其中第一链区的序列是不同的、所需序列，且第一链区不含核糖型核碱基。

46．权利要求45的方法，其中所述第一链区含有5’末端核碱基。

47．权利要求45的方法，其中所述第一链区含有3’末端核碱基。

48．将靶DNA序列转化到真核细胞中的不同的、所需序列中的方法，该方法包括(A)给细胞施用双螺旋突变载体，所述载体含有：

c．一个3’末端核碱基和一个5’末端核碱基；

其中

ⅰ．第二条链的最3’和最5’核碱基是分别与第一条链的第

一和第二末端核碱基配对的Watson-Crick碱基，和

ⅱ．第二条链含有至少两个至少含5个连续核碱基的非重叠

区，所述核碱基是与第一条链的核碱基配对的Watson-Crick碱

基；

其中所述链含有靶DNA的序列，且一条链的序列含有不同的、所需序列的序列，而且含有所述不同的、所需序列的寡核碱基片段是由至少12个连续脱氧核糖型核碱基组成；

49．权利要求48的方法，其中所述第一条链的序列含有靶DNA的序列。

50．权利要求48的方法，其中所述第一条链的序列含有不同的、所需序列的序列。

51．权利要求48的方法，其中所述第二条链由第一链区和第二链区组成，而且所述第一链区不含核糖型核碱基。

52．权利要求51的方法，其中所述靶DNA的序列是第一链区的序列。

53．权利要求51的方法，其中所述不同的、所需序列的序列是所述第一链区的序列。

54．将靶DNA序列转化到真核细胞中的不同的、所需序列中的方法，该方法包括(A)给细胞施用嵌合双螺旋突变载体，所述载体含有：

b．有最3’和最5’核碱基并与第一链有相同数目核碱基的第二寡核碱基链，所述第二条链被分成第一链区和第二链区；和

c．一个3’末端核碱基和一个5’末端核碱基；

其中

ⅰ．第二条链的最3’和最5’核碱基是分别与第一条链的第

一和第二末端核碱基配对的Watson-Crick碱基，和

ⅱ．所述第一链区的核碱基是脱氧型核碱基，并且与第一条

链的核碱基配对的是核酸酶抗性核糖型核碱基；

ⅲ．第二条链含有至少两个至少含5个连续核碱基的非重叠

区，所述核碱基是与第一条链的核碱基配对的Watson-Crick碱

基；

其中所述链的序列含有靶DNA的序列，且一条链的序列含有不同的、所需序列的序列，并且含有所述不同的、所需序列的寡核碱基片段是由至少12个连续脱氧核糖型核碱基组成；

55．权利要求54的方法，其中所述第一链区含有5’末端核碱基。

56．权利要求55的方法，其中最多一个所述第一链区的核碱基与所述第一条链的非互补核碱基配对。

57．将靶DNA转化到真核细胞中的不同的、所需序列中的方法，该方法包括(A)给细胞施用嵌合双螺旋突变载体，所述载体含有：

b．有最3’和最5’核碱基的寡核碱基链；和

c．与第二末端核碱基相连的3’突出端；

其中

ⅰ．所述链区的最3’和5’末端核碱基是分别与第一链的第

一和第二末端核碱基配对的Watson-Crick碱基，和

ⅱ．所述链区的核碱基是脱氧型核碱基，并且与其配对的链

的核碱基是核酸酶抗性核糖型核碱基；

ⅲ．第二条链含有至少两个含至少5个连续核碱基的非重叠

区，所述核碱基是与第一条链的核碱基配对的Watson-Crick碱

基；

其中所述链的序列含有不同的、所需序列的序列；

58．权利要求57的方法，其中所述链的序列含有靶DNA的序列。

59．权利要求58的方法，其中最多一个所述第一链区的核碱基与所述第一条链的非互补核碱基配对。