CN1309416C

CN1309416C - 新的药物组合物

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Publication number: CN1309416C
Application number: CNB018095607A
Authority: CN
Inventors: 阿波隆·帕帕季米特里乌
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2000-05-15
Filing date: 2001-05-08
Publication date: 2007-04-11
Anticipated expiration: 2021-05-08
Also published as: DE60109625T2; PL219131B1; EP1311285A2; ECSP024352A; IL152659A0; CA2408685A1; RU2281116C2; AR035034A1; BRPI0110914B1; JP2003533487A; JO3404B1; HUP0302114A2; AU784091B2; DK1311285T3; BRPI0110914B8; DE60109625D1; NO330934B1; MEP90708A; RS51292B; CZ304855B6

Abstract

本发明涉及含有促红细胞生成素，在适合将溶液pH保持在大约5.5至大约7.0范围的药学可接受缓冲剂中的多电荷无机阴离子，和任选地，一种或多种药学可接受赋形剂的液体药物组合物。该组合物特别有用于预防和治疗与红细胞生成相关的疾病。

Description

新的药物组合物

本发明涉及含有促红细胞生成素，在适合将溶液pH保持在大约5.5至大约7.0范围的药学可接受缓冲剂中的多电荷无机阴离子，和任选地，一种或多种药学可接受赋形剂的液体药物组合物。该组合物特别有用于与红细胞生成相关疾病的预防和治疗。

红细胞生成是产生红细胞，其发生抵消细胞破坏。红细胞生成是一种受控生理机理，其使得正常组织氧化作用可获得足够的红细胞。肾中产生天然存在的人促红细胞生成素(hEPO)，并且人促红细胞生成素是体液血浆因子，其刺激红细胞产生(Carnot，P和Deflandre，C(1906)C.R.Acad.Sci.143：432；Erslev，AJ(1953血液(Blood)8：349；Reissmann，KR(1950)Blood 5：372；Jacobson，LO，Goldwasser，E，Freid，W和Plzak，LF(1957)自然(Nature)179：6331-4)。天然存在的EPO刺激骨髓中定向红细胞祖先的分裂和分化，并且通过与红细胞类原代上的受体结合而表现出其生物活性(Krantz，BS(1991)Blood 77：419)。

应用重组DNA技术(Egrie，JC，Strickland，TW，Lane，J-等(1986)免疫生物学(Immunobiol.)72：213-224)通过生物合成制备了促红细胞生成素，其是克隆的人EPO基因插入中国仓鼠卵巢组织细胞(CHO细胞)中并且表达的产物。SEQ ID NO：1中描述了hEPO的主要的，完全加工的形式的一级结构。Cys⁷-Cys¹⁶¹和Cys²⁹-Cys³³之间有两个二硫键。没有糖基的EPO多肽链的分子量是18,236Da。在完整的EPO分子中，分子量的大约40％来自碳水化合物基团，其在蛋白质的糖基化位点将蛋白质糖基化(Sasaki，H，Bothner，B，Dell，A和Fukuda，M(1987)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)262：12059)。

因为人促红细胞生成素在红细胞形成中是必需的，该激素在特征在于低或者有缺陷的红细胞产生的血液病的治疗中是有用的。临床上，对慢性肾衰竭患者(CRF)(Eschbach，JW，Egri，JC，Downing，MR等(1987)NEJM316：73-78；Eschbach，JW，Abdulhadi，MH，Browne，JK等(1989)Ann.Intern.Med.111：992；Egrie，JC，Eschbach，JW，McGuire，T，Adamson，JW(1988)Kidney Intl.33：262；Lim，VS，Degowin，RL，Zavala，D等(1989)Ann.Intern.Med.110：108-114)和艾滋病和接受化学治疗的癌症患者(Danna，RP，Rudnick，SA，Abels，RI In：MB，Garnick，编著，EPO的临床应用-国际观察(Erythropoietin in ClinicalApplications-An International Perspective).New York，N.Y.：MarcelDekker；1990：p.301-324)的贫血的治疗使用EPO。

已知的药物组合物具有下面缺点的至少一项：

-它们是冻干物。除了制备方法复杂之外，冻干物具有在注射给人体之前要重新溶解配制的缺点。这使得医药人员必须额外操作，不方便而且有对药物产物操作不恰当的危险；

-它们含有作为添加剂的人血清白蛋白。因为人血清白蛋白是从人体液衍生的产物，有白蛋白制剂中污染物带来的病毒感染的危险。此外，变应性反应是可能的；

-现存所有商售促红细胞生成素组合物在升高的温度下，即高于通常在2℃和8℃之间的冰箱温度时，是不稳定的。因此，它们必须在冰箱(2-8℃)中保存，并且不能在室温(大约20℃)下保存。这导致在低温下贮存和运输带来的成本的增加，并且还在药物产品的操作中引起不方便。在本说明书的上下文中，所谓不稳定指在升高的温度例如25℃下长期贮存(即几个月，或者多于6个月)导致蛋白质降解。在本说明书中，所谓降解描述的是已知优选在升高的温度(高于8℃)下发生的蛋白分子的物理变化(例如聚集和变性)和化学变化(例如一般来说化学键的氧化或修饰)。在接近或者高于其转变温度(transition temperature)(也称为解链温度)下温育一种蛋白质导致该蛋白质的解折叠，即该多肽失去了天然结构和生物活性。转变温度与蛋白质的温度稳定性密切相关，并且取决于蛋白质的环境(例如pH，盐，离子强度，缓冲物质等)。例如，变性可以导致促红细胞生成素分子的聚集，即二聚体(共价或者非-共价)，更高级聚集体和甚至颗粒的的形成。这导致药物效力降低并且在对人注射之后可能引起不期望的副作用。

因此，本发明要解决的问题是提供能最小化或克服上述缺点的组合物。

根据本发明，通过提供含有促红细胞生成素，在pH是大约5.5至大约7.0的缓冲溶液中的多电荷无机阴离子，和任选地，一种或多种药学可接受赋形剂的药物组合物解决了所述问题。

令人惊奇地发现在这种组合物中配制促红细胞生成素改进了其在高于冰箱(2-8℃)，特别是在室温下(即低于25℃)，甚至在更高温度例如40℃下的稳定性。这意味着所述组合物不冷却就能够长时期贮存，而活性没有明显降低，并且没有明显降解。

除非另有说明，提出下面的定义描述和定义这里用来描述本发明的各种术语的定义和范围。

术语″多电荷无机阴离子″指每个分子具有两个或多个负电荷的无机阴离子，例如硫酸根SO₄ ^2-，或者磷酸根阴离子，即磷酸氢根HPO₄ ^2-。加入的多电荷无机阴离子可以是其相应盐例如钠盐，钾盐及其混合物形式，和/或缓冲物质，例如磷酸缓冲液形式。

术语″等渗或等张″指能够与体液混合而不影响其成分的溶液。与血液等渗的溶液，例如0.9％氯化钠，和血清具有相同的渗透压，并且它们不影响红细胞的膜。一般情况下，与血液等渗的溶液是大约290mosm/kg H₂O。

术语″强无机酸″指在1N溶液，例如H₂SO₄中表现出20至100％解离的无机酸。

这里使用的术语″药学可接受的″是指缓冲剂或者盐从毒性角度来说是可接受的。

术语″稀释剂″指药物制剂中没有药理活性但是是药学上必需或期望的成份。例如稀释剂可以是用来溶解要注射的药物的液体，例如水。

术语″溶剂″指将另一种物质保持在溶液中，即将其溶解的液体，例如水。

术语″防腐剂″指加给药物组合物防止细菌生长的物质，例如洁尔灭或者苯甲醇。

术语″多元醇″指具有多个羟基的任何物质，包括多羟基醇和碳水化合物。多羟基醇包括这样的化合物如山梨糖醇，甘露糖醇和甘油。碳水化合物是可以具有酮基或醛基的环状分子，象例如蔗糖或者海藻糖。

术语″促红细胞生成素″或者″促红细胞生成素蛋白″指具有引起骨髓细胞提高网状细胞和红细胞生产的体内生物活性的蛋白质，并且选自人促红细胞生成素和下面定义的类似物。

术语″聚乙二醇基化促红细胞生成素(Peg-EPO或者PEG-EPO)″指与一种至三种如下所述聚乙二醇(polyethylene)衍生物共价连接的促红细胞生成素蛋白。

术语″装置″指用于特定目的的发明物。在本发明中，该目的是使，支持或者有利于施用液体药物组合物。

附图说明：

图1：人EPO的一级结构(165氨基酸)(SEQ ID NO：1)。

图2：人EPO的一级结构(166氨基酸)(SEQ ID NO：2)。

图3：pH对热稳定性的影响。转变温度对pH作图。

图4：离子强度对热稳定性的影响。转变温度对磷酸根浓度作图。

图5：热稳定性对缓冲物质的依赖性。

图6：说明在低pH(例如pH 6.2)时，硫酸根也是一种合适的缓冲剂/添加剂，而与pH 7.5相比，磷酸根在pH 6.2下较不合适。这表明即使是在低pH时，硫酸根也能保持热稳定性高。

图7：peg-EPO聚集对pH的依赖性。通过SDS-PAGE分析热应力(如上所述)之后的Peg-EPO样品。用银对蛋白质染色。泳道1：分子量标准。泳道2：pH 5。泳道3：pH 5，还原的。泳道4：pH 6。泳道5：pH 6，还原的。泳道6：pH 6.5。泳道7：pH 6.5，还原的。泳道8：pH 7。泳道9：pH 7，还原的。泳道10：peg-EPO，没有应力的。

图8说明1mg/ml乙酰基半胱氨酸作为抗氧化剂防止热应力下聚集物形成的用途。pegEPO在热应力下(20分钟80℃)的聚集作用：泳道1：pH7.5下的pegEPO，没有应力；泳道2：pH 7.5下的pegEPO，有应力；泳道3：pH 6.2下的pegEPO，有应力；泳道4：pH 6.2下的pegEPO，有应力，还原的；泳道5：pH 7.5下的pegEPO，+1mg/ml N-乙酰基-半胱氨酸，应力；泳道6：pH 7.5下的pegEPO，+1mg/ml N-乙酰基-半胱氨酸，应力，还原的。

图9：各种温度下贮存六个月的新配方中peg-EPO样品的唾液酸(NANA)含量。

图10：在10mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3％(w/v)甘露糖醇，pH 6.2中在几个温度下贮存6个月之后，peg-EPO样品的小鼠生物活性测定。

图11：在10mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3％(w/v)甘露糖醇，pH 6.2中贮存6个月的peg-EPO样品的大小排阻色谱覆盖图(底部至顶部：缓冲剂，起始材料，4℃，25℃，30℃和40℃)。

更具体地，本发明涉及含有促红细胞生成素蛋白，在适合将溶液pH保持在大约5.5至大约7.0范围的药学可接受缓冲剂中多电荷无机阴离子，和任选地，一种或多种药学可接受赋形剂的液体药物组合物。

在优选的实施方案中，所述组合物是液体溶液，例如水溶液。在本发明优选的实施方案中，上述药物组合物是等渗溶液。

阴离子优选选自无机强酸的阴离子，例如H₂SO₄，H₃PO₄或者柠檬酸。因此，优选的阴离子选自硫酸根，磷酸根和柠檬酸根，优选硫酸根或磷酸根，并且最优选硫酸根。多电荷无机阴离子的浓度可以自10至200mmol/l变化，例如10至200mmol/l之间的硫酸根阴离子。

本发明所用来保持pH在大约5.5至大约7.0的范围内，优选在5.8至6.7的范围内，更优选在6.0至6.5的范围内，最优选大约pH 6.2的缓冲剂可以是常规有机酸或无机酸缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲剂，精氨酸/H₂SO₄/Na₂SO₄缓冲剂，或者任何其它的药学可接受缓冲剂体系)。在优选的实施方案中，组合物包括磷酸盐或者精氨酸/H₂SO₄/Na₂SO₄缓冲剂，更优选10至50mmol/l磷酸盐缓冲剂。当然，这些缓冲剂体系的组合也是本发明的部分。可以分别使用磷酸盐缓冲体系中相应的碱例如NaOH和精氨酸缓冲体系中相应的酸例如硫酸来调节pH。

本发明的药物组合物可以含有一种或多种药学可接受赋形剂。这些药学可接受赋形剂可以选自药学可接受盐，稀释剂和/或溶剂和/或防腐剂等，例如张度剂(使等渗剂)，多元醇，抗氧化剂或者非离子去污剂。这些物质的例子是氯化钠，氯化钙，山梨糖醇，甘露糖醇，甘油，蔗糖，海藻糖，乙酰半胱氨酸，多乙氧基醚20(polysorbate 20)，多乙氧基醚80(polysorbate 80)，或者pluronic F68。

在本发明优选的实施方案中，药物组合物可以含有选自甘露糖醇，山梨糖醇，甘油，海藻糖和蔗糖的多元醇，优选甘露糖醇的多元醇。多元醇的浓度可以在1和10％(w/v)之间变化。

抗氧化剂的例子是半胱氨酸，蛋氨酸，乙酰半胱氨酸或者抗坏血酸，优选蛋氨酸。通常可以以0.01和0.5％(w/v)之间的浓度加入氧化剂，或者，例如在蛋氨酸的情况下，以1-20mM的浓度加入。

还有，上述组合物可以任选地含有0.01至大约0.9％w/w的使等渗剂。这些化合物是本领域公知的；这些试剂的例子是氯化钠或硫酸钠。在本发明优选的实施方案中，组合物是等渗溶液。上述组合物还可以含有非离子去污剂，象多乙氧基醚20，多乙氧基醚80，或者pluronic F68，优选pluronic F68，例如多达1％(w/v)，更优选多达0.1％(w/v)，例如0.001％至0.01％(w/v)。

上述组合物还可以含有另外的盐，例如多达1mmol/l CaCl₂。

本发明特别用于制备含有促红细胞生成素作为药物活性成分的药物组合物。术语″促红细胞生成素″或者″促红细胞生成素蛋白″或者″EPO″是如下的：特别地，该术语指糖蛋白，例如人促红细胞生成素，例如具有(SEQ IDNO：1)或(SEQ ID NO：2)列出的氨基酸序列或者基本上与其同源的其生物学性质与骨髓中红细胞产生刺激和定向红细胞祖先(committederythroid progenitors)的分裂和分化刺激有关的氨基酸序列。在这里使用时，这些术语包括例如通过定点诱变或者偶然突变故意修饰的这样的蛋白质。这些术语还包括具有1-6个另外的糖基化位点的类似物，在糖蛋白的羧基末端具有至少一个另外的氨基酸的类似物，其中说述另外的氨基酸包括至少一个糖基化位点，和具有包括至少一个糖基化位点重排的氨基酸序列的类似物。这些术语包括天然和重组制备的人促红细胞生成素。

如下面详细说明的，EPO的制备和纯化是本领域公知的。所谓促红细胞生成素产物是指天然的或者重组蛋白产物，优选人的，从任何常规来源获得，例如组织，蛋白质合成，使用天然或者重组细胞的细胞培养。包括具有促红细胞生成素活性的任何蛋白质，例如突变蛋白或者以其它方式的修饰的蛋白质。重组体EPO可以通过重组DNA技术或者通过内源基因激活通过在CHO-，BHK-或者HeLa细胞系中表达来制备。蛋白质的表达，包括，通过内源基因激活，是本领域公知的并且公开于例如美国专利号5,733,761，5,641,670，和5,733,746，和国际专利公开号WO 93/09222，WO 94/12650，WO 95/31560，WO 90/11354，WO 91/06667和WO 91/09955，各专利内容在此引作参考。用于制备促红细胞生成素糖蛋白产物的优选的EPO物种(species)是人EPO物种。更优选地，所述EPO物种是具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2给出的氨基酸序列，更优选氨基酸序列SEQ ID NO：1的人EPO。

此外，促红细胞生成素可以是具有1-6个另外的糖基化位点的糖蛋白类似物。蛋白质的糖基化作用，带有一个或多个寡糖基团，发生在沿着多肽主链的特定位置，并且极大地影响该蛋白质的物理性质例如蛋白质稳定性，分泌，亚细胞定位，和生物活性。糖基化作用通常有两种类型。O-键联的寡糖连接丝氨酸或苏氨酸残基，而N-键联的寡糖连接天冬酰胺残基。在N-键联的和O-键联的寡糖上都发现的一种类型寡糖是N-乙酰神经氨酸(唾液酸)，其是含有9个或多个碳原子的氨基糖家族。唾液酸通常是N-键联的和O-键联的寡糖上的末端残基，并且，因为它带有负电荷，因此赋予糖蛋白以酸性性质。人促红细胞生成素，具有165个氨基酸，具有三条N-键联的和一条O-键联的寡糖链，其占糖蛋白总分子量的大约40％。N-键联的糖基化作用发生在位于24，38，和83位的天冬酰胺残基，而O-键联的糖基化作用发生在位于126位的丝氨酸残基。用末端唾液酸残基修饰寡糖链。从糖基化促红细胞生成素酶去除所有的唾液酸残基导致体内活性损失，但是体外活性不损失，因为促红细胞生成素的唾液酸化防止其结合和接着的肝结合蛋白对其的清除。

术语本发明的药学组合物″促红细胞生成素″包括人促红细胞生成素的氨基酸序列中有一处或多处导致唾液酸连接位点数增加的变化的人促红细胞生成素类似物。这些糖蛋白类似物可以通过定点诱变添加，缺失或者取代氨基酸残基增加或改变糖基化可利用的位点来产生。通过添加不扰乱生物活性所必需的二级或三级构象的糖基化位点来产生唾液酸水平高于在人促红细胞生成素中发现的那些的糖蛋白类似物。本发明的糖蛋白还包括在通常涉及在紧接近N-键联或者O-键联位点一个或多个氨基酸取代的糖基化位点有增加水平的糖连接的类似物。本发明的糖蛋白还包括具有从促红细胞生成素的羧基末端延伸的一个或多个氨基酸并且提供至少一个另外的糖基位点的类似物。本组合物的促红细胞生成素蛋白还包括具有包括至少一个糖基化位点重排的氨基酸序列的类似物。这样的糖基化位点重排涉及人促红细胞生成素中一个或多个糖基化位点的缺失和一个或多个非天然存在的糖基化位点的添加。促红细胞生成素上糖链的数目增加，以及因此每个促红细胞生成素分子的唾液酸数目可以带来有利性质，例如提高的溶解性，对蛋白水解的更大的抗性，降低的免疫原性，提高的血清半寿期，和提高的生物活性。具有另外的糖基化位点的促红细胞生成素类似物更详细地公开于欧洲专利申请640 619，Elliot 1995年3月1日公开。

在优选的实施方案中，本发明的药物组合物含有具有包括至少一个另外的糖基化位点的氨基酸序列的促红细胞生成素蛋白，例如但不限于包括经选自下面的修饰修饰的人促红细胞生成素序列的促红细胞生成素：

Asn³⁰Thr³²；

Asn⁵¹Thr⁵³，

Asn⁵⁷Thr⁵⁹；

Asn⁶⁹；

Asn⁶⁹Thr⁷¹；

Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹；

Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰；

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰；

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰；

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹²；

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²；

Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰；

Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰；

Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹；

Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹；

Asn¹³⁶Thr¹³⁸；

Asn¹³⁸Thr¹¹⁰；

Thr¹²⁵，和

Pro¹²⁴Thr¹²⁵。

这里对于氨基酸序列的修饰使用的标注指上角标数指示的相应的没有修饰的蛋白质(例如SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：2的hEPO)的位置改变为各个上角标数前面的氨基酸。

促红细胞生成素蛋白产物还可以在糖蛋白的羧基末端具有至少一个另外的氨基酸，其中该另外的氨基酸包括至少一个糖基化位点的类似物。该另外的氨基酸可以包括从人绒毛膜促性腺激素的羧基末端衍生的肽片段。优选地，该糖蛋白是选自下面的类似物：(a)具有从羧基末端延伸的氨基酸序列，Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro SerArg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro IIe Leu Pro Gln(SEQ ID NO：3)的人促红细胞生成素；(b)进一步包括Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO的(a)中的类似物和(c)进一步包括Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO的(a)中的类似物。

促红细胞生成素蛋白质还可以是具有包括至少一个糖基化位点重排的氨基酸序列的类似物。重排可以包括人促红细胞生成素中N-键联的任何糖基位点的缺失和人促红细胞生成素的氨基酸序列的88位的N-键联的糖基位点的添加。优选地，所述糖蛋白是选自Gln²⁴Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO；Gln³⁸Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO；和Gln⁸³Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO的类似物。

更特别地，如上所述本发明药物组合物的促红细胞生成素蛋白还可以包括其聚乙二醇化(pegylated)的衍生物。促红细胞生成素的聚乙二醇化的衍生物及其制备是本领域公知的并且描述于例如EP-A-539,167，EP-A-605,963，WO 93/25212，WO 94/20069，WO 95/11924，U.S.Pat.No.5,56，EP-A-584,876，WO 92/16555，WO 94/28024，WO 97/04796，美国专利5,359,030和5,681,811，美国专利4,179,337，日本专利，WO 98/32466，美国专利5,324,650。聚乙二醇化促红细胞生成素物种的一个优选的实施方案涉及下面描述的衍生物。

因此，本发明还涉及促红细胞生成素缀合物(conjugate)，所述缀合物包含如上所述的具有至少一个游离氨基并且具有引起骨髓细胞增加网状细胞和红细胞的产生的体内生物活性的促红细胞生成素蛋白并且选自人促红细胞生成素和具有通过加入1-6个糖基化位点或者重排至少一个糖基化位点而修饰的人促红细胞生成素序列的其类似物；所述促红细胞生成素共价连接于式-CO-(CH₂)x-(OCH₂CH₂)m-OR的“n”聚(乙二醇)基，各聚(乙二醇)基的-CO(即羰基)与所述氨基中的一个形成酰胺键；其中R是低级烷基；x是2或3；m是大约450至大约900；n是1至3；并且选择n和m，使得减去促红细胞生成素糖蛋白的缀合物的分子量从20千道尔顿到100千道尔顿。本发明进一步提供含有这里所述缀合物的药物组合物，其中n是1的缀合物的百分比至少是组合物中所有缀合物的90％，优选至少92％，更优选96％。

更具体地，上述缀合物可以用式(I)表示：

P-[NHCO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR]_n (I)

其中P是这里所述促红细胞生成素蛋白的残基，(即没有与式(I)中所示羰基形成酰胺键的氨基)，具有引起骨髓细胞增加网状细胞和红细胞的产生的体内生物活性；并且其中R是低级烷基；x是2或3；m是大约450至大约900；n是1至3；并且选择n和m，使得减去促红细胞生成素糖蛋白的缀合物的分子量从20千道尔顿到100千道尔顿。

如这里使用的，″低级烷基″指具有1-6个碳原子的直链或支链烷基。低级烷基的例子包括甲基，乙基和异丙基。根据本发明，R是低级烷基。其中R是甲基的缀合物是优选的。

符号″m″代表聚(环氧乙烷)基中环氧乙烷残基(OCH₂CH₂)的数目。环氧乙烷的一个PEG(聚乙二醇)亚基具有大约44千道尔顿的分子量。因此，缀合物的分子量(不包括EPO的分子量)取决于″m″数。在本发明的缀合物中，″m″是从大约450至大约900(相应于大约20kDa至大约40kDa的分子量)，优选是大约650至大约750(相应于大约30kDa的分子量)。选择数值m，使得得到的本发明缀合物具有可与未修饰EPO相比的生理活性，其活性可以代表与未修饰的EPO的相应活性相同，或者比其大，或者是其的一部分。“大约”某一数值的分子量是指根据常规分析技术测定的，其在某一数值的合理范围内。选择数值″m″使得与促红细胞生成素糖蛋白共价连接的各个聚(乙二醇)基团的分子量是大约20kDa至大约40kDa，并且优选是大约30kDa。

在本发明的缀合物中，数值″n″是通过酰胺键与促红细胞生成素蛋白的自由氨基(包括赖氨酸的ε-氨基和/或氨基末端氨基)共价键合的聚(乙二醇)基团的数目。本发明的缀合物对于每个EPO分子可以具有一个，两个或者三个PEG基团。″n″是1-3的整数，优选″n″是1或2，更优选″n″是1。上述缀合物中优选的缀合物包括其中x是2，m是650-750，n是1并且R是甲基的化合物。

式(I)的化合物可以通过使式II的化合物与促红细胞生成素糖蛋白缩合而从已知的聚合物材料制备：

其中R和m如上所述。其中x是3的式(II)的化合物是α-低级烷氧基，聚(乙二醇)的丁酸琥珀酰亚胺酯(低级烷氧基-PEG-SBA)。其中x是2的式(II)的化合物是α-低级烷氧基，聚(乙二醇)丙酸琥珀酰亚胺酯(低级烷氧基-PEG-SPA)。可以使用活化酯与胺反应生成酰胺的任何常规方法。在上述反应中，例举的琥珀酰亚胺酯是引起酰胺形成的离去基团。使用琥珀酰亚胺酯例如式(II)的化合物产生和蛋白质的偶联物描述于美国专利No.5,672,662，1997年9月30日颁发(Harris，等)。

人EPO包含9个自由氨基，氨基-末端氨基加8个赖氨酸残基的ε-氨基。当聚乙二醇化试剂与式(II)的SBA化合物化合时，发现在pH 7.5，蛋白质∶PEG之比是1∶3，反应温度是20-25℃，产生一-，二-和痕量三-聚乙二醇化物种的混合物。当聚乙二醇化试剂是式(II)的SPA化合物时，采用类似条件，除了蛋白质∶PEG之比是1∶2，主要产生一-聚乙二醇化物种。聚乙二醇化EPO可以作为混合物或者作为离子交换色谱分离的不同的聚乙二醇化物种加以施用。通过操作反应条件(例如，试剂比例，pH，温度，蛋白质浓度，反应时间等)，不同聚乙二醇化物种的相对量可以变化。

如上所述的药物组合物还可以含有如上定义的具有至少一个游离氨基并且具有引起骨髓细胞增加网状细胞和红细胞的产生的体内生物活性的促红细胞生成素蛋白并且选自人促红细胞生成素和具有通过加入1-6个糖基化位点而修饰的人促红细胞生成素一级结构的其类似物；所述糖蛋白被共价连接到一至三个低级烷氧基聚(乙二醇)基团，各聚(乙二醇)基团通过式-C(O)-X-S-Y-的接头与糖蛋白共价连接，所述接头的C(O)与所述氨基中的一个形成酰胺键，X是-(CH₂)_k-或者-CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-，k是1-10，Y是

或者

各个聚(乙二醇)部分的平均分子量是大约20千道尔顿至大约40千道尔顿，缀合物的分子量是大约51千道尔顿至大约175千道尔顿。

这种促红细胞生成素物种还可以用式(III)表示

P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH₂CH₂)_m-OR]_n (III)

其中R可以是任何低级烷基，意思是指具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基，乙基，异丙基等。优选的烷基是甲基。X可以是-(CH₂)_k-或者-CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-，其中k是1至大约10。优选地，k是1至大约4，更优选，k是1或2。更优选，X是-(CH₂)。

在式1中，Y是

或

优选地

或者

更优选地

在式(III)中，选择数值m使得得到的式(III)缀合物具有可与未修饰EPO相比较的生理活性，其活性可以代表与未修饰的EPO的相应活性相同，或者比其大，或者是其的一部分。m代表PEG单元中环氧乙烷残基的数目。-(OCH₂CH₂)-的一个PEG亚基具有大约44道尔顿的分子量。因此，缀合物的分子量(不包括EPO的分子量)取决于m数值。″大约″某一数值的分子量指它在通过常规分析技术测定的那个数值的合理范围内。m是大约450至大约900的整数(相应于20至40kDa的分子量)，优选m是大约550至大约800(大约24至35kDa)，最优选m是大约650至大约700(大约29至大约31kDa)。

在式(III)中，数值n是通过酰胺键与PEG单元共价结合的促红细胞生成素蛋白中赖氨酸氨基酸的ε-氨基的数目。本发明的缀合物对于每个EPO分子可以含有一个，两个，或者三个PEG单元。n是1-3的整数，优选n是1或2，并且更优选n是1。

下式代表式(III)优选的促红细胞生成素蛋白：

和

下式代表更优选的促红细胞生成素糖蛋白产物：

其中在上述结构式中，n是1-3的整数；m是450-900的整数；R是低级烷基；X是-(CH₂)_k-或者-CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-，并且P是没有与X形成酰胺键的一个或者多个氨基基团的促红细胞生成素糖蛋白的残基。

下式代表另一个优选的促红细胞生成素糖蛋白产物：

和

下式代表更优选的促红细胞生成素糖蛋白产物：

这些促红细胞生成素蛋白可以通过下述制备：

(a)式P-[NH₂]_n代表的促红细胞生成素蛋白的赖氨酸的ε-氨基与式Z-CO-X-S-Q代表的双官能试剂共价反应，生成下式代表的具有酰胺键的中间体：

P-[NH-CO-X-S-Q]_n

其中P是没有形成酰胺键的氨基的促红细胞生成素蛋白；n是1-3的整数；Z是反应基团，例如羧酸(carboxylic)-NHS酯；X是-(CH₂)_k-或者-CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-，其中k是1至大约10；而Q是保护基团，象烷酰基，例如乙酰基。

(b)来自步骤(a)的具有酰胺键的中间体与式W-[OCH₂CH₂]_m-OR代表的活化聚(乙二醇)衍生物共价反应，生成下式代表的促红细胞生成素糖蛋白产物：

其中W是Y的巯基反应形式；m是大约450至大约900的整数；R是低级烷基；而Y如上定义。

在该实施方案中，双官能团试剂优选是N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代丙酸酯或者N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯，Z优选是N-羟基-琥珀酰亚胺，而活化的聚(乙二醇)衍生物W-[OCH₂CH₂]_m-OR优选选自碘-乙酰基-甲氧基-PEG，甲氧基-PEG-乙烯砜，和甲氧基-PEG-马来酰亚胺。

更详细地说，式(III)的促红细胞生成素蛋白可以通过巯基与EPO共价连接(“活化作用”)并且将得到的活化的EPO与聚(乙二醇)(PEG)衍生物反应来制备。根据本发明的制备聚乙二醇化EPO的第一步骤包括通过EPO的NH₂-基团共价连接巯基基团。使用双官能试剂进行EPO的活化作用，所述双官能试剂带有保护的巯基和另外的反应基团，例如分别是活性酯(例如琥珀酰亚胺酯)，酸酐，磺酸酯，羧酸和磺酸的卤化物。用本领域公知的基团例如乙酰基保护巯基。这些双官能试剂能通过形成酰胺键而与赖氨酸的ξ-氨基反应。下面给出该反应的第一步：

EPO，n和X如上定义并且Z是本领域公知的反应基团，例如下式的N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)取代基

在优选的实施方案中，通过与带有琥珀酰亚胺基的双官能试剂反应进行ε-氨基赖氨酸基团的活化作用。双官能试剂可以带有不同的间隔基团，例如-(CH₂)_k-或者-CH₂-(O-CH₂-CH₂-)_k-基团，其中k是1至大约10，优选1至大约4，更优选1或2，最优选1。这些试剂的例子是N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代丙酸酯(SATP)和N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯(SATA)

乙酰基硫烷基-羧酸-NHS-酯，象

或

2-(乙酰基硫)-(乙氧基)_k-乙酸-NHS-酯

其中k如上定义。

双官能试剂的制备是本领域公知的。2-(乙酰基硫)-(乙氧基)_k-乙酸-NHS-酯的母体公开于DE-3924705，而March，J.，Advanced OrganicChemistry，McGraw-Hill，1977，375-376描述了生成乙酰基硫基化合物的衍生化作用。SATA是商业上可获得的(Molecular Probes，Eugene，OR，USA和Pierce，Rockford，Ill.)。

通过调节反应参数例如蛋白质(EPO)浓度和蛋白质/双官能试剂比例可以选择加给EPO分子的巯基数目。优选地，通过每个EPO分子共价连接1-5个巯基来活化EPO，更优选每个EPO分子共价连接1.5-3个巯基。这些范围指巯基对EPO蛋白质总体的统计学分布。

例如在pH 6.5-8.0的缓冲水溶液中，例如在10mM磷酸钾，50mM NaCl，pH 7.3中进行反应。可以在DMSO中加入双官能试剂。反应完全后，优选30分钟之后，通过加入赖氨酸来中止反应。通过本领域公知的方法例如通过透析和柱过滤可以分离过量的双官能试剂。通过例如Grasetti，D.R.和Murray，J.F.在J.Appl.Biochem.Biotechnol.119，41-49(1967)中描述的光测定方法能够测定加给EPO的巯基的平均数。

上述反应之后，共价偶联活化的聚(乙二醇)(PEG)衍生物。合适的PEG衍生物是具有大约20至大约40kDa平均分子量的活化的PEG分子，更优选大约24至大约35kDa，最优选大约30kDa。

活化的PEG衍生物是本领域公知的，并且对于PEG-乙烯砜描述于例如Morpurgo，M.等J.Bioconj.Chem.(1996)7，363页ff。直链和支链PEG物种适合制备式1的化合物。活性PEG试剂的例子是碘-乙酰基-甲氧基-PEG和甲氧基-PEG-乙烯砜：

或

这些碘-活化的物质是本领域公知的，并且描述于例如Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego(1996)p.147-148。

更优选地，使用(烷氧基-PEG-马来酰亚胺)，例如甲氧基-PEG-马来酰亚胺(MW 30000；Shearwater Polymers，Inc.)通过马来酰亚胺活化PEG物种。烷氧基-PEG-马来酰亚胺的结构如下：

或

R和m如上定义，优选地

在缓冲水溶液例如10mM磷酸钾，50mM NaCl，2mM EDTA，pH 6.2中原位裂解巯基保护基之后发生与烷氧基-PEG-马来酰亚胺的偶联反应。例如在25℃下在DMSO，pH 6.2中用羟基胺进行保护基团的裂解大约90分钟。对于PEG修饰，活化EPO/烷氧基-PEG-马来酰亚胺的摩尔之比应该是大约1∶3至大约1∶6，优选1∶4。通过加入半胱氨酸和使残留的巯基(-SH)与N-甲基马来酰亚胺或者能够形成二硫键的其他合适的化合物反应可以中止反应。因为所有残留的活化的巯基与保护基团例如N-甲基马来酰亚胺或者其他合适的保护基团反应，本发明缀合物中的EPO糖蛋白可以含有这样的保护基团。一般情况下，这里描述的方法将产生不同保护基团数保护的不同巯基数的分子的混合物，取决于不与PEG-马来酰亚胺偶联的糖蛋白上的活化巯基的数目。

而N-甲基马来酰亚胺在用来封闭(block)聚乙二醇化蛋白质上的残留巯基时形成相同类型的共价键，二硫化合物将导致分子内硫化物/二硫化物互换反应导致封闭试剂的二硫键偶联。对于那种类型的封闭反应优选的封闭试剂是氧化谷胱甘肽(GSSG)，半胱氨酸和胱胺。而半胱氨酸没有带给聚乙二醇化蛋白质另外的净电荷，使用封闭试剂GSSG或者胱胺导致另外的负电荷或正电荷。

通过本领域公知的方法例如柱层析可以对式(III)的化合物的进一步纯化，包括一-，二-和三-聚乙二醇化EPO物种的分离。

含有聚乙二醇化促红细胞生成素衍生物的组合物优选含有至少90％的一-PEG缀合物，即其中n是1，可以根据实施例5所示制备。通常，促红细胞生成素糖蛋白的一-PEG缀合物是期望的，因为它们趋向于具有比二-PEG缀合物更大的活性。通过将洗脱峰附近的更宽级分合并可以控制一-PEG缀合物的百分比以及一-和二-PEG物种的比例来降低一-PEG在该组合物中的百分比或者合并洗脱峰附近的更窄级分来增加组合物中一-PEG的百分比。大约90％一-PEG缀合物是产率和活性的好的平衡。有时期望其中例如至少92％或者至少96％的缀合物是一-PEG物质(n等于1)的组合物。在本发明的实施方案中，其中n是1的缀合物百分比是90％至96％。

根据本发明的组合物如上所述每毫升可以含有10-10000微克的促红细胞生成素蛋白。优选地，该组合物含有每毫升10-1000微克，例如10，50，100，400，800或者2500微克/毫升。

此外，根据本发明的组合物可以含有每毫升10-10000微克的促红细胞生成素蛋白，10-200mmol/l硫酸盐，10-50mmol/l磷酸盐，pH 6.0-6.5。该组合物还可以含有多达20mM甲硫氨酸，1-5％的多元醇(w/v)，多达0.1％pluronic F68(w/v)和任选的多达1mM CaCl₂。该组合物的一个例子含有每毫升10-10000微克的促红细胞生成素蛋白，40mmol/l硫酸盐，10mmol/l磷酸盐，3％甘露糖醇(w/v)，10mM甲硫氨酸，0.01％pluronic F68(w/v)，pH 6.2。

在本发明另一个实施方案中，组合物可以含有每毫升10-10000微克的促红细胞生成素蛋白，10-100mmol/l NaCl，10-50mmol/l磷酸盐pH 6.0-7.0，任选的1-5％(w/v)多元醇。此外，该组合物可以含有多达20mM甲硫氨酸，多达0.1％pluronic F68(w/v)和任选的7.5mmol/l CaCl₂。具体地说，该组合物可以含有每毫升10-10000微克的促红细胞生成素蛋白，100mmol/l NaCl，10mM甲硫氨酸，0.01％pluronicF68(w/v)，和10mmol/l磷酸盐，pH 7.0。

本发明还涉及上述含有10-10000微克/ml的促红细胞生成素蛋白，10-50mmol/l精氨酸，pH 6-pH 6.5，10-100mmol/l硫酸钠的组合物。另外，该组合物可以含有多达20mM甲硫氨酸，多达0.1％pluronic F68(w/v)，任选的多达1mmol/l CaCl₂和任选的1-5％(w/v)多元醇。具体地说，该组合物可以含有每毫升10-10000微克的促红细胞生成素蛋白，40mmol/l精氨酸，pH 6.2，30mmol/l硫酸钠，3％甘露糖醇(w/v)，10mM甲硫氨酸，0.01％pluronic F68(w/v)和任选的1mmol/lCaCl₂。

本发明优选的实施方案涉及含有10-10000微克/毫升促红细胞生成素，优选25-2,500微克/毫升促红细胞生成素，和

a)10mM磷酸钠/磷酸钾，100mM NaCl，pH 7.0或者

b)10mM磷酸钠，120mM硫酸钠，pH 6.2或者

c)10mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3％甘露糖醇(w/v)，pH 6.2或者

d)10mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3％甘露糖醇(w/v)，10mM甲硫氨酸，0.01％ pluronic F68(w/v)，pH 6.2或者

e)40mM精氨酸，30mM硫酸钠，3％甘露糖醇(w/v)，pH 6.2或者

f)40mM精氨酸，30mM硫酸钠，3％甘露糖醇(w/v)，10mM甲硫氨酸，0.01％ pluronic F68(w/v)，pH 6.2。

在最优选的实施方案中，组合物含有50，100，400，800或2,500微克/毫升量的促红细胞生成素蛋白。最优选的组合物含有10mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3％甘露糖醇(w/v)，10mM甲硫氨酸，0.01％pluronic F68(w/v)，pH 6.2或者40mM精氨酸，30mM硫酸钠，3％甘露糖醇(w/v)，10mM甲硫氨酸，0.01％pluronic F68(w/v)，pH 6.2。

本发明组合物的可以是喷雾干燥粉末形式。

此外本发明涉及组合物，其是如上所述的水溶液的冻干物或者喷雾干燥粉末。冻干物或者喷雾干燥组合物可以通过加入溶剂例如水重新配制形成液体溶液或者通过例如吸入装置或透皮施用装置直接施用。

本发明还涉及制备如上所述组合物的方法，包括混合促红细胞生成素蛋白和含有带多个负电荷阴离子的溶液和任选的如上所述一种或多种药学可接受赋形剂。

另外，本发明涉及如上所述组合物制备用于治疗和预防与慢性肾衰竭患者(CRF)和艾滋病中的贫血相关的疾病和/或治疗接受化学治疗的癌症患者的药物的用途。这包括治疗和预防与慢性肾衰竭患者(CRF)，艾滋病和接受化学治疗的癌症患者中的贫血相关的疾病的方法，包括对患者施用如上所述组合物的步骤。

本发明的另一个实施方案涉及用于局部和全身缓释的含有如上所述组合物的装置。这可以是包括上述组合物的提供促红细胞生成素的控制释放的任何类型的植入剂，象例如以聚合物为基础的微米-或纳米颗粒。也可以以预先装入的注射器或者任何其它施用装置例如没有针头的注射装置或者吸入装置提供上述组合物。

本发明的组合物可以以用于可注射或者静脉内施用的单位剂量存在。另一方面，本发明的组合物可以以液体或者固体的形式贮然后分成单位剂量形式用于静脉内或者可注射施用。因此本发明的液体组合物可以以0.3毫升这样少存在用作施用的单位剂量形式。另一方面，在分装成剂量形式之前贮存时，要求的组合物的体积可以象60升这样大。从其增强的稳定性来看，本发明的组合物可以在大容器中贮存随后包装到适合分布给医生，患者和医院的包装器具中。

本发明可注射溶液可以通过注射器这样的常规注射方式施用，其一般作为单位剂量施用0.3毫升至20毫升这种组合物。另一方面，本发明的组合物可以通过注射使用安瓿施用，安瓿含有随后在注射之前以常规方法重新配制的冻干物或者喷雾干燥粉末的这种组合物。另一方面，由于本发明的组合物的稳定性，组合物可以分装成单位剂量形式，例如含有大约0.3毫升至大约10毫升这种组合物的小瓶。另外，本发明的组合物可以使用静脉包静脉内施用。这些包含有大约20毫升至大约500毫升这种溶液，取决于要对患者施用这种溶液的时间。根据本发明，本发明的液体溶液可以在贮存器中贮存，从该容器进一步分装成小剂量包装形式分发给医生，医院和患者。由于本发明的组合物的稳定性，在施用之前这些组合物可以长时间贮存在这样的贮存器中。

作为如上所述组合物的成分或者作为用于制备如上所述促红细胞生成素衍生物的起点的促红细胞生成素的制备详细描述于例如美国专利5,547,933和5,621,080，EP-B 0 148 605，Huang，S.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)2708-2712，EP-B 0 205 564，EP-B 0 209 539和EP-B 0 411 678以及Lai，P.H.等，J.Biol.Chem.261(1986)3116-3121，an Sasaki，H.等，J.Biol.Chem.262(1987)12059-12076。通过重组方法可以制备用于治疗应用的促红细胞生成素(EP-B 0 148 605，EP-B 0209 539和Egrie，J.C.，Strickland，T.W.，Lane，J.等(1986)Immunobiol.72：213-224)。

在无血清培养基中表达和制备促红细胞生成素的方法描述于例如WO96/35718，Burg 1996年11月14日公开，和欧洲专利公开No.513 738，Koch 1992年6月12日公开。除了上述提到的公开物之外，已知可以进行包含EPO基因的重组CHO细胞的无血清发酵。这样的方法描述于例如EP-A 0 513 738，EP-A 0 267 678，并且一般性描述于Kawamoto，T.等，Analytical Biochem.130(1983)445-453，EP-A 0 248 656，Kowar，J.和Franek，F.，Methods in Enzymology 421(1986)277-292，Bavister，B.，Expcology 271(1981)45-51，EP-A 0 481 791，EP-A 0 307 247，EP-A0 343 635，WO 88/00967。

在EP-A 0 267 678中，对于在无血清培养物中产生的透析之后的EPO纯化描述了S-琼脂糖上的离子交换色谱，C8柱上制备反相HPLC和凝胶过滤色谱。与此相关，可以用S-琼脂糖快速流动的离子交换色谱代替凝胶过滤色谱步骤。也提出过在离子交换色谱之前进行Blue Trisacryl柱上染料色谱。

Nobuo，I.等，J.Biochem.107(1990)352-359描述了重组EPO的纯化方法。但是在该方法中，在纯化步骤之前，用Tween^20，苯基甲基磺酰氟，乙基马来酰亚胺，胃蛋白酶抑制剂A，硫酸铜和草氨酸的溶液处理EPO。公开文献，包括WO 96/35718，Burg 1996年11月14日公开，公开了用无血清发酵方法制备促红细胞生成素的方法(EPOsf)。

通过本领域公知的各种测试方法可以测定根据本发明的EPO或EPO缀合物的比活。本发明经纯化的EPO蛋白质的生物活性如此，通过对人患者注射施用EPO蛋白质导致与没有注射或者对照组受试者相比骨髓细胞增加网状细胞和红细胞的产生。通过根据Annable，等，Bull.Wld.Hlth.Org.(1972)47：99-112和Pharm.Europa Spec.Issue Erythropoietin BRPBio 1997(2)的方法可以测试根据本发明获得和纯化的EPO蛋白质或者其片段的生物活性。测定EPO蛋白质活性的另一种生物测试，normocythaemic小鼠测试，描述于实施例6。

通过参考下面的实施例将更好地理解本发明，实施例详细说明本发明但是不限制所述本发明。

实施例

实施例1：人EPO的发酵和纯化

a)接种物制备和发酵

从液氮贮存罐的气相取出一小瓶工作细胞库，来自EPO-产生CHO细胞系(可以使用ATCC CRL8695，公开于EP 411 678(GeneticsInstitute))。将细胞转移到玻璃锥形瓶中并且在潮湿的CO₂恒温箱中在碳酸氢盐缓冲培养基中培养。用于接种物制备和发酵的典型无血清培养基公开于欧洲专利申请513 738，Koch 1992年6月12日公开，或者WO96/35718，Burg 1996年11月14日公开，例如含有培养基DMEM/F12(例如JRH Biosciences/Hazleton Biologics，Denver，US，顺序号57-736)和另外的碳酸氢钠，L+谷氨酰胺，D+葡萄糖，重组胰岛素，亚硒酸钠，二氨基丁烷，氢化可的松，硫酸铁(II)，天冬酰胺，天冬氨酸，丝氨酸和用于哺乳动物细胞的稳定剂，例如聚乙烯醇，甲基纤维素，葡聚糖，聚(乙二醇)，Pluronic F68，血浆扩张剂polygelin(HEMACCEL^(R))或者聚乙稀吡咯烷酮(WO 96/35718)。

对培养物显微镜检查没有污染的微生物，并且测定细胞密度。在各分解步骤进行这些测试。

最初的生长期之后，用新鲜培养基稀释细胞培养物开始细胞密度和经历另一个生长周期。重复该程序直到获得每个玻璃锥形瓶的培养物体积大约2升。大约重复12次，可获得1-5升该培养物，其然后用作10升接种物发酵器的接种物。

3-5天之后，10升发酵器中的培养物被用作100升接种物发酵器的接种物。

另外培养3-5天之后，100升发酵器中的培养物被用作1000升生产发酵器的接种物。

b)收获和细胞分离

使用间歇式再加料方法，即但达到期望的细胞密度时，收获大约80％的培养物。用新鲜培养基再次充满残留的培养物，并且在下次收获之前培养。一个生产周期由最多10次连续收获：9部分收获和发酵最后一次总收获组成。每3-4天进行收获。

将测定的收获体积转移到冷却的容器中。通过离心或者过滤取出细胞并且去除。排列过滤含有离心步骤上清液的EPO并且收集在第二个冷却的容器中。纯化期间分开进行各次收获。

纯化EPO-蛋白质的典型方法公开于WO 96/35718，Burg 1996年11月14日公开。下面解释纯化方法。

a)蓝色琼脂糖凝胶层析

蓝色琼脂糖凝胶(Blue Sepharose)(Pharmacia)由琼脂糖凝胶小球组成，其表面共价键合Cibacron蓝色染料。因为EPO比大多数非蛋白质污染物，一些蛋白质杂质和PVA更强地结合蓝色琼脂糖凝胶，在该步骤中能富集EPO。通过提高盐浓度及pH对蓝色琼脂糖凝胶柱进行洗脱。

柱子中装有80-100升用NaOH再生并且用平衡缓冲液(氯化钠/钙和乙酸钠)平衡过的蓝色琼脂糖凝胶。加载酸化并且过滤的发酵器上清液。加载完全之后，用和平衡缓冲液类似的含有更高浓度的氯化钠的缓冲液第一次冲洗柱子并且连续用Tris-基缓冲液冲洗。用Tris-基缓冲液洗脱产物并且根据总洗脱曲线收集在一个级分中。

b)丁基Toyopearl层析

丁基Toyopearl(Butyl Toyopearl)650 C(Toso Haas)是共价偶联脂肪族丁基残基的聚苯乙烯基基质。因为EPO比大多数杂质和PVA更强地结合这种凝胶，用含有异丙醇的缓冲剂将其洗脱。

柱子中装有30-40升用NaOH再生并且用Tris-基缓冲液冲洗过并且用含有异丙醇的Tris-基缓冲液平衡过的丁基Toyopearl 650 C。

将蓝色琼脂糖凝胶洗出物调节至柱平衡缓冲剂中异丙醇的浓度并且加载到柱子上。然后用具有提高的异丙醇浓度的平衡缓冲液冲洗柱子。用洗脱缓冲剂(具有高异丙醇含量的Tris-基缓冲剂)洗脱产物并且根据总洗脱曲线收集在一个级分中。

c)羟基磷灰石超凝胶层析

羟基磷灰石超凝胶(Hydroxyapatite Ultrogel)(Biosepra)由羟基磷灰石组成，其掺入到琼脂糖基质中改善机械性能。EPO对羟基磷灰石具有低亲和力，因此可以在比蛋白质杂质低的磷酸盐浓度下被洗出。

柱子中装有30-40升羟基磷灰石并且用磷酸钾/氯化钙缓冲剂和NaOH再生，并且接着用Tris-基缓冲液再生。然后用含有低含量异丙醇和氯化钠的Tris-基缓冲液平衡。

将含有EPO的丁基T oyopearl层析洗出物加载到柱子上。然后用平衡缓冲液和没有异丙醇和氯化钠的Tris-基缓冲液冲洗柱子。用含有低浓度磷酸钾的Tris-基缓冲液洗脱产物，并且根据总洗脱曲线收集在一个级分中。

d)Vydac C4上反相HPLC

RP-HPLC材料Vydac C4(Vydac)由硅胶颗粒组成，其表面带有C4-烷基链。从蛋白质杂质分离EPO以疏水性相互作用强度差异为基础。用稀释的三氟乙酸中乙腈梯度进行洗脱

使用不锈钢柱进行制备HPLC(装有2.8-3.2升Vydac C4硅胶)。通过加入三氟乙酸将羟基磷灰石超凝胶洗出物酸化并且加载到Vydac C4柱子上。对于冲洗和洗脱，使用稀释的三氟乙酸中乙腈梯度。收级分并且立即用磷酸盐缓冲剂中和。合并IPC限度内的EPO级分。

e)DEAE琼脂糖凝胶层析

DEAE琼脂糖凝胶(Pharmacia)材料由与琼脂糖凝胶小球表面共价连接的二乙基氨基乙基(DEAE)-基团组成。离子相互作用介导EPO与DEAE基团的结合。乙腈和三氟乙酸通过柱子不滞留。将这些物质洗出之后，通过用低pH的乙酸盐缓冲剂冲洗柱子去除痕量杂质。然后用中性磷酸盐缓冲剂冲洗柱子并且用增强离子强度的缓冲剂洗脱EPO。

柱子装有DEAE琼脂糖凝胶快速流。调节柱体积保证以3-10mg EPO/ml凝胶范围加载EPO。用水和平衡缓冲剂(磷酸钠/钾)冲洗柱子。加载HPLC洗出物的合并级分并且用平衡缓冲剂冲洗。然后用冲洗缓冲剂(乙酸钠缓冲剂)冲洗柱子接着用平衡缓冲剂冲洗。接着，用洗脱缓冲剂(氯化钠，磷酸钠/钾)将EPO从柱子中洗脱出来，并且根据总洗脱曲线收集在一个级分中。

将DEAE琼脂糖凝胶柱的洗出物调节至规定的导电率。得到的药物物质无菌过滤到聚四氟乙烯瓶中并且在-70℃下贮存。

实施例2：使用mPEG-SBA对EPO聚乙二醇化

根据分析方法测定，根据实施例1无血清方法纯化的EPO(EPOsf)是均匀的，并且表明由8个同种型组成的典型同种型模式。根据normocythaemic小鼠测试，其具有190,000IU/mg的比生物活性。使用的聚乙二醇化试剂是甲氧基-PEG-SBA，其是式II的化合物，其中R是甲基；x是3；并且m是650-750(平均大约680，相当于大约30kDa平均分子量)。

聚乙二醇化反应

向100毫克EPOsf(9.71ml的10.3mg/ml EPOsf原液，5.48微摩尔)加入含有506mg的30kDa甲氧基-PEG-SBA(16.5微摩尔)(得自Shearwater Polymers，Inc.，Huntsville，Ala.)的10ml的0.1M磷酸钾缓冲剂，pH，7.5，并且在室温下(20-23℃)混合2小时。最终蛋白质浓度是5mg/ml并且蛋白质∶PEG试剂之比是1∶3。2个小时之后，通过用冰醋酸调节pH至4.5终止反应，并且在-20℃贮存，以备纯化。

纯化

1.缀合物混合物：向AMICON玻璃柱(2.2×7.5cm)装入大约28ml的SP-SEPHAROSE FF(磺-丙基阳离子交换树脂，并且用20mM乙酸盐缓冲剂pH，4.5以150ml/h的流速平衡。用平衡缓冲液将含有30mg蛋白质的6毫升反应混合物稀释5倍并且加到柱子上。用缓冲剂洗出没有吸附的物质，并且用平衡缓冲液中0.175M NaCl从柱子上洗出吸附的PEG缀合物混合物。用750mM NaCl洗出依然保留在柱子上的没有修饰的EPOsf。柱子在起始缓冲剂中再平衡。通过SDS-PAGE分析样品，并且测定它们聚乙二醇化程度。发现0.175M NaCl洗出物含有一-和二-和痕量三-聚乙二醇化物质，而750mM NaCl洗出物含有没有修饰的EPOsf。

2.二-PEG和一-PEG-EPOsf：用缓冲剂将从前一步骤的柱子中洗出的纯化的缀合物混合物稀释4-倍，并且再加载到柱子上并且如所述的冲洗。分别用0.1M NaCl和0.175M NaCl从柱子上分别洗出二-PEG-EPOsf和一-PEG-EPOsf。还用750mM NaCl进行洗脱洗出所有的残留的没有修饰的EPOsf。

或者，用乙酸盐缓冲剂将反应混合物稀释5-倍，并且施加到SP-琼脂糖凝胶柱上(0.5mg蛋白质/ml凝胶)。冲洗柱子，并且根据前面部分中描述的洗出吸附的一-PEG-EPOsf，二-PEG-EPOsf和没有修饰的EPOsf。

结果

通过具有30kDa数均分子量的线性PEG分子的化学偶联合成PEG-EPOsf。产生酰胺键的EPOsf的伯胺基团和30kDa PEG-丁酸的琥珀酰亚胺酯衍生物之间的反应衍生PEG-EPOsf。

表1总结了结果。根据SDS-PAGE分析测定，纯化的缀合物混合物由一-和二-PEG-EPOsf组成并且没有未修饰EPOsf。缀合物混合物是23.4mg或者是起始材料的78％。一-和二-PEG-EPOsf的阳离子交换色谱分离表明缀合物混合物中一-与二-PEG之比几乎是1∶1。反应完全之后，一∶二∶未修饰的各成分之比是40∶38∶20(％)，总产率几乎是定量的。

表1：EPOsf聚乙二醇化作用的结果总结

样品蛋白质(mg) 产率(％)

Rxn.混合物 30 100

单 12.0 40

二 11.4 38

未修饰 6.0 20

缀合物混合物 23.4 78

实施例3：用mPEG-SPA对EPO聚乙二醇化

不同等份的实施例2中使用的EPOsf与30kDa甲氧基-PEG-SPA(Shearwater Polymers，Inc.，Huntsville，Alabama)反应。在蛋白质：试剂之比1∶2进行反应，并且纯化技术根据实施例2。主要产生一-聚乙二醇化物种。

实施例4：巯基与EPO的共价连接

该实施例公开了对于巯基(thiol)与EPO的共价连接的反应条件的测定。为了测定该条件，向EPO溶液，这里是向10mM磷酸钾，50mM NaCl，pH 7.3中的1ml的5mg/ml EPO加入不同量的含有封闭的巯基的试剂，这里是SATA或SATP(溶解于DMSO ad 10mg/ml)。将反应搅拌大约30分钟(25℃)，并且通过加入10mM的1M赖氨酸溶液终止反应。通过对10mM磷酸钾，50mM NaCl和2mM EDTA，pH 6.2透析去除过量的SATA和SATP。去除用羟胺保护的乙酰基之后，根据Grasetti，D.R.和Murray，J.F.在J.Appl.Biochem.Biotechnol.119，41-49页(1967)中描述的方法用二硫二吡啶(dithiodipyridine)光学测定与EPO共价连接的巯基的数目。

下面给出与每个EPO共价连接的巯基的数目。

EPO∶SATA或SATP摩尔比	Mol硫基/molEPO
EPO∶SATA或SATP摩尔比	Mol硫基/molEPO	EPO∶SATA＝1∶3	1,5
EPO∶SATA＝1∶5	2.4	EPO∶SATA＝1∶3	1,5
EPO∶SATA＝1∶5	2.4	EPO∶SATA＝1∶6	3.2
EPO∶SATP＝1∶3	1.3	EPO∶SATA＝1∶6	3.2
EPO∶SATP＝1∶3	1.3	EPO∶SATP＝1∶4	2.5
EPO∶SATP＝1∶6	3.7	EPO∶SATP＝1∶4	2.5

实施例5：用甲氧基-PEG-马来酰亚胺修饰活化的EPO

A)EPO的活化：根据实施例2用SATA(摩尔比：EPO/SATA＝1/5)活化根据实施例1产生的100mg EPO(190,000IU/mg，根据normocythaemic小鼠测试)。根据实施例1所述通过透析从副产物象N-羟基-琥珀酰亚胺或者没有反应的SATA分离带有共价连接的封闭的巯基的得到的EPO(″活化EPO″)。得到10mM磷酸钾，50mM NaCl，2mM EDTA，pH 6.2中的4.5mg/ml活化的EPO溶液。

B)活化EPO的聚乙二醇化

将具有上述“最优选”结构的380mg甲氧基-PEG-马来酰亚胺(MW30.000；Shearwater Polymers，Inc.，Huntsville(Alabama，USA))溶解于上述含有95mg活化EPO(4.5mg/ml，在10mM磷酸钾，50mM NaCl，2mM EDTA，pH 6.2中)溶液中。溶液中得到的活化EPO和甲氧基-PEG-马来酰亚胺之间的摩尔比是1∶4。通过向上述溶液加入1M羟胺水溶液ad 30mM，pH 6.2，将活化EPO的共价连接的封闭的巯基去封闭。反应混合物溶液中得到的活化EPO含有自由巯基(-SH)。巯基去封闭之后，紧接着是现在含有自由巯基的活化EPO和甲氧基-PEG-马来酰亚胺之间的偶联反应90分钟(搅拌，25℃)。通过向反应混和物中加入0.2M半胱氨酸水溶液ad 2mM终止偶联反应。30分钟之后，通过加入DMSO中0.5M N-甲基马来酰亚胺溶液达到5mM浓度封闭没有与甲氧基-PEG-马来酰亚胺反应的活化EPO的过量自由巯基。30分钟之后，用10mM磷酸钾，pH 7.5将得到的现在含有聚乙二醇化EPO物种的反应混合物透析≥15小时。

C)聚乙二醇化EPO物种的纯化

对于从反应混合物分离聚乙二醇化EPO物种，进行下面的纯化方法：用10mM磷酸钾，pH 7.5平衡50ml Q-Sepharose ff柱。将步骤B)获得的反应混合物加载到柱子上(流速：每小时3柱体积(CV))。为了分离没有反应的甲氧基-PEG-马来亚酰胺试剂，用5CV’s的10mM磷酸钾，pH 7.5冲洗柱子。通过用5CV’s缓冲剂A(10mM磷酸钾，pH 7.5)和5CV’s缓冲剂B(10mM磷酸钾，500mM NaCl，pH 7.5)组成的递增盐梯度以每小时3CV的流速洗脱来分离聚乙二醇化EPO物种。以NaCl梯度为基础，首先洗脱聚乙二醇化EPO物种(三-，二-和一-聚乙二醇化EPO物种)，接着是没有聚乙二醇化EPO物种。合并含有聚乙二醇化EPO物种(三-，二-和一-聚乙二醇化EPO物种)的洗出物级分，并且过滤(用0.2微米过滤器无菌过滤)。

在考马斯染色SDS-PAA凝胶(Laemmli，Nature 227，680-685(1970))上评价三-，二-和一-聚乙二醇化EPO物种的含量和纯度，同时根据Beer-Lambert定律在280nm下测定蛋白质浓度。通过SDS-PAA电泳测定的EPO物种的表观分子量是大约68kDa(一-聚乙二醇化EPO物种)，大约98kDa(二-聚乙二醇化EPO物种)，和大约128kDa(三-聚乙二醇化EPO物种)。

通过层析法例如通过大小排阻层析(Superdex，pg200；Pharmacia)可以实现三-，二-和一-聚乙二醇化EPO物种的进一步分离。通过下述方法进行含有三-，二-和一-聚乙二醇化EPO物种的洗出液的体内生物活性测定。

实施例6：通过normocythaemic小鼠测试测定的聚乙二醇化EPO的体内活性

normocythaemic小鼠生物测试是本领域公知的(Pharm.Europa Spec.Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2))并且是Ph.Eur.BRP促红细胞生成素的专论中的一个方法。用BSA-PBS稀释样品。对7-15周龄的正常健康小鼠皮下施用0.2ml的含有没有聚乙二醇化EPO或者得自实施例2或3的三-，二-或一-聚乙二醇化EPO的EPO-级分。6天之后，通过对尾静脉穿刺抽取血液并且稀释，使得1ml的0.15微摩尔吖啶橙色染色溶液中存在1微升血液。染色时间是3至10分钟。通过分析红色荧光直方图在流式细胞仪中显微荧光法进行网状细胞计数。以绝对数字给出网状细胞计数(分析的每30,000血细胞)。对于给出的数据，各组每天由5只小鼠组成，并且只对小鼠取一次血。

在单独的实验中，对小鼠施用单一剂量的未修饰EPO(25ng的EPO)，来自实施例2的PEG(SBA)-EPO混合物(10ng的缀合物)，来自实施例2的一-和二-聚乙二醇化EPOs(10ng的缀合物)，来自实施例3的PEG(SPA)-EPO(10ng的缀合物)，和缓冲溶液。表2给出了结果。结果表明与25ng剂量的未修饰的EPO相比，每只小鼠使用相同剂量(10ng)，表现出由显著增加的网状细胞量和网状细胞计数最大值位移表明的聚乙二醇化EPO物种的优越活性和更长的半寿期。

表2

	EPO(未修饰)	30kDaSPAPEG	单30KSBA	二30KSBA	PEG-EPO SBA缀合物混合物	对照缓冲剂
	EPO(未修饰)	30kDaSPAPEG	单30KSBA	二30KSBA	PEG-EPO SBA缀合物混合物	对照缓冲剂	72h	1000	1393	1411	994	1328	857
96h	500	1406	1501	926	1338	697	72h	1000	1393	1411	994	1328	857
96h	500	1406	1501	926	1338	697	120h	～200	1100	1182	791	944	701
144h	～0	535	607	665	660	708	120h	～200	1100	1182	791	944	701

实施例7：主要是一-PEG-EPO的制备

聚乙二醇化反应

用根据实施例1制备的100mM磷酸钾缓冲剂pH 7.5中的100mg(5.48微摩尔)的EPOsf起始，加入溶解于3ml 1mM HCl中的329mg(10.96微摩尔)的30kDa PEG-SBA试剂。加入足够的100mM磷酸钾缓冲剂pH 7.5使反应混合物体积达到20ml。最终蛋白质浓度是5mg/ml并且蛋白质∶PEG试剂之比是1∶2。室温(20-22℃)下将反应混合物混合2小时。2小时之后，通过用冰醋酸调节pH至4.5终止反应并且在-20℃下冷冻贮存以备纯化。

纯化

用10mM乙酸钠，pH 4.5将得自前一步骤的反应混合物稀释1∶5并且施加给装到4.2×19cm柱子中的300ml SP-琼脂糖凝胶FF(磺丙基阳离子交换树脂)。柱子预先用相同的缓冲剂平衡。使用Gilson UV监控器在280nm检测柱子流出物并且用Kipp和Zonen记录仪记录。用300ml或者1床体积的平衡缓冲剂冲洗柱子去除过量试剂，反应副产物和寡聚PEG-EPO。接着用2床体积的100mM NaCl冲洗，去除二-PEG-EPO。然后用200mM NaCl洗脱一-PEG-EPO。洗脱一-PEG-EPO期间，弃除第一50ml蛋白质峰，并且收集一-PEG-EPO为150ml级分。用750mM NaCl洗脱留在柱子上的未修饰EPOsf。所有的洗脱缓冲剂在平衡缓冲剂中制备。通过SDS-PAGE和高效大小排阻层析(SEC)分析所有的洗脱的样品。然后将没有可检测未修饰EPOsf的从150ml级分获得的一-PEG-EPO合并液浓缩至大约4.5-7.5mg/ml并且渗滤到贮存缓冲液，10mM磷酸钾，100mMNaCl，pH 7.5中。室温下使用装有50kDa截留Millipore Pellicon XLBiomax 50膜的Millipore Labscale^TMTFF系统进行浓缩/渗滤。将浓缩的一-PEG-EPO无菌过滤并且在-20℃下冷冻贮存

大约75％的EPOsf被聚乙二醇化。纯化之后，总产率是没有可检测未修饰EPOsf的大约30％一-PEG-EPO和大约25％的二-PEG-EPO。对残留的蛋白质计量寡聚物，和未修饰EPOsf。从150ml级分获得的一-PEG-EPO合并液含有大约90％的一-PEG-EPO和大约10％的二-PEG-EPO。

实施例8：各种配方中EPO和聚乙二醇化EPO的热稳定性：通过DSC(差示扫描量热法)分析

一般认为差示扫描量热法测定的热变性的转变温度是蛋白质热稳定性的有效指标。利用Nano-DSC(Calorimetric Sciences Corporation，Utah，USA)，以2K/分钟的加热速度，在各种有或者无稳定剂的缓冲剂中分析浓度在0.6和1.2mg/ml之间的促红细胞生成素或者聚乙二醇化促红细胞生成素溶液。转变温度提高表明蛋白质的热稳定性增强。测得的温度值不应该理解为绝对值，但是确实代表各配方彼此之间稳定性差异。

为了确定配方的最佳pH，研究了在4和9之间的范围内的聚乙二醇化促红细胞生成素的热变性的pH-依赖性。在30mM Na₂HPO₄，30mM柠檬酸钠，30mM硼酸盐中分析蛋白质样品。图l表明在大约pH 6至大约pH 9之间的平稳段的最大转变温度，和在低于pH 5.5的急剧降低。这表明最大热稳定性的最佳pH高于pH 5.5(图3)。

为了研究离子强度的作用，测定热变性的磷酸盐浓度依赖性。图4表明热稳定性随着制剂中离子强度的增加而提高。

通过DSC也研究了缓冲物质的影响。从图5可以看出高热稳定性的最适合的缓冲剂或添加剂是硫酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐。现行可获得的制剂中作为缓冲剂使用的甘氨酸(见上文)不是非常合适。

图6表明在低pH(例如pH 6.2)下硫酸盐也是合适的缓冲剂/添加剂，而与pH 7.5相比，在pH 6.2下磷酸盐较不合适。这表明即使在低pH下，硫酸盐也能保持高热稳定性。该发现使得制剂的pH在6.0和6.5之间，而促红细胞生成素的热稳定性没有严重损失。

实施例9：热应力下EPO和peg-EPO的聚集作用：通过SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析

为了研究热应力对促红细胞生成素蛋白的作用，将不同配方中的样品暴露给热应力(80℃下20分钟)，并且在还原(在样品缓冲剂中使用DTT)和非还原(在样品缓冲剂中w/o DTT)条件下通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。该方法可以检测共价聚集体形成。如上文概述的，聚集体形成是蛋白质主要降解途经之一，因此应该在蛋白质药物制剂中防止。不存在还原剂(例如DTT)下可检测的和存在还原剂下不可检测的聚集体高度地可能由热应力下氧化反应，不适当的二硫键而形成。图5说明热应力下聚集作用的pH依赖性。该项实验清楚地表明在pH低于6.5下抑制聚集体的形成。PH越高，聚集作用量越高。在SDS-PAGE期间通过用还原剂处理样品可以减少形成的大多数聚集体，提示热应力下形成的大部分聚集体是二硫键二聚体，寡聚物和更高级聚集体。总而言之，其表明可以通过将制剂的pH保持在或者低于pH 6.5而在很大程度防止聚集体的形成。

图7：peg-EPO聚集作用对pH的依赖性。通过SDS-PAGE分析热应力(如上所述)之后的Peg-EPO样品。蛋白质用银染色。泳道1：分子量标准。泳道2：pH 5。泳道3：pH 5，还原的。泳道4：pH 6。泳道5：pH 6，还原的。泳道6：pH 6.5。泳道7：pH 6.5，还原的。泳道8：pH 7。泳道9：pH 7，还原的。泳道10：peg-EPO，没有应力。

利用抗氧化剂也可以防止聚集体的形成。图8表明使用1mg/ml乙酰基半胱氨酸作为抗氧化剂防止热应力下聚集体的形成。因此，使用抗氧化剂，象例如乙酰基半胱氨酸，在低pH，例如pH 6.2，对于防止热应力下聚集体形成是有用的。

图6：pH 6.2和/或乙酰基半胱氨酸可以防止Peg-EPO聚集作用。通过SDS-PAGE分析热应力后(如上所述)的Peg-EPO样品。蛋白质用银染色。泳道1：peg-EPO，没有应力。泳道2：pH 7.5，有应力。泳道3：pH 6.2，有应力。泳道4：pH 6.2，有应力，还原的。泳道5：pH 7.5，1mg/ml乙酰基半胱氨酸，有应力。泳道6：pH 7.5，1mg/ml乙酰基半胱氨酸，有应力，还原的。

实施例10：4，25，30和40℃下各种制剂中peg-EPO的稳定性

在几个温度下温育不同制剂中的聚乙二醇化EPO。在指定的时间点，取样并且通过反相高效色谱(rpHPLC)，高效大小排阻层析(SEC)和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对样品评价稳定性。表3比较了几个温度下不同制剂中的peg-EPO的稳定性。这些数据清楚表明就蛋白质回收和凝集作用来说，本文涉及的制剂的优越性。

表3 几个温度下不同制剂中的peg-EPO的稳定性：

		6个月之后回收百分率				30℃下可测的聚集作用(+/-)
		6个月之后回收百分率					制剂*	pegEPO(μg/ml)	4℃	25℃	30℃	40℃
A	10	92	91	n.d.	39		制剂*	pegEPO(μg/ml)	4℃	25℃	30℃	40℃	n.d.
A	10	92	91	n.d.	39	B	50	97	98	97	78	-	n.d.
C	50	95	79	79	52	B	50	97	98	97	78	-	+
C	50	95	79	79	52	E	50	103	102	100	87	-	+
A	100	96	97	n.d.	50	E	50	103	102	100	87	-	n.d.
A	100	96	97	n.d.	50	B	400	101	101	101	77	-	n.d.
C	400	100	94	90	56	B	400	101	101	101	77	-	+
C	400	100	94	90	56	D	400	98	96	93	73	-	+
E	400	99	98	100	66	D	400	98	96	93	73	-	-

*制剂是：

制剂A：10mM磷酸钠，100mM氯化钠，pH 7.5。

制剂B：10mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3％(w/v)甘露糖醇，pH 6.2。

制剂C：10mM磷酸钠，100mM NaCl，pH 7.0。

制剂D：10mM磷酸钠，120mM硫酸钠，pH 6.2。

制剂E：40mM精氨酸，30mM硫酸钠，3％甘露糖醇，1mM CaCl₂，pH6.2.

实施例11：优化的制剂抑制EPO蛋白质中甲硫氨酸54的氧化作用，甲硫氨酸作为抗氧化剂

在几个温度下温育不同制剂中的聚乙二醇化EPO。6个月之后，取出样品并且如下测定甲硫氨酸54的氧化作用程度。简要地说，用内源蛋白酶LysC处理EPO样品。通过反相色谱分离得到的肽。计算氧化的肽T8(含有氧化的甲硫氨酸54)与肽T8(含有没有氧化的甲硫氨酸54)之比。表4总结了数据。

表4：在指定温度下6个月之后在不同制剂中的EPO蛋白质的甲硫氨酸54氧化作用的程度

		％氧化的甲硫氨酸54
		％氧化的甲硫氨酸54				制剂*	pegEPO(μg/ml)	4℃	25℃	30℃	40℃
A	400	2.00	15.89	24.89	37.89	制剂*	pegEPO(μg/ml)	4℃	25℃	30℃	40℃
A	400	2.00	15.89	24.89	37.89	B	400	2.33	6.55	12.88	30.24
C	400	2.51	2.95	5.99	14.4	B	400	2.33	6.55	12.88	30.24
C	400	2.51	2.95	5.99	14.4	A	50	5.37	21.36	30.62	48.05
B	50	3.44	13.38	16.59	30.83	A	50	5.37	21.36	30.62	48.05
B	50	3.44	13.38	16.59	30.83	C	50	4.41	5.52	10.01	15.62

*下面列出制剂

制剂A：10mM磷酸钠，100mM氯化钠，pH 7.0。

制剂B：10mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3％(w/v)甘露糖醇，pH 6.2。

制剂C：10mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3％(w/v)甘露糖醇，1mM甲硫氨酸，pH 6.2。

这些数据清楚地表明本发明优选的制剂(10mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3％(w/v)甘露糖醇，pH 6.2)就甲硫氨酸54氧化作用的程度来说，优于其它制剂，象10mM磷酸钠，100mM NaCl，pH 7.0。向制剂中加入1或10mM甲硫氨酸明显抑制甲硫氨酸54的氧化作用。因此，甲硫氨酸作为抗氧化剂起作用并且稳定EPO。

实施例12：各种制剂中peg-EPO样品的唾液酸含量

为了分析peg-EPO糖蛋白的糖结构的完整性，通过标准技术分析各种温度下贮存6个月之后的优化的制剂中的peg-EPO样品的唾液酸含量。这些数据表明糖结构的完整性不受本文描述的新制剂中蛋白质的贮存的负面影响(图9)。

实施例13：在升高的温度下贮存长时间之后的聚乙二醇化EPO的生物活性

为了证明peg-EPO在10mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3％(w/v)甘露糖醇，pH 6.2，中贮存不负面影响体内生物活性，进行标准的小鼠EPO测试(参见实施例6)。与新鲜的参照样品相比，在4，25和30℃下贮存之后，在指定温度下Peg-EPO样品在10mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3％(w/v)甘露糖醇，pH 6.2中贮存6个月之后，表现出体内活性没有降低(图10)。

实施例14：在升高的温度下贮存6个月之后peg-EPO的聚集体含量

为了分析在升高的温度下在10mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3％(w/v)甘露糖醇，pH 6.2中贮存6个之后peg-EPO样品中的聚集体含量，取样并且通过大小排阻层析分析。

在4，25和30℃下没有检测到聚集体，证明在上述制剂中聚乙二醇化EPO的稳定性。图11说明大小排阻层析覆盖图(overlay)。

序列表

(1)一般信息：

(i)申请人：

(A)名称：霍夫曼-拉罗奇有限公司

(B)街道：124 Grenzacherstrasse

(C)城市：巴塞尔

(E)国家：瑞士

(F)邮政编码(ZIP)：CH-4070

(G)电话：(61)688 11 11

(H)电传：(61)688 13 95

(I)电报：962 292 hlr ch

(ii)发明名称：新的药物组合物

(iii)序列数量：2

(iv)计算机可读形式：

(A)媒介类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容

(C)操作系统：WORD

(D)软件：PatentIn Release 2.0

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>165

<212>PRT

<213>人

<400>1

Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu

1 5 10 15

Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His

20 25 30

Cys Ser Leu Asn Glu Ash Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe

35 40 45

Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp

50 55 60

Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu

65 70 75 80

Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp

85 90 95

Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu

100 105 110

Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala

115 120 125

Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val

130 135 140

Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala

145 150 155 160

Cys Arg Thr Gly Asp

165

<210>2

<211>166

<212>PRT

<213>人

<400>2

Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu

1 5 10 15

Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His

20 25 30

Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe

35 40 45

Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp

50 55 60

Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu

65 70 75 80

Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp

85 90 95

Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu

100 105 110

Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala

115 120 125

Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val

130 135 140

Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala

145 150 155 160

Cys Arg Thr Gly Asp Arg

165

Claims

1.含有促红细胞生成素蛋白，在适合将溶液pH保持在5.5至7.0范围内的药学可接受缓冲剂中的多电荷无机阴离子，和任选地，一种或多种药学可接受赋形剂的液体药物组合物，所述组合物在室温下稳定，其中所述多电荷无机阴离子选自硫酸根，柠檬酸根或者磷酸根，且所述多电荷无机阴离子的浓度为10-200mmol/l。

2.根据权利要求1的组合物，其是水溶液。

3.根据权利要求1或2的组合物，其是等张溶液。

4.根据权利要求1的组合物，其中所述阴离子是硫酸根阴离子。

5.根据权利要求4的组合物，其含有10-200mmol/l硫酸根。

6.根据权利要求1的组合物，其中pH是5.8至6.7。

7.根据权利要求6的组合物，其中pH是6.0至6.5。

8.根据权利要求7的组合物，其中pH是6.2。

9.根据权利要求1的组合物，其中所述缓冲剂选自磷酸盐或者精氨酸/H₂SO₄/Na₂SO₄缓冲剂。

10.根据权利要求9的组合物，其中所述缓冲剂是10-50mmol磷酸盐缓冲剂。

11.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物含有一种或多种药学可接受赋形剂。

12.根据权利要求11的组合物，其中所述一种或多种药学可接受赋形剂选自药学可接受盐，稀释剂，溶剂和防腐剂。

13.根据权利要求11或12的组合物，其中所述药学可接受赋形剂选自张度剂，多元醇，抗氧化剂和非离子去污剂。

14.根据权利要求11的组合物，其中所述药学可接受赋形剂是多元醇。

15.根据权利要求14的组合物，其中所述多元醇选自甘露糖醇，山梨糖醇，甘油，海藻糖和蔗糖。

16.根据权利要求15的组合物，其中所述多元醇是甘露糖醇。

17.根据权利要求11的组合物，其含有抗氧化剂。

18.根据权利要求17的组合物，其中所述抗氧化剂是甲硫氨酸。

19.根据权利要求11的组合物，其含有大于0至1毫摩尔/升的氯化钙。

20.根据权利要求13的组合物，其中所述非离子去污剂是多乙氧基醚80，多乙氧基醚20，或者pluronic F68。

21.根据权利要求20的组合物，其中所述非离子去污剂是pluronicF68。

22.根据权利要求20或21的组合物，其中所述组合物含有大于0至1％(w/v)的非离子去污剂。

23.根据权利要求22的组合物，其中所述组合物含有大于0至0.1％(w/v)的非离子去污剂。

24.根据权利要求1的组合物，其中所述促红细胞生成素蛋白是人促红细胞生成素。

25.根据权利要求24的组合物，其中所述促红细胞生成素蛋白是通过内源基因激活表达的。

26.根据权利要求24的组合物，其中所述促红细胞生成素蛋白具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

27.根据权利要求24的组合物，其中所述蛋白质具有通过加入1-6个糖基化位点而修饰的人促红细胞生成素的序列。

28.根据权利要求24的组合物，其中所述促红细胞生成素蛋白具有通过选自下面的修饰而修饰的人促红细胞生成素序列：

Asn³⁰Thr³²；

Asn⁵¹Thr⁵³，

Asn⁵⁷Thr⁵⁹；

Asn⁶⁹；

Asn⁶⁹Thr⁷¹；

Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹；

Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰；

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰；

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰；

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹²；

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²；

Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰；

Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰；

Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹；

Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹；

Asn¹³⁸Thr¹³⁸；

Asn¹³⁸Thr¹⁴⁰；

Thr¹²⁵，和

Pro¹²⁴Thr¹²⁵。

29.根据权利要求24的组合物，其中所述人促红细胞生成素的序列通过至少一个糖基化位点的重排而被修饰。

30.权利要求29的组合物，其中所述重排包括人促红细胞生成素中N-键联的任何糖基位点的缺失和人促红细胞生成素的序列的88位的N-键联的糖基位点的添加。

31.权利要求29的组合物，其中所述糖蛋白具有通过选自下面的修饰作用而修饰的人促红细胞生成素序列：

Gln²⁴Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰；

Gln³⁸Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰；和

Gln⁸³Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰。

32.根据权利要求24-31中任一项的组合物，其中权利要求1-31中任一项定义的促红细胞生成素蛋白被聚乙二醇化。

33.权利要求32的组合物，其中所述促红细胞生成素蛋白是一种缀合物，所述缀合物包含具有至少一个游离氨基并且具有引起骨髓细胞增加网状细胞和红细胞的产生的体内生物活性的促红细胞生成素糖蛋白并且选自人促红细胞生成素和其类似物，其具有通过加入1-6个糖基化位点或者重排至少一个糖基化位点而修饰的人促红细胞生成素序列；所述糖蛋白共价连接于式-CO-(CH₂)x-(OCH₂CH₂)m-OR的“n”聚(乙二醇)基，各聚(乙二醇)基的-CO与所述氨基中的一个形成酰胺键；其中R是低级烷基；x是2或3；m是450至900；n是1至3；并且选择n和m，使得减去促红细胞生成素糖蛋白的缀合物的分子量从20千道尔顿到100千道尔顿。

34.根据权利要求33的组合物，含有下式促红细胞生成素蛋白：

P-[NHCO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR]_n (I)

其中m，n，x和R如上定义，而P是没有与聚(乙二醇)基团形成酰胺键的n个氨基的促红细胞生成素蛋白的残基。

35.根据权利要求34的组合物，其中在式(I)中，x是2，m是650-750，n是1并且R是甲基。

36.根据权利要求32的组合物，其中所述促红细胞生成素蛋白是缀合物，所述缀合物包括具有至少一个游离氨基并且具有引起骨髓细胞增加网状细胞和红细胞的产生的体内生物活性的促红细胞生成素糖蛋白并且选自人促红细胞生成素和其类似物，其具有通过加入1-6个糖基化位点而修饰的人促红细胞生成素的一级结构；所述糖蛋白被共价连接于一至三个低级烷氧基聚(乙二醇)基团，各聚(乙二醇)基团通过式-C(O)-X-S-Y-的接头与该糖蛋白共价连接，所述接头的C(O)与所述氨基中的一个形成酰胺键，X是-(CH₂)_k-或者-CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-，k是1-10，Y是

或者

各个聚(乙二醇)部分的平均分子量是20千道尔顿至40千道尔顿，并且缀合物的分子量是51千道尔顿至175千道尔顿。

37.权利要求36的缀合物，其具有结构式：

其中n是1-3的整数；m是450-900的整数；R是低级烷基；X是-(CH₂)_k-或者-CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-，并且P是没有氨基或者与X形成酰胺键的基团的促红细胞生成素糖蛋白的残基。

38.权利要求37的缀合物，其具有结构式：

39.权利要求1的组合物，每毫升含有10微克至10000微克促红细胞生成素蛋白。

40.权利要求1的组合物，含有每毫升10微克至10000微克促红细胞生成素蛋白，10-200mmol/l硫酸盐，和10-50mmol/l磷酸盐，pH 6.0-6.5。

41.权利要求1的组合物，含有10mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3％(w/v)甘露糖醇，1mM甲硫氨酸，pH 6.2。

42.权利要求40的组合物，含有大于0至20mM甲硫氨酸，1-5％多元醇(w/v)，大于0至0.1％Pluronic F68(w/v)和任选地大于0至1mM氯化钙。

43.根据权利要求40的组合物，含有每毫升10微克至10000微克促红细胞生成素蛋白，40mmol/l硫酸盐，10mmol/l磷酸盐，3％甘露糖醇(w/v)，10mM甲硫氨酸，0.01％Pluronic F68(w/v)，pH 6.2。

44.根据权利要求1的组合物，含有每毫升10微克至10000微克促红细胞生成素蛋白，10-100mmol/l氯化钠，10-50mmol/l磷酸盐，pH 6.0-7.0，任选地，1-5％多元醇。

45.权利要求44的组合物，含有大于0至20mM甲硫氨酸，大于0至0.1％Pluronic F68和任选地7.5mmol/l氯化钙。

46.根据权利要求44或45的组合物，含有每毫升10微克至10000微克促红细胞生成素蛋白，100mmol/l氯化钠，10mM甲硫氨酸，0.01％Pluronic F68，和10mmol/l磷酸盐，pH 7.0的。

47.根据权利要求1的组合物，含有每毫升10微克至10000微克促红细胞生成素蛋白，10-50mmol/l精氨酸，pH 6-6.5，10-100mmol/l硫酸钠。

48.权利要求47的组合物，含有大于0至20mM甲硫氨酸，大于0至0.1％Pluronic F68和任选地大于0至1mmol/l氯化钙和任选地1-5％多元醇。

49.权利要求47或48的组合物，含有每毫升10微克至10000微克促红细胞生成素蛋白，40mmol/l精氨酸，pH 6.2，30mmol/l硫酸钠，3％甘露糖醇，10mM甲硫氨酸，0.01％Pluronic F68和任选地1mmol/l氯化钙。

50.根据权利要求1的组合物，含有25-2，500微克/ml促红细胞生成素和：

a)10mM磷酸钠/磷酸钾，100mM NaCl，pH 7.0或者

b)10mM磷酸钠，120mM硫酸钠，pH 6.2或者

c)10mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3％甘露糖醇，pH 6.2或者

d)10mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3％甘露糖醇，10mM甲硫氨酸，0.01％pluronic F68，pH 6.2或者

e)40mM精氨酸，30mM硫酸钠，3％甘露糖醇，pH 6.2或者

f)40mM精氨酸，30mM硫酸钠，3％甘露糖醇，10mM甲硫氨酸，0.01％pluronic F68(w/v)，pH 6.2。

51.权利要求1的组合物，其中促红细胞生成素的量是每毫升50，100，400，800或2,500微克。

52.权利要求51的组合物，含有10mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3％甘露糖醇，10mM甲硫氨酸，0.01％pluronic F68，pH 6.2。

53.权利要求51的组合物，含有10mM磷酸钠，40mM硫酸钠，3％(w/v)甘露糖醇，1mM甲硫氨酸，pH 6.2。

54.权利要求51的组合物，含有40mM精氨酸，30mM硫酸钠，3％甘露糖醇，10mM甲硫氨酸，0.01％pluronic F68，和pH 6.2。

55.权利要求1的组合物，其是冻干物或者喷雾干燥的粉末。

56.制备根据权利要求1-55任一项的组合物的方法，包括混合促红细胞生成素蛋白和含有多负电荷的阴离子的溶液和任选的一种或多种药学可接受赋形剂。

57.根据权利要求1-55任一项的组合物制备用于治疗和预防与慢性肾衰竭患者(CRF)，艾滋病中的贫血相关的疾病和/或治疗接受化学治疗的癌症患者的药物的用途。

58.包含根据权利要求1-55的任一项的组合物的局部和全身缓释用装置，其选自植入剂、注射器和吸入装置。