CN1308037C - 增强蛋白和肽抗原免疫原性的Fc融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了在哺乳动物中增强预选蛋白或肽抗原免疫原性的组合物和方法。通过将预选抗原与免疫球蛋白重链恒定区相融合制备Fc-抗原融合蛋白以增强免疫原性。Fc-抗原融合蛋白与抗原呈递细胞表面的Fc受体结合，由此将该抗原靶向哺乳动物中的抗原呈递细胞。另外，还公开了佐剂家族，例如Fc-佐剂融合蛋白，其与Fc-抗原融合蛋白结合使用以增强或调节针对预选抗原的特定免疫应答。

Description

增强蛋白和肽抗原免疫原性的Fc融合蛋白
本申请要求申请日为1999年7月21日，申请号为60/144,965的专利申请的优先权，该申请所公开的内容在此引用作为参考。
发明的技术领域
一般来说，本发明涉及在哺乳动物中增强预选蛋白或肽抗原的免疫原性的组合物和方法。更具体地说，本发明涉及编码包括免疫球蛋白重链恒定区和预选抗原的融合蛋白的核酸和氨基酸序列，与单独的预选抗原相比融合蛋白中的预选抗原能够在哺乳动物中诱导更强的免疫应答。
发明背景
传统的疫苗研制着重于生产能够中和感染抗原的防御抗体。目前，用作疫苗的抗原典型地包括灭活或减毒的微生物(例如细菌或病毒)，它们的产物(例如毒素)或纯化抗原。随着现代分子生物学和基因克隆方法学的到来，使制备更纯，特异性更明显的疫苗成为可能。免疫系统分子水平上的知识使人们能分离和描述由感染抗原刺激的免疫应答。据认为对成功地产生免疫应答至关重要的两个免疫系统组分包括：调节和细胞毒性T细胞的关键作用；和通过抗原呈递细胞(APC)向这些细胞呈递抗原的方式。参见实施例，W.E.Paul，编(1993)免疫学基础，Raven出版有限公司，纽约。
典型地，从APC细胞外部接受的蛋白或多肽抗原(外源抗原)在APC细胞的胞吞囊或核内体中被降解。于是所得的肽片断与主要组织相容性复合体(MHC)II类蛋白形成复合物。所得的复合物移动到细胞表面并呈现于与该APC邻近的免疫细胞。肽片断与MHC分子形成的沟相匹配，并且该复合物可由表达对该复合物具有结合特异性的T细胞受体的T细胞所识别。肽结合的MHC II类分子与在本领域内称为CD4T细胞的辅助性T细胞之间的相互作用可通过另一相互作用，即MHC II类分子自身与T细胞表面的CD4+受体之间的相互作用予以进一步稳定。这样在APC细胞内加工的外源抗原通过MHC II类分子呈递到细胞表面。当MHC II类复合物呈现于CD4+T细胞表面时，可导致CD4+辅助细胞分泌细胞因子，该细胞因子刺激B细胞产生针对该肽的抗体。参见Paul，supra.
用外源抗原接种疫苗典型地导致CD4细胞-介导的T细胞应答，这种应答一般导致抗体产生。细胞毒性T细胞(CTL)典型地不由这种途径所刺激。显然地，CTL是由下述情况所刺激的，即其中的抗原源于APC自身内部(内源抗原)，例如在病毒感染细胞中产生的病毒蛋白或在癌细胞中产生的癌症特异性蛋白。事实上在许多病毒性疾病中，认为CTL细胞的产生是去除病毒感染细胞的关键，由此使感染得以恢复。
研究表明内源抗原和外源抗原是经过不同加工的。在新生多肽形成过程中，部分多肽由一种称为proteosome的细胞内部结构降解。通过这一加工得到的片断与新合成的MHC I类分子而非MHC II类分子形成复合物，所得的含MHC I类分子复合物的抗原转运到细胞表面。再一次，对特异肽片段具有特异性的T细胞与T细胞结合，但在此种情况下，所需的共同受体相互作用出现在MHC I类分子和CD8分子之间。由此APC细胞表面的内源抗体呈现于CD8+T细胞。尽管有一部分CD8+T细胞不是细胞毒性的，但CD8+T细胞构成CTL的主要部分。
据此，显然对能诱导CTL应答的疫苗的设计，需要抗原分子(一般为蛋白)或是在细胞内产生或是运送到合适的细胞区室以进入MHC加工途径。一种策略是将编码所需蛋白或肽的基因掺入到病毒中，然后用该基因工程病毒作为疫苗(Lorenz等(1999)人类基因治疗(HUM.GENETHER.)10：623-631)。另一种策略是将编码蛋白的DNA载体注射到细胞中，再将该细胞施与动物或病人使其从细胞内部表达，再通过MHCI类分子呈递到细胞表面。(Donnelly等(1997)免疫学年评(ANNU.REV.IMMUNOL)15：617)。已经公开了一种将DNA载体直接注入肌肉或皮肤的简单技术，由此诱导对几种抗原的CTL和/或抗体应答(Lai等(1988)免疫学CRIT.综述(CRIT.REV.IMMUNOL.)18：449-84和美国专利5,589,466)。研究结果表明抗原由APC摄入并加工由此呈现于免疫系统(Lai等，见上)。
将外源的肽或蛋白运送到MHC I类途径已通过使用化学佐剂，例如弗氏佐剂、角鲨烯与去污剂的混合物(Hilgers等(1999)疫苗17：219-228)，及最近通过使用可被巨噬细胞吞噬并通过一种供选择的MHCI类途径诱导CTL应答的抗原包被小珠(De Bruijn等(1995)欧洲免疫学杂志(EUR.J.IMMUNOL.)25：1274-1285)获得了部分的成功。而且其它增强对抗原免疫应答的方法可包括将化学佐剂与重组免疫刺激细胞因子，例如IL-2，IL-12，GM-CSF等结合使用。例如一种方法是用抗半抗原抗体与IL-2融合作为将这一细胞因子与蛋白抗原相连接的途径，该蛋白抗原已与该半抗原发生过化学反应。(Harvill等(1996)免疫学杂志157：3165)。
另一种技术通过将免疫球蛋白可变区的一部分区域用肽抗原替换开发出“抗原化”抗体。一旦重组抗体通过与APC细胞表面的Fc受体之间的相互作用结合于APC，杂合分子的肽抗原即呈递于APC(Lanza等(1993)美国国家科学院汇编(PROC.NATL.ACAD.Sci.USA)90：11683-11687)。这种方法的一种扩展是将编码“抗原化的”免疫球蛋白重链的质粒DNA进行脾脏注射，此后当提供免疫球蛋白轻链部分时，脾脏衍生的B细胞可分泌重组抗体。
抗体呈递系统的免疫原性是现代疫苗开发中的主要技术障碍之一。接种疫苗的目的是引起强免疫应答。但由于宿主的免疫系统已演化为对抗细菌和病毒，因而当用细菌或病毒作为载体时，信息将与信息载体一起遭到破坏。而且对某一病毒载体，例如牛痘和腺病毒的强免疫应答限制了它们的应用，可以理解在用细菌毒素作为蛋白载体时也会出现类似的问题。同样应用可变区的抗体衍生的“蛋白载体”由其特有的性质不被免疫系统视为“自体”，因而具有潜在地致免疫性。可以预见这些载体分子的多种应用均可以诱导抗独特型应答，因此妨碍了它们的有效应用。据此，本发明的一个目的是提供一种疫苗，其可产生针对预选蛋白或肽抗原强且持久的免疫。
发明简述
本发明部分地基于下述发现，即可以通过将预选抗原与免疫球蛋白重链恒定区相融合在哺乳动物中增强预选肽或蛋白抗原的免疫原性。所得的融合蛋白(这里也指“Fc-抗原融合蛋白”或“抗原融合蛋白”)或编码融合蛋白的核酸序列以疫苗的形式施用于哺乳动物以引起针对预选抗原的免疫应答。而且发现所引起的针对预选抗原的免疫应答的强度和类型可以通过将特定的佐剂和Fc-融合蛋白或编码Fc-融合蛋白的核酸序列一起使用得以调节。
据此本发明提供一种在哺乳动物中增强预选抗原的免疫原性的方法。一方面，该方法包括对哺乳动物施用足以引发免疫应答的量的Fc-抗原融合蛋白，该融合蛋白包括通过多肽键和预选抗原相连接的免疫球蛋白重链恒定区。另一方面，该方法包括对哺乳动物施用一种核酸序列，例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，该核酸序列编码包含融合于上述预选抗原的免疫球蛋白重链恒定区的Fc-抗原融合蛋白。在哺乳动物中与相当的(例如通过重量或分子数)单独预选抗原，即不与免疫球蛋白重链恒定区相融合的预选抗原相比，当该预选抗原作为Fc-抗原融合蛋白的一部分时以能够引发更强的免疫应答为特征。
而且，Fc-抗原融合蛋白所引发的针对预选抗原的免疫应答可以通过将一种佐剂与Fc抗原融合蛋白一起施用来进行增强或调控。尽管多种佐剂，例如化学佐剂如弗氏完全佐剂，或含非甲基化CpG序列的寡核苷酸均可用于实现本发明，目前优选的与Fc融合蛋白一起使用的佐剂包含一种第二Fc融合蛋白(此处指“Fc佐剂融合蛋白”或“佐剂融合蛋白”)或编码这样的Fc融合蛋白的核酸序列。优选的Fc佐剂融合蛋白包含通过多肽键和一种佐剂蛋白，如细胞因子相连接的免疫球蛋白重链恒定区。优选的用于构建Fc-佐剂融合蛋白的细胞因子包括，例如干扰素(IFN-y)白细胞介素-2(IL-2)，白细胞介素-4(IL-4)白细胞介素-12(IL-12)IL-8，肿瘤坏死因子(TNF)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。另一类Fc-佐剂融合蛋白包括与一种佐剂组成成分相融合的免疫球蛋白重链恒定区，该佐剂组成成分相当于通常部分或专门与膜结合的蛋白的细胞外结构域。例如CD40配基与Fc组分相融合以用作增强的佐剂蛋白。
以共同地或一个接一个地方式共施用的Fc抗原和Fc佐剂融合蛋白(例如Fc-佐剂接着Fc-抗原或Fc-抗原接着Fc-佐剂)可以用于调控所引发的针对预选抗原的免疫应答的类型。称作Th1和Th2的两类免疫应答由不同的刺激物起始且包含不同的细胞因子。Th1介导的免疫应答本质上是典型的细胞免疫，而Th1介导的免疫应答本质上是典型的体液免疫。因此Th1应答可用于攻击变化的细胞，例如癌细胞或病毒感染细胞，而Th2应答可用于攻击细胞外抗原，如寄生虫。通常将细胞因子融合于免疫球蛋白重链恒定区对刺激普通的免疫应答或者起始或调节特异的Th1或Th2应答都是有用的。
例如包括通过肽键和GMCSF相连的免疫球蛋白重链恒定区的融合蛋白是对包括Th1和Th2应答再内的免疫反应的有效通用激活剂。一种包含IL-12或INFγ的Fc-佐剂融合蛋白可共施用以刺激初级细胞的或Th1介导的免疫应答。另外的，一种包括IL-4的Fc-佐剂融合蛋白可以用于刺激初级体液的或Th2介导的免疫应答。
而且，对存在于Fc-佐剂融合蛋白的特定细胞因子的选择可以影响针对Fc-抗原融合蛋白中的预选抗原所产生的抗体的类型。例如包含IL-12的Fc-佐剂融合蛋白可以刺激辅助T细胞，并产生IgG2a类抗体。而含IL-4的佐剂融合蛋白可以刺激IgE类抗体的产生。
正如前面所讨论的，在一个优选实施例中，该方法包括将Fc-抗原融合蛋白或编码该Fc-抗原融合蛋白的核酸序列与Fc-佐剂融合蛋白一起施用。通过应用各自都包含免疫球蛋白重链恒定区的两种融合蛋白可以将预选抗原和佐剂蛋白(例如，细胞因子)共同定位于哺乳动物中的相同或相似细胞类型中。例如，在其表面表达Fc受体的巨噬细胞，B细胞，粒细胞和树状细胞。
据此，通过共同施用Fc-抗原和能与Fc受体结合的Fc佐剂融合蛋白可以将抗原融合蛋白中的抗原和佐剂融合蛋白中的佐剂共同定位于相同的细胞类型中。该佐剂能够刺激，增强或调节在预选抗原附近的免疫应答。
在这一优选实施例中，使用了两种不同的定位和浓度形式。首先，本发明使用了一种与抗原和佐剂都能融合的共同组分，它集中于体内特定的区域。在这种方式中，该佐剂附近抗原的有效局部浓度得以提高。
第二，本发明将该抗原靶向抗原加工和呈递系统。第一个浓缩步骤可通过将抗原和佐剂蛋白融合为一个组成成分并使其浓缩于机体中接近免疫系统的某一部分而进行。第二个靶向步骤是通过将抗原蛋白与任意可以增强向该抗原呈递系统递送或由该抗原呈递系统加工的组成成分相融合来进行的。
据此，本发明通过两种可供选择的方法达到这些浓缩效果。一种方法是构建和使用两种不同的融合蛋白，一种抗原定位蛋白融合体和一种佐剂-定位蛋白融合体。第二种方法是构建和施用一种包括所述抗原，佐剂和定位蛋白的融合体。Fc组成成分是定位蛋白的例子。
上述免疫球蛋白重链恒定区不同于该Fc抗原融合蛋白中的预选抗原的一个重要的特征是，其在预期的受体中优选的是无免疫原性或弱免疫原性的。换句话说，在Fc-抗原融合蛋白中，将预选抗原设计为比该免疫球蛋白重链恒定区在受体中免疫原性强。
类似地，可以理解Fc-佐剂融合蛋白在预期的受体中也应当是非或弱免疫原性的。可以通过使用来自或相似于那些预期受体的物种中的免疫球蛋白重链恒定区来降低，在特定的情况下甚至消除免疫球蛋白重链恒定区的免疫原性。例如用优选人源的免疫球蛋白重链恒定区用于生产施用于人的融合蛋白。类似地，当预期受体是人时Fc-佐剂融合蛋白中的佐剂蛋白也优选人源的。通过选择合适的定义免疫球蛋白重链恒定区和佐剂蛋白的氨基酸序列，可以尽可能完善针对预选抗原的初级免疫应答。
在一个优选实施例中，Fc-抗原融合蛋白的免疫球蛋白重链恒定区包括免疫球蛋白铰链区，和选自以下的一种可选择的免疫球蛋白重链恒定区结构域：CH2结构域，CH3结构域和CH4结构域，或其组合。所述的免疫球蛋白重链恒定区优选地至少缺少CH1结构域。而且本发明的Fc-融合蛋白，优选地缺少免疫球蛋白重链可变区结构域(VH)。当将该融合蛋白施用于人时，所述免疫球蛋白重链恒定区优选地包含铰链区，和CH2结构域或CH3结构域，最优选包含铰链区，CH2结构域和CH3结构域。可以理解对本发明有用的免疫球蛋白重链恒定区结构域可以来自在本领域中被称为IgA(Iga)，IgD(Ig5)，IgE(Igs)，IgG(Igy)，和IgM(Igp)的五种免疫球蛋白中的任意一种。但源于IgG类的免疫球蛋白重链恒定区是优选的。
可以理解任何所需的预选抗原均可包含在本发明的Fc-抗原融合蛋白中。在一个优选实施例中，预选抗原选自下面的组，该组包括：前列腺特异性膜抗原(PSMA)，细胞因子受体的胞外结构域(etcodomain)，病毒蛋白和癌症或肿瘤特异性抗原。
具有多种构型的Fc-抗原融合蛋白对实施本发明可能是有用的。例如，预选抗原的N-末端可以通过多肽键与免疫球蛋白重链恒定区的C-末端相连。或者预选抗原的C-末端可以通过多肽键与免疫球蛋白重链恒定区的N-末端相连。而且可以理解Fc-抗原融合蛋白可以包括多种一个或多个预选抗原，其中的一个或多个可以直接或通过多肽接头彼此连接或与免疫球蛋白重链恒定区相连接。而且两个或更多的Fc-抗原融合蛋白可以非共价地或共价地，例如通过一个或多个二硫键连接在一起形成二聚体或多聚体组合物。可以理解在二聚体或多聚体构建体中的Fc抗原融合蛋白可以彼此相同或不同。例如，即便两个Fc抗原融合蛋白可能包含相同的免疫球蛋白重链恒定区，其预选抗原可能不同。可以理解Fc-佐剂融合蛋白也可以应用类似的构型。
而且，编码Fc融合蛋白的多种核酸序列对于实现本发明都是有用的。例如，该核酸序列可以沿5’到3’的方向编码免疫球蛋白重链恒定区和预选抗原或预选抗原和免疫球蛋白重链恒定区。而且该核酸序列还可以任选地包括基于例如与免疫球蛋白重链恒定区的铰链直接相融合的免疫球蛋白轻链序列的“前导”或“信号”序列。在一优选实施例中，当Fc区域基于IgG序列时，该Fc区域沿5’到3’的方向编码至少包括免疫球蛋白铰链区(即铰链区包含至少一个能与第二种免疫球蛋白铰链区序列形成二硫键的半胱氨酸)，免疫球蛋白CH2结构域和CH3结构域。而其编码Fc抗原融合蛋白的氨基酸序列还可以整合到可复制的表达载体中，该表达载体可以在例如细菌宿主，预期受体或以上两者中表达Fc融合蛋白。
可以将编码Fc-抗原融合蛋白的核酸序列单独或与编码Fc-佐剂融合蛋白的核酸序列一起注射可以引起细胞免疫应答，体液免疫应答或以上两者。与单独应用核酸或蛋白所引起的免疫相比，将基于核酸或基于蛋白的免疫相结合(例如在施用编码Fc-抗原融合蛋白的核酸之前，之后或过程中施用Fc-抗原融合蛋白)可以产生彼此的协同作用进而引发针对预选抗原更强的免疫应答。
本发明的上述和其它目的，特征和优点将通过下述的详细描述附图和权利要求显得更为清晰。
附图的简要说明
本发明的上述和其它目的，特征和优点和该发明本身可以通过下述优选实施例的详细描述并结合附图得到更加完全的理解，其中附图1A-1G是用于实施本发明的Fc融合蛋白示例的图示介绍。图1A表示Fc-抗原融合蛋白或Fc-佐剂融合蛋白，其中免疫球蛋白重链恒定区1连接在抗原或佐剂2的N末端。图1B表示Fc-抗原融合蛋白或Fc-佐剂融合蛋白，其中免疫球蛋白重链恒定区1连接在抗原或佐剂2的C末端。图1C和图1D表示一种二聚体蛋白，其中两条多肽链之一或两者都包含Fc-抗原融合蛋白或Fc-佐剂融合蛋白。在图1C中在至少一条多肽链中连接到抗原或佐剂2的N末端，在图1D中免疫球蛋白重链恒定区1连接到抗原或佐剂2的C-末端。图1E表示一种蛋白二聚体，其中的多肽链之一或两者都包含Fc-抗原-抗原，Fc-佐剂-佐剂，Fc-抗原-佐剂或Fc-佐剂-抗原融合蛋白。图1F表示一种二聚体蛋白其中的多肽链之一或两者都包含抗原-Fc-佐剂或佐剂-Fc-抗原融合蛋白。图1G表示一种二聚体蛋白，其中的多肽链之一或两者都包含抗原-佐剂-Fc或佐剂-抗原-Fc融合蛋白。
图2A-2B以图示的方式表示实施本发明所用到的DNA序列。图2A表示人Fc融合蛋白表达载体。图2B表示表达小鼠IgG 2a Fc融合蛋白的基因融合体。
图3A-3F的曲线图表明化学和Fc-细胞因子佐剂对用Fc-抗原融合蛋白，小鼠Fc人IL-4受体胞外结构域(Fc-IL-4R)融合蛋白免疫的小鼠所产生的抗体的效果。在图3A中，用Fc-IL-4R和弗氏完全佐剂(CFA)中的Fc-IL-2免疫小鼠。在图3B中用磷酸盐缓冲液(PBS)中的Fc-IL-4R免疫小鼠。在图3C中用FCA中的Fc-IL-4R免疫小鼠。
在图3D中用PBS中的Fc-IL-4R和Fc-IL-2免疫小鼠。在图3E中用CFA中的Fc-IL-4R和Fc-GMCSF免疫小鼠。在图3F中用PBS中的Fc-IL-4R和Fc-GMCSF免疫小鼠。在图3A-3F中，方块，菱形和三角代表来自三只不同小鼠的数据。用ELISA检测针对一种抗原的抗体水平；Y轴代表由ELISA读出的光密度。
图4A-4D的曲线图表明用人癌抗原，PSMA以Fc-抗原融合蛋白的形式以多种用量的Fc-GMCSF为佐剂免疫小鼠的效果。在图4A中，单独用50μg的Fc-PSMA融合蛋白免疫小鼠。在图4B中，以0.05μg的Fc-GMCSF作为佐剂用50μg的Fc-PSMA免疫小鼠。在图4C中用50μg Fc-GMCSF和0.5μg的Fc-GMCSF作为佐剂免疫小鼠。在图4D中，以5μg的Fc-GMCSF作为佐剂用50μg的Fc-PSMA免疫小鼠。在图4A-4D中方块，菱形和三角代表来自三只不同小鼠的数据。
图5A-5F是比较作为天然蛋白(5A-5C)或作为小鼠Fc-PSMA融合蛋白施用的PSMA抗原的特异抗体应答的曲线图。在图5A中，用50g的PSMA作为抗原免疫小鼠。在图5B中，用50μg的PSMA作为抗原和0.2μg GMCSF为佐剂免疫小鼠。在图5C中，用50μg PSMA作为抗原，0.5μg Fc-GMCSF作为佐剂免疫小鼠。在图5D中，用50μg Fc-PSMA作为抗原免疫小鼠。在图5E中，用50μgFc-PSMA作为抗原，0.2μg GMCSF作为佐剂免疫小鼠。在图5F中，用50μg的Fc-PSMA作为抗原，0.5μg的Fc-GMCSF作为佐剂免疫小鼠。在图5A-5F中的方块，菱形和三角代表来自三只不同的小鼠的数据。用ELISA测定对每种抗原的抗体水平；Y轴代表ELISA读出的光密度。
图6是对针对抗人PSMA的抗体产生而言，与Fc-PSMA共同施用的Fc-GMCSF或Fc-F3L佐剂效果比较图表。所有的供试动物均单独或与作为佐剂的Fc-细胞因子结合施用50μg的Fc-PSMA。每组实验中测试三只小鼠。
图7A-7B是表示单独施用或与佐剂Fc-GMCSF结合施用的Fc-EpCAM融合蛋白在小鼠个体中免疫原性的曲线图。图7A和7B分别表示加强7天和14天后所测定的抗体滴度。在初级免疫的3周后给予加强。在两幅图中空心菱形代表单独用10μg Fc-EpCAM以皮下方式免疫小鼠，实心三角代表以1μg Fc-GMCSF为佐剂，用10μg Fc-EpCAM以皮下的方式免疫小鼠。用ELISA测定针对某种抗原的抗体水平；Y轴代表ELISA读出的光密度。
图8A-8B是表示单独施用或与佐剂融合蛋白Fc-GMCSF结合施用的EpCAM-Fc(Fc区域和抗原的反方向)融合蛋白在小鼠个体中免疫原性的曲线图。图8A和8B分别表示免疫14天和21天(即加强后7天)后所测定的抗体滴度。在两幅图中空心的菱形代表用25μgEpCAM-Fc融合蛋白免疫的三只小鼠的平均滴度，实心的三角代表用25μgEpCAM-Fc融合蛋白和2.5μgFc-GMCSF为佐剂免疫的三只小鼠的平均滴度。用ELISA测定相对于抗原的抗体水平；Y轴代表ELISA读出的光密度。
图9是构建编码EpCAM-Fc-GMCSF融合蛋白的质粒载体的图表。这种情况下，抗原EpCAM融于免疫球蛋白重链恒定区(Fc区域)的氨基末端，佐剂GMCSF融于Fc区域的羧基末端。
图10A-10D是表明用PBS或25％(w/v)的蔗糖溶液作为运载工具注射编码Fc-EpCAM融合蛋白的质粒载体的小鼠中抗体滴度的曲线图。图10A-10D分别代表开始注射后14天，27天，55天和69天后的抗体滴度。该图中空心的菱形代表用PBS中的编码Fc-EpCAM融合蛋白的质粒注射的个体小鼠中的抗体滴度，实心的三角代表用蔗糖中的编码Fc-EpCAM融合蛋白的质粒注射的个体小鼠中的抗体滴度用ELISA测定相对于抗原的抗体水平；Y轴代表ELISA读出的光密度。
图11A-11B是3H-胸腺嘧啶掺入刺激的图表，该刺激反应是对DNA接种或由蛋白注射免疫的小鼠中分离的脾细胞的抗原体外刺激的响应。图11B是图11A的下部数据的放大图。在该幅图中，实心的菱形代表从用100μg编码CMV-Fc-EpCAM融合蛋白的质粒DNA免疫的小鼠中得到的脾细胞，圆圈代表从用100μg编码CMV-EpCAM-Fc融合蛋白的质粒DNA免疫的小鼠中得到的脾细胞，十叉代表从用10μg编码Fc-EpCAM蛋白免疫的小鼠中得到的脾细胞。脾是在用质粒DNA或蛋白注射70天，并在间隔3周加强注射两次后的小鼠中去除的。
图12A-B是用从质粒DNA或Fc-EpCAM蛋白免疫的小鼠的脾细胞作的细胞毒T淋巴细胞(CTL)的杀伤分析的曲线图。图12A是抗表达人EpCAM蛋白的抗小鼠CT26肿瘤细胞的脾细胞活性。图12B是抗亲代小鼠CT26肿瘤细胞的脾细胞活性。在以上两幅图中空心的菱形代表用带有(CMV-启动子)-EpCAM构建体的DNA免疫的小鼠的脾细胞。空心方块代表用带有(CMV-启动子)-EpCAM融合构建体的DNA免疫的小鼠的脾细胞。空心的方块代表(CMV-启动子)-Fc-EpCAM融合构建体的DNA免疫的小鼠的脾细胞，空心的三角用带有(CMV-启动子)-EpCAM-Fc融合构建体的DNA免疫的小鼠的脾细胞，十叉代表用Fc-EpCAM融合蛋白免疫的小鼠的脾细胞。CTL分析是用以10U/ml的IL-2免疫后培养5天的小鼠的脾细胞进行的。标记的靶细胞与指示效应物混合并培养4小时。用放射性的释放来计算特异裂解物的百分比。
图13是通过皮下的方式单独或以5μgFc-GMCSF作为佐剂用PBS缓冲液中的的50μgFc-MCSP融合蛋白免疫的小鼠血清中的抗体滴度的曲线图。实心的菱形代表正常血清中的抗体滴度，空心方块代表单独用Fc-MCSP融合蛋白免疫的小鼠血清中的抗体滴度，实心三角代表以Fc-GMCSF作为佐剂用Fc-MCSP融合蛋白免疫的小鼠血清中的抗体滴度。用ELISA检测针对一种抗原的抗体水平；Y轴代表由ELISA读出的光密度。
图14A-B单独或以Fc-细胞因子作为佐剂用Fc-gp41pep626融合蛋白免疫的小鼠血清中的抗体滴度的曲线图。图14A和14B分别代表第二次加强后7天和33天后所达到的抗体滴度。该图中，空心的菱形代表单独由皮内注射25μgFc-gp41pep626抗原免疫的小鼠中的抗体滴度，空心方块代表以25μg Fc-GMCSF作为佐剂由皮内注射2.5μg Fc-gp41pep626抗原免疫的小鼠中的抗体滴度，实心三角代表以2.5μgFc-IL-2作为佐剂由皮内注射25μgFc-gp41pep626抗原免疫的小鼠中的抗体滴度。用ELISA检测针对一种抗原的抗体水平；Y轴代表由ELISA读出的光密度。
发明的详细描述
本发明涉及在哺乳动物体内有效地递送蛋白或肽抗原以诱导体液(即基于抗体的)或Th2细胞介导的免疫应答，细胞或Th1细胞介导的免疫应答，以及某些情况下两种免疫应答。已发现可以通过将预选抗原与免疫球蛋白重链恒定区相融合形成Fc-抗原融合蛋白来增强哺乳动物中蛋白或肽预选抗原的免疫原性。所得的Fc-抗原融合蛋白或编码Fc-抗原融合蛋白的核酸序列可以疫苗的形式施用于哺乳动物，例如人中以引发针对预选抗原的免疫应答。
Fc-抗原融合蛋白选择性地将该抗原靶向抗原呈递细胞(APCs)。在不拘泥于理论的情况下，据信Fc-抗原融合蛋白与APCs的结合是通过表达于许多类型的免疫细胞如树状细胞；巨噬细胞；B细胞；和粒细胞上的Fc受体介导的。当Fc-抗原融合蛋白施用于哺乳动物后即与Fc-受体结合，然后被APCs吞噬。据认为被吞噬的包括预选抗原的融合蛋白降解为小肽后呈递于细胞表面。所呈递的肽从而介导体液和/或细胞免疫应答。所激发的具体免疫应答类型可以通过将Fc-抗原融合蛋白和一种佐剂，如佐剂融合蛋白共同施用而修饰。
在一种施用方式中，将Fc-抗原融合蛋白施用于受体。在另一种施用方式中，将编码该Fc-抗原融合蛋白的核酸序列施用于受体。预选抗原或在所施用的Fc-抗原融合蛋白中，或由所施用的核酸表达均比单独的抗原，即不通过多肽键与免疫球蛋白重链恒定区相连接的抗原，免疫原性高。而且在某些情况下顺序施用融合蛋白后施用编码相同融合蛋白的核酸，或反之，施用编码融合蛋白的核酸后再施用相同的融合蛋白可以用于使预选抗原的免疫原性最大化。可以理解当融合蛋白的两个组分均有活性时可以诱导出理想的免疫应答。换句话说，Fc-抗原融合蛋白中的预选抗原能够引起免疫应答，而免疫球蛋白重链恒定区能够与APCs表面的Fc受体相结合。
而且，正如所讨论的，所诱导的免疫应答的类型和强度可以通过将特异的佐剂，Fc-抗原融合蛋白和/编码Fc-抗原融合蛋白的核酸共同施用予以调节。尽管对于实施本发明而言，化学佐剂，例如明矾或弗氏完全或非完全佐剂在一定条件下如于兽医方面应用中是有用的，其副作用如组织创伤，使得它们不适用于应用于人。据此，优选的佐剂包含一种第二Fc融合蛋白，其中的免疫球蛋白重链恒定区与一种佐剂蛋白相融合形成Fc-佐剂融合蛋白。与Fc-抗原融合蛋白一样，若Fc佐剂融合蛋白的两种组分均有活性则可以诱导理想的免疫应答。换句话说，在Fc佐剂融合蛋白中的佐剂可以调节免疫应答，其免疫球蛋白重链恒定区能与APCs表面的Fc受体相结合。
在本发明的一个优选实施例中，该抗原和佐剂均以Fc融合蛋白或编码这样的融合蛋白的核酸的形式施用。换句话说，所施用的抗原为Fc-抗原融合蛋白，所施用的佐剂为Fc-佐剂融合蛋白。对实施本发明有用的Fc融合蛋白的特定优选实施例如图1A-1G所示。
图1A中介绍了一种Fc融合蛋白示例，其中的免疫球蛋白重链恒定区1的C末端或直接或通过多肽接头的方式与预选抗原或佐剂2的N末端相连接。此处所用到的术语“多肽接头”是指将两个蛋白连接在一起的包含一个或多个氨基酸残基的序列。多肽接头通常是长度约为10-15个残基的一系列氨基酸，包括例如重复的甘氨酸和/或丝氨酸残基。图1B介绍了一种Fc融合蛋白的示例，其中预选抗原或佐剂2的C末端或直接或通过多肽接头的方式与免疫球蛋白重链恒定区1的N末端相连接。
图1C描述了一种包含通过二硫键共价连接在一起的两个Fc融合蛋白的二聚体构建体。该二聚体构建体包括两个Fc融合蛋白，其中每一个免疫球蛋白重链恒定区1的C末端均与预选抗原或佐剂2的N末端相连接。类似地，图1D描述了一种包含通过两个二硫键共价连接在一起的两个Fc融合蛋白的二聚体构建体。该二聚体构建体包括两个Fc融合蛋白，其中每一个预选抗原或佐剂2的C末端均与免疫球蛋白重链恒定区1的N末端相连接。
图1E描述了通过两个二硫键连接在一起的包括两个Fc融合蛋白的二聚体构建体。其中每一个免疫球蛋白重链恒定区1的C末端均直接或通过一种多肽接头与预选抗原或佐剂2的N末端相连接，其C末端还直接或通过一种多肽接头与一种第二抗原或佐剂2’相连接。
图1F也描述了包括通过两个二硫键连接在一起的两个Fc融合蛋白的二聚体构建体。其中每一个预选抗原或佐剂2的C末端均直接或通过一种多肽接头与N免疫球蛋白重链恒定区1的N末端相连接，其C末端还直接或通过一种多肽接头与一种不同的第二抗原或佐剂2’的N末端相连接。例如，这样的融合蛋白由N到C末端方向可以包括预选抗原-免疫球蛋白重链恒定区-佐剂。
图1G也描述了包括以两个二硫键的方式连接在一起的两个Fc融合蛋白的二聚体构建体。该二聚体构建体包括两个Fc融合蛋白，其中的抗原或佐剂2的C末端直接或通过一种多肽接头与一种不同的佐剂或抗原2’的N末端相连接，该佐剂或抗原2’的C末端直接或通过一种多肽接头与免疫求蛋白重链恒定区1的N末端相连接。例如，这样的融合蛋白由N-到C-末端的方向可以包括预选抗原-佐剂-免疫球蛋白重链恒定区。
在实施本发明时一般优选将Fc组分处在相对于佐剂组分的N末端位置。如果佐剂组分位于相对于Fc组分的N末端位置则佐剂-Fc融合蛋白可结合于免疫细胞的佐剂受体，且Fc组分将处于与抗体结合到细胞表面所采取的方向相同的方向。结果将导致ADCC或补体结合。但是，当Fc组分处在相对于佐剂组分的N末端位置时就不会产生ADCC或补体结合。
图1C-1G所描述的构建体是通过临近的铰链区上的半胱氨酸之间形成的一对二硫键交联成为二聚体的示例。在该图中描述了二硫桥在这些分子具有天然形式的铰链区将两个免疫球蛋白重链恒定区部分连接起来。尽管在本发明中包括铰链区是优选的，但可以理解如果需要也可以选择在其它部位交联。而且，在某些情况下，两个或更多的单体可以非共价地相连形成对实施本发明有用的二聚体或多聚体。
此处所用到的术语“免疫球蛋白重链恒定区”可与术语“Fc区域”相互替换使用，可理解为是指能与Fc受体相结合的免疫球蛋白重链恒定区的羧基端、其类似物或其中的一部分。已知每一免疫球蛋白重链恒定区包括4或5个结构域。这些结构域依次命名为：CH1-铰链-CH2-CH3-(CH4)。CH4存在于IgM中，IgM中不存在铰链区。对实施本发明有用的免疫球蛋白重链恒定区优选地包括免疫球蛋白铰链区，且优选地还包括CH3结构域。该免疫球蛋白重链恒定区最优选地包括免疫球蛋白铰链区，CH2结构域和CH3结构域。此处所用的术语免疫球蛋白“铰链区”可理解为是指完整的免疫球蛋白铰链区或至少足以与第二个免疫球蛋白铰链区形成二硫键的免疫球蛋白铰链区的一部分。
可以理解适合的免疫球蛋白重链恒定区可源于属于IgA，IgD，IgE，IgG和IgM中的每一种类型的抗体，但源于IgG型抗体的免疫球蛋白重链恒定区是优选的。而且可以理解所述的免疫球蛋白重链恒定区也可以源于任意一种IgG抗体亚类即IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。
在各种免疫球蛋白类型中免疫球蛋白重链恒定区结构域具有交叉同源性。例如，IgG的CH2结构域与IgA和IgD的CH2结构域同源，且与IgM和IgE的CH3结构域同源。优选的免疫球蛋白重链恒定区结构域包括相应于IgG的CH2区域和CH3区域的蛋白结构域，或其功能部分或其衍生物。该免疫球蛋白重链恒定区结构域优选地至少缺少CH1结构域。而且，Fc-抗原或Fc-佐剂融合蛋白可任选地缺少免疫球蛋白可变区。在一个更优选的实施例中，该免疫球蛋白重链恒定区结构域按由N末端到C末端的方向包括：免疫球蛋白铰链区，CH2结构域和CH3结构域，且以上全部基于来自IgG分子的序列。在美国专利5,541,087和5,726,044中详细讨论了对合适的免疫球蛋白重链恒定区的选择。从特定的免疫球蛋白类型和亚类中选择合适的免疫球蛋白重链恒定区序列属于本领域普通技术人员能力范围内。
在某些情况下通过基因工程或其他方法对免疫球蛋白重链恒定区进行修饰例如突变，缺失或其它的改变可能有用，由此特定的活性，如补体结合，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)的刺激可被减弱或消除。但是有必要保留免疫球蛋白重链恒定区与Fc受体相结合的能力。
对于实施本发明Fc-抗原融合蛋白和Fc-佐剂融合蛋白中的免疫球蛋白重链恒定区在预期受体中优选地为无免疫原性或弱免疫原性。如果免疫球蛋白重链恒定区不引起可检测到的直接针对该免疫球蛋白重链恒定区的抗体应答则认为Fc区域是无或若免疫原性的。据此该免疫球蛋白重链恒定区域应源于与该融合蛋白的预期受体同种的生物体中的免疫球蛋白或基于与该融合蛋白的预选受体同种的生物体中的免疫球蛋白相应的氨基酸序列。换句话说，当Fc融合蛋白构建体(Fc抗原和/或Fc-佐剂融合蛋白)施用于人时，应当使用人免疫球蛋白重链恒定区序列。人Fc IgG的核酸和氨基酸序列已经公布，例如在Ellison等(1982)核酸研究10：4071-4079。同样的当将Fc融合蛋白施用于小鼠时则应当使用鼠Fc序列。鼠Fc IgG2a的核酸和氨基酸序列已经公布，例如在Bourgois等(1974)欧洲生物化学杂志43：423-435。同理，当将Fc融合蛋白施用于其它的动物如猫，狗和牲畜如牛，马时也应遵循同样的规律。
此处所用到的术语“预选抗原”是指任何蛋白，或其中的片段或者多肽，其单独或与其它试剂结合能在哺乳动物中诱导免疫应答。可以理解任何所需的预选抗原均可以包括在本发明的Fc-抗原融合蛋白中。在一个优选实施例中，该预选抗原选自下组，该组包括：前列腺特异性的膜抗原(PSMA)；细胞因子受体的胞外结构域，例如人IL-4受体的胞外结构域；肿瘤特异性抗原(例如相对于正常细胞在肿瘤细胞中上调了或水平升高了的抗原)；和病毒蛋白，例如由人免疫缺陷病毒(HIV)基因组编码的蛋白。
此处所用到的术语“佐剂”是指任何可以通过例如增强针对预选抗原免疫应答(体液或细胞)而作为免疫调节剂的物质。此处所用到的术语“体液”免疫是指由体液如血浆或淋巴中的抗体介导的免疫，而“细胞”免疫在本领域中也称为“细胞介导的免疫”是指由T淋巴细胞引发、效应T淋巴细胞和/或巨噬细胞介导的免疫反应。
如上面所讨论的，多种化学佐剂例如弗氏佐剂可用于免疫非人动物。尽管广泛用于动物中以产生高滴度的抗体或显著的细胞毒T淋巴细胞(CTL)应答，但其副作用例如组织创伤，使得它们不适合应用于人。因此，需要在注射部位不产生炎症的条件下诱导强免疫应答。使用本发明的Fc佐剂融合蛋白的一个突出的优点在于其无须使用如弗氏完全佐剂之类的化学佐剂即可诱导强免疫应答。
用于实施本发明的优选的佐剂包括一种Fc佐剂融合蛋白或编码编码该佐剂融合蛋白的核酸。优选的包含在佐剂融合蛋白中的佐剂蛋白包括细胞因子。此处所用到的术语“细胞因子”是指能够修饰哺乳动物中的免疫细胞如T细胞；B细胞；巨噬细胞；中性粒细胞；嗜酸细胞；嗜碱细胞；树状细胞；和它们的前体的活性的任何蛋白，蛋白类似物或其中的功能片段。优选的细胞因子包括，例如IFN-y，IL-2，IL-4，IL-12，IL-18，TNF，和GMCSF。CD40配体的胞外结构域也是与Fc融合构成Fc-佐剂的优选蛋白。与不加Fc佐剂融合蛋白单独使用Fc抗原融合蛋白相比，与Fc佐剂共同施用的Fc抗原融合蛋白中的抗原可以引发更强的免疫应答。在某些情况下，仅用伴有Fc佐剂的Fc-抗原进行两次免疫所达到的抗体水平即等同或高于利用弗氏佐剂所达到的抗体水平且没有可观察到的皮肤反应。
对具有免疫球蛋白重链恒定区的Fc-抗原融合蛋白或Fc-佐剂融合蛋白而言，在预期的受体中，该佐剂蛋白优选的为无或弱免疫原性。这可以通过用与从预期受体同种的生物体中分离的细胞因子相应氨基酸序列定义的细胞因子掺入Fc佐剂融合蛋白来完成。例如，当将Fc佐剂融合蛋白施用于人时，其中的佐剂蛋白(如细胞因子)优选人源的。
将Fc-抗原和Fc佐剂融合蛋白同时或先后共同施用可用于调节所刺激的针对预选抗原的免疫应答的类型。称为Th1和Th2的两类免疫应答由不同的感染所引起并包含不同的细胞因子。Th1介导的免疫应答本质上是典型的细胞型的，而Th2介导的免疫应答本质上是典型的体液型的。据此，Th1应答可用于攻击可变细胞如肿瘤细胞或或病毒感染的细胞，而Th2应答可用于攻击胞外物质如寄生虫。通常将细胞因子与免疫球蛋白重链恒定区相融合用于激活普通的免疫应答或起始、调节特定的Th1或Th2应答。
而且，对存在于Fc-佐剂融合蛋白中的特定的细胞因子的选择可以影响针对Fc-抗原融合蛋白中的预选抗原所产生的抗体类型。例如，Fc-IL2通过刺激产生已知的Th1细胞因子如IFN-y，IL-2，和TNF激发辅助T细胞应答，上述的Th1细胞因子可促进有效的细胞免疫并产生IgG2a类抗体。相反，Fc-IL-4激发可促进体液免疫的Th2细胞因子例如IL-5，IL-6，IL-10和IL-4的产生。
如上所述，在一优选实施例中的方法包括将Fc-抗原融合蛋白或编码Fc抗原融合蛋白的核酸与Fc佐剂融合蛋白一起施用。通过使用各自均包含免疫球蛋白重链恒定区的两种融合蛋白，可以将预选抗原和佐剂蛋白(例如细胞因子)共定位(co-localize)于哺乳动物的相同或相似的细胞类型中。例如在其表面表达Fc受体的巨噬细胞，B细胞，粒细胞和树状细胞。据此，通过将Fc-抗原与能与Fc受体结合的Fc-佐剂融合蛋白共同施用，可将抗原-融合蛋白中的抗原和佐剂融合蛋白中的佐剂共定位于相同的APCs细胞区室。该佐剂可以增强或调节在该预选抗原附近的免疫应答。
Fc细胞因子的结合也可以一种协同的方式来刺激普通的免疫应答，并进而影响细胞(Th1)或体液(Th2)应答的出现。例如Fc-GMCSF是有效的常规免疫应答刺激物。但是为了调节进一步针对细胞或Th1介导的免疫应答，可以将如Fc-IL12或Fc-IFNy的佐剂蛋白与Fc-GMCSF共同施用。为进一步促进体液或Th2介导的应答可以将如Fc-IL4的佐剂蛋白与Fc-GMCSF共同施用以调节针对产生Th2细胞的应答。其它用于与Fc融合的Th1或Th2促进的细胞因子也可以依照所需生理应答的确切性质加以应用。可以理解这种常规的方法也可以通过使该应答针对特定抗原而非有害抗原而调节如自身免疫(一种Th1介导的疾病)和变态反应(一种Th2介导的疾病)等现存的致病应答，该调节过程是通过免疫一种新的相反Th类型的应答进行的。
某些环境下，当用Fc-抗原融合蛋白免疫动物时用核酸作为佐剂是有益的。核酸例如，包括富含胞嘧啶-磷酸二酯键连接-鸟嘌呤(CpG)序列的寡核苷酸偏向于Th1应答的免疫应答，也可选择性的与其它佐剂如细胞因子(参见例如，Brazolot等.(1998)美国国家科学院汇编(PROC.NATL.ACAD.SCI.U.S.A.)95：15553-8；Liu等(1998)血液92：3730-6；和Klinman等(1997)免疫学158：3635-3639)结合使用。据此可以理解将含CpG的寡核苷酸与Fc抗原融合体共同施用可以增强或适当地调节免疫应答。这样的核酸分子可以是任意的长度，但优选大于8个核苷酸。该核酸序列优选地包括CpG序列，更优选包括嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶，且CpG中间的胞嘧啶是非甲基化的。在佐剂DNA中该CpG二核苷酸的出现频率优选至少约为5％，更优选约为10％。例如双链形式的脱氧寡核苷酸TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ.ID NO.22)可以用作佐剂。依照所需的免疫应答的类型可以将该核酸序列与明矾结合使用。
本发明利用传统的重组DNA方法学构建Fc融合蛋白用于实施本发明。该Fc融合构建体优选在DNA水平构建，将所得的DNAs整合到表达载体中使其表达以产生本发明的Fc-抗原或Fc-佐剂融合蛋白。此处所用到的术语“载体”是指任何包含能够掺入到宿主细胞中并通过重组整合到宿主细胞基因组中或作为附加体进行自我复制的核酸序列。这样的载体包括线性核酸，质粒，噬菌粒，粘粒，RNA载体，病毒载体等。病毒载体的非限定性的实例包括逆转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒。此处所用到的术语Fc融合蛋白的“基因表达”或“表达”是指DNA序列的转录，mRNA转录体的翻译和Fc融合蛋白产物的分泌。分别包含IL2，CD26，Tat，Rev，OSF-2，bIG-H3，IgE受体，PSMA，或gp120的Fc融合蛋白已用上述类型的表达载体进行表达。在美国专利5,541,087和5,726,044中讨论了相同或相类似的表达构建体。
作为通过遗传工程技术对蛋白进行融合的替代，也可以将传统的化学交联剂进行化学偶联用于蛋白组分的融合。
用于实施本发明的基本载体包括一种选择标记，例如由源于诸如SV40病毒的转录调节序列驱动的编码二氢叶酸还原酶的基因(DHFR)，和用于选择和维持该质粒在大肠杆菌中存在的细菌质粒序列。融合蛋白序列的表达由启动子和可选择的增强子序列驱动，例如巨细胞病毒(CMV)启动子和增强子序列。
若将该Fc融合蛋白或编码该融合蛋白的核酸施用于人，该Fc融合蛋白编码序列沿5’-3’的方向优选地由衍生自例如抗体轻链(L)的“前导肽”起始并与优选源于人免疫球蛋白g1基因的Fcγ1区域的至少部分免疫球蛋白重链恒定区或其突变形式进行框内融合。该人免疫球蛋白Fcγ1基因的Fcγ1区域优选包括至少部分铰链区和CH3结构域，更优选包括至少部分铰链区，CH2结构域和CH3结构域。若将该Fc融合蛋白施用于小鼠，优选的编码免疫球蛋白重链恒定区结构域的的核酸序列包括沿5’-3’的方向编码源于小鼠IgG2a抗体铰链区，CH2结构域和CH3结构域的核酸序列。如果需要免疫球蛋白重链恒定区的羧基端可以在核酸水平进行修饰，以将其与编码预选抗原(对于Fc抗原融合蛋白的情况)或免疫激活因子(对于Fc-佐剂细胞因子的情况)进行框内连接。编码分泌盒的DNA可以是其基因组构型也可以是其cDNA构型。
编码信号序列的部分DNA优选编码指导Fc融合蛋白分泌并进而从该Fc融合蛋白的剩余部分中切除的的肽片段。本发明的信号序列是多核苷酸，其编码一种氨基酸序列，该氨基酸序列引发蛋白穿越内质网膜的转运。用于本发明的信号序列包括抗体轻链信号序列，例如抗体14.18(Gillies等(1989)免疫学方法杂志125：191)，抗体重链信号序列例如，MOPCI41抗体重链信号序列(Sakano等(1980)自然286：5774)和任何本领域所知的信号序列(参见例如，Watson(1984)核酸研究12：5145)。
已知在本领域中已被清楚描述的信号序列典型地包括16到30个氨基酸残基，也可以包括更多或更少的氨基酸残基。典型的信号肽序列包括3个区域：碱性的N末端区域，中间的疏水区域，和极性较强的C末端区域。中间的疏水区域包括4到12个疏水残基，其在裸肽转运过程中锚定该信号肽穿越脂双层膜。在起始后信号肽通常在内质网腔中由称为信号肽酶的细胞酶切除。信号肽中可能的切割位点一般遵循“(-3，-1)”规则。因而典型的信号肽在-1和-3位具有小的中性氨基酸残基且在这一区域内缺乏脯氨酸残基。该信号肽酶将切割-1和+1氨基酸之间的信号肽，这样在分泌过程中信号序列可从融合蛋白的氨基端切除，从而导致融合蛋白分泌。对实施本发明有用的信号肽序列是本领域所公知的。参见例如von Heijne(1986)核酸研究14：4683。
需用常规的实验来确定用于分泌盒的信号序列的适合性对本领域的技术人员来说是显而易见的。这样的实验包括确定信号序列指导Fc融合蛋白分泌的能力和/或确定为使Fc融合蛋白有效分泌所用到的基因组或cDNA序列的理想构型。另外本领域的技术人员也可以由上述von Heijne的文献中的方法构建合成的信号肽序列并通过常规的实验检测这样的合成信号肽序列的效率。术语“信号序列”，“信号肽”，“前导序列”或“前导肽”在此处可以相互替换。
可见有许多不同的方式将Fc融合蛋白或编码该融合蛋白的核酸序列用于免疫针对预选抗原的受体。本发明的两种不同的应用可以用于产生CTL应答，一种是基于注射编码Fc-抗原融合蛋白的DNA，另一种是基于施用能够将该蛋白呈递到I类MHC途径的Fc抗原融合蛋白。
注射蛋白抗原典型地用于在哺乳动物中引发免疫应答。但本发明也提供通过DNA注射将抗原呈递到APCs的方法。通常使用的技术是将编码抗原蛋白的DNA表达载体注射到肌肉中。有报道显示该蛋白抗原由肌肉细胞表达但该抗原不通过这些细胞呈递到免疫系统。而据信特化的APCs，例如巨噬细胞和树状细胞迁移到注射位点，以目前尚不清楚的过程裹挟并呈递该抗原。用Fc-抗原融合蛋白表达载体可使这一过程更加有效，因为所分泌的融合蛋白能比天然的抗原蛋白更有效地结合到APCs上。
DNA注射的方式的一个结果往往导致兼有体液和细胞免疫应答产生。典型地，外源施用的蛋白更难于进入呈递到MHCI类分子的途径。然而，施用本发明的Fc融合蛋白可能是通过MHCI类分子的呈递的外源预选抗原增加了细胞毒性细胞的产生。DNA免疫与蛋白免疫相结合也可以在免疫系统中对初级免疫起协同作用并进而以抗体产生和细胞毒性细胞应答的形式增加应答水平。将Fc-佐剂融合蛋白例如Fc-IL-2，Fc-GMCSF，Fc-IL-12，和Fc-Flt3配体与Fc-抗原融合蛋白的共同施用确保该融合蛋白共定位于相同的APCs细胞区室，由此刺激针对预选抗原更有效的免疫应答。
本发明的组合物(即，Fc-抗原和/或Fc-佐剂融合蛋白，或编码以上融合蛋白的核酸序列)可以通过任意合适的方式直接(例如局部地，如通过注射，植入或局部施用到组织位点)或全身的(例如非肠道的或口服)施用于动物。当该组合物以非肠道的方式提供时，例如由皮下的，眼睛的，腹膜内的，肌内的，口腔的，直肠的，阴道的，眼眶内的，经皮的，大脑内的，颅内的，脊柱内的，心室内的，鞘内的，脑池内的，囊内的，鼻内的或通过烟雾剂施用，该组合物优选包括部分含水的或生理上可接受的流体，悬浮液或溶液。这样该载体或赋形剂是生理上可接受的因此除向患者运送所需的组合物外并不对病人的电解质和/或容积平衡产生不良影响。该试剂的流体介质可以包括正常的生理盐水(例如含985％NaCl的水溶液0.15M，pH7-7.4)。
每次施用Fc-抗原融合蛋白的优选剂量在50ng/m2到1g/m2的范围内，更优选5μg/m2到200mg/m2，最优选0.1mg/m2到50mg/m2。每次施用Fc-佐剂融合蛋白的优选剂量在1ng/m2到0.1g/m2的范围内，更优选0.5μg/m2到20mg/m2，最优选10μg/m2到5mg/m2。每次施用编码Fc-抗原融合蛋白或Fc-佐剂融合蛋白的核酸的优选剂量在1μg/m2到100mg/m2，更优选20μg/m2到10mg/m2，最优选400μg/m2到4mg/m2。
可以理解通过多次独立的免疫可以达到最大限度的免疫，例如相隔约3周到6个月接种1到3次。而且，如上所述在特定的情况下通过交替施用Fc融合蛋白和编码这样的Fc融合蛋白的核酸可以获得最大程度的免疫反应。Fc-抗原融合蛋白或编码该融合蛋白的核酸可以在Fc佐剂融合蛋白或编码该佐剂融合蛋白的核酸施用于哺乳动物之前，同时或之后施用于哺乳动物。本领域的技术人员在其能力范围内可以通过常规的实验来确定理想的给药方式、剂量和加强方案。
通过下列非限定性的实施例对本发明作进一步介绍。
实施例
实施例1.Fc-抗原和Fc-佐剂表达载体的构建
用编码小鼠IgG2a Fc区域的核酸构建了表达载体以在小鼠模型中检验Fc融合蛋白的免疫原性。这减少了每一Fc融合蛋白的Fc区域在该哺乳动物中诱导免疫应答的风险。而且将小鼠细胞因子用作Fc-佐剂融合构建体的融合组分，因为它们的生物活性具有很高的物种特异性。因而用编码小鼠IgG2a Fc(美国专利5,726,044)的cDNA序列替换早先报道的载体(Lo等(1998)蛋白质工程11：495-500)中的人IgG1的Fc序列，以对其进行修饰(参见图2)。
从小鼠脾细胞库中通过聚合酶链式反应(PCR)克隆小鼠IgG2a Fc序列。该PCR引物包含在5’端连接前导序列的接头序列和在3’端连接编码抗原或佐剂细胞因子序列的唯一的Sma I/Xma I酶切位点。使抗原或佐剂(细胞因子)序列的5’端为Sma I位点并保持Fc和抗原或佐剂蛋白之间的阅读框，以及紧邻于翻译终止信号后的唯一的Xho I位点。所得的DNA构建体编码与小鼠IgG2a H链直接融合的轻链前导序列以及接下来的小鼠IgG2a CH2和CH3外显子和融合组分(抗原或佐剂细胞因子)。
转录由CMV启动子/增强子驱动，其对DNA体内注射后在培养中的大多数细胞类型中以及肌肉中和其它细胞类型中的表达有用。与维持质粒DNA在大肠杆菌中稳定所需的序列一样，每一载体均包括可选择的二氢叶酸还原酶(DHFR)标记基因以便于选出稳定的转染克隆。
下述是通过在所设计的载体中唯一的Sma I到Xho I位点之间插入合适的接头序列而构建的Fc-抗原构建体pdCs-muFc的示例。其中的″mu″代表该Fc是鼠源的：
所述人IL4受体(IL-4R)的胞外结构域(细胞外部分)是通过PCR扩增从人外周血单核细胞(PBMC)中克隆得到的。所用引物分别为5′GTCCCGGGTATGAAGGTCTTGCAGGAGC(SEQ ID NO：1)和5′CCCCTCGAGCTAGTGCTGCTCGAAGGGCTCCCTG(SEQ ID NO：2)，其分别包括Sma I和Xho I位点，以便于插入pdCs-muFc载体中。PCR反应的条件和接下来的克隆步骤如下。Advantage KlenTaq和多聚酶Mix(Clontech，Palo Alto，加拿大)，和用于增所需基因所用的特定引物。在总共100ml体积的反应混合物中包括10mM Tris-HCI，pH 8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01％明胶(w/v)，每种dNTPs 0.2mM，和1.25单位的KlenTaq。进行了30个PCR循环。每一循环包括在94℃热变性1分钟，42℃下退火45秒，在72℃下进行引物扩增1分钟。扩增产物亚克隆到SK载体上(Stratagene，San Diego，加拿大)，并通过标准的测序方法验证DNA序列。
以5′AAGCTTAAATCCTCCAATGAAGC(SEQ ID NO：3)和5′CTCGAGTTAGGCTACTTCACTCAAAG(SEQ ID NO：4)，分别作为正义链和反义链的引物通过PCR由LnCAP前列腺癌细胞系(ATCCCRL1740)中克隆到人前列腺特异性膜抗原(PSMA)的胞外结构域。验证了该DNA序列后将所得的PCR片段插入到pdCs-muFc载体中以构建了pdCs-muFc-PSMA融合构建体。
EpCAM(也是已知的KS抗原)的胞外结构域，在大部分癌细胞中上调的(upregulated)的上皮细胞表面蛋白，是分别以5′CCCCGGGTAAACAGGAAGAATGTGTCTGTG(SEQ IDNO：5)，和5′CTCGAGTCATTTTAGACCCTGCATTGAG(SEQ IDNO：6)作为正义链和反义链的引物，通过PCR由LnCAP细胞中克隆到的。通过标准的测序方法验证了该DNA序列，然后将该PCR片段插入到载体pdCs-muFc中构建了pdCs-muFc-EpCAM融合构建体。用EpCAM胞外结构域作为N-末端融合组分构建了另一载体，在这种情况下该PCR产物包括EpCAM cDNA的天然前导部分和到跨膜结构域边界的成熟胞外结构域。该PCR产物的3′末端包括一个基因工程化的AflII位点以连接到小鼠Fc片段的5′Afl II位点。所用的PCR引物包括5′TCTAGAGCAGCATGGCGCCCCCGC(SEQ ID NO：7)和5′CCTTAAGCACCCTGCATTGAGAATTCAG(SEQ ID NO：8).在该情况下小鼠Fc缺少插入到融合蛋白中的3′插入位点，但Fc编码序列末端包含包含翻译终止信号。
HIV gp41近膜区中相对保守的区域，即从Hind III位点到临近跨膜区域的赖氨酸，作为Fc融合蛋白表达，其是短肽抗原抗原序列的一个例证。尽管使用了来自HIV IIIB菌株的蛋白序列，但通过用偏嗜高GC含量的密码优化该编码序列以便其在真核细胞中理想地表达。编码第626位到669位氨基酸残基的DNA具有下述序列：C CCG GGA TCC CTG ATCCAC TCC CTG ATC GAG GAA TCC CAG AAC CAG CAA GAG AAGAAC GAG CAG GAG CTG CTG GAG CTC GAC AAG TGG GCC TCCCTG TGG AAC TGG TTC AAC ATC ACC AAT TGG CTG TGG TAC ATCAAG TGA CTC GAG(SEQ ID NO：9)，其是通过化学方法合成的并连接到载体pdCs-muFc中。融合多肽的氨基酸序列为：
SLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK(SEQID NO：10)。
其它HIV蛋白编码序列依照前述(美国专利5,541,087和5,726,044)用于构建Fc-抗原，其用小鼠IgG2a Fc而非人源的IgG1 Fc的融合蛋白。这些构建体代表本发明进一步的实施例。
用与Fc抗原融合蛋白相同的方式构建了一系列包括小鼠IgG2a Fc和几个小鼠细胞因子的Fc-佐剂(细胞因子)融合蛋白。特定的细胞因子和克隆引物如下所述。
小鼠IL-2通过PCR用下列引物由小鼠外周血单核细胞(PBMCs)克隆得到的。PCR引物(有义)5′GGCCCGGGTAAAGCACCCACTTCAAGCTCC (SEQ ID NO：11)，和(反义)5′CCCTCGAGTTATTGAGGGCTTGTTG (SEQ ID NO：12)。
小鼠GMCSF是用下列PCR引物通过PCR自小鼠PBMCs中克隆到的。PCR引物(有义)5′CCCGGGAAAAGCACCCGCCCGCTCACCC(SEQ ID NO：13)，和(反义)5′CTCGAGTCATTTTTGGCTTGGTTTTTTGC(SEQ ID NO：14)。
小鼠Flt3配体是用下列PCR引物通过PCR自小鼠胸腺中克隆到的。PCR引物(有义)5′CAAGCTTACACCTGACTGTTACTTCAGC(SEQID NO：15)，和(反义)5′CTCGAGTCAAGGCTCTGGGAGCTCCGTGGC(SEQ ID NO：16)。
小鼠IL-12p35是用下列PCR引物通过PCR自小鼠PBMCs中克隆到的。PCR引物(有义)5′CCCCGGGTAGGGTCATTCCAGTCTCTGG(SEQ ID NO：17)，和(反义)5′CTCGAGTCAGGCGGAGCTCAGATAGC(SEQ ID NO：18)。
小鼠IL12p40是用下列PCR引物通过PCR自小鼠PBMCs中克隆到的。PCR引物(有义)5′TCTAGACCATGTGTCCTCAGAAGCTAAC(SEQ ID NO：19)，和(反义)5′CTCGAGCTAGGATCGGACCCTGCAG (SEQ ID NO：20)。
所有的PCR产物，除小鼠IL-12p40外，均克隆了Sma I到Xho I片段，用标准的DNA测序方法进行分析后，连接到包含小鼠IgG2a的Fc作为其Fc区域的pdCs-muFc载体上。小鼠IL-12 p40PCR在含有相同的CMV启动子增强子，直接融合于成熟小鼠IL-12的亚单位p40上的轻链前导序列，和替代在pdCs-muFc载体中的DHFR选择标记基因的新霉素抗性基因的载体中单独表达(不作为Fc融合蛋白)。所得的载体称为pNC-mp40，其中的″N″代表新霉素选择基因。
所有的质粒构建体通过在人肾293细胞中的瞬间表达诱导特定融合蛋白的合成和分泌。简要地说，质粒与磷酸盐的共沉淀引入人肾单层膜细胞293中(Sambrook等(1989)分子克隆实验操作手册，冷泉港，纽约)。上述细胞放置过夜(16hr)，用PBS清洗，再加入新鲜细胞培养基(DMEM含10％胎牛血清(FBS))。2-3天后，用对小鼠IgG-Fc蛋白具有抗体特异性的Fc特异的ELISA(Gillies等(1989)免疫学方法杂志125：191)检测培养培养基中所分泌的Fc融合蛋白。对于小鼠Fc-IL12，将Fc-p35和p40表达质粒DNAs在相同的细胞培养物中瞬间表达，以便异源二聚体细胞因子融合蛋白在分泌出细胞前进行组装。(Gillies等(1998)免疫学杂志160：6195)。
因此，稳定转染的表达多种Fc融合蛋白的细胞是通过标准的电穿孔技术将线性DNA引入小鼠NS/0骨髓瘤细胞所产生的。简要地说，以107细胞/ml的浓度将细胞悬浮于Gene Pulser Cuvette(BioRad)中，0.5ml的悬浮与10μgDNA相混合，将混合物在冰上冷却10分钟。用设定为0.25V和500pF的Gene Pulser(BioRad)进行电穿孔。将细胞在冰上复苏10分钟，随后悬浮于生长培养基中并转入96-孔板。从电穿孔后两天开始，每2-3天用含0.1uM氨甲喋呤的生长培养基喂细胞。通过FcELISA方法检测在96-孔板上生长的抗性克隆表达。
为表达小鼠Fc-IL12融合蛋白，如上所述用小鼠Fc-p35亚单位表达载体转染已表达小鼠IL-12p40亚单位的NS/0转染细胞系。p40表达系是用pNC-mp40载体对NS/0进行电穿孔而获得的，如上所述，在含新霉素类似物G418(生命科学技术)的培养基中筛选。第二次转染后用FcELISA和小鼠IL-12ELISA(Genzyme，Cambridge，MA)筛选存活的细胞克隆。
所得融合蛋白的结构完整性由SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证。开始，融合蛋白结合于小体积(每ml培养基10-20μl)的蛋白A Sepharose(Repligen，Needham，MA)上。用含Tween-20(0.01％)的PBS洗涤结合物，然后在含SDS的凝胶缓冲液中洗脱，再在5％2-巯基乙醇存在下煮沸2分钟。将还原蛋白在预先灌制的SDS-PAGE凝胶中电泳后用考马斯兰染色。依照生产商的说明用蛋白A Sepharose柱(Repligen，Needham，MA)从所得稳定克隆中进行大量的纯化。
实施例2.Fc-抗原的免疫原性和化学或Fc-细胞因子佐剂对抗体产生的效果
将在实施例1中制备的小鼠Fc-huIL-4Rα亚单位构建体用作抗原以检测这些蛋白在动物模型中潜在的APC-靶向效果。IL-4Rα亚单位的胞外结构域代表物种间相当保守的分子，在人和小鼠间有高于50％的序列同一性。
用在PBS中或用弗氏完全佐剂(CFA)乳化的50μg Fc-抗原融合蛋白(Fc-IL-4R)以皮下的方式注射成组小鼠。其中一些组的小鼠还受到5μg剂量(与Fc-IL-4R混合)的Fc-IL2或Fc-GMCSF Fc-佐剂蛋白。两周后，在小鼠的腹膜腔中注射同样的混合物。该CFA形成产生微团，该微团形成缓释-抗原源，对免疫系统形成连续地刺激。CFA中的分枝杆菌蛋白也通过细胞因子的刺激诱导强炎症性的应答，由此进一步加强免疫应答。但CFA，引起包括皮肤损伤的严重的副作用因此不适宜施用于人。但掺有含于PBS中的Fc-佐剂融合蛋白的混合物在任何动物中均不引起任何可见的皮肤反应也没有任何明显的毒性迹象。
加强两周后(即第一次注射后28天)，采集动物血液并将全部的血液在微离心管中凝集制备血清，研磨细胞将块状物以12000RPM高速离心5分钟，收集上清液。将所得血清用分析缓冲液(含0.01％Tween-20的PBS)稀释并用人IL-4R检测抗体反应。用人Fc-huIL-4R包被的96-孔培养板进行抗原特异的ELISA，该培养板每孔加入100μl含于PBS的5μg/ml人Fc-huIL-4R，在4℃下培养(过夜)。使用前用封闭缓冲液(1％BSA，0.01％Tween-20PBS)清洗并封闭该培养板。室温下使孔中的供试抗原稀释物温育2小时，然后用分析缓冲液对孔清洗8次。加入第二抗-小鼠Fc-特异性的辣根过氧化物酶连接的抗体(1∶2000稀释，Jackson免疫研究)，将培养板再温育1小时。在用分析缓冲液清洗8次后，加入含25mM柠檬酸，50mM Na2HPO4，pH5的邻苯二胺二氢氯化物(OPD)溶液并加入0.03％的新鲜H2O2。反应30分钟后加入100μL of 4N H2SO4终止反应。所得平皿在读数仪上490nm读数，该读数仪可自动去除在650nm下读出的背景值。将所得结果绘制成光密度和抗血清稀释度之间的关系图。通过在光密度降到一个设定值例如1 O.D.单位前所需稀释的抗体量来确定相对抗体滴度。
免疫方法的结果如图3所示。通过这种方法单独注射含于PBS中的Fc-IL-4R融合蛋白仅在一只小鼠中引起抗体应答(图3B)。但添加了CFA可引起较多的小鼠产生应答而滴度与单独用含于PBS中的Fc-IL-4R融合蛋白注射时基本相同(图3C)。将小鼠Fc-IL2佐剂与含于PBS的Fc-IL4R共同施用可以在所有的动物中诱导应答，但所产生的抗体的量有所不同(图3D)。与单独使用任意一种试剂相比，将CFA与小鼠Fc-IL2佐剂共同施用(图3A)可诱导出较高的抗体滴度(图3C和3D)。将含于PBS中的小鼠Fc-GMCSF佐剂共同施用可诱导出在所有组中最强的免疫应答(图3E)，包括用Fc-GMCSF佐剂和CFA共同施用所免疫的组(图3F)。换句话说，含于PBS中的小鼠Fc-GMCSF佐剂当与小鼠Fc-IL4R抗原共同施用时无需使用CFA。因而这样的方法更适合应用于人。
实施例3.对在Fc-PSMA融合蛋白中的癌症抗原，PSMA所产生的抗体的Fc-GMCSF佐剂剂量的效果
此处PSMA基于其有限的正常组织分布代表一种有吸引力的人类肿瘤相关靶抗原。目前PMSA作为肿瘤疫苗侯选物正在进行临床实验。在这一实施例中对Fc-PMSA融合蛋白中的PMSA抗原进行了评估。
按照实施例1中所讨论的方法制备小鼠Fc-PSMA融合蛋白。对成组的小鼠以皮下方式注射50μg含于PBS中的小鼠Fc-PSMA，并辅以各种浓度的Fc-佐剂融合蛋白Fc-GMCSF，并在14天后以腹膜内注射的方式加强免疫。如实施例2中对Fc-IL4R融合蛋白的描述通过Fc-PSMA抗原俘获ELISA测定抗体滴度。结果绘制成图4中的抗体滴度(在OD值还原为1时的稀释度)和第一次免疫后的时间的关系图。
缺乏Fc-GMCSF时，小鼠针对PSMA的抗体滴度范围在1000到约20,000(图4A)。在与少到0.05μg Fc-GMCSF共同施用时所得的抗体滴度范围在30,000 to 140,000(图4B)。Fc-GMCSF10倍的增加进一步刺激针对这一癌症抗原的抗体滴度(图4C和4D)。所给出的最高剂量(每只小鼠5μgFc-GMCSF融合蛋白)仍仅代表每注射剂量约2μg GMCSF-对小鼠的皮肤或所免疫动物的任何系统标记没有明显的影响(参见图4D)。而且与CFA不同的是也没有明显的脾增大。
实施例4.免疫抗体应答相关的Fc-介导的PSMA呈递效果
通过比较在注射了该融合蛋白，非融合抗原或佐剂蛋白或前述混合物的小鼠中所诱导的免疫应答来检测Fc-抗原和Fc-佐剂融合蛋白中Fc组分的特异影响。人PSMA系统用于这一目的。
依照制造商的介绍用纤溶酶通过蛋白水解消化Fc-PSMA融合蛋白(Lo等(1998)蛋白质工程11：495-500)制备非融合的PSMA。通过蛋白A Sepharose(Repligen，Needham，MA)的吸收去除所释放的Fc和未消化的Fc-PSMA。
成组的小鼠(n＝3)以皮下方式单独(图5A)或与注射50μg剂量PSMA，或与0.2μg游离的GMCSF(图5B)或0.5μg Fc-GMCSF(图5C)(05μg含约0.2μg GMCSF的Fc-GMCSF)结合施用。另一组小鼠中，每只小鼠以皮下的方式单独注射了50μg剂量的Fc-PSMA融合蛋白(图5D)，或与0.2μg游离的GMCSF(图5E)或0.5μg Fc-GMCSF(图5F)结合使用。所有的注射均在不含化学佐剂的PBS中进行。免疫后14天测定抗体与小鼠Fc-PSMA的反应性。
当用无化学佐剂的PBS配制注射动物时Fc-PSMA中Fc-抗原的对PSMA的免疫原性的重要性是明显的。其本质上没有针对于PBS中施用的PSMA的初级免疫应答(图5A)。添加GMCSF或Fc-GMCSF除在一只动物中有微弱的应答外(图5B)对免疫只有非常微小的影响(图5B和5C)。相反单独用Fc-PSMA注射动物在所有的情况下均产生强的免疫应答(图5D)。向加强的Fc-GMCSF中添加游离的GMCSF只有微弱的影响(图5E)，但将抗原和作为Fc融合蛋白的细胞因子共同施用给出最高水平的应答(图5F)。
这些结果表明将Fc-抗原和Fc-佐剂相结合对产生免疫应答非常有用，并且对该抗原和在体内的刺激细胞的共定位，假定是对APCs，有明显的益处。
实施例5比较融合蛋白Fc-GMCSF或Fc-Flt3L的佐剂效果
Flt3的配体在本领域中也指Flt3配体(Flt3)，已表明其在树状细胞(Soligo等BR.J.HAEMATOL.101：352-63)的产生和成熟过程中起关键的作用。据认为，树状细胞和组织巨噬细胞是最重要的APC。在小鼠中的研究表明连续10天每天注射可以增强从淋巴组织和脾中收集的树状细胞的数量和APC活性，而且这些细胞对向CD4+和CD8+T细胞呈递抗原极为有效。据信皮肤的朗氏细胞(Langerhans cells)代表一种能在摄入后呈递抗原并转移到局部淋巴结的树状细胞。因为认为大多数树状细胞不表达在巨噬细胞(例如FcyRI)上典型的Fc受体阵列，因此不能预知Fc融合蛋白的共定位效果是否包含这一APC系。
为验证Flt-3L能否用作佐剂，将小鼠Fc-PSMA和小鼠Fc-FLt31而非小鼠Fc-GMCSF融合蛋白(巨噬细胞和粒细胞的有效刺激剂)注射成组的小鼠。在这种情况下，可以预期通过树状细胞的激活和摄入所介导任何佐剂效果，其最终导致针对PMSA的抗体应答。结果概括于图6中。
这一研究表明小鼠Fc-Flt3L是能够刺激抗-PSMA抗体的强有力的佐剂，即便不优于也至少等同于等量的Fc-GMCSF。这一结果支持了所观察到的Fc-抗原和Fc-佐剂的结合可以特别有效地诱导免疫应答。这一结果还表明树状的APC显然与巨噬APC一样能被Fc-抗原和Fc-细胞因子靶定，这表明至少一种形式的Fc受体存在于这些细胞表面。
实施例6.对Fc-EpCAM和EpCAM-Fc融合蛋白的免疫应答
用实施例1中的方法和质粒将另一种潜在的重要人癌抗原EpCAM(也称为KSA和17-1 A抗原)与小鼠IgG2a Fc区域构建融合蛋白，单独施用或与作为佐剂的Fc-GMCSF共同施用。小鼠通过皮下注射，并在3周后用含于PBS的10μg Fc-EpCAM 1μg Fc-GMCSF加强。对照小鼠不接受Fc-GMCSF。在加强后7天(图7A)和14天(图7B)后测定直接针对EpCAM的抗体滴度。该结果显示当单独使用Fc-EpCAM时，其是有效的免疫原(空心菱形)，而Fc-GMCSF可进一步增加对这一抗原的应答(闭合三角)。
此外，EpCAM抗原可以作为EpCAM-muFc(参见实施例1，图1B)，即相对于Fc片段的反方向表达。将这一分子通过皮下注射免疫TBalb/c小鼠。使用了更高剂量的EpCAM-Fc融合蛋白用于(25μg每剂)，佐剂的量也得以增加(2.5μg Fc-GMCSF)。在免疫14天(图8A)和21天(图8B)后检测针对的抗体滴度。不存在Fc-GMCSF(图8A和8B，(空心菱形))下单独的EpCAM-Fc蛋白是完全致免疫的。添加了The addition ofthe Fc-细胞因子后抗体滴度增加了3倍(图8A和8B，(实心三角))。
为检测对EpCAM的免疫应答能否防止哺乳动物中表达这一抗原的肿瘤细胞，对非免疫小鼠或那些由EpCAM-Fc融合蛋白(某些情况下是Fc-细胞因子)免疫的小鼠由尾静脉注射105CT26由人EpCAM(Gillies等(1998)J.免疫学160：6195)转染的小鼠癌细胞克隆。21天后，将动物处死并通过通过下述方法估计肺转移瘤的范围(1)根据肺表面有效区进行肿瘤分类；(2)通过称重和与正常动物肺的比较确定由于肿块所导致的不同重量增加。结果概述于表1，其表明与对照小鼠相比所有的经免疫小鼠均表现出在统计学上显著的肿瘤还原酶减小，包括单独用EpCAM-Fc免疫的动物。用Fc-EpCAM作为抗原也出现类似的结果。
表1
  处理组   肿瘤还原酶值   肺平均重量(mg)
  对照   4，4，4，1，1   412+/-130
  EpCAM-Fc   0，0，0，0，0   210+/-21
  EpCAM-Fc+Fc-GM   0，0，0，0，0   240+/-19
  EpCAM-Fc+Fc-IL2   0，0，0，0，0   230+/-19
用下列等级表示基于肺表面的肺有效区域的肿瘤还原酶值：1＝1-25％有效区域；2＝26-50％有效区域；3＝51-75％有效区域；and 4＝76-100％有效区域。
实施例7.在单一的融合蛋白中抗原-Fc和细胞因子佐剂相结合
实施例6中所描述的蛋白，EpCAM-Fc，是与作为羧基蛋白结构域的免疫球蛋白Fc区域相连接的N-末端抗原的示例。这一蛋白或与其它与之相似的蛋白与Fc-佐剂融合蛋白例如Fc-细胞因子共同施用以增加针对该抗原所产生免疫应答。另外，该抗原免疫球蛋白重链恒定区域和佐剂蛋白(例如细胞因子)可以作为单一的融合蛋白生产，例如EpCAM-Fc-GMCSF融合蛋白。
用小鼠IgG2a Fc和GM-CSF序列构建该蛋白的表达质粒以使该构建体能在小鼠模型中进行评价。将从原始的EpCAM-Fc表达载体(实施例1)获得的包含前导-EpCAM-Fc编码序列的Xba I到Sma I小片段连接到Fc-GMCSF表达载体(图9)中的Sma I到Xba I大片段上。
用氯化钙沉淀法将所得载体，pdCs-EpCAM-Fc-GMCSF，引入293细胞以瞬时表达，通过电穿孔法引入NS/0细胞以稳定表达。在含氨甲喋呤(0.1μM)的培养基中培养上述细胞以筛选稳定的转染子。Fc通过ELISA(参见实施例1)验证表达克隆并将高水平表达的产生菌在培养基上涂开。由条件培养基通过结合并洗脱自蛋白A Sepharose(Repligen，Needham，MA)对蛋白EpCAM-Fc-GMCSF进行纯化，由SDS-PAGE分析其结构完整性，其后由2-巯基乙醇还原。结果显示该蛋白分子量约为90kD，作为预期的EpCAM，Fc和GMCSF单链融合蛋白。
为比较所结合的融合蛋白的相对免疫原性，将等剂量的EpCAM-Fc-GMCSF和在组合EpCAM-Fc和Fc-GMCSF中单独的融合蛋白以皮下的方式注射于小鼠。14天后进行同样的注射，并在加强7天后检测血清样本中相对于人EpCAM的特异抗体的活性。相同的方法也可以用于其它蛋白或多肽抗原以及其它刺激细胞因子，例如IL-2，IL-12和Flt3L。
实施例8.用Fc-抗原通过DNA注射免疫
用于在哺乳动物细胞中转染和生产小鼠FcEpCAM和EpCAM-Fc的相同表达载体(参见实施例1)作为“裸”质粒DNA注射到Balb/c组小鼠的后腿肌肉中。所注射的DNA含于PBS或25％(w/v)的蔗糖溶液中，浓度为0.5mg/ml总量100μg。注射每3周重复一次共3次。在不同的时间检测抗体应答并用ELISA定量，在该定量过程中用人Fc-EpCAM包被的96-孔板进行俘获，用HRP-连接的抗小鼠Fc特异多克隆抗体进行检测(Jackson免疫研究)。图10中所列的数据代表注射后14天(图10A)，27天(图10B)，55天(图10C)和69天(图10D)所记录的抗体滴度。
图10所列的结果表明两种方案在第一个月中所诱导出低滴度的抗-EpCAM抗体(图10A和10B)。在第55天获得很高的抗体滴度(图10C)，而到第69天获得更高的抗体滴度(图10D)。用表达EpCAM-Fc的载体进行DNA注射也获得相似的结果，但滴度略低。这些数据表明表达为含蛋白抗原和免疫球蛋白Fc区域的融合分子的抗原能诱导免疫应答，当通过注射裸DNA引入时，持续的抗原暴露导致在大多数动物中的应答延迟。
通过培养来自DNA疫苗注射或蛋白免疫(注射70天后)并由不同浓度的Fc-EpCAM蛋白体外刺激的的小鼠的脾细胞以检测细胞免疫应答。如图11所示的数据(顶栏)表明对用Fc-EpCAM(十叉)蛋白免疫的或用CMV启动子-EpCAM-Fc(空心圆圈)或CMV启动子-Fc-EpCAM(闭合菱形)表达载体进行DNA疫苗注射所免疫的动物中的抗原的增殖应答(通过掺入3H-胸腺嘧啶检测)。即便在很低的剂量下，该蛋白免疫的动物表现出对该抗原更强的免疫应答。DNA接种免疫的动物的免疫应答(也在图11的底栏中不同部分示出)是剂量依赖的但在数量上低于蛋白注射的小鼠。这些应答以MHC II类限定的CD4+T细胞应答为特征。
为检测细胞毒性活性(一般表示MHC I类限定的T细胞应答)，将DNA或蛋白免疫的小鼠脾细胞培养物在约10U/ml IL-2存在下培养5天。效应细胞是所培养的脾细胞，靶细胞是标记的人EpCAM-表达CT26克隆癌细胞(Balb/c同系小鼠)或标记的亲代的(非转染的CT26细胞)。效应细胞和靶细胞以不同的比例混合，测定裂解的程度。在去污剂存在下培养标记靶细胞可达到100％的裂解值，所释放的标记物的量检测。
结果如图12所示，其中图12A表示抗表达人EpCAM的CT26细胞的脾细胞活性，图12B表示抗亲代CT26细胞的脾细胞活性。在两幅图中，空心的菱形代表从用带有Fc-EpCAM构建体的DNA免疫的小鼠分离的脾细胞，空心的三角代表从用带有EpCAM-Fc构建体的DNA免疫的小鼠分离的脾细胞，十叉代表从用Fc-EpCAM融合蛋白免疫的小鼠分离的脾细胞。
图12说明尽管DNA疫苗注射产生针对两种靶细胞弱的细胞毒性应答，在蛋白免疫的小鼠中可见显著提高的细胞毒性。亲代CT26肿瘤细胞和表达EpCAM的CT26肿瘤细胞在分析中均被杀死。所观察到的针对亲代CT26细胞的细胞毒性可能是因为这些细胞表达高水平的小鼠EpCAM同系物，该同系物与相应人源蛋白在氨基酸水平上具有81％的同一性。
然而，Fc-EpCAM蛋白免疫的确产生针对表达人EpCAM的CT26肿瘤细胞显著的细胞毒性活性，由此解释了实施例6中描述的肿瘤防御活性。
实施例9.用包含蛋白癌抗原亚区域的Fc-融合蛋白的免疫.
尽管一些完全蛋白不用作免疫治疗的抗原，其中一些小的蛋白亚区域却可能十分有效。例如蛋白可以包括经翻译后修饰的结构域使其免疫原性降低，由此减少实际的多肽组分的免疫活性。大蛋白可以诱导仅与抗原的非肽部分起反应的抗体，不介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)，即抗肿瘤免疫应答的潜在重要组分。人黑素瘤-特异的软骨素硫酸酯蛋白多糖(MCSP)抗原是这种情况的一个很好的示例，其可在所有的黑素瘤和几种类型的脑癌中表达。该蛋白高度糖基化并通过附加及条糖胺聚糖链得以进一步修饰。已知的抗体9.2.27(Bumol等(1982)美国国家科学院汇编79：1245-1249)，以高度亲和性与这一蛋白相结合，但不介导任何效应子功能，ADCC或补体介导的细胞毒性(CDC)。甚至这种抗体的部分人源化(嵌合的)的形式也不能介导这一活性。
为了在这一大分子更理想的靶区域引起更集中的应答，验证了该蛋白序列中的推定的聚糖附加位点。(Pluske等(1996)美国国家科学院汇编93：9710-9715)。筛选出了距细胞表面的跨膜序列不远的亚区域和一些距聚糖结合位点很远的序列。
肽序列如下：
QGATLRLDPTVLDAGELANRTGSVPRFRLLEGRHGRVVRVPRARTEPGGSQLVEQFTQQDLEDGRLGLEVGRPEGRAPGPAGD(SEQ ID NO：21)是反向翻译的，所得的DNA序列以化学方式合成，用与上述实施例中相同的酶切位点连接到pdCs-Fc-X表达载体中。将翻译终止位点加到3’端编码最后一个氨基酸的序列后，其后紧接着一个唯一的Xho I位点。最终的表达质粒以电穿孔的方式转化到NS/0骨髓瘤细胞中，表达所需蛋白稳定的转染子按实施例1中描述的方法获得。
用蛋白A Sepharose层析(Repligen，Needham，MA)从培养物的上清液中纯化Fc-MCSP蛋白。在以皮下方式将含于PBS中的50μgFc-MCSP融合蛋白单独或与5μg Fc-GMCSF佐剂相结合注射所免疫的Balb/c小鼠中以检测抗体滴度。结果如图13所示。实心的菱形代表正常血清中的抗体滴度，空心的方块代表用Fc-MCSP免疫的小鼠血清中的抗体滴度，实心的三角代表用Fc-MCSP和佐剂Fc-GMCSF免疫的小鼠血清中的抗体滴度。
在第14天检测到对这一MCSP的亚区域的特定免疫反应，以及在加强免疫后明显升高。这一结果表明与单独用Fc-MCSP(空心三角)免疫小鼠相比用Fc-GMCSF和Fc-MCSP免疫的小鼠刺激产生针对MCSP(实心三角)较高的抗体滴度。
实施例10.用含病毒抗原的Fc-融合蛋白进行免疫
开发针对引起AIDS的人免疫缺陷病毒(HIV)的有效疫苗是疫苗研究的一个重要目标。最近，有几篇报道显示该病毒包膜的特定性质是在无关的表位引起免疫应答，由此屏蔽病毒颗粒重要的和潜在的中和区域。这些包括存在作为捕获器的高度优势免疫抗原性区域和广泛的糖基化从而完全屏蔽和还原重要的表位的免疫原性(Wyatt等(1998)自然393：705-11)。
一种可能的包围该捕获器的机制是表达病毒包膜基因的小区域以避免不予保护的优势免疫应答并诱导中和应答。小亚单位疫苗的一个问题是还原的免疫原性或者作为合成肽或者是一小蛋白。一个方法已将该蛋白或肽结合到致免疫的载体蛋白例如匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)上。也由于该蛋白和多肽诱导对KLH的强免疫应答。另一方法是将Fc与如实施例1中所描述的例如gp41(病毒包膜锚定结构域gp160)的外结构域的亚区域构成融合蛋白。与其它载体不同，该免疫球蛋白区域被视为“自身”由此将优势免疫效果降到最低。
The Fc-gp41pep626融合构建体包括一融合于小鼠免疫球蛋白Fc区域的含44个氨基酸的多肽。HIV菌株IIIB在这一区域的序列包括N-连接糖基化信号，因此由293细胞通过瞬间表达或由NS/O骨髓瘤细胞通过稳定转染所产生的Fcgp41pep626融合蛋白表现出在SDS-PAGE分析时迁移率的高度变化，由此说明糖基化程度的不均一性。
尽管这一病毒抗原很小(44氨基酸残基)且是异源糖基化但可能在Balb/c小鼠(参见图14)中引发免疫应答。此种情况下，以5只小鼠为一组第一天以牙内地方式注射25μg Fc-gp41pep626，并在两周期间再注射两次，或单独(空心菱形)或与2.5μg Fc-佐剂融合蛋白Fc-GMCSF(空心方块)或Fc-IL2(实心三角)共同施用。图14A和14B分别代表在第二次加强后7天和33天的抗体滴度。
该免疫应答更依赖于与Fc-细胞因子共同施用，花费较长时间以获得高抗体滴度。可以理解用修饰这一不含糖基化信号的序列(事实上，许多菌株并不编码这一位点)或通过酶学方法在体外去除糖链可以引发强免疫应答。
实施例11：Fc-融合体的佐剂活性
包含细胞表面分子胞外结构域的蛋白
为构建Fc-佐剂融合蛋白，有时可以将Fc与膜结合蛋白胞外结构域相融合。例如CD40配体(CD40L)在N末端与Fc的C末端相融合。可选择使用接头。
CD40L是有用的因为其受体CD40，在B表面表达，而且起包括在由T细胞对B细胞的刺激过程中。类似于肿瘤坏死因子，CD40L是三聚体其可引起在细胞表面其受体的二聚体化或三聚体化。结果细胞间的受体结构域产生接触和信号转导。与TNF一样，CD40L可能是膜结合的但也可能从细胞表面切除，类似于细胞因子的功能。
Fc-CD40L融合蛋白与Fc-抗原融合蛋白共同施用于动物。在对照实验中，该Fc-CD40L蛋白和该Fc-抗原蛋白施用于不同组的动物。可以理解注射了两种融合蛋白的动物比单独施用一种融合蛋白的动物产生高的抗体滴度。
另外，单一的包含抗原和CD40L组分的Fc融合蛋白组分与可选择的与位于Fc，CD40L，和抗原组分之间的接头共同使用。该融合蛋白可能是N-末端到C-末端方向的Fc-(L)-抗原-(L)-CD40L，FC-(L)-CD40L-(L)-抗原，抗原)L)-CD40L-(L)-Fc，CD40L-(L)-抗原-(L)-Fc，抗原-(L)-Fc-(L)-CD40L，或CD40L-Fc-(L)-抗原-(L)。该包括Fc，抗原，和CD40L的融合蛋白注射到动物中并测定抗体滴度。将融合蛋白与CD40L和抗原共同注射小鼠所产生的抗体滴度比单独注射仅包括Fc和抗原、或Fc和CD40L的融合蛋白所产生的抗体滴度高。
根据上述施用融合蛋白，可以通过静脉，皮下或其它合适的方式注射动物。首次和加强施用抗体和/或佐剂免疫之间的时间以及测定抗体滴度的方法如前面的实施例所述。
可选择的可以使用标准的剂量和分析策略。
等同声明
在不背离本发明的本质或基本特征的前提下，本发明还包括其他特定的形式。上述的实施例可从各方面解释本发明但并不作为对本发明的限定。本发明的范围由附加的权利要求来界定，并非根据上述描述限定，但在与权利要求等同的含义和范围内的所有变化均应视为包括在本发明的范围内。
参考文献
上述的所有专利文献和科学出版物的教导均包含于此作为参考。
                            序列表
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<160>22
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：IL-4R引物
<400>1
gtcccgggta tgaaggtctt gcaggagc                                    28
<210>2
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：IL-4R引物
<400>2
cccctcgagc tagtgctgct cgaagggctc cctg                             34
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：PSMA引物
<400>3
aagcttaaat cctccaatga agc                                         23
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：PSMA引物
<400>4
ctcgagttag gctacttcac tcaaag                                      26
<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：EpCAM引物
<400>5
ccccgggtaa acaggaagaa tgtgtctgtg                                  30
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：EpCAM引物
<400>6
ctcgagtcat tttagaccct gcattgag                                    28
<210>7
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：EpCAM引物
<400>7
tctagagcag catggcgccc ccgc                                        24
<210>8
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：EpCAM引物
<400>8
ccttaagcac cctgcattga gaattcag                                    28
<210>9
<211>148
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：编码HIV IIIB gp41的氨基酸残基626-669的DNA
<400>9
cccgggatcc ctgatccact ccctgatcga ggaatcccag aaccagcaag agaagaacga  60
gcaggagctg ctggagctcg acaagtgggc ctccctgtgg aactggttca acatcaccaa  120
ttggctgtgg tacatcaagt gactcgag                                     148
<210>10
<211>44
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：来自pdC-muFC载体的融合多肽
<400>10
Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys
  1               5                  10                  15
Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn
             20                  25                  30
Trp Phe Asn Ile Thr Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys
         35                  40
<210>11
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：小鼠IL2引物
<400>11
ggcccgggta aagcacccac  ttcaagctcc                                 30
<210>12
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：小鼠IL2引物
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ccctcgagtt attgagggct tgttg                                       25
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：小鼠GMCSF引物
<400>13
cccgggaaaa gcacccgccc gctcaccc                                    28
<210>14
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：小鼠GMCSF引物
<400>14
ctcgagtcat ttttggcttg gttttttgc                                   29
<210>15
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：小鼠Flt3配基引物
<400>15
caagcttca cctgactgtt acttcagc                                     28
<210>16
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：小鼠FLt3配基引物
<400>16
ctcgagtcaa ggctctggga gctccgtggc                                  30
<210>17
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：小鼠IL-12p35引物
<400>17
ccccgggtag ggtcattcca gtctctgg                                    28
<210>18
<2ll>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：小鼠IL-12p35引物
<400>18
ctcgagtcag gcggagctca gatagc                                      26
<210>19
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：小鼠IL12p40引物
<400>19
tctagaccat gtgtcctcag aagctaac                                    28
<210>20
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：小鼠IL12 p40引物
<400>20
ctcgagctag gatcggaccc tgcag                                       25
<210>21
<211>83
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：MSCP肽
<400>21
Gln Gly Ala Thr Leu Arg Leu Asp Pro Thr Val Leu Asp Ala Gly Glu
  1               5                  10                  15
Leu Ala Asn Arg Thr Gly Ser Val Pro Arg Phe Arg Leu Leu Glu Gly
             20                  25                  30
Arg His Gly Arg Val Val Arg Val Pro Arg Ala Arg Thr Glu Pro Gly
         35                  40                  45
Gly Ser Gln Leu Val Glu Gln Phe Thr Gln Gln Asp Leu Glu Asp Gly
     50                  55                  60
Arg Leu Gly Leu Glu Val Gly Arg Pro Glu Gly Arg Ala Pro Gly Pro
 65                  70                  75                  80
Ala Gly Asp
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：可用作佐剂的寡聚脱氧核苷酸
<400>22
tccatgacgt tcctgacgtt                                             20

Claims (10)

1.一种用于在哺乳动物中引发增强的针对肽/蛋白抗原的免疫应答的组合物，该组合物包含：
(i)包含通过多肽键连接到所述抗原上的免疫球蛋白重链恒定区的融合蛋白；和
(ii)包含通过多肽键连接到佐剂蛋白上的免疫球蛋白重链恒定区的融合蛋白，所述佐剂蛋白是细胞因子，所述细胞因子选自IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-12、IL-18、TNF和GMCSF。
2.权利要求1的组合物，其中的细胞因子是GMCSF。
3.权利要求1的组合物，其中的抗原选自：前列腺特异的膜抗原、细胞因子受体胞外结构域、病毒蛋白和肿瘤特异性蛋白。
4.权利要求1的组合物，其中每个免疫球蛋白重链恒定区都包括CH2结构域和CH3结构域。
5.权利要求1的组合物，其中每种融合蛋白都是免疫球蛋白的Fc部分。
6.权利要求1的组合物，其中每种融合蛋白都能结合Fc受体。
7.权利要求1-6中任一项的组合物在制备适合用作在哺乳动物中增强抗原免疫原性的疫苗的药物中的用途，其中同针对不与佐剂蛋白一起给予的融合蛋白中抗原的免疫应答相比，佐剂融合蛋白增强针对融合蛋白中抗原的免疫应答。
8.权利要求7的用途，其中的融合蛋白同时施用。
9.权利要求7的用途，其中的融合蛋白在哺乳动物中共定位于相同或相似细胞类型上。
10.权利要求1-6中任一项的组合物在制备适合用作在哺乳动物中增强抗原免疫原性的疫苗的药物中的用途，其中与单独的抗原相比，融合蛋白中的抗原在哺乳动物中引发更强的免疫应答。
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