CN1302107C - 与硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶基因互补的寡核苷酸序列以及将其用于调节细胞生长的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及互补于硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶的寡核苷酸，其在哺乳动物中调节肿瘤细胞生长。本发明也涉及利用这类化合物抑制哺乳动物细胞中肿瘤细胞生长的方法。本发明还涉及包括药学可接受的赋形剂以及有效量的本发明化合物的药物组合物。

Description

与硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶基因互补的寡核苷酸序列 以及将其用于调节细胞生长的方法

                   参考的有关申请

本申请要求于1998年1月30日提交的美国临时申请号60/073,196的优先权，此处以参考文献方式将该申请完整并入。

                    本发明背景

本发明领域

本发明涉及与可调节哺乳动物肿瘤细胞生长的硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶基因互补之寡核苷酸序列。本发明还涉及将这种化合物用于抑制哺乳动物肿瘤生长的方法。本发明又涉及含有药学可接受赋形剂和有效量的本发明化合物的药物组合物。

参考文献

以上标数字来引用下列出版物、专利申请和专利：

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如同每个出版物、专利申请或专利各自以参考文献方式完整引入，将所有上述出版物、专利申请或专利以参考文献完整并入本发明。

现有技术

硫氧还蛋白是一种小的遍在氧化还原蛋白质，最初确认为是对DNA合成很重要的核糖核苷酸还原酶的还原辅因子¹。硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶构成硫氧还蛋白系统。硫氧还蛋白还原酶是一种含硒代半胱氨酸的黄素酶，它使用NADPH作为质子供体来还原硫氧还蛋白，硫氧还蛋白随之还原其它蛋白质，并因之影响其功能。

近年来，已经暗示哺乳动物硫氧还蛋白参与多种其它的生化途径。例如，它通过二巯基二硫化物(dithiol disulfide)交换调节转录因子的氧化还原性质，从而改变它们的DNA结合特性。转录因子诸如NF-κB³，BZLFI⁴和TFIIIC⁵被直接调节，而AP-1的激活是由核氧化还原因子Ref-1间接介导的，Ref-1进一步被硫氧还蛋白还原⁶。此外，已经显示硫氧还蛋白能够促进含二硫化物的蛋白质的重折叠，激活糖皮质激素或白介素-2-受体，抑制人免疫缺陷病毒在巨噬细胞中表达，降低H₂O₂清除自由基，保护细胞对抗氧化压力，以及作为一种早期妊娠因子。

已经显示克隆的人硫氧还蛋白与HTLV-1转化的T-细胞释放的称为成人T-细胞白血病衍生因子的生长因子类似⁷。它使用一种途径分泌。胞外表达的硫氧还蛋白刺激正常成纤维细胞、淋巴细胞和多种人实体瘤细胞系的增殖^8&9。使用氧化还原无活形式显示生长刺激需要硫氧还蛋白的氧化还原活性⁹。硫氧还蛋白的生长刺激看来是通过将细胞对其它生长因子致敏间接诱导的¹⁰。随后，报道硫氧还蛋白在某些原发肿瘤诸如肺、结肠、宫颈和肝细胞癌中过量表达^11-14。此外，用野生型硫氧还蛋白cDNA转染的人乳腺癌细胞显示出增强的肿瘤生长¹⁵，在体内降低的自发性凋亡¹⁶，和对多种抗癌治疗化合物诱导的凋亡的，敏感性降低¹⁶。另一方面，用显性-阴性、氧化还原-无活性的突变体硫氧还蛋白转染的细胞，在体外显示出降低的不依赖锚定的生长，以及在体内显示出的肿瘤生长抑制¹⁵。

多种人肿瘤显示出硫氧还蛋白还原酶的过量表达¹²。抗肿瘤的醌类^17-18，亚硝基脲和13-顺式-视黄酸对细胞硫氧还蛋白还原酶的抑制，导致硫氧还蛋白系统活性降低，并随后造成生长抑制性活性。

使用反义寡核苷酸，以靶特异性形式通过与靶mRNA的序列特异性杂交抑制了基因表达²。反义寡核苷酸介导的癌基因抑制已揭示这些化合物可用于鉴定支配癌发生的机制，以及亦可有前途的用作治疗癌症的新治疗化合物²²。因而，需要鉴定针对硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶的反义寡核苷酸，其以高特异性和低毒性抑制硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶的表达。

                      发明的概述

本发明涉及调节硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶基因在哺乳动物肿瘤细胞中的表达的反义寡核苷酸，以及含有这种反义寡核苷酸的药物组合物。本发明还涉及使用这类反义寡核苷酸抑制哺乳动物中肿瘤细胞生长和迁移的方法。

相应的，在其组合物的一个方面，本发明涉及一种反义寡核苷酸，该寡核苷酸含有大约3至大约50个核苷酸，该核苷酸与哺乳动物的硫氧还蛋白mRNA或硫氧还蛋白还原酶mRNA互补。反义寡核苷酸可以是核酸酶抗性的，并且可能有一个或多个硫代磷酸酯核苷酸之间的连键。反义寡核苷酸可能进一步含有其它不与硫氧还蛋白mRNA或硫氧还蛋白还原酶mRNA互补的核苷酸。

在组合物的另一个方面，本发明涉及一种含有从大约17至大约50个核苷酸的反义寡核苷酸，其中的寡核苷酸包含选自由表1所示的序列2601-2626[SEQ ID No：1-26]的序列。

在组合物的又一个方面，本发明涉及一种含有从大约20至大约50个核苷酸的反义寡核苷酸，其中的寡核苷酸包含选自由表2所示的序列3001-3040[SEQ ID No：27-66]的序列。

在组合物的再一个方面，本发明涉及一种药物组合物，它含有药学可接受赋形剂和有效量的反义寡核苷酸，该寡核苷酸含有从大约3至大约50个核苷酸，该核苷酸与哺乳动物的硫氧还蛋白基因或硫氧还蛋白还原酶基因互补。

在组合物的另一个方面，本发明涉及一种药物组合物，它含有药学可接受赋形剂和有效量的反义寡核苷酸，该寡核苷酸含有从大约17至大约50个核苷酸，其中的寡核苷酸包含选自由表1所示的序列2601-2626[SEQ ID No：1-26]的序列。

在组合物的又一个方面，本发明涉及一种药物组合物，它含有药学可接受赋形剂和有效量的反义寡核苷酸，该寡核苷酸含有从大约20至大约50个核苷酸，其中的寡核苷酸包含选自由表2所示的序列3001-3040[SEQ ID No：27-66]的序列。

在其方法的一个方面，本发明涉及一种抑制哺乳动物肿瘤生长的方法，包括在一定的条件下对怀疑有肿瘤的哺乳动物施用有效量的反义寡核苷酸，使得抑制肿瘤的生长，该寡核苷酸包括与哺乳动物硫氧还蛋白基因互补的大约3个核苷酸至大约50个核苷酸。可将反义寡核苷酸与化疗剂一起给药。

在方法的另一个方面，本发明涉及一种抑制哺乳动物肿瘤生长的方法，包括在一定条件下对怀疑有肿瘤的哺乳动物施用有效量的反义寡核苷酸，使得抑制肿瘤的生长，该寡核苷酸包括与哺乳动物硫氧还蛋白还原酶基因互补的大约3核苷酸至大约50个核苷酸。可将反义寡核苷酸与化疗剂一起给药。

在方法的又一个方面，本发明涉及一种抑制哺乳动物肿瘤迁移的方法，包括在一定条件下对怀疑有迁移肿瘤的哺乳动物施用有效量的反义寡核苷酸，使得抑制肿瘤的迁移，该寡核苷酸包括与哺乳动物硫氧还蛋白基因互补的大约3个核苷酸至大约50个核苷酸。可将反义寡核苷酸与化疗剂一起给药。

在方法的再一个方面，本发明涉及一种抑制哺乳动物肿瘤迁移的方法，包括在一定的条件下对怀疑有肿瘤的哺乳动物施用有效量的反义寡核苷酸，使得抑制肿瘤迁移，该寡核苷酸包括与哺乳动物硫氧还蛋白还原酶基因互补的大约3个核苷酸至大约50个核苷酸。可将反义寡核苷酸与化疗剂一起给药。

                附图的简要描述

图1A是硫氧还蛋白mRNA在不同细胞系中Northern印迹的放射自显影图：人正常胚胎肺细胞系(WI-38)，纤维肉瘤(HT-1080)，肺癌(A549)，卵巢腺癌(SK-OV-3)，肝细胞癌(Hep G2)，黑素瘤(C8161)，乳腺癌(MDA-MB-231)，迁移性胰腺癌(AsPC-1)，结肠腺癌(HT-29)，宫颈癌(HeLa S3)。

图1B是在不同细胞系中表达的硫氧还蛋白蛋白质的Western印迹的照片。

图2是硫氧还蛋白的cDNA序列[SEQ ID No：67和68]。标出了26种不同的寡核苷酸退火的杂交位点。

图3A-3F的图显示用与硫氧还蛋白cDNA互补的26种不同反义寡核苷酸处理后，多种人癌细胞系集落形成能力的抑制百分数。检测的细胞系是人结肠癌HT-29(图3A)，人乳腺癌细胞系MDA-MB-231(图3B)，人肝癌细胞系HepG2(图3C)，人黑素瘤细胞系A2058(图3D)，人卵巢癌细胞系SK-OV-3(图3E)和人肺癌细胞系A549(图3F)。

图4A图示在用与硫氧还蛋白mRNA互补的6种反义寡核苷酸处理后人肝癌细胞系HepG2中降低的硫氧还蛋白mRNA水平，以相对未处理细胞系中mRNA水平的百分数表示。

图4B图示在用与硫氧还蛋白mRNA互补的6种反义寡核苷酸处理后人乳腺癌细胞系MDA-MB-231中降低的硫氧还蛋白mRNA水平，以相对未处理细胞系中mRNA水平的百分数表示。

图5A是显示用所示反义寡核苷酸处理后，硫氧还蛋白蛋白质在人结肠癌细胞系HT-29中表达水平的Western印迹照片。

图5B是显示用所示反义寡核苷酸处理后，硫氧还蛋白蛋白质在人乳腺癌细胞系MDA-MB-231中表达水平的Western印迹照片。

图5C是显示用反义寡核苷酸2601[SEQ ID NO：1]处理后，硫氧还蛋白蛋白质在人结肠癌细胞系HT-29、人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和人肝癌细胞系HepG2中表达水平的Western印迹照片。下面一栏显示各泳道的蛋白质加样是一致的。

图6A是每隔一天用所示反义寡核苷酸静脉内处理小鼠后，肿瘤在裸鼠中的大小对时间的作图。

图6B是每隔一天用所示反义寡核苷酸静脉内处理小鼠后大约10天，从裸鼠去除的肿瘤的重量的图示。

图6C图示每隔一天用所示反义寡核苷酸静脉内处理小鼠后大约10天，从裸鼠切除的人结肠癌HT-29肿瘤中硫氧还蛋白蛋白质表达水平的Western印迹照片。在下面显示用印度墨水染色的部分印迹来说明蛋白质加样。

图7是Northern印迹的放射自显影图，显示在所示肿瘤细胞系中表达的硫氧还蛋白还原酶mRNA水平。

图8A-8D的图显示用与硫氧还蛋白还原酶mDNA互补的40种不同反义寡核苷酸处理后，多种人癌细胞系集落形成能力的抑制百分数。检测的细胞系是人乳腺癌细胞系MDA-MB-231(图8A)、人黑素瘤A2058(图8B)、人肝癌HepG2(图8C)和人胰腺癌SU.86.86(图8D)。

图9A和图9B图示在用所示反义寡核苷酸处理后细胞系中硫氧还蛋白还原酶mRNA表达水平，以相对未处理细胞系中mRNA水平的百分数表示。图9A是人结肠癌细胞系HT-29，图9B是人乳腺癌细胞系MDA-MB-231。

图10是显示用反义寡核苷酸3014和3037[SEQ ID NO：40和63]处理后，硫氧还蛋白还原酶蛋白质在人胰腺癌细胞系AsPC-1中表达水平的Western印迹照片。

图11A是每隔一天用所示反义寡核苷酸静脉内处理小鼠后，人肿瘤在裸鼠中的大小对时间的作图的图示。

图11B是每隔一天用所示反义寡核苷酸静脉内处理小鼠后大约10天，从小鼠去除的人肿瘤的重量的图示。

图12图示每隔一天用所示反义寡核苷酸静脉内处理小鼠后大约10天，从裸鼠切除的人结肠癌HT-29肿瘤中硫氧还蛋白还原酶蛋白质表达水平的Western印迹照片。

                    本发明的详细描述

定义

此处使用的下列术语具有下面的含义：

此处使用的术语”反义寡核苷酸”是指与所需的mRNA互补的核苷酸序列。优选的，反义寡核苷酸与硫氧还蛋白mRNA或硫氧还蛋白还原酶mRNA互补。预期反义寡核苷酸可与mRNA的5′非翻译区、编码区或mRNA的3′非翻译区中的任一个互补。

术语“寡核苷酸”是指由天然碱基、糖和糖间(骨架)键组成的核苷酸或核苷单体之寡聚体或多聚体。该术语还包括具有类似功能的含有非天然单体或其部分的修饰或取代寡聚体。由于例如增强的细胞吸收或在核酸酶存在下具增加的稳定性等特征，这种修饰或取代寡聚体相对天然形式是优选的。该术语还包括含有两个或更多化学独特区的嵌合寡核苷酸。例如，嵌合寡核苷酸可含有赋予有益特征(例如，增加的核酸酶抗性，摄入到细胞的增加)的至少一个修饰核苷酸的区域，或可将本发明的两个或多个寡核苷酸联结形成嵌合寡核苷酸。

本发明的反义寡核苷酸可以是核糖核酸或脱氧核糖核酸，并可含有天然存在或合成的单体碱基，包括腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶和尿嘧啶。寡核苷酸亦可含有修饰碱基，诸如黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，6-甲基、2-丙基和其它烷基腺嘌呤，5-卤代尿嘧啶，5-卤代胞嘧啶，6-氮杂尿嘧啶，6-氮杂胞嘧啶和6-氮杂胸腺嘧啶，假尿嘧啶，4-硫代尿嘧啶，8-卤代腺嘌呤，8-氨基腺嘌呤，8-巯基腺嘌呤，8-烷硫基(thiolalkyl)腺嘌呤，8-羟基腺嘌呤和其它8-取代的腺嘌呤，8-卤代鸟嘌呤，8-氨基鸟嘌呤，8-巯基鸟嘌呤，8-烷硫基鸟嘌呤，8-羟基鸟嘌呤和其它8-取代的鸟嘌呤，其它氮杂和脱氮杂尿嘧啶，胸腺嘧啶，胞嘧啶或鸟嘌呤，5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶。修饰亦可包括将其它化学基团诸如甲基、乙基、丙基等基团附加到寡核苷酸的不同部位，包括糖、碱基或骨架组分。

本发明的反义寡核苷酸亦可在磷酸骨架中含有修饰的磷氧杂原子，短链烷基或环烷基糖间键或短链杂原子或杂环糖间键。例如，反义寡核苷酸可含有甲基膦酸酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，和吗啉代寡聚物。在本发明的一个实施方案中，反义寡核苷酸含有连接4至6的3′末端核苷酸的硫代磷酸酯键。在另一实施方案中，硫代磷酸酯键连接所有的核苷酸。反义寡核苷酸亦可有糖模拟物。

本发明的反义寡核苷酸亦可包含核苷酸类似物，其中核苷酸的结构有根本改变。这种寡核苷酸类似物的例子是肽核酸(PNA)，其中DNA(或RNA)中的脱氧核糖(或核糖)磷酸骨架由类似于肽中发现的聚酰胺骨架代替。(Nielsen等²⁹；Good和Nielsen³⁰；Buchardt，已故，等³¹；美国专利5,766,855；Buchardt，已故，等³²，美国专利5,719,262)。PNA类似物已经显示能抵抗酶降解，并在体内和体外具有延长的寿命。由于PNA链和DNA链间缺少电荷排斥，PNA与互补DNA序列的结合亦强于与天然核酸分子的结合。

本发明的寡核苷酸亦可包括其它含有多聚物骨架、环状骨架或无环骨架的核苷酸。例如，核苷酸可含有吗啉代骨架结构(美国专利5,034,506³³)。

当被修饰从而对DNA和RNA核酸酶降解不敏感或将它们放入保护寡核苷酸免受DNA和RNA核酸酶作用的递送载体时，本发明的寡核苷酸具“核酸酶抗性”。核酸酶抗性寡核苷酸包括，例如，甲基膦酸酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，和吗啉代寡聚体。赋予核酸酶抗性的合适的递送载体包括例如脂质体。

本发明的寡核苷酸亦可含有基团，诸如改进寡核苷酸药物动力学特性的基团，或改进寡核苷酸药效学特性的基团。优选的，寡核苷酸不含有报告基团或标记，诸如荧光染料或放射活性标记。

反义寡核苷酸优选的选自与硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶基因互补的序列，这样该序列可能出现双螺旋形成、发夹形成和同寡聚体/序列重复的可能最小，但具有高至适中的与硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶基因序列结合的能力。这些特性可使用计算机模建程序OLIGO引物分析软件(OLIGO Primer Analysis Software)，版本5(国家生物科学公司(National Biosciences，Inc.)发布，Plymouth，MN)。这种计算机程序可以确定这五种参数的定性估计。

另外，反义寡核苷酸亦可基于两种或多种哺乳动物物种间的硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶基因的序列是高度保守的来选择。这些特性可使用威斯康星大学计算机小组(GCG)软件(Devereux J.等人³⁵)的BLAST程序(Altschul，等人³⁴)利用国立生物技术信息中心(NCBI)的数据库确认。

反义寡核苷酸可包括突变，诸如置换，插入和缺失。优选的将有低于10％的序列有突变。

反义寡核苷酸一般含有至少大约3个核苷酸或核苷酸类似物，优选的从大约3个至大约100个核苷酸或核苷酸类似物，更优选的从大约3个至大约50个核苷酸或核苷酸类似物，最优选的从大约17个至大约35个核苷酸或核苷酸类似物。

优选的，反义寡核苷酸含有表1和2中列举的序列(下面)。

                          表1

具有与人硫氧还蛋白mRNA互补的序列的反义寡核苷酸

SEQ IDNo：	命名	序列5’-3’	Tm(℃)	ΔG(kcal/mol)
					1	2601	TCC AAA GCA CCA AAC AGA GC	61.9	-38.2
2	2602	GAT GGA AAT GGA TCC AA	50.7	-31.6
					3	2603	TAA GGA CCG ATG GAA ATG GA	61.2	-38.8
4	2604	GAC GAG CGG CTG TAA GGA CC	65.4	-41.0
					5	2605	TTG GCT GCT GGA GTC TGA CG	65.2	-39.3
6	2606	GCT TCA CCA TCT TGG CTG CT	63.5	-39.3
					7	2607	GCT CTC GAT CTG CTT CAC CA	61.7	-37.7
8	2608	GCG TCC AAG GCT TCC TGA AA	66.0	-41.4
					9	2609	GTT TAT CAC CTG CAG CGT CC	61.4	-38.3
10	2610	ACG TGG CTG AGA AGT CAA CT	57.7	-35.7
					11	2611	GAT CAT TTT GCA AGG CCC AC	63.7	-39.8
12	2612	GGC TTG ATC ATT TTG CAA GG	61.7	-38.9

SEQ IDNo：	命名	序列5’-3’	Tm(℃)	ΔG(kcal/mol)
					13	2613	AGG GAA TGA AAG AAA GGC TT	58.7	-38.4
14	2614	TCA CGT TGG AAT ACT TTT CA	54.7	-34.7
					15	2615	CAT CCA CAT CTA CTT CAA GG	53.2	-33.8
16	2616	TCT GAA GCA ACA TCC TGA CA	57.4	-34.8
					17	2617	GGC ATG CAT TTG ACT TCA CA	60.7	-36.8
18	2618	TCA CCC ACC TTT TGT CCC TT	62.5	-39.1
					19	2619	GGC TTC AAG CTT TTC CTT	55.4	-35.3
20	2620	ATA TTT TCA GAA ACA TGA TT	47.3	-31.8
					21	2621	CAA TGG CTG GTT ATA TTT TC	53.9	-35.5
22	2622	GTT TTA AAT AGC TCA ATG GC	53.6	-35.6
					23	2623	TTA AAA AAA TTA CAA GTT TT	46.7	-32.4
24	2624	GCA ACT GGG TTT ATG TCT TC	55.5	-35.4
					25	2625	TCA CGC AGA TGG CAA CTG GG	68.2	-41.0
26	2626	GTT TTA TTG TCA CGC AGA TG	54.7	-34.6

                    表2

具有与人硫氧还蛋白还原酶mRNA互补的序列的反义寡核苷酸

SEQ IDNo：	命名	序列5’-3’	Tm(℃)	ΔG(kcal/mol)
					27	3001	CCC GAC GCA GAG CTT ACA AG	64.4	-40.4
28	3002	GCT CGC GGC TTT GTC TGG TT	68.4	-42.8
					29	3003	CCG TCC CCC GCG TGC TCC CA	80.0	-49.9
30	3004	GCT GTC GTC CCC GCC GGC AG	77.9	-48.4

SEQ IDNo：	命名	序列5’-3’	Tm(℃)	ΔG(kcal/mol)
					31	3005	CTG CTG CAC CCA GGC GCA AT	72.1	-44.3
32	3006	TCT TCC CTT CCC CGA GAC GC	69.4	-43.7
					33	3007	CCG TCT GCT CAG ACA CGC CT	66.7	-40.4
34	3008	CCG CAC ACG CCA CGA AGC TG	73.5	-44.5
					35	3009	GAA GCT TTG TGT GAC CGG GT	63.1	-39.0
36	3010	TCA GGG CCC GAC CGT CCT CA	73.5	-44.9
					37	3011	GCA GAT CGG TTT CCG CGG CC	74.8	-47.4
38	3012	GGT TGG ACC ATG GCC GCC TA	70.8	-44.3
					39	3013	AGG GCC GTT CAT TTT TAG TA	58.2	-38.3
40	3014	AGA TCT TCA GGG CCG TTC AT	61.9	-39.1
					41	3015	AGC AGC TGC CAG ACC TCC TG	65.9	-40.3
42	3016	CAA GAG GGG TGG GAG TGA CA	63.5	-38.5
					43	3017	TTT CGA GAG TCT TGC AGG GC	63.7	-39.6
44	3018	CTC GGT AGC CCC AAT TCA AA	63.6	-40.7
					45	3019	TTG TCA CCA GGG ATG CCC AA	67.4	-40.8
46	3020	TCC AAA GCG ACA TAG GAT GC	61.9	-38.8
					47	3021	CCT ATT GCC AGC ATC ACC GT	64.2	-40.0
48	3022	CTG GAT TGC AAC TGG GGT GA	64.6	-39.3
					49	3023	CCT CAG AAA GGC CAC AAG CA	64.4	-39.7

SEQ IDNo：	命名	序列5’3’	Tm(℃)	ΔG(kcal/mol)
					50	3024	TTG AGC GCA GCT GCA AAG CC	70.5	-43.5
51	3025	GAG CGC TTG GTC ACA GAC AA	62.6	-37.8
					52	3026	AAC AGC ATC CAC ACT GGG GC	66.1	-40.2
53	3027	GCA CGG AAA CGA GCC AGT GG	69.3	-42.5
					54	3028	ACG CAG GTG CCA AGA GCC CA	71.6	-43.8
55	3029	GTG ACC CCA GTG TGA TGC TG	62.1	-36.9
					56	3030	TCG ATG CCC TGC CAA ATG TC	67.2	-41.2
57	3031	ACA GTT GTT CCA TCA CCG CC	63.7	-38.9
					58	3032	TCC CTT CCA TGC AAC AAG AC	61.4	-37.8
59	3033	TTT CCC GGG ACA AGC CTA CA	66.2	-41.7
					60	3034	GCA CAC AGG GGC AAA TTT GG	66.8	-41.4
61	3035	CTA CCA AAT GCC AGG CAA TG	62.4	-39.2
					62	3036	TGT TTC TCC CCC ATT TCT GG	63.1	-39.6
63	3037	GTT CCC TGA GGT GGC CCA GA	67.6	-41.5
					64	3038	ACG GTC AGG GGC TCT GCT GC	70.4	-43.2
65	3039	ATG AGG ACG TGA GGC AGA GC	63.1	-38.6
					66	3040	TGG TCA ACT GCC TCA ATT GC	62.5	-38.1

在表1和表2中，“Tm”是依据最近邻热动力学数值计算的寡核苷酸双链的解链温度。在此温度下50％的核酸分子是双链，50％是变性的。“ΔG”是寡核苷酸的自由能，是寡核苷酸双链稳定性的量度。

术语“烷基”是指单价烷基基团，优选的有1至20个碳原子，并且更优选的1至6个碳原子。此术语例示为诸如甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，正己基等基团。

术语“芳基”是指有6至14个碳原子的不饱和芳香碳环基团，含单环(例如，苯基)或多个稠(融合)环(例如，萘基或蒽基)。优选的芳基包括苯基，萘基等等。

术语“环烷基”是指有3至20个碳原子的环状烷基基团，含一个单环或多个稠环。这类环烷基基团包括，例如，单环结构诸如环丙基，环丁基，环戊基，环辛基等等，或多环结构诸如金刚烷基等等。

术语“卤”或“卤素”是指氟，氯，溴和碘，并且优选的是氟或氯。

术语“巯基”是指基团-SH。

对于含有一个或多个取代基的任何上述基团，当然应该理解这种基团不含有立体上不实际的和/或合成上不适当的任何取代或取代模式。此外，本发明的化合物包括所有由于这些化合物的取代产生的立体化学异构体。

术语“药学可接受的盐”是指保留本发明反义寡核苷酸的生物学效应和特性，并且并非生物学或其它方面不适当的盐。在很多情况下，本发明的反义寡核苷酸可以由于氨基和/或羧基基团或其上类似基团的存在能够形成酸性和/或碱性盐。

药学可接受的碱加成盐可从无机和有机碱制备。从无机碱衍生的盐以举例方式包括钠，钾，锂，铵，钙和镁盐。盐衍生自的有机碱包括但不限于伯胺，仲胺和叔胺，诸如烷基胺，二烷基胺，三烷基胺，取代烷基胺，二(取代的烷基)胺，三(取代的烷基)胺，链烯基胺，二链烯基胺，三链烯基胺，取代的链烯基胺，二(取代的链烯基)胺，三(取代的链烯基)胺，环烷基胺，二(环烷基)胺，三(环烷基)胺，取代的环烷基胺，二取代的环烷基胺，三取代的环烷基胺，环链烯基胺，二(环链烯基)胺，三(环链烯基)胺，取代的环链烯基胺，二取代的环链烯基胺，三取代的环链烯基胺，芳基胺，二芳基胺，三芳基胺，杂芳基胺，二杂芳基胺，三杂芳基胺，杂环胺，二杂环胺，三杂环胺，混合的二胺和三胺，其中至少胺上的两个取代基不同，并选自包括烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，环烷基，取代的环烷基，环链烯基，取代的环链烯基，芳基，杂芳基，杂环等。亦包括两个或三个取代基与氨基氮一起形成杂环或杂芳基基团的胺。

合适的胺之例子包括，以举例方式，异丙基胺，三甲基胺，二乙基胺，三(异丙基)胺，三(正丙基)胺，乙醇胺，2-二甲基氨基乙醇，tromethamine，赖氨酸，精氨酸，组氨酸，咖啡因，普鲁卡因，hydrabamine，胆碱，甜菜碱，1，2-乙二胺，葡糖胺，N-烷基葡糖胺，可可碱，嘌呤，哌嗪，哌啶，吗啉，N-乙基哌啶等等。应当理解在本发明的实践中可使用其它羧酸衍生物，例如，羧酸酰胺，包括酰胺类，低级烷基酰胺，二烷基酰胺等等。

药学可接受的酸加成盐可从无机酸和有机酸制备。盐衍生自的无机酸包括氢氯酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸，等等。盐衍生自的有机酸包括乙酸，丙酸，乙醇酸，丙酮酸，草酸，苹果酸，丙二酸，琥珀酸，马来酸，富马酸，酒石酸，柠檬酸，苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，对-甲基苯磺酸，水杨酸等等。

术语“硫氧还蛋白基因”是指编码能够用作核糖核苷酸还原酶或甲硫氨酸亚砜还原酶的氢供体之蛋白质的任何基因。优选的硫氧还蛋白基因编码能够调节转录因子(诸如NF-κB，BZLF1，TFIIIC和AP-1)的氧化还原特性，并改变它们的DNA结合特性的蛋白质。该蛋白质可具有的其它功能包括但不限于，促进含二硫键的蛋白质的重折叠的能力，激活糖皮质激素或白介素-2受体的能力，或抑制免疫缺陷病毒在巨噬细胞中的表达的能力，降低胞内水、清除自由基、保护细胞对抗氧化压力的能力以及作为一种早期妊娠因子的重要成分。优选的，硫氧还蛋白基因编码一种蛋白质，该蛋白质能够刺激正常成纤维细胞、淋巴细胞和多种人实体瘤细胞系的增殖，并能够刺激肿瘤生长和在人肿瘤中过量表达时降低细胞凋亡。

术语“硫氧还蛋白还原酶基因”是指编码能够催化硫氧还蛋白的NADPH-依赖性还原的蛋白质的任何基因。

术语“与...互补”意思是反义寡核苷酸序列能够结合到靶序列，即硫氧还蛋白基因(或mRNA)或硫氧还蛋白还原酶基因(或mRNA)。优选的反义寡核苷酸序列与靶序列至少有75％相同，与靶序列优选的至少90％相同，并且最优选的至少95％相同，允许有几个碱基的缺口或不匹配。相同性例如可以用威斯康星大学计算机小组(GCG)软件的BLASTN程序确定。如使用此处描述的OLIGO程序所确认，优选的反义寡核苷酸序列可与硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶mRNA在解链温度至少45℃，更优选至少在大约50℃并且最优选的至少在55℃杂交。

术语“抑制生长”意思是至少一种肿瘤细胞类型的生长降低至少10％，更优选的至少50％，并且最优选的至少75％。对于肿瘤细胞生长的降低可通过测量裸鼠中肿瘤的大小确定，或通过肿瘤细胞不能在体外形成集落确定。

术语“哺乳动物”或“哺乳动物的”是指所有哺乳动物包括人，绵羊，牛，马，猪，犬，猫和鼠等。

一个“怀疑有肿瘤的哺乳动物”意思是该哺乳动物可能有增殖性疾病或肿瘤，或已经诊断有增殖性疾病或肿瘤，或先前检测出有增殖性疾病或肿瘤，且已经手术去除肿瘤，以及怀疑该哺乳动物有一些残留肿瘤细胞。

制备反义寡核苷酸

本发明的反义寡核苷酸可通过常规和为人熟知的技术制备。例如，寡核苷酸可使用固相合成方法制备，特别是使用市售设备诸如加拿大应用生物系统公司，Mississauga，加拿大的设备制备。寡核苷酸也可通过本领域已知方法酶促降解天然存在的硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶基因来制备。

反义寡核苷酸的分离和纯化

如果需要，此处描述的反义寡核苷酸的分离和纯化可通过任何合适的分离和纯化方法实现，例如过滤，抽提，结晶，柱层析，薄层层析，厚层层析，制备型低压或高压液相层析或这些方法的组合。但是当然也可以使用其它等效的分离方法。

参照寡核苷酸的序列并使用本领域已知方法可以构建含有反义寡核苷酸序列的表达载体。

本领域熟练技术人员可以构建含有所有需要的表达元件的载体，以实现反义寡核苷酸序列的所需转录。这样，本发明提供了含有有效连接于编码反义寡核苷酸的序列的转录控制序列的载体。合适的转录和翻译元件可来自不同来源，包括细菌，真菌，病毒，哺乳动物或昆虫基因。适当元件的选择依赖于选用的宿主细胞。

在载体中可含有报告基因。合适的报告基因包括β-半乳糖苷酶(即lacZ)，氯霉素乙酰转移酶，萤火虫萤光素酶，或一种免疫球蛋白或其部分。可以通过监测报告基因的表达来监测反义寡核苷酸的转录。

可以通过多种已知方法中的任一种将载体引入细胞或组织。这类方法可参考Sambrook等人²⁴；Ausubel等²⁵；Chang³⁶；Vega等³⁷；和载体：分子克隆载体及其应用³⁸的综述等，包括例如稳定或瞬时转染，脂质转染法，电穿孔和用重组病毒载体感染。

通过感染导入核酸有很多优点。可以高效获得组织类型的特异性。病毒一般在特定细胞类型中感染和增殖。这样，可以利用病毒的特异性将载体在体内靶定于特异细胞类型或一种组织或细胞的混合培养物内。亦可用特异性受体或配体修饰病毒载体以改变通过受体介导事件的靶向特异性。

本发明的寡核苷酸可以是不溶的。例如，可将寡核苷酸与适当的载体结合。合适的载体例子是琼脂糖，纤维素，葡聚糖，葡聚糖凝胶，琼脂糖凝胶，羧甲基纤维素聚苯乙烯，滤纸，离子交换树脂，塑料膜，塑料管，玻璃珠，多胺-甲基乙烯基-乙醚-马来酸共聚体，氨基酸共聚体，乙烯-马来酸共聚体，尼龙，蚕丝等。载体可以是例如管、试盘、珠圆盘、球形等形状。

不可溶寡核苷酸可通过使用已知的化学或物理方法将其与适当的不可溶载体反应来制备，例如溴化氰偶联。

预期本发明的寡核苷酸可以是一种切割mRNA的核酶。核酶优选的含有与本发明寡核苷酸序列同源的序列以及切割mRNA必需的催化中心。例如，可以选择破坏硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶mRNA的同源核酶序列。本发明使用的核酶类型可选自本技术领域已知的类型。已经确认了多种核酶结构性家族，包括I组内含子，RNA酶P，肝炎delta病毒核酶，锤头核酶和来自烟草环斑病毒卫星RNA(sTRSV)的发夹核酶(Sullivan 1994，美国专利5,225,347³⁹)。锤头核酶和发夹核酶基元最常改造用于反式mRNA切割，用于进行基因治疗(Sullivan 1994)。本发明中优选的使用发夹核酶。通常，核酶长度为30至100核苷酸。

药物剂型

用作药物时，通常以药物组合物的形式施用反义寡核苷酸。这些化合物可通过不同途径给药，包括口服，直肠的，经皮的，皮下的，静脉内的，肌内的，和鼻内的给药。这些化合物作为注射和口服组合物均有效。这些组合物以制药学技术中熟知的方式制备，并至少含有一种活性化合物。药物组合物例如可以静脉内给药。预期可将药物组合物直接向要治疗的肿瘤给药。

本发明还包括这种药物组合物，它含有作为活性成分的一种或多种反义寡核苷酸，其与药学可接受载体或赋形剂结合在一起。为了制备本发明的组合物，通常将活性成分与赋形剂混合，用赋形剂稀释或包埋在特定载体中，载体可以是胶囊、小袋、纸或其它容器的形式。当赋形剂作为稀释剂时，其可以是固体、半固体或液体材料，用作活性成分的赋形剂、载体或介质。这样，组合物可以是下列形式，片剂，丸剂，粉剂，锭剂，袋剂，扁囊剂，酏剂，悬浮剂，乳剂，溶液，糖浆，气雾剂(固体或液体介质)，含有例如至10％(重量)的活性化合物的药膏、软或硬的明胶囊、栓剂、无菌注射液，以及无菌包装的粉剂。

制备制剂时，在与其它成分混合前可能需要将活性化合物研磨成适当的颗粒大小。如果活性化合物基本上是不可溶的，通常将其研磨成小于200目的颗粒大小。如果活性化合物基本上是水可溶的，通常通过研磨进行调节可提供在制剂中大体一致的分布，例如大约40目。

合适的赋形剂的例子包括乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，淀粉，阿拉伯胶，磷酸钙，藻酸盐，黄蓍胶，凝胶，硅酸钙，微晶纤维，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素，无菌水，糖浆，甲基纤维素。制剂另外可包括：润滑剂诸如滑石，硬脂酸镁，和矿物油；润湿剂；乳化和悬浮剂；防腐剂诸如苯甲酸甲基酯和苯甲酸羟基丙基酯；甜化剂；以及调味剂。可以将本发明的组合物经过配制，以在通过本领域熟知方法向病人给药后提供活性成分的快速、持续或缓释释放。

通常优选的将组合物制成单位剂量的形式，每剂量含有从大约3毫克至大约3克，更经常的大约10毫克至大约1.5克活性成分。术语“单位剂量形式”是指适用于人受试者和其他哺乳动物单位剂量的物理上分离的单位，每单位含有预先确定量的经计算可产生所需治疗效果的活性物质，以及与其结合的适当的药物赋形剂。

反义寡核苷酸在很宽的剂量范围内有效，并且通常以药学有效量给药。有效量是给药后能够减轻症状的量。优选的有效量是能够抑制肿瘤细胞生长的量。优选的有效量是从大约0.1mg/kg体重至大约20mg/kg体重。然而必须理解到，实际给药的反义寡核苷酸的量将由医师依据相关环境，包括要处理的病况、选择的给药方法、实际施用化合物的量、年龄、体重、个体病人的反应、病人症状的严重程度，等等来确定。疗程可以持续数天至数月，或直到获得疾病减轻。

为了制备固体组合物诸如片剂，将主要活性成分/反义寡核苷酸与药物赋形剂混合，形成含有本发明化合物的均匀混合物的固体制剂确定前的组合物。提及这些制剂确定前组合物为均匀时，是指活性成分在组合物中平均分散，从而可将组合物容易的分成同等有效的单位剂量形式，诸如片剂、丸剂和胶囊。

可将本发明的片剂或丸剂包衣或化合以提供具有延长作用优点的剂量形式。例如，片剂和丸剂可包括内和外剂量成分，后者是以前者的包被形式。两种成分可以用能够抵抗胃中的降解的包裹层分开，使内成分完整进入十二指肠或延迟释放。多种材料可用作这类包裹层或包衣，这类材料包括多种聚合酸以及聚合酸与诸如紫胶，十六烷醇和醋酸纤维素等的混合物。

可掺入本发明的新组分以适用于口服或注射给药的液体形式中，包括水溶液，合适的调味糖浆，水或油悬浮液，和使用食用油(诸如玉米油、棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油)的调味乳剂，以及酏剂和类似的药物载体。

用于吸入或吹入的组合物包括溶液和在药学可接受的水性或有机溶剂中的悬浮液，或其混合物以及粉剂。液体或固体组合物可含有此处描述的适当的药学可接受的赋形剂。优选的将组合物通过口或鼻呼吸途径给药以产生局部或系统性效果。可使用惰性气体将优选的药物可接受溶剂中的组合物气雾化。可从气雾装置直接吸入气雾溶液或将气雾装置配到面罩或间歇正压呼吸器上。溶液、悬浮液、或粉剂组合物可从以适当方式递送药剂的装置优选的经口或鼻给药。

本发明方法中使用的另一种优选制剂使用透皮递送装置(“贴剂”)。这种透皮贴剂可用于以可控制的量提供本发明反义寡核苷酸的连续或不连续灌输。本领域熟知如何构建和使用可用于递送药剂的透皮贴剂。参见，例如，美国专利5,023,252⁴⁰，此处引入作为参考。这类贴剂可构建肜于药剂的连续、脉动或依要求的递送。

另一个优选的递送方法涉及裸反义寡核苷酸穿过皮肤层的“鸟枪”递送。本技术领域熟知“裸”反义寡核苷酸的递送。参见，例如，Felgner等，美国专利5,580,859⁴¹。预期在“鸟枪”递送反义寡核苷酸前可将反义寡核苷酸包装到脂质载体。

下列制剂实施例描述了本发明的典型药物组合物。

                    制剂实施例1

制备了含下列成分的硬凝胶胶囊：

成分                          量(mg/胶囊)

活性成分                      30.0

淀粉                          305.0

硬脂酸镁                      5.0

以340mg的量将上述成分混合并填充到硬凝胶胶囊中。

                     制剂实施例2

使用下列成分制备片剂：

成分                          量(mg/片)

活性成分                      25.0

纤维素，微晶                  200.0

二氧化硅胶体                  10.0

硬脂酸                        5.0

将组分混合压缩成片剂，各重240mg。

                     制剂实施例3

制备了干粉吸入剂制剂，含下列成分：

成分                          重量％

活性成分                      5.0

乳糖                          95.0

将活性成分与乳糖混和，并将混合物加到干粉吸入装置。

                     制剂实施例4

片剂，各含有30mg活性成分，如下进行制备：

成分                          量(mg/片)

活性成分                      30.0mg

淀粉                          45.0mg

微晶纤维素                    35.0mg

聚乙烯吡咯烷酮                4.0mg

(在无菌水中制成10％溶液)

羧甲基淀粉钠                  4.5mg

硬脂酸镁                      0.5mg

滑石                          1.0mg

总计                          120mg

将活性成分、淀粉和纤维素穿过20号美国筛(U.S.sieve)并完全混合。将聚乙烯吡咯烷酮溶液与产生的粉剂混合，然后穿过16号美国筛。将产生的颗粒在50℃至60℃干燥，并穿过16号美国筛。然后将预先经过30号美国筛的羧甲基淀粉钠，硬脂酸镁和滑石粉加到颗粒中，混合后在片剂仪器上生产各重120mg的片剂。

                       制剂实施例5

如下制备各含40mg药物的胶囊：

成分                          量(mg/胶囊)

活性成分                      40.0mg

淀粉                          109.0mg

硬脂酸镁                      1.0mg

总计                          150.0mg

将活性成分，淀粉和硬脂酸镁混合，穿过20号美国筛，以150mg的量填充到硬凝胶胶囊中。

                       制剂实施例6

如下制备各含25mg活性成分的栓剂：

成分                          量

活性成分                      25mg

饱和脂肪酸甘油酯至            2,000mg

将活性成分穿过60号美国筛，悬浮于预先用最少所需加热量融化的饱和脂肪酸甘油酯中。然后将混合物注入标称2.0g容量的栓模中冷却。

                     制剂实施例7

如下制备每5.0mL剂量含50mg药物的悬浮液：

成分                         量

活性成分                     50.0mg

黄原胶                       4.0mg

羧甲基纤维素钠(11％)

微晶纤维素(89％)             50.0mg

蔗糖                         1.75g

苯甲酸钠                     10.0mg

调味剂和色素                 q.v.

纯化水至                     5.0mL

将活性成分，蔗糖和黄原胶混合，穿过10号美国筛，然后与预先在水中制备的微晶纤维素和羧甲基纤维素钠溶液混合。用水稀释苯甲酸钠，调味剂和色素并搅拌加入。然后加入足量水达到所需体积。

                       制剂实施例8

成分                         量(mg/胶囊)

活性成分                     15.0mg

淀粉                         407.0mg

硬脂酸镁                     3.0mg

总计                         425.0mg

将活性成分，淀粉和硬脂酸镁混合，穿过20号美国筛，以425.0mg的量填充到硬凝胶胶囊中。

                       制剂实施例9

可如下制备制剂：

成分                         量

活性成分                     5.0mg

玉米油                      1.0mL

                    制剂实施例10

可如下制备一种局部制剂：

成分                        量

活性成分                    1-10g

乳化蜡                      30

液体石蜡                    20g

白色软石蜡           至    100g

将白色软石蜡加热至融化。将液体石蜡和乳化蜡掺入并搅拌至溶解。加入活性成分并继续搅拌至分散。然后将混合物冷却成固体。

本发明可用的其它适当制剂可参看雷明顿药物科学²³(Remington’sPharmaceutical Sciences)。

只要必需的材料被包装到合适的容器，可将反义寡核苷酸或含有反义寡核苷酸的药物组合物包装到方便的试剂盒。

本发明的寡核苷酸和核酶调节肿瘤细胞生长。因此提供了干扰和抑制哺乳动物中肿瘤细胞生长的方法，包括将肿瘤或肿瘤细胞与本发明的反义寡核苷酸接触。

术语“接触”是指将寡核苷酸，核酶等加到细胞悬液或组织样本，或将寡核苷酸等直接或间接向动物内的细胞或组织给药。

该方法可用于治疗增殖性疾病，包括不同形式的癌，诸如白血病，淋巴瘤(Hodgkins和非Hodgkins)，恶性肉瘤，黑素瘤，腺瘤，实体组织癌，缺氧性肿瘤，口、咽喉、喉和肺的鳞状细胞癌，泌尿生殖器癌诸如宫颈癌和膀胱癌，造血性癌，结肠癌，乳腺癌，胰癌，肾癌，脑癌，皮肤癌，肝癌，头颈癌和神经系统癌，以及良性损伤诸如乳头状瘤。亦包括其它增殖性疾病，诸如牛皮癣和那些涉及关节硬化、血管增生和病毒感染的疾病。

本发明的寡核苷酸亦可用于治疗抗药性肿瘤。抗药性肿瘤的例子是抗那些化疗剂(诸如5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、氨甲蝶呤或羟基脲)的肿瘤和高水平表达已知能够赋予其对多种抗癌药物(诸如秋水仙碱，长春碱和亚德里亚霉素)抗性的P-糖蛋白的肿瘤；或表达Dreeley等⁴³所述的多药物抗性蛋白质的肿瘤。相应的，预期可将本发明的寡核苷酸与已知的抗癌化合物或化疗剂联合使用或加入其中。化疗剂是可以抑制肿瘤生长的化合物。这类药剂包括，但不限于，5-氟尿嘧啶，丝裂霉素C，氨甲蝶呤和羟基脲。预期化疗剂的量为有效量(即足以抑制肿瘤生长的量)或低于有效量。

发现本发明的寡核苷酸可降低迁移性肿瘤(诸如MDA-MB-231乳腺癌，HT-29结肠腺癌，A549肺癌，和A2058黑素瘤癌细胞)的生长。在本发明的一个实施方案中，提供了降低迁移性肿瘤在哺乳动物中生长的方法，包括施用一定量的与硫氧还蛋白mRNA或硫氧还蛋白还原酶mRNA互补的寡核苷酸，或施用表1和表2所示的寡核苷酸。

可使用病毒或非病毒载体递送寡核苷酸。可将序列掺入盒或构建体中，使本发明的寡核苷酸在细胞中表达。优选的，构建体含有适当的转录控制区使寡核苷酸在细胞中转录。

因而，本发明提供的载体含有与编码本发明寡核苷酸的序列有效连接的转录控制序列。本发明进一步提供了用这些载体转化的宿主细胞，这些宿主细胞选自适当的真核和原核细胞。

已知合适的载体，并且优选的其含有所有必需的表达元件以获得序列的所需转录。噬菌粒是这类有益载体的特殊例子，因为它们可用作质粒或噬菌体载体。载体例子包括，病毒诸如噬菌体，杆状病毒，逆转录病毒，DNA病毒，脂质体和其它重组载体。载体亦可含有用于原核或真核宿主系统的元件。本技术领域普通人员知道哪种宿主系统与何种特定载体相容。

可通过稳定或瞬时转染、脂质体转染、电穿孔和重组病毒载体感染将载体引入细胞中。

可以给载体加上其它特性来保证其安全性和/或增强其疗效。这些特性包括，例如，可用于负选择用重组病毒感染的细胞的标记。一个这种负选择标记的例子是TK基因，它赋予对于抗病毒的9-(1，3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤的敏感性。亦可包括限制在特定细胞类型中表达的特性。这类特性包括，例如，对所需细胞类型专一的启动子和调节元件。

反转录载体是可用于体内引入所需核酸的另一种载体的例子，因为它们提供了诸如横向感染(lateral infection)和靶向专一性等优点。横向感染是单个感染的细胞产生能够感染相邻细胞的多个子代病毒粒子的过程。结果是快速感染大片区域。

根据作为标靶的细胞类型，可以选择用于本发明方法的载体。例如，如果需治疗乳腺癌，则可使用上皮细胞专一性载体。类似的，如果治疗造血系统的细胞，则对血细胞专一的病毒载体是优选的。

应用

本发明的反义寡核苷酸可用于多种目的。它们可用于抑制哺乳动物细胞中硫氧还蛋白基因的表达，从而抑制该细胞生长。它们可用于抑制哺乳动物细胞中硫氧还蛋白还原酶基因的表达，从而抑制该细胞生长。寡核苷酸可用作杂交探针检测哺乳动物细胞中硫氧还蛋白mRNA或硫氧还蛋白还原酶mRNA的存在。当这样使用时，可将寡核苷酸用合适的可检测基团(诸如放射性同位素，配体，专一结合对的另一成员，例如生物素)标记。最后，寡核苷酸可用作分子量标记。

为了进一步说明本发明及其优点，下面给出了特定的实施例，但在任何意义上并非限制权利要求。

                     实施例

在下面的实施例中，所有的温度为摄氏温度(除非特别说明)，所有的百分数是重量百分数(除非特别说明)。

在下面的实施例中，下列简写有下述含义。如果某个简写未定义，它有其通常接受的含义：

μM    ＝微摩

mM     ＝毫摩

M      ＝摩尔

ml    ＝毫升

μl   ＝微升

mg    ＝毫克

μg   ＝微克

PAGE  ＝聚丙烯酰胺凝胶电泳

rpm   ＝每分钟转数

ΔG   ＝自由能，寡核苷酸双螺旋稳定性的量度

kcal  ＝千卡

FBS   ＝胎牛血清

DTT   ＝二硫苏糖醇

SDS   ＝十二烷基硫酸钠

PBS   ＝磷酸缓冲盐溶液

PMSF  ＝苯甲基磺酰氟

分子生物学常规方法：

本技术领域熟知的标准的分子生物学技术和未特别说明的通常按照Sambrook等²⁴；和Perbal²⁶中的描述.

寡核苷酸

反义寡核苷酸选自与硫氧还蛋白mRNA或硫氧还蛋白还原酶mRNA互补的序列，这样该序列将最少可能出现双螺旋形成、发夹形成和同型寡聚物/序列重复，但分别与硫氧还蛋白mRNA序列或硫氧还蛋白还原酶mRNA序列有高结合能力。此外，消除了对其它经常出现的序列或人和鼠中的重复序列的错误引发。这些特性是通过计算机模建程序OLIGO^(R)引物分析软件，5.0版本，国际生物科学公司(InternationalBiosciences，Inc.)Plymouth MN确定的。关于针对硫氧还蛋白的反义寡核苷酸，选择了5个寡核苷酸(2601-2605)靶定于5′非翻译区，2个寡核苷酸(2606-2607)靶定于翻译起始点附近，12个寡核苷酸(2608-2619)靶定于编码区，而7个寡核苷酸(2620-2626)与3′非翻译区杂交。总共设计了66个不同的反义寡核苷酸，然后从道尔顿化学实验室公司(Dalton Chemical Laboratories，Inc.)(North York，Canada)或三联生物技术公司(TriLink Biotechnologies，Inc.)(San Diego，CA.)订购。

细胞系

从美国典型培养物中心(ATCC)获得人正常胚胎肺细胞系WI-38和十种不同的人癌症细胞系，包括纤维肉瘤(HT-1080)，肺癌(A549)，卵巢腺癌(SK-OV-3)，肝细胞癌(Hep G2)，黑素瘤(C8161)，乳腺癌(MDA-MB-231)，迁移性胰腺癌(AsPC-1)，结肠腺癌(HT29)，宫颈癌(HeLa S3)，人黑素瘤细胞系A2058，人胰腺癌SU.86.86。细胞系保存在补充有10％胎牛血清(FBS)的α-MEM培养基(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。

实施例1硫氧还蛋白在人癌细胞系中的过量表达

将来自不同细胞系的等份细胞悬液加到组织培养板并生长至亚铺满(70-80％)。通过Northern和Western印迹分析测定硫氧还蛋白mRNA或蛋白质的水平。

如前所述(Hurta和Wrigh²³)少量修改后进行Northern印迹分析。在指定时间使用TRIzol试剂(Gibco BRL，Gaithersburg MD)从细胞制备总细胞RNA。在1.5％甲醛凝胶上分级RNA(10-20μg)并转移到尼龙膜。将印迹与³²P-标记的300bp PCR片段杂交，该片段是使用正向引物[SEQID NO：69](5′-CAG ATC GAG AGC AAG ACT G-3′)，反向引物[SEQID NO：70](5′-TTC ATT AAT GGT GGC TTC AA-3′)和以人肝5′-延伸加法cDNA库(Clontech，Palo Alto，CA)为模板合成的。硫氧还蛋白核苷酸序列信息来自Genebank记录号X77585。人硫氧还蛋白mRNA表达为520bp转录物(Tagaya等²⁸)并使用放射自显影或磷光仪(phosphorImager)(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)显示和定量。

同时探查甘油醛三磷酸脱氢酶(GADPH)mRNA作为RNA加样对照。再次进行PCR，使用正向引物[SEQ ID NO：71](5′-CGC GGG GCTCTC CAG AAC AT-3′)和反向引物[SEQ ID NO：72](5′-GCA ATGCCA GCC CCA GCG TC-3′)从上述相同cDNA库产生308bp GADPH的DNA探针。

如图1A明显所示，硫氧还蛋白mRNA在所有9种不同肿瘤细胞系中比正常细胞有显著高水平的表达。但在不同细胞系中显示1.5至5.6倍范围的不同程度的过量表达。

制备50-150μl 2倍样品加样缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 6.8，0.2MDTT，4％SDS，20％甘油，和0.015％溴酚蓝)中的全细胞蛋白提取物。如前所述(Choy等²⁹和Fan等³⁰)少量修改后进行Western印迹分析。在15％SDS-PAGE凝胶上分级分离蛋白质提取物(10-20μg)，转移到硝酸纤维素膜并用印度墨水染色显示。用抗硫氧还蛋白抗体(0.2-1μg/ml)(American Diagnostica Inc.，Greenwich，CT)随后用稀释为1∶8,000的辣根过氧化物酶偶联的抗山羊IgG(Sigma，St.Louis，MO)检测硫氧还蛋白的表达。通过ECL(Amersham，Arlington Heights，IL)显示出大约12kDa的一种蛋白质。

如图1B所示，由于蛋白质表达模式紧随在mRNA表达模式中观察到的变化程度，在硫氧还蛋白mRNA和蛋白质水平之间有显著相关性。图1B的下栏显示在泳道中总蛋白质加样是一致的。

实施例2.与硫氧还蛋白互补的反义寡核苷酸抑制癌细胞系生长

使用前面所述的方法(Choy等²⁹)评价了用26种不同的反义寡核苷酸处理的癌细胞系的集落形成能力。特定的，将等份的肿瘤细胞悬液以大致1×10⁴的密度接种到组织培养板，并在补充有10％FBS的α-MEM中37℃培养过夜。用5ml PBS冲洗细胞一次，并在阳离子脂质(脂质转染试剂，终浓度5μg/ml，Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)存在下用0.2μM的指定反义寡核苷酸处理4个小时。用PBS冲洗细胞一次除去反义寡核苷酸，将细胞在37℃下生长培养基(补充有10％FBS的α-MEM)中培养7至10天。用亚甲基蓝将集落染色，且如(Choy等²⁹以及Huang和Wright³¹)所述直接计数评价。通过与不合反义寡核苷酸条件下培养物中存在的集落数目相比，计算抑制百分数。所有实验均为四份重复。

反义寡核苷酸对人肿瘤细胞系集落形成能力显示出抑制效应。每一反义寡核苷酸的抑制百分数显示于图3中，图3A是对人结肠癌细胞系HT-29；图3B是对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231；图3C是对人肝癌细胞系HepG2；图3D是对人黑素瘤细胞系A2058；图3E是对人卵巢癌细胞系SK-OV-3；图3F是对人肺癌细胞系A549。

实施例3使用与硫氧还蛋白互补的反义寡核苷酸处理后降低的mRNA水平

将人肝癌细胞(Hep G2)或人乳癌细胞(MDA-MB-231)培养至亚铺满(70-80％)，并在阳离子脂质(脂质转染试剂，终浓度5μg/ml，Gibco-BRL)和Opti-MEM(Gibco-BRL)存在下用0.2μM与硫氧还蛋白互补的硫代磷酸酯反义寡核苷酸处理4小时。用PBS冲洗细胞一次，并将细胞在补充有10％FBS的α-MEM培养基中培养16小时。在TRIzol试剂(Gibco-BRL)中制备总RNA并如前所述进行Northern印迹测定。将人硫氧还蛋白mRNA水平定量，并对GAPDH mRNA水平校准，表示为从未处理细胞获得的硫氧还蛋白mRNA水平的百分数。图4A和4B显示反义寡核苷酸降低硫氧还蛋白mRNA水平到至少为对照细胞的50％。

实施例4使用与硫氧还蛋白互补的反义寡核苷酸处理后在不同细胞系中硫氧还蛋白蛋白质表达的降低

将不同细胞系培养至亚铺满(70-80％)，并在阳离子脂质(脂质转染试剂，终浓度5μg/ml，Gibco-BRL)和Opti-MEM(Gibco-BRL)存在下用0.2μM硫代磷酸酯反义寡核苷酸处理4小时。用PBS冲洗细胞一次并将细胞在含有10％FBS的α-MEM培养基(Gibco-BRL)中培养20小时。重复处理和培养一次后，在2X加样缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 6.8，0.2M DTT，4％SDS，20％甘油，和0.015％溴酚蓝)中制备全细胞提取物并如前所述(Choy等²⁹和Fan等³⁰)少量修改后进行Western印迹检测。用抗硫氧还蛋白抗体(0.2-1μg/ml)(American Diagnostica Inc.，Greenwich，CT)随后用稀释为1∶8,000的辣根过氧化物酶偶联的抗山羊IgG(Sigma，St.Louis，MO)检测硫氧还蛋白的表达。通过ECL(Amersham，Arlington Heights，IL)显示出大约12kDa的一种蛋白质。

检测的细胞系是人结肠癌细胞HT-29(图5A)和MDA-MB-231人乳腺癌细胞(图5B)。用所示反义寡核苷酸处理后降低了蛋白质水平。

如上所述用0.2μM寡核苷酸2601[SEQ ID NO：1]处理了三种不同的人肿瘤细胞(分别为结肠，乳和肝癌的HT-29，MDA-MB-231和Hep G2细胞系)。图5C显示在各细胞系中反义寡核苷酸抑制硫氧还蛋白蛋白质的表达。较低的一栏显示蛋白质加样在泳道中是一致的。

实施例5将与硫氧还蛋白互补的反义寡核苷酸静脉内注射小鼠后对人肿瘤细胞生长的抑制

从Charles River Laboratories(Montreal加拿大)购买CD-1无胸腺裸鼠。将HT-29人结肠癌细胞(典型的在100μl PBS中有3×10⁶细胞)皮下注射到6-7周龄CD-1无胸腺雌性裸鼠的右侧。每个实验组包括5只小鼠。当肿瘤的大小达到大约100mm³的体积时，典型的在肿瘤细胞注射5天后，将不同的反义寡核苷酸每隔一天以10mg/kg的量大剂量灌注到尾静脉给药。对照鼠在同期仅接受盐水。此后的治疗一般持续10天。

图6A显示反义寡核苷酸对CD-1裸鼠中HT-29肿瘤生长的作用。通过抑制肿瘤体积评价抗肿瘤活性，这是使用测径器在9天时间内平均两天间隔的测定测量。图中的每个点是指从每个实验组的5只鼠计算的平均肿瘤体积。使用协方差分析以比较各处理组中小鼠对时间的回归曲线。当斜率相同时从分析中得出斜率相等或截距相同的具体假定。所有的分析使用SAS(统计分析系统)版本6.12。图6A显示与盐水对照相比的各反义寡核苷酸抑制肿瘤的生长，p值≤0.0001。

治疗结束后(通常最后一次治疗24小时后)杀死动物，测定肿瘤重量。图6B显示肿瘤的平均重量。反义寡核苷酸显示出对肿瘤生长的显著抑制效应。使用了方差的单边分析比较处理组的平均值。当所有组的效果显著时，使用利用了最小方均(least square means)的先验多重比较(priori multiple comparison)来寻找有显著差异的处理组对。比较肿瘤重量时，与盐水对照相比各反义寡核苷酸亦显示统计学上显著的抑制，p值≤0.0198(图6B)。

将HT-29人结肠癌细胞皮下注射到6-7周龄CD-1无胸腺雌性裸鼠的右侧。当肿瘤的大小达到大约100mm³的体积时，一般在肿瘤细胞注射5天后，将不同的反义寡核苷酸每隔一天以10mg/kg的量大剂量灌注到尾静脉给药。对照鼠在同期仅接受盐水。8次注射后杀死小鼠并迅速收集切下的类似大小的肿瘤块，放入RIPA抽提缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，1％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，0.02％NaN₃，1mM PMSF和10μM亮抑蛋白酶肽)并快速匀浆用于蛋白质制备。为了测定反义寡核苷酸对硫氧还蛋白蛋白质水平的作用，如前所述(Choy等.²⁹和Fan等³⁰)少量修改后进行Western印迹分析。在12％SDS-PAGE凝胶上分级分离蛋白质提取物(10-20μg)，转移到硝酸纤维素膜并用印度墨水染色显示。用抗硫氧还蛋白抗体(0.2-1μg/ml)(AmericanDiagnostica Inc.，Greenwich，CT)随后用稀释为1∶8,000的辣根过氧化物酶偶联的抗山羊IgG(Sigma，St.Louis，MO)检测硫氧还蛋白的表达。通过ECL(Amersham，Arlington Heights，IL)显示出大约50kDa的一种蛋白质。各泳道加样的蛋白质大致相同。下面显示了用印度墨水染色的部分印迹，以证实各泳道有相同加样。从图6C可清楚的看到，与从盐水处理小鼠获得的对照肿瘤组织相比，硫氧还蛋白的表达在从用靶定于硫氧还蛋白的反义寡核苷酸处理的小鼠中获取的肿瘤组织中显著降低。

实施例6硫氧还蛋还原酶白在人癌细胞系中的过量表达

将来自不同细胞系的等份细胞悬液加到组织培养板并生长至亚铺满(70-80％)。通过Northern印迹分析测定硫氧还蛋白还原酶mRNA水平。

如前所述(Hurta和Wright²³)少量修改后进行Northern印迹分析。简言之，在指定时间使用TRIzol试剂(Gibco BRL，Gaithersburg MD)从细胞制备总细胞RNA。在1.5％甲醛凝胶上分级分离RNA(10-20μg)并转移到尼龙膜。将印迹与³²P-标记的330bp PCR片段杂交，该片段是使用正向引物[SEQ ID NO：73](5′-TTG GCT TAG AAA CCG TAG GG-3′)，反向引物[SEQ ID NO：74](5′-CCA ATG GCC AAA AGT AACTA-3′)和人肝5′-延伸加法cDNA库(Clontech，Palo Alto，CA)为模板合成的。人硫氧还蛋白还原酶mRNA表达为3826bp的转录物(Gasdaska等³²)并使用放射自显影或磷光仪(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)显现和定量。

同时探查甘油醛三磷酸脱氢酶(GADPH)mRNA作为RNA加样对照。再次进行PCR，使用正向引物[SEQ ID NO：71](5′-CGC GGG GCTCTC CAG AAC AT-3′)和反向引物[SEQ ID NO：72](5′-GCA ATGCCA GCC CCA GCG TC-3′)从上述同一个cDNA库产生308bpGADPH的DNA探针。

如图7明显所示，硫氧还蛋白还原酶mRNA在所有9个不同肿瘤细胞系中比正常细胞系中有显著高水平的表达。

实施例7.与硫氧还蛋白还原酶互补的反义寡核苷酸抑制癌细胞系生长

使用前面所述的方法(Choy等²⁹)评价了用40种不同的反义寡核苷酸处理的癌细胞系的集落形成能力。特定的，将等份的肿瘤细胞悬液以大致1×10⁴的密度接种到组织培养板，并在补充有10％FBS的α-MEM中37℃培养过夜。用5ml PBS冲洗细胞一次，并在阳离子脂质(脂质转染试剂，终浓度5μg/ml，Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)存在下用0.2μM的指定反义寡核苷酸处理4个小时。用PBS冲洗细胞一次除去反义寡核苷酸，并将细胞在37℃下生长培养基(补充有10％FBS的α-MEM)中培养7至10天。用亚甲基蓝将集落染色并如(Choy等²⁹以及Huang和Wright³¹)所述直接计数评价。通过与不含反义寡核苷酸条件下培养物中存在的集落数目相比计算抑制百分数。所有实验均为四份重复。

大部分反义寡核苷酸对人肿瘤细胞系集落形成能力显示中度的抑制效应。每一反义寡核苷酸的抑制百分数显示于图8中，图8A是对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231；图8B是对人黑素瘤细胞系A2058；图8C是对人肝癌细胞系HepG2；图8D是对人胰癌细胞系SU.86.86。

实施例8使用与硫氧还蛋白还原酶互补的反义寡核苷酸处理后降低的mRNA水平

将人结肠癌细胞(HT-29)或乳腺癌细胞(MDA-MB-231)培养至亚铺满(70-80％)，并在阳离子脂质(脂质转染试剂，终浓度5μg/ml，Gibco-BRL)和Opti-MEM(Gibco-BRL)存在下用0.2μM与硫氧还蛋白互补的硫代磷酸酯反义寡核苷酸处理4小时。用PBS冲洗细胞一次并将细胞在补充有10％FBS的α-MEM培养基中培养16小时。在TRIzol试剂(Gibco-BRL)中制备总RNA，并如前所述进行Northern印迹测定。将人硫氧还蛋白还原酶mRNA水平定量，并对GAPDH mRNA水平校准，表示为从未处理细胞获得的硫氧还蛋白还原酶mRNA水平的百分数。图9A和9B显示反义寡核苷酸降低硫氧还蛋白还原酶mRNA水平到至少为对照细胞的50％。

实施例9使用反义寡核苷酸处理后在不同细胞系中硫氧还蛋白还原酶蛋白质表达的降低

将AsPC-1人胰癌细胞培养至亚铺满(70-80％)，并在阳离子脂质(脂质转染试剂，终浓度5μg/ml，Gibco-BRL)和Opti-MEM(Gibco-BRL)存在下用0.2μM硫代磷酸酯反义寡核苷酸3014[SEQ ID NO：40]和3037[SEQ ID NO：63]处理4小时。用PBS冲洗细胞一次，并将细胞在含有10％FBS的α-MEM培养基(Gibco-BRL)中培养20小时。重复处理和培养一次后，在2X加样缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 6.8，0.2M DTT，4％SDS，20％甘油，和0.015％溴酚蓝)中制备全细胞蛋白质提取物，并如前所述(Choy等³⁹和Fan等³⁰)少量修改后进行Western印迹检测。用抗硫氧还蛋白还原酶抗体(0.2-1μg/ml)(Research Genetics，Inc.，Huntsville AL)随后用稀释为1∶8,000的辣根过氧化物酶偶联的抗山羊IgG(Sigma，St.Louis，MO)检测硫氧还蛋白还原酶的表达。通过ECL(Amersham，Arlington Heights，IL)显示出大约50kDa的一种蛋白质，参见图10。

实施例10用反义寡核苷酸处理后对小鼠中肿瘤细胞生长的抑制

将HT-29人结肠癌细胞(一般在100μl PBS中有3×10⁶细胞)皮下注射到6-7周龄CD-1无胸腺雌性裸鼠的右侧。当肿瘤的大小达到大约100mm³的体积时，一般在肿瘤细胞注射5天后，将不同的反义寡核苷酸每隔一天以10mg/kg的量大剂量灌注到尾静脉给药。对照鼠在同期仅接受盐水。此后的治疗典型的持续10天。

图11A显示与硫氧还蛋白还原酶互补的反义寡核苷酸对CD-1裸鼠中HT-29肿瘤生长的作用。通过抑制肿瘤体积评价抗肿瘤活性，这是使用测径器在9天时间内以两天间隔平均测定测量的。图中的每个点代表从每个实验组的5只鼠计算的平均肿瘤体积。治疗结束后(通常最后一次治疗24小时后)杀死动物，测定肿瘤重量。图11B显示肿瘤的平均重量。反义寡核苷酸显示出对肿瘤生长的显著抑制效应。与盐水对照相比时，图11A所示的各反义寡核苷酸抑制肿瘤的生长，p值≤0.0001。比较肿瘤重量时，与盐水对照相比各反义寡核苷酸亦显示统计学上显著的抑制，p值≤0.0141(图11B)。

实施例11将反义寡核苷酸静脉内注射小鼠后人肿瘤中硫氧还蛋白还原酶蛋白质水平的降低

将HT-29人结肠癌细胞(一般在100μl PBS中有3×10⁶细胞)皮下注射到6-7周龄CD-1无胸腺雌性裸鼠的右侧。当肿瘤的大小达到大约100mm³的体积时，一般在肿瘤细胞注射5天后，将不同的反义寡核苷酸每隔一天以10mg/kg的量大剂量灌注到尾静脉给药。对照鼠在同期仅接受盐水。8次注射后杀死小鼠，并迅速收集切下的类似大小的肿瘤块放入RIPA抽提缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，1％ NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，0.02％ NaN₃，1mM PMSF和10μM亮抑蛋白酶肽)，快速匀浆用于蛋白质制备。为了测定反义寡核苷酸对硫氧还蛋白还原酶蛋白质水平的作用，如前所述(Choy等²⁹和Fan等³⁰)少量修改后进行Western印迹分析。在12％SDS-PAGE凝胶上分级分离蛋白质提取物(10-20μg)，转移到硝酸纤维素膜并用印度墨水染色显示。用抗硫氧还蛋白还原酶抗体(0.2-1μg/ml)(Research Genetics，Inc.，Huntsville AL)随后用稀释为1∶8,000的辣根过氧化物酶偶联的抗山羊IgG(Sigma，St.Louis，MO)检测硫氧还蛋白还原酶的表达。通过ECL(Amersham，Arlington Heights，IL)显示出大约50kDa的一种蛋白质。各泳道加样的蛋白质大致相同。参看图12。

Claims (12)

1.一种与编码哺乳动物硫氧还蛋白系统的一种蛋白质之mRNA互补的少于50个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含示于SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65或66中的任一序列，其中所述寡核苷酸抑制所述mRNA的表达，且能抑制癌症细胞生长，并且其中所述蛋白质选自硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶。

2.权利要求1的反义寡核苷酸，其中所述蛋白质是硫氧还蛋白。

3.权利要求1的反义寡核苷酸，其中所述蛋白质是硫氧还蛋白还原酶。

4.权利要求1的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65或66中的任一序列组成。

5.权利要求1、2、3或4的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。

6.权利要求1、2、3或4的反义寡核苷酸，其还包含异源多核苷酸。

7.权利要求1的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸为核酸酶抗性。

8.一种包含权利要求1、2、3、4、5、6或7的反义寡核苷酸的载体。

9.一种药物组合物，其包含药学可接受的赋形剂和有效量的权利要求1、2、3、4、5、6或7的反义寡核苷酸。

10.一种药物组合物，其包含药学可接受的赋形剂和有效量的权利要求8的载体。

11.用于治疗怀疑患有肿瘤的哺乳动物的权利要求1、2、3、4、5、6或7  中任一项反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸抑制肿瘤的生长或转移。

12.权利要求1、2、3、4、5、6或7中任一项的反义寡核苷酸用于制备治疗怀疑患有肿瘤的哺乳动物的药物的用途。

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